Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование молекулярной диагностики холеры и сибирской язвы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование молекулярной диагностики холеры и сибирской язвы"

На правах рукописи

у?*/-

АБДРАШИТОВА АДИЛЯ САБЕРЬЖАНОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 7015

Саратов-2015

005566718

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научн исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфе . защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнад зора)

Научные руководители: Саяпина Лидия Васильевна

доктор медицинских наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный эксперт Осина Наталия Александровна кандидат биологических наук

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория молекулярной диагностики, заведующая лабораторией Официальные оппоненты: Золотухин Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина»,

факультет ветеринарной медицины, декан Замараев Валерий Семенович доктор медицинских наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет», кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии с курсом клинической микробиологии, заведующий кафедрой Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки

«Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Нижний Новгород

Защита состоится «13» мая 2015 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.146.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) по адресу: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Тел./факс(8452) 97-03-83

Автореферат диссертации размещён на официальном сайте Минобрнауки РФ. Диссертация и автореферат размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.rvi/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан « 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

H.H. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ , , ,

Актуальность исследования и состояние проблемы. Эпидемиологическая обстановка в мире по особо опасным инфекционным болезням продолжает оставаться неблагоприятной. В современных условиях не ослабевает риск завоза холеры на территорию Российской Федерации из неблагополучных по данному заболеванию стран, сохраняется вероятность возникновения вспышек этой инфекции (Онищенко и др., 2005; Москвитина и др., 2012, 2013, 2014). Серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства нашей страны представляет сибирская язва, заболеваемость которой на протяжении последних лет не имеет тенденции к снижению (Рязанова и др., 2013; Еременко и др., 2013). Важной задачей в рамках проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий по холере и сибирской язве является своевременное выявление возбудителей данных инфекционных болезней. Одним из методов, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК микроорганизмов в течение 2-3 ч, является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Среди штаммов холерных вибрионов только Vibrio cholerae Ol и 0139 серогрупп, содержащие в своем геноме ctxAB и tcpA-F гены, отвечающие за синтез холерного токсина и ток-син-корегулируемых пилей адгезии, соответственно, способны вызывать заболевание холерой, склонное к широкому эпидемическому распространению, и являются эпидемически опасными. Вибрионы Ol серогруппы представлены двумя биоварами: классическим и эльтор, отличающимися по токсигенности.

Имеющийся к началу исследования зарегистрированный препарат для генной диагностики холеры «Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции (ГенХол)» обеспечивает детекцию только одного из указанных генов - ctxA. Для определения серогрупп и биоваров штаммов К cholerae широкое применение получили холерные диагностические сыворотки Ol, 0139 и бактериофаги диагностические холерные классический («С») и эльтор. Однако, результаты ежегодного анализа свойств холерных вибрионов, выделяемых на территории Российской Федерации, указывают на высокий процент штаммов V. cholerae, резистентных к данным бактериофагам и имеющих сниженную агглюти-набельность холерными диагностическими сыворотками: в 2004-2008 гг. такими были все выделенные штаммы холерных вибрионов, в 2011 г. - 79,5 %, в 2012 г. — 87,5% (Безсмертный и др., 2009, 2010; Иванова и др., 2011, 2012, 2013). Поэтому, при выявлении холерных вибрионов очевидна необходимость определения у них наличия генетических маркеров эпидемической значимости и принадлежности к Ol, 0139 серогруппе и биовару.

Вирулентные штаммы сибиреязвенного микроба содержат две плазмиды pXOl и рХ02, отвечающие за синтез токсинов и капсулообразование, соответственно. Потеря хотя бы одной плазмиды приводит к авирулентности культур патогена. Проведение исследований с помощью зарегистрированного препарата «Тест-система для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+

методом полимеразной цепной реакции (ГенСиб)» обеспечивает выявление только urrai В. anthracis, содержащих плазмиду pXOl, поскольку в качестве ДНК-мишени в этом препар используется pagA ген, расположенный на данной плазмиде. В связи с этим, определе11 трудности возникают при детекции атипичных изолятов сибиреязвенного микроба, особенн пробах из объектов окружающей среды (Шишкова и др., 2011). Кроме того, отсутствует в можность дифференциации вирулентных культур возбудителя сибирской язвы, несущих i миды pXOl и рХ02, от авирулентных - лишенных одной из обозначенных плазмид, в том ч ле и вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1 и 55.

Все это обусловливает необходимость совершенствования препаратов для генной 11 ностики холеры и сибирской язвы. Перспективным направлением представляется использо ние технологий мультилокусной ПЦР, основанной на одновременной амплификации неско ких ДНК-мишеней и гибридизационно-флуоресцентной детекции для регистрации результа ПЦР в режиме «реального времени». Используя обозначенные выше подходы, специали Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский инс тут эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и б гополучия человека (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора) и ФКУЗ РосНИП «Микроб» Роспотребнадзора разработали «Набор реагентов для выявления ДНК Bad anthracis в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной ц ной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального вре ни» «АмплиСенс® Bacillus anthracis-FRT», основанный на амплификации генов pagA и са локализованных на плазмидах pXOl и рХ02, соответственно. Диагностическая чувствите ность и специфичность данной тест-системы определена авторами только в лабораторных следованиях, тогда как для её дальнейшего использования в лабораторной практике необхо мо оценить диагностическую эффективность препарата в рамках расширенных медицине испытаний. В то же время, мультилокусные ПЦР-тест-системы для выявления и идентиф ции холерных вибрионов к началу исследования разработаны не были.

При производстве генодиагностических препаратов для оценки эффективности отде ных реагентов и компонентов тест-систем используются пробы, содержащие искомую Д мишень. В случае препаратов, направленных на выявление ДНК возбудителей бактериаль инфекций, наиболее часто такими образцами являются суспензии культур искомого пато1 Контроль тест-систем для генной диагностики холеры невозможен без использования эпиде чески значимых штаммов холерных вибрионов, что повышает риск биологической опасно отдельных этапов технологической линии комплектации препарата. Одним из подходов в шении данного вопроса может быть разработка стандартных образцов предприятия (СО

представляющих собой препараты ДНК рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генов ctxA и tcpA возбудителя холеры.

Цель работы — разработка тест-систем для выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом мулыилокусной ПЦР с гибридизационно-флуоресценгным и элек-трофоретическим учетом результатов, оценка диагностической эффективности новых препаратов для генной диагностики холеры и сибирской язвы.

Основные задачи исследования:

1. Выбрать участки хромосом холерных вибрионов, перспективные для использования в качестве ДНК-мишеней при выявлении и идентификации патогена методом ПЦР, подобрать к ним специфичные праймеры и зонды, оптимизировать условия амплификации с различными вариантами учета результатов в мультилокусном формате.

2. Разработать тест-системы для индикации и идентификации штаммов V. cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и изучить их диагностическую эффективность.

3. Сконструировать рекомбинантные штаммы Е. coli, содержащие фрагменты ctxA и tcpA генов холерных вибрионов. Создать на их основе стандартные образцы предприятия для технологической линии комплектации компонентов разработанных препаратов.

