Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание эффективного олигонуклеотидного ингибитора TAQ ДНК-полимеразы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Якимович, Ольга Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ДЛЯ ДОСТИЖЕНИЯ ПОСТАВЛЕННОЙ В РАБОТЕ ЦЕЛИ НЕОБХОДИМО

БЫЛО РЕШИТЬ СЛЕДУЮЩИЕ ЗАДАЧИ:.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ TAQ ДНК- ПОЛИМЕР АЗЫ.

1.1 .биологические функции taq днк- полимер азы.

1.2. сравнение структуры taq днк- полимер азы с основными структурами днк-зависимых днк-полимер a3.

1.3.строение молекулы taq днк-полимеразы.

1.4. трехмерная структура фермента.

1.5. структуры каталитических центров taq днк-полимеразы.

1.5.1.Строение полимеразного домена Taq ДНК-полнмеразы.

1.5.2. Строение 3'-5'-экзонуклеазного домена Taq ДНК-полимеразы.

1.5.3. Строение 5 -3 -экзонуклеазного домена Taq ДНК-полимеразы.

1.6. современное представление о механизме действия taq днк-полимеразы.

1.7. применение taq днк-полимеразы в методе пцр.

1.7.1. Основные принципы метода ПЦР.

1.7.2.Применение метода ПЦР в области молекулярной биологии.

1.7.3.Преимущества и ограничения метода ПЦР.

1.7.4.Проблема неспецифической амплификации для ПЦР.

1.7.5.Методы Hot start (горячий старт) для увеличения специфичности ПЦР.

1.7.5.1. «Горячий старт» ПЦР при помощи физического отделения Taq ДНК-полимеразы от остальных компонентов смеси при низкой температуре.

1.7.5.2. «Горячий старт» ПЦР при помощи химически-модифицированной.

Taq ДНК-полимеразы.

1.7.5.3. «Горячий старт» ПЦР при помощи антител к Taq ДНК-полимеразе.

1.7.5.4. «Горячий старт» ПЦР при помощи ДНК-геликаз.

1.7.5.5. «Горячий старт» ПЦР с использованием праймеров со шпилечной структурой.

1.7.5.6. «Горячий старт» ПЦР при помощи аптамеров к Taq ДНК- полимеразе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.изучение вторичной структуры олигонуклеотидов аптамеров для taq днк- полимер азы.

3.1.1.Компьютерное моделирование вторичной структуры ДНК-лигандов.

3.1.2.Экспериментальное исследование вторичной структуры ДНК-лиганда.

3.2.0пределение термодинамических параметров днклиганда. з.з.выявление структурных элементов днк-лиганда, оказывающих влияние на эффективность связывания с taq днк- полимеразой.

3.3.1.Модельная система.

3.3.2.Изучение влияния однотяжевого 5'- концевого участка олигонуклеотида на эффективность ингибирования Taq ДНК-полимеразы.

3.3.3.Изучение влияния двутяжевой части аптамера на эффективность ингибирования Taq ДНК- полимеразы.

3.3.3.1.Выявление функгщоналъно значимой длины двутяжевого участка аптамера.

3.3.3.2.Изучение влияния нуклеотидного состава двутяжевого участка молекулы аптамера на эффект ингибирования.

3.3.4.Изучение влияния фрагмента ДНК-аптамера петля на эффект ингибирования

Taq ДНК- полимеразы.

Последовательность петли.

3.4.изучение свойств оптимизированного аптамера.

3.4.1. Установление вторичной структуры.

3.4.2.Изучение конформационных свойств аптамера в растворе.

3.4.3.Изучение особенностей взаимодействия аптамера

Taq ДНК- полимеразой.

3.4.3.1. Определение тиминовых остатков, потенциально вовлеченных в специфическое взаимодействие с Tag ДНК полимеразой.

3.4.3.2. Установление домена Taq ДНК-полимеразы, участвующего во взаимодействии с ДНК-лигандом.

3.4.4. Изучение взаимодействия ДНК-лиганда с другими ДНК-полимеразами.

3.5. модель днк-белковых взаимодействий в комплексе taq днк полимеразы с днк-лигандом.

3.6. применение днк-аптамера для увеличения специфичности и чувствительности пцр.

3.6.1. Исследование оптимизированного ДНК-лиганда как субстрата для Taq ДНК-полимеразы.

3.6.2. Применение ДНК-аптамера для увеличения специфичности ПЦР.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание эффективного олигонуклеотидного ингибитора TAQ ДНК-полимеразы"

Функционирование клетки, в первую очередь, определяется протеканием таких молекулярно-биологических процессов как репликация, репарация, транскрипция и регуляция активности генов. В основе этих процессов лежит специфическое взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами (НК).

