Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза

Гречишникова, Ольга Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза"

На правах рукописи

ГРЕЧИШНИКОВ А ОЛЬГА ГЕННАДЬЕВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА

03.02.03- микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

005059252

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: Афанасьев Станислав Степанович

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Воропаева Елена Александровна

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: Лютов Андрей Германович

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора ЗАО «Иммуно-Гем» (г. Москва)

Павлов Виталий Михайлович

доктор биологических наук, заведующий лабораторией микробиологии туляремии Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава России (г.Москва)

Защита состоится 2013 г. в^^Рчасов на заседании

диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

Автореферат разослан^^ г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На сегодняшний день инфекционные заболевания урогенитального тракта, вызываемые видом Chlamydia trachomatis, являются одной из серьезных проблем здравоохранения вследствие своего широкого распространения и доказанного риска тяжелых клинических осложнений при отсутствии своевременного лечения (Гранитов В.М., 2002; Дмитриев Г.А., 2003; Carlson J.H., 2008).

В диагностике урогенитального хламидиоза значительная роль отводится лабораторным исследованиям, так как от точности поставленного этиологического диагноза зависит успех лечения инфекции (Савичева A.M., 2007). В настоящее время существует большое количество лабораторных тестов с различной чувствительностью и специфичностью, что создает предпосылки для разночтений при интерпретации результатов, и, следовательно, в постановке диагноза (Аликберов Ш.А., 2007; Bachmaier К., Penninger J.M., 2005).

Выделение хламидий в культуре клеток длительное время являлось «золотым стандартом», с которым сравнивали новые методы диагностики, не связанные с выявлением жизнеспособности микроорганизма. Однако культуральное исследование — это сложная и требующая достаточного времени процедура, для которой нет стандартизированных подходов. Информативность метода во многом зависит от условий забора и транспортировки клинического материала, качества клеточных линий и питательных сред, вариантов детекции хламидий, исправности оборудования и других факторов (Domeika М., 2002). Поэтому в последние годы для диагностики хламидиоза широко применяются молекулярные методы, в основе которых лежат амплификаци-онные технологии. В отличие от культурального метода исследования, они не требуют специальных условий транспортировки клинического материала для сохранения жизнедеятельности возбудителя и обладают высокой специфичностью, чувствительностью и быстротой выполнения. Однако использование ряда коммерческих тест-систем, основной мишенью которых при выявлении Ch.trachomatis, является участок нуклеотидной последовательности видоспецифической криптической плазмиды, выявлена достаточно серьезная проблема. В случае мутации в ДНК-мишени или появления бесплазмидных вариантов хламидий, возможны серьезные диагностические ошибки, ведущие к искажению результатов, а. в ряде случаев, к неверной постановке диагноза, как это произошло при появлении «шведского варианта» Ch.trachomatis (Stary А., 2007; Ripa Т., Nilsson P.A., 2007).

Наряду с урогенитальными широко распространены респираторные хламидио-зы, к числу которых относят острые респираторные заболевания и пневмонии, возникающие в результате заражения как Ch.trachomatis, так и Chlamydophila pneumoniae (Малкова Е.М. с соавт., 2003). Создание универсальной ПЦР-системы для выявления и видовой дифференциации ДНК хламидий как из урогенитального тракта (Ch.trachomatis), так и верхних дыхательных путей (Ch.trachomatis или

Chl.pneumoniae) представляет собой актуальную задачу для практического здравоохранения.

Сообщения последних лет свидетельствуют о возникновении проблемы резистентности хламидий к антибиотикам (Dessus-Babus S. et al.,1998; Somani J. et al., 2000). Определение чувствительности к лекарственным препаратам культуральным методом сопряжено с трудностями стандартизации процедуры и интерпретации результатов (Шипицына Е.В. с соавт., 2004). Поэтому исследования отечественных и зарубежных ученых направлены на разработку методических подходов оценки наличия в ДНК микроорганизмов генетических детерминант, определяющих устойчивость к антибиотикам (Мисюрина О.Ю. с соавт., 2002; Хулуп Г.Я. с соавт., 2006).

Среди Ch.trachomatis выделяют 19 генотипов, которые отличаются распространенностью в популяции, клеточным тропизмом, вирулентностью и иммуногенностью (Полещук Н.Н., Рубаник Л.В., 2005; Hsu М.-С. et al., 2006; Gao X. et al., 2007). Типи-рование хламидий не имеет значения для постановки клинического диагноза, но является важной частью в эпидемиологическом исследовании, в изучении клинических проявлений, ответа на лечение, а, также в создании вакцины (Morre S.A. et al., 2000; Ngandjio A. et al., 2003). В связи с тем, что эталонный метод генотипирования, основанный на секвенировании гена о/яр/, кодирующего основной белок наружной мембраны хламидий, сопряжен с рядом трудностей и не доступен для рутинных исследований, актуальным представляется вопрос о нахождении альтернативных путей типи-рования Ch.trachomatis.

Таким образом, трудности дифференциальной диагностики урогенитального хламидиоза, а также недостаточная информативность традиционно используемых методов подтверждают актуальность проблемы, в связи с чем возрастает роль научных исследований, направленных на совершенствование диагностики заболевания.

Цель исследования

Совершенствование диагностики урогенитального хламидиоза на основе сравнительного анализа диагностической значимости прямых методов детекции хламидий, их модификации и предложения алгоритма применения.

Задачи исследования

1. Оценить информативность лабораторных методов диагностики урогенитального хламидиоза в зависимости от характера течения инфекционного процесса.

2. Разработать ПЦР-систему для одновременного выявления и видовой дифференциации ДНК Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis, а также ПЦР-систему для верификации штаммов Chtrachomatis, выделенных от человека, с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК критической плазмиды.

3. Разработать способ генотипирования штаммов Ch.trachomatis методом ПЦР.

4. Установить наличие генетических детерминант антибиотикорезистентности штаммов хламидий методом ПЦР.

5. Подобрать оптимальные условия культивирования Ch.trachomatis и определить набор методических приёмов для детекции хламидий в культуре клеток.

6. Дать оценку диагностической значимости лабораторных методов выявления Ch.trachomatis с учетом их модификаций и предложить алгоритм прямой детекции хламидий в клиническом материале.

Научная новизна

Полученные в ходе диссертационной работы данные расширяют представление о методах диагностики урогенитального хламидиоза.

Дана оценка степени информативности различных методов лабораторной диагностики УГХ в зависимости от характера течения инфекционного процесса. Установлено, что наиболее сильная корреляционная связь прослеживается при клинически выраженной форме инфекции - с положительными результатами ПЦР и ИФА, средняя - с положительными результатами культурального и цитологического исследова-

ния. При бессимптомном процессе выявляется сильная корреляционная связь - с положительными результатами ИФА, средняя - с ПЦР, слабая корреляция - с сочетанием положительных результатов культурального и цитологического исследований.

Впервые разработанный способ видовой ПЦР-детекции хламидий позволяет одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Ch.trachomatis и Chl.pneumoniae, а способ ПЦР-верификации участка нуклеотидной последовательности ДНК критической плазмиды - фенотипические особенности возбудителя, выделенного от человека.

Впервые показана возможность молекулярно-генетического типирования штаммов Ch. trachomatis, выделенных от человека, методом ПЦР, что обеспечивает повышение информативности и упрощает исследование по сравнению с существующими способами генотипирования.

Практическая значимость

Результаты проведенных исследований позволяют оптимизировать алгоритм прямой детекции хламидий в биологическом материале и свидетельствуют о необходимости комплексного лабораторного обследования, с использованием модифицированных методов выявления хламидий с целью повышения их диагностической ценности для постановки диагноза.

Применение разработанной ПЦР-системы для видовой дифференциации хламидий, выделенных от человека, позволяет одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis.

Применение разработанной ПЦР-системы для верификации участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды Ch.trachomatis позволяет свести к минимуму наличие ложноотрицательных результатов при диагностике возбудителя.

Разработанный способ молекулярно-генетического типирования штаммов Ch.trachomatis, выделенных от человека, методом ПЦР позволяет в короткие сроки установить генотип возбудителя. Метод применим в стандартных лабораториях, оснащенных ПЦР-оборудованием, и адаптирован для рутинных исследований при хламидиозе.

Внедрение результатов работы в практику

В результате выполненной работы получены три Патента РФ на изобретение: _ «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946 (зарегистрирован 10.04.2010); «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385945 (зарегистрирован 10.04.2010); «Способ ге-нотипирования Chlamydia trachomatis» № 2443782 (зарегистрирован 27.02.12).

Результаты исследований и разработок внедрены в научно-исследовательскую работу лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

После проведения в 2013 году лабораторных испытаний планируется коммерческий выпуск тест-систем на основе разработанных методов для видовой дифференциации хламидий, обнаружения штаммов Ch. trachomatis с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК критической плазмиды, а также генетического типирования штаммов с целью дальнейшего использования в практике здравоохранения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установлена положительная взаимозависимость между обнаружением хламидий или их маркеров в клиническом материале и характером течения инфекционного процесса.

2. Впервые разработанные ПЦР-системы для диагностики хламидийной инфекции у людей позволяют одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis, а также верифицировать штаммы Ch.trachomatis с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК крипти-ческой плазмиды.

3. Разработанный метод генетического типирования штаммов Ch.trachomatis, основанный на ПЦР-амплификации специфического участка гена ompl, позволяет производить внутривидовую дифференциацию хламидий в стандартных лабораториях, оснащенных ПЦР-оборудованием.

4. Использование комплекса модифицированных методов прямой верификации хламидий повышает информативность лабораторной диагностики хламидийной инфекции.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Учёного Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 31 января 2013 г.

Результаты диссертационной работы были представлены на XV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008 г.); XVI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009 г.); XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010 г.); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.); The 3rd Congress of European Microbiologists "Microbes and Man - interdependence and future challenges" (Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009).

