Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Соматические гибриды Пасленовых на основе мутантов Nicotiana plumbaginifolia, устойчивых к действию соединении с антимикротрубочковой активностью

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Соматические гибриды Пасленовых на основе мутантов Nicotiana plumbaginifolia, устойчивых к действию соединении с антимикротрубочковой активностью"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукописи

0_ УДК 575.224+576.5”

ЄМЕЦЬ Алла Іванівна

СОМАТИЧНІ ГШРЙДИ ПАСЛЬОНОВИХ НА ОСНОВІ МУТАНТІВ NICOTIAN A PL UMBA GIN1FOLIA, СТІЙКИХ ДО ДІЇ СПОЛУК З АНТИМІКРОТРУБОЧКОВОЮ АКТИВНІСТЮ

03.00.25 - клітшпіа біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидита біологічних наук

Київ 1996

Дисертацією е рукопис

Робота виконана на кафедрі клітинної біології та генетичної інженерії біологічного факультету Київського університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук БЛЮМ Ярослав Борисович

Офіційні опоненти -

доктор біологічних наук, професор

КУНАХ Віталій Анатолійович

кандидат біологічних наук, н. співр.

РАТУШНЯК Яків Іванович

Провідна організація -

Інститут фізіології рослин та генетики НАН України

Захист дисертації відбудеться “ 4 1996 р. о ^ год. на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д.йі.19.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 252143, Київ-143, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології

та генетичної інженерії НАН України.

Автореферат розісланий “ ^ іддб р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради, 11 і і ■

кандидат біологічних наук | і-Л. В. Малишева

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Мікротрубочки - цс цитоплазматичну структури, які складаються з димерів а- та ß-тубуліпу, і разом з мікрофіламентами та проміжними філаментами формують нисокоорганізований цитоскслст сукаріотичних клітин (Alberts ct al., 1989). Вони приймають участь в підтриманні форми клітин, регуляції їх росту та морфогенезу, в організації цитоплазми та забезпечують поділ клітин, утворюючи мітотичне веретено (Блюм, 1988г Dustin, 1989; Mandelkow & Mandelkow, 1995). Як і у випадку клітин тварин, множинність функцій мікротрубочок в клітинах рослин зв’язують з гетерогенністю а- та ß-тубулінів (Hussey et al-, 1991). Ця гетерогенність являється результатом того, що різні ізатини тубуліиів кодуються мультигенною родиною генів ата ß- тубуліиів (Hussey et al., 1991; Kopczak ct al., 1992; Snustad et al.,

1992). В подальшому ізотипн рослинного тубуліну можуть інтенсивно піддаватись посттрансляційним модифікаціям, внаслідок чого гетерогенність нього білку ще збільшується (Смертенко, 199G). Тому поглиблення уяв нро функціональні взаємозв’язки між різиими членами родини генів тубуліну у рослин являється основою не тільки-' для розуміння фундаментальних механізмів росту і розвитку клітин, загальних для всіх еукаріотичннх організмів, але й для розуміння таких специфічних функцій мікротрубочок рослин, як їх участь в побудові клітинної стінки та формуванні мрсчірофазної стрічки і фрагмопласту під час мітозу (Cyr & Palcvitz, 1995; Seagull, 1989; Shibäoka & Nagai, 1994).

Прогрес в даному питанні може бути досягнутий шляхом; а) вивчення організації генів тубуліну в клітинах рослин та їх ткапипоснецифічиої експресії; б) отримання мутантних ліній по генах білків мікротрубочок і, в першу чергу, ио генах тубуліну; в) переносу мутантних генів тубуліну в інші клітини з метою вивчення можливих функціональних змін або порушень структурі] мікротрубочок. На сьогоднішній день вже знайдено декілька природних мутантних ліній рослин, стійких до дії гербіцидів з антимікротрубочковнм механізмом дії, серед яких добре вивчені Eleusine indica та Setaria viridis (Smcda & Vaughn, 1994). Було показано, що резистентність нринаймі и Е. indica нон’я лама зі змінами ь сірукгурі ß-тубуліну (Vaughn & Vaughan, 1990; Smeda & Vaughn, 1994).

Раніше експериментальним шляхом Я.Б. Блюмом та співр. вперше були отримані ß-тубулінові мутанти Nicotiana plumbaginifolia зі стійкістю до дії аміпрофосметилу (АПМ, гербіцид фосфоротіоамідного ряду) (Страшшок н др., 1993) і трифлюраліиу (ТФЛ, гербіцид динітроанілінового ряду) (Blume et al., 1991; Блюм и др., 1996), котрі характеризуються вираженою антимікротрубочковою активністю. Метою отримання таких мутантів було їх використання при створенні гібридних клітинних систем з маркерним білком (мутантним ß-тубуліном) у складі мікротрубочок як для подальшого

вивчення особливостей функціонування цього мутантного білку, так і для вивчення особливостей поведінки різних мікротрубочкових структур (іптерфалпа сітка, нрепрофазна стрічка, веретено поділу, фрагмонласт) в ■соматичних гібридах. Поряд з цим, оскільки ще не вдалося ізолювати жодного мутантного гену тубуліну, відповідального за стійкість до вищезгаданих типів гербіцидів, з метою подальшого uepeuocy в інші види рослин, то розробка підходів соматичної гібридизації для здійснення такого переносу є також актуальною в теоретичному і практичному плані.

Мета та завдання дослідження. В зв’язку з викладеним вище мстою даної роботи було отримання та аналіз високофункціональних симетричних та асиметричних соматичних гібридів на основі мутантів N. plumbaginifolia но ß-тубуліну, стійких до дії АПМ та ТФЛ, та рослин N. sylvestris і A. belladonna (реципієнти), які б успадкували ознаку даної резистентності, для вйичеішя особливостей функціонування мутантної ß-субодишші тубуліну в складі мікротрубочкових структур гібридних клітин.

До конкретних задач роботи входило:

1. Отримати симетричні гібриди N. plumbaginifolia + N. sylvestris і

N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійкі до дії АПМ, та N. plumbaginifolia + N. sylvestris і N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійкі до дії ТФЛ. '

2. Отримати асиметричні гібриди N. plumbaginifolia + N. sylvestris і N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійкі до дії АПМ, та N. plumbaginifolia + N. sylvestris і N. plumbaginifolia .+ A. belladonna, стійкі до дії ТФЛ.

3. Провести цитогенетичннй аналіз гібридних ліній.

4. Вивчити фертильність отриманих гібридів та успадкування ознак стійкості до гербіцидів в їх першому поколінні.

5- Порівняти стійкість мікротрубочок в протопластах гібридів та в протопластах батьківських ліній до дії АПМ та ТФЛ за допомогою імупофлюоресцснтної мікроскопії.

6. Провести ідентифікацію наявності мутантних ізоформ ß-тубуліпу N. plumbaginifolia в отриманих гібридах шляхом біохімічного аналізу.