Новые возможности для изучения структурных особенностей нуклеиновых кислот открыла методика in vitro селекции олигонуклеотидных лигандов SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), разработанная в 1990 году. Эта процедура позволяет выделить высокоаффинные целевые продукты - аптамеры (от латинского aptus - подходящий) из большого набора индивидуальных молекул (более 1015) - так называемой комбинаторной библиотеки. Аптамеры имеют небольшие размеры, уникальную трехмерную структуру. Они способны специфически и с высоким сродством взаимодействовать с различными молекулами - мишенями.

Интерес к изучению особенностей структуры аптамеров к ДНК (РНК) - связывающим белкам определяется двумя аспектами.

Во-первых, ДНК(РНК)-аптамер может образовывать сложные пространственные структуры, которые как ключ к замку подходят к определенным участкам фермента. Выяснение элементов структуры аптамера (НК-лиганда), вовлеченных в образование комплекса с белком, позволяет построить адекватную модель ДНК-белкового комплекса. Эта информация может быть полезна для понимания механизма действия фермента.

Во-вторых, в ряде случаев аптамеры активируют или ингибируют биологические функции белков. Активирующие или ингибирующие свойства аптамеров могут быть целенаправленно усилены привнесением изменений в его структуру.

В 1996 году были получены ДНК-аптамеры к Taq ДНК-полимеразе (Dang and Jayasena, 1996). ДНК-лиганды к Taq ДНК-полимеразе по признаку гомологии были сгруппированы в два семейства, среди которых выделены по одному ДНК-лиганду с наибольшим сродством к ферменту (TQ30 и TQ21 соответственно). Авторы работы (Lin and Jayasena, 1997) предположили, что комбинаторная часть аптамера TQ30 имеет структуру шпилечного типа.

Вторичная структура аптамера TQ21 не обсуждалась, но было показано, что 51-звенный фрагмент этого ДНК-лнганда участвует во взаимодействии с ферментом (Lin and Jayasena,1997). Для того, чтобы можно было применять аптамера как инструмент для изучения Taq ДНК- полимеразы необходимо получить более подробную информацию об их структуре.

Исследование структуры комплекса ДНК-аптамеров к Taq ДНК-полимеразе имеет не только научную, но и практическую ценность.

Taq ДНК- полимераза - это термостабильный и термоактивный (оптимум активности 75-80°С) фермент бактерии Thermus aquaticus. Он относится к классу ДНК-зависимых ДНК-полимераз семейства I, участвующих в процессах репликации и репарации ДНК. Интерес исследователей к свойствам Taq ДНК-полимеразы вызван использованием данного фермента в полимеразной цепной реакции (ПЦР) - одном из основополагающих методов современной молекулярной биологии и биотехнологии.

В настоящее время ПЦР нашла широкое применение в клинической диагностике и научных исследованиях, связанных с анализом ДНК и РНК. Одна из основных проблем, возникающих при постановке ПЦР, - образование неспецифических продуктов реакции. При температуре приготовления реакционной смеси, кроме специфического может происходить и неспецифический отжиг праймеров. Taq ДНК-полимераза обладает активностью в этих условиях, и, следовательно, может катализировать одновременную полимеризацию различных по длине фрагментов ДНК, что мешает правильной интерпретации результата. После начала ПЦР, температура реакционной смеси не опускается ниже температуры плавления (отжига) праймеров, и, следовательно, неспецифическое удлинение праймеров Taq ДНК-полимеразой уже невозможно. Таким образом, для решения этой проблемы необходимо создать такие условия, при которых Taq ДНК-полимераза была бы неактивна при комнатной температуре, но активировалась бы при температуре отжига праймеров.

Существует несколько путей решения данной проблемы, получивших название горячий старт ПЦР: физическое отделение Taq ДНК-полимеразы от остальных компонентов смеси при низкой температуре. использование химически-модифицированной Taq ДНК-полимеразы, так называемой AmpliTaqGold ДНК полимеразы; использование праймеров со шпилечной структурой «молекулярных маяков»; добавление ДНК-геликазы; добавление в реакционную смесь антител;

Аптамеры (ДНК-лиганды), разработанные Дангом и Джайасена (Dang and Jayasena, 1996) связывают Taq ДНК-полимеразу при температуре (25-35°С) и не взаимодействуют с ферментом при температурах выше 40°С, поэтому их так же можно использовать для увеличения специфичности ПЦР.

