Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние гемостаза на фоне введения биологически активной добавки "Медвежий жир" при экзо- и эндогенной тромбинемии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Состояние гемостаза на фоне введения биологически активной добавки "Медвежий жир" при экзо- и эндогенной тромбинемии"

На правах рукописи

Калашникова Светлана Петровна

Состояние гемостаза на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир» при экзо- и эндогенной тромбинемии

(экспериментальное исследование)

03.03.01 - Физиология

005534606

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ОКТ 2013

Челябинск-2013

005534606

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ханты-Мансийского автономного округа - Югры «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия»

доктор медицинских наук, профессор Соловьев Владимир Георгиевич

доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры анатомии, физиологии человека и животных ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный

педагогический университет», Ефимова Наталья Владимировна

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский

государственный медицинский

университет»,

Тишевская Наталья Викторовна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Защита состоится «24» октября 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03, созданного на базе ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. Ленина, 69, ауд. 116.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет».

Автореферат разослан «_» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^ _

доктор биологических наук __ />(л ' ' П.А. Байгужин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интегративная роль системы гемостаза в реализации транспортной функции крови многообразна. В условиях физиологической нормы она проявляется способностью к поддержанию жидкого состояния крови и быстрому тромбированию поврежденных участков сосудов, что требует слаженного взаимодействия всех компонентов гемостаза. При реакциях напряжения происходит ускорение непрерывно протекающего свертывания, нередко выходящее за рамки нормокоагулемии и проявляющееся тромбогеморрагическими осложнениями (Шахматов И.И., Киселев В.И., 2010; Датиева Ф.С. с соавт., 2011; Козяева Е.А., 2011; Липай Н.В., 2011; Rau J.C., 2007). Возможность развития последних зависит не только от интенсивности возмущающего воздействия, но и функционального потенциала отдельных звеньев регуляции агрегатного состояния крови, что требует поиска новых средств направленного воздействия на гемостаз.

Усилия специалистов в области гемостазиологии до сих пор в большей степени были направлены на борьбу с последствиями усиленного тромбиногенеза (тромбин является основным энзимом плазмокоагуляции). В клинической практике широко используются прямые ингибиторы тромбина (Николаева JI.C., 2011; Суханова Г.А. с соавт., 2011; Crawley J.T.B, е.а., 2007), антагонисты витамин K-зависимых факторов свертывания (Галявич A.C., 2012; Кропачева Е.С., 2012), уже достаточно известные (ацетилсалициловая кислота) и новые антиагреганты, в основе механизма действия которых лежит их способность блокировать GP Ilb/IIIa- (Ткачева О.Н. с соавт., 2011; Ferguson J., 2004), P2Y,2- (Зиганшин А.У., 2010; Zafar M.U. е.а., 2010), PAR-1- и PAR-4-рецепторы (Люсов В.А., Таратухин Е.О., 2011; Goto S.H. е.а., 2010) клеточных мембран тромбоцитов. Ряд данных свидетельствует о позитивном эффекте ингибиторов самосборки фибрина и тромбиногенеза животного и растительного происхождения, обладающих антитромбогенной в отношении сосудистой стенки, и антиагрегационной активностями (Бушин А.Е., 2009; Дрозд H.H. с соавт., 2011; Калинина Т.Б. с соавт., 2011), регуляторных пептидов (Калинин Е.П. с соавт., 2011; Тарнуев В.А., 2011).

Вместе с тем, применение различных антикоагулянтов и антиагрегантов в профилактических целях ограничивается рядом побочных эффектов -кумулятивными свойствами (что требует постоянного контроля за гемокоагуляцией), возможностью развития тромбоцитопений, тромбоэмболий при отмене препарата, нейтропений, апластических анемий и других осложнений (Шилов A.M., 2012; Patrono С., Rocca В., 2008).

В исследованиях, проведенных за последние десятилетия, была обоснована возможность снижения интенсивности внутрисосудистого свертывания крови с помощью неспецифических воздействий, в частности, синтетическими и природными антиоксидантами. Так, в условиях эксперимента и клиники было установлено, что предварительное введение витаминов-антиоксидантов, а также некоторых ненасыщенных жирных кислот

ограничивает вероятность тромбообразования (Шаповалова Е.М., 2008; Громова O.A. с соавт., 2011; Barden А. е.а., 2011; Larson M.K. е.а., 2011).

Вместе с тем, в естественных условиях антиоксиданты содержатся в источниках растительного и животного происхождения. Среди последних выделяются т.н. «животные жиры» - природные микст-субстанции, обладающие достаточной концентрацией мононенасыщенных и полиненасыщенных (со-3 и со-6) жирных кислот, а также жирорастворимых витаминов. Для настоящего исследования в качестве биологически активной добавки был выбран жир бурого медведя, широко используемый в нетрадиционной («народной») медицине в качестве средства, обладающего противовоспалительным, иммуностимулирующим и регенераторным эффектами, отличающегося высокой эффективностью и малой токсичностью при условии рационального употребления.

Учитывая тесную взаимосвязь гемостаза с липопероксидацией (Бышевский А.Ш., 2003; Богданова A.C. с соавт., 2012), данные об антиоксидантных свойствах липидных компонентов медвежьего жира (олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты, витамины А и Е), а также отсутствие сведений об их комплексном влиянии на гемостаз, нам представлялось перспективным изучить характер, направленность, а также возможные механизмы влияния БАД «Медвежий жир» (далее медвежий жир) на непрерывно протекающее свертывание крови в условиях физиологической нормы и при интенсивной индукции тромбиногенеза.

Цель работы:

Изучить характер и механизмы влияния медвежьего жира на различные звенья гемостаза в условиях физиологической нормы и при экспериментальной тромбинемии различного происхождения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить состояние плазменного и клеточного гемостаза, а также ПОЛ в клетках крови лабораторных животных в условиях физиологической нормы на фоне дополнительного введения медвежьего жира.

2. Охарактеризовать влияние медвежьего жира на состояние плазменного и клеточного гемостаза, состояние ПОЛ и толерантность животных к тромбину при введении в кровоток тромбина (экзогенная тромбинемия).

3. Оценить влияние медвежьего жира на параметры тромбоцитарного (тромбоцитограмма) и плазменного гемостаза (АЧТВ, ПТВ, ТВ, AT-III, РКМФ, содержание фибриногена) в условиях эндогенной тромбинемии, вызываемой комбинированным стрессом и необратимой ишемией.

4. Исследовать влияние медвежьего жира на функциональное состояние сосудистой стенки в условиях экспериментальной ишемии (неполная окклюзия магистрального сосуда).

5. Охарактеризовать влияние медвежьего жира на содержание циркулирующих в плазме надмолекулярных фрагментов и биохимических маркеров стресса при тромбинемии различного генеза.

Научная новизна:

Экспериментальными исследованиями впервые установлено, что введение медвежьего жира в дозе 0,08 мл на 100 г массы тела животного, не оказывая существенного влияния на гемостаз в условиях физиологической нормы, повышает толерантность животных к тромбинемии экзогенного и эндогенного происхождения.

Впервые выявлено, что защитное действие медвежьего жира, проявляющееся ослаблением гемостатических сдвигов при тромбинемии, реализуется за счет изменения функционального состояния тромбоцитов, сосудистой стенки, коагуляционного и противосвертывающего потенциалов, а также ингибирования свободнорадикальных процессов в клетках крови.

Доказано, что введение медвежьего жира в условиях ускорения непрерывно протекающего свертывания крови ограничивает поступление в кровоток циркулирующих надмолекулярных фрагментов и развитие гиперкатехоламинемии.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Полученные данные расширяют фундаментальные представления о биологических эффектах медвежьего жира, в частности - его влиянии на различные компоненты гемостаза в условиях физиологической нормы и при запредельной активации свертывания крови.

Результаты исследования используются для подготовки студентов по специальности «Лечебное дело» в рамках дисциплин «Физиология», «Фармакология» на кафедрах нормальной и патологической физиологии, фармакологии, клинической фармакологии с курсом иммунологии и аллергологии Ханты-Мансийской Государственной Медицинской академии.

Материалы работы могут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями гемостазиологического профиля, занимающимися поиском новых средств направленного воздействия на компоненты системы регуляции агрегатного состояния крови.

Работа выполнена на базе кафедры медицинской и биологической химии Ханты-Мансийской Государственной Медицинской академии в рамках научной программы «Механизмы адаптации и гомеостаза у человека в норме и при патологии в условиях северных территорий» (регистрационный номер 01.2.00708367).

Положения, выносимые на защиту:

1. Медвежий жир, предварительно вводимый животным в дозах, адекватных рекомендуемым для человека, ослабляет последствия экзогенной тромбинемии, вызываемой введением в кровоток сериновой протеазы -тромбина, а также эндогенной тромбинемии, вызываемой комбинированным стрессом и необратимой окклюзией магистрального сосуда. Это проявляется снижением степени потребления тромбоцитов, факторов свертывания и антикоагулянтов, а также ускорением нормализации параметров тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза в динамике.

2. Ограничение интенсивности тромбиногенеза при введении медвежьего жира проявляется увеличением антиагрегационной активности сосудистой стенки и изменением ее противосвертывающего потенциала в условиях экспериментальной ишемии.

3. Протективный эффект медвежьего жира при различных видах тромбинемии, проявляющийся повышением толерантности животных к тромбину, связан с ослаблением процессов липопероксидации в клетках крови, уменьшением фоновой суммарной тромбопластической активности циркулирующих в плазме надмолекулярных фрагментов, прироста содержания тромбопластических субстанций в кровотоке в условиях активации гемостаза и лимитированием гиперкатехоламинемии.

Апробация и публикации:

Основные положения диссертационной работы доложены на XIV международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2009), российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И.Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (г. Челябинск, 2009), XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (г. Санкт-Петербург, 2011), на VI-oй Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (г. Москва, 2013). Результаты исследований опубликованы в материалах перечисленных научных форумов, в медико-биологических журналах (всего 13 публикаций). По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 119 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, а также списка использованных источников литературы (216 отечественных и 96 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В исследованиях в качестве экспериментальных животных использовались самцы нелинейных белых крыс 3,5-месячного возраста, весом 250-300 г.

Выбор животных был обусловлен следующим:

1. Для крыс разработан и многократно апобирован оптимальный рацион питания, сбалансированный по важнейшим пищевым компонентам (Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А, 1974; Бышевский А.Ш., Винокурова Е.А., Галян С.Л. и соавт., 2008).

2. Изучение состояния гемостаза под влиянием разнообразных воздействий проводится в подавляющем большинстве случаев на этих животных.

3. У крыс удобно отбирать пробы крови из яремной вены в количестве, достаточном для определения всех намеченных нами показателей — до 40 мл на 1 кг массы тела, не нарушая при этом гемостазиологических требований (Белозерцева И.В., Беспалов А.Ю., Большаков О.П. и соавт., 2003).

Число крыс в группах сравнения составляло 14. Учитывая сезонные сдвиги гемостаза и его зависимость от метеофакторов, в каждую серию экспериментов включали контрольную группу (Балуда В.П. и др., 1980; Папаян Л.П., 2003).

Пробы крови брали в шприц из обнаженной овальным разрезом яремной вены, в симметричную вену осуществляли инъекции. Рану закрывали кожным швом (кетгут).

Кровь для коагулологических исследований стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9, а также 0,1% забуференным раствором глутаральдегида (для исследования морфологии тромбоцитов).

Изучаемой субстанцией являлась БАД «Медвежий жир» (ООО «Багира», г. Оренбург).

Экспериментальные модели.

Экзогенную тромбинемию вызывали внутривенным введением в яремную вену взвеси тромбина (1,67 N114/100 г массы) в физиологическом растворе хлорида натрия, не вызывающем гибель животных. Пробы крови отбирали через 0,5 и 1 ч.

Эндогенную тромбинемию воспроизводили, используя комбинированный (гипотермия + физическая нагрузка) стресс. Для этого животных помещали в емкости с водой при температуре воды +15°С на 30 минут, заставляя животных двигаться. Пробы крови отбирали до воздействия, а также спустя 0,1, 1 и 3 ч после его окончания (Никулина Е.Г. 2011).

Другую модель эндогенной тромбинемии (окклюзионную ишемию) моделировали путем перевязки одной из яремных вен наркотизированным животным с забором крови из симметричной вены через 4 минуты.

Воссоздание «мягкого» прессорного воздействия на сосудистую стенку, с целью изучения ее антитромбогенных свойств, осуществляли путем временного клипирования одной из яремных вен с забором крови из симметричной вены через 4 минуты (Полякова Е.А., 2004).

Выбор дозы изучаемых субстанций.

Животные содержались на смешанном сбалансированном рационе с оптимальным соотношением белков, липидов и углеводов. В состав суточных порций опытных групп дополнительно вводили медвежий жир в дозе 0,08 мл на 100 г массы тела животного. Пероральное введение крысам медвежьего жира осуществляли в течение 14 суток, руководствуясь инструкцией по применению медвежьего жира.

Дозы изучаемой субстанции для животных были адекватны рекомендуемым дозам для человека, не вызывающим токсических эффектов. Контрольные группы препарат дополнительно не получали.

Лабораторные методы исследования.

Состояние параметров коагуляционного гемостаза (протромбиновое время, тромбиновое время, активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время, содержание фибриногена) оценивали на коагулографе «Соппау» (Польша), определение активности антитромбина-III и растворимых комплексов мономерного фибрина проводили согласно инструкций к наборам фирмы «Технология-стандарт» (г. Барнаул).

Изучение содержания в сыворотке крови адреналина проводили методом иммуноферментного анализа.

Количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе «МахМ» («Coulter», США), а также с помощью прямой микроскопии в камере Горяева (Шитикова A.C., 2000). В последнем случае для оценки функционального состояния тромбоцитов изучали содержание дискоцитов и активированных форм (в абсолютных и относительных значениях), а также число клеток, вовлеченных в образование агрегатов (в % от общего количества тромбоцитов).

Общую коагуляционную активность тромбоцитов (ОКАТ) исследовали, согласно описанию патента (Бышевский А.Ш. и др., 1996).

Толерантность к тромбину оценивали по степени уменьшения количества содержания фибриногена через 30 минут после введения в кровь тромбина (Бышевский А.Ш. и соавт., 2003). t

Параметры состояния системы эритрона изучали с использованием выше названного гематологического анализатора.

Скорость ПОЛ в клетках крови оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), определяя оптическую плотность гептановой фазы при Я.=232 нм и флуорометрически. Для этого липиды эритроцитов и тромбоцитов экстрагировали 40-кратным избытком спирто-эфирной смеси в соотношении 3:1 по объему (Гагаро М.А., 2007).

Определение суммарного содержания микросгустков, микроагрегатов и фрагментов клеточных мембран (ММФ) в плазме крови проводили, согласно описанию (Никулина Е.Г., 2011).

Гемокоагуляционную активность надмолекулярных частиц плазмы крови определяли с использованием ультрацентрифуги «Allegra 64R» («Beckman Coulter», США) согласно описанию (Бышевский А.Ш., 1996).

Для исследования тромбопластической активности цельных клеток эритроциты трижды отмывали охлажденным забуференным 0,9% раствором NaCl в соотношении 1:9, после чего подбирали разведения, максимально укорачивающие время свертывания в системе АЧТВ. Для изучения тромбопластической активности разрушенных эритроцитов клетки подвергали деструкции. Деструкцию отмытых забуференным раствором 0,9% NaCl клеток производили осмотическим шоком: взвесь в предварительно подобранной пропорции помещали на 10 мин в раствор дистиллированной воды, после чего приступали к исследованию тромбопластической активности в системе: 0,1 мл

РРР (каолин-кефалиновая смесь) + 0,02 мл каолина + 0,1 мл исследуемой взвеси (или дистиллированной воды в контроле) + 0,1 мл СаС12.

Результаты исследований, имеющие цифровое выражение, анализировали методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений с использованием программы Microsoft Excel, вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (m) и среднеквадратичное отклонение (о). Для оценки достоверности отличий вычисляли доверительный коэффициент Стьюдента (t) и степень вероятности (р). Различия считали достоверными при значениях степени вероятности (р)<0,05. В таблицах приводятся значения величины ш.

Результаты исследований и их обсуждение

Состояние гемостаза у животных на фоне дополнительного введения биологически активной добавки «Медвежий жир»

Данные литературы, свидетельствующие о способностях микст природных субстанций (в том числе животного происхождения) оказывать влияние на процесс свертывания крови (Васьковский В.Е., 2010; Калинин Е.П., 2011; Лишневская В.Ю., 2011) позволили нам предположить, что введение медвежьего жира может отразиться на состоянии свертывания крови.

Как оказалось, введение жира лабораторным крысам в течение 14 дней не оказало существенного влияния на биохимический компонент гемостаза (рис. 1).

ТВ, с ОКАТ, % АФ, % Дискоциты, % AT-III, %

Ш Без введения МЖ И На фоне введения МЖ

Рис. 1. Состояние показателей гемостаза у животных, получавших и не получавших медвежий жир. Примечание: Знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с соседним столбцом

Наблюдалось умеренное снижение количества тромбоцитов (на 9,4%; р<0,05) и их общей коагуляционной активности, увеличение относительного

содержания дискоцитов (на 14,5%; р<0,05), а также уменьшение числа активированных форм. Существенно (на 46,9%; р<0,05) возросла активность антитромбина-III, что привело к приросту концентрации фибриногена, удлинению тромбинового времени (на 38,5%; р<0,05) и уменьшению содержания РКМФ (р<0,05).

Ослабление функциональной активности тромбоцитов на фоне приема медвежьего жира сопровождалось снижением интенсивности свободнорадикальных процессов в клетках (уменьшение количества ТБК-РП на 11,5%; р<0,05) (табл. 1). Схожая направленность наблюдалась и в эритроцитах - снижение уровня диеновых конъюгатов (на 23,5%; р<0,05) и ТБК-РП (на 14,3%; р<0,05).

Таблица 1

Показатели липопероксидации в клетках крови и морфофункциональное состояние эритроцитов на фоне введения медвежьего жира (по 14 крыс в

группе), М±т

Показатели Без введения МЖ На фоне введения МЖ

Тромбоциты:

ДК, А/мгЛП 0,18±0,02 0,16±0,03

ТБК-РП, ед/мг ЛП 0,61 ±0,03 0,54±0,02*

Эритроциты:

ДК, А/мг ЛП 0,17±0,02 0,13±0,01*

ТБК-РП, ед/мг ЛП 0,56±0,02 0,48±0,02*

Примечание: Знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с интактным контролем.

На фоне введения медвежьего жира изменились показатели, характеризующие состояние системы эритрона. Согласовано уменьшилось содержание эритроцитов (на 14,1%; р<0,05) и гемоглобина (на 6,3%; р<0,05), а также показатель гематокрита (на 6,6%; р<0,05). Это сопровождалось увеличением среднего объема клеток (на 7,1%; р<0,05), их насыщения гемоглобином (на 9,1%; р<0,05) и степени анизоцитоза (на 16,5%; р<0,05). Следует отметить тот факт, что перечисленные сдвиги не выходили за пределы физиологических границ.

Таким образом, 14-дневное пероральное введение медвежьего жира ослабляет интенсивность непрерывно протекающего свертывания крови, вызывая умеренный гипокоагулемический эффект, и уменьшая степень активации тромбоцитов. Последнее, позволяет предполагать тот факт, что в кровотоке животных, получавших исследуемую добавку, присутствует меньшее количество тромбоцитактивирующих эффекторов, в частности, тромбопластических субстанций.

Результаты наших исследований показали, что у животных, получавших медвежий жир, суммарная тромбопластическая активность плазмы крови ниже, чем в контроле. Следовательно, его введение отражается на интенсивности

деструкции клеток крови и эндотелия сосудов, являющихся важнейшими источниками фрагментов клеточных мембран в кровотоке.

Это было подтверждено при изучении общей коагуляционной активности цельных и разрушенных эритроцитов. Выяснилось, что тромбопластическая активность цельных эритроцитов у животных, получавших медвежий жир, оказалась на 12% (р<0,05) ниже, чем в контроле. Более низкую тромбопластическую активность, чем в контроле проявили и гемолизированные эритроциты крыс опытной группы. Причем, это различие (24,6%; р<0,05) оказалось в 2,1 раза более выражено, чем в случае с цельными эритроцитами.

Таким образом, ограничение ПОЛ, вызываемое введением медвежьего жира, сказывается на тромбопластической активности цельных и разрушенных клеток, а, следовательно, на реологии крови и поддержании ее гемостатического потенциала.

Состояние гемостаза в условиях экзогенной тромбинемии на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир»

Охарактеризовав гемокоагуляцию и клеточный гемостаз при введении медвежьего жира на фоне физиологической нормы, в следующей серии исследований мы изучили его воздействие на те же процессы в условиях экзогенной тромбинемии. Последнюю моделировали введением в яремную вену взвеси тромбина в 0,9%-м растворе NaCl в дозе, не вызывающей гибель животных (1,67 NIH/100 г массы).

Таблица 2

Состояние плазмокоагуляции у животных, получавших и не получавших медвежий жир, через 0,5 ч после введения взвеси тромбина (по 14 крыс в

группе), М±т

Показатели Интактный контроль Контроль на фоне МЖ Тромбин вводили

без МЖ на фоне МЖ

АЧТВ, с 25,3±0,6 23,8±1,0 28,7±1,1* 26,1±1,6и

ПТВ, с 21,3±0,7 22,9±2,1 23,7±1,0* 20,8±1,0"°

ТВ, с 19,7±0,8 23,2±0,6* 23,0±1,0* 24,1±0,9

ФГ, г/л 4,2±0,3 3,3±0,2* 2,2±0,1* 3,2±0,4ии

РКМФ, мг/% 3,6±0,2 3,2±0,1* 6,9±0,3* 4,1±0,3*и

AT- III, % 108,8±13,8 158,2±9,0* 86,8±2,4* 92,4±1,7*и

TT, % - - 100,3±6,2 185,1±9,5ÜÜ

Примечание: Знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с ИК, знаком -по сравнению с показателями ИМЖ, знаком - по сравнению с показателями ИМЖ и ОК, знаком ш - с показателями ОК.

Через 0,5 ч после воздействия у контрольных животных наблюдалась гипокоагулемия потребления (табл. 2). Удлинились все клоттинговые тесты -ПТВ на 11,1% (р<0,05), АЧТВ - на 13,4% (р<0,05), тромбиновое время - на 16,8%; (р<0,05). Содержание фибриногена упало в 1,9 раза, что сопровождалось

приростом уровня РКМФ (на 91,6%; р<0,05) и снижением активности антитромбина-Ш - на 20,2% (р<0,05).

Одновременно развилась выраженная тромбоцитопения с увеличением относительного числа активированных форм (на 73,1%; р<0,05) (рис. 2) и уменьшением содержания дискоцитов (в 6,8 раза), в 10,2 раза увеличилось относительное содержание клеток, вовлеченных в агрегаты.

Рис. 2. Динамика показателей тромбоцитограммы у животных, получавших и не получавших медвежий жир, через 0,5 и 1 ч после введения взвеси тромбина: а — общее содержание тромбоцитов, б - содержание активированных форм. Примечание: знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с И К, знаком 0 - по сравнению с показателями ИМЖ, знаком - по сравнению с показателями ИМЖ и ОК,00 - с показателями ОК

Через 1 гипокоагулемии

прежнем уровне при удлиненном тромбиновом времени (рис. 3) и признаками продолжающегося потребления антитромбина-Ш.

ч у животных контрольной группы нивелирования признаков не наблюдалось: содержание фибриногена осталось на

ФГ, г/л

5 -

4 -3

2 -]

О -

без воздействия

- на фоне МЯ

- на фоне МЖ

без воздействия

а б

Рис. 3. Динамика показателей плазмокоагуляции у животных, получавших и не получавших медвежий жир, через 0,5 и 1 ч после введения взвеси тромбина: а - содержание фибриногена, б - показатель тромбинового времени. Примечание: как к рис. 2

В группе опытных животных, через 0,5 ч также наблюдалась коагулопатия потребления, но степень ее была менее выражена, чем в контроле: оставались неизменными ПТВ, тромбиновое время и содержание фибриногена, а активность АТ-Ш оказалась выше, чем в контрольной группе. Прирост РКМФ составил лишь 28% (р<0,05) (в контроле - 92%; р<0,05).

Со стороны тромбоцитарного гемостаза через 0,5 ч снизилось содержание тромбоцитов, но в значительно меньшей степени, чем в контрольной группе (лишь на 45,4%), ниже оказался прирост содержания активированных форм, а уровень дискоцитов уменьшился всего в 2,9 раза (в контроле - 6,8 раза). Количество клеток, вовлеченных в образование агрегатов, выросло в 4,9 раза, т.е. значительно в меньшей степени, чем в контроле.

Через 1 ч у крыс, получавших медвежий жир, обнаружилось незначительное снижение концентрации фибриногена, что сопровождалось удлинением АЧТВ. В целом же потенциал гемостатического каскада, как и противосвертывающей системы, оставались высокими (судя по тестам ПТВ, тромбинового времени и содержанию антитромбина-Ш).

О позитивном эффекте медвежьего жира свидетельствует и интегральный показатель адекватности ответа системы гемостаза на введение прокоагулянта -, тест толерантности к тромбину. Согласно математическому расчету, у животных опытной группы толерантность возросла в 1,8 раза.

Предположение о том, что одним из механизмов эффекта медвежьего жира при тромбинемии является ограничение активации и вовлечения клеток крови в свертывающий каскад за счет торможения процессов перекисного окисления липидов, подтвердилось следующими результатами.

Введение тромбина животным контрольной группы привело к приросту содержания в тромбоцитах диеновых конъюгатов (к 0,5 ч - на 61%; р<0,05) и ТБК-РП (к 1 ч - на 45,9%; р<0,05), т.е. активировало свободнорадикапьные процессы в клетках (табл. 3). Схожие по направленности сдвиги были обнаружены в эритроцитах.

Таблица 3

Состояние липопероксидации в клетках крови у животных, получавших и не получавших медвежий жир, через 0,5 и 1 ч после введения взвеси тромбина (по

14 крыс в группе), М±т

Показатели Интактный контроль Контроль на фоне МЖ Тромбин вводили

без МЖ | на фоне МЖ

Тромбоциты:

ДК, А/мг ЛП 0,18±0,02 0,16±0,03 0,29±0,02* (0,24*0,01)* 0,22±0,02*" (0,20±0,03)

ТБК-РП, ед/мг ЛП 0,61±0,03 0,54±0,02* 0,85±0,05* (0,89±0,04)* 0,72±0,04*" (0,66±0,03)*°

Эритроциты:

ДК, А/мг ЛП 0,17±0,02 0,13±0,01* 0,38±0,03* (0,32±0,03)* 0,26±0,03*и (0,17±0,03)ш

ТБК-РП, ед/мг Л П 0,56±0,02 0,48*0,02* 0,93±0,04* (0,96±0,05)* 0,68±0,04*" (0,57±0,03)*°

Примечание: как к табл. 2. В скобках приведены показатели через I ч после введения тромбина

Дополнительное введение в рацион медвежьего жира заметно ограничило прирост продуктов пероксидации в условиях тромбинемии. Более того, содержание диеновых конъюгатов в тромбоцитах и эритроцитах к 1 ч после

введения прокоагулянта возвращалось к исходным значениям. Полученные данные косвенно свидетельствуют о том, что изучаемая биодобавка повышает антиоксидантный потенциал, и, следовательно, вполне объяснимо ограничивает ускорение непрерывно протекающего свертывания крови.

Установлено, что суммарное содержание микросгустков, микроагрегатов и фрагментов клеточных мембран у контрольных животных через 0,5 ч после введения тромбина, было в 1,3 раза выше, чем у животных, получавших медвежий жир, а через 1 ч - более, чем в 3 раза. Существенно, что у животных опытной группы значительно возрастает и скорость их элиминации из кровотока.

Исследуя состояние системы эритрона в условиях экзогенной тромбинемии, мы нашли, что содержание эритроцитов у контрольных животных к 1 ч опыта достоверно снизилось. Данный факт, вероятно, связан с развитием гемолиза и вовлечением разрушенных эритроцитов в пул ММФ.

У животных, получавших медвежий жир, признаки гемолиза отсутствовали, наблюдался компенсаторный выброс молодых клеточных форм в кровоток, что свидетельствует о большей адекватности реакции системы эритрона на воздействие, изменяющее потенциал процессов газообмена.

Таким образом, введение медвежьего жира ограничило развитие коагулопатии потребления, тромбоцитопении и тромбоцитопатии, а также повысило толерантность животных к введению тромбина.

Состояние гемостаза в условиях эндогенной тромбинемии на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир»

В следующих экспериментах мы изучили влияние медвежьего жира на состояние гемостаза при эндогенной тромбинемии, индуцируя тромбиногенез посредством воспроизведения стресс-воздействий.

Для воссоздания эндогенной тромбинемии были использованы уже апробированные модели комбинированного стресса и необратимой ишемии магистрального сосуда.

В опыте с комбинированным стрессом животные испытывали двойную нагрузку - физическую, связанную с погружением в воду и необходимостью держаться на плаву, и гипотермическую (температура воды составила + 15°С).

Выявлено, через 0,1 ч после окончания воздействия у животных контрольной группы произошла существенная интенсификация тромбиногенеза. На фоне укорочения АЧТВ (на 24,9%; р<0,05) и ПТВ (на 16,8%; р<0,05) наблюдалось удлинение тромбинового времени. На 52% выросла концентрация РКМФ (р<0,05) и снизилась концентрация фибриногена. Компенсаторно увеличилась активность антитромбина-Ш (на 52,8%; р<0,05).

К 1 ч признаки гипокоагулемии усугублялись в еще большей степени (по тестам ПТВ и тромбинового времени), одновременно обнаружилось интенсивное потребление антитромбина-Ш (снижение активности по сравнению с 0,1 ч - в 2,3 раза).

без воздействия 0.1 ч

ВО'ЦСНСТВНЯ

а б

Рис. 4. Динамика изменения показателей плазмокоагуляции у животных, получавших и не получавших медвежий жир, через 0,1; 1 и 3 ч после воспроизведения комбинированного стресса: а - содержание РКМФ, б - содержание фибриногена. Примечание: Знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с ИК, знаком 0 - по сравнению с ОК

К 3 ч на фоне нормального (исходного) содержания фибриногена и активности антитромбина-Ш, показатель тромбинового времени оставался повышенным на 39,3% (р<0,05), что, видимо, связано с высоким содержанием продуктов паракоагуляции.

Таким образом, стресс-воздействие в течение всего наблюдаемого периода вызвало у интактных животных ускорение непрерывно протекающего свертывания крови.

У животных, получавших медвежий жир, последствия стресс-воздействия со стороны коагуляционного гемостаза были выражены в меньшей степени. Через 0,1 ч, как и в течение всего эксперимента, АЧТВ не отличалось от исходных цифр. Содержание РКМФ и показатель тромбинового времени на всех этапах было меньше, чем в контрольной группе, а к 3 ч оба достигли первоначальных значений. Ни на одной временной точке не отмечено возрастание уровня фибриногена (рис. 4). Изначально высокий потенциал антитромбина-Ш расходовался адекватно, препятствуя запредельному ускорению непрерывно протекающего свертывания крови в плазме крови опытных животных.

Со стороны тромбоцитарного гемостаза, у контрольных животных наблюдалось повышение содержания тромбоцитов, которое сохранялось к 1 ч и превосходило исходный показатель на 34,3% (р<0,05). Несмотря на это, относительное количество дискоцитов на первых двух этапах эксперимента было сниженным, а содержание активированных форм увеличивалось (на 71,7%; р<0,05). Кроме того, до 1 ч сохранялось повышенным число агрегатообразующих клеток.

У животных, получавших медвежий жир, прироста содержания тромбоцитов не наблюдалось, более того, к 3 ч их уровень даже снизился.

Существенно, что относительное количество дискоцитов уменьшилось в меньшей степени, чем в контроле, а абсолютное содержание активированных форм повысилось лишь на начальном этапе эксперимента. Кроме того, у животных данной группы на протяжении всего эксперимента не изменялось число агрегатообразующих клеток.

Известно, что важнейшим индуктором образования тромбина в условиях стресса является избыточный выброс катехоламинов. Нами оценена в динамике содержание адреналина в сыворотке крови животных обеих групп наблюдения.

Установлено что 30-минутное воздействие комбинированного стресса активирует повышенный выброс и последующее расходование пула катехоламинов в контрольной группе. Через 0,1 ч (то есть, практически сразу после окончания возмущающего воздействия) концентрация адреналина снизилась в 2,1 раза, в дальнейшем возрастала, а к 3 ч превосходила исходные значения на 25,2% (рис. 5).

без воздействия 0,1ч 1ч Зч

контроль —■—на фоне Мж]

Рис. 5. Динамика содержания адреналина в плазме крови после воспроизведения стресса

Иная реакция наблюдалась у животных опытной группы. На протяжении всех временных точек адреналинемия оставалась на постоянном уровне. При этом исходное содержание стрессорного гормона (то есть до воздействия) в опытной группе оказалось ниже на 44,6%, чем в контроле.

Из этого следует, что одним из механизмов протективного влияния медвежьего жира на параметры гомеостаза является их антистрессорная способность, то есть высокая толерантность к интенсивным возмущающим воздействиям.

Для подтверждения данного факта, мы провели дополнительное исследование, провоцируя развитие эндогенной тромбинемии путем необратимой окклюзии крупного магистрального сосуда.

Воспроизведение ишемии у животных контрольной группы привело к ожидаемым для данной экспериментальной модели сдвигам (рис. 6). Со стороны тромбоцитарного гемостаза отмечался прирост общего количества тромбоцитов (на 43,3%; р<0,05) за счет активированных форм. Их абсолютное число увеличилось в 2 раза, а относительное возросло на 18% (р<0,05).

Состояние плазмокоагуляции характеризовалось приростом уровня фибриногена и активацией антитромбина-Ш. Как результат - рассогласование показателей клоттинговых тестов - удлинение АЧТВ (в 3 раза), и ТВ (почти в 2 раза), укорочение ПТВ. Иными словами, ишемия в данной группе животных вызвала ускорение непрерывно протекающего свертывания крови.

□ик ■ пыж иок оомж

А(Ж%

Рис. 6. Состояние параметров гемостаза у животных, получавших и не получавших медвежий жир после необратимой ОККЛЮЗИИ магистрального сосуда. Примечание: Знаком 4 отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с ИК, знаком * - по сравнению с показателями ИМЖ и ОК,011 - с показателями ОК

В опытной группе не претерпели изменений следующие показатели: общее количество тромбоцитов, содержание фибриногена и антитромбина-Ш, АЧТВ и ПТВ. Относительное содержание дискоцитов, как и в контрольной группе, уменьшилось, но составило 44,5% (р<0,05) (в контроле - 38,8%; р<0,05), абсолютный прирост активированных форм составил 53% (р<0,05) (в контроле — 100%; р<0,05). Среди показателей плазменного гемостаза наблюдалось лишь укорочение тромбинового времени.

Таким образом, дополнительное введение медвежьего жира повышает противосвертывающий потенциал плазмы крови и способствует минимизации последствий ускорения непрерывно протекающего свертывания крови при повреждении магистрального сосуда.

Состояние сосудистого компонента гемостаза при обратимой ишемии на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир»

Для оценки функционального статуса сосудистой стенки моделировалась обратимая окклюзия магистрального сосуда (Полякова Е.А., Дранишников Н.В., Власов Т.Д., 2004). После воздействия из симметричной яремной вены отбирали кровь и оценивали параметры гемостаза. При этом, часть животных в течение 14 дней до проведения опыта получала в составе рациона медвежий жир.

В группе контрольных животных произошло существенное увеличение количества тромбоцитов (в 1,5 раза), одновременно снижалось содержание дискоцитов (рис. 7). Прирост относительного числа активированных форм составил 51,2% (р<0,05), а их абсолютное содержание возросло в 2,3 раза. Увеличилось и количество клеток, вовлеченных в образование агрегатов. Со стороны плазменного гемостаза наблюдался прирост антитромбиновой активности, удлинение всех «временных» параметров, увеличение содержания фибриногена, уменьшение содержания РКМФ.

1

□ 1К !С 1?.Г/К

1701) г 1500

I I 1ттгнтг|

□ ИК ШИМЖ ШОК ЫОМЖ

Рис. 7. Состояние параметров гемостаза на фоне введения медвежьего жира после

обратимой ОККЛЮЗИИ. Примечание: знаком * отмечены достоверно отличающиеся показатели (р<0,05) по сравнению с ИК, знаком *" - по сравнению с показателями ИМЖ и ОК

У животных, получавших медвежий жир, воздействие не вызвало столь выраженной активации тромбоцитов. Относительное содержание активированных форм выросло лишь на 34,2% (р<0,05), а абсолютное - в 1,8 раза. При этом количество клеток, вовлеченных в агрегатообразование, не изменилось, а увеличение общего числа тромбоцитов составило 31,0% (р<0,05) (в контроле - 51,2%, р<0,05).

На фоне незначительных гиперкоагуляционных сдвигов (укорочение АЧТВ и ПТВ, уменьшение содержания фибриногена, увеличение содержания РКМФ), наблюдалось адекватное расходование антитромбина-111 - достаточное для того, чтобы состояние плазмокоагуляции не выходило за рамки непрерывно протекающего свертывания крови. Об этом же свидетельствует и более низкий прирост показателя тромбинового времени.

Данные результаты свидетельствуют о том, что предварительное введение медвежьего жира способствует более оптимальной реализации возможностей противосвертывающего потенциала сосудистой стенки.

Таким образом, дополнительное введение медвежьего жира ослабляет интенсивность тромбиногенеза в условиях физиологической нормы и уменьшает последствия тромбинемии при реакциях напряжения. Это связано со способностью медвежьего жира уменьшать поступление в кровоток тромбопластических субстанций (за счет антиоксидантных свойств) и ограничивать реализацию возмущающих стресс-реакций. Существенно, что точками приложения медвежьего жира в этих условиях являются все компоненты гемостаза.

выводы

1. Медвежий жир (биологически активная добавка животного происхождения), вводимый перорально в дозах, адекватных рекомендуемым для человека, уменьшает у животных степень активации тромбоцитов (количеств дискоцитов увеличивается на 14,5%) и вызывает умеренный гипокоагулемический эффект (прирост концентрации фибриногена на 25%, удлинение тромбинового времени (на 38,5%)) на фоне прироста антитромбинового потенциала (на 46,9%) (р<0,05).

2. Предварительное введение медвежьего жира ослабляет последствия экзогенной тромбинемии, вызываемой введением в кровоток тромбина. Это проявляется ограничением степени потребления тромбоцитов, факторов плазмокоагуляции и АТ-Ш, а также ускорением нормализации параметров гемостаза в динамике (АЧТВ, ПТВ, АТ-Ш, РКМФ, содержание фибриногена, количество тромбоцитов и клеток, вовлеченных в агрегатообразование) (р<0,05).

3. Введение медвежьего жира ослабляет эндогенную индукцию тромбиногенеза, вызываемую комбинированным стресс-воздействием и необратимой окклюзией магистрального сосуда. Это сопровождается ограничением адреналинемии (адреналинемия оставалась на постоянном уровне), прироста содержания активированных тромбоцитов, маркеров взаимодействия "тромбин - фибриноген" и развития вторичной гипокоагулемии, что способствует минимализации последствий ускорения непрерывно протекающего свертывания крови (р<0,05).

4. Снижение интенсивности тромбиногенеза на фоне введения медвежьего жира проявляется увеличением антиагрегационной активности интимы сосудов и оптимизацией расходования ее противосвертывающего потенциала.

5. Повышение толерантности животных к тромбину под влиянием медвежьего жира связано с уменьшением фоновой суммарной тромбопластической активности циркулирующих в плазме надмолекулярных фрагментов (в контроле - 27200 ЕА/мл, в плазме крови опытных животных -25680 ЕА/мл), уменьшением прироста содержания тромбопластических субстанций в кровотоке, а также ускорением их элиминации в условиях гипертромбинемии.

6. Ослабление коагуляционного потенциала тромбоцитов и эритроцитов, а также ограничение их потребления при тромбинемии на фоне введения медвежьего жира связано с торможением свободнорадикальных процессов в клетках крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Соловьев В.Г., Калашникова С.П., Никулина Е.Г., Никонова Л.Г., Гагаро М.А., Зиновьева A.B. Влияние субстанций природного происхождения на свертывание крови в эксперименте // Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - №4 (54). - С. 110-112.

2. Соловьев В.Г., Калашникова С.П., Никонова Л.Г., Гагаро М.А. Состояние системы гемостаза при комбинированном стрессе на фоне дополнительного приема медвежьего жира // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2012. - № 1. - С. 259-260.

3. Соловьев В.Г., Никонова Л.Г., Гагаро, М.А. Калашникова С.П., Нехороших А.Ю. Влияние медвежьего жира на состояние системы гемостаза в условиях окклюзионной ишемии // Медицинская наука и образование Урала. - 2012. -№4 - С. 92-94.

4. Калашникова С.П. Экспериментальное изучение эффектов медвежьего жира на процесс свертывания крови в условиях эндогенной тромбинемии // Медицинская наука и образование Урала. - 2013. - № 1. - С. 100-102.

5. Соловьев В.Г., Никонова Л.Г., Гагаро М.А., Калашникова С.П., Нехороших А.Ю. Изменение параметров гемостаза в условиях ишемии на фоне приема медвежьего жира // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №1.

Статьи в журналах и сборниках

6. Соловьев В.Г., Калашникова С.П., Никонова Л.Г. Влияние медвежьего жира на интенсивность гемостатических сдвигов при активации свертывания крови // Эколого-физиологические проблемы адаптации: Материалы XIV международного симпозиума. - г. Москва: РУДН, 2009 г. - С. 381-382.

7. Соловьев В.Г., Зиновьева A.B., Никулина Е.Г., Калашникова С.П. Диагностическое значение различных способов оценки содержания тромбоцитов при экзогенной тромбинемии // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: материалы Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. - Челябинск: ЧелГМА, 2009.-С. 185-187.

8. С.П. Калашникова, P.P. Галимов. Коррекция последствий тромбинемии препаратом медвежьего жира // Фундаментальная наука и клиническая медицина: материалы XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). — Санкт-Петербург: СПбГУ, 2011.-С. 57.

9. Соловьев В.Г., Никонова Л.Г., Гагаро М.А., Калашникова С.П. Состояние системы гемостаза в условиях обратимой ишемии на фоне приема медвежьего жира // Материалы VI-ой Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием). - г. Москва: 2013г. - С. 376-378.

10. Калашникова С.П. Состояние гемостаза у животных на фоне дополнительного введения медвежьего жира // Научный аспект. - 2013. - № 1. -С. 171-173.

Раздел главы в монографии

11. Гагаро М.А., Калашникова С.П. Природные цеолиты VII минералогической группы, их антиоксидантная активность и влияние на гемостаз // в монографии «О перспективах коррекции природными цеолитами гемостатических сдвигов». - Ханты-Мансийск: Издательский центр ХМГМИ, филиал ЮУНЦ РАМН. -2007.-С. 61-65.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АВР активированное время рекапыдификации

АДФ аденозиндифосфат

АОК клетки, вовлеченные в образование агрегатов

АТФ аденозинтрифосфат

АТ-Ш антитромбин-Ш

АЧТВ активированное частичное тромбопластиновое время

АФ активированные формы

БАД биологически активная добавка

ДК диеновые коньюгаты

ИК интактные контрольные животные

ИМЖ животные, получавшие МЖ без иных воздействий

ЛП липиды

МЖ медвежий жир

ММФ суммарное содержание микросгустков, микроагрегатов

фрагментов клеточных мембран

ОК животные контрольной группы после воздействия

ОКАТ общая коагуляционная активность тромбоцитов

ОМЖ животные опытной группы после воздействия

ПНЖК полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ перекисное окисление липидов

птв протромбиновое время

РКМФ растворимые комплексы мономерного фибрина

ТБК-АП продукты, взаимодействующие с тиобарбитуровой кислотой

ТВ тромбиновое время

тт толерантность к тромбину

ТФ тканевой фактор

ФГ фибриноген

На правах рукописи

Калашникова Светлана Петровна

Состояние гемостаза на фоне введения биологически активной добавки

«Медвежий жир» при экзо- и эндогенной тромбинемии

(экспериментальное исследование)

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал-макет подготовлен в редакционном отделе Издательского центра ХМГМА

Подписано в печать 2013 г. Формат 62x90/16

Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,15. Печать трафаретная. Тираж 100 экз. Заказ № .

Отпечатано полиграфическим отделом Издательского центра ХМГМА г. Ханты-Мансийск, ул. Мира, 40 тел. (3467) 324588

Ханты-Мансийская государственная медицинская академия 628011, Россия, ХМАО - Югра Тюменской области г. Ханты-Мансийск, ул. Мира, 40 Тел., факс (3467) 324588

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калашникова, Светлана Петровна, Ханты-Мансийск

ГБОУ ВПО ХМАО - Югры Ханты-Мансийская государственная медицинская академия

На правах рукописи

04201364377

Калашникова Светлана Петровна

СОСТОЯНИЕ ГЕМОСТАЗА НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ «МЕДВЕЖИЙ ЖИР» ПРИ ЭКЗО- И ЭНДОГЕННОЙ

ТРОМБИНЕМИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.Г. Соловьев

Ханты-Мансийск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................... 4

Глава 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................. 10

1.1. Современные представления о системе ^ гемостаза.........................................................................

1.2. Биологическая роль липидных компонентов медвежьего жира................................................................................. 25

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............... 38

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........... 43

3.1. Состояние гемостаза у животных на фоне дополнительного введения биологически активной добавки «Медвежий жир» .......... 43

3.2. Состояние гемостаза в условиях экзогенной тромбинемии на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир»... 47

3.3. Состояние гемостаза в условиях эндогенной тромбинемии на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир»... 55

3.4. Состояние сосудистого компонента гемостаза при обратимой ишемии на фоне введения биологически активной добавки «Медвежий жир»................................................................ 61

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................... 65

ВЫВОДЫ.......................................................................... 81

ЛИТЕРАТУРА.................................................................... 83

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АВР активированное время рекальцификации

АДФ аденозиндифосфат

АОК клетки, вовлеченные в образование агрегатов

АТФ аденозинтрифосфат

АТ-Ш антитромбин-Ш

АЧТВ активированное частичное тромбопластиновое время

АФ активированные формы

БАД биологически активная добавка

ДК диеновые коньюгаты

ИК интактные контрольные животные

ИМЖ животные, получавшие МЖ без иных воздействий

ЛП липиды

МЖ медвежий жир

ММФ суммарное содержание микросгустков, микроагрегатов и фрагментов клеточных мембран

ОК животные контрольной группы после воздействия

ОКАТ общая коагуляционная активность тромбоцитов

ОМЖ животные опытной группы после воздействия

ПНЖК полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ перекисное окисление липидов

ПТВ протромбиновое время

РКМФ растворимые комплексы мономерного фибрина

ТБК-АП продукты, взаимодействующие с тиобарбитуровой кислотой

ТВ тромбиновое время

ТТ толерантность к тромбину

ТФ тканевой фактор

ФГ фибриноген

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Интегративная роль системы гемостаза в реализации транспортной функции крови многообразна. В условиях физиологической нормы она проявляется способностью к поддержанию жидкого состояния крови и быстрому тромбированию поврежденных участков сосудов, что требует слаженного взаимодействия всех компонентов гемостаза. При реакциях напряжения происходит ускорение непрерывно протекающего свертывания, нередко выходящее за рамки нормокоагулемии и проявляющееся тромбогеморрагическими осложнениями (Шахматов И.И., Киселев В.И., 2010; Датиева Ф.С. с соавт., 2011; Хозяева Е.А., 2011; Липай Н.В., 2011; Rau J.C., 2007). Возможность развития последних зависит не только от интенсивности возмущающего воздействия, но и функционального потенциала отдельных звеньев регуляции агрегатного состояния крови, что требует поиска новых средств направленного воздействия на гемостаз.

Усилия специалистов в области гемостазиологии до сих пор в большей степени были направлены на борьбу с последствиями усиленного тромбиногенеза (тромбин является основным энзимом плазмокоагуляции). В клинической практике широко используются прямые ингибиторы тромбина (Ляпина Л.А. с соавт., 2011; Николаева Л.С., 2012; Суханова Г.А. с соавт., 2011а, 20116; Crawley J.T.B, е.а., 2007), антагонисты витамин К-зависимых факторов свертывания (Галявич A.C., 2012; Кропачева Е.С., 2012), уже достаточно известные (ацетилсалициловая кислота) и новые антиагреганты, в основе механизма действия которых лежит их способность блокировать GP Ilb/IIIa- (Ткачева О.Н. с соавт., 2011), P2Y12- (Зиганшин А.У., 2010; Angiolillo D.L., Capranazano P., 2008; Zafar M.U. e.a., 2010), PAR-1- и PAR-4-рецепторы (Люсов В.А., Таратухин Е.О., 2011; Goto S.H. e.a., 2010) клеточных мембран тромбоцитов. Ряд данных свидетельствует о позитивном эффекте ингибиторов самосборки фибрина и тромбиногенеза животного и растительного происхождения, обладающих антитромбогенной в отношении сосудистой

стенки, и антиагрегационной активностями (Бушин А.Е., 2009; Дрозд H.H. с соавт., 2011; Калинина Т.Б. с соавт., 2011), регуляторных пептидов (Тарнуев В.А., 2010; Калинин Е.П. с соавт., 2011).

Вместе с тем, применение различных антикоагулянтов и антиагрегантов в профилактических целях ограничивается рядом побочных эффектов -кумулятивными свойствами (что требует постоянного контроля за гемокоагуляцией), возможностью развития тромбоцитопений, тромбоэмболий при отмене препарата, нейтропений, апластических анемий и других осложнений (Шилов A.M., 2012; Patrono С., Rocca В., 2008).

В исследованиях, проведенных за последние десятилетия, была обоснована возможность снижения интенсивности внутрисосудистого свертывания крови с помощью неспецифических воздействий, в частности, синтетическими и природными антиоксидантами. Так, в условиях эксперимента и клиники было установлено, что предварительное введение витаминов-антиоксидантов, а также некоторых ненасыщенных жирных кислот ограничивает вероятность тромбообразования (Шаповалова Е.М., 2008; Вавилова Т.В. с соавт. 2011; Громова O.A. с соавт. 2011в; Кривошапко O.A., Попов A.M., 2011; Barden А. е.а., 2011; Larson M.K. е.а., 2011).

Вместе с тем, в естественных условиях антиоксиданты содержатся в источниках растительного и животного происхождения. Среди последних выделяются т.н. «животные жиры» - природные микст-субстанции, обладающие достаточной концентрацией мононенасыщенных и полиненасыщенных (со-3 и со-6) жирных кислот, а также жирорастворимых витаминов. Для наших исследований в качестве биологически активной добавки мы выбрали жир бурого медведя, широко используемый в нетрадиционной («народной») медицине в качестве средства, обладающего противовоспалительным, иммуностимулирующим и регенераторным эффектами, отличающегося высокой эффективностью и малой токсичностью при условии рационального употребления.

Учитывая тесную взаимосвязь гемостаза с липопероксидацией (Бышевский А.Ш., 2003; Богданова A.C. с соавт., 2012), данные об антиоксидантных свойствах липидных компонентов медвежьего жира (олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты, витамины А и Е), а также отсутствие сведений об их комплексном влиянии на гемостаз, нам представлялось перспективным изучить характер, направленность, а также возможные механизмы влияния БАД «Медвежий жир» (далее медвежий жир) на непрерывно протекающее свертывание крови в условиях физиологической нормы и при интенсивной индукции тромбиногенеза. Цель работы:

Изучить характер и механизмы влияния медвежьего жира на различные звенья гемостаза в условиях физиологической нормы и при экспериментальной тромбинемии различного происхождения. Задачи исследования:

1. Изучить состояние плазменного и клеточного гемостаза, а также ПОЛ в клетках крови лабораторных животных в условиях физиологической нормы на фоне дополнительного введения медвежьего жира.

2. Охарактеризовать влияние медвежьего жира на состояние плазменного и клеточного гемостаза, состояние ПОЛ и толерантность животных к тромбину при введении в кровоток тромбина (экзогенная тромбинемия).

3. Оценить влияние медвежьего жира на параметры тромбоцитарного (тромбоцитограмма) и плазменного гемостаза (АЧТВ, ПТВ, ТВ, AT-III, РКМФ, содержание фибриногена) в условиях эндогенной тромбинемии, вызываемой комбинированным стрессом и необратимой ишемией.

4. Исследовать влияние медвежьего жира на функциональное состояние сосудистой стенки в условиях экспериментальной ишемии (неполная окклюзия магистрального сосуда).

