Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ ПИГМЕНТОВ И ИХ ФОТОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ДЕТЕРГЕНТОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ ПИГМЕНТОВ И ИХ ФОТОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ДЕТЕРГЕНТОВ"

ÎSÎSÔ

'ГУТ—" un OOCP

ШЯНПТ ШШИП ш. Л.Н.БАХЛ

Л.Н.ЛНкНЖДЯ

H И

в в w мспомк

iltopifipit

Исюква - 197$

f]h^t -^сля-н /rf"£

шдешя НАУК ссср

ОРДЕНА хняои ИНСТИТУТ ВНШИШ ш, А.Н.БШ

На црамх рукошож

А.Н.ЛУГАНСКАЯ

юшнггав и пс «отскпичвсяая активность в водных растворах дктнртаггов.

( Стющшжыюсть 03,00,04 - 6*01

)

Авторефе рат

дасовртвцм не оомскаяме учено! степени кандждвта диалогических нвртс

Москва - 1975

Работа выполнена в лаборатория фотобиохкмик Ордена Ленива Института биохимия ш. А.Н.Баха АВ СССР • в Институте фотосинтеза АН СССР

Научннй руководитель: - ' Член-корреспондент АН СССР, профессор А. А. КРАСНООСКИЯ

Официальные оппоненты: Лектор биологических варе, профессор Ю.А.ВДАДИШРС® Доктор биологических наув, профессор Г.А.ДЕБОРИН

На официальные отзыв работа направлена на кафедр; Оиофязюси Онологкческого факультета ИГ7

Автсреферат разослан 1975 г. -

Защита диссертации состоятся " 1975 г.-

на заседании Ученого Совета Ордена. Женина Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.

С дяссертацкеД можно оанакоыитьси а Сивжиотеке Биологического отделения АН СССР / Иосяаа,B-7IДеюгаекка проспект 33/

Ученый секретарь Ордена Ленина Института биохимии

им. Д.Н.Баха АН ООСР кандидат биологических ваук Н.Н.ДЫЧВОВ

- Согласно современным представлениям, энергия света, поглощенная хлорофиллом;' преобразуется в фотосиитетической це-ш переноса алектрона, в которой фотохимические реакции пигментов сопряжены в работой Сиохимжчесхих ока слительно-восста-нсвктельшх систем. Хлорофилл при атом является фотосвнсиби-лизатороы, обеспечивая перовое алектрона "против" термодинамического потенциала. ■

.. . Изучение мздеиштх реакций о пигментами в гомогенной г ' фазе подвалило обосновать механизм фотосеясмбидизирупцего , действия хлорофилла, в основе которого лежат обратимые фотохимические превращения пигментов / Красновекий, Евстигнеев, 1940-1974 /. Однако кошюкеити влектро иного транспорта в пигменте локализовали в мембранах хюрошастов и хроматофоров, ■ деятельность хлорофилла как сенсибилизатора протекает в гетерогенных системах этих структур. Отегща естественно стремление исследователей к усложнению модельных систем да пути постепенного приближения к состоянии пигмента в живой метке.

В »той свези перспективным является использование в качестве модели водных мицеллярннх растворов поверхлостно-ах-тш веществ / ПАВ /. Внутренняя часть мицелл детергентов представляет собой жядку» угле водородную структуру* тогда как внешняя оболочка мицелл оостокт из гидрсермлеиых груш» окруженных молекулами вода.

Хлорофилл и его аналоги, нерастворимые а воде, солюбилк-мругтея в шщелдах детергентов, образуя прозрачные растворы, обладающие интенсивной люминесценцией / Крвсновский, Бржя, Х948 /. Пигменты при мом оказываются фиксированными в мицеллах ЩВ. Поскольку мицеллы распределены по всему объему раствора, 'а прочие компоиентк фотооекоиб]Ш1зкровакно& реакция свободно диффундируют в водной фазе, такая система мдоводует состояние хлорофилла в хлоропласте, где пигмент'евльгн о ли-попротеидаой мембраной;

Следует отметить, что широкое применение детергентов для оолюбихизеции клеточных структур и фракционироодшя фотоситем фотосинтеза требует анаши природы взаимодействии »¿¿»игровая- -них пигментов с ШВ.