Применение любой из перечисленных методик горячего старта приводит к увеличению специфичности ПЦР. Однако методика с использованием ДНК-лигандов к Taq ДНК-полимеразе является одной из наиболее перспективных как для исследовательских работ, так и для применения в технологичеких разработках.

Однако аптамеры, разработанные Дангом и Джайасена (Dang and Jayasena, 1996), не позволяют решить ряд задач, поскольку ингибируют Taq ДНК-полимеразу лишь в узком диапазоне температур (25-35°С). Кроме того, аптамеры инактивируют обратную транскриптазу (ОТ) M-MLV, необходимую для осуществления ОТ-ПЦР "в одной пробирке". Поэтому для увелечения области использования аптамеров в ПЦР и ОТ-ПЦР, необходимо было оптимизировать их структуру.

Цель настоящей диссертационной работы заключалась в изучении особенностей строения комплекса аптамера с Taq ДНК-полимеразой и оптимизации структуры ДНК-аптамера для получения эффективного ингибитора Taq ДНК-полимеразы, удовлетворяющего следующим требованиям:

1) прочное связывание Taq ДНК-полимеразы при температурах 20-45°С,

2) полная диссоциация ДНК-белкового комплекса при температурах выше

50 °С,

3) отсутствие ингибирования обратной транскриптазы M-MLV,

4) устойчивость к длительному хранению при -20°С.

Для достижения поставленной в работе цели необходимо было решить следующие задачи:

1) экспериментальным путем установить вторичную структуру отобранного для исследования аптамера к Taq ДНК-полимеразе;

2) выявить функционально-значимые структурные элементы аптамера, вовлеченные в специфическое взаимодействие с ферментом, и на основании полученных данных оптимизировать структуру ДНК-лиганда;

3) определить домен фермента, участвующий в формирование комплекса с ДНК-лигандом;

4) изучить взаимодействие ДНК-лиганда с другими ДНК-полимеразами;

5) разработать новую методику «горячего старта» ПЦР при помощи ДНК-лиганда, приводящую к увеличению специфичности и чувствительности ПЦР и ОТ-ПЦР «в одной пробирке».

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ TAQ ДНК- ПОЛИМЕР АЗЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Якимович, Ольга Юрьевна

105 ВЫВОДЫ

1. Изучена вторичная структура ДНК-лиганда (аптамера) к Taq ДНК-полимеразе (TQ21). Впервые показано, что в реакционном буфере олигонуклеотид TQ21 обладает структурой шпилечного типа, включающий однотяжевой 5'- концевой участок, двутяжевой участок и петлю.

2. Впервые установлено, что ингибирующие свойства ДНК-аптамера зависят от его вторичной структуры и нуклеотидной последовательности. Показано, что все нуклеотиды петли важны для образования стабильной структуры, участвующей в специфическом взаимодействии с ферментом. Идентифицировано основание ДНК-аптамера, находящееся в непосредственном контакте с аминокислотами остатками полимеразного домена Taq ДНК-полимеразы.

3. На основании экспериментальных данных по оптимизации ингибирующих свойств ДНК-аптамера получен эффективный олигонуклеотидный ингибитор Taq ДНК-полимеразы (TQ21-11), обладающий в 5 раз большим сродством к ферменту, чем исходный аптамер (TQ21). В результате оптимизации был уменьшен размер олигонуклеотидного ингибитора с 78 до 46 нуклеотидов и в два раза увеличена его термическая устойчивость.

4. Установлено, что ДНК-аптамер TQ21-11 эффективно ингибирует делеционное производное Taq ДНК- полимеразы, так называемый Стоффел-фрагмент, лишенный 5'-3' экзонуклеазной активности, «ThermoSequenase», Tth и Afu ДНК-полимеразы, в то же время не ингибирует Кленов-фрагмент ДНК-полимеразы I E.coli, Tli ДНК-полимеразу и обратную транскриптазу M-MLV.

5. Разработан новый метод «горячего старта» ПЦР с использованием ДНК-аптамера TQ21-11. Предложенный метод был успешно применен для увеличения специфичности ПЦР и реакции ОТ-ПЦР «в одной пробирке».

Автор выражает глубокую признательность В.Г.Лунину, Я.И.Алексееву, О.С.Колобовой, С.С.Анисимовой, И.А.Шилову, О.В.Сергиенко за поддержку в работе, помощь при выполнении экспериментов, обсуждении полученных результатов и дружеское участие. Автор благодарит О.Л.Воронину за создание благоприятных условий для выполнения работы, постоянную поддержку, участие в обсуждении результатов и написании статей. Автор глубоко признателен генеральному директору фирмы «Синтол» А.В.Кузубову за предоставление оборудования и методики выполнения синтеза дезоксирибоолигонуклеотидов, А.В.Максименко и С.А.Иванову за помощь при освоении спектральных методов исследования ДНК-лигандов.