4. Апробировать созданные тест-системы при идентификации штаммов V. cholerae, выделенных на территории Российской Федерации, и при проведении мониторинга воды открытых водоемов на наличие холерных вибрионов.

5. Сформировать целевую коллекцию штаммов представителей рода Bacillus и определить с её помощью диагностическую эффективность набора реагентов «АмплиСенс® Bacillus anthracis-¥KT» в рамках медицинских испытаний.

Научная новизна работы. Впервые реализован оптимальный подход для выявления ДНК холерных вибрионов с одновременным определением их эпидемической значимости и таксономического положения методом мультилокусной ПЦР на основании амплификации генов ctxA и tcpA, отвечающих за синтез А-субъединицы холерного энтеротоксина и большой субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии, соответственно; wbeNIwbeT и wbflt, входящих в состав кластеров генов, кодирующих формирование 01 и 0139 антигена, соответственно; hlyA, последовательность которого отличается у культур возбудителя холеры классического биовара наличием делеции 11 п.н.

Разработаны варианты мультилокусных ПЦР для одновременной амплификации ctxA и tcpA, wbeN и hlyA генов с электрофоретическим учетом результатов и ctxA и tcpA, wbeT, wbfR, hlyA генов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

На основании полученных результатов впервые сконструированы наборы реагентов выявления ДНК V. cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды метод ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Пр ложенная комплектация наборов обеспечивает их многоплановое использование в зависимо от поставленных задач: детекция и идентификация эпидемически значимых вибрионов в на ном биологическом материале и в пробах из объектов окружающей среды во время вспы i инфекции или идентификация выделенных культур патогена: определение принадлежносп Ol и 0139 серогруппе, биовару, эпидемической значимости в период эпидемического благо лучия по холере. Доказана их высокая диагностическая чувствительность - 1х104 м.к./ 1*103м.к./мл и специфичность - 100% как при исследовании культур микроорганизмов, т. проб биологического материала и объектов окружающей среды.

Показана перспективность использования СОП, содержащих ДНК плазмид pGEM-включенными в них фрагментами генов ctxA и tcpA, вместо бактериальных суспензий эпидеь чески значимых штаммов холерных вибрионов в технологической линии комплектации отде ных реагентов разработанных наборов для оценки их эффективности.

Продемонстрирована эффективность использования разработанных препаратов при ределении эпидемической значимости, принадлежности к Ol, 0139 серогруппам и биов культур V. cholerae, выделенных в последние годы от больных и из объектов окружающей с ды на территории Российской Федерации, и характеризующихся атипичными результатами чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам. Доказана возможность их п менения для выявления холерных вибрионов в пробах воды открытых водоемов после перв ного или вторичного обогащения на пептонной воде.

Установлена высокая диагностическая эффективность набора реагентов «АмплиСе Bacillus anthracis-FRT» при исследовании культур сибиреязвенного микроба, проб биолог ского материала и объектов окружающей среды, искусственно контаминированных возбуди лем сибирской язвы и другими бациллами: чувствительность 1 х 103 м.к./мл, специфичност 100%, воспроизводимость - 100%.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование в качестве ДНК-мишеней ctxA, tcpA, wbe, wbf и hlyA генов холер вибрионов позволяет с помощью набора мультилокусных ПЦР не только детектировать воз дителя холеры, но и определить его эпидемическую значимость, биовар и принадлежнос Ol, 0139 серогруппам.

2. Сконструированные наборы реагентов на основе мультилокусной ПЦР с электрофо тическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов характеризуются высо диагностической эффективностью: чувствительность от 1 х 104 м.к./мл до 1*103 м.к./мл, спе

фичность - 100%, и обеспечивают выявление ДНК холерных вибрионов и сибиреязвенного микроба в пробах биологического материала и объектов окружающей среды, а также видовую и внутривидовую дифференциацию этих патогенов.

3. Применение разработанных наборов реагентов для генной диагностики холеры способствует определению таксономического положения и эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов в случае их сниженной чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам и агглютинабельности сыворотками Ol и 0139, обеспечивает выявление возбудителя холеры в пробах воды открытых водоемов после их первичного или вторичного подращивания на пеггтонной воде.

4. Применение стандартных образцов предприятия, представляющих собой ДНК реком-бинантных плазмид с фрагментами ctxA и tcpA генов холерных вибрионов, позволяет отказаться от использования эпидемически значимых штаммов возбудителя холеры в технологической линии комплектации отдельных компонентов разработанных препаратов для оценки их эффективности.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны способы ускоренного выявления холерных вибрионов с одновременным определением наличия у них генетических маркеров эпидемической значимости: ctxA и tcpA генов, принадлежности к 01 и 0139 серогруппе, классическому и эльтор биовару методом мультилокусной ПНР с электрофоретической и ■ гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и сконструированы тест-системы для их выполнения.

Предложенные наборы реагентов для генной диагностики холеры и сибирской язвы зарегистрированы в установленном порядке:

- Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02417 от 09.04.2008 г. Набор реагентов для выявления ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» «АмплиСенс® Bacillus anthracis-FRT»;

- Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11139 от 27.06.2011 г. Набор реагентов для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации патогенных штаммов Vibrio cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Vibrio cholerae-VL»;

- Регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13430 от 21.05.2012 г. Набор реагентов для выявления и ускоренной идентификации Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции с элекгрофоретическим учетом результатов «Ген Vibrio cholerae - идентификация -РЭФ». . •,,

Внесены изменения в нормативную документацию на набор реагентов «АмплиСе Bacillus aníhracis-VRT» (акт внедрения рекомендаций, утвержденный зам. директора ФБ ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Малеевым В.В.).

Подготовлены и утверждены Инструкция по применению (приказ Росздравнадзора

20 июня 2011 года № 3690-Пр/11) и Технические условия ТУ 9398-058-01897593-2010 на « бор реагентов для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации патогенных штаммов Vib cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимераз цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Vib cholerae-YL».

Подготовлены и утверждены Инструкция по применению (приказ Росздравнадзора

21 мая 2012 года № 2444-Пр/12) и Технические условия ТУ 9398-039-01898109-2011 на « бор реагентов для выявления и ускоренной идентификации Vibrio cholerae методом полимер ной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae - иден фикация - РЭФ)».

В Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Р потребнадзора подготовлены к депонированию два рекомбинантных штамма Е. coli JM pGEM-Tctx564 и Е. coli JM109 pGEM-TIcpS67, несущих плазмиды со встроенными в них фрагм тами ctxA и tcpA генов.

На разработанный СОП проверки эффективности амплификации ctxA и tcpA генов в боре реагентов «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» на основе плазмид pGEM-Tctxs pGEM-Ttcp667 подготовлены свидетельство и инструкция по применению, утвержденные дир тором ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора Кутыревым В.В.

Результаты работы вошли в практическое руководство «Лабораторная диагност опасных инфекционных болезней» (Москва, 2013). Материалы диссертации используются курсах повышения квалификации специалистов «ПЦР в диагностике инфекционных болезне индикации патогенных микроорганизмов».

