Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов"

ГРИНЬ Светлана Анатольевна

СОВРЕМЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

UU3 1G4219

Щелково - 2008 i

003164219

ГРИНЬ

Светлана Анатольевна

СОВРЕМЕННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссер1ации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково - 2008 г

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследоваюльский и 1схноло1 ический институт биологической промышленности» РАСХН

Научный консультант:

кандидат технических наук,

докюр биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ

Официальные оппоненты:

доктор вс1еринарных наук, профессор докюр биоло! ических наук, профессор доктор ветеринарных наук

Рубан Ев1ений Александрович

Смоленский Владимир Иванович Тихонов Игорь Владимирович Колбасов Денис Владимирович

Ведущая организация — ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский инсш1у1 экспериментальной ветеринарии Я Р Коваленко» РАСХН

Защита сосшигся 5 мар!а 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 069 01 при Всероссийском научно-исследовательском и технолошческом институт биоло1 ической промышленное]и РАСХН по адресу 141142, Московская обл , Щелковский р-н, пос Биокомбинат, п/о Ка-шинцево

С дисссршцией можно ознакомился в библиотеке ВНИТИБГ1 Авюреферат разослан « 4 » февраля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ЮД Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы. Современная биотехнология занимав! ведущее положение в системе öhojioi ических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой соствляюг биологические объекты - человек, животные, растения, микроорганизмы и клегки животных и растений

Основы биотехнологии у нас в с фане отражены в работах Иерусалимскою НД (1963), Рабогновой И А (1957, 1974, 1976), Печуркина НС (1978), Помозговой И Н (1979), Дьяконова Л П (1998), Сергеева В А (1983), Бекера М Е (1978), Кофарова В В (1979), Басникьян И А (1992), Бирюкова В В (1985), Рубана Е А (1995, 2000, 2008), Самуйленко А Я (2000, 2008), Калунянцеа К А и др (1987), за рубежом - Monod I (1942), Alba S (1961, 1975), Novick A (1959), Herbert D (1958, 1961), Pert S (1975), Metzner A (1960), HamerG (1982), Janessens J (1984)

Современные промышленные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и биоло! ических процессов, оптимизация которых возможна на клеточном, популяционном, биоценошческом и аппаратурно-технологическом уровне

Успехи о!ечественной ветеринарной науки и практики в проведении специфической профилактики инфекционных болезней связаны с крупными научными открытиями, сделанными в конце XX и начале XXI столетий (Воронин Е С , Сюрин В Н , 2000, Панин А Н , 2001-2006)

Одной из главных задач биоюхнологии является обеспечение животноводства и ве1еринарии эффекшвными и качес!венными препаратами

В течение 40 лет учеными ВНИТИБП накоплен большой опыт в создании новых высокоэффек1 ивных био1ехнологических процессов получения вакцин, диагноешкумов, специфических аншгенов вирусного и бактерийно-ю происхождения, гипериммунных сывороток, методов очистки, концешри-

рования и инактивации микроорганизмов, выделения специфических антигенов и методов их оценки

Впервые в ветеринарной практике разработаны суспензионные методы культивирования в промышленных биореакторах микроорганизмов, клеток животных и вирусов (Рубан Е А , Раевский А А , Соловьев Б В , 1985-2000)

О получении трансгенных сельскохозяйс1венных животных впервые сообщили две лаборатории в США и Германии (Hammer et al, 1985, Brem et al, 1985) В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции Эют метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве (Зиновьева Н А , Эрно Л К , 2006)

Таким образом, использование при разработке новых и совершенствование существующих промышленных биотехнологий производства биопрепаратов с использованием современною высокопроизводительного оборудования (биореакторов, сепараторов, разделительных центрифуг, фильтров и тд) и высокоспецифических иммунобиологических методов будет способствовать повышению их эффективности, а следовательно и улучшению эпи-зоотческой, экологической и социальной обстановки в стране

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является совершенствование и разрабо1ка современных биогехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве ветеринарных препаратов

Для дос!ижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи 1 Разработать с использованием современного оборудования биоюхнолошческие процессы культивирования микроорганизмов, клеток живо1ных и вирусов и репродукции культур клеток, включая сперматогонии с генетическим вектором нужной направленности

2 Разработать современные методы получения специфических антигенов бактерийного и вирусного происхождения при производстве биопрепаратов

3 Разработать метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювашов и других компонентов на первично фипсинизированной или перевиваемой кулыуре клеток при промышленном изготовлении диаг-ноешкумов и лечебных гипериммунизированных сывороток

4 Разработать иммунологические методы оценки диашосгикумов, вакцин и лечебных сыворогок

5 Оценить экологическую, экономическую и социальную эффективность использования предложенных био1ехноло1ий и иммунологических методов

1.3. Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны

- био1ехноло1 ические процессы производства биопрепарате (диагноешку-мов, вакцин, сывороток) и современные иммунобиологические методы анализа при промышленном их производстве,

- впервые разрабо1ан «Набор для рефосиективной ИФА-диагностики инфекционного ринофахеига КРС» (Патент № 2196609 от 20 01 2003 г),

- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностики ринограхеита КРС» (Патент № 2196336 от 10 01 2003 г ),

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21,

- впервые разрабоын меюд получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеюк ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности,

- разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и к ашн-1цС] сыворотки мыши при разрабо1ке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС,

- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первично грипсинизированных культурах клегок при

изюювлении [ипериммунных диагносшческнх и лечебных сывороток (Па-1ент№2184568 от 10 07 2002 г),

- впервые получена I ипериммунная сыворотка для создания пассивного им-мунигега у свиней прошв гемофилсза (серовары I, штамм ГУ-19 и II, штамм 5870), сфспюкоккоза (серовара И, штамм Касли) и пастереллеза (серовари-анты А, штамм 1231, В, штамм 681 и Д, штамм Т-80) с использованием волов и свиней как продуцентов (Заявка на патент № 2006131443 от 1 09 2006 г, заявка на патент № 2007123692 от 20 06 2007г),

- впервые изобрели способ размножения сгромальных клегок, спермагого-ний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адашацию и культивирование вне организма, а гакже интеграцию (вшивание) в них генетического вектора, что позволило получи 1Ь сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленноеги в промышленных масштабах вне орханизма Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложною состава, обогащенных фегапьной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждою этапа уровне (Паюнт № 2196820 от 20 01 2003 г ),

- впервые удалось увеличить выход культур клегок из перепелиных эмбрионов за счет использования циалитов в рационе перепелок («Способ увеличения выхода культуры клеток из перепелиных эмбрионов» Заявка на патент № 2007142025 от 15 11 2007 г )

1.4, Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке промышленной технологии производства биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагноешкумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хлами-диоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных гипериммунных сывороток против ¡емофилеза, пастереллеза и стрептококкоза свиней

Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяю 1ся в ветеринарной практике в порядке широкого произволегвенного опыта за период 2001-2007 гг

За период с 2001 по 2007 г г выпущены для практического применения в АПК России диагностические наборы в количестве против вирусов ИРТ (ИФА) - 1400, бешенства (РДП) - 3500, (РИФ) - 4000 и хламидиоза (РСК) -15000

1.5 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1 Резулыаты усовершенствования и разработки био1ехноло1ических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, кулыур клеток и вирусов и методов контроля, технологических этапов при промышленном производстве ветеринарных биопрепаратов

2 Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных методов и оборудования для разделения, очисти, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов, выделения специфических антигенов и методов их оценки

3 Результаты оценки меюда определения юксичности масляных адъю-вантов и других компонентов для первично тринсинизированной или перевиваемой культуры клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагносгикумов ИФА - для ИРТ, РДП и РИФ для бешенства, ИРТ, ПГ-3 - РСК, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (ге-мофилез, (лрептококкоз и пасгереллез)

1.6. Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных научных конференциях - Москва (1999-2001 гг ), Киев (2001 г), Всероссийской научно-практической конференции - Щелково (2000г), Всероссийской научно-производственной конференции - С тавро-

ноль, (2000г ), Международных научно-практических конференциях - Покров (2000-2002гг), Новосибирск (2002 г), Щелково (2003, 2005, 2006 гг), Москва (2003, 2006 гг), Крым (2007 г), Международной биологической научно-практической конференции - Москва (2000г), Международных науч-но-практичсских конференциях молодых ученых - Щелково (2001, 2002, 2004 г г), заседаниях секции «Ветеринарной биотехнологии» РАСХН - Щелково (2006-2007гг), на заседаниях ученого совета ВНИТИБП - Щелково (2000-2007гг)

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 научные работы, в том числе 7 патенте (из них 3 заявки на патент) и 3 монографии

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 46 1аблиц и 25 рисунков Список литературы включает 604 наименования, из которых 282 огечес!венных и 322 зарубежных авторов В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие Л К Эрнст, Е Э Школьников, Б В Соловьев, В С Иванов, А И Гуславский, ЭЯ Сазанова, софудники отдела молекулярной биологии и иммунологи, оказывали практическую и консультативную помощь, за что приносим им сердечную благодарность Выражаем искреннюю признательность за помощь сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по 1емс

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

2.1.1. Культуры клеток и эмбрионы птиц. В работе использовались перевиваемая линия клеток ПТ-80 (почки теленка) и ТАУЭР, культура кле-¡ок ВГЖ 21/13, первичные кулыуры клегок СП (селезенки поросенка) и семенников, нормальных и обработанных рстровирусом, перевиваемые линии клеток СПЭВ, первично тринсинизированные культуры клеток почки, легкого и трахеи эмбриона коровы Использовали СПФ-яйцо, производимое на ФГУП «Щелковский биокомбинат» Инкубирование яиц проводили в промышленных или лабораторных инкубаторах

2.1.2. Животные. В качестве подопытных животных использовали морских свинок, мышей, кроликов разных возрастов, свиней, овец и крупный рогатый скот

2.1.3. Питательные среды и растворы. Культивирование клеток животных и вирусов проводили на кульгуральных средах Игла, Эрла, 199, полная среда Игла, модифицированная Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco, Панэко), бессывороточная среда Хенкса с 0,5% лактальбумина, сыворотка КРС, феталь-ная сыворотка телят и коров (НПО «Вектор», Панэко) Фосфатно-буферный раствор (ФБР) в различных модификациях, растворы бикарбоната нагрия, трипсина («Дифко»), 2,5% лактальбумин, ферменты, юрмоны, полиэтиленг-ликоль (ПЭГ) разной концентрации, физраствор готовили по стандартным технологиям

2.1.4. Масла и эмульгаторы. Для эмульгирования микробной суспензии использовали масла вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ 1581970) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52 (фирма «Эссо», США) и эмульгаторы ланолин, ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монганид 888 и 103 (фирма «Сенник», Франция)

2.1.5. Штаммы В работе при создании диагностических препаратов и лечебных сывороток использовали фиксированный вирус бешенства, штамм «Щелково-51», вирус ИРТ КРС, штамм «ТК А» (ВИЭВ) В2, вирус хламидио-

за, шгамм «Улеюво», респирагорно-синцитиальный вирус, штамм «Randall», вирус ПГ-3, штамм «ЗКСМ», Pasterella multocida сероварианты А, «штамм 1231», В, «шгамм 681» и Д, «штамм Т-80», Haemophilus pleuropncumoniae серовара I, «шгамм ГУ-19» и серовара II, «шгамм 5870» и Streptococcus suis ссровара И, «штамм Касли»

2.1.6. Технологичекое оборудование и технологические средства контроля Для проведения экспсримснюв по суспензионному культивированию клеючных культур использовали газовый сгерилизаюр пита1ельных сред ЕТО фирмы Pharmatec (Германия), спиннеры магнитного типа с блоком управления (t, рН, р02, рС02) с перемешиванием фирмы Bellco Biotechnology (США), установку для увеличения клеточной культуры фирмы Pharmatec (Германия), счс1чик колоний клеток «Bacfronic» фирмы NBS (США), сосуды Дюара фирмы Forma Scientific, Ins (США) и низкотемпературный холодильник фирмы Forma Scientific, Ins (США), биореакторы АНКУМ-2 (Россия) и «Элсктролюкс» (Швеция), микропроцессорные управляющие комплексы «Биоцикл МП 01 01», микроносители Cytodex-З (НПО «Биолар», г Олайне) и ВИ-3, изютовляемых во ВНИТИБП по разрабо1анной технологии (Па1ент РФ № 1255026)

В процессе суспензионною культивирования микроор!анизмов, клеток и вирусов авюматически конфолировались и peiулировались основные физико-химические параметры - 1емпература (tK), рН, р02, рС02, еН и темпера-iypa стерилизации биорсактора, арматуры и фубопроводов, окислительно-восс1ановительный потенциал, парциальное давление кислорода и углекислот газа в жидкоеiи, концентрация водородных ионов, давление и вакуум

В процессе исследований контролировали стерильность птательных сред и растворов общепринятыми методами на МППБ, МПБ, МПА и среде Сабуро

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах в суспензии и на микроносителях

Глубинное суспензионное культивирование в биореакторе. Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкос!ью 25 л (разработка ВНИТИБП, ИркутскНИИхиммаш) в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления (разработка и изготовление ВНИТИБП и НПО «Промавтомегика»)

Контроль и peíулирование процесса культивирования осущесхвлялся по основным технолт ическим параметрам, приведенным в габл 1

Для культивирования клстк животных и вирусов использовали традиционные питательные среды Индекс пролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 был соогве1с1венно 2-4 и 3-6, а накопление клеток в 1 см3 -0,9-1,3 106

Таблица 1

Основные контролируемые и регулируемые параметры

глубинного процесса культивирования клеток животных в биореакю-

рах

Наименование Единица Текущее Допусшмые

параметра измерения значение отклонения

1 2 3 4

Температура культи-

вирования "С 37,35 ±0,5°С

Температура стерилизации « 122,00 ±1,0°С

Температура в i ер-мост ате « 38,05 +0,3°С

_Продолжение таблицы 1

1 2 3 4

Расход воздуха об/мин 0,5-2,0 ±1%

рН едрН 7,20 ±0,1 ед рН

Скорость вращения

мешалки об/мин 45,84 ±1%

Концентрация С02 % 1,16 ±0,05

Резерв

еН мв 63,60 + 10 мв

р02 кПа 16,01 ±10%

рС02 кПа 5,71 ±10%

Давление в биоре- ати 0,29 ±5%

ак горе

Давление в рубаш- аги 0,128 ±10%

ке

биореакора

Культивирование клеток в биореакторе на микроносителях. При крупномасштабном выращивании кулыур клеток и вирусов основным критерием продуктивности процесса является обеспечение физиоло1 ических потребностей культур клеток, коюрые зависят от применяемого способа культивирования Во ВНИТИБП разработаны процессы крупномасштабного культивирования клеюк в биореакторах различных конструкций с модулем технологической обвязки и блоком автоматического управления основными параметрами (1К, 1СТ> рН, еН, р02, рССЬ, давление, расход воздуха на аэрации и др) На автоматизированных блочно-модульных ус!ановках отработаны оптимизированные режимы выращивания клеток линии ПТ-80 на микроносителе «Су1о<1сх», что позволило сравнить продукшвность клеточных культур в зависимости от различных систем культивирования (табл 2)

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для культивирования клеток животных и вирусов уделяли характерисшкам их консгрукшвных соотношений, материалам узлов биореактора и гидро-

динамическим условиям кулыивирования при гарантированном соблюдении ассишчееких условий при длительном кулыивировании пугем сравнения существующих систем культивирования

Таблица 2

Средняя продуктивность различных систем кулыивирования клеток животных

№ п/п Системы культивирования Количество клеток с 1 мл питательной среды

1 Биорсактор с перемешиванием и протоком среды 5 106

2 Эрлифтный биореактор 5 106

3 Биореакгор с биофильтром и протоком среды 7 106

4 Культивирование в микрокапсулах, микроносителях типа «Су1ос1ех» 107 (перфузия)

5 Биореактор с пористыми ячейками 108 (перфузия)

6 Биорсактор с полыми волокнами 108 (перфузия)

7 Мембранные биореакгоры (керамический модуль) 109 (перфузия)

Для практической реализации процесса кулыивирования клеюк живо шых и вирусов наиболее перспективным является метод культивирования на микрокапсулах и микроносителях

В результате 5-ти кулыивирований перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителе «Сук)с1сх-3» при среднем времени культивирования 72 ч средний индекс пролиферации был равен 2

В процессе культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосредственно в биореакторе При отрабо1ке промышленной тсхнолошческой схемы адсорбции клеюк на микроносителе в 25 л био-рсакторе установлено, что оптимальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе Распределение клеток на по-всрхносш микроносшеля в конце стадии адсорбции через 2,5-3 часа после

добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе При этом количество прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95% Теоретически рассчитанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, составлял 4,2

2.2.2. Основных факторы, влияющие на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах.

Гибель клетк является основной проблемой при глубинном суспензионном культивировании в биореакторах, которая при прочих равных условиях, может быть вызвана гидродинамическими силами под влиянием аэрации с использованием барбогажных устройств Процесс аэрации является необходимым для снабжения клеток достаточных количеством кислорода и углекислого газа Влияние аэрации можно разделить на влияние самих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз I аз-жидкость Основные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков Кроме влияния потоков при перемешивании, образования поверхности контакта газ-жидкос1ь и ее разрушения происходит процесс образования пузырьков при диспергировании газа и, соответственно, переход пузырька в поток жидкости Разрушение пузырька происходит также и при образовании пены

Если пузырьки образуются в месте барботирования, первоначально они не покрыты защишой пленкой поверхностно-активных веществ (ПАВ) В период образования и подъема пузырьков, ПАВ адсорбируется на поверхность пузырька

Дос1ижение критическою положения взаимодействия клеток-пузырьков приводит к немедленной гибели клеток Чем больше молекул ПАВ адсорбируется пузырьком, 1ем насыщенней он становится и клетки, далее адсор-бируясь пузырьком, не подвергаются повреждению Адсорбированные клетки могуг передвигаться по поверхности пузырька Если пузырек полностью насы-

щен, то новые кле!ки больше не смогут примкнуть к нему, а уже адсорбированные пузырьком поднимаются вместе с пузырьком на поверхность, ¡де они могут затем погибнуть, если пузырек лопнет

Скорость 1ибели клеток является простой линейной функцией от интенсивности аэрации Р/У(Р - скорость потока !аза, V - рабочий объем биореактора), для пузырьков диамефом от 4 до 5,5 мм Влияние размера пузырьков и их слияния на скорость 1ибели клеток требует дальнейшего изучения В качестве защиш от Iидродинамических напряжений сдвига использовались ПАВ, бар-богированне и перемешивание Особенно это важно при масштабировании процесса выращивания клеючных культур в биореакторах 2.2.3. Культивирование клеток сперматогоиий.

Предложена и испытана четырехпериодная система суспензионного кулыивирования сперматотоний свиньи

В нервом периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 100 мл, при коэффициенте заполнения 0,5 Посевная доза клеюк составляла 5-106 кл/мл

Культивирование во в юром периоде суспензионного культивирования осуществлялось в спиннере емкостью 200 мл, при коэффициенте заполнения 0,5 Посевная доза клеток составляла 109 кл/мл

В фетьем периоде кулыивирование осуществлялось в спиннере емкостью 500 мл при коэффициенте заполнения 0,5 Посевная доза жизнеспособных клеток сос!авила 107 кл/мл

Прежде, чем приступить к четвертому периоду суспензионного культивирования спермашдов, было проведено концентрирование их заданной дозы на установке ВОР-1 с использованием биофильтра 5и1хет с концентрацией от Ю10 кл/мл до 5x1015 кл/мл, что соответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенеза клеток семенника поросенка После концентрирования суспензионное культивирование осуществлялось на спиннере емкостью 1000 мл, коэффициент заполнения 0,5 Концентрация сперма-птдов сос!авила 5х 1014 кл/мл

Кошролируемыми и регулируемыми параметрами культивирования явились температура, скорость вращения мешалки, рН, еН, рСЬ, рС02 и концентрация сперматогоний Алгориш управления процессом культивирования приведен в табл 3

Таблица 3

Алгори I мы управления процессом суспензионно1 о культивирования сперма ¡идов

Период Параметр Уровень

сперматогенеза

поддержания

Первый период Температура 35+0,5°С

рН 7,0-7,1+0,01

сН -200мв+10%

рОг 40% нас +10%

рСОг 5%нас ± 10%

Второй период Темпера 1ура 35+0,5°С

рн 7,2+0,01

еН -100мв+10%

рОг 40% нас ±10%

рСОг 5%нае + 10%

Третий период Температура 35+0,5°С

РН 7,1+0,01

еН -200мв+10%

рОг 60% нас ± 10%

рССЪ 7%нас + 10%

Четвертый период Температура 35+0,5°С

рн 7,2+0,01

еН -200м в+10%

рОг 60%нас ±10%

рСС>2 7%нас + 10%

Наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе

С целью создания фансгенных свиней оптимизированные парамефы кулыивирования позволяли получать 5-10% живых клеток, включая спермаю-гонии, несущие дополнительную полезную информацию

Таким образом, показана принципиальная возможность поэтапного суспензионною культивирования клеток семенника поросенка в процессе спер-маюгенеза

Кроме того, рабо1ы по оптимизации пша^льных сред на втором периоде и особенно на третьем и четверюм периодах сиермаюгенеза, осуществляемого нами способом суспензионного культивирования, являются более сложными и требуют дальнейшего изучения

2.2.4. Накопление вируса (бешенства, ИРТ, ПГ-3) при глубинном культивировании в биореакторах.