107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы был получен ДНК-лиганд, удовлетворяющий следующим требованиям:

1) прочное связывание Taq ДНК-полимеразы при температурах 20-45°С ,

2) полная диссоциация ДНК-белкового комплекса при температурах выше 50 °С,

3) устойчивость при длительном хранении ДНК-лиганда при -20 °С, которая была протестирована в течение 2 лет.

Применение ДНК-лиганда для увеличения чувствительности и специфичности ПЦР имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методиками «горячего старта». Преимущество данного метода «горячего старта» по сравнению с методом физического отделения фермента от других компонентов смеси при низкой температуре заключается в сокращении манипуляций при постановке ПЦР. В отличие от использования геликаз и антител нет необходимости в постоянном контроле активности белков. Для активации фермента нет необходимости в прогреве реакционной смеси выше температуры 75°С для антител и 95°С для AmpliTaqGold ДНК полимеразы, ДНК-геликаз или при физическом отделение Taq ДНК-полимеразы от остальных компонентов смеси при низкой температуре. Мягкие условия «горячего старта» с ДНК-лиганд ом сводят к минимуму инактивацию фермента в ходе ПЦР. Оптимизированный нами ДНК-лиганд отличается от аптамеров, предложенных Дангом и Джайасена (Dang and Jayasena, 1996) по следующим параметрам:

- он ингибируют фермент в более широком диапазоне температур, что позволяет максимально увеличить специфичность ПЦР.

- минимизированный ДНК-лиганд не ингибирует обратную транскриптазу М-MLV, поэтому может быть использован для увеличения специфичности ОТ-ПЦР "в одной пробирке".

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Якимович, Ольга Юрьевна, Москва

1. Друца В.Л., Кабердин В.Р., Королева О.Н., Шилов И.А.// Эффективный метод направленного введения мутаций в плазмиды и клонирования однотяжевых фрагментов ДНК. Биоорган. химия.-1991.-Т17.-С.1487-1494.

2. Кабоев O.K., И.В.Шевелев, Л.А.Лучкина, А.Н.Третьяков, О.Г.Щербакова. Горячий старт полимеразной цепной реакции при помощи ДНК-геликаз. // Биоорган. Химия. -1999. -Т25. -С.398-400.

3. Копылов A.M., Спиридонова В.А., Парк К-Х. Применение аптамеров в медицинской диагностике и терапии. // РХЖ.-1998. -Т.5. -С.89-96.

4. Копылов A.M., Спиридонова В.А. Комбинаторная химия нуклеиновых кислот: SELEX. // Мол. биол. -2000. -Т.34. -С. 1097-1113.

5. Коренберг А. Синтез ДНК. //М.: Мир. -1977. -С. 360.

6. Ленинджер А. Биохимия. //М.: Мир. -1974. -С.737-739.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генитической инженерии. Молекулярное клонирование.// М.: Мир. -1984. -480с.

8. Патрушев Л. И. Экспрессия генов. // М.: Наука. -2000. -С281.

9. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. // М.: Мир. -1998. -258с.

10. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. //М.: Мир. -1980. С.450-479.

11. П.Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухин А.С. Химические основы генетической инженерии. //М.: МГУ. -1994. -С.21-24.

12. Якимович О.Ю., Алексеев Я.И., Воронина О.Л., Колобова О.С., Анисимова С.С., Лунин В.Г. Hot Start (Горячий старт) полимеразной цепной реакции при помощи ДНК-лиганда. //Биотехнология. -2002.-Т.6. -С.57-59.

13. Abramson R.D., Innis М.А., Gelfand D.H., Sninsky J J. // In PCR strategies. Academic Press, New York. 1995,- P.39-57.

14. Astatke M., Grindley N.D.F., Joyce C.M. How E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment) distinguishes between deoxy- and dideoxyribonucleotides // J. Mol. Biol. -1995.-V. 270,-P. 1945-1954.

15. Baxter S.M., Greizertein M.B., Kushlan D.M., Ashley G.W. Conformational properties of DNA hairpins with TTT and TTTT loops.// Biochem.-1993.- V. 32. -P.8702-8711.

16. Bebenek,K., Kunkel,T.A. Frameshift errors initiated by nucleotide misincorporation.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1990.-V. 87.-P. 4946-4950.