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследо ния. Работа выполнена в отделах диагностики инфекционных болезней и Государственная к лекция патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора в рамках пла вых научно-исследовательских тем «Усовершенствование лабораторной диагностики опас бактериальных и вирусных инфекций» 2009-2013 гг. (шифр 39-2-09) и «Разработка соврем ных средств диагностики геморрагической лихорадки Денге, трахомы, лепры, гельминтозо других ЗТБ, актуальных для стран Центральной Азии» 2009-2012 гг. по постановлению Пр тельства РФ №1426-р от 02.10.2009 г. «О выделении в 2009-2012 гг. средств федеральн бюджета на проведение научно-исследовательских работ, разработку новых средств диагно ки и профилактики тропических болезней, развитие международного сотрудничества». Лич

вклад автора состоит в непосредственном участии в получении и обработке экспериментальных данных. Лично автором проведен анализ литературы, выполнены исследования по выбору оптимальных ДНК-мишеней для выявления и идентификации холерных вибрионов с помощью мультилокусной ПЦР, подбору на их основе специфичных праймеров, разработке препарата для генной диагностики холеры с электрофоретическим учетом результатов, конструированию рекомбинантных штаммов Е. coli, содержащих плазмиды с фрагментами ctxA и tcpA генов, и подготовке на их основе стандартного образца предприятия, апробации разработанных препаратов при индикации и идентификации штаммов V. cholerae, определении диагностической эффективности набора реагентов «АмплиСенс® Bacillus anthracis-¥RT». Подбор праймеров, зондов, создание тест-системы «АмплиСенс® Vibrio cholerae-FL» осуществляли совместно с сотрудниками ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (г. Москва) при непосредственном участии автора Совместно с сотрудниками ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора и ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (п. Обо-ленск) определена диагностическая эффективность набора реагентов «Ген Vibrio cholerae -идентификация - РЭФ» в рамках медицинских испытаний.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (г. Киров, 2008); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (г. Саратов, 2012); проблемной комиссии и Координационном научном совете по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (г. Ставрополь, 2012); Международной конференции «Биология - наука XXI века» (г. Москва, 2012); ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (г. Саратов, 2008, 2011, 2014); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации" (г. Москва, 2012); VI Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2014); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014»

(г. Москва, 2014). Материалы диссертации вошли в научные отчеты по законченным техн ским и медицинским испытаниям наборов реагентов.

Публикацни. По теме диссертационной работы опубликовано 15 работ, из них 4 опубликованы в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах и состоит введения, обзора литературы, главы с описанием используемых материалов и методов иссле вания, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссер ция иллюстрирована 25 таблицами, 12 рисунками. Библиографический указатель включает источников литературы, в том числе 58 отечественных и 197 зарубежных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данном разделе рассмотрены вопросы применения молекулярно-генетических тех! логий для выявления и идентификации возбудителей холеры и сибирской язвы, ге: инженерных подходов для конструирования рекомбинантных штаммов, перспективных в ка стве положительных контрольных образцов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований. Материалом для исследования служили: бактериальные взв культур микроорганизмов, пробы биологического материала от человека (испражнения, же; пробы из объектов окружающей среды (вода из открытых водоемов), а также искусстве контаминированные возбудителями холеры, сибирской язвы и гетерологичными микроор низмами пробы биологического материала от человека (кровь, содержимое язвы, мокрота, пражнения), от лабораторных животных (печень, селезенка, лимфатические узлы), пробы объектов окружающей среды (вода из открытых водоемов, почва, корма, молоко крупного гатого скота).

Работа выполнена с использованием 405 штаммов микроорганизмов, из них 228 шт мов из коллекционного фонда Государственных коллекций патогенных бактерий ФКУЗ Р НИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора и ГИСК им. Л.А. Тарасевича (112 - V. cholerae, 73 -cillus spp, 43 - штаммы гетерологичных микроорганизмов), 177 штаммов холерных вибрион выделенных на территории Российской Федерации в период с 2009 по 2012 гг.

Методы исследования. Для культивирования микроорганизмов применяли общепр: тые среды и методы. Работу с культурами возбудителей холеры и сибирской язвы проводи соответствии с действующей нормативной документацией по оргшшзации и проведению ла раторной диагностики данных инфекционных болезней.

Микробиологические, биохимические, серологические методы исследования с помош коммерческих препаратов проводили в соответствии с инструкциями изготовителей.

Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК осуществляли с использованием генетической базы данных GenBank NCBI, программы Mega 3.1, алгоритмов AlignX - для выравнивания последовательностей и UPGMA - для кластерного анализа. Подбор праймеров проводили с помощью программы Primer Express, GeneRunner, алгоритма BLAST. Подбор зондов проводили в онлайн-режиме на интернет-сайте www.genscript.com.

Выделение ДНК осуществляли с использованием наборов «ДНК-сорб В», «Рибо-сорб», «Рибо-преп» в соответствии с инструкциями изготовителей. ПЦР проводили на программируемых термоциклерах Терцик MC 2 («ДНК-технология», Россия), БИС (ООО «БИС-Н», Россия), RotorGene 3000 и 6000 («Corbett Research», Австралия). Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза, согласно методике, рекомендованной Л.А. Осгерманом (1981). Результаты учитывали и документировали с помощью системы GelDoc 2000 («BioRad», США).

Очистку ампликонов проводили на колонках «Centry-sep columns» («PIRCETON SEPARATIONS», США). Клонирование ПЦР-продукта осуществляли с помощью набора «pGEM-T Vector Systems» («Promega», США), очистку плазмидной ДНК - набора «Риге Link@Quick Plasmid Mini prep kit» («Invitrogen», США). Работу проводили в соответствии с инструкциями изготовителей. Определение концентрации ДНК проводили с использованием портативного флуориметра Qubit® 2.0 и набора реагентов «Quant-itTM dsDNA assay kit, broad range» («Invitrogen», США) в соответствии с инструкцией к прибору и набору реагентов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка способов выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

На первом этапе нашей работы проведен анализ нуклеотидных последовательностей холерного вибриона, представленных в базе данных NCBI GenBank, а также литературных источников по вопросам генной диагностики холеры. Установлено, что для обеспечения возможности выявления возбудителя холеры с одновременным определением его таксономического положения и эпидемической значимости методом мультилокусной ПЦР наиболее перспективным представляется использование локусов ctxAB, tcpA, wbe, wbf, hlyA.

Гены ctxAB, отвечающие за синтез холерного токсина, и ген tcpA, кодирующий большую субъединицу токсин-корегулируемых пилей адгезии, являются основными генетическими детерминантами эпидемической значимости возбудителя холеры (Четина и др., 1992; Смирнова и др., 1999). Показана высокая степень гомологии ctxA гена (до 99%), тогда как ctxB локус несет до 8 единичных мутаций. Поэтому для подбора праймеров был выбран ctxA ген.