При культивировании вирусов ИРТ, ПГ-3 и бешенства с использованием культур клеток ПТ-80 и ВНК 21/13 в биореакторах по отработанным оптимальным параметрам в отделах вирусологии и молекулярной биологии в 2001-2004 п были получены данные, представленные в таблице 4

Таблица 4

Результаты накопления вирусов при культивировании _в биореакторах суспензионным способом___

Кулыура клеюк Вирус п Титр в

ИФА lg LDio/мл

Г1Т-80 ИРТ 5 1 512 6,9+0,2

ПГ-3 5 1 512 7,4+0,1

ВНК 21/13 бешенства 7 1 512 6,3+0,2

Результаты свидетельствуют о высоком накоплении вирусных антигенов, полученных при оптимальных условиях культивирования в биорсакто-рах суспензионным способом

2.2.5. Культивирование пастерелл, гемофил и стрептококков в биореакторах

В работе использовали производс!венные шшммы Pasteurella multo-cida, А-1231, В-681 и Д-Т-80, Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, шт 5870 и ГУ-19, Streptococcus zooepidenncus, шт П-2082 и Streptococcus suis "Касли", Salmonella typhimunum, шт 415 и Salmonella cholcraesuis, шт

370 Питательные среды для выращивания вакцинных штаммов юювили по дейс1вующим инструкциям на монопрепараты, а их выращивание осуществляли по разрабоганным нами режимам кулыивирования в лабораторных биореакторах АНКУМ-2М, оснащенных системами автоматического кон-фоля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, еН и р02)

В процессе рабош кулыуры пастсрелл, 1емофильных бактерий и стрептококков исследовали по следующим показателям морфология, куль-туральные свойс1ва, ошическая плотность

Кулыуры гемофильных бактерий инакгивировали формалином в конечной конценфации 0,2% при 1смпературе 18-22°С в течение 5-6 суток и концентрировали до концентрации 20 млрд м т /мл методом центрифугирования

Культивирование пас1ерелл проводили реакторным способом на Щелковском биокомбинате в соответствии с режимом, разработанным сотрудниками отдела микробиологии ВНИТИБП Штамм Р пшИоаскт 115-й, полученный из ВГНКИ, культивировали в усовершенствованной питательной среде на основе перевара Хоттингера (ПХ)

Концентрация кулыур производственных штаммов по окончании процесса выращивания (10-12 час) составляла 22 ± 2 млрд м т /мл

Культуры пастерслл инактивировали формалином в конечной концентрации 0,3% при температуре 37°С в течение 24 часов и конценфировали методом центрифугирования на центрифуге ОТР 101 - К1 при q = 12000

В таблице 5 и на рисунке 1 представлена динамика накопления Н р1еигорпеитошае (шг 5870 и ГУ-19) в процессе культивирования

Фаза логарифмического роста начинается с 2-х часов и заканчивается к 5-ти часам культивирования К 6-7 часам культуры вступают в стационарную фазу роста

Таблица 5

Динамика накопления гемофилъных бактерий в процессе _культивирования(п - 3)_

Время культивирования Концентрация микробных клеток (млрд м т /мл)

(час) шт 5870 шт ГУ-19

1 0,7 ±0,2 0,5±0,1

2 1,0 ±0,1 0,9 ±0,1

3 4,5 ±3,6 1,8 ±0,3

4 7,4 ±2,0 6,7 ±1,2

5 9,3 ± 0,2 9,7 ±1,6

6 10,4 ±0,9 11,9 ±2,1

1 8 10,7 ±0,7 11,9 ±2,1

10,7 ±0,7 11,9 ±2,1

Рис I Динамика накопления 1емофил шгамм ГУ-19 (1) и штамм 5870 (2) в процессе кулыивироваиия

Культуры штаммов 5870 и ГУ-19 имели типичную для своего вида микроорганизмов морфологию, культуральные и биохимические свойс1ва У хемофильных бактерий наблюдали выраженную капсулу

Результаты исследований оiражены в табл 6, из которой видно, чю при управляемом по еН, pH, р02 и концентрации глюкозы культивировании пастерелл, шт 115, длительность фазы приспособления как по оптической

плошосги, гак и по количеству живых бактерий значительно короче, максимальная удельная скорость роста выше, чем при культивировании по методике выращивания пас!ерслл, предложенной ВНИВИП (контроль) Максимальное накопление жизнеспособных бактерий при управляемом выращивании наблюдалось через 8 ч роста (по методике ВНИВИП - через 10-12 ч) и составило в среднем 38,4 млрд/см3, что почти а 3 раза выше максимального накопления, полученного при контрольном режиме выращивания (13,7 млрд/см3) Изучение морфоло!ии и ультраст рук туры пастерелл позволило сделать вывод о наличии коррелятивных связей между режимом, продолжи 1ельностью культивирования и анатомическими особенностями микробных клеток в популяции

Кулыуральные и биохимические свойства были типичными для пастерелл цнамма 115 при pocie в бульоне наблюдалось равномерное помутнение среды, на агаре - мелкие просвечивающие колонии На средах Гисса отмечалась ферментация глюкозы, сахарозы, сорбита, маннита без образования газа и огсугс1Вис фермешации лактозы Пас1ереллы образовывали индол и сероводород

С целью повышения продуктивности процесса получения бактериальной массы использовали непрерывное (хемосгашое) культивирование

Условия кулыивирования - температуру, рН и р()2 поддерживали на оптимальных, ранее определенных нами уровнях

При другом режиме выращивания (скорость разбавления - 0,7 1/час и So= 3 г/л) пасюреллы имели более крупные формы, чем при скорости разбавления 0,4 1/час, в основном, эллипсоидные формы

Во всех исследованных режимах непрерывного культивирования рост пастерелл был лимширован шюкозой, а биохимические свойства со-огветс!вовали паспортным данным

Таблица 6

Показатели процесса периодическою культивирования пастерелл, иламма № 115

Условия кулы ивирования Показатели

Продолжительность фазы рос-га (ч) Максимальная удельная скорость роста (ч ') Максимальное на копление, млрд/см3

ла1 -фаза

опт пл живые микр кл 0111 пл живые микр кл опт пл живые микр кл оиг пл живые микр кл

Усовершенствованная 1,00 1,00 3,25 3,50 1,20 1,68 1,25 42,10

питательная среда на 0,25 1,00 3,25 3,00 1,38 1,47 16,50 42,10

основе ПХ и 0,60 2,00 3,05 2,70 1,23 1,73 20,50 48,90

экспериментальный 0,55 1,75 3,05 2,00 1,35 1,61 16,40 20,60

режим

Среднее значение 0,60 1,44 3,15 2,80 1,29 1,62 16,16 38,40

Конроль (меюдика 2,25 2,40 3,50 4,10 0,92 1,15 4,75 16,50

ВИИВИП) 2,35 1,90 2,90 3,55 1,15 1,15 4,80 10,90

Среднее значение 2,30 2,15 2,15 3,82 1,03 1,15 4,81 13,70

После 4 ч культивирования сальмонелл, шг ТС-177 по ранее действовавшей НТД наблюдалась фаза замедления роста Подключение мембран-ною биологическою реактора (МБР) позволило продли 1ь рост сальмонелл еще на протяжении 8 ч При этом накопление жизнеспособных сальмонелл увеличилось в 3-4 раза Поддерживание оптимального режима культивирования сальмонелл в МБР позволило еще на 4 ч продлить активную фазу роста и увеличить концентрацию жизнеспособных сальмонелл еще более чем в 7 раз Коэффициент разбавления питательной средой при этом поддерживался в пределах 0,5-0,7 1/ч

2.2.6. Современные оборудование и методы очистки, концентрирования и инактивирования биоматериала антигенов, вирусов и микроорганизмов

Использовались высокоэффеюивные аппараты для разделения, очистки и концентрирования полидиспсрсных жидких систем методами сепарирования, ценфифу1 ирования, фильфования и улырафильтрования (новые жидкостью сепараторы и осадительно-фильгрукнцие центрифуги на бесприводной основе с высокими 1ехнико-экономическими показателями) Теоретически и практически подтверждено, что применение фильтрующих перегородок в роюре и осадигельно-филырующей ценфифуги и сепаратора-разделителя позволяет улучшив качество разделения жидких биоло!ических систем

Очистка и концентрирование вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита. При проведении физико-химических исследований структуры вирусов, создания диагностикумов, получения специфических антисыво-рошк, проведения генно-инженерных работ необходимы очищенные и кон-

цен фированные прспарахы

С целью определения оптимальных условий очистки и концентрирования культурального вируса бешенства был испытан ряд методов

Определяли условия осаждения вируса ПЭГ с молекулярной массой 1000, 3000, 6000 и 20000 Д в различных концентрациях 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0

Для концентрирования вируса применяли метод ульграфильтрации, позволяющий свести к минимуму необходимость использовать доро1 остоящсе оборудование Он дает возможность работать с большими объемами вирусного маюриала Метод основывается на 01деление вируса от кульгуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенной степенью пористости

Наиболее широко применяемым способом получения вирусов в чистом виде является центрифугирование дифференциальное, равновесное и в градиенте пло1нос1И При высокоскоростном центрифугировании (90 шс §) полное осаждение вируса происходило за 6 часов

Для концешрирования вируса бешенства использовали равновесное центрифугирование на «подушке» сахарозы (55%), хлористого цезия (22%) и

1 лицсрина (80%) Проводили центрифугирование при 161 тыс § на ульграцен-трифуге в течение 4 ч

На основании полученных результатов была составленна схема получения очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства По предлагаемой схеме очистки и концентрирования вируса бешенства удается

получить высокоочищенный на 99,99% вирус

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса

ИРТ КРС были испьианы те же принципы выделения вирусов из суспензий

Результаты получены аналогичные как при выделении вируса бешенства

Инактивация вируса бешенства. В работе был использован вирус

бешенства, штамм «Щелково-51», репрдуцированный в культуре клеток

ВНК-21/13 Вирус инактивировали при различной температуре, фенолом и (}-

пропиолактоном

Термическая инактивация проводилась путем прогревания при 56°С, что оказывало влияние на гемагглютинирующую активность вируса Через 3 ч после начала обработки титр гема!глютинирующей активности снижался с 1 16 (в исходном вирусном материале) до 1 12 К 4-му часу инактивации он снижался в 2 раза до 1 8, к 5-му часу - до 1 4 На комплементсвязы-вающую и преципитирующую акшвности прогревание при температуре 56°С в течение 6-ти часов не оказывало влияния Биологические свойства вируса, помещенною в условия температуры 62°С, проверяли через 5, 10, 15 и 30 мин и далее через каждые 30 мин до 4 ч инкубации, а затем через 5 и 6 часов с момента начала обработки Было установлено, что в результате воздействия юмпературы 62°С инактивация вируса шла быстрее, чем при 56 С Уже через 45 мин происходила нолная потеря инфекционности вируса бешенства Кроме того, наблюдалось резкое снижение гемаплютини-рующей активности антигена Тигр гемагглютинирующей активности снижался с 1 16 в исходном вирусе до 1 4 При дальнейшем протревании титр гемагглкминирующей активности постепенно снижался и через 210-240 мин после начала обработки был равен 0 Комплементсвязывающая и

прсципи гирующая активности вируса в течение всего опыта оставались неизменны Как видно из приведенных данных, скорое 1Ь тепловой инактивации препаратов культурального вируса бешенства зависела от 1емпературы

При изучении влияния химических факторов инактивации, в частности фенола на комплементсвязывающую активность вируса бешенства было установлено, что активное!ь вируса в эгой реакции, по сравнению с инактивированным вирусом, в течение 72 ч не изменялась при 4°С С повышением температуры до 20°С через 24ч инкубации наблюдалось снижение титра комплемснтсвяывающей активности в 2 раза Через 48 и 72 ч дальнейшего понижения штра не наблюдалось как при 20°, гак и при 37°С

Концентрация фенола и температура инактивации не влияли на титры гемапрлютинирующий активности вируса бешенства Титры сохранялись в пределах 1 12-1 16

Титр преципширующей активности зависит от увеличения концентрации фенола Если через 24 ч инкубации при концентрации фенола 0,25% 1итр не изменялся и был равен исходному 1 28, то при добавлении фенола в концентрации 0,5-, 0,75- и 1,0% титр снижался до 1 10, 1 8 и 1 4, соответственно Тигр преципишрующей активности, снижающийся с 1 28 до 1 4 при обрабо1ке 1,0% фенолом в течение 24 ч, далее оставался неизменным При обработке прспараюв вируса бешенства всеми выше указанными концентрациями фенола преципитирущая акшвность снижалась к 72 ч до 1 12-1 4

На основании полученных данных были установлены оптимальные режимы инакшвации вируса бешенства фенолом 0,75% концентрация при температуре 20°С в течение 48 ч или при 37°С в течение 24 ч

Резулыаш опьпов показали, что иммуногенность препаратов, инакги-вированных 0,75% фенолом при температуре 20°С в течение 48 ч, в 2 раза превышает иммуногенность препаратов, обработанных фенолом в такой же концентрации при 37°С и индекс иммуногснности соответственно равнялись 0,68+0,07 и 0,30+0,10 (п=9)

При обработке полученною препарата гемагглютинина ß-пропиолакто-ном в lex же условиях, что и цельный вирус, учитывали период полураспада ß-пропиолактона в водном растворе (при 37°С 24-32 мин, 25°С 210 мин, 4°С от 16 до 20 часов) ß-пропиолакгон в максимальной концентрации 1 2000 при температуре 37°С в ишервале 15-120 мин не влиял на ГА-активность гемагг-люшнина, которая оставалась на уровне исходной При инактивации вируса при 4° и 20°С [акже не наблюдалось потери ГА-активности белковою компонент в течение всего срока наблюдения Ранее было установлено, что используя ß-пропиолактон в концентрации 0,05% (1 2000), можно получить неинфекционные и иммунш еннме препараты вируса бсшенс1ва

На основании полученных данных предположили, что ß-npo-пиолактон, используемый для инактивации вируса бешенства в максимальной концсшрации 0,05%, взаимодействует с основаниями РНК, лишая тем самым вирус инфекционности Были проведены опыты по выяснение взаимодейс!вия ß-пропиолактона с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями РНК аденози-ном, гуанозином, ци1идином и уридином

Контроль за ходом реакции осуществляли хроматографически и спек-фофотометрически (по изменению характера спектра реакционной смеси во времени) при длине волны 200-350 нм В качестве контрольного спектра использовали спектр немодифицированного аденозина

Для характерношки продукта реакции ß-пропиолактона с аденозином полученное вещество выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии в системах А, В и С Вещество характеризовалось хроматографиче-ской подвижностью Rf на Si02

ß-пропиолактон инактивирует кульгуральный вирус бешенства полностью и необратимо На выделенный сфуктурный компонент вируса бешенства - гемагглютинин, ответственный за иммуноюнноегь, ß-пропиолактон не оказывает влияния Он взаимодейс1вует с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями вирусной РНК Изменения в РНК, вызываемые взаимодействием ß-пропиолактона с основаниями, приводит к се инактивации

2.2.7. Биологические свойства культурального вируса бешенства

Изучены биологические свойства культурального вируса бешенства,

репродуцированною в кулыуре клеток ВНК-21/13, ппамм «Щелково-51» 1 ема1 глютинирующие (ГА), комплеменгсвязывающие (КС), преципити-руюшие (Пр) и иммуногенные (Им), а также влияния таких физико-химических факторов, как рН среды и обработка вируса ферментами (РНК-аза, трипсин)

Для сохранения биологических свойств вируса бешенства оптимальными являю1ся пределы рН 6,0-8,0 Вирус обладает комплементсвязываю-щей активностью при рН 6,0-8,0, гематглюшнирующсй - при рН 3,0-9,0, прс-ципитирующей - при рН 5,0-9,0

Препара1Ы вируса обрабатывали трипсином в концентрации 0,05, 0,10 и 0,15% и РНК-азой в концентрации 0,05, 0,02 и 0,01% Инкубацию проводили 30 мин при 37 С Затем в обработанных ферментами препаратах вируса определяли гитр инфекционности, комплеменгевязывающей, 1емагглюгинирую-щей и нреципитирующей активности

Трипсин и РНК-аза оказывают влияние на инфекционноегь вируса бешенства Трипсин в концентрации 0,05% практически не снижает инфекци-онноегь вируса С повышением концентрации фермента до 0,10% титр инфекционности снижается на 1,75 а при обработке вируса 0,15% трипсином происходит снижение его до 0 РНК-аза существенно снижает инфекцион-ность в пределах более 2 ^ (с 6,25 до 4,00 при всех изученных концентрациях

Оба эти фермента не влияют на его гемагглюгинирующую и преципитирующую активность РНК-аза не снижает также и комнлементсвязывающую активность, в го время как трипсин разрушает ее

2.2.8. Очистка иммуноглобулина

Иммуноглобулин О из сыворотки крови животных выделяли осаждением 33 % сернокислым аммонием Полученную глобулиновую фракцию сыворотки

обессоливали 1ельфиль фацией на сефадексе 0-25 в колонке К 26x70, уравновешенным 10 мМ грис-11С1 буфером, рН 8,0

Выход фракций контролировали спектрофотометричееки по оптической плотности при длине волны Х.=280 нм (ОПгхо) и объединяли фракции с ОП2«о больше 1,0 Затем объединенные фракции наносили на ОЕАЕ-Тоуореат! 650М, уравновешенный 25 мМ грис-НС1, рН 8,3 (колонка К 26x40)

Выход иммуноиюбулина в КРС определяли, исходя из величины ОП2«о объединенного элюата, по формуле

ОП2Ю

Выход 1цО в М1 = Ух-------- ,

1,31

I де V - объем обьединенно! о элюата, ОПгм- оптическая плошоегь объединенно1 о элюата, 1,31 - экс 1инкция раствора ^ в с концентрацией I мг/мл Выход очищенного иммуноглобулина составил 160 мг/мл Чистоту препарата ^ в проверяли диск-электрофорезом в полиакриламидном геле (7,5 %) в 1 рис-НС1 буфере, рН 8,3

Однородность и специфичность проверяли иммуноэлектрофорезом в слое 1 % 31 ара «Дифко» на веронал-мединаловом буфере, рН 8,6

Преципширующую активность определяли по Оухтерлони Полученный нами препарат давал полосу преципитации в разведении 1 256-1 512 и выше

Таким образом, методом ионообменной хроматографии, получен высоко-очищенный препарат ^ О КРС, необходимый для последующей гипериммунизации кроликов, с целью получения атисыворозки к [ц С КРС

2.2.9. Разработка метода определения токсичности масляных адъю-вантов и их компонентов

При исследовании токсичности различных масляных адъювантов и их компоненюв использовали разработанный нами способ в сравнении

со способом с использованием белых мышей, как более близкий к количественному способу оценки токсичности В результате проведенных исследований получили данные юксичност и различных масел, эмульга-юров и эмульсий, используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах и культуре клеток СП, которые представлены в таблицах 7-9

Таблица 7

Токсичность эмульгаторов при исследовании на мышах и

культ уре клеюк в монослое

№ Наименование Результаты оценки на мышах ТЦДя/мл

пп эмулыатора АПМТ, г ОПМТ,% на культуре клеток (1ц)

1 2 3 4 5

I Ланолин 6,6+0,4 70,2+4,5 2,1+0,2

2 СорбиIанололеа г 6,1+0,3 59,4+3,2 3,4+0,1

1 2 3 4 5

3 Монтанид 888 7,1+0,4 75,5+4,3 1,6±0,1

4 Монтанид 103 7,3+0,4 77,7+4,3 1,5+0,1

5 Физ раствор (кош роль) 9,4+0,5 100,0+2,0

Таблица 8

Результаты рсактоюнности масла на мыша!ах и его токсичность на __культуре клеток в монослое_

№ пп Наименование масла Процент о1ека опытных лап (М+ш), п = 5 ТЦД5о(^)на культуре клеток СП

1 Вакцинное 83,0+2,0 1,8±0,2

2 Основа РМ 155,0+10,0 3,1+0,3

3 Основа АМГ-10 165,0+7,0 3,4+0,3

4 Ангарское 80,0+2,0 1710 2

5 Маркол 52 31,0±4,0 1,1 Ю,1

Таблица 9

Резулыагы реакгогенносш масляных компонентов в опыте на

мышах и их токсичность на культуре клсгок СП

№ ли Наименование компонента масло+эмуль-1атор Соотношение компонентов в адыованте, % Процент отека опытных лап мышеи (М + 111, п = 5) тщыв на кульгуре клеток СП

I 2 3 4 5

1 Ангарское/ монганид 103 90/10 68,0+5,0 1,6+0,1

2 Лшарское/ланолин 85/15 68,0+4,0 2,0+0,2

3 Ангарское/ сор-би ганолеат 90/10 83,0+6,0 3,1+0,3

4 Маркол 52/ монтанид 103 90/10 40,0+4,0 1,4+0,1

5 Маркол 52/ланолин 8/5 41,0+4,0 1,8+0,2

6 Маркол 52/ сорбит анолеат 90/10 46+3,0 3,0+0,3

Из полученных результате видно, чго между двумя способами оценки токсичности масляных адъювантов и их компонентов, с использованием белых мышек и кулыуры клеток СП в пробирках с монослоем, существует корреляция Причем способ оценки токсичности с использованием культуры клеток СП в монослое в пробирках на один-два порядка чувствительней, чем в случае исследований на белых мышках

2.2 10. Получение специфических гипериммунных сывороток для изготовления диагаостикумов.

При получении специфических гипериммунных сывороток с целью из-гоювления из них диагноешкумов использовали масляные адъюванты Отбор

менее токсичных, но обладающих высокой иммунизирующей активностью, проводили с использованием разработанного нами метода на кульгуре клеток СП в монослое В таблице 10 приведены данные активности гипериммунных сывороток, полученных с применением оюбранных адъювангов, при иммунизации вирусами ИРТ, ПГ-3, бешенства, РС, ящура, а также хламидиозными антигенами

Таблица 10

Активности гипериммунных сывороток с вирусными антигенами

Вид животных Кол-во жив0111ых Антигены Гиперимму иные сыворот ки

Методы Активность

КРС 5 ИРТ ИФА 25600+600

КРС 5 ПГ-3 ИФА 800+20

Овцы 63 Бешенство РСК 480+7

КРС 5 РС ИФА 800^-20

КРС' 5 Ящур, тип А2Д РН 3,2+0,1 1е

Овцы 45 Хламидиоз РСК 1 256-1 1024

Примечание - с вирусом ящура изучали иммуногенную активность вакцин с масляным адъювангом при ревакцинации живо!Ных

Резулыагы исследований позволили получить высокоэффективные специфические 1 ипериммунные сыворотки для изготовления диагносгикумов с использованием отобранных адъювантов на разных видах животных без заметных клинических изменений

2.2.11. Получение лечебной ассоциированной гипериммуной сыворотки против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза свиней с использованием различных видов животных.

В последние тоды за рубежом изготавливается целый ряд вакцинных и сывороточных препаратов против юмофилеза, стрептококкоза и пастереллеза, в том числе и ассоциированных

В нашей сгране сывороточные препараты против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза не разработаны

Значительный экономический ущерб, наносимый свиноводству гемофиле-зом, пас1ереллезом и сфсптококкозом, и огсутмвие эффективных специфических средств лечения и профилакшки эшх заболеваний послужило основанием для выполнения работы по разработке нового препарата - гипериммунной сыворотки против гемофилеза, пастереллеза и сфептококкоза свиней

Исследования по офаботке схемы I ипериммунизации и получению опытных партий сывороток прошв 1смофилеза, паыереллеза и сфептококкоза свиней проводили на Армавирской биофабрике

Для этого были сформированы пять фупп свиней по пять тлов в каждой Гицсримму низанию свиней проводили пуюм внутримышечных инъекций возрастающих доз инактивированных концентрированных антигенов (гемофи-лезного, пасгереллезного и сфстиококкозного) с ишервалом в 2-3 дня При этом антигены вводили раздельно в разные участки тела животного Через 7-10 дней у свиней брали кровь, получали сыворо!ку и определяли ее активность в реакции аплкиинации (РА) Были испытаны пять схем, отличающихся дозой антигенов и количеством инъекций (таблица 11)

Как видно из таблицы 11 схема 1 гипериммунизации свиней путем 10-ти внуфимышечных инъекций в возрастающих дозах инактивированно1 о концен-фированного пастереллезного и гемофиллезного антигенов в общем количестве по 1000 млрд микробных тел (м г) каждого антигена, стрешококкового - в общей дозе 1255 млрдмт позволяв 1 получить сыворотку с титрами антител в РА к Р тиИоск1а А, О - 1 400, В - 1 800, к Н р1еигорпситопгае 5870 - 1 320, ГУ - 19 - 1 640, к Би сЬо1егаеыл5, Касли - 1 200 (таблица 12)

Увеличение числа инъекций больше 10-ги и количества антигенов пастереллезного и Iемофилезного больше 1000 млрд м г, стрептококкового больше 1255 млрд м т (схема 2, 3) не привело к дольнейшему повышению титра анти-1ел сыворотки в РА

Увеличение количества ашиюнов и числа инъекций нецелесообразно, так как оказывает дополни 1сльную нагрузку на иммунную систему продуцентов и не выгодна с экономической точки зрения

Таблица ! 1

Схема гипериммунизации свиней_

Схема

1 2 3 4 5

Количество инъекций 10 11 12 8 7

Количество (млрд м т )

Пасгереллы 1000 1220 1470 645 510

Гемофилы 1000 1220 1470 800 700

Стрептококки 1255 1475 1725 1000 800

Таблица 12

Активность сывороток против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней, полученных разными способами, в РА

Схема

1 2 3 4 5

Активность сыворотки в РА

Р тиИос1с1а А 1 400 1 400 1 400 1 400 1 200

В 1 800 1 800 1 800 1 800 1 400

И 1 400 1 400 1 400 1 400 1 200

Н р1еигорпеитопте 5870 1 320 1 320 1 320 1 320 1 160

ГУ-19 1 640 1 640 1 640 1 640 1 160

81г сЬоЬгаевШБ, Касли 1 200 1 200 1 200 1 200 1 100

Уменьшение числа инъекций до 8-ми (схема 4) при уменьшении общего количества вводимых антигенов пастереллезного до 645 млрд м т, гемофилез-ного - до 800 млрд м т , сфспгококкового - до ЮООмлрдм I , не привело к снижению тигра антител в сыворотке

Уменьшение числа иньекций до 7-ми (схема 5) при уменьшении общего количества вводимых ангшенов пастереллезного - до 510 млрдмт, гемофи-лсзною - до 700 млрд м т, стрептококкового - до 800 млрд м т привело к снижению т и фов ангител в полученной сыворотке в 2 раза

Таким образом, сравнительная оценка 5-ти схем т ипериммунизации свиней для получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастерсллсза свиней позволило предложить схему гипериммунизации путем 8-10-ги инъекций антигенов в общей дозе пастереллезного - 645-1000 млрдмт, гемофилезного - до 800-1000 млрдмт и стрептококкового - 1000-1255 млрд мтс интервалом в 2-3 дня В виду разной реактивности продуцентов целесообразно проводить гипериммунизацию по циклам 1-й цикл - 8 инъекций, 2-й цикл - 2 инъекции Животных, давших активную сыворотку после 1-го цикла, переводят в эксплуатационную труппу, остальных подвергают второму циклу т ипериммунизации, что экономически оправдано

Предложенный способ апробирован с положительными результатами в произволе! венных условиях на Армавирской биофабрике

Разработку способа получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней, включающего приготовление антигена из инактивированных и концентрированных культур Р multocida, серо-варианты А, В и Д, Н pleuropneumoniae, серовары I и И, Streptococcus cholerae-suis серовара II (штамм Касли), фундиммунизацию и гипериммунизацию возрастающими дозами антигена с последующим крововзятием и выделением целевого продукта, отличающегося тем, что в качестве продуцентов использовали волов, при этом гипериммунизацию проводили 7-10-кратными внутримышечными инъекциями в общей дозе каждого антигена 1800-2400 млрд мтс интервалом 2-3 дня, а грундиммунизацию осуществляют подкожно в разные участки