17. Beese L.S., Steitz T.A. Structural basis for the 3-5 exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism // EMBO J. 1991.- V. 10.- P.25-30.

18. Bernad, A., Blanco, L., Lazaro, J.M., Martin, G. and Salas, M.: A conserved Зл-5' exonuclease active site in prokaryotic and eukaryotic DNA polymerises. // Cell. -1989.-V. 59. -P.219-228.

19. Bernad, A., Zaballos, A., Salas, M. and Blanco, L.: Structural and functional relationships between prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases. // EMBO J. -1987. -V. 6.-P.4219-4225.

20. Birch D.E. Simplified hot start PCR. // Nature. 1996. -V.381. - P.445,446.

21. Blanco, L., Bernad, A., Blasco, M.A. and Salas, M.: A general structure for DNA-dependent DNA polymerises. // Gene. -1991. V.100.- P.27-38.

22. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A, Vermaas E.H., Toole J.J. // Nature. 1992. V.355. -P.564-566.

23. Braithwaite D.K. Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerises // Nucleic Acids Res.- 1993. V. 21.- P.787-802.

24. Brock Т., Freeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. п., a nonsporulating extreme thermophile. I I Journal of Bacteriology. 1969. -V.98.- P.289-97.

25. Carroll, S.S. and Benkovic S.J. (1990). Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. // Chem.Rev.- 1990.- V.90.- P.1291-1307.

26. Chen H., and Gold L. Selection of High-Affinity RNA Ligands to Reverse Transcriptase: Inhibition of cDNA Synthesis and Rnase H Activity. //Biochemistry. -1994.-V. 33.- P.8746-8756.

27. Chou Q., Russel M., Birch D.E., Raymond J.and Bloch W. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. // Nucleic Acid Res. -1992. -V 20.- P. 1717-1723.

28. Cockerill III F.R. Genetic Methods for Assessing Antimicrobial Resistance. // Antimicrob Agents Chemother. 1999. -V.43.- P.199 - 212.

29. Dahlberg M.E. and Benkovic S.J. Kinetic mechanism of DNA polymerase I (Klenow fragment): identification of a second conformational change and evolution of the internal equilibrium. // Biochemistry.-1991,- V. 30.- P. 4835-4843.

30. Dang C., and Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. I I J.Mol.Biol. 1996. - V. 264. - P.268-278.

31. D'Aquila R.T., Bechtel L.J., Videler J.A., Eron J.J., Gorczyca P, Kaplan J.C. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. // Nucl.Acids.Res. 1991. -V. 19. - P.3749.

32. Delarue M., Poch O., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases // Protein Engeneering. 1990. - V. 3. - P. 461-467.

33. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C. and Ellenberger T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2,2 A resolution. // Nature. -1998. V.391. -P.251-258.

34. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. Quality Control of Polymerase Chain Reaction. Diagnostic Molecular Microbiology. // Principles and Applications. Washington: ASM Press. 1993. - P. 160 - 168.

35. Drew H.R., Wing R.M., Takano Т., Broka C., Tanako S„ Itakura K., Dickerson R.E. Structure of a B-DNA dodecamer: conformation and dynamics. // Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. -1981. -V.78. P.2179-2183.

36. Eaton B.E., Gold L., Hicke B.J., Janjic N., Jucker F.M., Sebesta D.P., Tarasow T.M., Willis M.C., Zichi D.A. Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers. // Bioorg. Med. Chem-1997. -V.5. P.1087-1096.

37. Eckert K.A., Kunkel T.A. High Fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase // Nucleic Acids Res. -1990. V. 18. - P.3739-3744.

38. Eckert,K.A., Kunkel, T.A. // PCR Methods Appl. 1.-1991,- P.17-24.

39. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. //Nature. 1990. - V.346. - P.818.

40. Ennis P.D., Zemmour J., Salter L.D., Parham P. Rapid cloning of HLA-A, В cDNA by using the polymerase chain reaction: frequency and nature of errors produced in amplification. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. V.87.- P.2833-2837.

41. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site //Nature. -1996. V. 382. -P. 278-281.

42. Fredericks D.N., Relman D.A. Application of Polymerase Chain Reaction to the Diagnosis of Infectious Diseases. // Clin Infect Dis.- 1999. V.29. - P. 457 - 488.

43. Freemond P.S., Friedman J.M., Beese L.S., Sanderson M.R., Steitz T.A. Cocrystal structure of an editing complex of Klenew fragment with DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1988. V. 85. - P. 8924-8928.

