Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА"

сЛ-^зщ;

На правах рукописи

ПЛЕХОВА Ним Аштммип

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

03.00.19 - парязитологня

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидат* биологических наук

Курск-2007

Работ« выполнен» в иаучно-нсследовагельской лаборатория «Паразитология» Курских! государственного университета

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Ромаисшео Николай Алексеевич

Официальные оппоненты;

заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор Горохов Влжлимкр Васильевич

кандшат биологических наук Кузнецов Дмитрий Николаевич

Ведущая Организация:

Московский государственный университет прикладной Биотехнологии (МГУПБ)

Защита диссертации состоятся _ 200^, в '/^^мсов на заседании

диссертационного Совета Д 006.0П.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И, Скрябина (ВИГИС)

С диссертацвей можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС по адресу: 117218, Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета довггор биологических наук, профессор лй'^ЗзЛ ВК. Берсжко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время продолжает оставаться актуальной проблема обес-• печения населения доброкачественной питьевой водой, поставленная на саммите в Йоханнесбурге (2002 г.) в число основных.^Подтверждением этому является решение Организации Объединенных Наций о провозглашении десятилетня 2005-2015 гг. Международной декадой «Вода для жизни» вслед за завершимся годом пресной воды, международными водными форумами в Киото и Душанбе.

Возникшая в России в последние десятилетия XX века экологическая обеспокоенность в связи с резко возросшими в глобальных масштабах антропогенными нагрузками на окружающую среду закономерно обусловила необходимость пересмотра взглядов на сложившуюся в нашей стране напряженную эпидемиологическую ситуацию по паразитарным болезням. Особое внимание обращает на себя значительный рост кишечных протозойных болезней, передающихся водным путем. Так, по данным В.П. Сергиев а (2003), в 1991 г. заболеваемость населения лямблиозом составила 45,0 на 100 тыс. населения, а в 2003 г. - 103,4, т.е. увеличилась более чем в 2 раза.

В России первые водные вспышки лямблиоза были отмечены в 20002001 гг. в детских учреждениях гг. Перми, Вологды, Волгограда (Кучеря Т.В. и др. 2002; Федотова РЛ. и др. 2002; Коза Н.М. н др. 2002; Авдюхнна Т.Н. и др. 2003). По-видимому, число их значительно больше. По данным Г .Г. Оннщенко (2003), ежегодно в стране регистрируется до 30 вспышек острых кишечных инфекций в результате употребления недоброкачественной тггьевой воды.

В этих условиях регулярный контроль и адекватная оценка качества во* ды поверхностных водных объектов и питьевой воды в отношении их паразн-тологического загрязнения приобретает особое значение.

Несмотря на это, экологический мониторинг за качеством водных объектов и питьевой воды в отношении их паразитарного загрязнения до сих пор не налажен. Для проведения сангггарно-паразигологических исследований воды используется методика, рекомендуемая МУК 4,2.964-00 «Сашггарно-паразитологические исследования воды хозяйственного и питьевого назначения». К сожалению, она громоздка, трудоемка, требует применения дорогостоящей аппаратуры, а эффективность невысокая. Паразитологнческие исследования питьевой вода и воды поверхностных водных объектов проводятся эпизодически и только на отдельных территориях; практически отсутствуют сведения о многолетней н внутригодовой динамике контаминации питьевой и природной воды возбудителями паразитозов.

С учетом важности этой проблемы нами, начиная с 2004 по 2007 год на базе научно-исследовательской лаборатории «Паразитология» Курского государственного университета совместно с Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. ЕЛ. Мэрцинр.вского Сечено- " ва, Всероссийским институтом гельминтологии им. КЛ^СкрА^ин^О^у^^П,

3 ПНб имени Н И* Железное»

ООО «Комрнс» (г. Зеленоград), проводятся специальные исследования, направленные на решение заданий НИР: «Разработка мероприятий по снижению риска заражения населения паразнтозамн. Оптимизация профилактики паразитарных болезней», № ««регистрации 01.200.118799 (2001-2005 гг.); «Эколого-паразитологнческий мониторинг на территории Курской области» № госрегистрации 01.2.006 08190 (2006-2010 гг.). Тема настоящего исследования является составной частью Российской научно-технической программы (2001-2005 гг.), задание 02 «Разработка новых теоретических подходов и принципов профилактики паразитарных болезней животных и охраны окружающей среды от паразитоюв».

Цель работы

Совершенствование саннтарно-паразитологических методов исследования воды в системе экологического мониторинга водных объектов.

Задачи исследования

1) обобщить и систематизировать данные о методическом обеспечении санитарно-паразитологическнх исследований воды поверхностных водных объектов и питьевой воды в нашей стране н за рубежом;

2) выявить причины, снижающие эффективность применяемых на практике методик исследования воды;

3) предложить новые технологии, позволяющие облегчить забор и доставку в лабораторию проб природной и питьевой воды, их дальнейшую обработку и подготовку препаратов для микроскопического исследования;

4) выявить возможности использования насыщенных растворов в качестве флотирующей жидкости при проведении паразитологических исследований проб воды и определить особенности распределения цист лямблий в них;

3) изучить возможность и эффективность применения аналитических трековых мембран для санитарно-паразитолошческих исследований природной и питьевой воды;

6) обосновать возможность применения веществ, обладающих альгицид-ным действием, для предварительного осветления проб воды поверхностных водных объектов от цианобактернй при исследовании их;

7) предложить окончательный вариант усовершенствованной методики исследования воды по паразитологическим показателям.