тела двукрашо сначала по 10-15 млрд м т, а через 14 дней по 20-25 млрд м т с добавлением 10 см3 гидроокиси алюминия Промышленные серии лечебных сывороток на волах имели активность, гараншруютцую высокую лечебную эффективность

Титры антител зависели отантитена и индивидуальных особенностей продуцентов Средние титры ант и тел в РА в отношении Н pleuropneumomae (5870 и ГУ-19) и Str choleraesuis (Касли) составляли 1 474 (1 80-1 640), 1 640 (1 3201 1280) и 1 200 (1 100-1 400), соответственно

Наибольший штр в РПГА наблюдался в сыворотках в отношении Р multocida, сероварианты В 1 700 (1 320-1 1600) Титры антител в отношении серовариантов А и Д были 1 130 (1 40-1 256) и 1 139 (1 64-1 240), соогветсшен-но

В процессе экеплуагации 10 продуцентов было получено 3 варианта сыворотки-сырца, которые были объединены в одну опытную серию объемом 75 л

В таблице 13 представлены гитры антител в РА опытной серии сыворотки в сравнении с показателями ТУ

Таблица 13

Титры антител в РА опытной серии гипериммунной сыворожи

Р multocida Н pleuro-pneumoniae Str cholera-su1s

Штамм А В Д 5870 ГУ-19 Касли

Опытная серия 1 120 1 512 1 120 1 320 1 320 1 300

Показатели ТУ 1 32 1 128 1 32 1 100 1 100 1 100

Контроль полученной опытной серии гипериммунной сыворотки показал соответствие показателям ТУ на препарат

2.2.12. Изготовление диагностических наборов в промышленных условиях

В течение последних 7 лет по нашим разработкам во ВНИТИБП были изготовлены и выпущены для пракшческого применения наборы для диагностики бешенства в РДП, хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК, инфекционного рино трахеита КРС «Диарин-С» в ИФА,а также флюоресцирующий тлобулин Количество выпущенных препаратов за 2001-2007 гг представлено в таблице 14 Рекламаций на выпущенные препараты получено не было

Экономический и экологический эффект. Улучшение экологической обстановки происходило за счет уменьшения опасности распространения инфекционного маюриала с учетом усовершенивования промышленных технологий изгоювления биопрепаратов и своевременной улучшенной диагностики, приводившей к более быстрому и точному диа1 нозу инфекций ИРТ, ПГ-3, бешенства, хламидиоза, а 1акже за счет проведения своевременных срочных вете-ринарно-санитарных мероприяшй и своевременного лечения животных с использованием ассоциированной лечебной сыворотки против пастереллеза, ге-мофилеза и стрепгококкоза

Таблица 14

Объем выпуска диагноешкумов за 2001-2007 1Г

Наименование диаг-постикумои 2001 г 2002 г 2003 г. 2004 г. 2005 г. 2006 г. 2007 г

Набор для диагност и-ки бешено пш в РДП 374 500 270 456 415 402 443

Глобулин флюоресцирующий 330 500 485 616 520 71 598

Набор для лил! пос| и ки хламидиом с/к ж-х 2150 3100 2400 2693 2000 649 2306

Набор для диагностики ИРТ КРС ИФА «Диарин-С» 200 229 230 408 120 120 120

Экономический эффект от использования изгоювленных препаратов в ветеринарной практике только за 2007 г составил 2086, 25 гыс руб (см габл 15)

Расчет годового экономического эффекта выполнен в соответствии с Методическими рекомендациями по определению годового экономического эффекта от использования результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских pa6oi в АПК, М , 2007 г

Таблица 15

Годовой экономический эффект о г снижения себестоимости

производства диагностических препаратов

Наименование А Зп руб/наб Количество Годовой эко-

продукции наборов ном эффект, тыс руб

1 Набор компонентов

для диагностики бе-

шенства ЖИВ01НЫХ в

РДП 805,25 373 300,36

2 Глобулин флюо-

ресцирующий для ди-

31 ностики бешенетва

живошых 198,86 588 116,93

3 Набор для диа1-

ностики хламидиоза

с/х животных в РСК и

РДСК 815,72 2046 1668, 96

Всего 2086,25

3. Выводы

3 1 Усовершенствованы и разработаны с использованием современного оборудования и технических средств механизации и автоматизации биотсхноло! ические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов при производстве высокоэффективных диагно-стикумов в ИФА, РИФ, РДП и РСК для нужд ветеринарии

3 2 Использование современных автоматизированных биореак-горов и методов оптимизации технологического процесса позволило при суспензионном и псевдосуспензионном кулыивировании культур клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 увеличить получение их конценфации до 3 млн кл в мл

3 3 Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирусы (бешенство - в штрах 1089ТЦД5о, ИРТ - 1 0*ТЦД5о) и микроорганизмы (пастереллы, I емофилы и стрептококки до 20-40 млрд кл в мл)

3 4 Использование высокоэффективных методов и аппаратов (жидкостных сепараторов и осадительно-фильтрующих центрифуг на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателям) для разделения, очистки и концентрирования вирусов и микроорганизмов методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультроцен-грифугирования позволило получать очищенные специфические антигены при промышленном производстве биопрепаратов (диагностикумы, лечебные сыворот ки и др )

3 5 Теоретически обосновано и практически подтверждено наличие гепоюгического объема гибели клеток линии ВНК 21/13 в биореакторах при суспензионном культивировании в зависимости от уровня аэрации, размера пузырьков, силиконового пеногасителя (пропинол Б-400), а также при культивировании на микроносителях и установлена константа 1ибели клеток, которая в зависимости от времени культивирования колебалась от 2,7x10 6 сек"1 до 22,3x10 6сск"'

3 6 Установлены условия культивирования стромальных клеток тестикул (семенников) мужских половых зародышевых сперматогоний, снерматоцитов и сперматозоидов с интегрированным (вшитым) в них генетическим вектором Размножение осуществлялось в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного ро-

i этого скота, энерюгическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оши-мальном для каждого этапа уровне Способ позволяет получить сперматозоиды с генсшческим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма, что предусматривает дальнейшие исследования

3 7 Разработан высокоэффективный способ оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов с использованием первичнот-рипсинизированных и перевиваемых культур клеток в 10-100 раз по чувст-вшельности выше, чем с использованием белых мышей, что позволило повысить эффективность биопрепаратов при их применении при промышленном производс i ве лечебных сывороток и диагносгикумов (бешенство, ИРТ, хламидиоз, респираторно-синци гиальная инфекция, ящур и другие) в процессе изюговлении гипериммунных сывороток

3 8 Разработаны методы очистки, концентрирования и инакш-вации вирусов бешенстаа и инфекционного ринотрахеита и изучены их биоло1 ические свойстаа, которые сохранялись при получении специфических ангшенов, используемых для получения i ипериммунных сывороток при промышленном производстве диагносгикумов

3 9 Усовершенс1вованы способы получения и очистки специфических анги1ел и моноклональных антител при промышленной технологи производства диагносгикумов для практического применения 4. Практические предложения

1 Разработан способ оценки токсичности масляных адъюванюв и других компонентов с использованием первично трипсинизированных и перевиваемых культур клеток, утвержденный академиком РАСХН А М Смирновым (Патент №2184568 от 10 07 2002г)

2 За период с 2001 по 2007 гг выпущены для практического применения в АПК России наборы для диагностики ИРТ КРС в ИФА - 1400, бешенства в РДП - 3500, в РИФ - 4000 и хламидиоза в РСК - 15000 наборов 3 Разработаны и утверждены

-Инструкция по изюювлению и контролю набора для ретроспективной иммунофермснтной диагностики инфекционного ринотрахеига крупного рогатого скота, утвержденная 10 04 2001 г директором ВНИТИБП

-Инструкция по изготовлению и контролю набора для ранней имму-ноферментной диагностики инфекционного ринограхеита крупного рогато-I о скота, угвержденная 10 04 2001 г директором ВНИТИБП

-Методические рекомендации по ретроспективной лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденные 22 05 2001 г академиком РАСХН А М Смирновым

-Методические рекомендации по ранней лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеига крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденные 22 05 2001 г академиком РАСХН А М Смирновым

- Инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации, утвержденная 21 02 2006 г директором ВНИТИБП

- Инструкция по изготовлению и контролю глобулина флуоресцирующего для диагноежки бешенства животных, утвержденная 22 01 2006г директором ВНИТИБП

-Изменения в ТУ 9388-003-00497963-97 «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» согласовано с Руководителем Департамента ветеринарии МСХ РФ Е А Непоклоновым 12 04 2004 г

- Инструкция по применению набора компонентов для диагностики бешенства в реакции диффузионной преципитации утверждена Заместителем Руководителя Россельхознадзора Е А Непоклоновым 22 02 2006

- Инструкция по применению глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных утверждена Заместителем Руководителя Россельхознадзора Е А Непоклоновым 22 02 2006

- Технологический регламент на производство набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных живожых в РСК и РДСК, утвержденный 2101 2006 i дирекюром ВНИТИБП

- Инструкция по изготовлению и контролю I ипериммунной сыворотки против гсмофилеза, стрептококком и пастсреллеза свиней, утвержденная 21 10 2007 г директором ВНИТИБП

- Инструкция по изгоювлению и контролю гипериммунной сыворотки против пастсреллеза и гсмофилеза свиней, утвержденная 21 10 2007 г директором ВНИТИБП

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛТКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Эрнст Л Н , Моисеева Н А , Самуйленко С.А. Особенности иммунной системы у транстснных свиней Междунар конф, посвященная 80-летию Московской тосударственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина -М, 1999-С 67

2 Эрнст Л К, Самуйленко С.А., Соловьев Б В , Самуйленко А Я Об использовании клеточных систем поддержания и культивирования сперма-тогониев in vitro Всерос научно-практ конф «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов», посвященная 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института био-ло1ической промышленности — Щелково, 2000 -С 118-119

3 Эрнст Л К , Самуйленко С.А., Зиновьева Н А Оценка эффективности использования ретровирусных векторов для переноса генов у сельскохозяйственных животных in vivo Всерос научно-практ конф "Научные основы производства ве!еринарных биопрепаратов", посвященная 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биолотической промышленности - Щелково, 2000 - С 119-120

4 Самуйленко С.А. Достижения биотехнологии в области создания гранс-гснных животных Всерос научно-произв конф «Разработка и освоение производства новою поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарной практике» - Ставрополь, 2000 - С 63

5 Бобровская И В , Самуйленко С.А. Перспективы использования полиме-разной цепной реакции (ПЦР) для типирования вируса болезни Марека Междунар научно-прагг конф «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооашропонозными болезнями животных» - Покров, 2000 - С 221-224

6 Самуйленко А Я , Рубан Е А , Гунин М А, Самуйленко С.А. Исследование гибели клеток в процессе аэрации при глубинном культивировании в биореакгоре Междунар научно-практ конф «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозны-ми болезнями животных» - Покров, 2000 - С 199-203

7 Эрнст Л К , Рубан Е А , Самуйленко А Я , Еремец В И , Самуйленко С.А. Культуры микроорганизмов и клеток животных-продуцентов биологически активных веществ Междунар научная конф «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» - М , 2000

8 Рубан Е А , Соловьев Б В , Самуйленко С.А., Самуйленко А Я , Клюкина В И Некоторые проблемы глубинного культивирования клеток животных в биореакторах Биологическая научно-прак конф ВГНКИ - М , 2000

9 Самуйленко А Я , Самуйленко С.А., Клюкина В И , Рубан Е А Технология производства генноинженерных вакцин Биологическая научно-прак конф ВГНКИ - М , 2000

10 Самуйленко А Я , Еремец В И , Скичко Н Д Яковлев А Е , Самуйленко С.А., Казаков М А Получение противоящурных гипериммунных сывороток на использованных морских свинках Науковий вюник Национально-1 о аграрного ушверситету - Киев, 2001 -С 264-265

11 Кузнецов Д П , Самуйленко А Я , Белоусов В И , Кузнецова С В , Самуйленко С.А. Тест-система для ранней иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота Науковий вюник Национального аграрного ушверситету - Киев, 2001 -С 269-271

12 Самуйленко С.А., Кузнецов ДП Функция лимфоцишв и макрофаюв в клеючноопоередованном иммунитете при инфекционном ринотрахеиге КРС Mai междунар конф молодых ученых - Щелково, 2001 - С 15-18

13 Самуйленко С.А., Бобровская ИВ, Кузнецов ДП Очистка индивидуальных ишкопро теинов вируса инфекционного ринотрахеита с помощью моноклональных антител Мат междунар конф молодых ученых - Щелково, 2001 -С 35-37

14 Романенко M H , Бирюков А Г , Клюкина В И , Самуйленко С.А. Современное состояние диагностики и типирования лиссавирусов Мат междунар конф молодых ученых - Щелково, 2001 - С 174-176

15 Самуйленко С.А., Бобровская И В , Кузнецов Д П Исследование имму-ногенных свойств отдельных гликопротеинов вируса ИРТ КРС Материалы международной конференции молодых ученых - Щелково, 2001 - С 38-41

16 Романенко M H , Клюкина В И , Бирюков А Г , Самуйленко С.А. Получение и применение альбумин-родамина конъюга1а в диашостике бешен-С1ва животных методом флюоресцирующих антител Мат междунар конф молодых ученых - Щелково, 2001 - С 50-52

17 Яковлев А Е , Самуйленко С А., Еремец В И , Самуйленко А Я , Скичко H Д, Казаков M А , Большакова M В Получение афгозного материала от морских свинок, зараженных вирусом ящура типов А, О и С Мат междунар конф молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2001 - С 182-184

18 Тетеричев В И, Самуйленко АЯ, Рубан ЕА, Белоусов ВИ, Бирюков А Г , Самуйленко С.А. Эпизоотическая ситуация по бешенству в Тульской области и смежных областях Российской Федерации Мат междунар научно-прак конф «Нейроинфекции бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного poiaroro скота, Крейтфслдта-Якоба и другие при-онные болезни, листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена» - Покров, 2001 -С 10-14

19 Тегсричев В И , Самуйленко А Я , Белоусов В И , Солодилов А Н , Бирюков А Г , Самуйленко С.А., Рубан Е А , Иванов В С Современное состояние юболеваемости бешенством домашних и диких животных в Тульской области Мат междунар научно-прак конф «Нейроинфекции бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтфелдта-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Аус-ски, болезнь Тешена» - Покров, 2001 - С 14-17

20 Самуйленко А Я , Албулов А И , Уша Б В , Бирюков А Г , Фролов Ю Д , Моисеев А В , Самуйленко С.А., Моисеева Н А , Зацерковная Е Б , Ершов П Б, Шинкарев С М Разрабон<а новых технологий и расширение сферы применения биологически активных препаратов (БАП) из гидро-бионтов Мат шестой междунар конф «Новые перспективы применения хитозана и хитина» - М , 2001 - С 56

21 Самуйленко С.А., Самуйленко А Я , Еремец В И , Рубан Е А , Соловьев Б В , Бирюков А Г , Албулов А И , Большакова М В , Васенина Т И , Да-дасян А Я / «Способ определения токсичности и реакго1 енности масляных адыовантов и их составляющих компонентов» Патент №2184568 от 10 07 2002г

22 Яковлев А Е , Самуйленко С.А., Самуйленко А Я , Еремец В И , Скичко Н Д , Казаков М А Акшвносгь и специфичность в РСК гипериммунных сывороток, полученных высокоэффективным способом Мат междунар научно-прак конф «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патолотии сельскохозяйственных животных и людей» - Покров, 2002 - С 323-324

23 Яковлев А Е , Бирюков А Г , Фролов Ю Д , Самуйленко С.А., Самуйленко А Я , Еремец В И , Скичко Н Д , Казаков М А Оценка комплемент связывающей активности (РСК) вируса ящура типов А, О и С, репродуцированного в различных биолот ических системах, с использованием экспериментальных серий гипериммунной сыворотки Мат второй науч конф с междунар участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах

Сибири, Дальнею Востока и Крайнею Севера» - Новосибирск, 2002 - С 169

24 Самуйленко С.А., Кузнецова С В , Кузнецов Д П Получение очищенных и концешрированных препаратов вируса бешенства Мат междунар конф молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов - Щелково, 2002 - С 25-27

25 Инфекционная патология живошых Хламидиозы Монография, том V / Самуйленко А Я , Сюрин В Н , Воронин Е С , Ямникова С С , Самуиленко С.А. и др (Под ред А Я Самуйленко, В Н Сюрина, Е С Воронина) -М ,2003 - 207 с

26 Кузнецов Д П , Самуйленко А Я , Белоусов В И , Кузнецова С В , Самуйленко С.А. / «Набор для ранней иммуноферменгной диагностики инфекционного ринотрахеита» Патент №2196336 от 10 01 2003г

27 Эрнст Л К , Самуйленко А Я , Рубан Е А, Соловьев Б В , Самуйленко С.А., Ерсмец В И / «Способ размножения стромальных клеток тестикул (семенников), мужских половых зародышевых клеток, сперматогоний, сперматоцитов и спермаюзоидов» Па1снт №2196820 от 20 01 2003г

28 Кузнецов Д.П , Самуйленко А Я , Белоусов В И , Кузнецова С В , Самуйленко С.А. / «Набор для ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита животных» Патент №2196609 от 20 01 2003г

29 Самуйленко С.А. Использование флюоресцирующих моноклональных антител для выявления вируса бешенства Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2003 - С 51-53

30 Самуйленко С.А , Яковлев А Е , Самуйленко А Я , Казаков М А Анализ эффективности противоящурных вакцин по дополнительному показателю с помощью ИФА Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2003 - С 56-58

31 Самуйленко С. А., Рубан Е А, Самуйлснко А Я Влияние концентрации парциального давления СОг на жизнедеятельность микроорганизмов и клегок животных Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2003 - С 80-85

32 Самуйленко А Я , Рубан Е А, Самуйленко С.А. Влияние растворенного кислорода на рост культур микроорганизмов и клеток животных Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2003 - С 77-80

33 Истомина С В , Самуйленко С.А., Кузнецова С В , Сазанова ЭЯ , Кузнецов Д П , Маслов Е В Тест-система для индикации вируса бешенства и антирабичсских антител методом ИФА // XI Московский Междунар ветеринарный конгресс - М , 2003 - С 244-245

34 Истомина С В , Самуйленко С.А., Сазанова Э Я , Кузнецова С В , Кузнецов ДП Гемагглютинин вируса бешенства // XI Московский Междунар ветеринарный контресс -М, 2003 -С 245-246

35 Самуйленко С.А , Истомина С В , Сазанова Э Я , Кузнецова С В , Кузнецов Д П Инактивирующее действие bete-пропиолактона на вирус бешенства // XI Московский Междунар ветеринарный конгресс - М , 2003 -С 247-248

36 Самуйленко А Я , Яковлев А Е , Самуйленко С.А , Казаков М А Использование иммунофермешного анализа для изучения пост вакцинального иммунитета при ящуре // Ветеринарная патология - М , 2003 - №1(5) - С 96-97

37 Самуйленко С.А , Сазанова Э Я , Кузнецова С В , Кузнецов Д П Глико-протеин вируса бешенства и протеин Ф (Staphylococcus aureus) в титровании методом ИФА антирабических антител Сб науч тр , посвященная 75-летию научно-исследовательскою института микробиологии Московской обл РФ - Киров, 2003 - С 113-114

38 Самуйленко С.А , Сазанова Э Я , Кузнецова С В , Кузнецов Д П Температура в инактивации вируса бешенства // Весшик РАСХН - М , 2004 -№1 -С 61-63

39 Самуйленко С.А , Сазанова Э Я , Кузнецова С В , Кузнецов Д П Влияние фенола на биологические свойства вируса бешенства // Вестник РАСХН - М , 2004 - №4 - С 78-80

40 Самуйленко С.А., Сазанова Э Я , Кузнецова С В , Кузнецов Д П Действие р-пропиолактона на геманлклинин и РНК вируса бешенс!ва // Вестник РАСХН - М , 2004 - №6 - С 68-70

41 Акиньшина Т В , Сазанова Э Я , Самуйленко С.А., Кузнецова С В , Кузнецов ДП Некоюрые аспекты инактивации вируса бешенства химическими агентами Мат Междунар научно-прак конф молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2004 - С 6-11

42 Гринь С.А , Кузнецова С В , Кузнецов Д П , Сазанова Э Я , Акиньшина Т В Гуморальный иммунитет при вакцинации культуральной антираби-ческой вакциной // Ветеринария и кормление - М , 2005 - №5 - С 14-15

43 Гринь С.А., Сазанова Э Я , Кузнецов Д П , Кузнецова С В , Акиньшина Т В Клеточный иммунитет при культуральной антирабической вакцинации // Вестник РАСХН - М , 2004 - №2 - С 76-78

44 Клюкина В И , Кочетов А И , Гринь С.А. Изучение фракционного состава ангирабических ФИТЦ-конъюгагов методом хроматографии Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биоло1 ических препаратов» - Щелково, 2005 - С 92-94

45 Акиньшина Т В , Гринь С.А., Кузнецов Д П , Кузнецова С В , Сазанова ЭЯ Поликлональные антиидиошпические антитела к антигенам культу-ральною вируса бешенеша Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» -Щелково, 2005-С 261-266

46 Матвеева И Н , Г'ринь С.А., Кузнецов Д П , Мальгин Ю А, Мальгина ТА, Попова ВМ Выделение биологически активного протеина А для использования в биологических исследованиях Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2005 - С 421-423

47 Матвеева И Н , Гринь С.А , Кузнецов Д П , Мальгин Ю А , Мальгина Т А , Попова В М Получение биологически активного протеина А для золотистого стафилококка Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2005 - С 423-425

48 Самуйленко А Я , Рубан Е А , Дадасян А Я , Гринь С.А. Перспектива развития биотехнологии производства ветеринарных препаратов // Ветеринария и кормление -М,2005 - № 2 - С 12-13

49 Инфекционная патология животных Монография, I том / А Я Самуйленко, Б В Соловьев, Е А Непоклонов, Е С Воронин, Н В Фомина, С.А. Гринь и др (Под ред А Я Самуйленко, Б В Соловьева, Е А Непоклонова, Е С Воронина) - М , 2006 — 910 с

50 Инфекционная патология животных Монография, II том / А Я Самуйленко, Б В Соловьев, Е А Непоклонов, Е С Воронин, Н В Фомина, С А. Гринь и др (Под ред А Я Самуйленко, Б В Соловьева, Е А Непоклонова, Е С Воронина) - М , 2006 - 807 с

51 Матвеева И Н , Кузнецов Д П , Кочиш Т Ю , Кочиш И И , Гринь С.А. Изучение репродукции респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота Мат Междунар научно-прак конф «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» - М , 2006 -С 277-278

52 Матвеева И Н , Кузнецов Д П , Гринь С.А. Промышленный способ получения биологически активного протеина А Мат Междунар научно-прак конф «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» - М , 2006 - С 275-276

53 Ма/всева ИН, Кузнецов ДП, Кочиш ТЮ, Кочиш ИИ, Гринь С.А. Разработка гес1-сис!емы для детекции ашител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного poiaioro скота Мат Междунар науч-но-прак конф «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологи живожых» - M , 2006 - С 279-281

54 Матвеева И H , Кузнецов Д П , Кузнецова С В , Гринь С.А. Разработка rcci-системы для де!екции ашител к вирусу парагриппа-3 крупного рога-loi о скота Mai Междунар научно-прак конф «Актуальные проблемы инфекционной патологи и иммунолотии животных» - M , 2006 - С 284286

55 Машеева И H , Кузнецов Д П , Кочиш Т Ю , Кочиш И И , Гринь С.А. Очисша и концешрирование респираюрно-синцитиального вируса крупною радатою скота Mai Междунар научно-прак конф «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» - M , 2006 - С 282-283

56 Кузнецов Д П , Кузнецова С В , Сазанова Э Я , Гринь С.А. Иммуноген-ныс свойства отдельных гликонроюидов вируса инфекционного ринотра-хеша крупного рогаюго скота Мат Междунар научно-прак конф, посвященной 80-ЛС1ИЮ со дня рождения И А Хорысова «Научные основы производс!ва ветеринарных биоло! ичсских препаратов» - Щелково, 2006 - С 75-77

57 Кузнецов Д П , Кузнецова С В , Сазанова Э Я , Гринь С.А. Гибридомы, продуцирующие aHiniena к антИ1 снам вируса инфекционного ринотра-хеита крупного poi а того скота Мат Междунар научно-прак конф , посвященной 80-летию со дня рождения И А Хорькова «Научные основы производства ветеринарных биоло1 ических препаратов» — Щелково, 2006 - С 77-80