44. Gesteland,R.F. and Atkins,J.F. // The RNA Word. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. -1993.

45. Gilgen M., Hofelein C., Luthy J., Hubner Ph. Hydroxyquinoline overcomes PCR inhibition by UV-damaged mineral oil. // Nucl.AcidsRes. -1995. V.23. - P.4001, 4002.

46. Gold L., Brown D., He Y-Y. // Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. -1997. -V.94 P.59-64.

47. Gold,L., Polisky,B., Uhlenbeck,0. and Yarns,M. Diversity of oligonucleotide functions. // Annu.Rev.Biochem. -1995. -V.64.-P. 763.

48. Gueguen Y., Rolland J.-I., O.Lecompte, P.Azan, G.Romancer, D.Flament, J.-P. Raffin and J.Dietrich Characterization of two DNA polymerases from the hyperthermophilic euryarchaeon Pyrococcus abyssi. I I Eur.J.Biochem. -2001. -V.268. -P.5961-5969.

49. Gutman P.D., Minton K.W. Conserved sites in the 5'-3'-exonuclease domain of Escherichia coli DNA polymerase 11 Nucleic Acids Res.- 1993. -V. 21. P. 44064407.

50. Haase H., Retzel E.F., Staskus K.A. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. -V. 87. P. 4971-4975.

51. Hald M., Pedersen J.B., Stein P.C., Kirpekar F., Jacobsen J.P. A comparison of the hairpin stability of the palindromic d(CGCG(A/T)4CGCG) oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. -1995. V.23. - P.4576-4582.

52. Hansen H., Lemke H., Bodner U. Automated "Hot Start" PCR Using Mineral Oil and Paraffin Wax. // BioTechniques. 1993. - V.14. - P.30-32.

53. Horton R.M., Hoppe B.L. and Conti-Tronconi B.M. AmpliGrease: "Hot Start" PCR Using Petroleum Jelly. // BioTechnique. 1994. - V.16. -P.42-43.

54. Jayasena S.D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. // Clin.Chem. -1999. V.45. - P.1628-1650.

55. Jellinek D., Lynott C.K., Rifkin D.B., Janjic N. High-affinity RNA ligands to basic fibroblast growth factor inhibit receptor binding. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1993.-V.90. -P.l 1227-11231.

56. Jing N., Hogan M.E. Structure-activity of tetrad-forming oligonucleotides as a potent anti-HIV therapeutic drug. //J.BiolChem. -1998. V.273. -P.34992-34999.

57. Johnson K.A. Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. // Annu. Rev. Biochem. -1993. V.62. - P.685-713.

58. Joyce C.M., Steitz T.A. Function and structure relationships in DNA polymerises. // Annu. Rev. Biochem. -1994. -V.63. P.777-822.

59. Kaboev O.K., L.A.Luchkina, A.N.Tret'iakov and A.R.Bahrmand PCR hot start using primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure). // Nucleic Acids Res. 2000. -V.28. - P.94, 95.

60. Kelly R.B., Atkinson M.R., Huberman J.A., Kornberg A. Excision of thymine dimers and other mismatched sequences by DNA polymerase of Escherichia coli I I Nature. -1969,- V. 224.-P. 495-501.

61. Kim В. and Loeb L.A. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase substitutes for DNA polymerase I in Escherichia coli. // Proc.Natl.Acad. Sci. USA. -1995. V.92.- P.684-688.

62. Kim H.S., Smithies O. Recombinant fragment assay for gene targetting based on the polymerase chain reaction // Nucleic Acids Res. -1988. V.16. - P.8887-8903.

63. Kim J.L. Nikolov D.B., Burley S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element. // Nature. -1993. -V.365. -P.520-527.

64. Kim Y., Eom S.H., Wang J., Lee D.S., Suh S.W., Steitz T.A. Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase // Nature. -1995. -V.376. -P.612-616.

65. Knopf, C.W. The herpes simplex virus type I DNA polymerase gene: site of phosphonoacetic acid resistance mutation in strain Angelotti is highly conserved. // J.Gen.Virol. -1987. V.68.- P.1429-1433.

66. Kornberg A., Backer T.A. In DNA Replication. 2nd edit. 1992. Freeman W.N. San Francisco. CA.

67. Kornberg A., Baker T.A. DNA Replication, 2nd edn. 1991 W.H.Freeman, New York.

68. Korolev S., Naval M., Barnes W.M., Di Cera E., Waksman G. Crystal structure of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I at 2.5 A resolution: Structural basis for thermostability // Proc. Natl. Acad. USA. -1995. V. 92. -P.9264-9268.