Наукова новизна. Вперше серед вищих рослин отримані високофункціоиальні соматичні гібриди N. plumbaginifolia + N. sylvestris і N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійкі до сполук з антимікротрубочковнм механізмом дії - аміпрофосметилу татрифлюраліііу. Зокрема, вперше отримані у-гібриди на основі Лг. plumbaginifolia (донор) та A. belladonna (реципієнт). Встановлено, що стійкість до даних речовин пов’язана з успадкуванням мутантного гену тубуліну від N. plumbaginifolia, продукт якого - мутантна ізоформа ß-тубуліну - с складовою частиною мікротрубочок гібридних клітин. Отримані гібридні, лінії можуть бути використані для вивчення механізмів подальшої переважної сегрегації хромосом одного з батьків в соматичиих гібридах та

з

встановлення структурно-функціональних особливостей їх веретена нолілу, яке може забезпечувати правильність розходження в мітозі хромосом, усиадкуваних від різних батьків.

Практична цінність. На прикладі ß-тубулінових мутантів N. plumbaginifolia, стійких до АПМ (фосфоротіоамідний гербіцид) та ТФЛ (динітроаніліновий гербіцид), продемонстровано можливість ефективного використання асиметричної соматичної гібридизації для переносу ознаки стійкості до цих тинів гербіциді» (мутантні гени ß-тубуліпу) до близькосгюріднених (N. sylvestris) та філогенетично иідда.'іеиих (A. belladonna) видів рослин. Гібриди, які успадкували одну хромосому від відповідного мутанту .V. plumbaginifolia, можуть бути використані як вихідний матеріал для ідентифікації та клонування мутантного гену ß-тубуліпу і псрспссення його у важливі види сільскогоеиодареьких культур для отримання стійких до даних гербіцидів сортів рослин.

Результати досліджень використовуються в учбовому процесі на кафедрі клітинної біології та генетичної інженерії Київського університету ім. Тараса Шевченка при читанні спецкурсів “Скелетні структури клітини та їх функції” та “Клітинна селекція рослин”, а також можуть бути використані при читанні спецкурсу “Клітинна інженерія рослин”.

Основні положення, які виносяться на захист. На основі проведених досліджень на захист виносяться наступні положення:

1. Отримання соматичних гібридів N. phimbaginifolia + N. sylvestris та ,V. plumbaginifolia + Л. belladonna, стійких до дії АПМ та ТФЛ, шляхом симетричної гібридизації.

2. Отримання соматичних гібридів N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійких до дії АПМ та ТФЛ, шляхом асиметричної гібридизації.

3. Встановлення закономірностей розподілу хромосомного матеріалу в отриманих гібридах.

4. Вивчення фертильності отриманих гібридів та успадкування ознак стійкості до гербіцидів в їх першому поколінні.

5. Наявність підвищеної стійкості мікротрубочок до дії АПМ та ТФЛ и протопластах гібридів N. plumbaginifolia + N. syh’estris та ,V. plumbaginifolia + A. belladonna порівняно зі стійкістю мікротрубочок протопластів батьківських ліній.

6. Успадкування мутантної форми ß-тубуліну в отриманих гібридах.

7. Можливість використання стійкості до АПМ та ТФЛ на прикладі N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia + A. belladonna комбінацій, як селективних маркерів в соматичній гібридизації рослин.

Апробація роботи. Результати дисертаційної роботи доповідались на IIму (1993) та ІІІ-му (1995) Російських симпозіумах “Нові методи біотехиололї рослин” (Пущино, Росія); XV-му Міжнародному ботанічному конгресі (Йокагама, Японія, 1993); ІІ-му з’їзді товариства фізіологів

рослин України (Київ, Україна, 1993); VIIl-му Міжнародному конгресі по культурі рослинних тканин і клітин (Флоренція, Італія, 1994); IV-mv Європейському конгресі по клітинній біології (Прага, Чехія, 1994); Міжнародному симпозіумі “Біотехнологія та генетична інженерія рослин” (Київ, Україна, 1994); Міжнародному симпозіумі “Молекулярна біологія та біотехнологія рослин” (Ньго-Делі, Індія, 1994); Міжнародному симпозіумі по стійкості бур’янів та сільськьгоснодарських рослин до гербіцидів (Кордова, Іспанія, 1995); Х-му Європейському нитоскслстпому форумі (Стокгольм, Швеція, 1995); семінарі Європейського товариства молекулярних біологів “Контроль циклу клітинного поділу вищих рослин” (Сегед, Угорщина, 1995).

Публікапії. Основні результати дисертації викладені у 11 друкованих роботах, список яких наведено в кінці автореферату.

Структура та об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, заключения, висновків та списку цитованої літератури, який містить найменувань. Робота викладена на сторінках, містить рисунків та 6 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

В роботі використовували наступний рослинний матеріал; мутант Nicoliana plumbaginifolia (2п=20), стійкий до дії АПМ (Страшнюк и др.,

1993), та мутант N. plumbaginifolia (2п=20), стійкий до ТФЛ (Блюм и др., 1996). Рослини N. sylvestris (2п=24) та A. belladonna (2л=72) дикого типу, а також канаміцин-стійкі лінії рослин N. sylvestris та A. belladonna (з колекції Ін-ту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України). В якості аитимікротрубочкових сполук використовували АПМ, фосфоротіо-амідннй гербіцид, отриманий від Chemagro Division, Baychcm Corp. (США) та ТФЛ, дннітроаніліновий гербіцид, отриманий від DosvElanco (США).

Рослини вирощували в асептичних умовах на безгормональному середовищі Мурасіге-Скуга (MC) (Murashige & Skoog, 1962) при освітленні 4-5 клк та температурі 25°С. При симетричному злитті в якості реципієнтів використовували канаміцин-стійкі лінії рослин N. sylvestris та A. belladonna, при асиметричному - рослини N. sylvestris та A. belladonna дикого ткну. Мсзофільні протопласти виділяли за відпрацьованою раніше методикою (Сидоров и др., 1985). Для отримання у-гібридів (асиметрично 'злиття) протопласти рослнн-донорів опромінювали у-иромспями в дозі 200 Гр (потужність дози - 9,6х10'2 Гр/с, . 60Со). Злиття ме.чофільпих протопластів проводили за методикою Мепцсля та снівавт. (Mcnczel ct al., 1981). Культивування продуктів злиття N. plumbaginifolia + N. sylvestris здійснювали в рідкому поживному середовищі КМ8р (Kao & Michayluk, 1975), а N. plumbaginifolia + A. belladonna - в рідкому поживному

середовищі MO-1 (Gleba et at., 1982). Селективний тиск здійснювали па стадії 3-5 клітинних поділів, додаючи в культуральні середовища селективні концентрації АПМ (5 мкМ) чи ТФЛ (12 мкМ), відповідно, та 100 мг/л канаміцину (в разі отримання гібридів при симетричному злитті). Регенерацію гібридних клонів N. plumbagin іfo І і а + \Т. sylvcstris проводили на твердому селективному середовищі МС, що містило 1 мг/л кінетшіу, 0,1 мг/л 3-індолилоцтової кислоти (ЮК) та селективні концентрації АПМ чи ТФЛ, а також 100 мг/л канаміцину - в разі отримання гібридів шляхом симетричного злиття. При селекції гібридних клонів N. plumbaginifolia +

A. belladonna використовували селективне тверде середовище МС, що містило 1 мг/.'i з'сатину, 0,1 мг/л ЮК, селективні концентрації АПМ або ТФЛ, а також у випадку симетричного злиття - 100 мг/л канаміцину. Регенеранти вкорінювали на бсзгормоііальиому середовищі МС, а потім висаджували в грунт.