Нуклеотидная последовательность tcpA гена имеет более высокий процент содержания полиморфных нуклеотидов (до 33,4%) по сравнению с опероном ctxAB. Начальный участок ло-

куса с 1 по 176 нуклеотид содержит 7,9% SNP (от англ. Single-Nucleotide Polymorphism - полиморфизм единичных нуклеотидов) (14 нуклеотидов), а концевой со 177 по 675 нуклеотид -43,7% (218 нуклеотидов). Кроме того, вариабельность данного гена связана с принадлежностью холерных вибрионов к классическому и эльтор биоварам. Праймеры и зонды подбирали таким образом, чтобы хотя бы один из них располагался в области консервативной для всех холерных вибрионов.

В качестве ДНК-мишеней для определения принадлежности V. cholerae к Ol и 0139 се-рогруппе наиболее перспективным представляется использование wbeN, wbeT и wb/R генов, соответственно, поскольку они характеризуются высокой гомогенностью и специфичностью среди вибрионов данных серогрупп. В то же время, локус hlyA может рассматриваться как видос-пецифичный, поскольку его последовательность с одной стороны консервативна у холерных вибрионов разных серогрупп, а с другой — отличается от таковой у других вибрионов. Помимо этого, у возбудителя холеры классического биовара в данном гене имеется деления размером 11 п.н., что указывает на возможность использования этого участка в качестве ДНК-матрицы для дифференцирования биоваров V. cholerae методом ПЦР.

На основании локусов ctxA, tcpA, wbeT, wbeN, wb/R, hlyA подобраны олигонуклеотидные праймеры и зонды. Для проведения реакции с учетом результатов в режиме «реального времени» в состав зондов были введены различные флуоресцентные метки, а с электрофоретической детекцией - выбранные праймеры фланкировали фрагменты различной длины (Таблица 1). По данным анализа с помощью алгоритма BLAST по базе данных GenBank NCBI олигонуклеотиды характеризовались высокой специфичностью в отношении соответствующей ДНК-мишени.

Для обеспечения возможности проведения многоплановых исследований с помощью разрабатываемых наборов реагентов (идентификация выделенных культур холерных вибрионов по эпидемической значимости и/или таксономическому положению, или детекция эпидемически значимых вибрионов в нативных пробах биологического материала и из объектов окружающей среды по эпидпоказаниям) было подготовлено несколько вариантов мультилокусных ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени»: амплификация генов ctxA и tcpA («Скрин»), wbeT, wb/R и hlyA (консервативный участок) («Тип»), а также моно- и мультилокусных ПЦР с электрофоретической детекцией - генов ctxA и tcpA («ctx-tcp»), wbeN и hlyA (участок с делецией) («Ol-биовар»), wb/R («0139») (Таблицы 2, 3).

Таблица 1 - Характеристика праймеров и зондов, подобранных на основе ctxA, tcpA, wbeT,

wbeN, wbfR, hlyA генов

ДНК—мишень Флуоресцентные метки зонда при ПЦР-РВ Размер амплифицируемого фрагмента при ПЦР-ЭФ, н.п.

ctxA FAM-BHQ1 564

tcpA ROX-BHQ2 218

wbeT/N FAM-BHQ1 420

wbfR ROX-BHQ2 439

hlyA, консервативная область R6G-BHQ1 н/и

hlyA, участок с делецией н/и* 264

Примечание: * - не исследовали.

Таблица 2 - Варианты мультилокусной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени

Флуоресценция по каналам

Штамм «Скрин» «Тип»

V, cholerae ctxA ВКО tcpA wbeT hlyA wbfR

FAM JOE ROX FAM JOE ROX

01, б/классический (ctxA+ tcpA+) + ± - + -

OI, б/эльтор (ctxA + tcpA+) + ± :: 4- : + + :: -

0139 (ctxA+tcpA+) + ± + - ...

OI, б/эльтор (ctxA- tcpA-) - - + + -

0139 (ctxA- tcpA—) - ± - - + : +

не-Ol, не-0139 (ctxA+ tcpA+) + ± : + - + -

не-01, не-0139 (ctxA- tcpA-) - ± - - + -

Таблица 3 - Варианты мультилокусной ПЦР с учетом результатов методом электрофореза в

агарозном геле

Амплификация фрагментов, п.н.

Штамм «ctx-tcp» «01-биовар» «OI 39»

V. cholerae ctxA tcpA wbeN ЫуАеШ/1к~°1 wbfR

564 218 420 264 439

01, б/классический (ctxA+ tcpA+) + + й + - -

OI, б/эльтор (ctxA+ tcpA+) + : + + -

0139 (ctxA + tcpA+) + + : - + +

OI, б/эльтор (ctxA- tcpA-) - - + + -

0139 (ctxA- tcpA-) - - - + .

не-Ol, не-0139 (ctxA+ tcpA+) + + : - + -

не-01, не-013 9 (ctxA- tcpA-) - - - + -

Для контроля эффективности экстракции ДНК в исследуемых пробах был разработан рекомбинантный неконкурентный внутренний контрольный образец (ВКО), содержащий последовательности праймеров на основе ctxA гена при проведении ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени». Для выявления ВКО сконструирован специфичный зонд с флуоресцентными метками R6G-BHQ1 и его амплификация предусмотрена вместе с праймерами и зондами на основе ctxA и tcpA генов в ПЦР-смеси «Скрин».

Оптимизацию условий амплификации и определение чувствительности и специфичности разработанных моно- и мультилокусных ПЦР осуществляли с использованием препаратов ДНК, выделенных из бактериальных суспензий штаммов V. cholerae eltor 1344 (ctxA+tcpA+), V. cholerae классического биовара 569В (ctxA+tcpA+), V. cholerae 0139 серогруппы Р-16064

(ctxA+tcpA+), V. cholerae eltor KM-26 (ctxA-tcpA-), V. cholerae 0139 M-368 (ctxA-tcpA-), V. cholerae не-Ol не-0139 P-9741 (ctxA-tcpA-), E. coli с концентрацией lxlO2- 1хЮ5 м.к./мл.

Установлено, что для проведения реакции с учетом результатов в режиме «реального времени» на термоциклерах типа RotorGene необходимо: по 2,8 пМоль каждого из праймеров, 0,87 пМоль каждого из зондов, 0,17 мМоль - дНТФ, 3,4 мМоль - ионов Mg2+, 1,12 ед. - фермента, а программа амплификации должна включать предварительную денатурацию при температуре 95°С в течение 5 мин, 10 циклов, состоящих из 95°С - 10 с, 60°С - 25 с, 72°С - 10 с, 35 циклов, включающих 95°С - 10 с, 56°С - 25 с, 72°С — 10 с, учет флуоресцентного сигнала - при 56°С. При этом оптимальные значения пороговой линии (Threshold) по каналам FAM и JOE составляют - 0,05, по каналу ROX - 0,1, а максимальная величина порогового цикла Ct - не выше 33. Подбор праймеров, зондов и оптимизацию условий амплификации для мультилокусной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией осуществляли совместно с сотрудниками ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (г. Москва).