Связь работы с научными,программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательской работы ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора - «Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при различных патологических состояниях» (Рег.№ 01.2.006 08844) и «Определение функционально-значимых геномных молекулярных детерминант, определяющих таксономическую принадлежность, вирулентность и антибиотикорезистентность возбудителей инфекционно - воспалительных процессов респираторного, урогенитального и кишечного трактов» (Рег.№ 01201157147).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 7 - в рецензируемых изданиях; 1 — в центральной печати; 6 - в сборниках материалов конференций; 1 книга в соавторстве.

Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах печатного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследований (глава 2), собственные исследования (глава 3 из пяти подразделов), обсуждение полученных результатов (глава 4), выводы, практические рекомендации, список цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 15 таблицами. В библиографическом указателе приведен 191 источник, из них 75 -на русском и 116 - на иностранном языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Результаты диссертационной работы основаны на лабораторном исследовании 101 образца биологического материала от клинически обследованных пациентов на

базе Консультивно-диагностического центра ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора за период 2008-2012гг. Группу контроля составили 39 человек, не имеющих в анамнезе заболеваний урогенитального тракта и обратившихся с целью профилактического осмотра. Сбор клинико-анамнестических данных и лабораторную трактовку результатов анализов проводили совместно с врачами-гинекологами к.м.н. Е.В. Фандеевой, к.м.н. З.А. Плиевой, A.B. Леоновой на основании методических пособий для врачей по диагностике и лечению УГХ (Дмитриев Г.А., 2003; Козлова В.И., Пухнер А.Ф., 2003; Савичева A.M. с соавт., 2002). ^

Материалом для исследования служили мазки-соскобы из цервикального канала и уретры женщин и мужчин, и соскобы с задней стенки глотки. Взятие материала производилось с помощью стерильных универсальных одноразовых зондов, позволяющих получить слой эпителиальных клеток слизистой.

Используемые культуры клеток, среды и реактивы. В качестве транспортной среды для доставки материала в лабораторию с дальнейшим выделением возбудителя в культуре клеток, использовали 3 варианта растворов, рекомендованных различными методическими пособиями по культивирование хламидий: №1 - среда Игла с глюта-мином и солями Хэнкса, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицином 40 мкг/мл и амфотерицином В 25 мкг/мл; №2 - транспортная пробирка заводского производства, содержащая дакроновый тампон и губку, пропитанную антибиотиками и антимикотическими препаратами; №3 - сахарозо-фосфатный буфер, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицин 20 мкг/мл, ванкомицин 100 мкг/мл, амфоте-рицин В 2 мкг/мл (Титов Л.П. с соавт., 1998; Савичева A.M. с соавт. 2002).

Для выделения хламидий культуральным методом использовались 3 перевиваемые клеточные линии: McCoy В, Vero, M-HeLa, полученные из коллекции культур клеток позвоночных ФГБУН «Института цитологии Российской академии наук» (г. Санкт-Петербург).

В качестве основы питательных сред для поддержания клеточных линий и культивирования хламидий использовались среды производства НПП «ПанЭко»: 1) среда Игла с солями Хэнкса и глутамином (кат.№ С-140); 2) среда RPMI-1640 с глутамином (кат_№ С-130); 3) среда DMEM с глутамином и с 25 мМ HEPES (кат.№№ С-450, Ф-032). Рабочие растворы для формирования монослоя культуры клеток и культивирования возбудителей готовили в соответствии с методическими рекомендациями (Титов Л.П. с соавт., 1998; Савичева A.M. с соавт. 2002).

Штаммы микроорганизмов. В качестве положительных контрольных образцов использовали референс штаммы Chl.pneumoniae- «В» (Рег.№ 836) и ChJrachomatis-«Бурхан» (Рег.№ 863), полученные из Государственной Коллекции Вирусов (ГКВ) ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Лабораторные методы исследования. Культуральный, цитологический, серологический и молекулярно-генетические методы исследования проводились на лабораторной базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора. Отдельные молекулярно-генетические исследования проводились на базе ФБУН «Государствен-

ный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ПДРФ-типирование штаммов Ch.trachomatis - д.в.н., проф. Светоч Э.А., к.б.н. Воложанцев Н.В.) и ЗАО «Постгеномные и нанотехнологические инновации» Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины Федерального Медико-биологического Агентства (секвенирование продуктов амплификации участка гена ompl генотипов Ch.trachomatis - к.б.н. Акопиан Т.А.).

Цитологический метод. Окраску мазков-соскобов по Романовскому-Гимзе проводили согласно общепринятой методике (Шаткин A.A., Мавров И.И., 1983). Учет результатов осуществляли на световом микроскопе «Микмед 5» при увеличениях^ хЮО, х400, х 1000. Окрашивание ФИТЦ-меченными антителами для выявления антигенов Ch.trachomatis в реакции ПИФ и Chl.pneumoniae в реакции НИФ проводили тест-системой CeLLabs (Австралия), согласно методическим рекомендациям производителя. Учет результатов осуществляли на люминесцентном микроскопе «Micros» (Австрия) при увеличении хЮОО. Хламидии в препаратах выявлялись в виде характерных окрашенных цитоплазматических включений.

Серологический метод. Серологическое исследование по выявлению специфических антител (AT) иммуноглобулинов (Ig) классов IgA и IgG к Ch.trachomatis проводилось методом ИФА на тест-системах Ch.trachomatis-lgA-pELlSA medac (Рег.№ 498) и Cktrachomatis-lgG-pELlSA medac (Рег.№ 497), Германия. Положительным результатом считали содержание IgA-AT >1:50, IgG-AT >1:50. Выявление AT к белку теплового шока (hsp) проводилось с использованием иммуноферментного тест-набора для определения IgG-AT к хламидийным белкам теплового шока 60 CHSP60-IgG-ELISA medac (Per.№ 435, Германия). Положительный результат оценивался при содержании IgG-AT >1:50. Постановку реакций проводили в соответствии с инструкциями по применению, прилагаемыми производителем.

Культуральный метод. Материал соскобов слизистой вносили в суточную культуру клеток, выращенную на покровных стеклах (Титов Л.П. с соавт., 1998; Са-вичева A.M. с соавт. 2002). Для формирования монослоя использовали: а) 24-луночные планшеты с покровными стеклами, б) пластиковые плоскодонные пробирки с покровными стеклами, в) стеклянные пенициллиновые флаконы с покровными стеклами. Выделение хламидий в культуре клеток включало следующие этапы: удаление среды роста из лунок с культурой клеток, инокуляция клинического материала, центрифугирование, инкубация при 37 "С 2 часа, удаление инокулята и внесение изолирующей среды, инкубация при 37 °С в течение 72 часов (Титов Л.П. с соавт., 1998; Савичева A.M. с соавт. 2002). По истечении срока инкубации покровные стекла окрашивали по Романовскому-Гимзе, или раствором Люголя, или ФИТЦ-меченными антителами для выявления антигенов хламидий в реакции ПИФ и НИФ. Документирование препаратов с культуры клеток проводили с помощью цифровой камеры для микроскопов Digital Camera for Microscope DCM130 (USB 2.0, 1.3 МПикс, Китай).

Титрование хламидий осуществляли стандартным методом по цитопатическому действию (ТЦДзо/мл) (Павлович С.А., 2008).

Молекулярно-генетические методы. Экстракцию ДНК проводили с помощью набора для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-АМ» (Рег.№ ФСР 2007/00183, ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора г. Москва). Для ПЦР амплификации ДНК Ch.trachomatis использовали набор реагентов «АмплиСенс Chlamydia tra-chomatis-EPh» (Рег.№ ФСР 2007/00683 ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора г. Москва). Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле. Все этапы проведения ПЦР выполнялись согласно инструкции производителя. ^

Для видовой детекции и идентификации Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis впервые были применены подобранные оригинальные универсальные праймеры на фрагмент гена 16S рРНК: прямой праймер для Ch.trachomatis Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3' (СР000051 Gene Bank), прямой праймер для Chl.pneumoniae Cpn: 5'-CGGAATAACGACTTGAGTTG - 3' (AE002161 Gene Bank), общий обратный праймер для обоих видов R: 5-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3' (АЕ001363 Gene Bank). Размер амплифицируемого продукта определяли с помощью маркера длин фрагментов 1000-100 п.н. в концентрации 0,5 мкг/мкл в буфере для нанесения на гель (Кат.№ D0510, ЗАО «Силекс», г. Москва). Размер продукта амплифицируемого фрагмента гена 16S рРНК для Chl.pneumoniae - 440 пар нуклеотидов, для Ch.trachomatis - 334 пары нуклеотидов (Патент РФ № 2385946).

Для детекции штаммов Ch.trachomatis, несущих участок нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды и свободных от него, была впервые предложена следующая оригинальная комбинация праймеров: праймер Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3' и праймер R: 5'- CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3' для амплификации фрагмента (334 пары нуклеотидов) 16S рРНК гена Ch.trachomatis-, праймер PLf: 5'-TTCGAGGCGAGTAACGAAGA-3' (Х06707 Gene Bank) и праймер PLr: 5-AAGCAACGCGCGCGATAGGT-3' (АМ886279 Gene Bank) для амплификации участка ДНК криптической плазмиды (241 пара нуклеотидов) Ch.trachomatis (Патент РФ№ 2385945).

Амплификацию проводили в 25 мкл смеси: ПЦР Буфер (*10): 700 шМ Трис-НС1, рН 8,6 / 25 °С, 166 mM (NH4)2S04, 25 rnM MgCl2,0,2 mM dNTPs, Taq - полимера-за, на амплификаторе GeneAmp2700 (Applied Biosystems, США).

Для амплификации фрагментов 16S рРНК гена Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis применяли следующие условия проведения реакции: 1 цикл: 95 °С - 3 мин., затем 40 циклов: 94 °С - 30 сек., 58 °С - 30 сек., 72 °С - 30 сек., 1 цикл: 72 "С - 2 мин., охлаждение до 6 СС с последующим хранением при 10 °С (Патент РФ № 2385946).

Для амплификации фрагментов 16S рРНК и криптической плазмиды Ch.trachomatis применяли условия проведения реакции: 1 цикл: 95 °С - 3 мин., затем 40 циклов: 94 °С - 20 сек., 60 °С - 20 сек., 72 °С - 20 сек., 1 цикл: 72 °С - 2 мин., охлаждение до 6°С с последующим хранением при 10 °С (Патент РФ № 2385945).