Для первинної перевірки гібридних ліній на стійкість до АПМ або ТФЛ проводили аналіз регенераційної здатності їх листових експлантів на відповідних регенераційних середовищах, які містили селективні концентрації гербіцидів. Порівнювали також різницю приросту калусу батьківських та гібридних рослин, на середовищах для калусогснезу з різними концентраціями АПМ або ТФЛ через 4 тижні після їх висадки. Калус індукували, відповідно, на середовищах для калусогенезу тютюну (Сидоров и др., 1985) та беладоини (Eapen et а]., 1978).

Для оцінки фертильності гібридів проводили самозапилення та в ряді випадків зворотнє запилення. Для аналізу успадкування стійкості до АІІМ та ТФЛ в їх першому поколінні насіння, одержане від самозапилення та зворотнього запилення, стерилізували та висаджували на середовища бел гербіцидів та середовища з селективними концентраціями АПМ чи ТФЛ.

Для проведення цитогенетичного аналізу кінчики коренів рослин обробляли 0,5%-ним розчином колхіцину, фіксували в суміші етанол/оцтова кислота (3:1) та фарбували ацстоорсеїиом (розчин 1%-ного орсеїну в 45%-ній оцтовій кислоті). Давлені препарати готували в 45%-ній оцтовій кислоті.

Імунофлюоресцентний аналіз стійкості кортикальних та мітотичних мікротрубочок мезофільпих протопластів гібридних та батьківських рослин до АПМ та ТФЛ здійснювали за методом (Meijer & Simmonds, 1988) з деякими модифікаціями. Мікротрубочки фарбували мишиними монокло-нальиими антитілами Ти-С)1 проти а-тубуліну. ДНК в клітинах фарбували за допомогою Hoechst 33258.

Виділення та очищення тубуліпу із мезофілу рослин N. plumbaginifolia, N. sylvestris, A. belladonna та гібридів, отриманих на їх основі , проводили за методом (Morejohn & Fosket, 1986) з деякими змінами. Двомірнин електрофорез тубуліпу здійснювали за методом (O'Farrell, 1975). Імуноблотииг субодиниць тубуліпу проводили за методом (Towbin et al..

1979). Для ідентифікації а-субодішиці використовували моиоклональні антитіла Ти-01, а для ß-субодиниці - Tu-Об, які були люб’язно надані д-ром

В. Вікліцкі (Ін-т молекулярної генетики, Прага, Чеська Республіка).

Для статистичної обробки експериментальних даних використовували стандартні методи обробки результатів (Деркач, 1963; Урбах, 1964).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

І. Отримання гібридів N. plumbaginifolia + N. sylvestris та

N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійких до дії АПМ та ТФЛ

Вивчення впливу селективних коннснтраній АПМ. ТФЛ та канамінину на протопласти чутливих ло їх дії батьківських ліній. Відомо, що АПМ (Mörejöhn & FöSket, 1984) і ТФЛ (Morejolin & Fosket, 1991) являються одними з найбільш ефективних антимікротрубочкових сполук, які руйнують мікротрубочки клітин рослин, що призводить до втрати платності клітинами ділитися під час мітозу. Однак чутливість до цих речовин може варіювати в залежності від об’єктів, на які вони виливають (Falconer & Scaguli, 1987). Канаміїшн - аміноглікозидний аптибіотлк бактеріального походження - специфічно зв’язується з 708-субодиницями рибосом, при-водячи до помилок при зчитуванні мРНК і, таким чином, інгібує біосинтез білку в еукаріот з наступною загибеллю чутливих клітин (Гейл и др., 1975; Мапиатис и др., 1984). Тому на першому етапі дослідженнь вивчали вплив селективних концентрацій АПМ (5 мкМ) та ТФЛ (12 мкМ) на мезофільні протопласти N. sylvestris та A. belladonna та канамінину (100 мг/л) - на протопласти мутантів N. plumbaginifolia, щоб визначити, чи приводять селективні концентрації даних речовин до повного інгібування росту клітин чутливих рослин.

Після внесення в середовища для культивування протопластів N. sylvestris та A. belladonna 5 мкМ АПМ або 12 мкМ ТФЛ, клітини повністю припиняли свій ріст і гинули. В подальшому при дослідженні виливу різних концентрацій АПМ та ТФЛ на ріст калусів цих рослин нами було показано, що для клітин калусу N. sylvestris критичними є ті концентрації АПМ, які лежать в межах 1-3 мкМ (Рис. 1а), ТФЛ - до 2 мкМ (Рис. 2а). Для калусу A. belladonna - критичними являються концентрації АПМ та ТФЛ в діапазоні до 1 мкМ (Рис. 2а, 26). Концентрація 100 мг/л канаміцину теж була критичною для культивованих клітин N. plumbaginifolia. Оскільки таке повне пригнічення росту чутливих клітин до тих чи інших сполук в умовах їх селективного тиску важливе для селекції соматичних гібридів (Сидоров, 1990), то ці результати власне і дали підстави використовувати концентрації 5 мкМ АПМ, 12 мкМ ТФЛ та 100 мг/л канаміцину як селективні при отриманні гібридів. .

Олгкпія in vitro соматичних гібридів зі стійкістю ло дії АПМ та ТФЛ. Шляхом симетричної гібридизації протопластів АПМ-стійкого мутанту N. plumbaginifolia з протопластами канаміїїии-стіикої (Кшг) лінії N. sylvestris було відібрано 312 гібридних калу сів, резистентних до селективних концентрацій АПМ та канамішшу (Табл. 1). З них здатністю до

Табл. 1. Селекція соматичних гібридів, стійких до дії сполук з анти-мікротрубочкотім механізмом дії

Кількість от- Кількість ре- Кількість пі-

KoMÖiiiani« риманих казусів на Се- генерованих з калусів рослин дібраних гібридів на се-

лективному на селективно- лективному

середовищі му середовищі середовищі

Симстричпі гібриди

N. plumbaginifolia apmr + M. sylvestris Kmr 312 9,4 68

N. plumbaginifolia tflr + N. sylvestris Kmr 190 32 . 8

N. plumbaginifolia apm1' ^ A. belladonna Km1' , 102 22 13

N. plumbaginifolia tflr + A. belladonna Km' 61 Асиметричні 7 (у) гібриди 3

yN. plum!>aginifolia apmr +■ N. sylvestris 157 41 17

yN. plumbaginifolia tflr i N. sylvestris т 28 в

yN. plumbaginifolia apmr + A. belladonna 64 17 .5

yN. plumbaginifolia tflr + A. belladonna Л8 11' і

регенерації в умовах селективного тиску характеризувались тільки 68 ліній, з яких для аналізу було взято 12. При симетричному злитті нротоиластів ТФЛ-стійкого мутанту N. рІитЬадіпі/оІіа з протопластами канаміции-