69. Kuchta T.D., Mizrani V., Benkovic P.A., Johnson K.A. and Benkovic S.J. Kinetic mechanism of DNA polymerase I (Klenow). // Biochemistry. -1987. V.26. -P.8410-8417.

70. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. -1970. V. 277. - P. 680-685.

71. Larder, B.A., Kemp, S.D. and Darby, G.: Related functional domains in virus DNA polymerase. // J.Gen.Virol. -1987. -V.6. -P.169-175.

72. Li H., Cui X., Arnheim N. Direct electrophoretic detection of the allelic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. -V.87. P.4580-4584.

73. Li Y., Kong Y., Korolev S., Waksman G. Crystal structures of the Klenow fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I complexed with deoxyribonycleoside triphosphates // Protein Sci. -1998. -V.7. P.l 116-1123.

74. Lin,Y., and Jayasena, S.D Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer. // J.Mol.Biol. -1997. V.271. -P.100-111.

75. Lundquist R.C., Olivera B.M. Transient generation of displaced single-stranded DNA during nick translation. // Cell. -1982. -V. 31. P.53-60.

76. Lyamichev V., Brow M.A.D., Dahlberg J.E. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases // Science. -1993. -V.260. -P.778-783.

77. Marky, L.A., Breslauer, K.J. Calculating Thermodynamic data for transitions of any Molecularity from equilibrium melting Curves. // Biopolymers. -1987. V.26. -P.1601-1620.

78. Mathews D.H., Sabina J., Zuker M., Turner D.H. Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. // J. Mol. Biol. -1999. -V.288. -P.911-940.

79. Maxam, A.M., Gilbert, W. A new method for sequencing DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1977. V.74. -P.560-564.

80. Nekludova L., Pabo C.D. Distinctive DNA conformation with enlarged major groove is found in Zn-finger-DNA and other protein-DNA complexes. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. -V.91. -P.6948-6952.

81. Newton C.R., Graham A. PCR. // Oxford: Bios Scientific Publishers. 1996. -P. 18 ,19.

82. Ollis D.L., Brick P., Hamlin R„ Xuong N.G., Steitz T.A. Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP// Nature. 1985.- V. 313.-P. 762-766.

83. Patel S.S., Wong I. and Johnson K.A. Pre-steady-state kinetic analysis of processive DNA replication including complete characterization of an exonuclease-deficient mutant. // Biochemistry. -1991. V.30. -P.511-525.

84. Pelletier H., Sawaya M.R., Kumar A., Wilson S.H., Kraut J. Structures of ternary complexes of rat DNA polymerase p, a DNA template-primer, and ddCTP // Science. 1994. - V.264. - P. 1891-1903.

85. Perler F.B., S.Kumar and H.Kong Thermostable DNA polymerases. //Protein Chem.-1996. -V.48. -P.377-435.

86. Persing D.H, Cimino G.D. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. //Principles and Applications. Washington: ASM Press. -1993. -P.105- 121.

87. Polesky A.H., Dahlberg M.E., Benkovic S.J., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Side chains involved in catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli HI. Biol.Chem. -1992. -V.267. P. 8417-8428.

88. Polesky A.H., Steitz T.A., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Identification of residues critical for the polymerase activity of the Klenow fragment of DNA polymerase I from Escherichia coli Hi. Biol.Chem. -1990. V.265. - P.14579-14591.

89. Roberts, J.D., Bebenek,K., Kunkel,T.A. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1. // Science. -1988. -V.242. -P. 1171-1173.

90. Robertson S.A., Harada K., Frankel A.D., Wemmer D.E. Structure determination and binding kinetics of a DNA aptamer-argininamide complex. // Biochemistry. -2000. -V.39. -P.946-954.

91. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S J., Higuchi R.G., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H. A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. // Science. -1988. -V239. -P 487-491.

92. Sandusky P., Wooten E.W. Kurochkin A.V., Kavanaugh Т., Mandecki W., Zuiderweg E.R. Occurrence, solution structure and stability of DNA hairpins stabilized by a GA/CG helix unit. //Nucl.AcidsRes. -1995. -V.23. -P.4717-4725.

93. Sayers J.R., Ecketein F. Propeties of overexpressed phage T5 D15 exonuclease. Similarities with Escherichia coli DNA polymerase 15-3 exonuclease //J. Biol. Chem. -1990. -V.265. P. 18311-18317.

94. Scheffler I.E., Elson E.L., Baldwin R.L. Helix formation by dAT oligomers. I. Hairpin and straight-chain helices. //J.Mol.Biol. -1968. -V.36. -P.291-304.