После амплификации 6 мкл образца смешивали с *6 буфером для загрузки и вносили в 2% агарозный гель (0,5 мкг/мл этидия бромида). Электрофорез проводили

при 50 А, 100 В на 1 см2 в течение 30 минут (камера SE-2, Helicon, Россия; источник питания Powerpac Basic Power Supply, BioRad, США). Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе ECX-20L (Vilber Lourmat, Германия) с помощью системы регистрации результатов электрофореза Gel Imager (Helicon, Россия) (Покровский В.И. с соавт.,1995).

Молекулярно-генетическое типирование штаммов Ch.trachomatis осуществляли методом ПДРФ. В качестве ДНК-мишени использовался ген ompl Ch.trachomatis, продукты которого и определяют генотип хламидий. Для наработки участка гена ompl, включающего вариабельные участки VS1^VS4, использовали праймеры: NLO:5' - ATGAAAAAACTCTTGAAATCG - 3' и NRO: 5' - CTCAACTGTAACTGCG-ТАТТТ - 3', размер продукта амплификации составлял 1130 пар нуклеотидов (Koskela Р. et al., 2000).

В лабораторных условиях наиболее стабильные результаты были получены при амплификации с 5 мкл препарата ДНК в общем объеме реакционной смеси 100 мкл при использовании Трис-калиевого буфера с 2,0 mM MgCb, 0,25 тМ dNTPs и Taq-полимеразы на амплификаторе GeneAmp 2700 (Applied Biosystems, США) при следующем режиме: 1 цикл: 95°С- 3 мин., затем 45 циклов: 95 °С- 15 сек., 40 °С- 15 сек., 72 °С- 60 сек., 1 цикл: 72°С- 2 мин., охлаждение до 6 °С с последующим хранением при 10 °С.

Для уменьшения возможного влияния вклада случайных замен (мутаций), возникающих в результате «ошибок» Taq-полимеразы, ПЦР для каждого образца проводили в 5 пробирках. Продукты амплификации из объединенного амплификата после окончания реакции анализировали в горизонтальном электрофорезе в 1,5% агарозном геле. Для дальнейшего расщепления рестриктазами продукты амплификации очищали, используя коммерческий набор «Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System» (Promega).

Для ПДРФ-анализа наработанных в результате амплификации фрагментов использовали рестрикгазы Taql, AluI и PvuII. Расщепление ДНК проводили в буферах для рестрикции согласно инструкции для каждого фермента («Fermentas»). Общий объем рестрикционной смеси составлял 25 мкл. Пробы инкубировали в течение 2 часов при температуре 37 °С (для Taql - 65 СС). Электрофорез проводили в 2,0% агарозном геле в трис-боратном буфере в течение 1 часа с охлаждением. Обсчет элек-трофореграмм осуществляли с использованием программы Photo-CaptMw V.99.04. Полученные экспериментальные данные ПДРФ-анализа в последующем сравнивали с результатами компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей гена ompl штаммов Ch.trachomatis разных генотипов, представленных в электронной базе данных NCBI Gene Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

Молекулярно-генетическое типирование штаммов Ch trachomatis, осуществляли также с помощью метода ПЦР, применяя сконструированные оригинальные оли-гонуклеотидные праймеры, ориентированные к ДНК-мишени гена ompl Ch.trachomatis согласно вариабельным участкам VS1-VS4 (табл. 1).

Таблица 1. Предлагаемые праймеры для генотипирования штаммов Ch.trachomatis.

Генотипы Олигонуклеотидные праймеры Размер продукта

Группа генотипов В (генотипы: В, Ва, D, Da, Е, Ll, L2, L2a) BGrl f 5'-GCTTAATCAATCTGGCTGTTGA-3' BGrl r 5'-TCCAGACTTGTGGATAGTAAAC-3' 191 п.н.

Группа генотипов С (генотипы: А, С, H, I, Ja, J, К и L3) CGr f 5'-AACTAAGTGGGCTTATTAGGAA-3' CGr r 5'-TCAAGTAGAGAGCTAGACCA-3' ^ 107 п.н.

Промежуточная группа (генотипы: F, G, Ga) FI 5'-CTGGGATGGAACTGTATACA-3' RI 5'-TACAACTCAGGGTAGGTCAA-3' 274 п.н.

Генотип С Comp f5-AAGGAAGTGTGGGATCTGACG-3' Comp r 5 '-AAATATAC AATGATTAGCACC-3 ' 221 п.н.

Генотип Е Eomp f 5'-AGACGGATACCGCCTTATCTTG-3' Eomp r 5'-CTGGCTTGCCACTCAGGCTAAT-3' 265 п.н.

Генотип J Jomp f 5'-ATATTTTGCCTAAGACTGCT-3' Jomp г 5'-TTTAGGGTTAGATAGAGAAT-3' 152 п.н.

Генотип Ja Jaomp f 5-TAGTGTCGGCGACGTAGCAG-3' Jaomp г 5'-TCCTAGATATTTAATGCCAT-3' 135 п.н.

Генотип H Fh 5'-ATCTTCTGAGTATAATACAGC-3' Rh 5'-ACGTTACGTTTAAATTGAGCA-3' 177 п.н.

Генотип F Ff 5'-ACGAAACGTGCTGCAAATA-3' Rf 5'- T AGCC AATCATTGT AAACA-3 ' 321 п.н.

Генотип D Domp f 5-ATAATGAGAATCTAAAGACG-3' Domp r 5-TAGAATGAGCATATTGGCAA-3' 174 п.н.

Генотип К Komp f 5'-TGTTCTTAACACAGCTTTGGA-3' Komp r 5'-AGGTATAGATTGAGCGTATTGG-3' 150 п.н.

Генотип G Gomp f 5-AGAGTAGTCGCAGCGAAC-3' Gomp r 5'-ACTGTAACGGCGTATGTG-3' 146 п.н.

Генотип А Aomp f 5'-AATACAGTATTCTGGCTTAGAT-3' Aomp r 5'-TGACTGAATGCAGGGTTGGGA-3' 57 п.н.

Генотип В Bomp f 5'-AGTTCGAGAGTATCTTTGATGTT-3' Bomp г 5'-TCTGCGCTAGTTATCATTATCG-3' 75 п.н.

Амплификацию проводили в 20 мкл смеси: ПЦР Буфер (><10): 700 шМ Трис-HCI, рН 8,6 / 25 °С, 166 mM (NH^SC^, 25 тМ MgCl2,0,2 гаМ dNTPs, Taq-полимераза, на амплификаторе GeneAmp 2700 (Applied Biosystems, США). Режим амплификации включал следующий режим: 1 цикл: 95 °С - 2 мин., затем 40 циклов: 94 °С- 20 сек., 60 °С- 20 сек., 1 цикл: 72 °С- 20 сек., 1 цикл: 72 °С- 3 мин., охлаждение до 6 СС с последующим хранением при 10 °С. По истечении амплификации 10 мкл образца смешивали с *6 буфером для загрузки и вносили в 2% агарозный гель (0,5 мкг/мл этидия бромида). Размер амплифицируемого продукта определяли с помощью маркера длин

фрагментов 1000-100 п.н. в концентрации 0,5 мкг/мкл в буфере для нанесения на гель (Кат.№ D0510, ЗАО «Силекс», г. Москва). Специфичность ПЦР оценивалась по соответствию размера продуктов амплификации с размером, определенным каждой паре праймеров генотипа. Электрофорез проводили при 50 А, 100 В на 1 см2 в течение 30 минут (камера SE-2, Helicon,Россия; источник питания Powerpac Basic Power Supply, BioRad, США). Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе ECX-20L (Vilber Lourmat, Германия) с помощью системы регистрации результатов электрофореза Gel Imager (Helicon, Россия) (Патент РФ № 2443782). Для проверки достоверности специфичности полученных результатов генотипирования с помощью ПЦР проводилось секвенирование продуктов амплификации участка гена ompl генотипов в сравнении с нуклеотидными последовательностями генотипов, представленных в электронной базе данных NCBI GenBank.

Анализ наличия генетических детерминант антибиотикорезистентности штаммов Ch.trachomatis и Chl.pneumoniae проводили с помощью ПЦР с использованием подобранных оригинальных праймеров с целью выявления генов устойчивости к тет-рациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (егт). Для наработки участка гена устойчивости к тетрациклинам (let) использовали праймеры: Tet-f: 5-AGY ТТС САС'CGA AYT ССТ ТТС-3' и Tet-r: 5'-АТА САС CGA GCA GGG ATT ТС-3' (размер продукта амплификации 470 пар нуклеотидов). Для наработки участка гена устойчивости к макролидам (егт) использовали праймеры: Erm-f: 5-AAG CCA YTG CGT CTG АСА ТС-3' и Erm-r: 5-TGG CGT GTT ТСА TTG СТТ GA-3' (размер продукта амплификации 300 пар нуклеотидов).

Стадию амплификации проводили в подобранной опытным путем смеси: ПЦР Буфер (*10): 700 тМ Трис-HCl, pH 8,6 / 25 °С, 166 mM (NH4)2S04, 25 mM MgCl2i0,2 тМ dNTPs, Taq- полимераза, на амплификаторе GeneAmp2700 (Applied Biosystems, США).

Для амплификации фрагмента гена tet применяли подобранные опытным путем условия: 1 цикл: 95 СС- 3 мин, затем 40 циклов: 94 °С- 30 сек, 52 °С- 30 сек, 72 °С- 30 сек; 1 цикл: 72 °С - 3 мин., охлаждение до 6 °С с последующим хранением при 10 °С. Для амплификации фрагмента гена егт применяли условия: 1 цикл: 95 °С- 3 мин, затем 40 циклов: 94 °С- 30 сек, 50 °С- 30 сек, 72 °С- 30 сек; 1 цикл: 72 °С- 3 мин., охлаждение до 6 °С с последующим хранением при 10 °С.