В составе реакционной смеси для ПЦР с электрофоретическим учетом результатов требовалось наличие 10-12 пМоль каждого из праймеров, 0,2 мМоль - дНТФ, 2,5 мМоль - ионов Mg2+, 1,0 ед. - фермента, а термоциклирование предусматривало предварительную денатурацию при температуре 95°С в течение 5 мин, 5 циклов, включающих 95°С - 40 (10) с, 62°С - 40 (10) с, 72°С - 40 (10) с; 30 циклов, состоящих из 95°С - 30 (7) с, 60°С - 30 (7) с, 72°С - 30 (7) с; заключительная достройка комплементарной цепи при температуре 72°С в течение 5 мин (в скобках указана продолжительность поддержания температуры при использовании активного режима термоциклирования). Показано, что для учета результатов разработанных мультило-кусных ПЦР оптимальным является проведение электрофореза в 2% агарозном геле при градиенте напряжения 8,5 В/см в течение 30-40 мин. При осуществлении ПЦР в соответствии с указанными выше параметрами чувствительность реакции составила 1 х103 м.к./мл, специфичность - 100%, вне зависимости от типа ПЦР-смеси и способа регистрации результатов (Рисунки 1, 2).

Дополнительно ПЦР-смеси «Скрин», «Тип», «ctx-tcp», «Ol-биовар», «0139» были изучены при анализе 100 проб испражнений и желчи, а также образцов биологического материала и из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных штаммами V. cholerae 01 и 0139 серогрупп (ctxA+tcpA+). Установлено, что с образцами нативного клинического материала во всех случаях получен отрицательный результат, тогда как ДНК эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов обеих серогрупп выявлялась при концентрации в пробе патогена не менее 1х 103 м.к./мл.

М123456 123456 123456

А I Б I П

M - маркер молекулярных масс 100, 300, 500, 750,1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н. (GeneRuler Express DNA Ladder, ThermoScientific), 1 - V. choleras классического биовара 569B (ctxA+ tcpA+), 2 - V. cholerae eltor 1344 (ctxA+ tcpA+), 3 - V. cholerae 0139 серогруппы P-16064 (ctxA+tcpA+), 4 - V. cholerae eltor KM-26 (ctxA- tcpA-), 5 - V. cholerae Ol 39 M-368 (ctxA- tcpA-), 6-V. cholerae не-Ol не-0139 P-9741 (ctxA- tcpA-)

Рисунок 1 - Электрофореграмма результатов амплификации ДНК штаммов холерных вибрионов с помощью мультилокусных ПЦР с электрофоретическим учетом результатов А («ctx-tcp»),

Б («0139), В («01-биовар»)

А

__Шиш

Б

_Цист

В

А (канал FAM), Б (канал JOE), В (канал ROX): «Скрин» 1 ■ V. cholerae классического биовара 569В (ctxA+ tcpA+),

2 V. cholerae eltor 1344 (ctxA+ 1срА+),

3 UV. cholerae 0139 P-16064 (ctxA+tcpA+),

4 ■ V. cholerae eltor KM-26 (ctxA- tcpA-),

5 ■ V. cholerae 0139 M-368 (ctxA- tcpA-),

6 Я V. cholerae не-01/не-0139 P-974(cor^-icp^l-),

7 ■ K+ скрин, 8 - Ct Neg ■ K+ BKO,

9 ■ К- (отрицательный контроль, ТЕ-буфер) «Тип» \ Ш - V. cholerae классического биовара 569В (ctxA+tcpA+\

2 ■ - V. cholerae eltor 1344 (ctxA+ tcpA+),

3 ■ - V. cholerae 0139 серогруппы P-16064 0ctxA+tcpA+),

4 - V. cholerae eltor KM-26 (ctxA- tcpA-),

5 ■ - V. cholerae Ol 39 M-368 (ctxA- tcpA-),

6 * - V. cholerae не-Ol не-0139 P-9741 (ctxA-tcpA—) 7 ■ — Ю тип, 8 ■ — К- (отрицательный контроль, ТЕ-буфер)

Рисунок 2 - Результаты амплификации ДНК

штаммов холерных вибрионов с помощью мультилокусных ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени»

2. Конструирование наборов реагентов для индикации и идентификации холерных вибрионов методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и оценка их диагностической эффективности

На основании проведенных исследований были сконструированы экспериментальные серии препаратов: «Набор реагентов для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации патогенных штаммов Vibrio cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Vibrio cholerae-FL» и «Набор реагентов для выявления и ускоренной идентификации Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Ген Vibrio cholerae - идентификация — РЭФ)». Оптимизированы способы проведения анализа с данными тест-системами в зависимости от поставленных задач и эпидемиологической ситуации по холере.

Для изучения чувствительности и специфичности разработанных препаратов исследовали 155 штаммов V. cholerae и гетерологичных микроорганизмов; пробы испражнений людей без клинических проявлений (200 образцов) и с энтеритами различной бактериальной и вирусной этиологии (50 образцов); пробы дуоденального содержимого (100 образцов) и воды открытых водоемов (100 образцов), в которых с помощью бактериологического анализа подтверждено отсутствие холерных вибрионов; а также пробы испражнений и воды, искусственно конта-минированные токсигенными штаммами холерных вибрионов OI эльтор и 0139 серогрупп до конечной концентрации 1х104-1х103 м.к./мл.

Специфичность разработанных генодиагностических препаратов составила 100% - при исследовании ДНК гетерологичных микроорганизмов, нативных проб биологического материала и из объектов окружающей среды ни в одном случае в ПЦР не выявлено положительного результата, а с ДНК холерных вибрионов наблюдалось образование ампликонов или специфичной флуоресценции в полном соответствии с их таксономическим положением и эпидемической значимостью. Чувствительность обеих тест-систем - 1хЮ3 м.к./мл как при анализе культур возбудителя холеры, так и проб биологического материала и из объектов окружающей среды.

Совместно с сотрудниками ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора и ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора определена диагностическая эффективность набора реагентов «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» в рамках медицинских испытаний. Для этого изучены бактериальные суспензии 19 штаммов холерных вибрионов с различным набором ctxA и tcpA генов (всего 72 образца), 6 - гетерологичных микроорганизмов (всего 12 образцов), пробы биологического материала (желчь, испражнения) и из объектов окружающей среды (вода поверхностных водоемов, смывы с поверхностей),

искусственно контаминированные эпидемически опасными и безопасными штаммами V. cholerae Ol и 0139 серогрупп (всего 128 образцов), гетерологичными микроорганизмами -24 образца.

Установлено, что при исследовании 18 проб, содержащих V. cholerae Ol и 0139 (ctxA+tcpA+) в концентрации 1*104 м.к./мл положительный ответ в ПЦР отмечен в 100% случаев, 1х103 м.к./мл - 94,4% (17 образцов), 1хЮ2 м.к./мл - 50% (9 образцов). При анализе 18 бактериальных суспензий V. cholerae Ol, 0139 и не-Ol не-0139 (ctxA-tcpA-) в концентрации 1хЮ4 м.к./мл во всех пробах отмечена амплификация генов wbeN, wbßi и hlyA в соответствии с таксономическим положением вибрионов. Чувствительность препарата при исследовании проб биологического материала и из объектов окружающей среды, контаминированных эпидемически значимыми штаммами холерных вибрионов составила 100% при содержании патогена 1хЮ4 м.к./мл, 93,7% - 1*103 м.к./мл, а эпидемически безопасными культурами V. cholerae -. 100% вне зависимости от концентрации возбудителя. В пробах, содержащих гетерологичные микроорганизмы, в ПЦР получен отрицательный результат.