58 Школьников Е Э , Коломнина Г Ф , Гринь С.А , Самуйленко А Я , Шеги-дсвич Э А , Сивцева Л Я , Сидоров M А,, Скородумов Д И , Кржижановская ЕВ / «Способ получения гипериммунной сыворотки против гемо-

филсза и насгереллеза свиней» Заявка на патент № 2006131443 от 1 09 2006 г

59 Кочиш И И , Самуйленко А Я , Еремец В И , Кочиш Т Ю, Гринь С.А , Матвеева И Н , Филиппов С Ю , Чулков А К , Кржижановская Е В Разработка тест-системы ИФА для диагностики респирагорно-синцитиальной инфекции Мат Междунар научно-прак конф «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине и биологии» -Крым, 2007-С 116-119

60 Кочиш И И , Самуйленко А Я , Еремец В И , Кочиш Т Ю , Гринь С.А , Матвеева И Н , Филиппов С Ю , Чулков А К , Кржижановская Е В Тест-сисгема ИФА для диагностики парагриппа-3 Мат Междунар научно-прак конф «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине и биологии» - Крым, 2007 - С 120-122

61 Самуйленко А Я , Рубан Е А , Гринь С.А , Кржижановская Е В , Чулков А К Производство культуральной вакцины против гриппа птиц с использованием блочно-модульных гибких технологических линий Мат научно-прак конф «Грипп птиц профилактика и меры борьбы», - М , 2007-С 75-79

62 Школьников Е Э , Коломнина Г Ф , Самуйленко А Я , Гринь С.А , Шеги-девич Э А , Ставцева Л Я , Сидоров М А , Скородумов Д И , Панин А Н , Малик Е В , Кржижановская Е В , Чулков А К / «Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней» Заявка на патент № 2007123692 от 20 06 2007г

63 Скичко Н Д, Гуславский А И , Самуйленко А Я , Школьников Е Э , Красу гкин С Н , Чиниус Ю Г , Висящая Т Ф , Гринь С.А , Кржижановская Е В , Чулков А К / «Способ увеличения выхода культуры клеток из перепелиных эмбрионов» Заявка на патент № 2007142025 от 15 11 2007г

64 Скичко Н Д, Гуславский А И , Самуйленко А Я , Школьников Е Э , Кра-суткин С Н , Чипиус Ю Г , Висящая Т Ф , Гринь С.А , Кржижановская

Е В , Чулков А К / «Способ увеличения выхода культуры клеток из перепелиных эмбрионов» Заявка на патент №2007142025 от 15 11 2007 г

65 Гринь С.А , Школьников Е Э , Коломнина Г Ф , Меньшенин В В , Кржижановская Е В , Чулков А К , Скородумов Д И , Ставцева Л Я , Малик ЕВ Получение гипериммунной сыворотки против темофилеза, стрепто-коккоза и пасгереллеза свиней на свиньях-продуцентах Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2007 - С 250-253

66 Клюкина В И , Гринь С.А , Рахманин П В , Проничев А Б Получение и изучение иммунохимичсских свойств компонентов вируса бешенства Маг Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2007 - С 95-99

67 Филиппов С Ю , Гринь С.А , Кузнецов Д П , Кузнецова С В Поверхностные антигены вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биолог ических препаратов» - Щелково, 2007 - С 118-122

68 Матвеева И Н , Сивков Г В , Гринь С.А , Кочиш И И , Кочиш Т Ю Изучение репродукции вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скога Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2007 - С 126129

69 Матвеева И Н , Сивков Г В , Гринь С.А , Кочиш Т Ю , Кочиш И И , Кржижановская ЕВ, Чулков А К Концентрирование и очистка вируса аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2007 -С 129-132

70 Сивков ГВ, Кочиш ИИ, Кочиш ТЮ, Гринь С.А., Матвеева ИН, Кржижановская Е В , Чулков А К Разработка компонентов тест-системы ИФА для определения уровня антител к возбудителю аденовирусной инфекции крупного рогатого скога Мат Междунар научно-прак конф

«Научные основы произволе та ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2007 - С 132-137

71 Кочиш И И , Кочиш Т Ю , Гринь С.А., Матвеева И Н , Кржижановская Е В , Чулков А К Разработка ieci-систсмы ИФА для изучения иммунологической акгивносш вакцин про1ив пастереллеза живожых Мат Меж-дунар научно-прак конф «Научные основы производства веюринарных биол01ичсских препаратов» - Щелково, 2007 - С 234-238

72 Самуйленко А Я , Рубан Е А , Еремец В И , Гринь С.А., Матвеева И Н , Клюкина В И , Люлькова Л С , Кузнецов Д П , Кузнецова С В , Павленко ВС, Лихошерсгова С В Современные биотехнологичсскис процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов (диагностикумов) Мат Междунар научно-прак конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» - Щелково, 2007 - С 6-10

73 Кузнецов П А , Албулов А И , Клюкина В И , Гринь С.А. Изучение им-муномодулирующих свойс1в сукцината хитозана//Веткорм -М, 2007 -С 12-13

74 Гринь С.А , Кузнецов Д П , Maieecea И Н , Кузнецова С В , Филиппов С Ю Диагносжка парагриппа-З КРС методом иммуноферментного анализа /Ма1ериалы XVI Московского международного ветеринарного конгресса -М , 2008 - (в печати)

Отпечатано в ООО «Мещера», г Щелково, М О , уп Свирская, д 8а,зак № 725, тираж 100 экз

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гринь, Светлана Анатольевна

1 .Введение

2.Обзор литературы 1 б 2.1.Оборудование для культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов

2.2.Питательные среды и ингредиенты, используемые при культивировании клеток животных и вирусов

2.3.Штаммы и их характеристика

2.4.Культивирование фиксированных штаммов вируса бешенства

2.5.Методы и процессы культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов

2.6.Выделение, очистка и концентрирование вирусного материала

2.7.Методы диагностики бактерийных и вирусных препаратов 63 2.7.1 .Традиционные методы

2.7.2. ИФ А-мето д ы

2.7.3.ПЦР-методы

2.8.Антигенные свойства вирусов

2.9.Инактивация вируса

2.10 .Механизмы выработки иммунитета

2.11 .Технология производства гипериммунных сывороток

2.12.Трансгенные животные

2.13.Биологические свойства адъювантов и их компонентов 96 2.14.0бсуждение литературного обзора 96 3.Собственные исследования 99 3.1 .Материалы и методы 99 3.1.1 .Культуры клеток и эмбрионы птиц

3.1.2.Животные

3.1.3.Штаммы 101 3.1.4.Оборудование

3.1.5.Методы

3.1.5.1 .Культивирование микроорганизмов в биореакторах

ЗЛ.5.2.Культивирование клеток и вирусов в биореакторах

3.1.5.3.Репродукция вируса бешенства

3.1.5.4.Репродукция вируса инфекционного ринотрахеита 105 3.1.5.5 .Концентрирование вируса 106 3.1.5.6.0чистка вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота от клеточных белков 106 3.1.5.7.0пределение титра инфекционности вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

3.1.5.8.Белок

3.1.5.9.Комплементсвязывающая активность вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

3.1.5.10.Преципитирующая активность вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

3.1.5.11.Гемагглютинирующая активность вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

3.1.5.12.0чистка Ig G

3.1.5.13 .Оценка чистоты препарата иммуноглобулина G

3.1.5.14.0днородность и специфичность препаратов иммуноглобулинов

3.1.5.15.0ценка реактогенности масел на мышах

3.1.5.16.Оценка токсичности масел на мышах

3.1.5.17.Получение гипериммунной сыворотки против ~ гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней

3.2. Результаты исследований

3.2.1. Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах в суспензии и на микроносителях

3.2.2. Основные факторы, влияющие на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах

3.2.3. Влияние механического перемешивания и аэрации на гибель клеток в биореакторе

3.2.4. Способ оценки токсичности масляных адъювантов и их компонентов, используемых при разработке и производстве биопрепаратов с помощью культуры клеток свиной почки в пробирке с монослоем

3.2.4.1. Клеточная культура 124 3.2.4.1.1. Подготовительные операции

3.2.4.2. Культивирование первичных клеток СП

3.2.4.2.1. Приготовление питательных сред

3.2.4.2.1.1. Основной раствор

3.2.4.2.1.2. Разведенные растворы

3.2.4.2.2. Приготовление масляных адъювантов

3.2.4.3. Приготовление первичных клеток СП

3.2.5. Суспензионное культивирование клеток сперматогоний свиньи

3.2.5.1. Теоретическое обоснование

3.2.5.2. Периоды сперматогенеза

3.2.5.3. Регуляция сперматогенеза

3.2.5.4. Суспензионное культивирование

3.2.5.4.1. Первый период суспензионного культивирования клеток семенника поросенка

3.2.5.4.2. Второй период суспензионного культивирования сперматогоний

3.2.5.4.3. Третий период суспензионного культивирования сперматоцитов

3.2.5.4.4. Четвертый период суспензионного культивирования сперматидов

3.2.5.4.5. Основные выводы

3.2.5.4.6. Оптимизация культивирования клеток ткани семенника поросенка по основным физико-химическим и биофизическим параметрам

3.2.6. Накопление вируса (бешенства, ИРТ, ПГ-3) при глубинном культивировании в биореакторах

3.2.7. Культивирование пастерелл, гемофил и стрептококков в биореакторах 149 3.2.7.1. Анализ традиционного процесса культивирования пастерелл

3.2.7.2. Разработка управляемого процесса периодического культивирования пастерелл

3.2.7.2.1. Оптимизация процесса культивирования пастерелл на начальной стадии роста (на фазе приспособления и начале фазы логарифмического роста)

3.2.7.2.2. Влияние окислительно-восстановительного потенциала культуральной жидкости на рост Pasteurella multocida

3.2.7.3. Испытание управляемого процесса культивирования пастерелл в лабораторных и промышленных условиях

3.2.7.3.1. Испытание управляемого процесса культивирования в лабораторных биореакторах

3.2.7.3.2. Испытание управляемого процесса культивирования в промышленных биореакторах

3.2.8. Современные оборудование и методы очистки, концентрирования и инактивации биоматериала антигенов, вирусов и микроорганизмов

3.2.8.1. Очистка и концентрирование вируса ИРТ КРС

3.2.8.2. Биологические свойства вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

3.2.8.3. Биологические свойства культурального вируса бешенства

3.2.8.4. Очистка и концентрирование вируса бешенства

3.2.8.5. Инактивация вируса бешенства

3.2.8.6. Получение конъюгата анти-IgG КРС с пероксидазой из хрена

3.2.8.6.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки крови крупного рогатого скота

3.2.8.6.2. Очистка иммуноглобулина вируса бешенства

3.2.9. Разработка метода определения токсичности масляных адъювантов и их компонентов

3.2.9.1. Изучение токсичности масляного адъюванта и его компонентов на культуре клеток СП в пробирках с монослоем

3.2.9.2. Сравнительное изучение показателей токсичности масляных адъювантов и их компонентов, используемых в производстве биопрепаратов, на белых мышах и культуре клеток СП в пробирках с монослоем

3.2.10. Получение специфических гипериммунных сывороток для изготовления диагностикумов

3.2.10.1. Получение лечебной ассоциированной гипериммунной сыворотки против пастереллеза, гемофилеза и стрептококкоза свиней с использованием различных видов животных

3.2.10.2. Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней

3.2.11. Изготовление диагностических наборов в промышленных условиях

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов"

Актуальность темы. Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты - человек, животные, растения, микроорганизмы, клетки и вирусы.

Фундаментом современной биотехнологии являются микробиология, вирусология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. Сочетанное использование основных элементов указанных дисциплин позволяет создавать производственные системы для выпуска биологических-препаратов, предназначенных для индикации возбудителей, диагностики, профилактики инфекционных болезней и лечения животных [211].

Основы биотехнологии у нас в стране отражены в работах наших ученых [32, 33, 34, 19, 20, 193, 202, 205, 82, 116, 218, 219, 300, 213, 240], за рубежом [472, 6, 407, 179].

Современные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, физико-химических и биологических процессов, оптимизация которых возможна на клеточном, популяционном, биоценотическом и аппаратурно-технологическом уровне.

Успехи отечественной ветеринарной науки и практики в проведении специфической профилактики инфекционных болезней связаны с крупными научными открытиями, сделанными в конце XIX и начале XX столетий [211, 234, 175].

В течение 40 лет сотрудниками ВНИТИБП накоплен большой опыт в создании новой высокоэффективной техники и биотехнологии получения вакцин, диагностикумов, специфических антигенов вирусного и микробного происхождения, гипериммунных сывороток, методов очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов, выделении специфического антигена и методов их оценки.

Разработаны суспензионные методы культивирования микроорганизмов. клеток животных и вирусов [200, 201, 205, 206, 211, 198, 197, 196, 195, 194, 231].

Обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами - одна из главных задач биотехнологии.

Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии. В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве [94, 279].

Таким образом, использование при разработке новых и совершенствование существующих промышленных биотехнологий производства биопрепаратов с использованием современного оборудования (биореакторов, сепараторов, разделительных центрифуг, фильтров и т.д.), иммунобиологических методов будет способствовать повышению их эффективности и улучшению эпизоотической, экологической и социальной обстановки в стране.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в совершенствовании и разработке современных биотехнологических процессов и иммунобиологических методов при промышленном производстве ветеринарных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать с использованием современного оборудования методы и биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов и репродукции культур клеток (включая сперматогонии с генетическим вектором нужной направленности.

2. Разработать современные методы получения специфических антигенов микробного и вирусного происхождения при производстве биопрепаратов.

3. Разработать метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре при промышленном изготовлении диагностикумов и лечебных сывороток и для получения гипериммунных сывороток.

4. Разработать современные биотехнологические процессы производства препаратов (диагностикумов, вакцин, лечебных сывороток) и иммунологические методы их оценки (ИФА, ПЦР).

5. Оценить экологическую, экономическую и социальную эффективность использования предложенных методов и биотехнологий и иммунологических методов.

Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны

- биотехнологические процессы и современные иммунобиологические методы анализа при промышленном производстве ветеринарных препаратов, включающие:

- впервые разработан «Набор для ретроспективной ИФА-диагностики инфекционного ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностики' ринотрахеита КРС»; впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21; впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности; разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток при разработке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС;

- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первичнотрипсинизированных культурах клеток при изготовлении гипериммунных диагностических и лечебных сывороток;

- впервые получена гипериммунная сыворотка для создания пассивного иммунитета у свиней против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза с использованием волов как продуцентов, а в качестве антигенов бралась культура Pasterella multocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 и Д штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штамм ГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suis серовара II (штамм Касли);

- впервые изобретен способ размножения ' стромальных клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в у промышленных масштабах вне организма;

- впервые установлено, что кормление перепелок сбалансированным рационом с добавлением циалитов значительно увеличивает выход культур клеток из перепелиных эмбрионов.

Новизна полученных результатов подтверждена 7 патентами, в т.ч. 3 заявками (Патент № 2184568 от 10.07.20002г., Патент № 2196336 от 10.01.2003г., Патент № 2196609 от 20.01.2003г., Патент № 2196820 от 20.01.2003г. и Заявки на патент № 2006131443 от 1.09.2006 г., № 2007123692 от 20.06.2007г. и №2007142025 от 15.11.2007г.).

Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований вошли в НТД производства диагностикумов и лечебных ассоциированных сывороток.

Результаты проведенных исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагностикумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза.

Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяются в ветеринарной практике в порядке широкого производственного опыта за период 2001-2007 гг.

За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА - 500, бешенства РДП - 3500, РИФ - 4000 и хламидиоза РСК - 15000 наборов. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защит

1.Результаты совершенствования и разработки биотехнологических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, культур клеток и вирусов и контроля репродукции вирусов и микроорганизмов при промышленном выпуске ветеринарных биопрепаратов.

2. Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных методов и оборудования для разделения, очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов и выделение специфических антигенов и методы их оценки.

3. По результатам оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФ бешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (гемофилез, стрептококкоз и пастереллез).

Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной конференции, посвященная 80-летию Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, Москва (1999 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов», посвященная 30-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности,

Щелково (2000 г.); Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарной практике» в Федеральном государственном унитарном предприятии «Ставропольской биофабрике», Ставрополь (2000 г.); Международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии, Покров (2000 г.); Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии, Москва (2000 г.); Биологической научно-практической конференции ВГНКИ, Москва (2000 г.); Науковий вюник Национального аграрного ушверситету, Киев (2001 г.); Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов, Щелково (2001, 2002, 2004гг.); Международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, гупкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтфелдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена», Покров (2001 г.); Шестой международной конференции «Новые перспективы применения хитозана и хитина», Москва (2001 г.); Международной научно-практической конференции «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей», Покров (2002 г.); Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск (2002 г.); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково (2003, 2005, 2007 гг.); XI Московском международном ветеринарном конгрессе, Москва (2003 г.); Международной научно-практической конференции, посвященная 75-летию Научноисследовательского института микробиологии Московской области

Российской Федерации, Киров (2003 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», Москва (2006 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А. Хорькова «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково (2006 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы молекулярной диагностики в ветеринарной медицине и биологии», Крым (2007 г.); Научно-практической конференции «Грипп птиц: профилактика и меры борьбы», Москва (2007 г.); на заседаниях ученого совета ВНИТИБП, Щелково (2000-2007гг.).

Публикации результатов исследований По материалам диссертации опубликовано 73 научные работы, в том числе 7 патентов (из них 3 заявки на патент) и 3 монографии.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 46 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 604 наименования, из которых 282 отечественных и 322 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гринь, Светлана Анатольевна

5.ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованы и разработаны с использованием современного оборудования и технических средств механизации и автоматизации биотехнологические процессы культивирования микроорганизмов, клеток животных и вирусов при производстве высокоэффективных диагностикумов в ИФА, РИФ, РДП и РСК для нужд ветеринарии.

2. Использование современных автоматизированных биореакторов и методов оптимизации технологического процесса позволило при суспензионном и псевдосуспензионном культивировании культур клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 увеличить получение их концентрации до 3 млн. кл. в мл.

3. Использование гибких и блочно-модульных систем культивирования позволило получать в высоких концентрациях вирусы (бешенство - в титрах о л о

10 ТЦД50, ИРТ - 10 ТЦДзо) и микроорганизмы (пастереллы, гемофилы и стрептококки до 20-40 млрд кл в мл).

4. Использование высокоэффективных методов и аппаратов (жидкостных сепараторов и осадительно-фильтрующих центрифуг на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателям) для разделения, очистки и концентрирования вирусов и микроорганизмов методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультроцентрифугирования позволило получать очищенные специфические антигены при промышленном производстве биопрепаратов (диагностикумы, лечебные сыворотки и др.).

5. Теоретически обосновано и практически подтверждено наличие гепототического объема гибели клеток линии ВНК 21/13 в биореакторах при суспензионном культивировании в зависимости от уровня аэрации, размера пузырьков, силиконового пеногасителя (пропинол Б-400), а также при культивировании на микроносителях и установлена константа гибели клеток, которая в зависимости от времени культивирования колебалась от 2,7x10"6 сек"1 до 22,3x1 О^сек"1.

6. Установлены условия культивирования стромальных клеток тестикул (семенников) мужских половых зародышевых сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов с интегрированным (вшитым) в них генетическим вектором. Размножение осуществлялось в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма, что предусматривает дальнейшие исследования.

7. Разработан высокоэффективный способ оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов с использованием первичнотрипсинизированных и перевиваемых культур клеток в 10-100 раз по чувствительности выше, чем с использованием белых мышей, что позволило повысить эффективность биопрепаратов при их применении при промышленном производстве лечебных сывороток и диагностикумов (бешенство, ИРТ, хламидиоз, респираторно-синцитиальная инфекция, ящур и другие) в процессе изготовлении гипериммунных сывороток.

8. Разработаны методы очистки, концентрирования и инактивации вирусов бешенства и инфекционного ринотрахеита и изучены их биологические свойства, которые сохранялись при получении специфических антигенов, используемых для получения гипериммунных сывороток при промышленном производстве диагностикумов.

9. Усовершенствованы способы получения и очистки специфических антител и моноклональных антител при промышленной технологии производства диагностикумов для практического применения.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.Разработан способ оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов с использованием первично трипсинизированных и перевиваемых культур клеток, утвержденный 28.09.2002 г. академиком РАСХН A.M. Смирновым.

2.3а период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России наборы для диагностики ИРТ КРС в ИФА — 1400, бешенства в РДП -3500, в РИФ - 4000 и хламидиоза в РСК - 15000 наборов.

3.Разработаны и утверждены:

-Инструкция по изготовлению и контролю набора для ретроспективной иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, утвержденная 10.04.2001 г. директором ВНИТИБП. -Инструкция по изготовлению и контролю набора для ранней иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, утвержденная 10.04.2001 г. директором ВНИТИБП.

- Методические рекомендации по ретроспективной лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденная 22.05.2001 г. A.M. Смирновым в отделе ветеринарной медицины РАСХН.

- Методические рекомендации по ранней лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержденная 22.05.2001 г. A.M. Смирновым в отделе ветеринарной медицины РАСХН.

- Инструкция по применению набора компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузионной преципитации, утвержденная 22.02.2006 г. заместителем Руководителя Россельхознадзора Е.А.Непоклоновым. -Инструкция по применению глобулина флуоресцирующего для диагностики бешенства животных, утвержденная 22.02.2006г. заместителем Руководителя

Россельхознадзора Е.А.Непоклоновым.

- Изменения в ТУ 9388-003-00497963-97 «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» согласовано с Руководителем Департамента ветеринарии МСХ РФ Е.А. Непоклоновым 12.04.2004 г.

- Технологический регламент на производство набора для диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в РСК и РДСК, утвержденный

21.01.2006 г. директором ВНИТИБП.

- Инструкция по изготовлению и контролю гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней, утвержденная

21.10.2007 г. директором ВНИТИБП.

- Инструкция по изготовлению и контролю гипериммунной сыворотки против пастереллеза и гемофилеза свиней, утвержденная 21.10.2007 г. директором ВНИТИБП.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гринь, Светлана Анатольевна, Кашинцево

1. Авилов B.C., Матюгина Н.И. Влияние дозы и очистки вируса ИРТ КРС на антителообразование при иммунизации кроликов: Тр. ВИЭВ «Акт.пробл.вет.вирус » 1981.- 53.-С. 60-62.

2. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. Иммуноферментный анализ Ветеринария.-1981.-8. -С.33-35.

3. Адаме Р. Методы культур клеток для биохимиков. М.,1983. - 246 с.

4. Авилов B.C., Матюгина НИ. Влияние дозы и очистки вируса ИРТ КРС на антителообразование при иммунизации кроликов // Акт.пробл.вег.вирус., тр. ВИЭВ, 1981. — 53.-С. 60-62.

5. Адамушкин В.Е., Светлышев С.Д., Петрова И.А. Методы очистки и концентрирования вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота: Сб. научн. тр.,- М.: MB А, «Проблемы вирусол., молекул. Биологии и гистологии с/х жив». 1983.-С. 18-20.

6. Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н. Биохимическая технология и аппаратура, Пищевая промышленность. М., 1975 - С.587.

7. Аксенова Т.А., Хапчаев Ю.Х., Миронова Л.Л., Сошенко Ю.В., Селимов М.А., Хозинский В.В. Культивирование вакцинного вируса бешенства в линиях перевиваемых клеток зеленой мартышки // Вопросы вирусологии.-1991.-№5.-С. 432.

8. Андреев Е.В., Драгомир А.В. Изучение гуморальных посвакцинальных антител у КРС, иммунизированного живой и инактивированной вакциной против ИРТ // Инф. и инвазионные болезни с.х. жив.-Одесса, 1982.-С. 11-15.

9. Андреева Л.Ф., Десницкий Л.Г., До иду а Л.К., Букина Н.4. Клеточное размножение и процессы дифференциации. Л., Наука, 1983. - 248 с.

10. Андросик Н.Н. Профилактика пневмоний свиней. Минск, 1989. Н.Анисимова Л.И., Прилепская Е.П., Недосеков В.В., Тарасенко О.В.,

11. Антонова» Н.И., Коломнина Г.Ф., Нецепляева Л.И. и др. Сравнительная оценка роста, пастерелл на различных питательных средах: Тез.докл «Науч.основы технологии пром.производства вет.биол.препаратов- » — М., 1991. С. 160-161.

12. Антонюк В.М. Проблемы ветпаразитоценологии. Новое учение о заразных болезнях.- Киев, 1994.

13. Аткинсон Б. Биохимические реакторы М.: Пищевая промышленность -1979,-280с.

14. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. -180 с.