Анализ продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального электрофореза разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле (камера SE-2, Helicon,Россия; источник питания Powerpac Basic Power Supply, BioRad, США).

Программное обеспечение в молекулярно-генетическом исследовании хлами-дий. При выборе олигонуклеотидных последовательностей для конструирования оли-гонуклеотидных праймеров применяли биоинформационный анализ с использованием комплекса компьютерных программ Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http://

blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), и данные электронной базы NCBI Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

Статистическая обработка полученных данных. Математическая обработка полученных данных основывалась на методах непараметрического статистического анализа. Вычисление и оценку корреляционной связи между показателями лабораторных тестов и течением хламидийной инфекции рассчитывали с помощью коэффициента корреляции рангов Спирмена (rs). При rs>0,7 связь считали сильной; при 0,5< rs <0,7 связь являлась средней,-при rs <0,5 связь считали слабой. Если rs=0 - линейная связь отсутствует. Для определения значимости различий применения комбинации методов детекции хламидий использовали критерий Мак-Нимара, различия оценивали как статистически значимые при р<0,05 (Гланц С., 1998). При оценке взаимозависимости клинического проявления заболевания от принадлежности к генотипу использовали критерий хи-квадрат (х) (Ашмарин И.П., Воробьёв А. А., 1962; Гланц С., 1998). Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программы Microsoft Excel. (Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002; Сидоренко М.Г., 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная характеристика информативности лабораторных методов диагностики урогенитальиого хламидиоза в зависимости от характера течения инфекционного процесса

Проведено лабораторное исследование образцов биологического материала от 50 пациентов с подозрением на хламидиоз (35 женщин и 15 мужчин), разделенных на две группы. В первую группу вошли 25 пациентов, предъявлявших жалобы на обильные выделения из УГТ, жжение и рези при мочеиспускании; во вторую группу- 25 человек без выраженной симптоматики, имевшие в анамнезе хронические заболевания УГТ. Контрольную группу составили 15 человек, не предъявлявших жалобы и обратившихся с целью профилактического осмотра.

Среди обследованных пациентов первой группы в 72% случаев (п=18) наличие инфекции было подтверждено четырьмя методами (ИФА, ПЦР, Культуральный (КМ) и цитологический метод (ЦМ)). У 8% (п=2) пациентов хламидийная инфекция была подтверждена тремя методами (ПЦР, ИФА, КМ). У 20% (п=5) возбудитель верифицирован только в комбинации ПЦР и ИФА без выявления хламидий культураль-ным и цитологическим методами. Коэффициент корреляции (rs) между наличием выраженных клинических проявлений заболевания и положительными результатами лабораторных тестов по культуральному исследованию составил - 0,49; ПЦР- 1,0; ИФА-1,0; ЦМ-0,48.

Другая картина наблюдалась во второй группе пациентов. Наличие инфекции, подтвержденное четырьмя методами, наблюдалось в 12% случаев (п=3). У 16% (п=4) пациентов хламидийная инфекция была подтверждена комбинацией ПЦР, ИФА и КМ. Еще у 12% (п=3) - комбинацией ПЦР и КМ. При отрицательном результате

культурального и цитологического методов, положительные результаты только по ПЦР выявлены в 4 (п=1), только по ИФА - в 44 (n=l 1), по комбинации ПЦР и ИФА -в 12% (п=3) случаев. Коэффициент корреляции (rs) между наличием стертых клинических проявлений заболевания и положительными результатами лабораторных тестов по культуральному исследованию составил - 0,39; ПЦР - 0,59; ИФА - 0,71; ЦМ -0,23. В контрольной группе пациентов результаты исследования всеми предложенными методами были отрицательными.

Таким образом, показатели корреляционного анализа свидетельствуют о тесной взаимосвязи показателей лабораторных тестов и характеристик^ течения хламидий-ной инфекции. Установлено, что наиболее сильная корреляционная связь прослеживается при клинически выраженном течении процесса - с положительными результатами ПЦР и ИФА, средняя - с положительными результатами культурального и цитологического исследования. При бессимптомном процессе выявляется сильная корреляционная связь - с положительными результатами ИФА, средняя - с ПЦР, слабая корреляция - с сочетанием положительных результатов культурального и цитологического исследований.

Разработка ПЦР-системы для одновременного выявления и видовой дифференциации ДНК ChLpneumoniae и Ch.trachomatis, а также ПЦР-системы для верификации штаммов Ch.trachomatis, выделенных от человека, с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической

плазмиды

Проведена предварительная отработка условий амплификации и оценка специфичности праймеров предлагаемых систем на референс штаммах Chl.pneumoniae -«В» и Ch.trachomatis- «Бурхан». При амплификации выделенной ДНК из культуры клеток, зараженной двумя штаммами, и последующем анализе фрагментов амплификации с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле регистрировали размеры продуктов, специфичных для каждого вида хламидий.

Проведена оценка чувствительности и специфичности ПЦР-детекции штаммов Ch.trachomatis, несущих участок нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды и свободных от него. При амплификации выделенной ДНК из культуры клеток, зараженной штаммом Chi pneumoniae -«В», анализ продуктов амплификации показал отрицательный результат, что подтверждает специфичность предлагаемых праймеров как к гену 16S рРНК Ch.trachomatis, так и к участку ДНК криптической плазмиды, которая отсутствует у штамма Chl.pneumoniae. При амплификации выделенной ДНК из культуры клеток, зараженной штаммом Ch trachomatis- «Бурхан», анализ продуктов амплификации был положительным по обоим эпитопам: гену 16S рРНК и плазмиде.

В модельных экспериментах, по оценке аналитической чувствительности предлагаемых тест-систем с использованием разведений ДНК референс штаммов хламидий, установлено, что нижний предел обнаружения и Ch.trachomatis и Chl.pneumoniae

составляет от 5 до 10 геном-эквивалентов на реакцию. При этом неспецифическая амплификация не наблюдается (рис. 1 и 2).

Рис. 1. Детекция и идентификация штаммов Рис. 2. Детекция штаммов Ch.trachomalis, не-Ch.trachomalis и C.hl.pneumoniae. сущих участок нуклеотидной последователь-

Примечания: М - маркер длин фрагментов от 100 ности ДНК криптической штазмиды и свобод-до 1000 пар нуклеотидов (размер 100 п.н. на рисун- ных от него.

ке не просматривается); 1, 2, 4 - смесь штаммов Примечания: М - маркер длин фрагментов от Cktrachomatis и СМ. pneumoniae, 3, 5, б - штаммы 100 до 1000 пар нуклеотидов (размер 100 п.н. СИ. trachomatis; KF1 - положительный контроль на рисунке не просматривается); 1, 2, 3, 5 -{Chi. pneumoniae - «В»); KF2 - положительный плазмидосодержащие штаммы Ch. trachomatis', контроль {Chi. trachomatis - «Бурхан»); К- - отри- 4, 6 - бесплазмидные штаммы СИ. trachomatis; цательный контроль. К1- - отрицательный контроль проведения ре-

акции, К2+ - положительный контроль (рефе-ренс штамм Ch. trachomatis - «Бурхан»).

Апробацию чувствительности системы видовой верификации хламидий и системы по обнаружению участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды проводили на биологическом материале мазков-соскобов, полученных из уретры, цервикального канала у 35, и носоглотки у 2 человек, обратившихся в диагностический центр. У 27 пациентов в клиническом материале из урогенитального тракта обнаружена ДНК штаммов Ch.trachomatis, несущих участок нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды. У одного пациента в соскобе из уретры обнаружен штамм Ch. trachomatis, детектируемый только при амплификации фрагмента 16S рРНК гена Ch. trachomatis и показывающий отрицательный результат при детекции участка ДНК плазмиды. У 7 пациентов хламидии не обнаружены.

Из двух штаммов Chi.pneumoniae, выделенных из верхних дыхательных путей и подтвержденных на культуре клеток ФИТЦ-меченными антителами, только один был подтвержден системой видовой верификации как Chi.pneumoniae. Другой штамм был детектирован как Ch. trachomatis, что говорит о наличии перекрестной реакции при выявлении хламидий ФИТЦ-меченными антителами в реакции иммунофлуоресцен-ции.

При оценке штамма Ch.trachomatis от пациента с патологией органов дыхания на наличие или отсутствия участка ДНК плазмиды, получен положительный результат, что также подтверждалось коммерческим набором «АмплиСенс Chlamydia trachomatis- EPh».

Таким образом, предлагаемые ПЦР-системы позволяют не только выявлять возбудителей (в большем проценте случаев по сравнению с коммерческими тест-

системами, генетической мишенью в которых является криптическая плазмида Ch. trachomatis), но и осуществлять дифференциацию хламидий. Тест-системы могут применяться для выявления ДНК Chi.pneumoniae и Ch.trachomatis в образцах клинического материала и в культуре клеток для повышения диагностической значимости метода.

Разработка способа молекулярно-генетического типирования методом ПЦР и анализ наличия генетических детерминант антибиотикорезистентности штаммов Ch.trachomatis

В настоящее время типирование Ch. trachomatis нацелено на разработку и применение молекулярно-генетических методов с использованием вариабельных участков гена ompl. Насчитывается 19 генотипов Ch. trachomatis, объединенных в три группы: группа В (генотипы В, Ва, D, Da, Е, Lb L2, L2a), группа С (генотипы А, С, Н, I, Ja, J, К и L3), и промежуточная группа (генотипы F, G, Ga).

Проведено типирование 26 образцов Ch.trachomatis, с использованием метода ПДРФ, в качестве сравнения. Анализ длин рестрикционных фрагментов ДНК, полученных в ходе реакции, с представленными в базе данных GeneBank, характерных для каждого из известных генотипов, позволил сгруппировать их в 5 ПДРФ-групп: штаммы, наиболее близкие по ПДРФ-профилям к штаммам генотипа К (п=11); генотипа G (п=5); генотипа Е (п=4); генотипа F (п=2); генотипа J (п=1). В трех образцах результат оказался не информативен вследствие возможного наличия в них смеси нескольких генотипов возбудителя.