стійкої лінії N. sylvestris було отримано 190 резистентних до ТФЛ та каиаміцшіу калусів, з яких могло регенерувати тільки 32 лінії, що відрізнялись між собою по швидкості росту. З них 8, нормально розвинутих, було взято для подальшого аналізу (Табл.1). Майже всі отримані міжвидові гібриди N. plumbaginifolia + N. sylvestris були морфологічно подібні до N. sylvestris, хоча частіша мала проміжний фенотип, який поєднував ознаки як донора, так і реципієнта, що підтверджує результати по отриманню гібридів при злитті в даній комбінації (Hung et al., 1993).

При симетричній гібридизації протопластів N. plumbaginifolia та A. belladonna було відібрано 13 АПМ- та каиамішш-стійких гібридних ліній (Табл. 1), серед яких 4 гібриди (NpAb-201, NpAb-202, NpAb-203, N'pAb-204) мали виражені морфологічні ознаки N. plumbaginifolia, а 9 були морфологічно подібними до A. belladonna. В аналогічній комбінації було також відселектовано 3 гібридні лінії, стійкі до ТФЛ та капамішшу (Табл. 1), які мали реципієнту або химерну морфологію.

В результаті у-гібридизації було отримано 17 АПМ-стійких гібридних ліній N. plumbaginifolia + N'. sylvestris, та б ТФЛ-стійких гібридних ліній нри злитті в аналогічній комбінації (Табл. 1), Внаслідок злиття в міжтрибній комбінації було отримано 5 високоасиметричиих АПМ-стійких та 4 ТФЛ-стійких гібридних клонів N. plumbaginifolia + A. belladonna (Табл. 1). Отримані гібриди успадкували фенотип реципієнтів N. sylvestris або A. belladonna, відповідно, що і слід було очікувати при асиметричній соматичній гібридизації рослин з використанням y-опромінення, оскільки воно призводить до інактивації клітин-донорів та індукції елімінації частини їх генетичного матеріалу (Глеба и Сьітник, 1984).

Первинна перевірка отриманих гібридних ліній па стійкість ло АПМ та ТФЛ. На першому етані для доказу наявності стійкості до АПМ чи ТФЛ у отриманих гібридів N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia + A. belladonna проводилась перевірка здатності листових сксплантів гібридних та батьківських ліній до регенерації на середовищах з селективними концентраціями даних гербіцидів. За цих умов на листових ексилантах мутантів N. plumbaginifolia та гібридів утворювалась велика кількість регенерантів, які на відміну від росліш-реципієнтів нормально розвивались в умовах селективного тиску. Аналогічні результати були отримані раніше нри тестуванні вихідних мутантів (Страшнюк, 1993).

Стійкість до АПМ та ТФЛ у отриманих гібридів була підтверджена при визначенні відносного приросту маси їх калусів в присутності різних концентрацій даних гербіцидів (Рис. 1, 2). Так, калус висаджували па середовища, які містили концентрації АПМ від 1 мкМ до 15 мкМ та ТФЛ від 1 мкМ до 20 мкМ. Калусні тканини, індуковані з гібридних рослин та мутантів, утворювали па середовищах з селективними концентраціями гербіцидів білий пухкий калус, тоді як нри тестуванні калусів N. sylvestris та A. belladonna спостерігали їх потемніння та гальмування росту. При по-

Приріст

маси

Приріст

маси

(а) (б) •

Рис. 1. Криві приросту миси калусів (%) батьківських та АПМ-стійких гібрилних рослин в присутності різних концентрацій АПМ: а) 1 - .V. plumbaginifolia apmr, 2 -гібрид NpNs-1, 3 - гібрид y>Jp№-3, 4 - N. sylvestris; б) i- іV, plumbaginifolia apmr, 2 -гібрид NpAb-106, З - гібрид yNpAb-1, 4 - /1. belladonna

І Ірлрісг маси

Приріст

мас»

(а)

(б)

Рис. 2. Криві приросту маси калусів (%) батьківських та ТФЛ-стшкнх гібридних рослин в присутності різних концентрацій ТФЛ: а) 1 - N. plumbaginifolia tflr, 2 - гібрид HN-1, З - гібрид 7NN-3, 4 - N. sylvestrix; б) 1- N. plumbaginifolia tflr. 2 - гібрид NA-4. З -гібрид у.Ч'Л-З, 4 ■ Л. belladonna

рівнянні відносного приросту сирої маси калусів гібридів та рецииієнтних ліній було встановлено, що всі гібриди мали підвищену стійкість до АПМ чи ТФЛ. Так, гібриди NpNs-1 та yNpNs-З були в 8 разів стійкіші до АПМ, ніж N. sylvestris (Рис. 1а), а гібриди NpAb-106 та yNpAb-1 - майже в 10 разів стійкіші, ніж A. belladonna (Рис. 16). Гібриди NN-1 -та yNN-3 характеризувались стійкістю до ТФЛ в 9-10 разів вищою порівняно з N. sylvestris (Рис. 2а), а гібриди NA-4 та yNA-3 мали стійкість в 7-8 разів вищу, ніж A. belladonna (Рис. 16). Підвищена резистентність гібридів до дії АПМ чи ТФЛ порівняно з рспипієнтними лініями дає можливість припустити, що гібридні рослини успадкували ознаки стійкості від відповідних мутантів N. plumbaginifolia.

II. Характеристика отриманих гібридів

ІІнтогенетичний аналіз гібридів. В подальшому для отримання прямих доказів щодо гібридної природи відсслсктованих ліній був проведений цитогенетичний аналіз. При аналізі соматичних гібридів доводиться враховувати тс, що в процесі культивування та регенерації рослин, зокрема гібридів, хромосоми можуть зазнавати сильної перебудови та сильно змінюватись порівняно з хромосомами вихідних видів рослин (Кунах, 1979; Larkin & Scowcroft, 1981). В нашому випадку цитогенетичний аналіз полегшувався завдяки тій обставині, що хромосоми рослин N. plumbaginifolia, N. sylvestris та A. belladonna морфологічно дуже відрізняються між собою. Так, диплоїд N. plumbaginifolia мае 20 телоцентричних або акроцс.нтричних різних за розміром хромосом, тоді як диплоїд N. sylvestris має 24 однакових за розміром метацентричних хромосом (Hung et al., 1993). У диплоїдної рослини A. belladonna присутні 72 метацентричні хромосоми, в два рази коротші та тонші, ніж хромосоми N. plumbaginifolia (Glcba ct al., 1988):

З результатів цитогенетичного аналізу видно, що АПМ- (Табл. 2) та ТФЛ-стійкі (Табл. 4) соматичні гібриди N. plumbaginifolia + N. sylvestris, отримані при симетричному злитті, містять невелику кількість хромосом донорів (за виключенням гібриду NpNs-22) та ди- або тетраплоїдний набір хромосом реципієнту, що свідчить про нсрснажну сегрегацію хромосом N. plumbaginifolia is даііній Комбінації. Ці результати можна розглядати як підтвердження відомих даних про спонтанну елімінацію геному донора N. plumbaginifolia (від 33% до 67%) при отриманні високоасимсгричних гібридів між N. plumbaginifolia та N. tabacum без якої-нибудь попередньої їх обробки (Agoudgil et al., 1990).

При симетричній гібридизації протопластів N. plumbaginifolia та .4. belladonna були відселектовані морфологічно різні гібриди, які відповідно мали різні набори хромосом (Табл. 2, 4). Так, АПМ- (Табл. 2) та ТФЛ- стійкі (Табл. 4) гібриди, які успадкували морфологію

A. belladonna, містили ди- або тетраплоїдний набір хромосом реципієнту та 1-3 хромосоми донору. Навпаки, гібриди з панелі NpAb-201 - NpAb-204 (морфологічно подібні до тютюну) містили ди- або тстранлоїдннй набір хромосом N. plumbaginifolia та декілька хромосом бсладопни. Наявність різних хромосомних наборів у цих гібридних рослин свідчить нро те, що у соматичних гібридів N. plumbaginifolia + A. belladonna не відбувалось переважної елімінації хромосом того чи іншого батька.

Таблиця 2. Характеристика хромосомних наборів АПМ-стіГіких соматичних гібридів, отриманих при симетричному злитті

Соматпчшій Хромосомний _________________Кількість хромосом_____________

гібрид/батько набір

______________________________________N. plumbaginifolia N. sylvestris .-1. belladonna

N'pNs-1 2n=24-25 1 ■ 23-24

NpNs-2 • 2n=49-50 1-2 48

NpNs-4 2n~50 2 48

NpNs-5 2n=49-50 1-2 48

N'pNs-7 2n=48-50 1-2 47-48

N'pNs-8 2n=25-26 1-2 24

N’pN's-10 2n=25-26 1-2 24

NpNs-12 2n=32-154 8-10 24

NpN.s-22 2n=44 20 24

NpAb-106 2n=145-!47 1-3 Ж

NpAb-107 2n=71-75 1-3 70-72

N'pAb-202 2n=26 20 .5-6

NpAb-204 2n=42 40 2

¡V. plumbaginifolia 2n=20 20

N. sylvestris 2n=24 24

.1. belladonna 2n~72 72

Скорочення: NpNs - сомагіічііі гібриди між N. phimbagimfolia і N. sylvestris, \трАЬ - соматичні гібриди між N. plumbaoinifolia і Л. belladonna, стійкі до дії А! І.М ' ’

АПМ- (Табл. 3) та ТФЛ-гтійкі (Табл. 5) міжвидові та міжтрибні гібриди, які були отримані внаслідок у-гібридішції (у-оироміпсния використовували для індукції елімінації генетичного матеріалу N. рІитЬадіпіїоІіа), містили незначну кількість генетичного матеріалу донорів та ди- або тстраплоїдні набори хромосом реципієнтів.

Таблица 3. Характеристика хромосомних наборів ЛПМ-стійких соматичних у-гібрндів .

Соматичний гібрид/батько Хромосомний набір Кількість хромосом

N. plumbag, inifolia N. si/Ivestris A. belladonna

yNpNs-З 2n=25 1 24

yNpNs-4 2n=49-50 1-2 48

yNp№-11 2n=25 2 4«

yNpNs-16 2 n=49-51 1-3 48

yNpAb-2 2n=146-149 2-5 144

yNpAb-4 2n=73-7B 1-6 72

yNpAb-5 2n=147-148 3-4 144

N. plumbaginifolia 2n=2G 20

N. sylvestris 2n=24 24 -

A. belladonna 2n=72 72

Скорочення: yNpNs - сохашчні y-гібриди між Л’. plumbaginifolia та N. sy Ivest ris, y.N'pAb - соматичні у-гібриди між N. plumbaginifolia ти A. belladonna, стійкі до дії ЛПМ

Таблнца 4. Характеристика хромосомних наборів ТФЛ-стійких соматичних гібридів, отриманих при симетричному злитті

Соматичний Хромосомний Кількість хромосом

і ібрид/батько набір N. plumbaginifolia N. si/lvestris /1. belladonna

NN-1 NN-3 NN-4 NA-1 NA-2 NA-4 N. plumbaginifolia N. sylvestris A. belladonna 2 п=24-25 2п=24-25 2п=27 2п-144-146 2п=144-146 2п=73-74 2а=20 - 2п=24 2п-72 1-2 23-24 . 1-2 23-24 3 24 2 142-144 2-3 140-142 1-2 72 20 • 24 ' 72

Скорочення: NN - соматичний гібрид між N. plumbaginifolia та N. sylvestris, NA - соматичний гібрид між N. plumbaginifolia та A. belladonna, стійкі до дії ТФЛ

Таблица 5. Характеристика хромосомних наборіп ТФЛ-стійких соматичних у-гібридів

Соматичний Хромосомний ______________Кількість хромосом

гібрид/'батько набір N. plumbaginifolia N. sylvestris /1. belladonni

yNN-2 2n=48-50 2 40-48

yNN-З . 2n=24-25 1-2 23-24

yNN-4 2n=48-50 2 4G-48 .

vNN-9 2n=27 3 24

yNA-І 2n=144-!45 2 142-144

yNA-2 2n=144-14R 2 142-144

yNA-З ■ 2n=73-74 1-2 72

yNA-4 2a=74-76 2-4 72

,V. plumbaginifolia 2n=20 20

N. sylvestris 2n=24 24

A. belladonna 2n=72 72

Скорочення: yNN - соматичний у-гібрид між N. plumbaginifolia та N. sylvestris, yNA - соматичний у-гібрид між N. plumbaginifolia та A. belladonna, стійкі до дії ТФЛ .