Научная новизна

Разработана методика санитарно-паразитологнческого исследования воды, позволяющая увеличить пропускную способность паразитологических лабораторий и повысить эффективность экологического мониторинга водных объектов и питьевой воды до 82,3%; ее использование в практике лабораторий

позволит наиболее точно прогнозировать риск заражения населения и животных паразнтозами.

Предложены для оптимизации отбора проб природной и питьевой воды и дальнейшего их исследования в лаборатории:

- пробоотборник — концентратор гидробиологический «ПробоКонГ», позволяющий отбирать пробы воды объемом 400-1000 л и доставлять в лабораторию для обработки концентрат в количестве 100-130 мл;

- отборник флотанта фильтрующий (ОФФ-25), благодаря использованию которого возможно проводить осаждение паразитарных объектов из центрифужной пробирки непосредственно на аналитическую трековую мембрану.

Обосновано применение прозрачных трековых мембран с размером пор 0,2—0,4 мкм, обеспечивающих осаждение на своей поверхности 96,4±0,1 % цист лямблий.

Установлено, что модельная жидкость цист лямблий является гетерогенной. При использовании в качестве флотирующего раствора 30%-ного водного раствора сахарозы жизнеспособные цисты на ранней стадии развития {92,3±0,2%) концентрируются в поверхностной пленке; цисты иа поздней стадии обнаруживаются (4,4±0,1%) в толще растворе, а погибшие выпадают (3,1 ±0,1%) в осадок.

Рекомендовано использовать химические и биологические препараты для осветления концентрата пробы природной вода от цнанобактерий путем осаждения их:

— в 20% растворе мочевины при экспозиции 1 час, что позволяет осадить 92,5% цнанобактерий;

- в 1% растворе препарата «Альгицид» при экспозиции 24 часа; эффективность осаждения микроводорослей достигает 98,4%;

~ в жидкой культуре штамма ЮМ-Зб при экспозиции 24 часа, что позволяет привести к осаждению 27,9% цнанобактерий, содержащихся в концентрате природной воды.

Данные препараты не влияют на целостность оболочки цист лямблий, а следовательно, не препятствуют флотированию паразитарных объектов в насыщенном растворе.

Практическая значимость

Предложена методика санстарно-паразитологического исследования питьевой воды и воды поверхностных водных объектов. Внедрение ее в практику паразитологическнх лабораторий увеличивает частоту индикации цист патогенных кишечных простейших в воде в 1,4-1,6 раз, повышает пропускную способность производственных лабораторий водоочистных сооружений и лабораторий ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» до 400-1000 л. Это позволяет расширить возможности данных учреждений при организации экологического мониторинга за безопасностью воды в отношении ее паразитарного загрязнения.

Внедрение результатов в практику

Материалы исследований использованы при подготовке с нашим участием:

- МУ 3.2.1756-03 «Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями» (утверждены Минздравом Российской Федерации 2S марта 2003г.);

- МУ 3.2.1882-04 «Профилактика лямблиоза» (утверждены Минздравом Российской Федерации 3 марта 2004 г);

- МУ 3.2.1880-04 «Профилактика дирофилярноза» (утверждены Минздравом Российской Федерации 3 марта 2004 г);

- МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологичеекмй анализ воды поверхностных водных объектов» (утверждены Минздравом Российской Федерации 3 марта 2004 г);

- МУК 4.2.1881-04 «Санитарно-паразитологические исследования плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции» (утверждены Минздравом Российской Федерации 3 марта 2004 г).

Разработанные приборы (пробоотборник — концентратор гидробиологический «ПробоКонГ» и отборник флотанта фильтрующий ОФФ-25) предложены к использованию по назначению и апробированы на базе ООО «Агрозащи-та-шаос» (Курское региональное отделение) при проведении санитарно-паразнтологического анализа воды естественно-водных объектов. Предложенные методы индикации цист лямблий в воде также апробированы на базе ЗАО «Институт экологической безопасности» и внедрены в процесс саншарно-паразитологичского анализа питьевой воды и естественных водных объектов при организации экологического мониторинга в отношении их паразитарного загрязнения.

Материалы диссертационной работы вошли в циклы лекций по курсам: «Общие вопросы паразитологии» (отделение «Социально-культурный сервис и туризм»), «Саитврно-паразитологический мониторинг объектов окружающей среды» (отделение «Экология») на естественно-географическом факультете; «Экологая» на факультете искусств Курского государственного университета; использованы при проведении семинаров по профилактике паразитарных болезней для учителей, сотрудников и родителей учащихся МОУ «Средняя общеобразовательная школа № 31 г. Курска» и МОУ «Шкапа с углубленным изучением отдельных предметов № 6 г. Курска».

Апробация работы

Материалы исследований по теме диссертации обсуждены на научно-практических конференциях «Интеграция медицины и образования» (Курск; 2006, 2007), «Диверсификация и стратегия медицины и образования» (Курск, 2006, 2007), «Научные подходы к решению региональных гигиенических проблем сохранения здоровья человека» (Липецк, 2005), «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2005,2006,2007).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Использование новых технических устройств (ПробоКонГ и ОФФ-25) н -технологий позволяет оптимизировать проведение санитарно-паразитологнческих исследований воды, что повышает эффективность и частоту выделения возбудителей паразптозов в воде и значительно облегчает организацию экологического мониторинга питьевой воды н водных объектов.