На основании вышеизложенного установлено, что разработанные препараты для генной диагностики холеры с учетом результатов в режиме «реального времени» и методом электрофореза в агарозном геле характеризуются высокой диагностической эффективностью: чувствительность от 1хЮ4 м.к./мл до 1хЮ3 м.к./мл, специфичность- 100%.

Для обеспечения биологической безопасности технологической линии комплектации компонентов разработанных наборов реагентов проведена работа по созданию стандартного образца предприятия, содержащего ДНК плазмид с включенными фрагментами ctxA и tcpA генов холерных вибрионов. Для этого были сконструированы штаммы Е. coli JM109 pGEM-TcK564 и Е. coli JM109 pGEM-Ttcp667, содержащие рекомбинантные плазмиды с фрагментами ctxA гена размером 564 п.н. и tcpA гена - 667 п.н. На основании полученной ДНК плазмид pGEM-Ttcp667 и pGEM-Tctx564 подготовлен стандартный образец предприятия, представляющий собой их разведения по отдельности и вместе до конечной концентрации 1 х 105—1ХЮ3 ГЭ/мл каждой. Показано, что результаты оценки чувствительности ПЦР с праймерами на основе ctxA и tcpA генов, полученные при использовании разработанного стандартного образца предприятия и препаратов ДНК, выделенных из бактериальных суспензий V. cholerae eltor 1344 (ctxA+tcpA+) и V. cholerae классического биовара 569В (ctxA+tcpA+) с концентрацией 1хЮ4-1хЮ3 м.к./мл, совпадают (Рисунок 3).

Полученные данные указывают на возможность проведения контроля эффективности отдельных компонентов разработанных препаратов без использования эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов, что повышает уровень биологической безопасности технологической линии производства данных тест-систем.

564 п.н. (ctxA) 218 п.н. (tcpA)

А Б

А (СОП): 1 - К+ (смесь плазмид pGEM-TBpe67 и pGEM-TCK564 в концентрации 1 х 106 ГЭ/мл), 2 - СОП 1 х 105 ГЭ/мл, 3 - СОП 1 х 104 ГЭ/мл, 4 - СОП 1x10 ГЭ/мл Б (ДНК V. cholerae)-. 1 - V. cholerae 1344 1хЮ4 м.к./мл, 2 - V. cholerae 1344 1хЮ3 м.к./мл, 3 - К cholerae 569В 1хЮ4 м.к./мл, 4- V. cholerae 569В 1 хЮ3 м.к./мл, 5 - К+ (ДНК V. cholerae eltor 1344 1 хЮ5 м.к./мл)

Рисунок 3 - Результаты исследования СОП и препаратов ДНК V. cholerae eltor 1344 (ctxA+tcpA+), V. cholerae классического биовара 569В (ctxA+tcpA+) методом ПЦР с праймерами

на основе ctxA и tcpA генов

3. Апробация сконструированных амплификационных тест-систем при идентификации штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Российской Федерации, и при исследовании проб воды открытых водоемов

В ходе апробации наборов реагентов «АмплиСенс® Vibrio cholerae-FL» и «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» определяли эпидемическую значимость и таксономическое положение (серогруппа и биовар) 177 штаммов холерных вибрионов различного происхождения, выделенных в период с 2009 по 2013 гг.

На основании полученных результатов 143 штамма холерных вибрионов, выделенных из воды поверхностных водоемов на территориях Республик Калмыкия и Татарстан, Челябинской и Астраханской областей, идентифицированы как V. cholerae OI серогруппы биовара эльтор эпидемически безопасные {ctxA-tcpA-). Анализ ДНК 7 штаммов холерных вибрионов, изолированных из объектов окружающей среды в Республике Калмыкия и Челябинской области, а также от 4 больных людей в Челябинской и Астраханской областях, показал их принадлежность к V. cholerae не-Ol не-0139 серогруппы эпидемически безопасным (ctxA-tcpA-). Для 21 культуры вибрионов, изолированных из воды открытых водоемов и от больного с острым инфекцион- | ным гастероэнтеритом в Республике Калмыкия, характерно наличие генов hlyA, wbeT, wbeN, | tcpA и отсутствие - ctxA, wbfR, что указывает на их принадлежность к штаммам V. cholerae OI серогруппы биовара эльтор потенциально эпидемически опасным (ctxA-tcpA+). Специфическая амплификация ctxA и tcpA генов, а также hlyA, wbeT и wbeN генов выявлена при исследовании двух культур возбудителя холеры, выделенных от больных в г. Химки Московской области, в

1 2 3 4 5

12 3 4

результате чего данные штаммы были идентифицированы как V. сИокгае 01 серогруппы биовара эльтор эпидемические опасные (сйсЛ+ ¡срА+).

В то же время, определение биовара данных культур холерных вибрионов с использованием бактериофагов холерных классического и эльтор вызывало затруднения. Из 166 штаммов V. сИокгае биовара эльтор, большинство (63,3%) были резистентны к диагностическому фагу эльтор и в высоком проценте случаев (71,6%) лизировались фагом «С» в различных разведениях.

Вышесказанное указывает на перспективность использования разработанных амплифи-кационных тест-систем для биотипирования выделенных культур холерных вибрионов.

Решающую роль в передаче возбудителя холеры играет водный фактор, в результате загрязнения поверхностных водоемов неочищенными, хозяйственно-бытовыми сточными водами (Черкасский, Беляев, 2003). В связи с этим, нами была проведена оценка эффективности использования новых препаратов для генной диагностики холеры при мониторинге воды открытых водоемов. В результате исследования с помощью разработанных наборов реагентов 216 проб воды, отобранных из реки Волга на территории г. Саратова в период с 2011 по 2013 гг., после их первичного подращивания на пептонной воде в течение 4 часов, в 50 случаях наблюдалась амплификация только ЫуА гена, что указызает на наличие в образцах штаммов V. скокгае не-01 не-0139 серогруппы эпидемически безопасных (ОхА-1срА-). В оставшихся пробах не наблюдалось амплификации ни одной из использованных в тест-системах ДНК-мишеней, что свидетельствует об отсутствии в данных образцах ДНК холерных вибрионов: При исследовании препаратов ДНК, выделенных из этих же проб воды до подращивания в пептонной воде, во всех случаях получен отрицательный результат, тогда как анализ образцов после вторичного обогащения в пептонной воде подтвердил в 100% случаев наличие в 50 пробах ДНК холерных вибрионов не-01 не-0139 серогруппы. Полученные результаты полностью совпали с данными бактериологического анализа, что подтверждает перспективность применения разработанных наборов реагентов для генной диагностики холеры при мониторинге объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов.