. Кроме того, в листьях растений фотосеыснбилхэировашше

реакции протекают в присутствии кислорода, поскольку имеется данные о том, что кислород, выделяемый при работе второй фотосистем* может включаться в цепь: фотосинтетического переноса электрона /7г«псЬ, Тогк,19бО} Бе ХоисЬкотвку, 1969 Л

В связи о швеизлохеиным мы предприняли попытку моде-лированяя реакций первой фотосистемы в присутствии кислорода в водных растворах детергентов. В качестве доноров влек-трона в основном использовались сульфгидрилыше соединения, в качестве акцепторов влектрона - вещества с высоким окислительно-восстановительным потенциалом - мстшшкологен к фер-редоксин, являхщиесл конечными акцепторами электрона в первой фотосистеме.

■. ■ ь Задачи настоящего исследования могут быть кратко сфор- -цулировалы следупцим образом:

1. Изучение состояния хлорофилла и его аналогов в водных растворах трёх типовдетергентов: неионогенном, катиояо-^ активном я анионоактивном при различных концентрацияхпо-верхностно-актквного вещества и рН раствора.

2. Сравнительное исследование фотосенсибилиэированно- ■ го хлорофиллом и его аналогами восстановления метилвиологе- ' на х других акцепторов »лектрона в органических растворах; годных растворах детергентов и водных средах в аэробных ж -анаэробных условиях. '

3. Исследование механизма фото сенсибилизированного воо-отановлевкя акцепторов электрона сульфгидрнльными соединениями в присутствии кислорода,

. МАТЕЕИШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Солгбилизаодя пигментгв исследовалась в водных растворах неионогенного детергента тритона Х-100 / соляоксиэтяли-рованного иэ" '«.тилфенола /, катионоактивпого цетилтриметкх-амяонийбромида / ЦТАБ / к анионоактявного додецилсулъфата натрия / ДСН /.

Тритон Х-100 обладает мицеллярным весом 90 ООО я критической концентрацией мицеллообразования / ККЫ / 9» 10 II / Венфельд,1Э65 /. Иицелла ЦТАБ состоит из положительно заряженных ионов цетилтркметиламмоння с мицеллярным весом

61 700 и КВУ КГ9!! / Шинода, 1966 /. Лкиокоактивный ДОН при растворении в воде диссоциирует с образовавшем отрицательна заряженных ионов додешисульфата, мицеллы из которых имеют мицежлярный вес 23 200 и КЮ1 Ю'^М / Шшюда, 1966 А . Для приготовления растворов пигментов в ПАВ к определенному объему буферного раствора исследуемого {Л приливали концентрированный раствор детергента, чтобы получить заданную концентрации ПАВ, а затем прибавляли концентрированный раствор патента в втидовом спирте. Конечная концентрация патентов составляла 10"5 И.

Все пигменты получались методами, принятыми в допев лаборатории, вклотаищвш на последней стадии выделения хро-1Штогра$4счвское разделение на сахарозе. Хлорофшлы "а4 и "б" и феофитин "а" выделялись из высушенных листьев крапивы, баатериоиюрофидл и бактериовяридин - из культуры пурпурных серой бактерий КЬоО»р»««<1<шаам ра1иеЪг1в и зеленых сер-шис бактерий СЫогорввийсшоплл еЪЪгИсш! , протоыорофядл — к$ внутренних оболочек семян тыквы.

Спектры поглощения еолюбилиэированных пигментов регистрировали на спектрофотометре №-14. Спектры флу 1ресценции измеряли на спектрофхуорометре, состоящем из спектрографа ИСЦ-51, фотоэлектрической приставки Ф50-1 с фотоумножителем вЗУ-22 и усилителя 5ШУ-01. Запись спектров производили на регистрирующем потенциометре ШП-ОЭ. Для возбуждения лвми-весценции использовали ртутао-кварцевую лампу ДШ-250 со светофильтрами ЭС-3 и ФС-6, сропускапцями линии ртути 365 км и 404 нм.«Определение окислительно-восстановительно— го потенциала среды , проводили с полнощью гладких платиновых электродов в видоизмененное трубке Тунберга. р!1 растворов контролировали при помощи лабораторного рВ-метра ЛПУ-01.

В качество фотосенсибилизаторов исследовались указанные пигмента, а такие растворимый в воде гематопорфирин. Донорами электрона служили тиомочевина, цястеин, глюгатпон, аскорбиновая кислота, гвдрот;лн, резорцин, пирокатехин и ряд других. Акцептором электрона - преимущественно метил-виологен, а также ферредрксин, сафранин и метиловый красный.

ФотооенсиОиялэированные реакции изучались в анаэробных з аьробных условия с. За течением фотосеноибилизкрованного

процесса следили по изменению оптической плотиостя в главных максимумах поглощения акцептора влзктрона и пигмента-сенсиби-лягатора при освещении растворов. Освещение осуществлялось конденсированным светом лампы докаливания мощкосты» 300 ватт /да 106 эрг/см^ сек / через водяной фильтр ж различные абсорбционные светофильтры, выдьдяициеразличные участки спектра.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. СОЛЮЫШЗАЦИЯ ШИШЛОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ВОШИШОСТШ- ■ А1СТИШЫХ ВЕЩЕСТВ

Молекулы патентов обладают характерными 1гверхностно -активными свойствами. Все они состоят из гидрофильной спст«м< четырех пярролышх колец о атомом магния в центре и гидрофобного углеводородного "хвоста" / фаряеэола у бактериовиридина ш фи тола у другьх пигиентов /. Наличие или отсутствие атома магния в центре порфиринового кольца молекулы И различные аа-ме'тители 7 пиррольных колец определяет молвхудярную структуру каждого пигмента.

Иц исследовали спектры поглощения и спектры лпикнесцен-ции шести пигментов - аналогов хлорофилла - хлорофидлов "а", "б", феэфитийа "а", протохлорофилла, баятериогярхдшш к бак-териохлорэфилла в растворах трех различных детергентов - три-, тоне Х-100, ЦГАБ и ДСН при изменения концентрации детергентов / от 0,001$ до 1% / и рН среды / в пределах рН 4-12 /.

Спектры поглощения пигментов. Оря добавлении концентрированных растворов пигментов в спирте в водный раствор ШВ , содержащая ищешш, ва&вдхается садвОклизация всех исследованных пигментов, "что проваляется в возрастании амплитуда красно! полосы поглощения и уменывелии ширины полос поглощения но сравнены» о водными коллоидными растворами пигментов

Максимальная ивтенсевность осаовной полосы поглощения, пигментов наблюдается при концентрации тритона Х-100 ЦТАБ - 0,1ДСН — 0,25%. Дальнейшее увеличение концентрации детергентов, приводящее к возрастание количества кгхелд в

растворе не оказывает догоняя ка общий вид спектров поглощения пигментов при прочих равных условиях / рн раотвора, природа детергента А

Положение водсю поглощения пигментов в растворе тритона I-ICO при концентрации ПАВ 0,5-Ií указывает на то, что все дктенты, за исклтенаем феофитана находятся в мицелле этого детергента в мономерной форме. С:уменьшением концентрации детергента ниже 0,£С в спектрах поглощения пигментов обнаруживаются шк мономерша, так и агрегированные формы, причем положение длинноволновых максимумов я отношение ах автен-сквнооти к интенсивности максимумов мономерных форм-, зависит как от концентрации детергента, так к от рН,раствора.