2. Научное обоснование усовершенствованной саннтарно-паразитологической методики исследования воды позволяет включить ее в систему экологического мониторинга за безопасностью питьевой воды н водных объектов в отношении их паразитарного загрязнения.

Публикации

Основные результаты диссертации содержатся в 14 опубликованных работах, в том числе трех статьях в журналах и сборниках работ, включенных в перечень ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, из которых одна посвящена обзору литературы, а 3 другое -результатам собственных исследований, заключения, выводов н практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 23 рисунками. Список литературы включает 133 работы, в том числе 95 отечественных и 38 зарубежных авторов.

Хотелось бы высказать искренние слова благодарности за оказанную помощь и поддержку в выполнении и написании диссертационной работы руководителю научно-исследовательской лаборатории «Паразитология» Курского государственного университета Наталье Семеновне Малышевой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты работы, материал, методы и объем исследований

В качестве объектов работы выбраны методы санитарно-паразитологического исследования питьевой воды и воды поверхностных водных объектов, применяемые в настоящее время в нашей стране и рекомендуемые МУК 4.2.964 - 00 «Санитарно-параэитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования».

Общий объем выполненных исследований представлен в таблице 1.

При выполнении работы исследовалась вода поверхностных водных объектов, питьевая вода централизованного н нецеотралнзованного водоснабжения и модельная жидкость, приготовленная в соответствие с методикой, рекомендуемой МУК 4.2.1174 - 02 «Использование модельных тестов цист лямблий и ооцист криптоснорндий для гигиенической оценки эффективности водоочистки».

Таблица 1

Общий объем выполненных исследований

№ Наименование работы Число

п/п исследований

1. Саиитарно-паразитологаческне исследования воды в соответствии с методикой, рекомендуемой МУК 4.2.964-00:

- поверхностных водных объектов 540

• литьевой воды централизованного водо- ISO

снабжения

- питьевой воды нецентрализо ванного водо- 168

снабжения

Саннтарно-лараэитсяогические исследования во*

ды в соответствии с предложенной методикой:

- поверхностных водных объектов 252

- питьевой воды централизованного водо- 285

снабжения

• питьевой воды нецентрализованного водо- 192

снабжения

2. Экспериментальные исследования:

по выявлению потерь инвазионного ма- 192

териала при проведении санитар нопарази-

тологического исследования воды;

по оценке эффективности выявления .480

цист лямблий порошковым фильтром про-

боотборника «ПробоКонГ»

по оценке эффективности методов ис- 480

следования воды, рекомендуемых МУК

4.2.964-00

изучению возможности применения 135

ATM для идентификации цист лямблий в

воде

по изучению гетерогенности культуры 246

лямблий

по оценке действия альгетиков на жиз- 1392

неспособность цианобахтернй н инст лямб-

лий 288

оценке действия карбамида (мочевина)

на жизнеспособность цианобактернй и цист

лямблий 315

по оценке действия биопрепаратов на

жизнеспособность цианобактернй н цист

лямблий

При анализе результатов исследования применяли методы матемзтнче-ской статистики — вычисление интенсивных и экстенсивных показателей; оценку достоверности показателей определяли с помощью доверительного коэффициента Стьюдента.

Результаты наших комплексных исследований и анализ данных литературы позволили сформулировать и обосновать следующие положения диссертации, представляемые к защите.

В ходе проведенных санитарно-паразитологических исследований воды поверхностных водных объектов и питьевой воды в соответствии с МУК 4.2.964 — 00 установлены основные причины, сдерживавшие применение данной методики при организации экологического мониторинга за паразитологи-ческой безопасностью водных объектов:

1) низкая эффективность выявления паразитарных патогенов в природ* ной и питьевой воде;

2) трудность отбора проб воды (природной - 25 л и питьевой - 50 л) и их доставки в лабораторию, длительные сроки фильтрования;

3) потери паразитарных патогенов при осуществлении основных операций методики;

4) трудность идентификации в препаратах воды паразитарных патогенов от растительных объектов (сине-зеленых водорослей).

Повышение вероятности обнаружения возбудителей кишечных паразите зов в природной и питьевой воде за счет увеличения объема проб, при одновременном снижении трудозатрат на их отбор, доставку а лабораторию и обработку достигается при создании специального пробоотборника — концентратора гидробиологического «ПробоКонГ» (рис. 1).

ПробоКонГ - переносное устройство для концентрирования из воды методом фильтрования паразитарных патогенов (цисты кишечных простейших) с размерами более 1,5 мкм из воды непосредственно на месте отбора пробы.

Он может использоваться при проведении контроля качества по гидробиологическим, экологическим и санитарным показателям воды на станциях водоочистки, в распределительной сети централизованного водоснабжения, в источниках индивидуального водоснабжения, в природных и искусственных водоемах, плавательных бассейнах, а также бутилироаанной воды. Фильтрование осуществляется через намывной слой порошкового фильтрующего материала.

Использование ПробоКонГ позволяет проводить отбор проб н фильтрование воды на месте пробоотбора, увеличить объем проб воды до 400-1000 л и получить концентрат объемом 100-150 мл, который можно легко транспортировать в параэитологнческую лабораторию. Это существенно увеличивает их пропускную способность и положительно сказывается на качестве экологического мониторинга питьевой воды и воды естественных водных объектов в отношении их паразитарного загрязнения.