Вивчення Фертильності гібридів та успадкування ознак стійкості ло ЛПМ чи 'ГФЛ в їх першому поколінні. При аналізі фертильності 22 АПМ-і ТФЛ-стійких гібридів N. plumbaginifolia + N. sylvestris та /V. plumbaginifolia + A. belladonna спочатку були проведені досліди по самозапиленню цих рослин, що дозволило відібрати иефертильпі лінії. Як правило, такі гібриди характеризувались великими хромосомними наборами, що, напевно, і було головною причиною їх нездатності до нормального функціонування та утворення репродуктивних органів. Так, серед проаналізованих ліній рослин N. plumbaginifolia + N. sylvestris нефептильними виявились гібриди Np\Ts-4, NpNs-5, NpN's-7, yNpNs-16, NX-3. NN-9, yNN-З, yNN-4. Всі воші мали тетраплоїдшш набір хромосом реципієнта та 1-3 хромосоми N. plumbaginifolia, за виключенням гібриду yNN-З (2п=24-25). Останній мав редуковану квітку (з аномально розвинутою маточкою), наслідком чого була його повна нездатність до запилення. Серед проаналізованих ліній в комбінації N. plumbaginifolia + Д. belladonna нефертильиими виявились гібриди NpAb-204, yNpAb-2, yNpAb-j, NA-1, NA-2, yNA-І, yNA-2, геноми яких містили 144-149 хромосом (за виключенням гібриду NpAb-204, який мав 42 хромосоми: 2 хромосоми від беладонни та 40 хромосом від тютюну). Гібридні рослини, які

/

виявились фертильними при самозапиленні, в подальшому зворотньо запилювались відповідною реципієнтною лінією (.V. sylvestris чи A. belladonna). У гібридів NpAb-107 та К'А-І після схрещування з беладоішою не вдалось отримати насіння.

Для вивчення успадкування стійкості до АПМ та ТФЛ в першому поколінні гібридних рослин було проведено аналіз схожості насіння, отриманого від самозапилення та зворотнього запилення фертильних гібридів, на середовищах з селективпими концентраціями гербіцидів (5 мкМ або 12 мкМ ТФЛ) (Табл. 6). Процент схожості насіння від самозапилення у проаналізованих гібридів на середовищах без гербіцидів складав від 56,8% до 93,4%, з АПМ чи ТФЛ від 43,2% до 78,2% (для встановлення цих значень висаджували не менше 300 насінин кожного гібриду). Процент схожості насіння гібридів від зворотнього запилення з Ar. sylvestris або, відповідно, з A. belladonna ла середовищах без гербіцидів складав 32,7-87,8%, з гербіцидами - 26,7-63,2% (Табл. 6). Очевидно, що ознаки стійкості до гербіцидів передавались в першому поколінні гібридів по складній схемі. Можливо, цс пов’язано з аномальним хромосомним статусом гібридів чи відсутністю в деяких випадках гомологічної нари перенесених хромосом від N. plumbaginifolia, або ж зі складними порушеннями, які можуть відбуватися під час мейотичного поділу клітин в репродуктивних органах. Таким чином, ознака стійкості у фертильних АПМ- та ТФЛ-резистентішх гібридів може успадковуватись в першому поколінні цих рослин.

Таблиця 6. Схожість пасіїшя АПМ- та ТФЛ-стпікнх шмаїичмих гібридів в присутності селективних концентрацій гербіцидів

■ ^Схожість Гібриди —_ Самозапилення Зворотне запилення (я реципієнтом)

бел гербіциду а гербіцидом без гербіциду з гербіцидом

NpNs-1 90,1% 70.8% 87,8% 63,2%

NpNs-8 93,4% 78,2% 54,2% 33,8%

yNpNs-3 84,3% 72,8% 75,6% 58,9%

yNpNs-11 56,8% 43,2% 32,7% 26,7%

NpAb-107 78,4% 53,4% - -

NN-1 85,4% 62,8% - ' -

yNA-3 91,7% 75,4% 64,7% 49,8%

III. Докази природи стійкості гібридів

Аналіз гібпиліп за лопомогою імунофлюорсснеитної мікроскопії. Відомо, що хоча АПМ і ТФЛ належать до хімічно різних класів гербіцидів, воин характеризуються однаковими симптомами враження рослин та схожими механізмами дії: порушенням розвитку меристемн коренів та нагонів (Appleby & Valverde, 1989), що являється результатом деполімеризації сітки мікротрубочок після їх дії (Morejohn & Fosket, 1991). Відомо, що гербіциди цих двох класів зв’язуються з ізольованим тубуліном. рослин та інгібують збирання рослинних мікротрубочок in vitro (Morejohn & Fosket, 1991). Тому ;уія з’ясування стійкості мікротрубочок до дії АПМ чи ТФЛ в отриманих гібридах N. plumbaginifolta + N. sylvestris та N. phmbaginifolia + A. belladonna проводили імунофлюорссцситиу мікроскопію з мстою нізуалізації цих структур в інтерфазних та мітотичних клітинах після їх обробки даними гербіцидами.

При аналізі міжвидових гібридів та батьківських форм' було встановлено, що кортикальні мікротрубочки протопластів АПМ-стійкої мутантної лінії N. plumbaginifolia та отриманих гібридів N. plumbaginifolia + N. sylvestris, стійких до АПМ, зберігали свою нативну структуру після обробки 5 мкМ АПМ па протязі 2 год (Рис. 36, Зд - для гібриду yNpNs-3). Аналогічні результати для вихідного мутанту вже були представлені раніше (Страшнюк, 1993). Було показано, що стабільність сітки мікротрубочок мутанту до даної речовини пов'язана з появою зміненої субодшпщі ß-тубуліну, що, можливо, є результатом мутації н гені ß-тубуліпу (Страшнюк, 1993). Кортикальні мікротрубочки протопластів, виділених з N. sylvestris, руйнувалися за цих умов (Рис. Зг).

Відомо, що більш чутливими до дії антимікротрубочкових сполук являються мітотичні структури (нрепрофазна стрічка, веретено поділу, фрагмопласт) (Hoffman & Vaughn, 1994). тому пастушиш етапом досліджень було вивчення виливу АПМ на регенеровані протопласти гібридних та батьківських рослин. Було показано, що повис руйнування мітотичних веретен регенерованих мезофільних протопластів N. sylvestris також виникає tipil обробці АПМ в концентрації 5 мкМ на протязі 2 год. Однак веретена мутанту та гібридів, як і кортикальні сітки мікротрубочок, за аналогічних умов обробки були резистентними до дії АПМ та зберігали свою нативную форму.

При тестуванні чутливості мікротрубочок протопластів гібридних рослин N. plumbaginifolia + N. sylvestris, стійких до трифлюраліиу, було показано, то як і в випадку з ТФЛ-стііікими мутантами N. plumbaginifolia (Страшнюк, 1993; Блюм п др., 1996), їх кортикальні та мітотичні мікротрубочки не руйнувалися при обробці 12 мкМ ТФЛ на протязі 2 год. Мікротрубочки протопластів батьківської лінії N. sylvestris повністю

дснолімеризувалися після дії даної речовини за цих умов. Певне, стійкість мікротрубочок гібридів до дії АПМ чи ТФЛ може бути мов язаііа з наявиіс-

Рис 3. Результати імупофлтоорссиеппіоГ мікроскопії кортикальних чперотруйочок після їх пофарбування монок.юнальшімк антитілами TU-01 в протопластах без обробки (а, ») та після обробки АПМ (б, г, д): а, б - АПМ-стШкші мутант ,V. plumbaginifnlia; в, г - N. sylvestris; д - yNpNs-З. Масштаб: в 1 см - 20 мкм. )

\ ' '

Рис. 4. Результати шзуалізації мікротрубочок за допомогою мопоклопплышх антитіл TU-01 (а, б, в) та пофарбування ЛИК за допомогою Hocchst !£Ш8 (г, д, с) і> регенерованих протопластах після їх обробки АПМ: а, г - АПМ-стііікніі мутант N. plumbaginifolitr, б, д - A. belladonna-, в, е -NpAb-107. Масштаб: в І см - 10 мкм.