15. Баснакьян И.А. Оптимизация культивирования микроорганизмов, в иммунобиотехнологии // Микробиология.- 1989.- 5.-С. 90-96.

16. Баснакьян И.А. Патология1 и физиология микробов. Усовершенствование технологии культивирования // Микробиология, 1982.- 12.-С. 28-33.

17. Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Запорожцев JI.H. Классификация процессов культивирования микроорганизмов: Тр. Моск. научн-исслед. ин-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.-1981.-С. 5-17.

18. Баснакьян И.А., Боровкова В.М., Кузьмин С.Н. Патология и физиология микробов. Сообщение 1. Общие вопросы//Микробиология.-1981.- 9.-С. 14-19.

19. Баснакьян И.А., Мельникова В.А. Перспективы усовершенствования технологии культивирования патогенных микроорганизмов: Тр. Цент, науч.-иссл. ин-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.- Деп. ВНИИМИ МЗ СССР 16.10.1987, №14317.-С. 19-36.

20. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989 — Т. 1.-692с.

21. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989-Т.2. - 590с.

22. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М: Мир, 1989. - Т. 1. - 692 с.

23. Биотехнология / Под ред. Академика РАСХН Е.С. Воронина, С.-Петербург, 2007. 703 с.

24. Биотехнология клеток животных / Под ред. Р.Д. Спиера и Дж.Б.Гриффита. -М.; ВО «Агронромиздат», 1989. Т.1. 365 с.

25. Биотехнология клеток животных / Под ред. Р.Д.Спиера и Дж.Б.Гриффита, т. 1 М.: ВО «Агропромиздат», 1989.Т.2. - 518 с.

26. Бирюков В JB. Основы промышленной биотехнологии.-М: Колос, Химия, 2004.—295 с.

27. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М., Наука, 1985.- 293 с.

28. Бирюков В.В., Шнайдер JI.E. Управляемые периодические процессы микробиологического синтеза. Обзорная информация. Серия XI. Процессы и аппараты микробиологических производств.-М.: ВНИИСЭНТИ, 1986.- 52с.

29. Богаров А.Ф. Вирусы группы герпеса.- М., 1979.

30. Богаров А.Ф., Гофман Ю.П., Бикбулатов P.M. Морфология внутриклеточного паразитизма вируса герпеса человека: Тр. стоматологов Лит. ССР. Каунас, 1967.-С. 49.

31. Богаров А.Ф., Кицак В.Я. Некоторые аспекты персистенции вируса простого герпеса человека. Хроническая вирусная инфекция и ее роль в патологии человека. - Новосибирск, 1978.-С. 63 - 69.

32. Богаров А.Ф., Кицак В.Я., Богаров Е.Ф., Трухачев А.А. Вирус простого герпеса.- Новосибирск: Наука, 1982.-С. 4 27.канд.биол.наук. - Щелково, 2000.

33. Большакова М.В. Эффективность противояшурных вакцин в зависимости от используемого адъюванта. Автор.ди. . канд.биол.наук. - Щелково, 2000.

34. Вайсман И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяций // Микробиология, 1984.- 4.-С. 3-8.

35. Валишина Т.В. Разработка и совершенствование средств и методов диагностики бешенства: Дисс. канд. биол. наук. Покров, 1993.- 147 с.

36. Ванновский ТJL Производство и контроль препаратов в ветеринарии. -М, 1937 -111с.

37. Василиади А.Г., Сергеева И.В., Хаустов В.И. Возможность индикации вакцинного штамма в носовых смывах телят методом точечной молекулярной гибридизации // Актуал. вопр. инфекц. и инваз. болезней животных. М., 1993.-С. 75-77.

38. Виестур У.Э., Крисгансон МЖ, Былинкина Е.С. Культивирование микроорганизмов. — М: Пищевая промышленность, 1980.—231 с.

39. Витин В.Г.; Закутский Н.И.; Жестерев В.И.; Вишняков И.Ф.; Коломыцев А.А.; Конакова Л.Д. Безыгольный способ иммунизации крупного рогатого скота против инфекционного ринотрахеита // Пробл.инфекц. патологии с.-х. животных. -Владимир, 199 С. 86.

40. Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков В.В., Горшкова Т.Ф., Жестерев В.И., Шевченко А.А., Зуев В.В., Груздев К.Н. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства животных // Ветеринария. 1998.- № 6. С.76-80.

41. Власкина О.В. Патоморфологическая характеристика патогенности P. multocida различных серовариантов и их неочищенных экзотоксинов: Автореф.дисс.канд.вет.наук.-М., 1999.-23 с.

42. Волкова А.В. Культивирование вируса бешенства штамма «Внуково-32» в культуре перевиваемых клеток для производства антирабической вакцины: Дисс. канд. биол. наук. М., 1997.- 117 с.

43. Воробьев А.А., Васильев Н.И. Адъюванты (неспецифические стимуляторы иммуногинеза). -М.: Медицина, 1969. -205 с.

44. Вуннер В. Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов // Вирусологические методы. М.: «Высшая школа», 1988. - С. 112-130.

45. Гагинская Е.Л., Калинина Е.И. Прелептогенная конденсация хромосом в профазе мейоза // Генетика, биохимия и цитология мейоза М.: Наука, 1992.-97 с.

46. Глейзер Д.А. Разработка технологии изготовления полиштаммной вакцины против инфекционного бронхита кур инактивированной эмульсионной. -Автореф.дисс.канд.вет.наук. Владимир, 2007.

47. Глотов А.Г. Обнаружение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в тройничном ганглии латентно инфицированных телят методом молекулярной гибридизации //Актуал. вопр. ветеринарии. -Новосибирск, 1997.- С. 51-52.

48. Глотов А.Г.; Орешкова С.Ф. Диагностика инфикционного ринотрохиита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации // Ветиринария, 1996.- N 6.- С. 24-27.

49. Глотов А.Г.; Сергеев А.Н. Частота выявления вируса инфекционного ринотрахиита крупного рогатого скота в пробах патологического материала от больных телят методом молекулярной гибридизации //Актуал. вопр. ветеринарии. Новосибирск, 1997.- С. 47-48.

50. Голубев Д.В., Соминина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. Л.: Медицина, 1976. - 224 с.

51. Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленногопроизводства инактивированной культуральной вакцины против бешенства: Автореф. дисс. канд. наук. Владимир, 1999. - 23 с.

52. Грипп птиц: профилактика и меры борьбы: Сб.матер.науч.-прак. конф. — М., 2007.-208 с.

53. Горьковенко Н.Е., Макаров Ю.А. Некоторые вопросы экологии и иммунологии (Вакцинация крупного рогатого скота в зонах экологического неблагополучия) // Сб.науч.трудов, 2005. С. 84-90.

54. Гуненков. В.В., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Применение сыворотки крови северных оленей для культивирования клеток, вирусов и трансплантации эмбрионов животных // Сб.науч.трудов, М., 2003. Т. 64. - С. 69-77.

55. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Бешенство животных. М.: «Аквариум ЛТД», 2001.-304 с.

56. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Бешенство животных.//М.: «Аквариум», 2001.-303с.

57. Груздев Л.К., Дешевых А.Е., Груздев К.Н. Изучение репродукции фиксированного штамма в культурах клеток // Вопросы прикл. экологии (природопользования), охотоведения и звероводства. Киров, 1997.-С. 285-286.

58. Гунин М.А. Исследование жизнеспособности клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях: Автореф. дисс.Канд. наук. Щелково, 2000. 13с.

59. Гуславский А.И. Высокоэффективные аппараты для разделения, очистки и концентрирования жидких систем и новые биотехнологические процессына их основе. Автореф.дисс.докт.техн.наук. Щелково, 2007.

60. Гутина В.Н. Очерки по истории физиологии микроорганизмов. М.: Наука,1988.-200 с.

61. Девришов Д.А. Дифференциальная диагностика респираторных болезней телят // Пробл. лейкоза и инфекц. Заболеваний с.-х. животных.-М, 1988.- С. 99-101.

62. Джавец Э., Мельник Д.Л., Эйдельберг Э.А. Руководство по медицинской микробиологии. М.: Медицина, 1982.- 366 с.

63. Долинов КК Научные основы производства вакцин и сывороток. -Н, 1955. -271 с.

64. Доссер ЕМ., Дорофеев ВМ. Выращивание клеток почечной ткани обезьян макаки-резус глубинным методом/Вирусные инфекции и противовирусные препараты. -М., 1961.-232 с.

65. Дрю С. Жидкая культура. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983.- 1.-С.374-441.

66. Дудников А.И., Коропов В.Н., Смирнов В.И., Бурдов А.Н., Мамков Н.С., Довгопол В.Ф. Количественная оценка иммуногенности противояпцорной эмульсионной вакцины на свиньях // Актуальные проблемы ветеринарной верусологии. —Владимир, 1983.- С. 61-62.

67. Душук Р.В. Болезни, вызываемые пастереллами. Пастереллезы / Инфекц.болезни ж-х. М., 1987. - С. 88-194.

68. Душук Р.В. Респираторные болезни свиней. -М., 1982.-С. 242-250.

69. Душук Р.В. и др. Новое в специфической профилактике бактериальных болезней свиней: Мат. Междун. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных». -Минск, 2000. С. 263-264.

70. Душук Р.В., Малахов Д.А., Шапошникова JI.M. и др. Специфическая профилактика пастереллеза птиц: Тез.докл.Всерос.науч.конф. «Совершенствованеи методов контроля, стандартизации и сертификации ветер.препаратов» М., 2001. - с.49-50.

71. Дьяконов Л П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии: Труды ВИЭВ. —1998. Т.71. - С. 149-161.

72. Еремеев ТВ. Методы адсорбции // Вопросы медицинской вирусологии1949. №2. - С. 263.

73. Жданова Л.Г. Значение исследований по физиологии патогенных микроорганизмов в вакцинном производстве: Тр. Моск. научн.-иссл. ин-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.- 1979.-С. 18-28.

74. Закутский Н.И.; Жестерев В.И.; Вишняков И.Ф.; Конакова Л.Д.; Анисимова Л.И.; Шевченко А.А. — Культуральная инактивированная вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота //Ветеринария, 1997.- N8.-С. 17-20.

75. Закутский Н.И.; Жестерев В.И.; Вишняков И.Ф.; Конакова Л.Д.; Анисимова Л.И.; Шевченко А.А. Эффективность культуральной инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Докл. РАСХН, 1997.- N 5.- С. 38-40.

76. Закутский Н.И., Жестерев В.И., Вишняков И.Ф. и др. Схема иммунизации крупного рогатого скота инактивированной вакциной против ИРТ КРС // Пробл.инфекц.патологии с.х.животных, Владимир, 1997. С. 85.

77. Зверьков Д.А. Антигенные и иимуногенные свойства инактивированной вакцины против пастереллеза, сальмонеллеза и актинобациллезной плевропневмонии свиней. Автореф. дисс. кард. вет. наук. М., 2000.

78. Зверьков Д.А. Антигенные и иммуногенные свойства инактивированной вакцины против пастереллеза, пастереллеза и актинобациллезной плевропневмонии свиней. //Автореф. дисс. . канд. вет. наук. М.-2000.

79. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. М.:Мир, 1982.- Т.2. -344с

80. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. М.:Мир, 1982.- Т.3. 438 с

81. ЗйновьеваНА, Эрнст.1ЖПроб11а^ МоасОбл2006.-343 а

82. Иванов B.C. Сравнение методов крупномасштабного культивирования инфицированныхвирусом бешенства перевиваемых клеток ВНК-21/13 // Мат. Ш Всесоюз.совещания «Культивирование человека и животных», Пущино, 1990. С. 94-95.

83. Иванов B.C. К вопросу предэкспозиционной и постэкспозиционной иммунизации животных против бешенства: Тез. докл. конф., поев. 100-летия открытия вируса ящера — Владимир, 1997.-С. 188.

84. Иванов B.C. К. вопросу профилактики бешенства с помощью инактивированных кулыуральных антирабических вакцин из штамма «Щелково-51» : Мат. 8-ш Межд. Конгресса по проблеме ветеринарной медицины мелких домашних животных. М., 2000. — С.275-276.

85. Иванов B.C. Особенности крупномасштабного культивирования первичных и перевиваемых клеток животных на микроносителях, изготовленных во ВНИТИБП: Мат.Ш Всесоюз. Совещания. «Культивирование клеток человека и животных»- Пущино, 1990.-С. 93-94.

86. Иванов B.C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин// Вирусные болезни животных. Владимир, 1995. - С. 203.

87. Тез. докл. 5-й Всесоюз. конф. «Методы получения и анализа биохимических препаратов». -Рига, 1987.-С. 95.

88. Иванов B.C., Хорьков ИЛ., Кузнецов ГШ, Пименов БИ, Бехтерев СИ «Способ выращивания культур клеток». Патент РФ № 1182817,15.04.1993.

89. Игнатьев A.M., Мони Ю.В., Бабикова Р.А., Петрова И.А. Использование метода иммунофлюоресценции при диагностике инфекции КРС // Сб.науч. тр.МВА им.Скрябина, 1973.-70.-С. 118-119.

90. Игудин Л.И., Маркман Г.А., Лобань С.А. и др. Полиэтиленгликоли и их использование в биологии и медицине // ЖМЭИ, 1984. 4. - С. 17-21.

91. И.А. Баснакьян, Е.А. Мельникова И.А. Баснакьян, А.П. Власенко, Т.Н. Ратникова Изучение экономических коэффициентов в процессе периодического и многоциклического культивирования Clotridium perfringens типа А. Микробиология, 1984.- 11.-С.65-68.

92. Ильясова Р.Ш. Влияние ДЕАЕ-декстрана, декстран-сульфата, декстран-150, MgCl2 на репродукцию уличного вируса бешенства (штамм Мочалин) в культуре клеток первичной ВНК // Тез.докл.конф. «Вопросы медицинской вирусологии», 1975. С. 76.

93. Исаевич Л.В. Влияние некоторых инактивирующих агентов на фиксированный вирус бешенства, штамм ОК-4, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13 //Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. М., 1976. - № 4. - С. 3-4.

94. Культура клеток в вирусологии. Итоги науки и техники. Серия «Вирусология» // М., ВИНИТИТ, 1990. Т. 19. - 254 с.

95. Культура клеток в производстве биопрепаратов. Итоги науки и техники. Серия «Вирусология» // М., ВИНИТИТ, 1991. Т. 21. - 270 с.

96. Аппаратура для ультурально-технологических процессов в микробиологии. Итоги науки и техники. Серия «Микробиология». М.; ВИНИТИ, 984.-Т.21. - 288 с.

97. Карпов А.А., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я. Масштабирование процессов культивирования микроорганизмов: Мат. Межд.науч.-прак.конф. «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». Щелково, 2004. - с. 190-192.

98. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев JI.C. Моделирование биохимических реакторов // М., Лесная промышленность, 1979. 342 с.

99. Кирюхина Л.П., Кекух И.Г., Демченко Л.П., Струсь С.Г. Штамм культивируемых клеток Saica tatarica для вирусологических исследований: А.с. 1467356 СССР МКИ с 12 №5/00-Н-и с-х -№4092085/30-13; от 18.07.86.

100. Кицак В.Я. Твердофазный иммуноферментный анализ в вирусологии. Обзор литературы // МРЖ, 1988. Разд. М. -1. - С. 20-23.

101. Кицак В.Я., Мойсиади С.А. Биофизические параметры и биологическая активность ДНК вируса простого герпеса. Рестрикционный анализ // вопросы вирусологии, 1980. 1. - С. 16-23.

102. Кицак В.Я., Мойсиади С.А., Бочаров А.Ф. и др. Сравнительное изучение эффыективности очистки и концентрирования вируса простого герпеса типов 1 и 2 // Вопросы вирусологии, 1979. 2. - С. 142-148.

103. Клюкина В.И. Промышленные технологии производства тест-систем для диагностики инфекционных болезней свиней // Автореф.дисс.-.докт.биол.наук, Щелково, 2002.

104. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству: Докл. 7-й. Женева, 1984 (СТД 709).-104с.

105. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству: Докл. 8-й. Женева, 1994 (СТД 824).-118с.

106. Кочиш И.И. Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики хламидиоза овец: Автореф.дисс.канд.биол.наук. Щелково, 2000.

107. Красочко П.А., Усов С.М. Эффективность использования вакцины «Монорин» для профилактики инфекционного ринотрахеита. Технология получения и выращивания здорового молодняка с.-х.животных и рыбопосадоч.материала // Минск, 1993. —С. 106-107.

108. Красуткин С.Н. Усовершенствование технологий производства вакцин против бешенства животных: Автореф. дисс.канд.наук. Щелково, 2002.

109. Крюков Н.Н. Инфекционный ринотрахеит пустулезный вульвавагенит КРС // Инфекционные болезни при промышленном скотоводстве, М., 1980. - 13. -С. 32-113.

110. Крюков Н.Н. Научные принципы специфической профилактики вирусных респираторных заболеваний КРС // Тр. ВИЭВ, 1981. 53. - С. 13-20.

111. Крюков Н.Н. Инфекционный ринотрахеит // Инфекционные болезни КРС, 1974.-С. 83-93.

112. Крюков Н.Н., Сологуб В.К., Шуляк А.Ф. Гемагглютинирующие свойства вируса инфекционного ринотрахеита КРС // Ветеринария, 1982. 1. - С. 26-28.

113. Кудрявцев В.В. Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококка. Автореф.дисс.канд.вет. наук. М., 1993. -24 с.

114. Кузнецов А.В. Молекулярные аспекты транспорта экзогенной ДНК сперматозоидами: Авторефдисс. докт.биол.наук. Оболенск, 1999.

115. Кузнецов Д.П. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота:диагностика на основе современных методов биотехнологии:Автореф. дисс.докт.биол.наук. Щелково, 2001.

116. Кузнецов П.П., Иванов B.C., Игнатьева B.C., Ревишвили Т.М. Иммуногенностъ кулыурального вируса бешенства, инактивированного УФ -светом : Тез. докл. 4-й Всесоюзн. вет. вирусол. конф. «Актуал. вопр. вет. Вирусодогии» Владимир, 1976. - Ч. 2. - С. 45-47.

117. Кузнецов П.П., Таршис М.Г. Бешенство животных: Обзорная информ. -М.:ВНИИТЭИсельхоз, 1981.-С. 4-5.

118. Кузнецова С.В., Сорокина О.Ф., Панферова С.М. и др. Концентрирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом ультрафильтрации // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности, 1984. 12. - С. 3-4.

119. Ламберт Дж., Берт Дж.Р. Среды для выращивания клеток // Биотехнология выращивания клеток животных, М., 1989. С. 98-138.

120. Лежнев Э.И. Теория и методы управляемого культивирования клеток животного и человека // Управляемое культивирование клеток, Пущино, 1983. — С. 8-32.

121. Лихачев Н.В. Вакцины против бешенства // Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты, М., 1963. С. 28-38.

122. Лях Ю.Г., Крот Л.А. Поливалентная вакцина против пастереллеза свиней и крупного рогатого скота: Мат. Межд.науч.-прак.конф «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2005. — С. 326-329.

123. Мазур Т.В. Характеристика производственных штаммов пастерелл: Тез.докл.конф. «Совершенств.методов госконтроля вет.препаратов» М., 1991. -С. 14-16.

124. Майборода А. Д., Крюков Н.И. Адсорбция вируса инфекционног ринотрахеита крупного рогатого скота гидратом окиси алюминия // Ветеринария, 1976.-4.-С. 51-52.

125. Мамков Н.С. Масляные адъюванты для противоящурных вакцин:

126. Автореф;дисс.докт.вет.наук. Владимир; 1999;.

127. Медуницин Н.В. Вакцинология // М., 1999,- С. 14-23.

128. Мельникова В.А. Значение состояния популяции микроорганизмов для? разработки питательных сред и процессов культивирования. Автореф. дисс.докт. биол. наук. М., 1987.- 43 с.I

129. Мирисмаилов М.И. и др. Усовершенствование некоторых этапов производства сухой антирабической вакцины. // Вопросы инфекционной инеинфекционной патологии Ташкент, 1975. - С. 205-208.

130. Мирясова Л.В., Баснакьян И.А. Совершенствование технологии культивирования коклюшных бактерий на основе изучения кинетики процессов. Микробиология, 1983.- 10.-С. 20-25.

131. Моисеев А.В. Иммуноферментная тест-система для диагностики хламидиоза пушных зверей (лиса, норка и песец). -Автореф. дисс.канд.вет.наук. Щелково, 2000:

132. Морозов И.А., Шуляк А.Ф., Артюшин С.К., Коромыслов Г.Ф.

133. Деффиринциация штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью рестрикционного анализа // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1991. Т. 4. - С. 29-32.

134. Мутафаров С.Б., Минкевич И.Г., Ерошин В.К. рН-ауксостат: теория и практика//Пущино, 1985.- С. 41.

135. Мчедлишвили Б.В., Кондратьева H.JL, Аксенова Т.А. Опыт использования мембран типа «Владипор» для концентрирования кулыурального вируса бешенства// Тез.конф. «Вопросы медицинской вирусологии», 1975. С. 500-501.

136. Назаров В.П. Бешенство животных. М.: «Сельхозгиз», 1961. - 160 с.

137. Налимов В.В. Теория эксперимента. М.: Наука, 1971.- 207 с.

138. Наумкина М.А. Разработка методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции для идентификации вируса бешенства; Автореф. Дисс . канд. биол. наук. Покров. 1999. 27 с.

139. Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства // Автореф.дисс.канд.вет.наук, Покров, 1998.-24 с.

140. Никишин И.В., Сологуб Т.В., Вишняков И.Ф. Получение универсального культурального рабического антигена: Мат. науч. конф. «Вопросы ветеринарной вирусологии и микробиологии». Покров, 1992. - С.260.

141. Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. Итоги науки и техники // Вирусология, 1979. Т. 8. - С. 3134.

142. Новохатский А.С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. Итоги науки и техники // Вирусология, 1979. Т. 8. - С. 3134.

143. Ночевный В.Т. Оптимизация процессов производства культур клеток и вирусов в суспензии переживающих тканей // Автореф.дисс. .докт.биол.наук, М., 1994.

144. Нужнов С.А. Диагностические исследования на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота в хозяйстве, неблагополучном по респираторным болезным телят // Бюл. ВИЭВ, 1989. Т. 71. - С. 32-33.

145. E.JI. Головлев, Л.А. Литвиненко, А.Н. Шкидченко, А.В. Шульга. Об изучении физиологического состояния микроорганизмов //Микробиология, 1982.-51.- 1.-С. 171-174.

146. Озеренко О.А., Раевский А.А., Рубан Е.А. Математическая модель периодического процесса культивирования сальмонелл: Мат. Межд.науч.-прак.конф. молод.уч. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2004. - С. 79-84.

147. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-потнециал как индикатор физиологического состояния бактерий в культурах с добавлением субстрата: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. «Управляемое культивирование микроорганизмов» -Пущино, 1986. 140с.

148. Определитель бактерий Берджи. -М.Д997.-Т.1.- С. 200-203.

149. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. -М., 1999-С. 498-500.

150. Орешкова С.Ф., Глотов А.Г., Семинихина В.И. и др. Выявление вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота гибридизацией с нерадиоактивными ДНК-зондами // Вопросы вирусологии, 1995. № 6. -С. 279-282.

151. Панасюк Д.И. Смешанные (сочетанные), ассоциированные и осложненные болезни // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной эксперизы, Ульяновск, 1994. С.57-59.

152. Панин А.Н., Засепский Н.Х., Цветков Е.И. и др. Способ изготовления вакцины для профилактики стрептококкозов свиней". Авторское свидетельство N 1564789, 1988.

153. Панкратов В.П. Двухкратные культивирования клеток // Управляемоекультивирование клеток, Пущино, 1983.-С. 122-139.

154. Патент Румынии N 80308. Вакцина против респираторных болезней свиней и способ ее получения. От. 06.05.89 г.

155. Мельникова В.А., Баснакьян И.А., Ратникова Т.К., Власенко А.П. Патология и физиология микробов. Сообщение III. Критерии оценки функциональных состояний //Микробиология, 1984.-1.-С. 42-46.

156. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-331 с.

157. Петкус Ю.К., Моркунас А.Б., Диканене И.П. Применение иммуносорбентов для получения специфических антисывороток к иммуноглобулинам IgGl и IgG2 коров // Метаболизм и его регуляция биологическими активными веществами, Вильнюс, 1979. С. 237-241.

158. Пилле Э. Р. Лиссавирусы // Вопросы вирусологии 1996.- №1.- С. 2-6.

159. Пинаев Т.П. Методы культивирования клеток : Научные труды ин-та цитологии АН СССР. Л.:Наука,1988. - 319 с.