Генотипирование с использованием сконструированных олигонуклеотидных праймеров в реакции ПЦР осуществлялось в два этапа без привлечения ферментативных реакций в присутствии рестриктаз. На первом этапе проводили ПЦР с использованием специфических праймеров к группам генотипов (В, С и промежуточной). Далее, при положительной ПЦР с праймерами одной из групп, проводили ПЦР со специфичными праймерами, тем самым определяя генотип штамма Ch.trachomatis. Результаты типирования совпали с результатами ПДРФ, а в трех неопределенных образцах выявилась смесь штаммов двух генотипов. Причем в ассоциации всегда присутствовал генотип К.

В ходе типирования 26 образцов методом ПЦР установлена циркуляция 5 генотипов: G, Е, J, F, К. У мужчин встречались генотипы G (14%), Е (21%), J (7%), F (14%), К (44%); у женщин - генотипы G (37,5%), Е (19%), К (43,5%). Установлено, что генотип G у женщин встречается чаще, чем у мужчин, генотипы К и Е- распределены в равных долях, а генотипы F и J встречались исключительно у мужчин. При оценке взаимосвязи клинического проявления заболевания и генотипа возбудителя показано, что генотипы G, J,E и F с равной частотой определяют тот или иной характер клинической симптоматики, а генотип К чаще всего определяет клинически выраженное течение инфекции.

Для проверки достоверности специфичности полученных результатов геноти-пирования с помощью ПЦР проводилось секвенирование продуктов амплификации

участка гена отр1 генотипов в сравнении с нуклеотидными последовательностями генотипов, представленных в электронной базе данных Генбанка.

Анализ штаммов СИлгасИота!м, выделенных от пациентов, показал наличие 1:е1-гена у 1 (3,8%) из 26 штаммов, егш-гена - у 4 (15,4%). Одновременное наличие детерминант устойчивости к тетрациклинам и макролидам было выявлено у 3 штаммов (11,5%) (рис.3,4).

М !Г 2Г М 4Г 51 « 7{ 81 К-

Рис 3. Электрофореграмма детекции детерминант устойчивости к тетрациклинам (let)

Примечание: If, 4f, 5f и 7f - положительные варианты Cktrachomalis по гену lev, 2f, 3f, 6f и 8f -отрицательные варианты по гену lev, М - маркер молекулярных масс от 100 до 1000 пар нуклеотидов; (К-) - отрицательный контроль.

М If 2f 3i 4f Sf if 7f Sf K-

. . .... ц ^ , ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ г

Рис 4. Электрофореграмма детекции детерминант устойчивости к макролидам (егт)

Примечание: - положительные варианты С.ИлгасИотаПз по гену егт, - отрицательный

вариант по гену егт, М - маркер молекулярных масс от 100 до 1000 пар нуклеотидов; (К-) -отрицательный контроль.

Анализ данных не показал связи наличия генов устойчивости к тетрациклинам и макролидам с клиническими проявлениями заболевания. Проведенное определение детерминант антибиотикорезистентности штаммов СкАгаскотайх, выделенных от пациентов с хламидиозом, раскрывает возможности его использования для разработки ускоренных молекулярно-генетических методов оценки устойчивости к лекарственным средствам циркулирующих штаммов хламидий.

Оптимизация проведения диагностики хламидиоза культуральным методом

Известно, что транспортная среда должна обеспечивать сохранение жизнеспособности микроорганизмов, в то же время обязана предупредить или в значительной степени лимитировать размножение сопутствующей микрофлоры. Установлено, что транспортные среды № 1 и № 2 не являются оптимальными для хранения и транспортировки хламидий. Недостатками среды №1 являлись: высокое содержание антими-котического препарата, а так же наличие только гентамицина, к которому отмечается

резистентность у многих микроорганизмов. Вследствие этих факторов культивирование хламидий нередко заканчивалось неудачей из-за деструктивных изменений в клетках, вызванных амфотерицином В и размножающейся микрофлорой. К существенному недостатку среды № 2 следует отнести отсутствие раствора в пробирке. Зонд, опущенный в пробирку, зачастую не попадает в смоченную губку, вследствие этого жизнеспособность хламидий теряется уже на этапе транспортировки. Оптимальной оказалась среда № 3.

В культуре клеток McCoy В штаммы хламидий вызывали изменения с образованием выраженных специфических включений. В культуре Vero и М-Не1а цитопати-ческий эффект был менее выраженным или отсутствовал.

В качестве питательной среды оптимальной оказалась среда DMEM с глутами-ном вследствие содержания 25 мМоль HEPES, имеющая при этом более высокую буферную емкость и поддерживающая необходимый для клеток рН длительное время.

Значимых различий при культивировании в разных емкостях (в 24-луночных планшетах, пластиковых плоскодонных пробирках, стеклянных пенициллиновых флаконах) выявлено не было. ,

Оптимизация культивирования хламидий позволила провести сравнительную фенотипическую характеристику штаммов Ch.lrachomatis и Chl.pneumoniae в культуре клеток McCoy В. Оценивали титр возбудителя, характер образования включений и уровень накопления гликогена в зараженной культуре клеток. Для исключения лож-ноположительных и ложноотрицательных результатов при окраске дополнительно применяли оригинальные ПЦР-системы для видовой верификации Chl.pneumoniae и Ch.trachomatis, а также для верификации ДНК плазмиды у штаммов Ch.lrachomatis.

Установлено, что все штаммы вызывали в культуре клеток McCoy В характерное для хламидий цитопатическое действие, степень которого варьировала от слабой до выраженной (табл.2). Титры Ch.trachomatis в зависимости от штамма колебались от 2,0 до 5,51g ТЦДл/мл. В двух случаях на первом пассаже хламидии в культуре клеток не выявлялись. Учитывая, что в анамнезе эти пациенты имели хронические заболевания урогенитального тракта, было произведено до 3-х пассажей клинического материала, в котором через 216 часов определили Ch.trachomatis в низком титре 2,01g ТЦДзо/мл. При окраске по Романовскому-Гимзе (РГ) цитоплазматические включения визуализировались в 22 случаях из 23. При окраске раствором Люголя выявилось 22 штамма Ch.trachomatis, продуцирующих гликоген. При видовой идентификации хламидий ФИТЦ-меченными антителами получен неоднозначный результат. При окраске музейных штаммов хламидий наблюдалась перекрестная реакция антител со штаммами Ch.trachomatis и Chl.pneumoniae. Аналогичный результат был получен у 1 штамма, выделенного от пациента. Применение ПЦР-системы видовой детекции помогло установить наличие перекрестной реакции, в результате применения ФИТЦ-меченных антител, а также точно определить видовую принадлежность хламидий.

Таблица 2. Фенотипическая характеристика штаммов Ch.trachomatis и Chi.pneumoniae.

и/и оХ Место взятия материала 1 I1 >> -N. ко Й 13 X 1- Методы детекции хламидий в культуре клеток

Окраска Люголем Окраска по Романовскому-Гкмзе ФИТЦ - меченные антитела ПЦР

Chi. pneumoniae Ch. trachomatis t Система видовой верификации Система верификации участка ДНК плаз миды

Chl.pneu moniae Ch.tr acho matis

1 носоглотка 2,01g - - + - + - -

2 носоглотка 2.5 Ig + + + + - + +

3 уретра 2,91g + + * + - + +

4 цервикальный канал 5.5 lg + + * + - + +

5 цервикальный канал 5,1 lg + + * + - + +

6 цервикальный канал 4.5 1g + + * + - + +

7 уретра 3,5 lg + + t * + - + +

8 уретра 3,91g + + * + - + +

9 уретра 2,5 lg + + - - + +

10 уретра 4,71g + + * + - + +

И цервикальный канал 5,21g + + * + - + +

12 уретра 3,8 lg + * + - + +

13 уретра 3,6 lg + + + - + +

14 уретра 4,1 lg + + + - + +

15 уретра 4,6 Ig + + * + - + +

16 уретра 5,3 lg + + + - + +

17 цервикальный канал 5.51g + + + - + +

18 цервикальный канал 3.2 Ig + + * + - + +

19 цервикальный канал 2,01g + - + + +

20 уретра 4,8 lg + + + + +

21 уретра 3,5 Ig + + + + +

22 уретра 4.3 lg + + + + +

23 уретра 2,9 lg + + + +

24 СЛ. 1гасИота11$-Бурхан» 5,3 lg + + + + + +

25 СЫ.рнеитопше-«В» 3,5 lg - + + + + - -

26 Смесь референс-штаммов » • + + + + + +

Примечания:*- не использовали в исследовании; (+) - положительный результат; (-) - отрицательный результат.

Таким образом, при детекции и идентификации хламидий в культуре клеток разными методами установлено, что детекция хламидий окраской по Романовскому-Гимзе не позволяет дать полную дифференцировку хламидий до вида. Отсутствие хламидийных включений при данной окраске не свидетельствует об отсутствии хла-

мидий в культуре клеток, что подтверждается окраской ФИТЦ-меченными антителами. Однако в результате применения антител при детекции и идентификации хлами-дий в культуре клеток, наблюдается появление перекрестных реакций, что приводит к некорректной оценке результатов. Дополнительная детекция разработанными ПЦР-системами позволяет не только определить вид хламидии, но и свести к минимуму наличие ложноположительных и ложноотрицательных результатов и, тем самым, повысить чувствительность и специфичность культурального метода.

Оптимизация алгоритма лабораторной диагностики хламидиоза

Проведён сравнительный анализ диагностической значимости общепринятых методов лабораторной диагностики УГХ, с учетом модификаций, с целью оптимизации алгоритма их применения. Проведено лабораторное обследование 49 пациентов с подозрением на УГХ. Обязательным критерием наличия инфекционного процесса в УГТ было выявление хламидий в мазках-соскобах из цервикального канала и/или уретры, а также культуральным методом и/или ПЦР. Группу контроля составили 24 пациента. При оценке диагностической значимости методов определяли чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного результата теста (РУ+), прогностическую ценность отрицательного результата теста (РУ), индекс точности (ИТ), отношение правдоподобия положительного (ЬИ.+) и отрицательного (ЬЯ) результатов (Гринхальд Т., 2008).