4. Оценка диагностической эффективности набора реагентов «АмплиСенс® -В. а/1<йгяс/5-П1Т» в рамках медицинских испытаний

Для возможности использования нового препарата «АмплиСенс® В. амЪгаш-РЯТ» в лабораторной практике проведена оценка его диагностической эффективности в рамках расширенных медицинских испытаний.

Поскольку детекция сибиреязвенного микроба с помощью данного набора реагентов осуществляется на основании выявления генов pagA и сарА, расположенных на плазмидах

pXOl и pX02, соответственно, то определение диагностической специфичности такой тест-системы должно включать в себя исследование штаммов В. anthracis с различным плазмидным профилем. С учетом вышеизложенного была подобрана целевая коллекция штаммов сибиреязвенного микроба и близкородственных бацилл: 9 штаммов В. anthracis (рХ01+рХ02+), выделенных в период с 1965 по 1999 гг. от больных людей, 5 штаммов В. anthracis (рХ01+рХ02+) -от больных животных в период с 1949 по 1977 гг., 2 штамма В. anthracis (рХ01+рХ02+) - из объектов окружающей среды в 1985 и 1998 гг., 8 изолятов сибиреязвенного микроба с разным набором плазмид; 16 изолятов других видов бацилл и близкородственных микроорганизмов. При использовании испытуемого набора реагентов процент выявляемых проб к числу исследованных штаммов В. anthracis, имеющих различный плазмидный профиль, составил 17% — при содержании возбудителя 1x10 м.к./мл, 38% - 1х102 м.к./мл, 96% - 1хЮ3 м.к./мл. Полученные результаты в полной мере подтверждают заявленную чувствительность набора реагентов «АмплйСенс® Д anthracis-FRT» при исследовании культур В. anthracis - 1хЮ3 м.к./мл. Отсутствие перекрестных реакций с ДНК других видов бацилл указывают на высокую специфичность данного препарата.

Поскольку данный диагностический препарат предназначен не только для исследования штаммов возбудителя, но и проб биологического материала и из объектов окружающей среды, в испытаниях были исследованы 126 проб крови человека, содержимого язв, мокроты, суспензии печени, лимфатических узлов, молока, воды открытых водоемов, почвы, кормов, искусственно контаминированных возбудителем сибирской язвы и другими бациллами. Процент выявляемых к числу исследованных положительных проб биологического материала и из объектов окружающей среды, инфицированных В. anthracis в концентрации 1х104 м.к./мл составил 100%, ]хЮ3 м.к./мл-98%.

Исходя из вышеизложенного, набор реагентов «АмплйСенс® В. anthracis-FRT» характеризуется высокой диагностической эффективностью: чувствительность - 1хЮ3 м.к./мл, специфичность - 100%, воспроизводимость - 100% при исследовании культур микроорганизмов, а также проб биологического материала и из объектов окружающей среды. Полученные результаты указывают на перспективность использования данного препарата в практике здравоохранения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, нами разработаны наборы реагентов, позволяющие быстро и точно определять таксономическое положение (принадлежность к OI и 0139 серогруппе, биовар) и эпидемическую значимость холерных вибрионов методом ПЦР с "учетом результатов в режиме «реального времени» и методом электрофореза: «АмплйСенс® Vibrio cholerae-VL» и «Ген

Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ», основанные на мультилокусной амплификации ctxA, tcpA, hlyA, wbe, wbf генов. Установлена высокая чувствительность и специфичность созданных препаратов при исследовании коллекционных штаммов холерных вибрионов, проб биологического материала и из объектов окружающей среды, а также культур вибрионов, выделенных в последние годы на различных территориях Российской Федерации, и при проведении мониторинга проб воды открытых водоемов на наличие возбудителя холеры после первичного или вторичного подращивания материала в пептонной воде. Сконструированы рекомбинанатные штаммы Е. coli JM109 pGEM-Tctx564 и Е. coli JM109 pGEM-TKp667, на основании полученных плазмид pGEM-Tttp667 и pGEM-Tclx564 разработан стандартный образец предприятия (СОП) для технологической линии производства разработанных наборов реагентов. В результате медицинских испытаний на репрезентативной выборке штаммов сибиреязвенного микроба и близкородственных бацилл подтверждена высокая диагностическая эффективность набора реагентов «АмплиСенс® Bacillus anthracis-FKT».

ВЫВОДЫ

1. Для выявления холерных вибрионов с одновременным определением их эпидемической значимости, биовара и принадлежности к Ol и 0139 серогруппе методом мультилокусной ПЦР в качестве оптимальных ДНК-мишеней выбраны гены ctxA, tcpA, wbe N/T, wbfR, hlyA, на основе которых подобраны специфичные праймеры и зонды.

2. Разработаны варианты мультилокусных ПЦР, позволяющие проводить многоплановые исследования в зависимости от поставленных задач: индикация и идентификация эпидемически значимых штаммов V. cholerae в нативном материале или идентификация выделенных культур вибрионов по эпидемической значимости и таксономическому положению. Оптимизированы условия амплификации с различным способом учета результатов.

3. Сконструированы наборы реагентов для выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов «Ген Vibrio cholerae - идентификация - РЭФ» и с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Vibrio cholerae-¥L», характеризующиеся высокой диагностической эффективностью при исследовании культур микроорганизмов, проб биологического материала и из объектов окружающей среды: чувствительность от 1х104м.к./мл до 1*103м.к./мл, специфичность - 100%.

4. Сконструированы штаммы Е. coli, содержащие рекомбинантные плазмиды с фрагментами ctxA и tcpA генов. Подготовлен на их основе стандартный образец предприятия, позволяющий в технологической линии комплектации разработанных наборов реагентов определять эффективность отдельных компонентов и реагентов.

5. Разработанные тест-системы эффективны в 100% случаев при идентификации штаммов V. cholerae со сниженной чувствительностью к холерным диагностическим бактериофагам «С», «Эльтор» и индикации холерных вибрионов в пробах воды открытых водоемов после их первичного или вторичного подращивания на пептонной воде.

6. На основе подобранной целевой коллекции штаммов сибиреязвенного микроба с различным набором плазмид pXOl и рХ02 и близкородственных бацилл установлена высокая диагностическая эффективность набора реагентов «АмплиСенс® В. anthracis-VKY» при исследовании культур патогена, проб биологического материала и из. объектов окружающей среды: чувствительность 1хЮ3м.к./мл, специфичность - 100%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Абдрашитова, A.C. Оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза и холеры методом ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» / A.C. Абдрашитова, Л.В. Саяпина, А.Н. Малахаева, H.A. Осина // Здоровье населения и среда обитания - 2013 - № 1 (238). - С. 32-34.

2. Абдрашитова, A.C. Апробация амплификационных гест-систем для идентификации штаммов холерных вибрионов, выделенных в различных регионах Российской Федерации /

A.C. Абдрашитова, H.A. Осина, И.А. Касьян, A.M. Сеничкина, С.А. Щербакова // Здоровье населения и среда обитания. -2014. -№ 5 (254). - С. 22-24.