160. Пинаев Г.П., Кухарева Л.В., Дьяконов И.А. и др. // Иммобилизированные клетки в биотехнологии, Пущино, 1987. С. 48-56.

161. Писаренко Н.П. Иммуногенность культур P. multocida, выделенных при пневмониях // Болезни овец в Ставропольском крае. — Севастополь, 1991. — С. 6571.

162. Прунтова О.В., Русалеев B.C. и др. Получение специфических компонентов Haemophilus parasuis для постановки реакции агглютинации (Получение антигена HPs и гипериммунных сывороток) // Болезни диких животных, 2004. С. 174-178.

163. Почерняева Р.Я. и др. // Вопросы вирусологии, 1990 №5.- С.433.

164. Прилепская Е.П., Анисимова Л.И., Недосеков В.В., Юрков С.Г. Культивирование вируса бешенства в культуре клеток ПС с низким содержанием сыворотки: Тез. докл. Международной научно-практ. конф. Покров, 2001. -С.66-68.

165. Прискока В.А. Распространение и течение смешанных инфекций всвиноводческих хозяйствах // Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка с.-х.ж-х. Минск, 1990. - С. 17-21.

166. Процессы культивирования микроорганизмов / И.Л. Работнова, И.А. Бас-накьян, В.И. Боровкова, Л.Н. Запорожцев. Изв. АН СССР. Сер. биол.- 1982.-4.-С.559-572.

167. Прудников С.И. Эпизоотология заболеваний, обусловленных условнопатогенными микроорганизмами в свиноводческих хозяйствахпромышленного типа // Профилактика и меры,борьбы с инф.болезнями с.-х.ж-х. Новосибирск, 1987. - С. 142-147.

168. Прунтова О.В., Русалеев B.C., Гневашев В.М: и др. Смешанная бактериальная инфекция в патологии молодняка сельскохозяйственных животных и птиц: Тезис докл.конф. «Проблемы инфекционной патологии с.-х.ж-х» Владимир, 1997. - С. 190.

169. Работнова И.Л. Об изучении физиологического состояния исследуемых микроорганизмов//Микробиология, 1980.- 49.- 4.-С. 634-638.

170. Раевский А.А. Разрабртка управляемого процесса культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин: Автореф дисс.канд.биол.наук. -Щелково, 2002.

171. Раевский А.А., Анисимова Л.В., Коротеева Л.А., Хабаров А.К.Разработка

172. Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». Щелково, 2004. - С. 173174.

173. Раевский А.А., Самуйленко А .Я., Анисимова J1.B. и др. Разработка новых технологий изготовления противобактерийных препаратов:Тезисы семинара -презентации инновационных научно-технич. проектов «Биотехнологии -2000». Пущино 2000. -С. 28-29.

174. Раевский А.А. Разрабртка управляемого процесса культивирования Pasteurella multocida при производстве вакцин. -Автореф.дисс.канд.биол.наук. -Щелково, 2002.

175. Рубан Е.А. Автоматизация процессов культивирования клеток животных в суспензии (Экспресс-информация) // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности, Щелково, 1981. № 6. - С. 4-6.

176. Рубан Е.А. Биотехнология производства препаратов для защиты животных / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, 1999. № 1.-С. 67-70.

177. Рубан Е.А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных с использованием методов системного анализа: Автореф. дис . д-ра биол. наук. М., 1995.

178. Рубан Е.А., Сазыкин Н.Ю., Зиновкин К.В. и др. Устройство для измерения заряда микроносителей // А.С. № 1398826, 1987.

179. Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Гунин М.А. Некоторые проблемы глубинного культивирования животных клеток в биореакторах // Тез.докл.Всерос.научно-практ.конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000. С. 290-293.

180. Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я., Гунин М.А. Гибель клеток при их выращивании на микроносителях // Тез.докл.Международ.семинара-презентации инновакцинных научно-технических проектов «Биология-2000», Пущино-на-Оке, 2000. С. 29-30.

181. Русалеев B.C. Разработка инактивированных вакцин против сальмонелле-за и пастереллеза свиней: Докл. Конф. «Современные аспекты патологии животных». - Владимир, 1999.-С. 141-147.

182. Сазанова Э.Я., Кузнецов Д.П, Кузнецова С.В., Бойко А.А. Выделение анти-IgG лошади из сыворотки крови кролика методом аффинной хромотографии // Передовой науч.-производет.опыт в биол.промышл., 1986. — 12. -С. 1-3.

183. Сазанова Э.Я. Инактивация вируса бешенства фенолом //Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. -М.,1977. -№3.- С. 5-9.

184. Сазанова Э.Я. Тепловая инактивация вируса бешенства// Ветеринария.1978. -№9.-С. 44-45.

185. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы технологии производства ветеринрных биологических прпаратов (I и II том). — Москва, 2000.

186. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Озеренко О.А. Влияние концентрации глюкозы на накопление и выживаемость пастерелл // Вет.мед. Межвед. тематич.науч.сб. Харьков, 2004.- 84. - С. 852-854.

187. Самуйленко С.А. использование культур клеток органов поросенка в производстве ветеринарных биопрепаратов и получении трансгенных свиней. -Дисс. канд . биолог, наук. Щелково, 2000. 108с.

188. Сафонов Г.А., Чевелев С.Ф., Калинина Т.А., Башмакова А.П. Результаты исследований по разработке и производственным испытаниям культуральной лиофилизированной вирусвакцины из штамма ТС-80 // Отчет о НИР. Покров, 1991. - 43 с.

189. Селимов М.А. Бешенство М.: Медицина, 1978. - 336 с.

190. Селимов М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспективы элиминации бешенства // Вопросы вирусологии. 1998. - №5. - С. 195-198.

191. Сергеев В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани. — Автор.дисс. .докт.биол.наук, Москва, 1967.

192. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Киев: "Урожай", 1993.-368 с.

193. Смирнов П.Н., Сороколетова В.М., Суворина О.С. Иммунная защита поросят с использованием аллогенной иммунной сыворотки свиней (АИСС) // Актуал.вопросы вет.медицины, 2005. С. 271-273.

194. Сергеева И.В., Василиади А.Г., Аваков А.Э. и др. Сравнительный анализ рестриктных карт штаммов «ИРТ/МВА/2/81» и «40616» вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Актуал.вопр.инфекц. и инваз. Болезней жиивотных, М., 1993. С. 77-79.

195. Сидоров М.А. Гемофилезы животных // М., 1986. 176 с.

196. Сидоров М.А. Специфическая профилактика сальмонеллеза у свиней. // Ветеринария. 1992.- №6. - С. 32-35.

197. Ситьков В.И. Особенности промышленного производства ассоциированных и поливалентных биопрепаратов // Диагностика, лечение и профилактиказаболеваний с.-х. ж-х. Ставрополь, 1997. - С. 18-19.

198. Скичко Н.Д. Гидролизаты животных белков основа питательных сред для промыленного производства биопрепаратов. - Автореф.дисс.докт.биол.наук. Москва, 1992.

199. Скородумов Д.И., Сидоров М.А., Прусак-Глотов В.Э. Возбудители фибринозно-геморрагической плевропневмонии свиней // Ветеринария 1992.- 6.-С. 21-24.

200. Сливко И.А. Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов ТС-80 и 71БелНИИЭВ-ВГНКИ вируса бешенства. Автореф. дисс.канд.наук. Покров, 2003.

201. Станишевский Я.М., Лобова Т.П. и др. Использование полимерных суспензий в качестве сорбента вирусов для детекции антител в сыворотках крови крупного рогатого скота // Вопр.вирус., 2006. Т. 51, № 4. — С. 45-48.

202. Субботин В.В., Сидоров М.А. Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококка // Ветеринария, 1996.- №4. С.24-27.

203. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Бешенство: Вирусные болезни животных. -М., 1998. 928 с.

204. Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология// М., «Колос». С. 61-67.

205. Танцуиз М. Питательные среды при культивировании тканей. Тампакуцсицу капусан косо // Protein, Nuclek Acid and Tnsyme, 1988. 33. - № 11.-С. 1829.

206. Тарасов B.H. Управляемое культивирование и непрерывное культивирование вирусов и клеток позвоночных // Итоги науки и техники, ВИНИТИ, сер. «Микробиология», 1975. № 4. - С. 152-207.

207. Таршис М.Г., Ковалев Н.А., Кузнецов П.П. Бешенство животных. -Минск: «Ураджай», 1990. 174 с.

208. Тетеричев В.И. Эпизоотологическая ситуация по бешенству в Тульской области и совершенствование мер борьбы с этой болезнью на современном этапе: Автореф.дисс.канд. вет наук. Щелково, 2001.

209. Тихонов И.В., Рубан Е.А., Грязнева Т.Н., Самуйленко А.Я., Гаврилов В.А. Биотехнология. С.-Петербург, 2005. - 704 с.

210. Толокнов А.С., Кравченко В.М., Гусев А. А., Мамков Н.С. Иммуногенность эмульсионной противоящурной вакцины, изготовленной из сухого антигена А22 № 550// Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. -Владимир, 1983.- С. 64-66.

211. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. Ставрополь, 1997. - 133 с.

212. Угайкин В.Ф., Шамшева О.В. Вакцинопрофилактика.-М.,ГЭОТАР МВД 2001.

213. Федосеев К.Ю. Инактивированная эмульсионная вакцина против инфекционного ларинготрахеита птиц // Автореф.дисс.канд.биол.наук, Владимир, 2007.

214. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных // М., Мир, 1977. Т. 1. — 447 с.

215. Фролова А.В., Шафеева Р.С. Культивирование вакцинного вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero на микроносителях: Сб. науч. трудов. «Вирусные инфекции» Екатеринбург, 1993. - С. 295-299.

216. Хабаров А.К. Влияние условий культивирования на ростовую активность пастерелл: Мат. Межд.науч.-прак.конф. «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». — Щелково, 2004. С. 52-53.

217. Хабаров А.К. Оптимизация состава питательных сред для культивирования гемофильных бактерий: Мат. Межд.науч.-прак.конф. «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». Щелково, 2004. - С. 6970.

218. Хабаров А.К., Раевский А.А. Изучение характера роста пастерелл при хемостатном культивировании: Мат. Межд.науч.-прак.конф. молод.уч. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». — Щелково, 2004.-С. 49-51.

219. Хабаров А.К., Раевский А.А. Разработка технологического процесса непрерывного культивирования пастерелл при производстве поливалентной

220. ГОА-вакцины против пастереллеза свиней // Мат.Межд.науч.-прак.конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». Щелково, 2004. - С. 45-48.

221. Хабаров А.К. Разработка процесса хемостатного культивирования пастерелл при производстве вакцин // Автореф. дис. канд.биол.наук, Щелково, 2005.

222. Хагивара X. // Биоиндастрии, 1987. 4. - № 8. - С. 622-631.

223. Харитоненков И. Г., Закомырдин Ю. JL, Григорьев В. Б. и др. // Вопр. Вирусологии, 1982. — № 3. — С. 358—362.

224. Царева А.А., Исаенко JI.A., Немцов Ю.В. и др. Каталог перевиваемости культур клеток, т. 1-4 ВНИИ мол.биол. // Деп. ВИНИТИ 29.01.88. С. 865-1388.

225. Цеденхуу П. Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA»: Автореф. дисс.канд. Наук. Владимир, 2005.

226. Чечеткина Н.П., Кузнецов А.Г., Стеценко А.В. Носительство вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи у крупного рогатого скота // Проблемы и перспективы паразитоценологии, Харьков, Луганск. С. 175-176.

227. Шафеева Р.С., Фролова А.В. Культуральная антирабическая вакцина на клетках Vero //Цитология 1994. Т. 36, № 6.- С. 588.

228. Шегидевич Э.А. Состояние и перспективы изучения пастереллезов с/х животных: Сб. научн. трудов ВИЭВ, 1984.- 60.-С. 58-63.

229. Шипилов В.И. Усовершенствование технологии изготовления антирабической вакцины: Тез. докл. Всероссийской науч.-практ. конф. «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных» Владимир, 1995.-57с.

230. Шипицын А.Г., Семенов И.Г., Пшеничный А.А. Сухая культуральная ассоциированная вакцина против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита (вакцинация телят на откормочных комплексах) // Тр. ВИЭВ, 1991. — Т. 69. С. 91-93.

231. Школьников Е.Э., Анисимова Л.В., Соловьев Л.Б., Коротеева Л.А., Родин

232. Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Скородумов Д.И., Шегидевич Э.А. Испытание сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней: Мат. Межд.науч.-прак.конф. «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее». -Щелково, 2004. С. 56-57.

233. Шубина Е.А., Скичко Н.Д., Шегедевич Э.А. Прблемы профилактики пневмонийных пастереллезов свиней: Мат. Межд.науч.-прак.конф. «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». — Щелково, 2005. С.321-326.

234. ТТ Тугтяк- А.Ф. Стабильность вакцинного штамма ТК-А вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Бюл. ВИЭВ, 1989. Т. 71.-С. 16-21.

235. Щетникова Л.А. Получение чистых антител и иммуноглобулинов классов М и G КРС методом аффинной хроматографии на сефарозе // Сб.нау.тр. МВА, 1979.- 107.-С. 34-35.

236. Эрнст Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. — М., 1995.

237. Эрнст JI.K., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. -М.: Колос, 1995.-С. 132-144.

238. Эрнст Л.К., Жигачев А.И. Мониторинг генетических болезней у животных в системе крупномасштабной селекции. М., 2006. - 382с.

239. Юров К.П., Щербаков П.Н. Реактогенные и иммуногенные свойства новой инактивированной вакцины против ринотрахеита крупного рогатого скота //Бюл. ВИЭВ, М., 1994. 8 с.

240. Юткин Е.В. Получение трансгенных коз и изучение фенотипических показателей у трансгенных овец с геном-казеин-химозина: Автореф.дисс.канд.биол.наук. Моск.обл., п. Горки Ленинские, 1999.

241. Ярцев М.Я., Сапегина Е.П., Душук Р.В. и др. Антигенные и иммуногенные свойства пастерелл на разных стадиях роста при управляемом культивировании // Передов.науч.-произв. опыт в биол. промыш-ти. — 1985. -№11. С.1-6.

242. Ackermann М., Belak S., Bitsch V. Round table on infectious bovine rhinotracheitis/infectious pustular vulvovaginitis virus infection diagnosis and control // Veter. Microbiol., 1990. -T. 23. -N P. 361-363.

243. Ackermann M., Muller H.K., Bruckner L. Die Bekampfung der Infektiosen Bovinen Rhinotracheitis (IBR) in der Schweiz von 1978 bis 1988 // Schweiz. Arch. Tierheilk, 1989.- T. 131.- N 7.- S. 397-407.

244. Ackermann M., Weber H., Wyler R. Aspects of infectious bovine rhinotracheitis eradication programmes in a fattening cattle farm // Prev. veter. Med, 1990.- T. 9.- N 2.- P. 121-130.

245. Ackermann M., Muller H.K., Bruckner I., Kihm U. Eradication of infectious bovine rhinotracheitis in Switzerland: Review and prospects // Veter. Microbiol, 1990.- T. 23.- N x/4.- P. 365-370.

246. Allison A. C. Immunity against viruses. In Scientific Basis of Medicine: // Annual Reviews I. Gilliland and J. Francis, Editors.-P. 49-73. Lon don: The Althone Press., 1972.

247. Allison A. C. Interactions of antibodies, corn plement omponents andvarious cell types in im munity against viruses and pyogenic bacteria // Transplant Revs., 1974.-19.-P. 3-55.

248. Allison A. C. On the role of mononuclear phagocytes in immuity against viruses//Prog. med. Virol.,-1974.- 18.-P. 15-31.

249. Allison A. C. and L. Malluci. Histochemical studies of lysosomes and lysosomal enzymes in viral infected cell cultures // J. exp. Med. 1965.- 121.-P. 463-476.

250. A1-Rubeai, Emery A.N. Mechanismus and kinetics of monoclonal antibody and secretion in synchronous and asynchronous hybridoma cell culture // J. Biotechnol., 1990. 16. - P. 67-86.

251. A1-Rubeai, Singh R.R., Goldman M.N., Emery A.N. Death mechanismus of animal cells in condition of intensive agitation // Biotechnol. Bioeng., 1994. 45. -P. 463-472.

252. Armerdin D., Rossiter H., Ghazzouli et al. Rapid diagnosis of Aujeszky's disease in pigs byimmunofluoresctnct // J. Infect. Des., 1982. Vol. 145. - P. 320-330.

253. Anilionis A., Wunner W.H., Curtis P. Development of a microtitre fluorescent antibody test for serological detection of adenovirus infection inbirds // Nfture, 1981. Vol. 294. - P. 275-278.

254. Atanasiu P., Lepine P., Dighe P. Purification partielle et concentration du virus rabiegue des rues, culture sur une souse de cellules clonales de rein de hamster // C.K. Acad. Sci. 1963. - № 256. - P. 1415-1417.

255. Babiuk L.A., Rouse B.T. Ribonukleotides in infectious bovine rhinotracheitis virus DNA // J. Gen. Virol., 1976. -31.-221.

256. Babiuk L.A., Wardley R.C., Rouse B.T. Defense mechanisms against bovine herpesvirus: relationship to virus-host cell events to susceptibility to antibody complement lysis // Infection and Immunity, 1975. 12. - P. 958-963.

257. Bachmayer H., Liehl E., Schidt G. Isolation and cell culture propagation of rotaviruses from turkeys and chickens // Post-grad. Med. J., 1976. Vol. 52. - P. 360-367.

258. Baer G.M. Oral rabies vaccination // Rev. Infec. Diseases 1988. Vol. 10, №4.-P: 644-648.

259. Bacer J.C. Clinical aspects of bovine virus diarrhoea virus infection // Rev. Sci. Techn.Off.Epizoot., 1990. T. 9. - N 1. - P. 25-41.

260. Banes A. Biocompatidble polyorganosilloxane compasition for cell culture apparatus: Пат.США, № 4789601, 1988.

261. Bang F.B. and Warwick A. Mouse macrophages as host cells for the mouse hepatitis virus and the genetic basis of their susceptibility // Proc. Nat. Acad. Sci., I960: P. 46: 1065-1073.

262. Вагоп С., Thompson Т.Е. Prevalence of antibody to conventional and atypical rotaviruses in chickens. Biochem. Biophys // Acta, 1975. Vol. 382. -P: 276-285.

263. Bartal A.H. Apparatus for enhancing cell growth, preservation and transport. Пат.США, №4734313, 1988.

264. Bartha A., Kisary J., Belan S. The general ferile respiratory of infectious bovine rhinotracheitis in calves // Acta Vet. Acad. Sci. Hung., 1974. 24, 1. - 2. - P. 77-83.

265. Basak S., Compans R. W. An entero-like virus associated with the runting syndrome in broiler chickens // Virology, 1983.- Vol. 128.-P. 77-91.

266. Bass E.P., Schrpee L., Norden L.J., Lincoln Inactivated rabies vaccine for veterinare use. Пат.США. 4711778 от 22.05.85.

267. Bell S.L., Bebbington C, Scott F., Wardell J.N., Spier RE., Bushell MR, Sanders P.G. Genetic engineering of hybridoms glutamine metabolism // Enzyme. Microbiolm. Technol, 1996.-17.-P. 98-106.

268. Benmansour A., Leblois H., Coulon P., Tuffereau G., Gaudin Y., Flamand A., Lafay F. Antigenecity of rabies glycoprotein // J. Virology 1991. Vol. 65, №8.-P. 4198-4203.

269. Bibila T.A., Flickinger M.C. A model of intraorganelle monoclonal antibody transport and secretion in mouse hibridonia cells // Biotechnoll. Bioeng, 1991.-P. 767-780.

270. Bijlenga G., Bogaard A. In vivo enhancement of rabies infection by dethylaminoethyldextran//Arch. des Virusforsch 1973. Vol. 42, №1. - P.96-101.

271. Black D.N., Slack G. A comparison of two strains of infectious bovine rhinotracheitis virus // Arch. Ges. Virus., 1972. 39. - P. 330-337.

272. Blander R.V. Mechanisms of recovery from a generalized viral infection: mouse pox III. Regression of infectious foci //J. Exp. Med., 1971. 133. - P. 1090-1103.

273. Blander R.V., Hapel A.J., Doherty P.C. and Zinkernagel R.M. Lymphocyte-macrophage activation in the expression of antimicrobial immunity in vivo. In Immunobiology of the Macrophage // D.S. Nelson, Editor, New York: Academic Press, 1976.-P. 367-400.

274. Blander R.V. T cell response to viral and bacterial infection // Transplant Revs., 1974.- 19.-P. 56-88.

275. Bloom B:R. and Rager-Zisman B.Gell mediated immunity in viral infections. In Viral Immunology and Immunopathology // A.L. Notkins, Editor: New York: Academic Press, 1975.-P. 113-136.

276. Bols N.C., Scharer J.M., Philips Н.Л. et at.//Biotechnol.Adv.-1988.-6, № 2.-P. 169-182.

277. Bolton D.S., Zee Y.C., Ardans A.A. Identification of Envelope and Nucleocapsid Proteins of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis // Veter. Microbiol., 1983. - 8, 1. - P. 57-68.

278. Borunda G.A., Aofaro F.J.P., Melgarejo C.V., Aparicio E.D. Patron de comportamiento de anticuerpos contra IBR en becerras у vaquillas Holstein-Friesina bajo un esquema de vacunacion // Teen, pec, en Mexico, 1989.- T. 27. Nl.-P. 22-29.

279. Bosch F. X., Mayer A, Huang R. Т. С An outbreak of abortion in a dairy herd following inoculation with an intramuscular infectious bovine rhinotracheitis virus // Med. Microbiol. Immunol. 1980. — Vol. 168.—P. 249—259.

280. Bottex C, Burckhart M. F., Fontanges R. The virus of infectious bovine rhinotracheitis as a cause of abortion in cattle. // Arch. Viroe.1981.— Vol. 70.—P.83— 89.

281. Bourhy H., Kissi В. Molecular diversity of the Lyssavirus genus // Virology 1993.-Vol. 194.-P. 70-81.

282. Brand C.M., Skehel J.J. Reactivation of a bovine herpesvirus aftar cprticosteroid treatment // Natur. New Bioe., 1972. Vol. 238. - P. 145-147.

283. Brentrup H. Grippe-Bullen bringen nur Verlust // Landw. Wochenbl. Westfalen-Lippe, 1990. T. 147. - N 15. - P. 34-35.

284. Bulter M.//Biochem.Eng.Biotechnol, 1987. 56, № 8. - P. 346-349 / Cell culture substrares for inproved cell attachment // Bioprocess Technol., 1988. - 10, № 8. - P.7.

285. Burrill P.M., Bemarolini L., Kleinan H.K. Effect of serum, fibropectin, and lumilin on adhesion of rabbit intestinal epithelial cells in culture // J.Supromol. Struct and Cell Biochem. 1981.-Vol.l6.-4.-P.385-392.

286. Bzik D.J., Fox B.A., Deluka N.A. et al. Infectious bovine rhinotracheitis virus excretion after vaccination, challenge and immunosuppression // Ibid., 1984. — Vol. 133.-P. 301-304.

287. Cappel R. Comparison of the humoral and cellular immune responses after immunization with live, UV inactivated herpes simplex virus and a subunit vaccine and efficacy of these immunizations // Arch Virol., 1976. 52. - P. 29-35.

288. Casselberry N.H. Present status of immunization procedures for infectiousbovine rhinotracheitis // J. Am. Vet. Med. Assoc., 1968. 152. - P. 853-856.

289. Chister K. A., Hawkins R. E. Clinical issue in antibody design // Tib. Tech., 1995.- 13.-P. 294-310.

290. Chisti M.Y. //Airliff bioreactors. Elsever Science Publishers LTD, New Jork, 1989-h. 120.

291. Clark J.M., Gebb С, Hirlenstein V.D., Develop //Biol.Stand., 1982.-50,- P. 81 -91.

292. Conzelman K., Cox J., Schneider L., Thiel H. Molekular cloning and complete nucleotide seguence of the attenuated rabies virus SAD В19 // Virology 1990. P. 485-499.

293. Cortney R., Steiner S.M., Benyesh-Melnick M. Molecular epidemiology of DNA viruses: applications of restriction endonuclease cleavage site analyses // Ibid, 1973.-Vol. 52.-P. 447-455.

294. Coudert M., Martel J.L., Fedida M. The French national network of epidemiological surveillance of bovine disease // Acta Veter. Scand. Suppl., 1988. -T. 84.-P. 176-179.

295. Cotter T.G., Al-Rubeai M. Cell death (apoptosis) in cell culture system // Tib. Tech., 1995. 13.-P. 447-455.

296. Couture M. L., Heath C.A. Relationship between loss of heavy chains and the ppearance of nonproducting hybridomas // Biotechnol. Bioeng., 1995,- 47.-P. 270-275.