Из 49 обследованных КМ при окраске зараженного монослоя по РГ или ПИФ положительный результат теста выявлен у 27 человек независимо от способа окраски (в 55,1% случаев). При окраске мазков-соскобов из урогенитального тракта (табл. 3) установлено, что чувствительность ПИФ выше на 7,3%, чем РГ, однако по специфичности ПИФ уступает РГ. РУ+ и РУ обоих тестов имеют достаточно высокие показатели, тогда как ПИФ говорит о слабой связи между положительным результатом теста и заболеванием. ЬЯ+ РГ =15 увеличивает подозрение на наличие заболевания и свидетельствует о высокой диагностической ценности окраски по РГ.

Таблица 3. Диагностическая значимость исследования мазков-соскобов, окрашенных по РГ и методом ПИФ.

Метод окраски Чувствительность Специфичность Ру+ РУ ИТ ЬЯ"

РГ 63% 95,8% 94,4% 69,7% 0,78 15 0,38

ПИФ 70,3% 79% 79% 70,3% 0,74 3,35 0,37

Примечания: РГ - окраска по Романовскому-Гимзе; ПИФ - окраска ФИТЦ-меченными антителами для выявления антигенов С/игасИотаНз', РУ- прогностическая ценность положительного результата теста; РУ- прогностическая ценность отрицательного результата теста; ИТ - индекс точности; -отношение правдоподобия положительного результата; I.К" - отношение правдоподобия отрицательного результата.

Эффективность выявления СИлгасИота/й с помощью разработанной тест-системы для детекции штаммов с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды была оценена путем параллельного

тестирования образцов клинического материала коммерческой системой «АмплиСенс Chlamydia trachomatis- EPh». Обе тест-системы обеспечивали высокие диагностические показатели, а также отвечали требованиям теста с высокой диагностической точностью (табл.4). Однако применение комбинации праймеров позволило выявить у одного пациента носительство штамма Ch.lrachomatis с отсутствием участка ДНК криптической плазмиды, что повысило диагностическую ценность метода, по сравнению с применением праймеров, ориентированных только на плазмиду.

Таблица 4. Диагностическая значимость ПЦР-тест-систем.

Сравниваемые тест-системы Чувствительность Специфичность PV+ PV" ИТ LR+ LR"

Тест-система «АмплиСенс Chlamydia trachomatis-Eph» 96,3% 92% 92,8% 73,3% 0,94 12 0,04

16S rRNA+плазмида 96,3% 95,8% 96,3% 95,8% 0,96 22,9 0,04

4 Установлено, что чувствительность КМ при окраске ПИФ или раствором Лю-голя достаточно низкая (<70%), хотя специфичность колеблется около 90% (табл. 5).

Таблица 5.Диагностическая значимость различных методов детекции хламидий в культуре клеток._

Методы детекции Чувствительность Специфичность PV+ PV ИТ LR+ LR"

ПИФ 66,7% 87,5% 85,7% 70,0% 0,76 5,3 0,38

Раствор Люголя 55,5% 92,0% 88% 64,7% 0,72 6,9 0,48

ПЦР 96,3% 95,8% 96,3% 95,8% 0,96 22,9 0,04

Диагностические показатели применения ПЦР в КМ указывают на высокую диагностическую ценность и позволяют принять окончательное решение в подтверждении диагноза.

Также оценивали диагностическую значимость различных методов верификации хламидий по сравнению с ПЦР (табл.6). Чувствительность КМ с применением окраски ПИФ, раствором Люголя или по РГ колеблется от 63,2% до 73,5%, а специфичность от 66,7% до 95,8% в зависимости от выбранного варианта окраски зараженного монослоя. Причем ПИФ проигрывает окраске раствором Люголя и по РГ по многим диагностическим показателям. Учитывая данные о высокой специфичности, но низкой чувствительности окраски мазка-соскоба по РГ по сравнению с окраской по ПИФ (высокая чувствительность, но низкая специфичность), возможно одновременное использование этих способов окраски для повышения достоверности результатов. Высокая диагностическая точность ПЦР, по сравнению с традиционными ме-

•годами окраски, позволяет рекомендовать его как перспективный способ детекции хламидий в КМ.

Таблица 6. Диагностическая значимость различных методов верификации хламидий по сравнению с ПЦР.

Тесты Чувствительность Специфичность PV+ PV" ИТ LR+ LR-

ПИФ в мазке-соскобе 83,3% 45% 52% 79% 0,61 1,52 0,36

Окраска мазка-соскоба по РГ 49% 95,8% 96% 48,9% 0,65 11,7 0,53

ПИФ в культуре клеток 63,2% 66,7% 79% 47% 0,64 1,9 0,55

Раствор Люголя в культуре клеток 65% 92% 94% * 59,5% 0,74 8,1 0,38

РГ в культуре клеток 73,5% 95,8% 97,3% 63,9% 0,8 17,5 0,27

Сопоставляли два комплекса методов верификации хламидий: окраску мазков -соскобов из урогенитального тракта по РГ в сочетании с КМ (детекция хламидий в культуре клеток методом ПИФ) и окраску мазков - соскобов по РГ в сочетании с КМ (детекция хламидий в суспензии зараженных клеток McCoy методом ПЦР). Процентные соотношения положительных результатов, полученных с помощью двух комплексов методов, сравнили с применением критерия Мак-Нимара. В результате расчетов получены достоверные подтверждения для отказа от нулевой гипотезы о том, что один и тот же процент обнаружения хламидий в клиническом образце обеспечивается применением этих двух комплексов методов исследования (р<0,01).

Таким образом, микроскопия мазка, окрашенного по РГ, не отличается высокой чувствительностью, что требует подтверждения другими тестами. С учетом специфичности метода очевидна его ценность в качестве дополнительного метода исследования для повышения достоверности диагностики, особенно при остром течении процесса. Использование метода выявления углеводсодержащего компонента (гликогена) раствором Люголя в цитоплазматических включениях, образуемых Ch.trachomatis, учитывая его простоту, может использоваться при детекции хламидий в КМ. Недостаточная чувствительность при этом обусловлена тем фактом, что не все штаммы хламидий обладают гликогенсинтетазной активностью. Для дифференциальной диагностики хламидий при окраске мазков-соскобов из урогенитального тракта этот метод имеет ряд ограничений. Он позволяет выявить включения только в определенной фазе развития микроорганизма, а также метод не пригоден при изучении соскобов

слизистой оболочки влагалища, клетки которой содержат эндогенный гликоген. В качестве основных прямых методов обнаружения хламидий, в связи с высокой диагностической значимостью, можно рекомендовать исследование клинического материала (мазки-соскобы) методом ПЦР, а так же КМ с детекцией возбудителя методом РГ или ПЦР. Целесообразно проводить одновременную детекцию штаммов хламидий, как несущих плазмиду, так и свободных от неё, что позволит увеличить процент выявления возбудителя хламидийных инфекций и определить специфику ведения больного, прогнозируя характер течения инфекции, повысить эффективность проводимой терапии (рис. 5). ^

Рис. 5. Алгоритм прямой детекции хламидий в клиническом материале.

Выводы

1.При сравнительной характеристике информативности общепринятых методов верификации СкЛгасЪотайх применение корреляционного анализа позволило установить тесную взаимосвязь между обнаружением хламидий или их маркеров и характером течения инфекционного процесса.

2.Впервые разработанные ПЦР-системы для диагностики хламидийной инфекции позволяют одновременно выявлять ДНК СА./гасЛо/яа/и и СЫ.рпеитотае, а также верифицировать штаммы вида СИлгасИотайз с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК критической плазмиды.

3.Впервые разработанный способ генетического типирования штаммов СИЛгаскотаНз методом ПЦР позволяет в короткие сроки производить внутривидовую дифференциацию клинических изолятов и музейных штаммов хламидий для определения принадлежности к тому или иному генотипу.

4. Установлено наличие генетических детерминант антибиотикорезистентности к тет-рациклинам и макролидам у штаммов Ch.trachomatis методом ПЦР с использованием оригинальных праймеров. Дальнейшая работа над расширением возможностей метода может привести к созданию на его основе простого и надежного инструмента для определения антибиотикорезистентности штаммов хламидий.

5. Оптимизация условий культивирования и предложенный комплекс детекции хламидий в культуре клеток сводят к минимуму наличие ложноположительных и ложно-отрицательных результатов, повышая диагностическую ценность культурального метода исследования на хламидиоз.

6. Проведённая оценка диагностической значимости общепринятых методов лабораторной диагностики хламидиоза с учетом их модификации позволила предложить алгоритм прямой детекции хламидий в клиническом материале.

Практические рекомендации

Для диагностики хламидийной инфекции целесообразно использование не* I

скольких взаимодополняющих тестов с учетом характера течения инфекционного процесса.

Предложенные модифицированные культуральный и молекулярно-генетические методы, включённые в алгоритм прямой детекции хламидий в клиническом материале, позволяют провести выявление и дать объективную оценку геноти-пических и фенотипических свойств возбудителя.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Метельская В.А. Современные методы лабораторной диагностики хламидио-зов / В.А. Метельская, В.А. Алешкин, В.В. Зверев, О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Ю.В. Несвижский, М.С. Афанасьев, АЛ. Байракова, Е.А. Егорова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2008-№ 4.- С.111-117.

2. Гречишникова О.Г. Лабораторная база диагностики хламидиоза / О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, В.А. Метельская,

A.Л. Байракова, В.В. Слободенкж, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XV Росс. Нац. конгресса - М, 2008. -С.430-431.

3. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов выявления Chlamydia trachomatis у человека и обезьян / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, В.А. Метельская // Биологическая безопасность в современном мире. Материалы науч,-практ. конф. СМУиС - Оболенск, 2009. - С. 114-117.

4. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза у больных в зависимости от остроты клинических проявлений / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, Е.А. Воропаева,

B.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, М.С. Афанасьев,

Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XVI Росс. Нац. конгресса -М, 2009. - С.76.