Обозначения: ) - пластиковая бутылка;

2 - элемент Крапу хина;

3 - распределительная головка; 4-кран;

5 — манометр;

6 - счетчик;

7 — входной патрубок;

К — выходной патрубок; 9 - подвеска; 10-регулятор; 11 - опора.

Рис. 1. Схема устройства пробоотборника - концентратора гидробиологического «ПробоКонГ» Результаты сравнительных экспериментальных исследований модельной жидкости цист лямблий, представленные в табл,2, показывают, что при использовании современных технических устройств наблюдается повышение эффективности выявления цист лямблий в модельной жидкости. Считаем целесообразным обратить внимание на выявляемое» паразитарных объектов в пробах модельной жидкости с их количеством 25 экз./пробу, т.к. это наиболее актуально при мониторинге водных объектов окружающей среды.

Таблица2

Эффективность индикации инст лямблий в пробах модельной жидкости

Используемая методика Содержание цистлямблий в пробе, экз. Объем пробы, л Выявлено цист лямблий (экз.) Эффективность выделения цист лямблий, (%±го)

Методика, рекомендуемая МУК 4.2.964 - 00 25 25 0 0

25 50 0 0

25 100 3,2±1 12,8±0,3

25 200 5,!±2 20,4±0,2

Методика с использованием пробоотборника «ПробоКонГ» 25 25 8,2±! 32,8±0,4

25 50 11,]±2 44,4±0,2

25 100 14,5*1 58,0±0,1

25 200 17,2±1 68,8*0,3

Экспериментально установлено, что использование методики, рекомендуемой МУК 4.2.964 - 00, не позволяет выявлять цисты в пробах модельной жидкости объемом 25 и 50 л. А при их обработке в соответствии с предложенной нами методикой обнаруживалось 32,8±0,4% н 44,4*0,2% экз. в пробах объемом 25 и 50 л соответственно. Увеличение объема проб модельной жидкости .объемом 200 л позволяет повысить эффективность их индикации до 68,4±0Д%, что в 3,4 раза выше, чем при использовании применяемой в настоящее время методики (20,4±0¿%).

Кроме этого нами было проанализировано изменение выявляемое™ цист лямблий в модельной жидкости в зависимости от объема проб. Так, отбор проб при помощи ПробоКонГ показывает, что эффективность индикации патогенов в пробах модельной жидкости объемом 25 л составляет 32,8*0,4%, что в 2 раза ниже, чем при анализе проб объемом 200 л (68,4*0,3%).

Результаты экспериментальных исследований проб модельной жидкости, представленные в табл.3, показывают, что наблюдается и колебание экстенсивных показателей в зависимости от объема пробы, метода отбора и обработки полученного концентрата.

Таблица 3

Результаты саннтярно-паразитологнческого исследования модельной

жидкости

Используемая методика Содержание цист лямблий в пробе, экз. Объем пробы, л Выявлено положительных проб,

всего (% ± т)

Методика, рекомендуемая МУК 4.2.964 - 00 25 25 0 0

25 50 0 0

25 100 2*1 13.310,3

25 200 4±i 26,6*0,5

Методика с использованием пробоотборника «ПробоКонГ» 25 25 6±1 40,0±0,3

25 50 7±1 46,7±0,2

25 100 7±1 46,7±0,3

25 200 10±1 66,7*0,2

При анализе проб модельной жидкости объемом 25 и 50 л по методике, рекомендуемой МУК 4.2.964 - 00, паразитарные объекты не обнаруживались. Исследование проб объемом 25 и 50 л С использованием современных технических устройств позволяет выявлять цисты лямблий соответственно в 12 (40,0±0,3%) и 14 (46,7*0,2%) из 30.

Увеличение объема проб модельной жидкости от 25 до 200 л и обработка нх по предложенной нами методике повышает частоту обнаружения цист

лямблий от 40,0±0,1% до 6б,7±0,2%, т.е. наблюдается увеличение количества положительных проб в 1,6 раз. Теоретическое обоснование увеличения минимальных объемов проб исследуемой воды можно дать при помощи распределения малых чисел Пуассона.

Другим техническим решением, позволяющим усовершенствовать методику обработки флотирующего раствора н оптимизировать индикацию паразитарных патогенов в воде на этапе микроскопирования путовых препаратов, является отборник флотшгга фильтрующий — ОФФ-25 (рис. 2).

Отборник флотанта фильтрующий применяется в паразитологических исследованиях для нанесения паразитарных объектов путем вакуумного фильтрования флотанта непосредственно из центрифужной пробирки на прозрачную аналитическую трековую мембрану для последующего микроскопического исследования приготовленного таким образом препарат.

Аналитическая трековая мембрана изготавливается из тонкой прозрачной полизтилекгерефталатной пленки со сквозными порами диаметром от 0,05 до 5 мкм.

Рис. 2. Устройство отборника флотанта фильтрующего ОФО-25

Результаты санитарно-паразигологических исследований модельной жидкости, представленные в табл.4, показывают, что эффективность осаждения паразитарных объектов на поверхности аналитической трековой мембраны зависит от размера пор.

Установлено, что при проведении санитарно-паразитологнческого анализа воды предпочтительнее использовать трековые мембраны с размерами лор от 0Д-О,4 мкм, что обусловливает задержание 9б,4±0,5% цист лямблий на

Обозначения:

1 — шасси;

2 - вакуумметр;

3 - регулятор разряжения;

4 - шаровый кран;

5 - конусная муфта;

6 — конус;

7 - основание для ATM;

8 - диск мембраны; 9 — цилиндр; 10 — гайка; 11 - амортизатор;

12 - крышка;

14 — уплотнитель;

15 —трубка, соединяющая цилиндр с основанием;

16-штуцер;

17 - игольчатый регулятор;

18 — трубка, соединяющая цилиндр с атмосферой

нх поверхности. Это обусловлено тем, что при использовании крупнопористой мембраны 1-3 мкм (поры соизмеримы с размером цист) при достаточном перепаде давления появляется возможность проскока цист лямблий через поры; а также создается неудобный для микроскопического исследования задний фон.