297. Cox J.H., Dietzschold В., Schneider L.G. Characterization of virulent and avirulent strains of pseudorabies virus for thymidine kinae activity, virulence and restriction paiterns // Infect. And Immun., 1977. Vol. 16. - P. 754-759.

298. Crimmins D.L., Schlesinger S. Differention of pseudorabies (Aujeszky's Disease) virus streins by restriction endonuclease analysis // Biochemistry (Wash.), 1982. Vol. 21. - P. 3518-3524.

299. Culture plate//Amer.Biotechnol. Lab, 6, № 8A., 1988. -p.46.

300. Curtis R.A., Angulo A. A field trial to evaluate an intranasal infectious bovine rhinotracheitis vaccine // Can. Vet. J., 1974. 15. - P. 327-330.

301. D'Offay J.M., Mock R.E. Isolation and characterization of encephalitic bovine herpesvirus type 1 isolates from cattle in North America // Am. J. Veter. Res., 1993.-Vol. 54.-N4.-P. 534-539.

302. Dan F., Stirbu Т., Date on cell culture prepared rabies vaccine control // Stud. Res. In vet. Med. Bucharest 1992. - Vol. 1, № 1. - P. 33-38.

303. Darsel C.Q., Dorward W.J. Recovery of infectious bovine rhinotracheitisvirus following corticosteroid treatment of vaccinated animals // Can. Vet. J., 1975. 16.-P. 87-88.

304. Development of cell culture (MDCK) live cold-adapted (CA) attenuated influenza vaccine (Y.Z. Ghendon, S.G. Markushin, I.I. Akopova et al.) // Vaccine, 2005. V. 23, № 38. - P. 78-84.

305. De Bruyne N.A. Magnetic stirrer apparatus with quided, folating stirrer. Toche tap. Пат. США № 4665377, 1984.Frame K.K., Hu W.S. Behaior of producers andcompazision to nonprodusers//Biotechn. Bioeng. 1995.- 42.-P. 1011-1118.i

306. Dietzschold В., Tollis M, Lafon M., Wunner H., Koprowski H. Mechanisms of rabies virus neutralization by glycoprotein-specific monoclonal antibodies // Virology, 1987. Vol. 161, № 1. - P. 29-36.

307. Dietzschold B. Localization and immunological characterization of antigenic domans of the rabies virus internal N and NS proteins // Virus. Res. 1987. - №8. -P. 103-105.

308. Dietzschold В., Wunner W., Wiktor Т., Koprowski H. Chemical and immunological analisis of the rabies soluble glycoprotein // Virology 1983.-Vol. 124.-P. 330-337.

309. Dietzschold В., Wang H., Rupprecht C, Celis E., Tollis M, Ertl H., Heber-Katz E., Koprowski H. Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci 1987.-Vol. 84.-P. 9165-9169.

310. Dudnikov A.I., Koropov V.N., Smirnov V.I., Mikhalichine V.V., Oufurov N.A., Mamkov N.S. Le vaccin antiaphteux en emulsion a base de virus lapinise. — In: O.I.E.XVI-e Conf. Comm. Pour l'etude Fievre Aphteuse/ 14-17 sept. Paris 1982.- P. 89-92.

311. DuptonH.W. et al. Evaluation of experimental sudunit vaccines for infectious bovine rhinotracheitis. // American Journal of veterinary reseach 1980.-T.41,№3.-P.383-390.

312. Eagle H. Amino-acid metabolism in mammalian cell cultures // Scince 1959.-P.432-437.

313. Eckert A.E. Persistent infection of the genital tract and excretion of the vaccine strein after live virus immunization with bovine herpesvirus 1 (IBR/IPV virus) // Infect. And Immun., 1976.-Vol. 14.-P. 1302-1308.

314. Edelman R. Excretion and reexcretion of thermosensitive and wild-tyre strains of infections bovine rhinotracheitis virus after co-infection or two successive infections // Rev. Infect. Dis., 1980. Vol. 2. - P. 370-383.

315. Edelman R., Hardegree M.C., Chedid L. Ovarian lesions induced in heifers by intravenous inoculation with modifiedlive infectious bovine rhinotracheitis virus on the day after breeding // J. Infect. Dis., 1980. Vol. 141. - P. 102-112.

316. Edwards A J. The effect of stressors like rumen overload and induced abortion on BRD in feedlot cattle // Agri-Pract, 1989. T. 10, N 2. - P.l 0-15.

317. Edwards S., White H., Nixon P. A study of the predominant genotypes of dovid herpesvirus 1 found in the U.K. // Veter. Microbiol., 1990. T. 22, N 2/3. - P. 213-223.

318. Enders O. Serologische Untersuchungen uben die Verbeitung von IBR-Infektionen in den Rinderbestanden des Saarlandes, 1989.

319. Ennis F.A. Comparison of the genomes of infectious bovine rhinotracheitis and infectious pustular vulvovaginitis virus strains by restriction endonuclease analysis // Arch. Virol., 1982. Vol. 73. - P. 207-217.

320. Evans D.L., Barnett J.W., Bowen J.M., Dmochenski L. Antigenic relation ship between the herpesviruses of infectious bovine rhinotracheitis, marons disease, and Burkitts lymphome // J.Virol., 1972. 10, 2. - P. 272-287.

321. Fearneyhough G., Glark A. et al. Texas oral rabies vaccination program //International Rabies Meeting: Abstracts. Paris, 1997. - P. 503.

322. Fenje P. A rabies vaccine from hamster kidney tissue cultures: preparation and evaluation in animals // Can. J. Microbiol I960. №6. - P. 605-609.

323. Fenner M. Classification and nomenclature of viruses // Intervirol., 1976.-7.-P.71-116.

324. Ferrua В., Vincent C., Revillard J.P., Petassi G., Malioni R., Viot G., Masseyeff R. // A sand vich method of enzyme-immunoassay. III. Assay for human bets-2-microglobulin compared with radioimmunoassay // J.Immunol.Meth., 1980.- 36, 2.-P. 149-158.

325. Fischer A. Biology of tissue cells.-New York, 1946.- 121 p.

326. Flamand A., Raux H., Gaudin Y., Ruigrock R. Mechanism of rabies virus neutralization//Virology 1993. Vol. - P. 302-313.

327. Fraefel C., Wirth U.V., Vogt В., Schwyzer M. Immediate-early transcription over соvalently joined genome ends of bovine htrpesvirus 1: the cirs gene // J. Virol, 1993.- Vol. 67, N 3.- P. 1328-1333.

328. Frankena K., Franken P., Vandehoek J., Koskamp G., Kramps J.A. // Probability of detecting antibodies to bovine herpesvirus 1 in bulk milk after theintroduction of a positive animal on to a negative farm // Veter.Rec, 1997.-Vol.l40,N 4.-P. 90-92.

329. Freed J.J., Howard S.D., Bluett A.C.Sci.Rept. (1984-1985) Fox Chase Can cer Cent. Ins. Cancer Res, 13th Sci.Rept.Amer.Oncol.Hosp. and Sci. Rept. Philadelphia, Pa.Plenum Prass, 1986. P. 285-286.

330. Freedman J. B. Structural Aspects of Biological Membranes / Ed. J. B. Finean, R. H. Michell. // Elsevier-North Holland 1981.—P. 161—214.

331. Fyass К., Bakke O., Zevine D.W. Growfh of hydridoma cell under confitions of medium stress // Proc. 4th Eur.Congr.Biolechnol.,Amsterdam 1987.- vol.3.-P.589.

332. Gandolfi F., Lavitrana M., Camaioni A., Spadafora C., Siracusa G., Lauria A. The use of sperm-medited gene transfer for the generation of transgtnic pigs // J. Reprod. Fert., 1989.- V. 81.- P. 23-28.

333. Garroff H., Frischauf A.M., Simons K. et al. Changes in the bovine herpesvirus 1 genome during acure infection, after reactivation from latency, and ader superinfection in the host animal // Nature, 1980. Vol. 288. - P. 236-241.

334. Gaudin Y., Rugrock R., Tuffereau С et al. Rabies virus glycoprotein is a trimer // Virology 1992. Vol. 187, № 2. - P. 627-632.

335. Gebimer R.G., Tolbert W.R. Cell culture filtere apparatus and method. Monsanto Co: Пат. США № 825716 1987.

336. Gibson R., Kornfeld S., Schlesinger S. Indirect solid-phase microradioimmunoassay for detection of pseudorabies virus antibody in swine sera // J. Biol. Chem., 1981. Vol. 256.-P. 456-462.

337. Goodman T. and Koprowski H. Study of the mechanism of innate resistance to virus infection // J. Cell сотр. Physiol., 1962. 59. - P. 333-373.

338. Gordon J.B., Scangos, G.A., Plonkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA// Proc. Natur. Acad. Sci. USA, 1980.- V. 77.- P. 7380-7384.

339. Grewal A.S., Rouse B.T. and Babiuk L.A. Mechanisms of resistance to herpesvirus: Comparison of effectiveness of different types in mediatingantibody dependent cell mediated cytotoxicity // Infect. And Immun., 1977. 15. - P. 698-703.

340. Gyorgy E, Sheehan MC, Sokol F. Release of envelope glycoprotein from rabies virions by a nonionic detergent // J. Virol. 8.-P.649-655.

341. Hall W. H., Martin S. J. Application of radioimmunological methods for checking the quality of class-specific antibodies against bovine and porcine immunoglobulins//Med. Micro-biol. Immunol 1974.-Vol. 160.-P. 143-154.

342. Halonen P. E., Ryan J. M, Stewart J. A. Activation of latent infectious bovine rhinotracheitis infection // Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.) 1969.— Vol. 125.—P. 162— 167.

343. Ham R.G. Clonal growth of mammalin cells in a chemically defined synthetie medium//Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53, 1965. -P.288-293.

344. Ham R.G. Survival and grouth requirements of nontransformed cells // Tissue grouth factors /Ed. R. Baserga. Berlin, 1981.- P. 13-88.

345. Ham R.G., Me Keehan W.L. Media and growth requirements // Methods in Ensymology. New York: Academic Press, 1979. - Vol.58 - P.231-348.

346. Hartwig N.R. Is there salvation in a bottle // Feeding and health management. S.I, 1989.-P. 26-29.

347. Hayflick L, Moorhead P.S. The serial cultivation diploid cell strains //Exp.Cell Res.,1961.- 25.-P.585.

348. Heine JW, Spear PG, Roizman B. Proteins specified by herpes simplex virus. VI. Viral proteins in the plasma membrane J. Virol. 1972,- 9.-P.431-439.

349. Heinz F. X., Тита W., Kunz Ch. The characterization of the immunological memory of the IgM type of response in chickens // Infect. Andlmmun 1981.—Vol. 33. —P. 250—257.

350. Heinz F. X., Kunz Ch. Antibody formation. III. The primary and secondary antibody response to bacteriophage Ox 174 in guinea-pigs // J. gen. Virol. 1980.—Vol. 49.—P. 125—132.

351. Helenius A, Simons K. Solubilization of membranes by detergents. // Biochim Biophys Acta 1975.- 415.-P.29-79.

352. Helenius A., Simons K. Transfer of IgG from plasma to nasal secretions in newborn lambs // Biochem. bio-phys. Acta 1975.—Vol. 415.—P. 29— 79.

353. Helenius A., von Bonsdorff С Characterization of an antigenic determinant of the glycopro-tcin that correlates with pathogenicity of rabies virus // Ibid 1976. — Vol. 436. — P. 895—899.

354. Hemert P. Vaccine production as a unit process // Progress in Indust. Microbiol 1974.-№ 13.-P.151-273.

355. Henderson T.M. Class-surfase micrjcarrier for anchorage-dependent cell cul tivation. KMS Fusion; Tnc. Пат.США № 4661407, 1985.

356. Henessy A. M, Davenport F. M. Genetic dimorphism in influenza viruses: Characterization of stably associated hemagglutinin mutants differing in antigenicity and biologi-cal properties // Proc. Soc. exp. Biol. (N.Y.), 1974. -Vol. 146. P. 200-204.

357. Herbert D. A theoretical analysis of continuous culture systems SCI // Soc. Chem. Ind. London, 1961. Vol. 12. - P. 21-53.

358. Herring A.I., Nettleton P.F., Burrells C. A microenzymelinked immunosorbent assay for the detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis virus // Veter. Rec., 1980. 107, 7. - P. 155-156.

359. Hiller G.W., Aeschlimann, Clark D. S., Blanch H.V. A kinetic analysis of .hybridoma growth and metabolism in suspension culture on serum free medium //Biotechnol. Bioeng., 1995.-23.-P. 167-182.

360. Honda E., Katsu V., Fujii C. A comparison of polypeptides and restriction endonuclease sites of BHV-1 isolates and identification of IPV virus in Japan // Japan. J. Veter. Sc., 1989.-T. 51,N6.-P. 1143-1149.

361. Hristov S, Karadjov I, Ignatov et al On the immunogenic properties of a polyvalent inactivated vaccine from respiratory viruses (IBR, Pi-3, Ad-1, Ad-3) (in Bulgarian, English summary) // Vet. Med. Nauki , 1976.- 13(4).-P. 3644.

362. Huang R. Т. C, Wahn K., Klenk H.-D. Varicella-zoster virus-specific gp 140: a highly immunogenic and disulfide-linked structural glycoprotein // 1976.—P. 476—491.

363. Hartel H., Nikunen S. et al. Viral and bacterial patogens in bovinerespiratory disease in Finland // Acta veter. Scand., 2004. Vol. 45, N 3/4. -P. 193-200.

364. Hyland S.J., Easterday B.C., Pawlisch R. Antibody levels and immunity to infectious bovine rhinotracheitis virus (IBR) infections in Wisconsin dairy cattle //Dev Biol Stand 1975.- 28.-P.510-525.

365. Jennings R., Brand C.M., McLaren C. et al. Hemagglutinin variants ofreovirus type 3 have altered central nervous system tropism // Med.Microbiol. Immunol., 1974.-Vol. 160.-P. 295-309.

366. Jensen R., Pierson R.E., Braddy P.M. et al. Shipping fever pneumonia in yearling feedlot cattle // J. Am. Vet. Med. Assoc., 1976. 169. - P. 500-506.

367. Jetteur P., Thiry E., Pastoret P.P. Enquete serologique concernants les virus IBR, CHV2, BVD, P13, RSB et bovipestique chez les petits ruminants au Zaire // Rev. Elevage Med. Veter., 1990. T. 4. - P. 435-437.

368. Kaeberle M., Maxwell D., Johnson E. Antiviral antibodies in a cow herd // Iowa state univ, 1989. T. 597. - P. 32-34.

369. Kaplan A.S., Erickson J.S., Ben-Porat T. Excretion of specific glycoproteins by cells infected with herpes simplex virus types 1 and 2 // Pros. Med. Virol. 1975.- 21.-P.l-12.

370. Kapczynski D.R., Sellers H.S. et al. Immunization of turkeys with a DNA vaccine expressing either the F or N gene of avian metapneumovirus // Avian Dis., 2003. -Vol. 47, №4. -P. 1376-1383.

371. Kasempimolporn S., Hemachudha Т., Khawplod P., Manatsathit S. Human immune response to rabies nucleocapsid and glycoprotein antigens // Clin. Exper. Immunol 1991. Vol. 84, № 2. - P. 195-199.

372. Kawano H., Mifime K, Mannen K. et al. Protection against rabies in mice by a cytoxic T cell clone recognizing the glicoprotein of rabies virus // J. Gen. Virol 1990.-Vol. 71.-P. 281-287.

373. Kelley J.M., Emerson S.U., Wagner RR. The glycoprotein of vesic-ular stomatitis virus is the antigen that gives rise to and reacts with neutralizing antibody // J. Virol.1972.- 10.-P.1231-1235.

374. Kibenge F.S.B., Harris L.M., McKenna P.K., Wadowska D., Vason C.V. Amplification of strains of bovine herpesvirus 1 by use of polymerase chain reaction with priwers in the thymibine kinase region // Am.J.veter.Res, 1994.- Vol. 55, N 9-P.1206-1212.

375. Kissi В., Tordo N., Borhy H. Genetis polymorphism in the rabies virus nucleoprotein gene // J. Virol. 1995. Vol. 209, № 2. - P. 223-229.

376. Kit S., Kit M. Expression of pseudorabies virus and foot-and-mouth disease virus proteins by modified-live infectious bovine rhinotracheitis virus vectors // Proc. Ann. Meet. United States Anim. Health Assn. Richmond (Va), 1990. - 94. -P. 66-75.

377. Kitces E.N., Morahan P.S., Tew J.G. et al. Protection from oral herpes simplex vims infection by a nucleic acid-free virus vaccine // Intect. Immun., 1977. 16. - P. 955-960.

378. Knezevic N., Kosanovic P., Rogan D. Imunoprofilaktiksa respiratornog sindroma goveda inaktivisanim vakcinama. 3. Iapitivanje imunogenosti bivalente inaktivisane uljne vaccine IBR I PI-3 // Veter. Glasnik, 1990. T. 44. - N 7. - P. 503512.

379. Kruse P.P., Patterson M.K. Tissue culture methods and application.- Academic Press: New York, San Francisco, London, 1973.-Vol. 868.- P. 101.

380. Kucera C.J., White R.G., Beckenhauer W.H: Evaluation of the safety and efficacy of an intranasal vaccine containing a temperature-sensitive strain of infectious bovine rhinotracheitis virus // Am.J.Vet.Res. 1978.-39.-P.607-610.

381. Kumrasamy R., Blough H. A. Host responses to infectious bovine rhinotracheitis virus. III. Isolation and immunologic activities of bovine T lymphocytes // Biochem. biophys. Res. Commun 1982. — Vol. 109.— P. 1108—1115.

382. Kundsen K.A. Host defense mechanisms against infectious bovine rhinotracheitis virus. II. Inhibition of plaque formation by immune peripheral blood lymphocytes // Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1981.- 78.-P. 6071.

383. Kutinoua L., Slichtova V., Vonka V. Cell-mediated immunity to Herpes simplex virus in man//Arch. Virol 1979.-Vol. 61.—P. 141— 147.

384. Kwansiowski W., Holl H. Verahren zur Herstellung pH-Wert stabiler Kulturmedien. Патент ГДР № 2803083, 1989.

385. Lafon M., Wiktor T. Antigenic sites on the ERA rabies virus nucleoprotein and non-structural protein // J. Gen. Virol 1985. Vol. 66, № 10. - P. 2125-2133.

386. Lafon M., Ideler J., Wurmer W. Investigation of the antigenic structure of rabies virus glycoprotein by monoclonal antibodies // Monoclon. Antibod.: Stand. Charact. and Use. Pros. Symp. Paris, 1983. - P. 219-225.

387. Lancz L, Physical integrity of Herpes Simplex Virus following thennal inactivation // Arch.Virol., 1980.- 64, 4.-P. 375-381.

388. Lazic S., Mihajlovic В., Durisic S., Vidic В., Cekic N. Neutralizujuca antitela za govedi herpesvirus-1 u krvnom serumu gravidnih krava, teladi i kolostrumu//Veter.Glasnik, 1991.- Vol. 45, br. 11/12.-P. 791-795.

389. Lazic S., Pavlovic R., Simko M. Seroloski odgovor visoko gravidnih krava na "iffavax" vakcinu // Veter.Glasnik, 1991.- Vol. 45, br. 11/12.-P. 797-80Г.

390. Lehmann R., Kalbe P. Unger C. IBR/IPV- (BHV 1-) Sanierung in einer Jungrinderaufzuchtanlage: Kurzmitteilung // Mh. Veter.-Med, 1990.- T. 45. N 15.-P. 519-521.

391. Lesnik F., Ross L.J.N. Immunization against Marek's disease using Marek's disease virus-specific antigens free from infectious virus // Int J. Cancer 1975.-16.-P.153-162.

392. Lesso J., Hana L., Matis J. Reactions of immune sera against the nucleocapsid, envelope and whole herpes simplex virus type 1 // Acta Virol (Prague) 20.-P.48-52.

393. Livingstone D.M. Defense mechanisms against bovine herpesvirus: Relationship of virus-host cell events to susceptibility to antibody-complement lysis

394. Methods enzymol., 1974.- 34.-P. 723.445JLodmell D., Smith J., Esposito J.3 Ewalt L. Crossprotection of mice against a global spectrum of rabies virus variants// J. Virol 1995. Vol. 69, № 8. - P. 256-261.

395. Loretu K., Blenden D.C., Abstr. Annu. Meet //Amer. Soc. Microbiol., 86 Annu. Meet,Washington, 1986.-P.340.

396. Lu G.Z., Thompson B.C., Gray M. R. Physical modeling of animal cell in suspension culture //Biotechn. Bioeng., 1996.-40.-P. 1277-1281.

397. Lugovic B. Primgena indirektne hemaglutinacije u titraeiziserum skin protutjela zarazneg rinotraheitisa goveda// Veterinarski arhiv, 1981.-51, l.-P. 43-50.

398. Lwof F.A., Toumier P. The classification of viruses //Annu.Rev. Microbiol. 1966.-30.-P.45.

399. Maclennan, I. С. M. Antibody in the induction and inhibition of lymphocytotoxicity. Transplant Revs 1972.-13.-P. 67-95.

400. Magyar G., Tanyi J., Hornyak A., Bartha A. Restriction endonuclease analysis of Hungarian dovine herpesvirus isolates from different clinical forms of IBR, IPV and encephalitis // Acta veter. Hung, 1993.- Vol. 41, N У2.-Р. 159-170.

401. Makino S., Reynolds J.A., Tanford C. The binding of deoxycholate and triton, X-100 to proteins //J.Biol.Chem.1973.- 248.-P. 4926-4932.

402. Mannen K., Niramatsu K., Mifune K., Sakamoto S. Conserved nucleotide seguence of rabies virus cDNA encoding the nucleoprotein // Virus.Gen 1991.-Vol. 5.-P. 69-73.

403. Mark U., Tretzer J. Verfahren und Vorrichtung zum Kultivberen von tierischen Zellen: Akzo GmbH. Заявка на патент. № 36338915, ФРГ 1988.

404. Martinezarends A. Superantigen properties of the rabies virus nucleocapsid //interciecia 1997. Vol. 22, Iss 2. - P. 68-72.

405. Mc Sharry J., Benzinger R. Concentration and puritication of VSV by polyethylene glycol "precipitaion" // Virology 1970.-P. 745 -746.

406. Mcfarland H.F. and Lohnson R.T. Inflam-matory response in viral infections // Viral Immunology andImmunopathology.New York: Academic Press. 1975.-P.l37-148.

407. Mcfarland H.F. In vitro studies of cell-mediated immunity in an acute viral infection//J. Immun 1974,- 113.-P. 173-180

408. Mcguire Т. C., Crawford T.B. and Henson J.B. Immunofluorescent localization of equine infectous anemia virus in tissue // Am. J. Path 1971.- 62.-P. 283-292.

409. McKercher D.G., Crenshaw G.L. Comparative efficacy of intrana-sally and parenterally administered infectious bovine rhinotracheitis vac-cines // J.Am. Vet.Med. Assoc 1971.-159.-P. 13 62-13 69.

410. Mcnutt, S. H. Some infectious diseases involving the nervous system of swine //North Am. Vet 1945.-24.-P. 409-417.

411. Melnick J.L. Tissue culture methods for the cultivation ot poliomyelitis turn other viruses // In: Diagnostic prosedures for virus and rickettsial diseases Am. Publ. Assoc- New York, 1956. P. 139.

412. Metliods for preparation of media, supplements and substrate for serum-free animal cell culture //Ed. Barkes D.H.,New York: Alan R. Liss, 1984-1986.

413. Microbiological control in stem cell banks: approaches to standardization / Cobo F., Stacey G., Hunt C. et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005. V. 68, N 4. -P. 456-466.

414. Min-Jou W., Verhoyen M., Deuos R. et al. Immune interactions with cells infected with herpes simplex virus: antibodies to radioiodinated surface antigens // Cell, 1980.- Vol. 19.-P. 683-696.

415. Misra V., Blumenthai R.M., Babiuk L.A. Proteins specified by bovine herpesvirus 1 (infectious bovine rhinotracheitis virus) // J. Virol. 1981.- 40.-P. 367— 378.

416. Mohan M., Singh B.K., Manickam R. Seroepidemiological studies on infectious bovine rhinotracheitis (IBR) in bulls // Indian veter. J. 1989.-T. 66. N 10.-P. 914-916.

417. Micukoshi F., Maeda K. et al. IgG antibody subclass response against equine herpesvirus type 4 in horses //Veter. Immunol. Immunopat., 2002. Vol. 88, N V2, P. 97-101'.

418. Monod I. La technique de culture continue. Theorie et application // Ann. Inst. Pasteur, Paris, 1950. Vol. 79.-P.390-410.