5.Гречишникова О.Г. Фенотипическая характеристика штаммов хламидий, выделенных от человека и обезьян культуральным методом / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, В.Ф. Ликов, Е.А. Воропаева, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Н.Н. Полещук, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, М.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, Л.В. Рубанин, Е.А. Егорова, Е.О. Рубальский, З.Б. Квачева, Й.В. Евсегнеева, А.В. Караулов // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. -2009 - № 3. - С.44-53.

6.Слободенюк В.В. ПЦР-детекция и идентификация возбудителей хламидийных инфекций человека и обезьян / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, Д.В. Кокушков, О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, М.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, Е.А. Егорова, Е.О. Рубальский, И.В. Евсегнеева, А.В. Караулов // Иммунопатология, Аллергология, 'Инфектология. -2009 - № 3. - С.54-62.

7.Слободенюк В.В. Генотипирование и анализ антибиотикорезистентности штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян / В.В. Слободенюк, А.В. Караулов, В.А. Алешкин, О.Г. Гречишникова, С.С. Афанасьев, Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, Е.А. Егорова, А.Л. Байракова // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. —2009 -№ 4. - С.74-81.

8.Слободенюк В.В. Сравнительная характеристика методов верификации Chlamydia trachomatis у человека и обезьян / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, Е.А. Егорова, Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, А.В. Караулов, Ю.В. Несвижский, Д.Л. Теплый, О.В. Рубальский, Е.О. Рубальский // Естественные науки. - 2009 -№ 1 (26). -С.65-71.

9. Слободенюк В.В. Изучение генотипов и антибиотикорезистентности штамммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян / В.В. Слободенюк, А.В. Караулов, В.А. Алешкин, О.Г. Гречишникова, С.С. Афанасьев, Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, А.В. Алешкин, В.А. Метельская, Е.А. Егорова, А.Л. Байракова // Человек и лекарство: сборник материалов XVII Росс. Нац. конгресса - М, 2010.-С.719.

10. Слободенюк В.В. Анализ антибиотикорезистентности и генотипирование штаммов Chlamydia trachomatis в популяции обезьян и человека / В.В. Слободенюк, О.Г. Гречишникова, И.М. Аршба // Развитие научных исследований и надзор за

инфекционными заболеваниями. Материалы международной конференции. - СПб, 2010.-С.129.

11. Гречишникова О.Г. Сравнительный анализ прямых методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза / О.Г. Гречишникова, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.В. Слободенюк, А.В. Караулов, Ю.В. Несвижский, О.В. Ру-бальский, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, Е.А. Егорова, Е.О. Рубальский // Астраханский медицинский журнал. - 2010 - Т. 5. - № 2. - С.80-86.

12.Караулов А.В. Установление генотипических и фенотипических свойств возбудителя и его филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae штаммов хламидий, выделенных от обезьян и человека с хламидийной патологией /

A.В. Караулов, В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, О.Г. Гречишникова, С.С. Афанасьев, Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, А.В. Алешкин, В.А. Метельская, Е.А. Егорова, А.Л. Байракова II Вестник Российской АМН. - 201Х - Т.7. - С.16-21.

13. Караулов А.В. Хламидийная инфекция. Новые аспекты патогенеза, иммунологии, верификации и лечения инфекции у человека и приматов / А.В. Караулов, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, Воропаева Е.А., М.С. Афанасьев, В.В. Слободенюк, А.В. Алёшкин, А.Л. Байракова, О.Г. Гречишникова, И.А. Дятлов, Х.М. Галимзя-нов, И.В. Евсегнеева, Э.К. Джикидзе, О.В. Рубальский, Ю.В. Несвижский, А.Ю. Миронов, О.Г. Фотиади, Л.И. Кафарская, О.М. Кострова, А.П. Топтыгина, Н.С. Матвеевская, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, Э.А. Светоч, С.Ю. Пчелинцев, О.В. Логунов, Л.И. Новикова, В.Ф. Ликов.- М., Издательство первого МГМУ им. И.М. Сеченова.-2012.-256 с.

14. Slobodenuk V.V. The comparative estimation of diagnostic value of laboratory methods for urogenital chlamydiosis in humans and monkeys / V.V. Slobodenuk, V.A. Aleshkin,

B.A. Lapin, A.V. Karaulov, S.S. Afanasiev, O.G. Grechishnikova, E.A. Voropaeva, E.K Jikidze, U.V. Nesvizskii, M.S. Afanasiev, V.A. Metelskaia, A.L. Birakova, E.A. Egorova // FEMS 2009, 3rd Congress of European Microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28-Juli 2, 2009.

15. Karaulov Alexander. Identification of Phylogenetic Position in the Chlamydiaceae Family for Chlamydia Strains Released fromMonkeys and Humans with Chlamydial Pathology / Alexander Karaulov, Vladimar Aleshkin, Vladimir Slobodenyuk, Olga Grechishnikova, Stanislav Afanasyev, Boris Lapin, Eteri Dzhikidze, Yuriy Nesvizhsky, Elena Voropayeva, Maxim Afanasyev, Andrei Aleshkin, Valeria Metelskaya, Ekaterina Yegorova, and Alexandra Bayrakova // Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology. - Volume 2010, Article ID 130760, 11 pages.

Патенты РФ на изобретение

1. Пат. JVs 2385945 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкнн, С.СЛфанасьев, Б.А. Лапин, Е.А. Воропаева, В.А. Баннов, О.М. Кострова, А.В. Караулов, Э.К. Джикидзе, Н.В. Воложанцев, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, О.В. Рубальский, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, Ю.Н. Урбан, А.Н. Куракова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-№ 2008151548/13; заявл. 26.12.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2010.

2. Пат. № 2385946 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С.Афанасьев, Б.А. Лапин, Е.А. Воропаева, В.А. Баннов, О.М. Кострова, А.В. Караулов, Э.К. Джикидзе, Н.В. Воложанцев, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, О.В. Рубальский, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, Ю.Н. Урбан, А.Н. Куракова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-№ 2008151550/13; заявл. 26.12.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2010.

3.Пат. № 2443782 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ генотипирования Chlamydia trachomatis I В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С.Афанасьев, Б.А. Лапин, Х.М. Галимзянов, Е.А. Воропаева, Ю.В. Несвижский, А.В. Алёшкин, О.М. Кострова, А.В. Караулов, О.В. Рубальский, Э.К. Джикидзе, ИЛ. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, Д.С. Афанасьев, Ю.Н. Урбан, Е.О. Рубальский; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-№ 2010132294/13; заявл. 03.08.2010; зарег. во ФГУП «Роспатент» 27.02.2012.

Список сокращений

АТ- антитело

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота ИФА — иммуноферментный анализ КМ - культуральный метод

НИФ — реакция непрямой иммунофлуоресценции

ПИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР — полимеразная цепная реакция

рРНК - рибосомальная РНК

РГ- окраска по Романовскому-Гимзе

УГТ - урогенитальный тракт

УГХ — урогенитальный хламидиоз

^ - иммуноглобулин

ФИТЦ - флуоресцинизотиоцианат

ЦМ — цитологический метод

Подписано в печать: 25.02.2013 Тираж 100 экз. Заказ №939 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский пр-тд.74 (495)790-74-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гречишникова, Ольга Геннадьевна, Москва

На правах рукописи

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО» РОСПОТРЕБНАДЗОРА

Гречишникова Ольга Геннадьевна

04201355740

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С. Афанасьев

кандидат биологических наук Е.А.Воропаева

Москва - 2013

Оглавление

Список сокращений.........................................................................4

Введение.........................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы...............................................................11

1.1. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза......................11

1.1.2.Методы обнаружения и дифференциации Chlamydia trachomatis ...................................................................................................Л 1

1.1.3. Особенности верификации Chlamydia trachomatis при урогенитальном

хламидиозе.....................................................................................17

1.2. Типирование хламидий..................................................................23

1.3.Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам............................26

Глава 2. Материалы и методы исследований.......................................30

2.1. Материалы исследования..............................................................30

2.1.2. Образцы клинического материала..................................................30

2.1.3. Штаммы микроорганизмов..........................................................31

2.1.4. Культуры клеток......................................................................31

2.1.5. Используемые питательные среды и буферы....................................32

2.2. Лабораторные методы исследования...............................................33

2.2.1. Цитологический метод................................................................33

2.2.2. Серологический метод...............................................................33

2.2.3. Культуральный метод.................................................................34

2.2.4. Молекулярно-генетические методы................................................34

2.3. Программное обеспечение в молекулярно-генетическом исследовании хламидий.......................................................................................40

2.4. Статистическая обработка полученных данных.................................40

Глава 3. Результаты собственных исследований...................................42

3.1. Сравнительная характеристика информативности методов верификации Chlamydia trachomatis в зависимости от характера течения инфекционного про-

3.2. Разработка ПЦР-системы для одновременного выявления и видовой дифференциации ДНК Chlamydophyla pneumoniae и Chlamydia trachomatis, а так же ПЦР-системы для верификации штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека, с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды.............................................44

3.3.Разработка способа молекулярно-генетического типирования методом ПЦР и анализ наличия генетических детерминант антибиотикорезистентности штаммов Chlamydia trachomatis ........................................................49

3.4. Оптимизация проведения диагностики хламидиоза культуральным методом .....................................................................................................55

3.5. Оптимизация алгоритма лабораторной диагностики хламидиоза.............62

Глава 4. Обсуждение полученных результатов......................................71

Выводы..........................................................................................77

Практические рекомендации............................................................78

Список литературы...........................................................................79

Список сокращений

AT антитело

ВЗОМТ воспалительные заболевания органов малого таза

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА иммуноферментный анализ

КМ культуральный метод

ЛПС (LPS) липополисахарид

ЛЦР лигазная цепная реакция

МАНК метод амплификации нуклеиновых кислот

МОМР (major outer membrane protein) основной белок наружной мембраны

НИФ реакция непрямой иммунофлуоресценции

ПДРФ полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПИФ реакция прямой иммунофлуоресценции

ПЦР полимеразная цепная реакция

РИГА реакция непрямой гемагглютинации

РНК рибонуклеиновая кислота

рРНК рибосомальная РНК

тРНК транспортная РНК

РТ ретикулярное тельце

УГТ урогенитальный тракт

УГХ урогенитальный хламидиоз

ФИТЦ флуоресцинизотиоцианат

ЭТ элементарное тельце

Ig иммуноглобулин

NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplificaition

Введение

На сегодняшний день инфекционные заболевания урогенитального тракта, вызываемые видом Chlamydia trachomatis, являются одной из серьезных проблем здравоохранения, вследствие своего широкого распространения и доказанным риском тяжелых клинических осложнений при отсутствии своевременного лечения [2,5,9,11,56,59,76,77,80,81,83,89,95,97,105,110,111,127,130,133, 150,154,156] .