тю мутантного тубуліну, успадкованого віл АПМ- або ТФЛ-рсзистсптної рослини N. plujnbaginifolia, який входить до їх складу.

При аналізі АПМ- або ТФЛ-стійких міжтрибних гібриді» ;V. plumbciginifolia + A. belladonna та батьківської лінії A. belladonna було встановлено, що и регенерованих протопластах Л. belladonna після обробки 5 мкМ АПМ або 12 мкМ.'ТФЛ теж спостерігалося повне руйнування мітотичних мікротрубочок (Рис. 4, зокрема для гібриду N’pAb-l07). Як зіідпо із Рис. 4 в протопластах АПМ-стііікої лінії N. plumbaginifolia та гібриду NpAb-107, іцо діляться, за даних умов клітини не зупинялися в

промстафазі та зберігали нормальну форму веретена поділу (Рис. 4а, 4в). Протопласта, які аналізувалися, додатково забарвлювали за допомогою Hoechst 33258 для детекції положення ДНК в клітинах (Рис. 4г, 4д, 4е).

Із результатів імунофліооресцснтного аналізу можна зробити висновок, що мікротрубочки і кортикальних сіток, і мітотичних структур протопластів АПМ- та ТФЛ-стійких гібридних ліній рсзестентиі до дії даних антимікротрубочковнх сполук на відміну від таких рецинієнтних ліній (N. sylvestris, A. belladonna). Отже, стійкість мікротрубочок гібридів могла би бути пояснена наявністю в складі їх мікротрубочок мутантної ізоформи ß-субодиниці тубуліиу (як у випадку мутантів), яка сксирееується в результаті переносу мутантного гену ß-тубулину від АПМ- чи ТФЛ-стійкої рослими N. plumbaginifolia. •

Біохімічний аналіз гібридних ліній. Відомо, що стійкість різних мутантних ліній нижчих еукаріот, клітин ссавців та рослин до антимікротрубочковнх сполук забезпечується появою генетичних змін в одній із субодиниць тубуліиу (Блюм н Страшнюк, 1993). Як уже згадувалось ишцс, у АПМ- та ТФЛ-резистентних ліній порівняно з чутливим типом N. plumbaginifolia були виявлені зміщення в більш кислу область однієї із. ізоформ ß-тубуліну (Рис. 56 для АПМ-стійкого мутанту), котра і забезпечувала стійкість мутантних рослин до даних речовин (Страшнюк, 1993).

Для того, щоб проаналізувати наявність мутантної ізоформи ß-субодинині тубуліиу в складі мікротрубочок гібридів N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia+A. belladonna був проведений двомірнин електрофорез тубуліиу гібридних та батьківських рослин з наступним імуноблотингом. Результати цих аналізів дали можливість встановити присутність в гібридах N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia+A. belladonna поряд з ізоформами а- та ß-тубулінів реципієнтів додаткової ізоформи ß-тубуліну, яка була характерною для мутантів N. plumbaginifolia. Положення мутантної ізоформи ß-субодипиці тубуліиу серед інших ізоформ цього білку у гібрида N. plumbaginifolia +. A. belladonna (NpAb-107), стійкого до АПМ, показано на Рис. 5г. Отже, в кожному із проаналізованих випадків появу цієї додаткової ізоформи ß-тубуліну на електрофореграмах тубуліиу гібридів слід пов’язувати з переносом мутантного гену ß-тубуліну та ного екснресіею від рослини-донора N. plumbaginifolia.

Ці дані дають можливість припустити, що отримані нами соматичні гібриди N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia +

A.belladonna, стійкі до АІІМ чи ТФЛ, успадкували мутантний ген ß-тубуліну від відповідної резистентної батьківської лінії N. plumbaginifolia, який здатен забезпечувати стійкість гібридів до дії цих антимікротрубочковнх сполук.

Рис.5. Результати двомірного електрофорезу тубуліну, пиділеного а - контрольної рог.шііи .V. !>iumbaginifolia. чутливої до АПМ: б - АПМ-стійкоіо муіанту

■V. plumbaginifolia', в - рослішії A. belladonna: г - соматичного гібриду .V. plumbaginifolia -г Л. belladonna (NpAb-107). ‘

Таким чином, нами вперше серед вищих рослин отримані високофулкціоиальні соматичні гібриди N. plimbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійкі до речовин з антимікро-трубочковим механізмом дії - амінрофосметилу (фосфоротіоамідного гербіциду) та трифлюраліиу (динітроанілінового гербіциду). Дані рослини представляють собою клітинні системи з маркерним білком (мутантна ізоформа ß-тубуліиу, яка з’являється внаслідок успадкованім генетичного матеріалу від N. plumbaginifolia) в складі їх гібридних мікротрубочок, котрий відповідає за резистентність до вищеназваних сполук. Результати експериментів дають можливість стверджувати, що оскільки мутантний геп тубуліну, котрий забезпечує стійкість до аміирофосметилу чи трифлюраліиу, поки що не ізольований, то нсрснос цієї ознаки стійкості до інших видів рослин можна здійснювати за допомогою методу соматичної гібридизації. В подальшому, гібриди, які успадкували мінімальну кількість

хромосом від N. plumbaginifolia, можуть бути використані, для ідентифікації та клонування мутантного гену тубуліну я ціллю перенесення його у важливі сільськогосподарські культури для отримання стійких до даних гербіцидів сортів рослин.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою методу симетричної соматичної гібридизації отримані гібриди в комбінаціях N. plumbaginifolia + N. sylvestris та N. plumbaginifolia + A. belladonna, стійкі в кожному із випадків або до аміпрофосметилу (АПМ), гербіциду фосфоротіоамідного раду, або до трифлюраліну (ТФЛ), гербіциду динітроанілінового ряду. Ця стійкість була перенесена до гібридних клітин від відповідних батьківських ліній N. plumbaginifolia, резистентних до аміпрофосметилу або трифлюраліну.

2. За допомогою методу асиметричної гібридизації (шляхом у-опромінення донорних ліній) отримані високоасиметричіп гібриди зі стійкістю до АПМ та ТФЛ в тих же комбінаціях, що і в випадку симетричної гібридизації.

3. На підставі результатів нитогсиетичного аналізу та результатів вивчення успадкування ознаки стійкості у першого покоління фертильних соматичних гібридів продемонстровано, що їх стійкість до АПМ та ТФЛ е прямим наслідком переносу генетичного матеріалу від відповідних мутантів N. plumbaginifolia.

4. Встановлено, що як і кортикальна сітка мікротрубочок, так і мітотичні структури мікротрубочок в протопластах, ізольованих із соматичних гібридів, стійких до гербіцидів з антимікротрубочковим механізмом дії, характеризуються підвищеною стійкістю до АПМ та ТФЛ в кожному окремому випадку. Цс дозволяє стверджувати; що як і в випадку батьківських мутантних ліній N. plumbaginifolia, стійкість гібридів може бути наслідком генетично обумовлених змін структури мікротрубочок.

5. За допомогою двомірного електрофоретичного аналізу підтверджено, що стійкість окремих гібридів до АІІМ і ТФЛ пов’язана з наявністю мутантних ізоформ ß-тубуліну, успадкованих від батьківських N. plumbaginifolia.

6. Виходячи з результатів соматичної гібридизації запропоновано використання ознаки стійкості до АПМ та ТФЛ як селективних маркерів у соматичній гібридизації рослин, а мутантного ß-тубуліну - як маркер для вивчення функціонування систем мікротрубочок в гібридних клітинах.

7. Продемонстрована принципова можливість використання асиметричної гібридизації для переносу ознаки стійкості до гербіцидів з антимікротрубочковим механізмом дії від відповідних мутантних рослим в філогенетично віддалені види вищих рослин.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації

1. Емец А.И., Страшнкж Н.М., Блюм Я.Б. Получение соматических гибридов высших растений с использованием мутантов по тубулииу // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Рос. сими. (Пущино, 18-20 мая 1993 г.).-Пущино, Россия, 1993.-е. 138.

2. Blume Ya.B;, Yemcts A.I., Strashnyuk N.M., Glcba Yu.Yu. Somatic hybrids of higher plants with mutant bcta-tubulin //’ Abstr. of XV Int. Botanical Congress (Yokohama, Japan, August 28- September 3, 1993).-Yokohama, Japan, 1993.-p.550.

3. Ycmets A.I., Kundelchyk. O.P., Blume Y.B., Glcba Y.Y. Asymmetric somatic hybrids using 3-tubulin mutants of Nicotiana plumbaginifolia // Abstr.of VIII Int. Congress of Plant Tissue & Cell Culture (Firenze. Italy, June 12-17, 1994).-Firenze, Italy, 1994.-p. 101.

4. Ycmets A., Rudas V., Strashnyuk М., Blume Ya.B. Symmetric hybrids using p-tubulin mutants of Nicotiana plumbaginifolia /'/’ Abstr. of IV Eur. Congress of Cell Biology (Prague, Czech Republic, June 26 - July 1, 1994).-Praguc, Czccli Republic, 1994.-p. 448.

5. Blumc Ya.B., Ycmets A.I., Kundel’chuk O.P., Smertenko A.P., Solodushko V.G:, Strashnyuk N.M. Somatic hybrids with mutant tubulin / / Abstr. of Int. Symp. "Plant Biotcch. & Genet. Engineering" (Kiev, Ukraine, October 3-6, 1994).-Kiev, Ukraine, 1994.-p. 9.

6. Ycmcts A., Rudas V., Smertenko A., Blumc Ya.B. (1994) Characterization of symmetric hybrids with mutant (5-tubulin / / Abstr. of Int. Symp. "Plant Mol. Biol. & Biotech." (New Delhi, December 14-17,

1994).-New Delhi, India, 1994.-p. 38.

7. Yemets A., Solodushko V., Smertenko A., Kuntlclchuk O., Blume Ya.B. Antimicrotubular drug-resistant plants and their somatic hybrids with mutant p-tubulin // Abstr. of 10th Eur. Cytoskeletal Forum (Stockholm, Sweden, May 27-31, 1995).-Stockholm, Sweden, 1995.-p.71.

8. Yemcts A.I., Smertenko A.P., Solodushko V.G., Kundelchuk O.P., Blumc Ya.B. Asymmetric somatic hybrids with mutant p-tubulin resistant to amiprophosmcthvl .// Proc. of Int. Symp. Plant Mol. Biol. & Biotcch., New Delhi. 1995.-P. 45-51.

9. Blume Ya.B., Kundel’chuk O.P., Solodushko V.G., SuHmcnko V.V., Ycmcts A.I. Asymmctric somatic hybrids of higher plants resistant to trifluralin // Proc. of Int. Symp. on Weed & Crop Resistance to Herbicides. Kluwer Academic Publishers. 1995.-P. ¿'«¿'“¿V7.

10. Емец А.И., Кундельчук О.П., Смертепко А.П., Солодушко В.Г.,

Блюм Я.Б., Глеба Ю.Ю. Соматические гибриды высших растений с использованием мутанта Nicotiana plumbaginifolia, устойчивого к аминрофосметилу // Генетика.-1996.-Н 7.-С. ,

11. Емец А.И., Блюм Я.Б., Смсртенко А.П., Купдельчук О.Р., Рудас

В.А., Глеба Ю.Ю. Получение 7-гибридов высших растений с мутантным р-тубулином // Доклады Академии наук (Россия).-1996, в печати.

Yemets A. I. Somatic hybrids of Solanaccae on the basis of Nicotiana plumbaginifolia mutants resistant to action of antimicrotubulc compounds.

Thesis for gaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.25 - Cell Biology, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1996.

The results of 11 scicntific publications are defended.

As a result of symmetric and asymmetric hybridization high functional N. plumbaginifolia + N. sylvestris and N. plumbaginifolia + A. belladonna somatic hybrids with the resistance to amiprophosmethyl (phosphorotioamide hcrbicide) or trifluralin (dinitroaniline herbicide), respectively, were obtained. By genetic, cytogcnctic analysis, immonofluorescent microscopy methods and biochemical analysis it was shown that resistance deals with the transfer of mutant tubulin gene, because its product - the mutant p-tubulin isoform - is the component of microtubulcs of hybrid cells.

Емец А. И. Соматические гибриды Пасленовых на основе мутантов Nicotiana plumbaginifolia, устойчивых к действию соединений с антимикротрубочковой активностью. •

Диссертация на соискание ученой степени кандидада биологических наук но специальности 03.00.25 - клеточная биология, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1996.

Защищается 11 научных работ по теме диссертации.

В результате симметричной и асимметричной гибридизации получены высокофункциональные соматические гибриды N. plumbaginifolia + N. sylvestris и N. plumbaginifolia + A. belladonna, устойчивые и каждом из случаев к действию антимикротрубочковых веществ - аминрофосметила (фосфоротноамидного гербицида) и трифлюралина (динитроанилинового гербицида). С помощью генетического, цитогенетического анализа, методов нммунофлюорссцентной микроскопии и биохимического анализа установлено, что устойчивость связана с переносом мутантного гена тубулина, продукт которого - мутантная изоформа р-тубулииа - является составной частью микротрубочек гибридных клеток.

Ключевые слова: микротрубочки, р-тубулин, антимикротрубочковые вещества, устойчивость к гербицидам, аминрофосметил, трифлюралип, перенос устойчивости, соматические гибриды. .