419. Morein В., Sharp M, Sundquist B. et al. Mechanisms of resistance of different cell types in mediating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity // J. gen. Virol 1983. —Vol. 64. —P. 1557— 1569.

420. Nilsson K. Trands//BiotechnoL, 1987.-№3.-P.74-78.

421. Norton J.H., Tranter W.P., Campbell R.S.F. A farming systems study of abortion in dairy cattle on the Atherton tableland. 2. The pattern of infectious diseases // Austral, veter. J, 1989.- T. 66. N 6.-P. 163-166.

422. Noser P., Limant A. //J.Cell Biol. Suppl.1986.- 42, №15.-P. 10.

423. New Study Raises New Hopes; Limitation on Stem Cell Research seen as Biggest Hurdle, CAMBRIDGE, Mass / Medpanel, Inc. // Web Site, 2007.

424. O'Callaghan D.J., Randall C.C. Molecular anatomy of herpesviruses:Recent studies // Prog.Med.Virol. 1976.- 22.-P. 152-210.

425. Osier A. Complement «Mechanisms and» Functions // Foundations of Immunology. Eaglewood Cliffs, New Jersey: Prentice Hall. 1976.

426. Owens O.H., Gey G.O., G'e'y M.K. A new method for cultivation of mammalian cells suspended in agitated fluid medium // Proc. Am. Ass. Cancer Res.1953.-4-Р. 41.

427. Padien P., Chessebeuf-Padien M.Eur //J.Cell Biol. Suppl., 42, №5.-P.6.

428. Palfi V., Glavits R., Hornyak A. The pathology of concurrent bovine viral diarrhoea and infectious bovine rhinotracheitis virus infection in newborn calves // Acta veter. hung, 1989.- T. 37. N 1/2 .-P. 89-95.

429. Papoustsaks E.T. Fluid mechanical damage of animal cells in bioreactors // Tib Tech, 1996.- 9.-P. 427-373.

430. Papp-Vid G., Derbyshire J.B. The protective antigens of equine herpesvirus type 1 // Can. JComp. Med. 1978.-42.-P.219-226.

431. Pastoret P.P., Aguilar-Setien A., Burtensey G., Schwere A. Effect de la cyclophosphamide sur la latence du virus, de la rhinotracheite infectionse bovine //Ann.med.vet., 1980,- 124, l.-P. 55-67.

432. Payment P., Assat R., Trudel N., Marois P., Enzyme-linked immunosorbent assay for serology of infectious bovine rhinotracheitis virus infectious. //J.Clin.MicrobioL, 1979, 10, 5, 633-636.

433. Pedersen C.E., Eddy G.A. Herpesvirus induced 'early' glycoprotein: characterization and possible role in immune cytolysis // Virol., 1974. Vol. 14. - P. 740—744.

434. Poel W.H.M.van der, Kramps J.A., Quak J. et al. Persistence of bovine herpesvirus-1-specific antibodies in cattle after intranasal vaccination with a live virus vaccine // Veter.Rec., 1995. Vol.137,N14. - P. 347-348.

435. Porter D.D. Persistence of viral infection in the presence of immunity. In Viral Immunology and Immunopathology. A. L. Notkins, Editor, New York: Academic Press, 1975.-P. 189-200.

436. Potgieter LND: Current concepts on the role of viruses in respiratory tract disease of cattle // Bovine Pract., 1977. 12. - P. 75-81.

437. Powell K.L., Buchan A., Sim C. et al. Type-specific protein in herpes simplex virus envelope reacts with neutralising antibody//Nature (London), 1974. -249. P.360-361.

438. Powell K.L., Watson D.H. Some structural antigens of herpes simplex virus type 1 //J. Gen. Virol., 1975.-29.-P. 167-178.

439. PCR-based detection of mycoplasma species / Hyeran Sung, Seung Hye Kang, Yoon Jin Bae et al. // The Journal of Microbiology, 2006. V. 15. - P. 42-49.

440. Rawls W.E. and Tompkins W.A.F. Destruction of virus-infected cells by antibody and comple-ment. In Viral Immunology and Immunopathology. A.L. Notkins, Editor, New York: Aca-demic Press., 1975. P. 99-112.

441. Rayn A.M., Hutcheson D.P., Womack J.E. Tyre-I interferon genotyres and severity of clinical disease in cattle inoculated with bovine herpesvirus 1 // Am.J.veter.Res, 1993. Vol. 54, N 1. - P.73-79.

442. Reed M.L., Roessner C.A., Womack J.E. et al. Microinjection of liposome-encapsulatid Dna into murine and bovine blastocysts // Theriogtnology, 1988. V. 29. -P. 293.

443. Robertson D.C., McCuIlough W.G. Glucose catabolism of Erysipelothrix rhusiopatiae//J. of Bacteriology, 1968. -Vol.95, №6.- P.2112-2116.

444. Roers N. Analyse des EDV-Einsatzes zur Lenkung staatlicher Massnahmen zur Bekampfung der BHV1 -Infektionen des Rindes in Hessen // Inaug.-Diss, 1990.

445. Roison В., Morse L.S. Human herpesvirus I as a modelof regulation of herpesvirus macromolecular metabolism: a review // IARC Sci. Publ.,1978.- 24. P. 269-286.

446. Roizman, В., M. Kozak, R. W. Honess and Hayward G. Regulation of herpesvirus macromolecular synthesis: evidence for multilevel regulation of HSV-1 RNA and protein synthesis // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1974.-39.-P. 687-701.

447. Rola J. Amplification of DNA from bovine herpesvirus type I // Bull. Veter.Inst.in Pulamy, 1997. Vol. 41, N I. - P.5-10.

448. Ronin С, Granier С, Caseti С. et al. Membrane proteins specified by herpes simplex viruses I. Identification of four glycoprotein precursors and their products in type-1-infected cells // Europ. J. Biochem, 1981. Vol. 118. -p. 159- 164.

449. Rose J.K., Gallione C.J. Human cytomegalovirus: Glycoproteins associated with virions and dense bodies // J. Virol., 1981. Vol. 39. - P. 519-529.

450. Rosenberg G.L. and Notkins A.L. Induction of cellular immunity to herpes simplex virus: rela-tionship to the humoral immune response. •// J. Immun., 1974.-112.-P. 1019-1025.

451. Rosenberg G.L., Farber P.A. and Notkins A.L. In vitro stimulation of sensitized lymphocytes by herpes simplex virus and vaccinia vims // Proc. Nat. Acad. Sci., 1972.-69.-P. 756-760.

452. Rottmann O.J., Stratowa Ch., Hornstein M., Hughes J. Tissue specific expression of hepatitis b surface antigtnin mice following liposome-mediated gene transfer into blastocysts // Zbl. Vet. Med. A., 1985. V. 32. - P. 676-682.

453. Rouse B.T., Grewal A. S. and Babiuk L.A. Complement enhances antiviral antibody dependent cell cytotoxicity // Nature, 1977. 266. - P. 456-458.

454. Rouse B.T. and Babiuk L.A. The direct anti-viral cytotoxicity of bovine lymphocytes is not restricted by genetic incompatibility of lymphocytes and targel cells // J. Immun., 1977. 188. - P. 618-624.

455. Rouse B.T. and Babiuk L.A. Host defense mechanisms against infectious bovine rhinotracheitis virus II. Inhibition of viral plaque formation by immune peripheral blood lymphocytes // Cell. Immun., 1975. — 17. P. 43-56.

456. Rouse B.T. and Babiuk L.A. Host defense mechanisms againstinfectious bovine rhinotracheitis virus: in vitro stimulation of sensitized lymphocytes by virus antigen 11 Infection & Immunity, 1974. - 10. - P. 681-687.

457. Rouse B.T., Wardley R.C. and Babiuk L.A. The role of antibody dependent cytotoxicity in recovery from herpesvirus infections. // Cell. Immun., 1976.-22.-P. 182-186.

458. Rouse B.T., Grewal A.S., Babiuk L.A. and Fujimiya Y. Enhancement of antibody dependent cell cytotoxicity of herpesvirus infected cells by complement // Infection & Immunity, 1977. 18. - P. 660-665.

459. Roux (1885). Цит. по H.H. Петрову. Жизнь тканей вне организма. Врачебная газета. 1913.-№30.-С. 1039.

460. Ruben F.L., Jackson G.C. Crossed immunoelectrophoretic analysis and viral neutralizing activity of five monospecific antisera against five different herpes simplex virus glycoproteins // J. infect. Dis., 1972. Vol. 125.—P. 656—664.

461. Rubin B.A., Tint H. The development and use of vaccines based on studies of virus substructures//Prog. Med. Virol., 1975.-21.-P.144-157.

462. Sabirovic M., Hajdarevic F., Nevjestic A. Uticaj virusa infektivnog bovinog rinotraheitisa (IBR/IPV) i virusa mukozne bolesti (BVD/MD) na reproduktivne performanse goveda // Veterinaria (Sarajevo), 1990. T. 39. N 1/2.-P. 165-172.

463. Sagara J., Kawai A. Identification of heat shock protein in the rabies virion // Virol., 1992. Vol. 190, №2. - P. 845-848.

464. Saha S.N., Sen A.K. Indian // Vet. J., 1987. 64, № 6. - P.541-545.

465. Saiki K., Gelond D.H. et al. Immune control of herpesvirus latency // Science., 1988.-V. 239.-P.487.

466. Schneider J. //Genet.Eng.New, 1987. № 5. - P. 108-110; 1988. - № 1. - P. 14,29.

467. Schwartz K.A., Zu G., Trosbo J.E. et al. // Aimer J.Hematol., 1984. 17, № 1. - P.23-27.

468. Schrattenholz A. Neuronal cell culture from human embryonic stem cellas in vitro model for neuroprotection / A. Schrattenholz, M. Klemm // ALTEX, 2007.-V. 24, N l.-P. 9-15.

469. Sekine N., Yoshiko K. Enhanced growth and plague of rabies virus in static chick embryo cell culture // Jap. J. Microbiol., 1976. Vol. 20, №4. - P. 331-338.

470. Servais L. La Belgique entname un programme d'eradication de l'LB.R. // Elevages beiges, 1996. N 10. - P. 9-14.

471. Shafeeva R., Volkova A., Mullagulova M. Reproduction of Vnukovo-32 fixed rabies virus in Vero cells by suspension cultivation // Present Status and Future Prospects: Inter. Conf. on Modern Vaccinology. Ufa, 1996. - P.35.

472. Sheffy B.E., Davies D.H. Reactivation of a bovine herpesvirus after corticosteroid treatment // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1972. 140. - P. 974-976.

473. Sheffy B.E., Rodman S. Activation of latent infectious bovir rhinotracheitis infection // J. Am. Vet. Med. Assoc., 1973. 163. - P. 850-851.

474. Shihar A., Reuveny E. Adv. //Biochem. Eng. Biotechnol., 1987. 34. - P. 3335.

475. Shimizu Yuko, Isayama Yasure, Kawakami Yoshimi et al. Micro inderect hemagglutination test for detecting antibody against infectious bovine rhinotracheitis virus //Nat.Inst.Anim.Health Quart, 1972. 12, 1. - P. 1-2.

476. Shinje K., Toshihiro A. Tureo M. Fermeter Kohen Co. Патент № 521083, 1985.

477. Shore S.L., Black C.M., Melweicz F.M. et al. Antibody de-pendent cell mediated cytotoxicity to target cells infected with Type 1 and Type 2 herpes simplex virus//J. Immun., 1976.- 116.-P. 194-201.

478. Shore S.L., Nahmias A.J., Starr S.E. et al. Detection of cell-dependent cytotoxicity antibody to cell infected with herpes simplex virus // Nature, 1974. -251.-P. 350-352.

479. Sibbel R.L., Bass E.C., Thomas P.C. How long will a killed IBR vaccine protect against challenge // Veter. Med. (Edwardsville), 1988. T. 83. Nl.-P. 90-93.

480. Silva F.F., Castro R.S., Melo L.E.H. et al. Anticorpos neutralizantes contra HVB 1 em bovinos do estado de Pernambuco // Arq. brasil. Med. veter. Zootecn. -Belo Horizonte, 1995. P.597-599.

481. Skehel J.J., Stevens D.J., Daniels R.S. et al. Isolation of pure IgGi, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose // Proc. nat. Acad. Sci. USA, 1983. Vol. 81. - P. 1779-1783.

482. Skirvin R.M., Chu M.C., Mann et.ai. Plant Cell Repts., 5, № 4, 1986. -pp.282-294.

483. Sklyanskaya E.L, Itkin Z.B., Iofman Y.P., Kaverin N.V. Structural proteins of infectious bovine rhinotracheitis virus // Acta virol., 1977. 21,4. - P. 273-279.

484. Smith J.C., Stiles CD. Cytoplasmic transfer of the mitogentc response to platelet derived growlh factor //Proc. NatAcad.ScLUSA, 1981. Vol. 78. - P. 4363-4367.

485. Stec J., Bicka L., Kuzmak J. Isolation and purification of polyclonal IgG antibodies from bovine serum by high performance liquid chromatography // Bull. Veter. Inst. In Pulawy, 2004. Vol. 48, N 3. - P. 321-327.

486. Sovocol F., Koprowski H. Structuretunction relationshipsand mode of replication of animal rhabdovirus // Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 1975. 72, 3. - P. 933936.

487. Spear P.G., Keller J.M., Roizman B. Proteins specified by herpes simplex virus. II. Viral glycoproteins associated with cellular membranes // J. Virol., 1970. -5. P. 123-131.

488. Spear P.G., Roizman B. Proteins specified by herpes simplex virus. V. Purification and structural proteins of the herpes-virion // J. Virol., 1972. 9. - P. 143-159.

489. Spier R.E. The economic Implication of ammal cell biotechnology //8 Int Biotechnol. Symp., Paris, Proc, 1989. Vol.1. - P. 205-215.

490. Stevens J.G. and Cook M. L. Restriction of herpes simplex virus by macrophages. An analysis of cell-virus interaction // J. exp. Med., 1971. — 133. P. 19

491. Stinski M.F. Sequence of protein synthesis in cells infected by human cytomegalovirus: early and late virus-induced polypeptides // J. Virol., 1978.-26. P. 686-701.

492. Straub O.C., Funk K., Bruchhof B. IPV-Belastungsversuche nach Applikation einer BHVl-Subunit-Vakzine // Tierarztl. Umsch, 1990. T. 45. N 6. - P. 383-388.

493. Straub O.C., Mawhinney I.C. Vaccination to protect calves against infectious bovine rhinotracheitis // Veter. Rec, 1988. T. 122. N 17.- P. 407-411.

494. Stubbs G. W., Smith H. G., Litman B. J. Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: Responses in cattle and swine // Biochem. biophys. Acta., 1976. Vol. 246. - P. 46—56.

495. Sureau P. Rabies vaccine production in animal cell cultures // Vertrebrate Cell. Cult., 1987.-P. 111-128.

496. Talens L.T., Beckenhauer W.H., Thurber E.T. Efficacy of viral components of a nonabortigenic combination vaccine for prevention of respiratory and reproductive system diseases in cattle // J. Am. Veter. Med. Assn, 1989. T. 194. N 9. - P. 1273-1280.

497. Talens L.T., Zee J.C. Purification and buoyant dencity of infectious bovine rhinotracheitis virus//Exper. Biol. And med., 1976.- 151, l.-P. 132- 135.

498. Tanford C., Reynolds J.A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions // Biochim Biophys Acta, 1976. 457. - P. 133-170.

499. Tanford C., Nozaki Y., Reynolds J. A. et al. Polymorphonuclear neutrophil-mediated antibody-dependent cell cytotoxicity of herpesvirus-infected cells: ultrastructural studies // Biochemistry (Wash.), 1974. Vol. 13. P. 2369-2376.

500. Tanyi J., Varga J. Guidelines for the eradication of infectious bovine rhinotracheitis in Hungary // Acta veter. hung, 1992. Vol. 40, N 3. - P. 165169.

501. Thiry E., Pastoret P.P. Biocheme de l'herpesvirus bovin 1 (BHV 1) //

502. Anna!. Recherc. Veter., 1984. 15, 4.-P. 455-465.

503. Thomson T. A., Hilfenhaus J., Moser H. et al. The synthesis of glycoproteins in human myeloma cells infected with varicella-zoster virus // Infect, and Immun, 1983. Vol. 41. - P. 556-562.

504. Telang N. Cell culture model for colon cancer prevention and therapy: An alternative approach to animel experimentation / N. Telang, M. Katdare // ALTEX, 2007.-V. 24, N l.-P. 16-21.

505. Tissue culture: methods and applications // Ed. Kruse P.F. Petterson M:K.Jr. -New York: Acad. Press, 1973. P. 869.

506. Todd J.D. Development of intranasal vaccination for the immunization of cattle against infectious bovine rhinotracheitis // Can. Vet. J., 1974. 15. - P. 257259.

507. Tolbert W.R., Schoenfeld R.A., Levis C., Feder J. Large-scale mammalian cell culture; design and use of an economacal bath suspension system //Biotechn. Bieng., 1983. Vol. XXIV, № 7. - P.1670-1679.

508. Tollis M., Buonavglia C., Treoni L., Vignolo E. Sensitivity of Different cell Iinies for rabies virus isolation // J. Vet. Med. В., 1988. V.35, №7. - P. 504-508.

509. Torado G.J., De Larco J.J.L., Fryling C.M. Asrcome growth factor and other transforming peptides produced by human cells; interaction with membrane receptor.// Fed. Proa, 1982. Vol. 41. - P. 2996-3003.

510. Tordo N. Characteristics and molecular biology of the rabies virus // Laboratory techniques in rabies 4-th ed. Geneva, 1996. - P. 28-45.

511. Tordo N., Poch O. Structure of rabies virus // Campbell J., Charlton K. eds

512. Rabies. Boston, Kluwer Academic Publishers, 1988. - P. 25-45.

513. Tousimis A.G., Howells W.V., Griffin T.P., Porter R.P., Chlathem W.I., Mauer F.D. Biophisical characterization of infectious bovine rhinotracheitis virus // Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 1958. P. 99.

514. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. A new method for partial peptide mapping using N-chlorosuccinimide urea peptide silver staining in sodiumsulfate polyacrylamide gels // Proc. nat. Acad. Sci. USA, 1979.- Vol. 76.- P. 4350-4354.

515. Tremblay M., de Perrier M., Chavarie C., Archambault J. Fed batch culture cells // Bioroc. Eng., 1996. - 9. - P. 13-21.

516. Tyrrell D. A. G. Cell fusion induced by herpes simplex virus is promoted and suppressed by different viral glycoproteins // J. infect. Dis., 1974. Vol. 129. - P. 766770.

517. Valiseh L., Smid B. Electron microscopy study of the structure of the envelopes of IBR virus in ultrathin sectious // Folia microbiol., 1975. 20, 1. - P. 9 1 -92.

518. Veber P., Kuniak J., Scanto J. et al. Sposob pestovania buniek in vitro na cellulozovych micronosicoch. A.C. ЧССР, № 230757, 1986.

519. Verhoyen M., Fang R., Min-Jou W. et al. The direct antiviral cytotoxicity by bovine lymphocytes is not restricted by genetic compatibility of lymphocytes and target cells // Ibid., 1980. Vol. 286. - P. 771-776.

520. Vernon S.K., Lawrence W.C., Long C.A., et al. Herpesvirus vaccine development: Studies of virus morphological components, in VoUer A, Friedman H (ed): New Trends and Developments in Vaccines. Baltimore, University Park Press, 1978.-P. 179-210.

521. Vernyr C„ Imbenotte S. Cell Biol //IntRepts, 1988. -12, № 2. P. 115-122.

522. Veselinovic S., Veselinovic S., Medic D. et al. Disturbances in bovine reproduction caused by action of IBR/IPV viruses // Proc.of the 12.Intern.congr.on animal reproduction. S.I., 1992.-P. 1605-1607.

523. Vestergaard B.F., Bjerrum O.J., Norrild B. et al. Crossed immunoelectrophoretic studies of the solubility and immunogenicity of herpes simplex virus antigens // J. Virol., 1977. 24. - P. 82-90.

524. Vilcek S. Vyvoj. PCR testov na detekciu BHV-1, BRSV a pestivirusov // Veter.Med. Praha, 1994. R.39, c.l 1. - P. 687-700.

525. Vilcek S., Deliova I., Forgac O. et al. Detekcia bovinneho herpesvirusu-1 metodou dot-blot hybridizacie // Veter.Med. Praha, 1993. R.38, c.4. - P. 193-202.

526. Vilcek S., Nettleton P.F., Herring J.A., Herring A.J. Rapid detection of bovine herpesvirus 1 (BHV 1) using the polymerase chain reaction // Veter.Microbiol., 1994. -Vol. 42, N 1. P. 53-64.

527. Virus Taxonomy: Sixth Report of the International commitee on Taxonomy of Viruses, 1995. 458 p.

528. Visser I.K.G., Bildt M.W.G.v.d., Brugge H.N. Vaccination of harbour seals (Phoca vitulina) against phocid distemper with two different inactivated canine distemper virus (CDV) VACCINES // Vaccine, 1989. T. 7. N6.-P. 521-526.

529. Vrana D., Votruba J., Placek J. Age related changes in the physiological state of budding yeast cells //Exp. Cell. Res., 1982. Vol.138, №1. - P.57-62.

530. Wall R.J., Pursel V.G., Hammer R.E., Brinster R.L. Development of porcine ova that were centrifuged to permit visualization of pronuclei and nuclei // Biol. Reprod., 1985. V. 32. - P. 645-651.

531. Wang B.J.C., Cooney C.L., Demain A.L. Fermentation and enzyme technology. -N.-Y.: John Willey and sons, 1979.-180 p.

532. Ward C. W. Membrane proteins specified by herpes simplex viruses. I. Identification of four glycoprotein precursors and their products in type 1 -infected cells // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1981. Vol. 94/95. - P. 1 — 74.

533. Wberts В., Bray D., Lewis I. Et al. Molecular Biology of the Cell Garlang Publishing, New York, 1983.-P. 120.

534. Webster R.G., Hinshaw V.S. Synthesis of proteins and glycoproteins in cells infected with human cytomegalovirus // Infect, and Immun., 1977.1. Vol: 17.-P. 561—566.

535. Wezel A.L. Large-scale concentration and purification of virus suspension from microcarrier culture for the preparation of intractivated virus vaccines // Develop.biol.Stand., 1979. — 42. P. 65-69.

536. Wiktor T. et al. Antigenic properties of rabies virus components//J. Immunol., 1973.-№4. -P. 243-251.

537. Wiktor Т., Femandes M., Koprowski H. Cultivation of rabies virus in human diploid cell strain WI-38 // J. Immunol., 1964. № 93. - P. 353-356.

538. Wiktor Т., Koprowski H. Use of Hybridoma monoclonal antibodies, in the detection of antigenis differences between rabies and rabies-related virus proteins // J. gen. Virol., 1980. Vol. 48. - P. 97-104.

539. Wilfert C.M., Buckley R.H., Mohana-Kumar T. et al. Persistent and fatal central nervous system echovirus infections in patients with agammaglobulinemia // New Enrl. J. Med., 1977. 296. - P. 1485-1489.

540. Wiseman A. infectious bovine rhinotracheitis virus // Veter. Ann. Bristol., 1980. 20. - P. 204-208.

541. Wunner W. Structure of rabies viruses // World's debt to Pasteur, 1985. P. 171-186.

542. Zaia J.A., Palmer E.L., Feorino P.M. Humoral and cellular immune responses to an envelope-associated antigen of herpes simplex virus // J. Infect. Dis., 1975. 132. -P. 660-666.

543. Zhai Z., Ding M. Studies of fine structure and morphogenesis of infectious bovine rhinotracheitis virus // Acta microbiol. Sinick., 1983. 25, 3. — P. 275-279.

544. Zoletto R. Proc. And1 Exploit. Exist. And New Animal Cell Substrat // Proc. Joint ESACT/IABS Meet, Gardone Rivera, 1984, Basel; S.Karger, 1985.-P.178.182.

545. Zygraich N., Huygelen C., Vascoboinic E. Vaccination of calves against infectious bovine rhinotracheitis using a temperature sensitive mutant. Dev Biol Stand, 1974.-26.-P. 8-14.

546. Zygraich N., Lobmann M., Vascoboinic E. et al. In uivo and in vitro properties of a temperature sensitive mutant of infectious bovine rhinotracheitis virus // Res. Vet. Sci., 1974. 16. - P. 328-335.

547. Zygraich N., Vascoboinic E., Huygelen C. Immunity studies in calves vaccinated with a multivalent live respiratory vaccine composed of IBR, parainfluenza 3 and bovine adenovirus type 3 // Dev. Biol. Stand., 1976. 33. - P. 379-383.