Таблица 4

Эффективность задержании цнет лямблий на поверхности аналитической трековой мембраны

№ п/п Размер пор используемых ATM, мкм Исследовано проб Содержание цист лямблий в пробе, экз. Обнаружено цист лямблий на поверхности ATM, экз. Эффективность задержания цист лямблий на поверхности ATM, (m±%)

1. 0,2-0,4 30 10±1 9,64±1 96,4*0,1

2. 2.5-3,0 30 10*1 9,58±1 95,8±0,1

3. 3.0-3.5 30 101:1 8,53±2 85,3±0,2

Всего 90 10±1 9,25±t 92,5±0,2

Результаты экспериментальных исследований показывают, что молельная жидкость цист лямблий гетерогенна, что является причиной неравномерного распределения их в насыщенном растворе. Также флотирование частиц в растворе зависит от используемого флотирующего раствора, т.е. его физико-химических характеристик.

Установлено, что при микроскопировзнии проб в нижних слоях центрифужной пробирки выявляется ЗД±0,2% и 3,1 ±0,2% экз. погибших цист лямблий при использовании в качестве флотанта раствора сульфата цинка н сахарозы соответственно. Оболочки погибших цист имеют микроповреждения и через них теряют внутриклеточную воду. Внутреннее содержимое не выражено. При помещении таких цист в сильно осмомолярный флотирующий раствор плотность их возрастает, объем и плавучесть уменьшаются, в результате чего наблюдается осаждение в нижние слон раствора.

В толще водного растворе семнводного сульфата цинка обнаруживается в среднем 11,2±0,1%экз, что 2,5 раза больше, чем при исследовании раствора сахарозы (4,4±0,1%). Это связано с тем, что силы притяжения между противоположно заряженными гадратированными нонами в растворе сульфата цинка обусловливают нахождение большего количества цист лямблий в столбце раствора. Обнаруживались жизнеспособные цисты лямблий, вероятно находящиеся на поздних стадиях развития (нх удельный вес соизмерим с плотностью раствора}, а потому представляющие потенциальную опасность для здоровья человека и животных. Они имели характерную для них овальную форму и размеры (в среднем 10-12 мкм в длину и 6-8 мкм в ширину). Снаружи цисты Lamblia intestinalis покрыты плотной оболочкой, препятствующей поступлению окружающего раствора внутрь клетки.

В поверхностных слоях концентрируется в среднем 79,4*0,2% и 92,3*0,2% экз. в растворе сульфата цинка и сахарозы соответственна Всплывшие цист лямблий на поверхность раствора обусловлено их небольшим удельным весом по сравнению с плотностью окружающего раствора и целостностью их оболочки. Цисты Lamblia intestinalis, обнаруженные в флотанте и представленные на рис. 3, имели овальную форму с размерами 10—12 мкм в длину и 6-8 мкм в ширину. Выявленные жизнеспособные цисты на ранних стадиях развития покрыты плотной оболочкой, не имеющей микроповреждений; под ней располагается хорошо оформленное внутреннее содержимое.

Рис. 3. Цисты Lamblia intestinalis. Окраска 1%-ным раствором Люголя (объектив 40*, окуляр 10*)

Это было принято нами во внимание при разработке пробоотборника «ЛробоКонГ». Порошковый материал, применяемый в качестве фильтра, не травмирует целостность оболочки цисты лямблий. Отделение объектов от фильтрующего материала не требует таких механических воздействий, как со-нифнкакия, стирание в пластиковых мешочках, интенсивное взбалтывание н т.о. Считаем, целесообразным также рекомендовать для обработки прк помощи ОФФ-25 не только поверхностных слоев (флотанта), но и супернатанта, что позволит наиболее верно определить риск заражения человека и животных паразитарными болезнями.

Следующим этапом исследования стало изучение возможности очистки готовых препаратов от цианобактерий. Для этого предложено проводить предварительное осветление концентрата пробы от цианобактерий в результате осаждения их во флотирующем растворе при помощи химических и биологических веществ.

В ходе экспериментальных исследований изучалось альгицидное действие альгетиков (препаратов, применяемых для борьбы с водорслямн а аквариуме) «Алговек», «Алгостоп», «Альгицид», а также препарата «Аквастоп» с концентрацией действующего вещества 0,05 и 1%. Время экспозиции различно: 1,6 и 24 часа.

Результаты исследования проб, представленные на рис. 4, показывают, что наиболее эффективное разрушение оболочек цианобактерий наблюдается под воздействием на них препарата «Альгицид» при экспозиции 24 часа.

Акюсгсл, 1%

Аквастоп, 0.05%

ш

с

а Альгицид.

§ Альгицид, 0,0$%

£ и

5 Апостол, *

а «а

е-

| Алгостоп, 0,05%

£ н

Алл»«, 1% Алговек, 0,05%

0 10 20 30 40 » № їй І0 90 100

|И1ч«с НІчмз Р24чаа( Я погибши« цшиобшггсрнЯ

Рис. 4. Действие водных растворов альгетмков на жизнеспособность цианобактерий

Исследование осадка при экспозиции 24 часа показало, что растворы «Альгицид» с концентрацией 0,05% н 1% приводят к утрате жизнеспособности в среднем 76,8% и 98,4% клеток цианобактерий. Эффективность препарата «Алгостоп» в борьбе с цнанобактериями ниже в 1,8 раз, препарата «Аквастоп» - в 1,5 раза, а «Алговек» - в 10 раз. При этом увеличение концентрации «Альгицид» от 0,05% до 1% приводит к повышению эффективности его воздействия в 1,3 раза.

Обработка модельной жидкости цист лямблий раствором данной концентрации и экспозиции не приводит к нарушению целостности клеточной стенки цист лямблий, что позволяет рекомендовать использование 1% раствора «Альгицид» при экспозиции 24 часа для предварительного осветления воды

естественных водных объектов от цианобактерий в ходе ее ларингологического исследования.

Также изучалась возможность применения мочевины (карбамид COfNHîh) для очистки препаратов цист лямблий от цианобактерий. Результаты экспериментальных исследований, показывают, что 0,5%, 1% и 5% водные растворы мочевины за указанные промежутки времени не приводят к нарушению целостности клеточной стенки цист лямблий и цианобактерий.

Воздействие 10% и 20% растворов мочевины на циаяобактерии оказывается губительным через 1 час. Так, действие 10% раствора мочевины приводит к нарушению целостности клеточной стенки 67,8±0,2%, что в 1,4 раза меньше, чем при действии иа них 20% раствора (92,5±0,1%). При увеличении экспозиции до 2 часов достигается полная гибель (Ю0±0,1%) экз. при действии 20% раствора мочевины. А действие 10% раствора приводит к гибели 94,3±0,2% клеток цианобактерий.

Данные экспозиции и концентрации вещества, обладающего альгицнд-ным действием, также не вызывает осаждения цист лямблий во флотирующем растворе, что позволяет рекомендовать использование 20% раствора мочевины при экспозиции 1 час для осветления концентрата проб воды от цианобактерий.

В качестве биологических средств борьбы с сине-зелеными водорослями были изучены наиболее перспективные штаммы бактерий IGM-17 и IGM-36, отнесенных на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков к BrevibacEllus laterosporus.

Для этого к концентрату природных водорослей добавляли 96-часовую культуру бацилл в соотношении 12. Экспозиция составляла 20 мин., 1 и 24 часа. В исследуемых пробах при экспозиции 20 мин. и 1 час отмечалось вспенивание растворов, вызванное действием штаммов.

Результаты микроскопического исследования препаратов, представлен* ные на рис. 5, показывают, что через 24 часа в среднем было обнаружено 72,3 ±0,2% и 79,2*0,3% образовавшихся свободных нежизнеспособных клеток природных цианобактерий после воздействия на них штаммов IGM-I7 и IGM-36 соответственно. При дальнейшем помещении их во флотирующий (насыщенный) раствор наблюдалось их осаждение в нижние слои, что свидетельствует о нарушении целостности их клеточной стенки.

Микроскопическое исследование препаратов позволяет сделать вывод, что полный лизис клеток природных цианобактерий наблюдался лишь у 2,8±0,3% и 8,7±0,1% экз. после контакта их со штаммами бацилл IGM-I7 и ¡GM-36 соответственно. Это позволяет сделать вывод, что штамм IGM-36 за 24 часа обусловливает утрату жизнеспособности 87,9±0,3% клеток цианобактерий, что в 1,2 раза больше, чем при воздействии на них штамма 1GM-17(75,1 ±0,4%).

При изучении действия штаммов IGM-17 н 1GM-36 на цисты лямблий установлено, что при указанной экспозиции культуры штаммов IGM-Зб и IGM-I7 не влияют на их жизнеспособность. Это позволяет рекомендовать ис-

пользование штамма ЮМ-Зб при экспозиции 24 часа для предварительного осветления концентрата природной воды от цианобактерий.

Штамм IGM-17 Штамм ЮМ-Зб

Используемый препарат

Рис. 5. Влияние штаммов IGM-17 и ЮМ-Зб на клетки природных цианобактерий при экспозиции 24 часа

Экспериментальные исследования на модельной жидкости цист лямблий позволили разработать методику санитарно-пзразитологического исследования природной и тггьевой воды, основные этапы которой заключаются в следующем;

К Центрифугирование отобранного концентрата воды (природной ли питьевой) следует проводить в качающемся роторе (бакет-роторе) в течение 10 мин при 1500 об7мин., надосадочную жидкость осторожно слить.

2. К осадку добавить 3 мл 30% раствора сахарозы с удельным весом не менее 1,26 и тщательно перемешать стеклянной палочкой. При использовании химических средств борьбы с цнанобакгериями флотацию следует осуществлять в 33% водном растворе сем вводного сульфата цинка.

3. При исследовании природной воды для освобождения ее концентрата от цианобактерий в пробирку добавить 20% раствор мочевины в соотношении 1:1 и оставить на 1 час. Возможно использование для этих целей культуры штамма бактерий ЮМ-36 в соотношении 1:2 при экспозиции 24 часа. Осаждение цианобактерий в растворе также можно добиться при помощи 1% раствора препарата «Альгицнд» при экспозиции 24 часа.

4. При исследовании природной воды провести повторное центрифугирование в течение 10 мин при 1500 обУмин (режиме для флотирования биообъектов), при этом биологические объекты (цианобактерий), части-

цы фильтрующего материала (ПФГ) переходят в осадок, а паразитарные агенты всплывают,

5. Затем супернатанг отобрать на аналитическую трековую мембрану с помощью отборника флотанта фильтрующего ОФФ-25 по инструкции к нему, промыть дистиллированной водой.

6. Приготовить микропрепарат, окрасить его раствором Люголя и провести микроскопическое исследование при увеличении: объектив 10* - 40*, окуляр 10*.

Сравнение результатов исследований, полученных при организации экологического мониторинга поверхностных водных объектов, питьевой воды в отношении их паразитарного загрязнения и представленных в табл.5, показывает, что наиболее полное представление об уровне паразитарного обсеменения воды было получено при внедрении современных технических средств отбора н обработки проб воды.

Таблица 5

Результаты сшнпрно-тршталогаческого исследования поверхностных водных объектов н питьевой воды

Место отбора проб Методика исследования Выявлено положительных проб, %±т Обнаружено цист лямблий, в среднем на пробу, экз.

Река Тускарь Предложенная методика 54,2*0,3 8,7*0,2

Методика МУК 4.2.964 - 00 38,7*0,1 2,6*0,1

Река Сейм Предложенная методика 25,9±0,1 4,8*0,2

Методика МУК 4.2.964 - 00 17,б±0,2 1,6*0,2

Шахтные колодцы индивидуального пользования Предложенная методика 13,9*0,2 2,8*0,2

Методика МУК 4.2.964 - 00 8,3*0,2 1,1*0,1

Шахтные колодцы общественного пользования Предложенная методика 25,0аЮ,1 6,1*0,1

Методика МУК 4.2.964 - 00 16,7*0,1 2,3*0,2

Недействующие шахтные колодцы Предложенная методика 45,8*0,3 10,7*0,2

Методика МУК 4.2.964 - 00 29,2*0,1 3,9*0,3

Питьевая вода разводящей сети Предложенная методика 1,4*0,1 1,5*0,1

Методика МУК 4.2.964 - 00 0 0

При этом частота обнаружения паразитарных патогенов в воде увеличивается в среднем в 1,5 раза, а эффективность выявления — в 3 раза. Внедрение предложенной методики в практику паразитологнческих лабораторий позволяет повысить эффективность экологического мониторинга воды при оценке ее паразнтологической безопасности и наиболее точно прогнозировать риск заражения человека и животных цистами лямблий.

Экспериментальные исследования модельной жидкости цист лямблий в соответствии с методикой, рекомендуемой МУК 4,2.964 — 00, н предложенной нами методикой, показывают, что обработка проб с использованием современных технических устройств повышает эффективность обнаружения цист лямблий в 3,5-4,5 раза. При этом отмечается повышение экстенсивных показателей в 14 раза.

Вычисление относительной погрешности каждой из методик позволяет сделать вывод, что предложенная нами методика с использованием современных технологий отбора проб воды и их исследования не нуждается в дальнейшей доработке н может быть использована в практике паразитологнческих лабораторий. Исходя из этого, при организации экологического мониторинга водных объектов мы провели санитарно-паразитологнческие исследования воды поверхностных водных объектов, расположенных на территории Курской области, и питьевой воды разводящей системы г. Курска в соответствии с каждой из методик.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика санитарно-паразитологнчсского исследования воды с использованием современных технических устройств для отбора проб воды (пробоотборник • концентратор гидробиологический «ПробоКонГ») и их дальнейшей обработки а лаборатории (отборник флотанта фильтрующий ОФФ-25). Это позволяет отбирать пробы объемом до 400-1000 л, облегчает доставку в лабораторию полученного концентрата объемом 100-150 мл и обеспечивает более щадящий режим отделения (отстаивание или фильтрование) цист лямблий от фильтрующего материала. Применение данной методики позволяет существенно облегчить организацию и проведение экологического мониторинга воды поверхностных водных объектов и питьевой воды в отношении их паразитарного загрязнения, а также повысить его эффективность.

2. Внедрение новых технологий исследования воды сокращает время исследования до $-10 часов, а приготовление микропрепарата отборником флотанта фильтрующего ОФФ-25 и микроскопическое исследование его на аналитической трековой мембране уменьшает потери инвазионного материала на 10-12%.

3. Использование усовершенствованной методики для обнаружения цист лямблий в модельной жидкости повышает эффективность их индикации в

3,4 раза. При увеличении объема проб с 25 до 200 л выяаляемость паразитарных патогенов возрастает в 2 раза н достигает 68,4%. При исследовании проб <200 л) цисты лямблий обнаруживаются в 2,5 раза чаще (66,7±0,2%). Увеличение объема пробы приводит х повышению количества положительных проб в 1,6 раза.

4. Применение ПробоКонГ и ОФФ-25 в практике работы паразиютогнче-ских лабораторий при организации экологического мониторинга водных обьеетов и питьевой воды повышает частоту выделения паразитарных агентов в воде в 1,4-1,6 раза, а также интенсивные показатели обсемененностн вода! в 3 раза.

5. Аналитические трековые мембраны с размером пор 0,2-0,4 мкм обеспечивают удобный для микроскопического исследования задний фон, равномерное распределение цист лямблий на поверхности и способствуют задержанию на них 96,4% цист лямблий.