3. Абдрашитова, A.C. Разработка мультилокусных амплификационных тест-систем для выявления и ускоренной идентификации эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов / A.C. Абдрашитова, С.Б. Яцышина, H.A. Осина, Т.С. Астахова, С.А. Портенко, Л.В. Саяпина, Г.А. Шипулин, С.А. Щербакова // Биозащита и биобезопасность. - 2014. -Том VI, №2 (19).-С. 34-41.

4. Саяпина, Л.В. Совершенствование лабораторной диагностики сибирской язвы Л.В. Саяпина, Р.Н. Лобач, A.C. Абдрашитова, Н.Ф. Никитюк // Военно-медицинский журнал. ■ 2013. - Т. 334, № 8. - С. 58-59.

Материалы конференций:

5. Саяпина, Л.В. Изучение диагностической ценности набора реагентов «АмплиСенс®

B. anthracis-FRT» в приемочных испытаниях / Л.В. Саяпина, A.C., Абдрашитова, И.В. Касина, H.A. Осина, И.С. Барулина, А.Н. Малахаева, С.Б. Яцышина //Материалы 4-ой Международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского, института им. Пастера "Идеи Пас-тера в борьбе с инфекциями",- Санкт-Петербург. - 2008. - С. 83.

6. Абдрашитова, A.C. Изучение диагностической ценности наборов реагентов для выявления ДНК Bacillus anthracis и Brucella spp. в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в медицинских приемочных испытаниях / A.C. Абдрашитова, Л.В. Саяпина, А.Н. Малахаева, И.В. Касина, И.С. Барулина, H.A. Осина, С.Б. Яцышина // Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». - Киров. - 2008. - С. 30-33.

7. Саяпина, Л.В. Отчет о медицинских приемочных испытаниях диагностической ценности набора реагентов для выявления ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» «АмплиСенс® В. anthracis-FKT» / Л.В. Саяпина, A.C. Абдрашитова, И.В. Касина, И.С. Барулина, А.Н. Малахаева, H.A. Осина // Реферативный сборник «Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации». - Саратов. - 2008. - Вып. 11. - С. 33-34.

8. Осина, H.A. Набор реагентов для выявления ДНК Vibrio cholerae и идентификации штаммов Vibrio cholerae в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Vibrio cholerae-FL» / H.A. Осина, С.А. Портенко, Л.В. Саяпина, И.В. Касина, А.Н. Малахаева, A.C. Абдрашитова, Л.С. Карань, М.В. Козицына // Реферативный сборник «Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации». - Саратов. - 2011. - Вып. 14. - С. 37.

9. Абдрашитова, A.C. Изучение эффективности наборов реагентов для детекции ДНК возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза и холеры методом ПЦР в режиме «реального времени / A.C. Абдрашитова, Л.В. Саяпина, А.Н. Малахаева, H.A. Осина // Материалы XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера». - Саратов. - 2012. -С. 13-15.

10. Саяпина, Л.В. Новые препараты для выявления возбудителя холеры Ol и 0139 се-рогрупп / Л.В. Саяпина, A.C. Абдрашитова, Т.В. Валова, Т.В. Аленкина, В.Д. Кругликов, Л.П. Алексеева, В.Н. Савельев, Е.В. Белова // Материалы проблемной комиссии и Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы». - Ростов-на-Дону. - 2012. - Вып. 25. -С. 164-166.

11. Саяпина, JI.В. Характеристика новых препаратов для диагностики сибирской язвы по данным медицинских испытаний / Л.В. Саяпина, A.C. Абдрашитова, A.B. Комратов, Л.И. Ращепкин, A.B. Осин, М.В. Храмов, Н.Г. Гефан // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных». - Ставрополь. - 2012. -С. 181.

12. Комратов, A.B. Оценка эффективности наборов реагентов «АмплиСенс®» для индикации возбудителей особо опасных инфекций методом ПЦР в режиме «реального» времени / A.B. Комратов, Л.В. Саяпина, A.C. Абдрашитова, А.Н. Малахаева, H.A. Осина, С. А. Щербакова // Материалы Международной конференции «Биология - наука XXI века». -Москва. - 2012 - С. 394-396.

13. Осина, H.A. Конструирование и внедрение в практику нового препарата для генной диагностики холеры / H.A. Осина, Бугоркова, В.Е. Куклев, A.C. Абдрашитова, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, С.А. Щербакова, В.В. Кутырев // Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации". -Инфекция и иммунитет. - Москва. - 2012. - Т. 2, № 1-2. - С. 308-309.

14. Абдрашитова, A.C. Разработка и оценка диагностической ценности набора реагентов для выявления и ускоренной идентификации возбудителя холеры методом мультилокусной ПЦР / A.C. Абдрашитова, H.A. Осина, Т.В. Бугоркова, В.Е. Куклев, И.В. Шульгина, O.A. Лобовикова, С.А. Щербакова, В.В. Кутырев // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014». - Москва. -2014. - Т. 1, раз. 14. - С. 480-481.

15. Абдрашитова, A.C. Диагностическая эффективность новых препаратов для ускоренной идентификации холерных вибрионов методом ПЦР / A.C. Абдрашитова, H.A. Осина, А.М. Сеничкина, Ж.А. Касьян, С.А. Щербакова // Материалы VI Ежегодного Всероссийского Кон гресса по инфекционным болезням. - Инфекционные болезни. - Москва. - 2014. - Т. 12, прил. 1.-С. 3-4.

Выражаю глубокую признательность и благодарность научным руководителям работы главному эксперту ФГБУ НЦСМП Минздрава России, д.м.н. Саяпиной Л.В. и заведующей лабораторией молекулярной диагностики ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, к.б.н. Осиной H.A. за профессиональные советы и поддержку в процессе работы. Благодарю директо ра ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора Кутырева В.В. за предоставленную воз можность выполнения работы. Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам ФБУН ЦНШ эпидемиологии Роспотребнадзора к.м.н. Шипулину Г.А., к.б.н. Яцышиной С.Б., к.б.н. Асгахо вой Т.С., сотрудникам ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный инспг

Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора д.м.н. Урбанович Л.Я, к.м.н. Мироновой JI.B., к.м.н. Куликаловой Е.С., Басову Е.А., сотрудникам ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора к.м.н. Храмову М.В., Ажер-мачевой Н.И., Василенко Т.И., к.м.н. Мокриевич А.Н., к.б.н. Кудрявцевой Т.Ю., участвовавшим в проведении исследований. Искренне признательна и благодарна сотрудникам ФКУЗ Рос-НИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора д.б.н. Попову Ю.А., д.б.н. Ерошенко Г.А., д.м.н. Бойко A.B., д.б.н. Щербаковой С.А., к.б.н. Лобовиковой O.A., к.м.н. Шульгиной И.В., к.б.н. Шаровой И.Н., к.м.н. Куклеву В.Е., к.б.н. Казаковой Е.С., к.б.н. Найденовой Е.В., к.б.н. Портен-ко С.А., к.б.н. Осину A.B., к.б.н. Грачевой И.В., к.м.н. Бугорковой Т.В., Касьян И.А., Ляшо-вой О.Ю. за помощь на различных этапах работы.

Подписано к печати 12.03.2015 Формат 60x84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Усл. печ. л. 1,50. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.