95. Scheider D.J., Feigon J., Hostomsky Z, Gold L. High-affinity ssDNA inhibitors of the reverse transcriptase of type 1 human immunodeficiency virus. // Biochemistry. -1995. -V.34. -P.9599-9610.

96. Smirnov I., Shafer R.H. Effect of loop sequence and size on DNA aptamer stability. //Biochemistry. -2000. -V.39. -P.1462-1468.

97. Steitz T.A. Structural studies of protein-nucleic acid interaction: the sources of sequence-specific binding. //Quart.Rev.Biophys. -1990. -V.23. -P.205-280.

98. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependent DNA polymerises. // Curr. Opin. Struct. Biol. -1993. -V.3. -P.31-38.

99. Suzuki M., Avicola A.K., Hood L., Loeb L.A. Low fidelity mutations in the O-helix of Thermus aquaticus DNA polymerase I // J.Biol Chem. 1997. -V.272. -P.11228-11235.

100. Suzuki M., Baskin D, Hood L and Loeb L. Random mutagenesis of Thermus aquaticus DNA polymerase I: Concordance of immutable sites in vivo with the crystal structure. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. -V.93. -P.9670-9675.

101. Sweasy J.B. and Loeb L.A. Detection and characterization of mammalian DNA polymerase beta mutants by functional complementation in Escherichia coli. //Proc.Natl.Acad. Sci. USA. -1993. -V.90. -P.4626-4630.

102. Sweasy J.B. and Loeb L.A. Mammalian DNA polymerase beta can substitute for DNA polymerase I during DNA replication in Escherichia coli. // J.Biol.Chem. -1992. -V.267. -P.1407-1410.

103. Tabor S., Richardson C.C. A single residue in DNA polymerase of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. -V.92. -P.6339-6343.

104. Takeuchi,Y., Nagumo,H., Hoshino,H. Low fidelity of cell-free DNA synthesis by reverse transcriptase of human immunodeficiency virus. //J.Virol. -1988. -V.62. -P.3900-3902.

105. Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. // J.Mol.Biol. -1997. -V.272. -P.688-698.

106. Tindall K.R., Kunkel T.A. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase // Biochemistry. -1988. -V.27. -P.6008-6013.

107. Tirasophon W., Ponglikimongkol M., Wilairet P., Boonsaeng V., Panyim S. A novel detection of a single Plasmodium falciparum in infected blood. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1991. -V.175. -P.179-184.

108. Tuerk,C., and Gold,L. Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. // Science. -1990. -V.249. -P.505-510.

109. Villbrandt В., Sagner G., Schomburg D. Investigation on the thermostability and function of truncated Thermus aquaticus DNA polymerase fragment // Protein Eng. -1997. -V.10. -P.1281-1288.

110. Wang K.Y., Swaminathan S., Bolton P.H. Tertiary structure motif of Oxytricha telomere DNA. // Biochemistry. -1994. -V.33. -P.7517-7527.

111. White T.J. Amplification Product Detection Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. //Principles and Applications. Washington. ASM Press. -1993. -P.138 -148.

112. Willis M.C., LeCuyer K.A, Meisenheimer K.M, Uhlenbeck O.C and Koch T.H An RNA-protein contact determined by 5-bromouridine substitution, photocrosslinking and sequencing. // Nucleic Acids Research. -1994.- V. 22.-P.4947-4952.

113. Xodo L.E., Manzini G., Quadrifoglio F., Marel G. Oligodeoxynucleotide folding in solution: loop size and stability of B-hairpins. // J. Boom Biochemistry. -1988. -V.27. -P.6321-6326.

114. Xu Y., Derbyshire V., Ng K., Sun X.C., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Biochemical and mutational studies of the 5 -3 exonuclease of DNA polymerase I of Escherichia coli // J. Mol. Biol. -1997. -V.268. -P.284-302.

115. Xu Y., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Coordination between the Polymerase and 5 -Nuclease Components of DNA Polymerase I of Escherichia coli II J. Biol. Chem. -2000. -V.275. -P.20949-20955.

116. Zaphiropoulos P.G. Non-homologous recombination mediated by Thermus aquations DNA polymerase I. Evidence supporting a copy choice mechanism // Nucl. Acids Res. -1998. -V.26. -P.2843-2848.

117. Zuker M., Mathews D.H., Turner D.H. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. //RNA Biochemistry and Biotechnology. -1999. -P.l 1-43.3 /(93 20 Ь СЪ