6. Гетерогенность цист лямблий обуславливает неравномерное распределение их во флотационной жидкости. Жизнеспособные цисты лямблий на ранних стациях развития (92,3*0,2%) концентрируются в поверхностном слое флотационного раствора (30% раствор сахарозы); жизнеспособные цисты на поздних стадиях развития (15,2±0,1%) обнаруживаются в толще взвеси, а погибшие вдеты лямблий, имеющие нарушения целостности их клеточной стенки (3,2*0,2%), — оседают в нижние слон.

7. Для борьбы с цианобактериями, затрудняющими идентификацию цист, лямблий, необходимо использовать вещества, обладающие альгицндным действием: 20% раствор мочевины при экспозиции 1 час; 1% раствор препарата «Альгицид» и штамм бактерий ЮМ-36 при экспозиции 24 часа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Шире внедрять в практику производственных лабораторий водоочистных сооружений н ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» усовершенствованную методику санитарно-паразитологического исследования. питьевой воды и вода поверхностных водных объектов, поверхностного стока.

2. Для отбора проб воды использовать пробоотборник • концентратор гидробиологический «ПробоКонГ», который обеспечивает отбор проб воды объемом 400-1000 л в течение 5-6 часов и доставку в лабораторию полученного концентрата объемом 100-150 мл.

3. Приготовление препаратов паразитарных патогенов для микроскопиро-вания осуществлять из супернаханта, для чего использовать отборник флотанта фильтрующий ОФФ-25. Микроскопическое исследование го-

товых препаратов проводить непосредственно на мелкопорнстых аналитических трековых мембранах с размером пор 0,2-0,4 мкм. 4. Для осветления приготовленного концеюрата пробы воды от цианобак-терий проводить предварительную его обработку 20% раствором мочевины в течение 1 часа (соотношение 1:1). Л также возможно применение для этих целей 1% раствора препарата «Алынцвд» или биопрепарата, приготовленного на основе жидкой культуры бактерий Qrevibacillus laterospoms (штамм ЮМ-Зб) при экспозиции 24 часа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Эпидемический надзор за паразитарными болезнями; Методические указания. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.-83 с.

2. Санитарно-паразитологнческие исследования плодоовощной, плодово-ягодной и растительной продукции: Методические указания. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004, —19 с.

3. Буназсов- A.B., Грибннюк М.В., Плехова H.A. Санитарно-паразитологичсский мониторинг за централизованным водоснабжение в области // Научные подходы к решению региональных гигиенических проблем сохранения здоровья человека: Научные труды Федерального научного Центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана. Вып. 15. — Липецк, 2005. - С. 426428.

4. Малышева Н.С., Дмитриева EJ1., Плехова H.A. Внедрение компьютерных технологий в систему формирования паразитология ескнх представлений // Научные подходы к решению региональных гигиенических проблем сохранения здоровья человека: Научные труды Федерального научного Центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана. Вып. 15,—Липецк, 2005. — С. 520-522.

5. Профилактика лямбд поза: Методические указания. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2005.—36 с.

6. Профилактика дирофиляриоза: Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2005.— 18 с.

7. Санитар но-микробиологический и санитар i ю-параз отологический анализ воды поверхностных водных объектов. Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2005. — 75 с.

8. Плехова H.A., Дмитриева ЕЛ., Романенко H.A., Елизаров A.C. Совершенствование методов отбора и саннтарно-паразиталогического исследования воды // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Матер, науч. конф.-М., 2006.-С. 303-305.

9. Дмитриева ЕЛ., Малышева Н.С., Плехова H.A., Самофалова H.A. Мероприятия по снижению риска загрязнения окружающей среды ооцнетами крюттоспоридий И Интеграция медицины и образования: Матер, регион, науч. конф. - Курск, 2006. - С. 21-22.

10. Плехова H.A., Малышева Н.С., Дмитириева ЕЛ^ Елизаров A.C. Некоторые аспекты методического обеспечения санитарно-паразитологическнх исследований воды // Интеграция медицины и образования: Матер, регион, науч. конф. - Курск 2006. - С. 82-84.

11. Дмитриева £ЛЧ Малышева Н.С., Плехова H.A., Буря к MJ3. Распространение криптоспорндий в естественных экосистемах Курской области // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Матер, науч. конф. — М..2006.-С. 141-143.

12. Плехова H.A., Малышева Н.С. Значение современных методических решений в совершенствовании современных санитарно-паразитологичесхих исследований воды // Диверсификация и стратегия медицины и образования: Матер, междунар. науч. конф.: в 2 ч. - Ч. 2. - Курск: КГУ, 2006. - С. 43-46.

13. Плехова НА., Малышева Н.С. Совершенствование методов санитарио-паразитологических исследований воды // Медицинская паразитология и паразитарные болезни.—М, 2006. — №4 — С. 46-48.

14. Романенко H.A., Комисарова ЮЛ, Плехова НА. Состояние н перспективы улучшения санигарно-паразитологкческого контроля качества воды К Здоровье нации — основа процветания России: Матер, науч.-практич. контр. Ш Всероссийского фор. - М„ 2007. - Т. 2. -Ч. 1. - С. 228-229.

Нина Анатольевна ПЛЕХОВА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ САНИТАРНО-ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОДЫ В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Автореферат

Лицензия на издательскую деятельность ИД №06248 от 12.11.2001 г. Подписано в печать 25.04.2007. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 180!.

Изд-во Курского государственного университета 305000, г. Курск, ул. Радищева, д. 33

Отпечатано в лаборатории информационно-методического обеспечения КГУ