В диагностике урогенитального хламидиоза значительная роль отводится лабораторным исследованиям, так как от точности поставленного этиологического диагноза зависит успех лечения инфекции [1,3,10,13,14,18,28,45,58,60,94]. В настоящее время существует большое количество лабораторных тестов с различной чувствительностью и специфичностью, что создает предпосылки для разночтений при интерпретации результатов, а, следовательно, и в постановке диагноза [5,45,79].

Выделение хламидий в культуре клеток длительное время являлось «золотым стандартом», с которым сравнивали новые методы диагностики, не связанные с выявлением жизнеспособности микроорганизма. Однако культураль-ное исследование - это сложная и требующая достаточного времени процедура, для которой нет стандартизированных подходов. Информативность метода во многом зависит от условий забора и транспортировки клинического материала, качества клеточных линий и питательных сред, вариантов детекции хламидий, исправности оборудования и других факторов [101]. Поэтому в последние годы для диагностики хламидиоза широко применяются молекулярные методы, в основе которых лежат амплификационные технологии. В отличие от культураль-ного метода исследования, они не требуют специальных условий транспортировки клинического материала для сохранения жизнедеятельности возбудителя и обладают высокой специфичностью, чувствительностью и быстротой выполнения. Однако использование ряда коммерческих тест-систем, основной мишенью которых, при выявлении Ch. trachomatis, является участок нуклеотидной

последовательности видоспецифической криптической плазмиды, выявлена до-

статочно серьезная проблема. В случае мутации в ДНК-мишени или появлении бесплазмидных вариантов хламидий, возможны серьезные диагностические ошибки, ведущие к искажению результатов, а, в ряде случаев, к неверной постановке диагноза, как это произошло при появлении «шведского варианта» Ch.trachomatis [86,140,173].

Наряду с урогенитальными хламидиозами, вызываемыми Ch. trachomatis, широко распространены респираторные хламидиозы, к числу которых относят острые респираторные заболевания и пневмонии, возникающие в результате заражения как Ch. trachomatis, так и Chlamydophila pneumoniae [44]. Создание универсальной ПЦР-системы для выявления и видовой дифференциации ДНК хламидий как из урогенитального тракта (Ch.trachomatis), так и верхних дыхательных путей (Сh. trachomatis или Chi.pneumoniae) представляет собой актуальную задачу для практического здравоохранения.

Сообщения последних лет свидетельствуют о возникновении проблемы резистентности хламидий к антибиотикам [11,21,52,67]. Определение чувствительности к лекарственным препаратам культуральным методом сопряжено с трудностями стандартизации процедуры и интерпретации результатов [71]. Поэтому исследования отечественных и зарубежных ученых направлены на разработку методических подходов оценки наличия в ДНК микроорганизмов генетических детерминант, определяющих устойчивость к антибиотикам [96,100,102,129,138,145,167,171].

Среди Сh.trachomatis выделяют 19 генотипов, которые отличаются распространенностью в популяции, клеточным тропизмом, вирулентностью и им-муногенностью [19,31,41,59,70,72,73,82,115,116,128]. Типирование хламидий не имеет значения для постановки клинического диагноза, но является важной частью в эпидемиологическом исследовании, в изучении клинических проявлений, ответа на лечение, а также в создании вакцины [148,149,151,152]. В связи с тем, что эталонный метод генотипирования, основанный на секвенировании гена ompl, кодирующего основной белок наружной мембраны хламидий, сопряжен с рядом трудностей и не доступен для рутинных исследований, актуальным

представляется вопрос о нахождении альтернативных путей типирования Ch. trachomatis.

Таким образом, трудности дифференциальной диагностики урогениталь-ного хламидиоза, а также недостаточная информативность традиционно используемых методов подтверждают актуальность проблемы, в связи с чем возрастает роль научных исследований, направленных на совершенствование диагностики заболевания.

Цель работы

Задачи исследования

2. Разработать ПЦР-систему для одновременного выявления и видовой дифференциации ДНК Chi.pneumoniae и Ch.trachomatis, а также ПЦР-систему для верификации штаммов Ch.trachomatis, выделенных от человека, с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды.

3. Разработать способ генотипирования штаммов Ch.trachomatis методом ПЦР.

4. Установить наличие генетических детерминант антибиотикорезистентно-сти штаммов хламидий методом ПЦР.

6. Дать оценку диагностической значимости лабораторных методов выявления Ch. trachomatis, с учетом их модификаций, и предложить алгоритм прямой детекции хламидий в клиническом материале.

Научная новизна исследований

Дана оценка степени информативности различных методов лабораторной диагностики УГХ, в зависимости от характера течения инфекционного процесса. Установлено, что наиболее сильная корреляционная связь прослеживается при клинически выраженной форме инфекции - с положительными результатами ПНР и ИФА, средняя - с положительными результатами культурального и цитологического исследования. При бессимптомном процессе выявляется сильная корреляционная связь - с положительными результатами ИФА, средняя - с ПЦР, слабая корреляция - с сочетанием положительных результатов культурального и цитологического исследований.

Впервые разработанный способ видовой ПЦР-детекции хламидий позволяет одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Ch.trachomatis и Chi.pneumoniae, а способ ПЦР-верификации участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды - фенотипические особенности возбудителя, выделенного от человека.

Впервые показана возможность молекулярно-генетического типирования штаммов Ch. trachomatis, выделенных от человека, методом ПЦР, что обеспечивает повышение информативности и упрощает исследование, по сравнению с существующими способами генотипирования.

Практическая значимость

нием модифицированных методов выявления хламидий с целью повышения их диагностической ценности для постановки диагноза.

Применение разработанной ПЦР-системы для видовой дифференциации хламидий, выделенных от человека, позволяет одновременно выявлять в биологической пробе ДНК Chi.pneumoniae и Ch.trachomatis.

Применение разработанной ПЦР-системы для верификации участка нук-леотидной последовательности ДНК криптической плазмиды Ch. trachomatis позволяет свести к минимуму наличие ложноотрицательных результатов при диагностике возбудителя.

Разработанный способ молекулярно-генетического типирования штаммов Ch. trachomatis, выделенных от человека, методом ПЦР позволяет в короткие сроки установить генотип возбудителя. Метод применим в стандартных лабораториях, оснащенных ПЦР-оборудованием, и адаптирован для рутинных исследований при хламидиозе.

Внедрение результатов работы

В результате выполненной работы получены три Патента РФ на изобретение: «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946 (зарегистрирован 10.04.2010); «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385945 (зарегистрирован 10.04.2010); «Способ генотипирования Chlamydia trachomatis» № 2443782 (зарегистрирован 27.02.12).

криптической плазмиды, а так же генетического типирования штаммов с целью дальнейшего использования в практике здравоохранения.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Впервые разработанные ПЦР-системы для диагностики хламидийной инфекции у людей позволяют одновременного выявлять в биологической пробе ДНК Chi.pneumoniae и Ch. trachomatis, а также верифицировать штаммы Ch.trachomatis с наличием, либо отсутствием участка нуклеотидной последовательности ДНК криптической плазмиды.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза 1.1.2. Методы обнаружения и дифференциации Chlamydia trachomatis

В диагностике урогенитального хламидиоза ведущую роль играют лабораторные исследования, поскольку только лабораторное подтверждение делает этиологический диагноз достоверным [61].Однако к выбору методов диагностики нет единого подхода. В настоящее время предложено большое количество лабораторных тестов, дающих разные результаты чувствительности и специфичности [8,22,23,24,25,26,32,36,37]. Каждый из них имеет свои преимущества и ограничения. Помимо сложностей в выборе лабораторного метода, с учетом предполагаемой локализации возбудителя и клинических проявлений, эффективность и достоверность диагностики зависит от условий забора материала, его доставки в лабораторию, материально-технического оснащения лабораторной базы, подготовки персонала, проводящего исследование, качества используемых реактивов и тест-систем и др. [29,38,39,43,45,46,50].

К основным методам лабораторной диагностики УГХ относят:

- выделение чистой культуры возбудителя в культуре клеток МсСоу, Heia, Vero и др.,

- идентификация цитоплазматических хламидийных включений в клинических образцах цитологическим методом в светооптическом микроскопе,

- выявление антигенов возбудителя в мазках с помощью специфических антител (реакция прямой и непрямой иммунофлуоресценции), либо методом иммуноферментного анализа (ИФА),

- электронная микроскопия,

- серологические исследования (ИФА),

- экспресс методы (иммунохроматография)

- молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), ДНК-гибридизация и др.).

Размножение хламидий в культуре клеток применяют для их выделения

из образцов биологического материала, количественной оценки инфекционно-

сти, получения чистых препаратов элементарных или ретикулярных телец, изучения метаболизма и анализа механизмов взаимодействия паразит-хозяин [47,49,56,59,60,117,118]. Принцип метода основан на выделении Ch. trachomatis из биологического материала после заражения им чувствительных живых клеток тканевых культур McCoy, Hela-229, L-929, ВНК-21 (клон В), Vero и др., предварительно обработанных антиметаболитами или цитостатиками. Детекция хламидий проводится по истечении инкубации (48-72 часа) с помощью окраски клеток культуры раствором Люголя, окраской по Романовскому-Гимзе, специфическими поли - или моноклональными антителами с флуоресцентной меткой к родоспецифическому и видоспециф

Информация о работе

Гречишникова, Ольга Геннадьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гречишникова, Ольга Геннадьевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология