Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОПОСТАВЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ СИСТЕМЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ С ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СОПОСТАВЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ СИСТЕМЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ С ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ"

\ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО —'КРАСНОГО ЗНАМЕНИ' ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

_ Биолого-почвенный факультет

Галина Михайловна КОЛЕСОВА

СОПОСТАВЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГИБИТОРОВ СИСТЕМЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО

ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ С ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва ~ 1973

московские ОРДЕНА ЛЕНИНА И. ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО 8НАЦЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.ВЛКШНОСОбА

КОЛЕСОМ Гейма ИшсаВяогяа

сопоставление эмектжкгш ИНГИ&ИОРОВ свсгаш ОКИСЮТЕЛЬНОГО 40СС0т«Р(ШАНИЯ ШШШЖДРВ! С ИХ ФИЗИКО-ХШЙРШСШМ СВОЙСТВАМ .

(05.00*04 - бноиишя)

Авюрв} в р а т диссвр1ацви на соискаиие учвноК С1вцйнц кандидата биологических наук

ваолого-почввнный факультет

На правах р^ксшиов

Ц.'птрял^^^ с -К : . :: -

Москва, 1975

Работа выполнена в отдеае биаанергвхюся Цехфакудмехской лаборатории внооргацмчаской хжмм ЦГУ.

Научные руководители: доктор биологических неук, профессор В.П.. Скудачвв, кавдшдаг химических иауй Д.С.Ягужимсквй.

Оффжиадышв ояшшоню« доктор биологических мук М.Н.Копдрвяюва,

кандидат биологических иауи В.А.£обддков.

Работа нааревлеаа яа официальный иш в Институт Электрохимик АН СССР.

Автореферат разослан " * _ 1973г.

Завита диссертации состоится » "___1973г.

г 15 часов не заседании специализированного фиаиолого-биохими-чесяого Ученого совета бнолого-почвенного факультете МГУ (»00*58,117234, Леяииские горы, Биолого-почвенный факультет МГУ)

С диссертацией иохйо оэиакошшся п библиотеке биолого--лочвеияого факультета ИГУ.

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

„О.Р.Колье

В настоящее время при изучении механизма окнслитездного фосфорилнровання широко используется м е т оди иги би т орного анализа, Применение этого метода позволило установить последовательность расположения дыхательных переносчиков и их локализацию в мембране. Кроие веществ, обладащдх высокой специфичностью действия /ротенон, пирицидин к/ обнаружены ингибиторы с меньшей специфичность» и эффективное«.». Эти ингибиторы имеют простую химическую структуру, последнее обстоятельство позволивт относительно легко выявить структурные и физико-химические параметры, определяющие сродство ингибиторов к ферментам. В работе проведено систематическое сопоставление биологическом эффективности разных типов ингибиторов системы окислительного фоофорилировашаН; с их физико-химическими свойствами.

Б первой части работы исследована неспецифические иигиби- ; торы НАДН-дегидрогеназы митохондрий. Било установлено, что срод-| отво этих соединений к ферменту коррелирует с их способность» | адсорбироваться на границе раздела фаз в бинарной системе угле- | водород-вода. .* ^

Во второй части работы теоретическиисследован механизм | взаимодействия с ферментом специфических ингибиторов ШШ-дегид-; рогенази-ротенона и пирицидина А* |

й третьей части работа проведен систематический анализ ли-^ тературных данных по эффективности разобщителей диаитрофенольно*-го типа на митохондриях. Полученные данные позволяет сделать вы-; вод о том, что вопреки данным предыдущих авторов, в общем слу- | чае эффективность разобщителей не зависит от их сродства к лили дам. Было показано, что одинаковый биологический эффект разобщителен различного строении достигается при одинаковой концент- I рации диссоциированной формы разобщителя в водной фазе. Олреде- ;

депа каж^иаяся иоаохаят® дяссоцнацхя хонплехса иездз лецн-тх&ои м ааиовом пелтахдорфеиозт.

В чегэвргом разделе работы исследовало влаяаяс доляр-востя иолех^лы аЕкиднруюашх соединений ив их биологический вффект.

M Е Т О Д Ы

\ Ыитохоядри* сердце быка выделяли методом Крейна н соевт. (I95fi), Фосфоркдир^сихе СЫЧяолучали иа "тяжелой" фракция китохондриЯ сердца быка яо метоод Хаисвяв к Смита (196%). ИякзСационя~ясиесь,э которой озвучивали митохондрии и суо-пййдкровааи подзчеааыа СНЧ, содержала Q,2SH сахарозы, Û,0XU tp*o*HÇI-$ï$ep*»рН¿»2» Sitôt îljio^» Z«C£ АТФ я IltM сукцината.

Зитохокдркк сердца кролика выделяли s среде, содержачей О,ЗУ сехарозы, 0,02Цтрис-НС1-<!уферй, 0,0Ш 8ДТА, рЯ 7,5. Посде гокогемзавди хкаях ядра а облоши клеток осеждалм при 600j »звчеине 10 ими., кадосвдочвзю ыдхость цойтрнфзгирсаа-; ли*яря 12000^ » течение 15 их«., осадок митохондрий ojenea-; дхроааяа ъ оредо гыделеаяя.

£ьайя»е мхтрхьвдрай и СЦЧ хзиервдиполярогрбфически с открытых, стоцноаарник илатияовш алектродом. Среде инк}ба-. аии цитохондрий содерхгла 0*311 сах&рсзы, IOnii ÎCHjÎO^ х ЮмМ KCI рН 7,5. В качеств субстратов дшои*я< приненядя гяутаиат+ палат во 5и13.Среда яян$бац)щ CU4 содсргшда 0,3иеахароэы, 5ыМ глицил-глкцяйв» iua ЙК2К>4» ра 7,5. В качестве субстратов дыхания использовали НАДН -'liia или сукцыпьт - IQuU?

АТФ-азвую .активность иитохоядрий в СЛ измеряли ка рН--кетре, ЛЛУ - ОХ с саиопксцеяпзтем регистрации яодкисаекия среды з резздясато А1Ф-ааной реакция;

кф ♦ М^АДФ ♦ H* + H2iP0r

Среде иякубации магохоидрий содержала 0.3U Сахаровы, 6иУ Ai^HPO^

10иЫ KCl. Среда инкубации СМЧ содержала 0.25U сахарозы, ¿иК глнцил-гяицинаf 1нЫ KgHPO^ и 2ыМ В качестве субстрата

* реакции использовали АТФ - 5и11. ОСъеи реакционной среды 3 ид, pH 7,4. :

* При изиереник скорости окислительного фосформдироваяия использовали следующую jjtcrewj фериввтов: AT» + глюкоза + гдюкозо-6-фосфат (2)

гл юкоэо-6-фосфвт + НАДФ' УН* сфоглвконова я Кхслота+НДДФН, (5) где ГДГ - глшозо-б-фосфатдегидрогеназа. Кинетику образованна НАДФН измеряли tie флуоркметре, сконструированном в лаборатории Снооргышческой химии ИГУ ¿врионовим В.Н. Флуоресценцию НАДФН возбуждали светом с длиной волны 365 ни к регистрировала л области 440 ли.

Белок в пробах измеряли биуретовцы иетодои.

Цеж^азное натяжение (<£ ) рзивряли неходок измерения веса и объема каплш. Более тнкедая гвдкость вода выдавливалась через твфлоновыйкапнлдярв бодевлегкую - гептан. Время жизкм капли'-составляло не мене» двухииаз?длчдости*ояияадсорбдиояного равновесия. Конечное аиачекиа (<tf) вычислялось с учетои поправок на форму капли. : ';

Содержание диссоциированной (Т~) и »диссоциированной (НТ) форм пеитахлорфвяояа в бинарных системах гептан-вода и гептао--фосфояипид-вода измеряли на днффврешдаяънмх спектрофотометрах UniiamÄp-eoo u EPJ' -J фирмы Хитачи.: Спектра сииыали в диапазона длин воля от 210 до 360 ни. Система содержала 20 ид воды ■ '20 ив ; гептана. Водная фаза представляла собой цитретно-фосфатмо-бррат- ; иыВ буфьр (0,111;0,г11:0,211) и Хи VaCI. В опытах использовали смесь лецитина с холестерином в соотношении 4:3. Перед началом

измерений систему вцдеркквали не менее суток для установления равновесия.

Чвсленние данные зкспврииентои быки обрабонайы на вцчнсли-■ тельной иасяив с прогрэыяроваиным управление« 5e¡KQ 5-301 , нетодой наименьших квадратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Природа вааиио^еЬотвия неспецифических ингибитдроз

а гидрофобной площадной ЯАДН-дегидрогеназы митохондрий

В нашей лаборатории был исследован ряд неспецифических ингибиторов яа ¡ального участка дцхателькой цели. Было показано, что химически инертные вемотч« ароматического рнда ингибируют дыхатедьау» цель между ИЛДй и цитохраиом в. Эффект этих соедйа© вий окимаегсв витамином Kj, так «в как эффект ротеиона, гшриии-дина Л и амитала. Ингибирущий эффект но связан о прмрод&Й функ циональяой группа соедийения. Производное анилина, фенола /рК*-7,7/,' ъфяри и амиды ароматических йислот, ароматические опиртй ингибируют один и хот хе фермент. Эффективность соединений коррелирует с коэффициентом расаределевин в модальной систе ие октаиод-мода согласно уравнении:

где - концентрация вещее isa, вызывающая 50%-ное торио

женив дыхания митохондрий.

В принципе возможны два механизма взаимодействие гидрофоб «их ингибиторов о ферментом. Либо эффект ангибировакин обусловлен полним погружением молекул ингибитора в гидрофобнуюфаэу, яре атом молекула вецеств^попадает в углеводородный "каркай" фермента, либо эффект обусловлен адсорбцией молекул ингибитора на Гранине раздела фаз гидрофобной площадки фермента с полярной средой. °

сокой лилидорастлоримосмп; /о-ивтааов1^ вфир г-ий1ил-4-хдорфв-вола, ивтиловый г-фир А» -нафтола/ охазалис* слабыми ингибиторам влвмронвого транспорта. Эффвкгиеаооть этих веществ оказывалась в 100-1000 раз шгхе» чей этомоявобыло олидать на освогавня величины их коэффмшшнта распределения» соогветстэип с ура»нвмеи Повтоыу било сделано предтмдоша, что эффект ватиСированн« обусловлен адсорбцией иолвнул ввгабитора па границе раздела подпрной и непопарной фаз,

-ВнастояадЙ работе эффвктквкоагь иатябаторов сопоставлялась с их способностью адсорбироваться аа границе раздела фаз бинаргэн системы геатав-вода. ДдоорОшш ммотв на гранта раздела фаз определялась по их члиаиво на мелфазаое аатпжвкяа бинарной систеиа гешав-ввда. Были иэучеаы следувадд вещества: производные фенола /1,2,4,5/, анллиаа /3,7/, бенэаимд /6/ в этанол /8/. ......... ° • • ' • •

?н Г-"- и>*нл

фенол/5/ ,анилин /3/ бенэамвд/б/

2-ивгял-4-хлорфоиол/1/, 4-брома1шллц /7/ , , С^ОЙ «»-хаорфенол /2/ „ довод /8/

№ рпс.1 нокио гидеть* что всСдвдм^ккив важя аагвбятори /1-7/ скллоот нолфаэыоа цатяхзвие системы гептан-водд,* *

Ряс.1. Эааисииость мелфазяогзквтяжейия от концентрации ' соединений /1-7/. Оси координат 01 и ОУ; фенол /5/, анилин /3/, 4-броавяилия /?/, бензвмид /6/; оси координат; и XX: 4-хлоч-$внол /2/, г«иб*ия-4-хворфеи0л /I/, 2,<н-дихлорфенол /4/.

На рисповеден« мзотераы адсорбция изученных веществ в относительных координатах. Все ваомрии, кроне изотериы для этанола,ояисыгавтся в удовлетворительном лриблкхення Адсорбционный уравнением Фрукхива^

• ВС «. ? ц & . ехр С-2а еЛ <5)

где В - константа адсорбционного равновесия; характеризуемая адоор^циовну юсЯЪсоб кос тъ частиц, взаимодействуют« в поверхностью, •а" - аттракционная постоянная, учнтыаащая взаииэдев-мвие'адсорбирйроьаииых 'молекул друг"с другой.

4- ;

: 1 ; . л А ■ 5 Jf>.

Fue .2. Изотермы адсорбция ароматических воедявешк яа -граммце раздела фа зсио гвмыге п га и-вода .в» , У где Г - поверхностная коицемракк«, - концентрация

вещества» !фм которая гдоянца раздела фаз заполнена нааоловвау4

Степень прнОдижени*»в котор&Л полученные материи onacw-¿

ваются ада о рбциошаиму равнение и фру мин на, показана на рмс.З: -

в ......;

L

tíV L

~ j— i з ♦ ^ :.■■■:■■;■.

' Рнв.З. Экспериментальная изотерма/!/ 2-й«»д-4-хдорфевола и теоретическая «зотериа /гд построенная по »ыииленяым значениям а * В»

И» 9(10.4 видно« что концентрации ингибиторов! подавляющие на Э03& адектрошшй транспорт, йпязкн н концентрациям в ведиоЯ фазе модельной системы, когда граница раздала фаз заполнена наполовину /в « 0.5/. При этом биологическая эффективность хорошо

' ' энергии

коррелирует о изкеиеннаи свободной адсорбции при переходе из воды на границу раздала фаз в системе геатав-вода. Зависимость биологической1 эффективности веществ /1-8/; от изменения свободной анергии при переходе из воды «а границу раздела фаз системы гептан-вода описывается■следующим уравнением:

■О..; '

Г « 0,985 <6)

Риол. Вааимосвязь между поверхностно-активными свойст-щ лам* соединена й/1-6/ я яхспособв остью нпги<*ироватьэяектрол-внй тренепорт в иятохондряях.^С0 f концентрации »etwet*,;

выэивадезе полумзкеккальлое торможение дыхания митохондрия Ï-; печени крисм /суссграт;«зтвнаг V иалат/, _ - ■ концентра-

ции венеств в водной фазе, вызывавшее ваполневие границы раздела фа» надолоаяиу. -"/''■..'■

,м уравнение(6) свидетельствует, что,по всей вероятности, происходит адсорбция ингибитора на поверхности гидрофоб-B61 здомдхи фермента * точке контакта с поднрвой фазой.

Вида сделана попытка яайм корреляцию меяду Онолйгической эффективностью изученных веществ ийзиеьаииви 26 личина свободной энергии перехода к» воды в обми гексена. Оказалось, что биологическая эффективность ие коррелируете изменение« ДД перехода в обьеч ге кса на.вКоэффициввт корреляция в этой случае равен 0,422« Тзкии образок, последняя модель я« соответствует системе внгнситор - фермент.

С другой стороны, известно, что биологическая эффективность изученних соединений коррелирует со свободное анергией перехода в объец октакола. Сопоставление величин свободной энергии адсорбции ив границе раздела фаз системы релт&н - воде и свободной энергии перехода иэ воды в' объем октанола дня веществ (I - 8) показало, что меаду а г ими величикаии, в свое очередь, существует удовлетворительная корреляций:

Л £ граница - 1.08 овъвм - 2,96 г - 0,958 (?)

Таким обрезом, изменение структуры иолекупы приблизительно в , одинаковой степени сказивеетоя яа ведичииахд^ перехода вещества иэ воды на границу раздела фаз в сиохеие гептан-вода и перехода из воды в обьем полярного углеводорода - октанола.

Следует подчеркнуть, что адсорбционная модель дает количественное совпадение концеяграций ведесгв <1—а), при которых наполовину заполняется граница раздела фаз и наполовину ияги-бируется работа фермента, в то время кек распределение веществ в системе октанол-вода позволяет су^дть лишь об относительных изменениях в сродстве к ферменту ингибиторов разной структуры.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гидрофобная пловдика фермента дыхательной цепи, аффективно адсорбируюсая полирнке органические молекулы, сходна по адсорбционным свойствам с границей раздела фаз системы углеводород-воде.

5заh'jqдействие специфических ингибиторов ротбнона и пиркцидина с КАрй-^егиярогавазой аито^оидриИ

Установление того факта, что эффект ингибгрования НАДН- -

о

дегядрогвназы митохоадрий обусловлен адсорбцией органических молекул на границе контакта гидрофобной площадки фермеhiа о полярной фазе1*, позволило предположить непротиворечивую схему действия специфических ингибиторов НАДИ-дегидрогеназы - ротвновь (1) и пирицидива Л (1а). Оря »тон были использованы иыеювд-еся в литература данные ( Jeng et al,, 19681 Burgo», ВьйХввхч 1965} но действию I, la и их аналогов на начальный .участок дыхательной цепи,

Пирицадин А (1а), пак видно из приведенной формула, является близкий структурным аиалогом восстановленной формы кознэя-«8 Ц. ОН

ÖH3 CHj ¿H,

CM,

CH,

¿4. <W> ¿H,

(la)

Uto)

Условно молекула ингибиторе может быть разделена на две части - ароматическое ядро, которое вследствие структурного сходства может сеяадашхьскс местом посадки на ферменте коэнэи-U8 Ü, и на осгагох непредельного спирта; согласно нашим данным, алнфвглчвсхме спирты обладают высокий сродством к гидрофобной ллсдадхе фермента, входящего а НАДН-дегядрогепаэний комплекс дыхательной ц^нв.

Предполагаемая.схема действия пиртЩияа постудкруех бифункциональное связывание молекулы ингибитора о ферментом, при котором ароматическое ядро занимает место кознзииа Q, а диполь спиртовой группы локализуется на границе контакта гидрофобной площадки фермента с полярной средоб.

Такая схема; с одной стороны, подтверждается данными Гутмана и Сиагера которые обнаружили, что в определенных условиях существует конкурентные взаимоотношения между Qjq и ви-рицЩ^ивом при посадке аа фермент, из которого предварительно бы удален коэнзим <Jj0. С другой стороны, было показано, что структурный аналог /11а/ пирнцидана, который не содержит полярной гидрофильной группы в боковой цепи и, следовательно, на обладает ; способность» адсорбироваться на границе контакта гидрофобной площадки фермента с полярной средой, не квгибирует НАДН-дегидро-геваза в дыхательной цепи.

Сопоставление нигибирувщих свойств ротеномдов с ftx строе- -ииам (данные Бургоса к соавторов) подтверждает предложенную схему действия специфических ингибиторов НАДН-дегидрогенази.

. • (1)

т*

V

Кольцо А ротенопа формально ug*ao рассматривать как отруи-

туру, определявшую взаимодействие ингибитора с местом посадки Ü — -коэвзина 0 на ферменте; карбонильная группа при двенадцатом

Ттоне1 углерода определяв* связывание иагиНитора с гидрофобно?

площадкой фермента. Ниже проведены доводы, подтверхдашле

справедливость такого подхода.

I/ Ротенон и все «го активные аналоги (1,3,5,6,7,10,13*14, I?) содержат полярную группировку (ОО или ОН) у 12-го atona С.

ZJ Ьамена полярного заместителя у 12-го углеродного атома 8а неполярную СН3-группу приводит к полному исчезновение активности /cti.TüOt.I, метилротенон/.

Тгвяицв ^ Структура ротевоидов и их биологическая активность

i "К«¿-ЗГРайиТГГTSbCTUiiá tkuü'rf 'bU^-HOS1

К

t Ротеноид : торможение, ккмоли/ с

: : 'мг оелкат irfi

I Ротеяои 1,8

г зпарот«вон ггоо

3 -азоротенон 21,0

4 «каорствкои 4000

5 Дегяалив 3,7

6 Элляптоя 3,6

7 Дигидроротенон 4,6

8 Иундуоероя 90,0 $ Иетилротенон 6000

10 Ротевон ( восстановленные 2,0

11 Эпяротенок //аЗН4 25

12 Роте нон озссин ЮЗ IJ Ц-гидроксиротенея 3,2

14 ¿1-гидроксмдегуэлив 7,3

15 П-гядроконаллиотон 7,9

3/ Характер взаииодеИотвиа полярной группы у 12-го углеродного атома о ферментом является неспеиифячным. Замена С=0 группы роииоиа на группу *C4j¡£ при восстановлении УаВН4) практически се меняет активности ингибитора (10,12). введение в молекулу ро-техоха ОН-грумы, рядом о карбонильной группировкой, в положений

II «умственно я» меняет мнгибмрутеЯ активности соединений íl3,I4,I£); »то подтверждает капе представление о том, что мы деквтьятельне имеем дело с явлением вдсорОии^, а не с хиииче-

ским взаимодействием. в пользу этого вывода свидетельствует

также т^т факт, что изменения структуры кольца £ в боковой цв-« о .

пи не приводят к резкому падению мнгибирующей активности роте-

*ноидов.

V Согласно схеме, ингибитор адсорбирован на ферменте так, ч£о при лосадке диполя на границу раздела фаз кольцо А жестко фиксировано на определенном участке ферменте. Резкое падение активности при переходе от $ -изомеров к I.-изомерам ротевона в условиях жесткой фиксации кольца А должно объясняться тем,что карбонильная группа при Сва попадает на границу раздела фаз. ' Этим объясняется отсутствие активности у эпвротенона ж +иэороте-нока. При восстановлении карбоннла неактивных Х-нзомеров боргид-ридом натрии нзодсдается резкое возрастание активности веществ. ' Анализ на моделях показал, что в восстановленных изомерах положение образующейся полярной группы (ОН) при С^по отношению ж : плоскости кольца А меняется таким образом» что делает возможен» ' связывание полярной группировки ингибитора (при С^) в поверх- ; ноотью гидрофобной площадки Фермента. При этом пространственные координаты заместителей кольца А и полярных группировок яри С^ : ротекона к вещества II практически полностью совпадают. ;

Таким образом, удалось выявить конфигурации ротешша» а ко-

I '

торой ингибитор может связываться с ферментом*

!

рзакмосвязь Фиаико-химичедкирс двойств разобщителей ■

лимитрофе вольного типа с их эффективностью на иито^ондрряз; I

Ранее многие исследователи пытались установить связь между ! каким-либо химическим или физико-химическим параметром и биоло- \ гической эффективностью разобщителей. Однако, в лучи:ас случаях \ ям удавалось установить такую связь для одного класса разобщите-

№

лей. шркер (1958) и де Декен (1955) пришли к выводу, что ра-зобкапвшя эффективность веществ тем больше, чем сильнее выражены их кислотные свойства. Хемкер (1962) исследовал серии елолдинитрофенолов, обладающих лриблиэательяо. одинаковыми коистантаки диссоциации, и получил корреляцию эффективности разобщаешьго действия от концентрации надиссоциированной формы ведостав в липидной фазе.

Хана (1967), а такко в навей лаборатории Ра«кикова (1972) показали, что эффективность действия разобщителей определяется я липидорвстьоримость», и константой диссоциации. Однако, эти авторы не получила единой кретины действия резных классов разобгмтолей «а иитохоядриальные ыеибраны; во всех случаях корреляция наблюдалась только в рядах, сходных по строению векеств. .

Цц продолжили поиск пврзцетро, который определяет вффек-

«нвность рааобсителей дкиитрофеиольного типа. В качестве меры о

Активности рпэобщителей ыы взяли обрати?» величину концентрации иедиссоциировакнои формы вещества в водной фазе:

.1— (В), при которой наблюдается увеличение скорости

(18) ТВ

дыха ¡гая, равное полукаксииальиой с 20 ыкМ ДИФ.

■ ■

При атом била обнаружена количественная зависимость зффеи-тивностш разных классов реэобкитедей окислительного фоофорнли-роваяия на дыхание митохондрий ох величины их константы диссоциации. Мы показали, что для всех раэобцитедей, независимо ох XX структуры, выполняется уравнение 9 (рис. 5):

^ (1йГ * 1,162 *«»,15в Г « 0,92 (5)

Было проведено сопоставление коэффициентов корреляции (г) для

отдельных.классов и для нескольких классов разобщителей динихро-о

фенольного типа, вычисленных при условиях, когда аффектнвяоеть' определяется величиной [та] и величиной (ТН).

-Ä -5 -3 Ш

Рис. 5. Зависимость эффективности с типу л яцшг дыхания митохондрий ценвии крысы производили ''трифториатилбекзади-дазола (I-I9), фениягидразона (20-22), б'виэотриазола (23-25), бвнзояитрйла (26-20) и фенола ,(30-36) os величины их ноистэаты к«сяо$кой диссоциации (К). Субстрат дыхания - сукцинаг; величине—^— рассчитана на основании данных работ (Джонса и Уог- ■ _ сона iTH)l967, Иаркара 1965, РатникояоЯ 1972) но уравнении (8).*

I - ТФБ; £ - 5-ыетил-ТФБ; 5 - 6-хлор-5~метл-ТфБ; 4 - 4,6-дюслор-5-ы«тил-ТФБ; 5 - 5-хлор-ТФБ; 6 - 4,$-д1Шюр-Т6Б;

■ ? - 4,6,7-трихлор-ТфБ; S - 4,5,б-трихлор-Т4-Б; 9 - 4,5,6,7-тет-рахлор-ТФБ; 10 - 4-нитра-Т«Е; II - 4,6-дкнитро-ТФБ; 12 - 5,6-динитро-ТФБ; 73 - б-хяор-А-нитро-ТфБ; 14 - 4~хлор-6-ймтро-ТФ£; 15 - б-хлор-5-нигро-ТФБ; 16 - 4,6,7-:гркхлор~5-Еш:гро-Т5Е; 17 - 4,б-дихлор-5,7-дии111:ро-.ТФБ; 18 - 5-циако-ТФБ; 19 - 5-яит-ро-ТФБ; 20 - на рбднил-циа нид-a-ipифтораегоксифекилгадразоя; 21 - карбонил-циани д-м-эето рфе н ил гид ра э он; ZZ - карбошлцианяд-феиил гидраэон; 23 - 4,5,6,7-тетраиюрбекэотрийзол; 24 - 5-хйор-А-китро-бензотриазол; 25 - З-нитробеизотркззал; 26 — 4-гидрокси-3,5-диЯодобеиэонитрил; 27- 4-гидрокси-3,5-дкброио~бензострил;

_Jß г 4 -гхлр о tf QiL-3.5-дш рб ен з о ни грл л; 29 -цианопродан; 30 - кектафторфенол; 31 - метилхлорфэнол; 32 - дихлорфвкол; 33 - трихлорфенол; 34 - яантахлор^евол; 35 - нитрофенол; 36 - динитрофенол.

Таблица 2, Сопоставление коэффициентов корреляции

в уравнении _

^ (ТК)

Значения коэффициентов Д, , иг*

В качество мери эффективности взята " р) В качестве меры эффективности взята 2) <1Н)

} г Производине фенола 10,671 12,326 0,814 0,994 0,936 1 - 0,964

} 1 г Производные ТФБ (трифторыотилбеаэитщаэола) 13,444 , , 13*915 1.СОО 1,102 0,911 { 0,933

} и г ■ -(Г Производное фенола к ТФБ 12,790 13.538 0,963 1 1,080 0,650 ( 0.923

бензотриазола» Сенэонигрила л 2-вмино-1,1,5-трицианопропан

12,732 14,158

г. 0,934 1,162

г 0,837 " 0,920

Ета]~ концентрация аедиссоцинров( иной-формы разобщителя » липидноЯ фазе, вызывающая увеличение скорости дихакия митохондрий, равное полумаксимальной скорости с 30 мкй динитрофенояа. (ТН) - ю же, что и но в водной фазе.

Иа таСл, 2 видно, что наиболси высокие коэффициенты цорро-

ляция имеет ыссто в гон сг^чае, когда сопоставляются всличики

(ТН) и ¿р разобщителя.

Росчот также показал, что корреляция между константой о

диссоциации рьзобштеле;! и их коалиций» тем рсспрсдалоикя в

обцеи случае полностью отсутствие* ( г<0,5). Поэтому из того факта, что оуяествуе* зависимость (б); дохно однозначно сде-дать«вывсд о таи, что эффективность яарокого круга разобщите- ' •лек окислительного фос^орклирования. не^ зависит от их лнпидо-. растворимости, а определяется величиной константы диссоциации»'» Уравнение (9а) моас.» бить преобразовано в (9е) при уело- .

вщ, что x* i! --¿x - : : /

Ёз выражения константы диссоциации имеем;

- (ТН) * (Т-)\н+) .:.. ' (Ю)

Из (96) и (10) получасы: '' '

Л^ ш в»н+ « ¿оп^ : (И)

■"■ (Т ) : Г ■ -

Равенства (и) показывает, что: одинаковый эффект в случае различных разобщителей достигается при одинаковой концентрации соответствующего аниона Т!" в Лолярмой фазе*

Факт, что суаествениой оказывается концентрация Т" в по- ..■': лярной фазе говорит в пользу того, что в митохондриях реализуется механизм, в котором имеат место кинетическая стадия транспорта заряда через велярный примембрешшй слой. ;* Тот факт, что процесс разобщения окислительного фосфоркли-рования митохондрий лиынтируется концентрацией аниона X", кото-* рыЯ саи по себ? очень плохо растворим в гидрофобной фаае, побудил нас изучить способность этого аниона образовывать липидо-. растворимые комплексы с компонентам» ынтохондриальши меибран. Била исследована реакция конллексообразованин аннона цента» хлорфенола с лецитином. На« интерес х коиплоноообравоваиип о фосфолипндани определялся тем, что комплексы такого рода, сдало« гичио комплексам фенклбарен-Т*" (Либерман и соавт.,1971) или ТН"Т" {<#инкельвтейн, 1970) в принципа могут являться переносчиками заряда через митохондриадьные мембраны.

Цц оОквру*ИЛИ) чю анион пеятахлорфенола (Т~) нерастворим в гептане* Если к системе гептан-вода (при рК водной фазы 12) добавлять смесь лецитина с холестерином, то вабдвдается постелен* вое увеличение рестворииости т" в неводной фазе (кривая 1,рнс.б) При этой пропорционально падает концентрация ПХФ в вода, как атг следует из хода кркзоя 2 на той же рисунке. Увеличение рас-твориыостя Т~ формы в гептане-ери добавлении фосфолипяда обусловлено образованием комплекса с лецитином;

(Т~) (12)

который существенно л^чше растворим в гептане, чей Т" форма. Из данных рас. 6 и уравнения 12 наш била определена кажущаяся константа диссоциации коиплекса в гете^гэккой системе рК£,т" «5,7 и число молекул де ¡унике в комплексе п ■ 1.33. По-видимому» образуется комплекс мевдз лецитином и Т~ в,соотношений 1;1. , Гот факт, что образуется достаточно устойчивы» в гетерогенной системе хошлако ке*ду анконой рагсбаитеяя к лецитином, говорит о том, что в мембранах на гревицах разделов фаз помимо иеспецифичесной поверхностной адсорбции может происходить образование комплексов типа ХТ"» Анионы ПХФ при контакте о мембранами долхвы связываться полярными группам фосфолмпидов, которые расположены на границе раздела фаз. При атом концентрация Т~ на границе должна значительно превосходить концентраций 1" в

Рве. б. Бавнсимость содержания I" в гептане (кривая I)

ж в воде (кривая 2) от концентрации фосфолипидов, .

объема мембраны.Саедствиеи зтого будег значительный отрицательный поверхностный потенциал на мембране. С другой сторона« по-видямоыу, ивяьза иокяотить возможность того» что KOMIUSSOH типа ti.T" могут участвовать в переносезарядв через, ойъви мембраны. .. ' ■ • • -

Влияние-полярности вяумлирутихсое^вкеиЦ -

на их бвологичеоияй эМвхт -."■'.'■''лй

Ранее было обнаружено« чтодвйотвиа ки«ш*»еод5рхав1Юс^ ;

влехтрофильиу» группу, «а функции фзвфорияйрувдих витохондрвй

резко отличавтоя от действия соответствующих эфиров. ; '

Наблюдаемое качественное различие двух типов ингибиторов

коже* быть связано с двумя-причинам» либо это сбусло&дево рай-'

личным сродством этихмщвс.вк ферментам митохондрий, либо' - их

различной прошшаёмоохь» через интохопдриальныэ мембраны. Чтоб«

«окдючить последнее предположение» нами Оыд^ проведена работа по

ораэнательномуизучвнивалкялируючих со единений, содержащих кис-;

дохну» (I) и оложноофарнус (П) группировки яа'фбадтвхондриальны^

частица, мембрана которых икает противоположную ориентацию по

сравнению о иитохондрияия*

¡те-Cii чГ^Ъ— ¡J (дяхяордяэтил)-р-амипо-

^с^СЙг^С фвиияуксусяая кисхота (I)

н ЛУ.,/этиловый Эфир <дихлорд*этил)

-р-акинофеяилуксусиой . . ; Р 0 йислвпг (Н/ !

Согдосно данным, приведенный в табд.г, ефир в СМ. икгиби-рует здектронный транспорт врантичеокв в тех ве концентрациях, что и в ыитоховдранх. То ге самое отвоонтсн и к ингибмроваияю АТФ-азы, .■■'

ги

Табвииа ат Эффект эФира (ГП иа дыхание «активность АТФ-азы, стимулироваааой РССР

(!»Ч сеоЛиа («ка «■итохондики кйолика

диханае, суъшрат НАЛН й состояние 3** ; АТФ-аза дыхание,суострат гпутамат-малат состояние 3 АТФ-аэа

, 3,7'10* г,мб*

. Алкилируюме. соединение, содержащее кислотную группу (I), Практические неиш'ибирует дыхание иАТФ-азу субиитохондриальных частиц /табл.З/. Иногда в этих опытах наглодается стимуляция дыхания. Ранее Смо показано, что соединение (I) аффеиивдо подавляет соответствущие функшск ^ осформларуюу« митохондрий сердца нроднка Добликов» 1МО/. , •

Таблица 3. Действие алкилируодего агента (,1) аа Щ1Й-» сукиинатоксидазвуоиАТф-аэиувантнятсть ■. • СИЧ сердца: быка: - ....

"Лы^ании. состояние Зр АТ^-азв- .

. ¡¿Ш .. , . иукцинат ЭиДОГйЦийа ГбсР

С ~ " от кокт :родя ' * С - и» от :конт- , ,,,, (роля .'■V :ковтр» V;' ' г,„;„ и в* контроля

* * 10"* 125 в'Ю*4 156 1<Г3 Ю-3'. 126 гло1*3 х*5 ¡31р*3 155 0,6-10~3 100 1,2.10"** 100 г-1073 Юо 5-Ю"4 100 1.5'10~3 100 ; 2-Ю"3, 100 .":.;.'

Одяако« вам^ет врввять во вняиание, что кроне изменения ориекодхЯ уекСрави, ь С1Я сильно даруыоиа система сопряжения. Иосиогря иа кадвчйв сопряжен*« во все* 3 пунктах, <?ос<;ярелиру-, мая способность ОЛв Ю-15 раз ияньае, чей в прочвосопряхен-ьшс ыятоховдраях в проявляется «мяь в тон случае, ногда образующаяся АТФ постояано удаляетсд из системы гексокяааэой. Поэтому

отсутствие эффекта соединения I на дыхание и АТФ-аэу £ЛЧ могло быть обусловлено на издеяанивм ориентации мембраны, а варуаеви- , ех еистеш,сопряжения".

Действительно, исследование действия соединения I на реак-

о

цию синтеза АТФ суб^итохондриальныии частицами показало, что фоо форнлирующая фуккзия СЛЧ иигибируется приблизительно теки же концентрациями ингибитора, что и в митохондриях: 50$&-ное торможение наблюдается при концентрации /субстрат-сукцивах/.

Таким образом, можно видеть, что отсутствие аффекта соединения I на дыхание и АТФ-азу СЫЧ сбуояовлево иарувением системы ; сопряжения, процент фосфорилируювдгодыханияв СЙ существенно : нижа, чем в прочяоса1грякенаых мятох&ндряяг,11АТФ-аза так же плэ хо сопряжена с системой влектроаного транспорта. Все процессы в ■ СаЧ, протекающие с участием системы сопряжения /реакция синтеза ! АТФ, обратный перенос электронов на НАД: я трянсгндрогеяазная -.Г реакция - Кобляков, Грикюс, 1970/ подавляются соединено« I. ;

Совокупность данных по срааяатальвоиу всёледогяияо даух ! типов алкилярущих вещеотв, раздичаючихсяпо полярности. прсве- 1 ' денномуцз субмитохокдриалышх частицах, показывает, что различий в действия ингибиторов связаны ве с различиями в проницаемости | через митохондриальную мембрану, а обусловлены различны« сродет-; вол к самим ферментам. ' ■■ Ч ." ^ '

Таких образом» получено достаточно строгое дохазательстзо того факта, что направление алектр^ильной атаки ингибитора в полиферкентвом кои оде кое матохондрайи СМЧопредвдяетса .степе- ' лью полярности* всей молекулы в целен.

■ гг ВЫВОДЫ:

I. Изучено влияние производных рндч фенола, анилина, Сеигамида и этанола на иежфаэвое цатнжаиие системы геитан-вода,

о 2. Обнаружена четкаакорреляция между по м рхиостно-актив ними свойствами ароматических соединений и их способность» иагяби-ровать влектрокиый транспорт в митохондриях. Полученные данные позволяв* считать, что изученные вещества иаруыа&т транспорт электронов, адсорбируясь на границе контакта гидрофобной площадки ИАДК-деГйДрогеиазы и полярно« фвзд.

3.Дано обоснование механизма бифункци оналыюго связывания о ферментом специфических ингибиторов ЙАЛИ-дегидрогеиаэы - роге нона и пирицидина А.

4. Найдена "активная" конформация ротевоидов, ? которой 01 взаимодействий о ферментом, отвечаодая требованиям модели би-функциокидького связывания.

5. вффективность разобщителей ряда Т4Б, фенола, беизотриа иола, беиэонитрида и фекилгидраэона опредвлнется величиной кон стантм диссоциации. Одинаковый аффект различных классов разоба телеа динитрофеяольисго типа достигается при одинаковой коацен рации диссоциированной формы в водной Фазе.

¿. Определена кажущаяся константа диссоциации комплекса аниона пентахлорфенола с лецитином в гетерогенной системе гептан-вода. ; ' ■

7. Изучено нлиииие аэлярнооти молекулы на биологический аффект алкидируиих соединении. Показано, что на ^ММ , так же жак И на нитохоидриях, введение отрицательного заряда молекулу икид4рувнего агента приводит к изменении направлен! «лбктрофильиоЛ атаки ингибитора.

гз

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТШ ДИССЕРТАЦИЙ

1« Ягухинскяй Л.е., Колесова Г.!!., Ложкин Б Л. Взаимосвязь между лов ерхяоо тя о-ек тяв вши свойствами ароматических 1 соединений и ах способность» иягябкроватъ элвктроияий транспорт в цикхондря{1Х. До1СЛ. &Н СССГ. ^О?. 1001. 1972.

2. Колесова Г.Ц„,Ьзаимоевязь «екду поверхяоетно'-актквныия.

свойствами фенолов я их споссОкооть" икгибкровать адек-троняый транспорт втлтоюндрлях. Тезисы докладов Московской городской конференция молодых учеише по фиэлчво- -.' кой химия* 1972« стр. 105.

3. Колесова Г,П., Чиотяков В-В. Действие алкидируевде и гяд-

рофоСанх ооедикений на субнатохоадриальвые часткцв ж - ; : , КАДК-цитохрои 2-редукт£35* В сб."Циюхоадрия. Иолехуляр-• I , кывмеханкзиифериевтатавных реакций". И»» "Наука"» 1972,; ;■:.■' стр. 9. .■'." . .■.■;'-■

Колосова Г.II., Ягухилсхий Л.С. Интабитор(ы иачальлого учаот-: 1юдыхатедъяойцеш1.Взаимодейотвя» ротевояас ДАДН-дегвд-. . рогевазой митохондрий, Материалы УШ Симпозиума ло Свох*-' - мяулиятсхоядрий. Иосква, 1972 (в печати).

5. ЯгухинскиЯ 2.С., Хосвк Ф.И., Колесова Нуклеофильные

- центры и гидрофобные площадки вфосфорядируодей скатеце иито1ондрий. штериалы уп симпов*ума по с1ююиша мжто-

' ; хондрай, 1973/; ср. .

6. Колвсова Г.Н., £огуславск11й Д.й^> Ягу1мнскяа Д.С. Вэаиыо-. действие разобщив лнокиелктельвого фосфорнлнровавоя

- иептахлорфенола с лецитмном. Докл.АН СССРД973 (в яечвтк).

7, ЯгужняскиЯ Л.С., Колесова Г.M. Модель бифункционального

' связывания ротевоне я пярицидина А с НАДН-дегидрогенаэой

митохондрий. Молекулярная биология (в печати),

6. ЯгуживскяЙ Л.С., Ратников» Л.А,, Колесова Г.И. Холичест-

° веяная зависимость между величиной константы диссоциации

разобштелей и их эффективность» действия на митохондри-

вльные иембраны, Виофизикв, 19?3 (в печати). 9. Chlatyalto» Т.7., TeguzHlneky L.3., Ноалу F.M. , Koleaova G.M.

AlS^lating ageats «■ « tool for studying the весЬаЩяш of

•Mrgetlo couplingl.n »itochooàrla. Abet. Commun. 7tb

U«*t. Виз», Biochee, Soc., Bulgaria, 1971, p. 22?,

Материалы диссертации были долокены на 7Г , 7Г/ и Л* Все союзном Симпозиуме по биохимии митохондрий ( Носква, 1970, 19? 1972г.г.), на Московской городской конференции молодых ученых по физической химии (Носква, 1972г.).

Пот ш ««ч M/S-7Sr. ам ИЯ. T»j> ЭОО.ЧИНДЫ M

Тпегра^аШ Pcora»wwM»rp« фир он» MWIII» СМ РСФСР. : ■