5. Охарактеризовать влияние медвежьего жира на содержание циркулирующих в плазме надмолекулярных фрагментов и биохимических маркеров стресса при тромбинемии различного генеза.

Научная новизна:

Экспериментальными исследованиями впервые установлено, что дополнительное введение в рацион медвежьего жира в дозе 0,08 мл на 100 г массы тела животного, не оказывает влияния на гемостаз в условиях физиологической нормы, повышает толерантность животных к тромбинемии экзогенного и эндогенного происхождения.

Впервые выявлено, что защитное действие медвежьего жира, проявляющееся ослаблением гемостатических сдвигов при тромбинемии, реализуется за счет изменения функционального состояния тромбоцитов, сосудистой стенки, коагуляционного и противосвертывающего потенциалов, а также ингибирования свободнорадикальных процессов в клетках крови.

Доказано, что введение медвежьего жира в условиях ускорения непрерывно протекающего свертывания крови ограничивает поступление в кровоток циркулирующих надмолекулярных фрагментов и развитие гиперкатехол аминеми и.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Полученные данные расширяют фундаментальные представления о биологических эффектах медвежьего жира в области физиологии гемостаза, в частности - его влиянии на различные компоненты свертывания крови в условиях физиологической нормы и при запредельной активации свертывания крови.

Результаты исследования могут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями гемостазиологического профиля, занимающимися поиском новых средств направленного воздействия на компоненты системы регуляции агрегатного состояния крови.

Результаты исследования используются в учебном процессе для подготовки студентов по специальности «Лечебное дело» в рамках дисциплин «Физиология», «Фармакология» на кафедрах нормальной и патологической физиологии, фармакологии, клинической фармакологии с курсом иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия».

Положения, выносимые на защиту:

1. Медвежий жир, предварительно вводимый животным в дозах, адекватных рекомендуемым для человека, ослабляет последствия экзогенной тромбинемии, вызываемой введением в кровоток сериновой протеазы -тромбина, а также эндогенной тромбинемии, вызываемой комбинированным стрессом и необратимой окклюзией магистрального сосуда. Это проявляется ограничением степени потребления тромбоцитов, факторов свертывания и антикоагулянтов, а также ускорением нормализации параметров тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза в динамике.

2. Ограничение интенсивности тромбиногенеза при введении медвежьего жира проявляется увеличением антиагрегационной активности сосудистой стенки и изменением ее противосвертывающего потенциала в условиях экспериментальной ишемии.

3. Протективный эффект медвежьего жира при различных видах тромбинемии, проявляющийся повышением толерантности животных к тромбину, связан с ослаблением процессов липопероксидации в клетках крови, уменьшением фоновой суммарной тромбопластической активности циркулирующих в плазме надмолекулярных фрагментов, прироста содержания тромбопластических субстанций в кровотоке в условиях активации гемостаза и лимитированием гиперкатехоламинемии.

ф Ф *

Работа выполнена на базе кафедры медицинской и биологической химии Ханты-Мансийской государственной медицинской академии в рамках научной

программы «Механизмы адаптации и гомеостаза у человека в норме и при патологии в условиях северных территорий» (регистрационный номер 01.2.00708367).

Апробация и публикации.

Основные положения диссертационной работы доложены на Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И.Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (г. Челябинск, 2009), XIV Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (г. Москва, 2009), XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (г. Санкт-Петербург, 2011), на У1-ой Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (г. Москва, 2013). Результаты исследований опубликованы в материалах перечисленных научных форумов, в медико-биологических журналах (всего 13 публикаций). По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 16 таблиц и 11 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, а также списка использованных источников литературы (217 отечественных и 96 иностранных).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные сведения о системе гемостаза

Система гемостаза является эволюциоино сложившимся, многокомпонентным защитным приспособлением организма. Она обеспечивает остановку кровотечений и поддержание крови в жидком состоянии. Физиологическое формирование сгустка и его лизис представляет собой ряд тщательно отрегулированных и сбалансированных взаимодействий между плазменными факторами, кофакторами ферментов, их регуляторами и различными клетками крови, а также эндотелием сосудов. Основным механизмом активации компонентов гемостаза является ограниченный протеолиз, при котором из неактивного предшественника образуется активный фермент, катализирующий процесс свертывания крови или лизис фибринового сгустка (Пантелеев М.А., 2008; Баландина А.Н., 2011; Бокерия Л.А., Прядко С.И., с соавт., 2011; 8сЬепопе М., 2004).

Как любая функциональная система, система гемостаза обладает свойством внезапной мобилизиуемости структурных элементов в соответствии с непрерывными функциональными требованиями, которые функция предъявляет структуре. При отсутствии этой потенциальной способности структур системы регуляции агрегатного состояния крови к внезапной мобилизуемости в любой аранжировке, моментальная реорганизация функциональной способности была бы невозможна, а приспособительный результат был бы несовершенен (Анохин П. К., 1978).

Функции гемостаза обеспечены взаимодействием трех его компонентов: сосудистой стенки, клеток крови и плазменных ферментных систем.

Первичный или сосудисто-тромбоцитарный гемостаз обеспечивается взаимодействием слоев сосудистой стенки и тромбоцитов. Ему принадлежит ведущая роль в начальной остановке кровотечения в зоне микроциркуляции. В основе первичного, или сосудисто-тромбоцитарного, гемостаза лежат:

- временный сосудистый спазм, сопровождающийся прекращением кровотечений;

- адгезия и агрегация тромбоцитов с образованием тромбоцитарной пробки;

- уплотнение тромбоцитарной пробки.

Результатом первичного гемостаза является образование тромбоцитарной пробки (тромба) в зоне повреждения капилляра. В этот период тромбоцитарный барьер проходим для жидкой части крови, а связи между тромбоцитами непрочны, поэтому принято говорить о фазе обратимой агрегации тромбоцитов.

Основным звеном клеточного гемостаза являются тромбоциты. Показано, что реализация его функций напрямую зависит от размерных параметров тромбоцитов (Шитикова A.C., 2000; Мининкова А.И., 2010; Зоренко В.Ю., 2011; Дмитриев В.В., 2012; Коркушко О.В., Лишневская В.Ю. 2012; Frimerman А., 1997). В состоянии покоя тромбоциты представляют собой дискоообразные безъядерные клетки диаметром 2-3 мкм, толщиной 0,8 мкм с гладкой цитоплазматической мембраной (рис. 1). Неактивированные тромбоциты содержат гранулы различной плотности, в которых находятся небелковые (АТФ, АДФ, серотонин) или белковые (фибриноген, фактор фон Виллебранда) вещества, необходимые для реализации их гемостатической функции (Савченко А.П., 2009; Бышевский А.Ш., 2010; Долгих В.В., 2011; Пенькова Е.В., 2011; Kolde H.J., 2004).

Тромбоциты активно поддерживают трофику и функционирование эндотелиальных клеток сосудистой стенки, армируют ее, делают непроницаемой для эритроцитов, повышают устойчивость к травмам как извне, так и за счет высокого внутрисосудистого давления (Ткаченко Т.Е., 2007; Дуйсебеков М.М., 2011).

Surface connected micr

Canalicular system

Glycogen _

Mitochondria

««-Granules

^^jp Щ) - Microtubules

Dense granule

J ~ Submernbrane

filaments

Dense tubular system

Trilaminar unit

membrane

Рисунок 1. Внутриклеточные включения тромбоцита

Тромбоцитами синтезируются и экскретируются тромбоцитарные факторы свертывания, которые обозначаются литерой Р (platelet) с соответствующим подстрочником. Среди них следует выделить два:

Фактор Р3 - тромбопластический фактор (устаревшее название -«неполный» тромбопластин) нормализует потребление протромбина в плазме с низким содержанием тромбоцитов. �