В ДСП даже при высоких концентрациях DAB в спектрах поглощении пигментов наряду о максимумами мономерннх форм на-блвдаются максимумы агрегированных форм. Возможно, содюбкли-вацкя пигментов в »том детергенте затруднена вследствие влек-Тростатического отталкивания между отрицательно заряженной мицеллой ДСН и частчлами пигмента, ннёщшш в водной среде также отрицательный заряд /lUa*ini, Тоогп,1963 / ЦТАБ по' оолвСклизаквн пигментов занимает промежуточное положение между тритовом Х-100 и ДСЯ / тай*. I /.

Спектра лтомияеепешти.' В аэробных водных коллоидных растворах при +20°С пигменты не обладают флуоресценцией. В растворах детергентов при концентрации ПАВ 0.&-IÍ все иоследоваяние шгментн обладают отчетлявым свечением при комнатной температуре tt в присутствии воздуха, В спектрах лшинесцевдик всегда обнаруживается коротковолновая полоса, соответствуюцая основгоыу максимуму поглощения пигментов в обусловленная све-. чешем'иономераой форм». Вторая полоса флуоресценции, определяемая колебательными подуровнями, находится в той же области, где к длинноволновые макендуми испускания, дарактернзухщие лшинеоцекаию агрегированных форм пигментов.

Большое сходство спектров лхминесценциж пигментов наблюдается в растворе тритона Х-100 и в солярных органических растворителях. В ЦТДБ и Д2Н спектры флуоресценции во многих случаях обнаруживают наличке новых максимумов, интенсивность к положение которых завионт от jtí раствора в концентрации ПАВ в среде / табл. I /, Эти максимума характеризуют свечение как

Таблица I Максимумы поглощения в красной области сгектров и максимумы люминесценции пигментов в 1^-яы* водных растворах тритона Х-100» цетилтриметияадаонийбро--мида / ЦТАБ / и додецилсульфата натрия / ДСН / ; : через 5 минут после'оолпбилиэация. .

! | & МАХСНМЧМЫ СПЕКТРОВ потсщсннр /■**»/ МАКСИМУМЫ спеюроа та•вмБсцугр* 1 «о 5 ш МАКСИМУМ спехгро» погуоцут* н+нсмиимь) Спектров фемимссцгнт

% £ I4 и 8 Ч 670 ' его ею ьч&ЬН,1го 6Sq.no - 1 Р (2 $ Ч но «о вА>,гоо

1 ЯЕ 12 8 * $«5670 612 6Т2 ь^бг/^о» бгцюг £Я2,И2 ' 1 § 12 8 Ч ' ыг : «»,70«

| 12 & Ч (46, 7ДО бго.юз 1 12 8 V «37 63? «« е*7,700 ■ «УГ.бЩ-Ш

ь 1 12 в ч «5У (54 ПГ.ГИ - | 1? 12 а Ч 970 ЛТО • ЫО «ЦК» 6ЦИЙ

ад К у а & ч С5Ы . e6i.it» : 1 § 12 г ч 61 с,1 го «ЦП<1 «во,*«

1 § 12 6 ч ш СЮ «V вцтов в | 12 в У 615,Ко «М-

к Л г 12 В ч {Г2,100 бгг,1оо 6 619,129 - | Г 12 8 Ч 1*4 7М «06 ХОб 909-306

1 | 1 12 6 Ч 67*59» «вУ, 69» ■ ЫЗ,125-441 бщггг бы, Ю6.УЛ1 | «э 12 а * уео . та^в«- гаде«*1 19Л : ТОЙ**«'

1 § 12 в V 676,69?, 6»?, >¿3 ; б»т,тно-гво | 1 12 $ Ч г/г,«« 712,ЗЮ

агрегированных форм пигментов, так и нономернах о нарушенной мздекуаярио* структурой в связи с влиянием детергента.

Зависимость интенсивности основного максимума лтжшяес-неволя пигмента от концентрации ПАВ является показателем его солххЗ&лиэации. Если в детергенте пихмеит находится в мономерной форме* кривые имев? резкий подъем в области неокаяыю пре-яыаахщей ККН ПАВ / при константе солюбялязации- Кр^ - пигмента Л как вто наблжлается, например, в случае тритона Х-100. Это происходят в свяаи с установлением равновесного распределения пигментов между мицеллами детергента я дисперсионной -средой, Если же амплитуде свечения увеличивается постепенно я продолжает расти в области концевтрадий. эначлтельно превыиаг-пцях KKU, вто означает наличке в растворе ШВ наряду в моно-мерныш формами агрегированных, которые медленно дезагрегирует о ростом количества мицелл в системе. Примером является ДСИ._ С уменьшением концентрации ПАВ наблюдается снижение аыдли-; туда основного максимума испускания за счет роста длинноволнового иахсимума люминесценции пжгмеатов,цркчем положение последнего у феофитяна "а", прогсшгорофалла ибактериоадредша не постоянно и варьирует при изменении свойств среда/ концентрации детергента к jH /. Ниже критической концентрация мицел-лообразования флуоресценция пигментов при комнатной температуре я присутствии кислорода обычно незначительна, поскольку в ломитщ парной области ШВ пигменты находятся в агрегированном виде. '' '

- Химическое действие ЦАВ на пигиентц, При стоянки растворов пиментов в ШВ при щелочных рН наблвдается рвзрсш иавло-пеятаяового кольца молекул пигментов, а в кисльх - феофитянж-вацяя,*прячем в разных детергентах это нарувеняе структуры молекул проявляется в разной степени. ЦТАБ активно действует ' на карбоциклическое кольт пигментов* тогда как 'ДСВ способствует их феофятиниэация.

Эти явления мокко объяснить следующим образом. Положительно заряженные иона ЦТАБ в мицеллах детергента могут вза-имодеа отвечать с отрицательно ааряжвкяыми функциональными группами пигментов и,в первую очередь, с карбонильным кислородом цяклопентанового кольца. Возникавдее при «том напряжения связи Cg-CjQ облегчает ев разрыв в щелочных средах. В растворе

ЦГАБ этот процесс энергично протекает дата при рН 8, тогда как s растворах тритона Х-ГОО н ДСН он наблюдетсл только при рН 12. Обращает аа себя внимание, что параллельно с разрывом циклопентанового кольца в щелочных средах ПАВ проявляется тенденция пигментов к дезагрегации. Последнее легко объяснимо в свете представлений о роли карбоцикякческого кольца ори агрегации /Close, I963 /•

Известно, что отрицательно заряженная мицелла ДСП легко образует лиганды с центральным атомом магния порфиршювых молекул /К1л,1970 /, в результате чего связь магния с пирроль-яыми кольцами ослабевает. При наличия в среде избытка водородных ионов легко может произойти обмен атома магния на два водородных атома. Этим и объясняется более эффективная феофктв-яиэадая пигментов при низких рН в растворе ДСН по сравнению. с другими детергентами.

По-видимому, центральный атом магния в молекуле пигмента может взаимодействовать не только о молекулами ДСН. В ми-целлярном растворе тритона Z-IOO только у феофитква "а" образуют «5 агрегированные формы. Можно полагать, что в солюби-лиэация АК^-содеркацих глгментов участвует центральный атом . магния, который при помощи координационных связей может взаимодействовать о кислородом вфиринх группировок оясиэтклиро-ванкшс цепей мицеллы тритона Х-100. Ори зтом достигается, лучшая солюбилизацкя пигментов в растворе тритона Х-100 по Сравнение с другими ПАВ. С другой стороны, связывание центрального атома магния, вероятно, затрудняет агрегирование пигментов, поскольку атом магния принимав участие в образовании агрегированных форм пигментов /Kits, 19вЗ, Быстрова, КрасновскиЙ", 1967 /.

Обращает на себя внимание, что феофитнн "а" не только в тритоне Х-100, Но и в других детергентах агрегирован в большей степени, чем магннй-содержащие пигменты. Кроме того, параллельно феофятинизадай пигментов при низких рН в ПАВ наблэдается рост имещихся и образование новых длинноволновых максимумов. Вероятно, в молекулах феофахияов реализуется воамокность более тесного сближения шрфиржиовых частей молекул пигментов друг с другом, что затруднено для магнкй-содержащих молекул а силу стерическхх факторов.

раязь tntr**^4ff>w f иипвллой детергента. Обычно полагают, что молекулы хлорофилла расположены в мицеллах так, что жх > гидрофобные часта накопятся в углеводородной среде мицелл, тогда как гидрофильное порфиряновое кольцо - снаружи мжцелл, В водной фазе /Hertoga, 196; /.

Согласно Шапошниковой / 1973 / даже при высоких концентрациях хлорофилла / И / пигмент находится в растворе ПАВ В мономерной форме, тогда как длинноволновые формы пигментов образуются в водной фазе раствора ж ее связаны с мицеллой детергента. Давние Гурановнча с соавторами / 1972 / по изучению поляризации в квантового выхода лгакнесценции служат доказательством наличия агрегированных форм хлорофил-лов "а", "б" к феофиткна "а", связанных с мицеллой детергента.

Известно, что агрегированные протохлорофилл и бахтерио-виридин ее лияшегцируют при комнатной температуре и присутствии кислорода / Красковский к др. 1962,1965 /, Наличие в водной среде ШВ делает возмочошм обнаружение длинноволновой люминесценции агрегированных форм пигментов в присутствии кислорода и при +20°С. Поскольку один и тот же пигмент в зависимости от условий в растворе ПАВ может имйть различные максимумы агрегированных форм, можно полагать, что взаимодействие молекул пигментов о мицеллами детергентов происходит при участии различных функциональных группировок.

Обнаружение длинноволновой фяуоресцанции пигментов в растворах ПАВ дает основание полагать, что ассоциированные пигменты могут выть связаны о мицеллами детергентов. Возмэж-во» что жесткая фиксация агрегированных пигментов на поверхности мицелл способствует уменьшению межмолекудярвой дезактивации 'энергии возбуждения, а аффективная миграция анергии с более коротковолновых форм пигментов приводит к проявлению свечения форм о самым длинноволновым поглощением, .

Наличие длинноволновой люминесценции пигментов в растворах ПАВ свидетельствует о том, что молекулы зткх пигментов ваашюдействуют недду собой в мицеллах детергентов, приводя к образованию аосошатов пигмент-пигментного характера. Это обстоятельство позволяет использовать растворы ПАВ для изучения пигмент-пигментного взаимодействия, поскольку, изменяя параметры детвргенткых сред / pit растворов, концентрацию и

природу ПАВ / мокно получать разнообразные упаковки агрегатов. •

Различное влияние ри растворов и самих ШВ / мх специфики и концентрация / на спэктрн поглощения я люминесценции пигментов позволяет прийти к заключению, что солкЗялиэация последних протекает не только за очет гидрофобных связей / между фитолом / или фараезолом / молекулы пигмента н углево-1 дородными цепями мицелл ПАВ, но и путем образована коорди- ;- ' нациокных и водородных связей между пигментом и мицеллой де-„ тергента, В образовании втнх связей, скорее всего, участвует , те же функциональные группы, которые ответственны за пигмент-пигментное взаимодействие / атом магния, карбонильные, карбоксильные, а также, возможно, и гидрокснлыше группы /. Таким образом, способ связи пигментов о мицеллами детергентов определяется химической структурой взаямодевствущих партнеров, .

п/шгосЕасишиэирлщв ДЕЙСТВИЕ ШШШТОВ В ВОДНСЫ

РАСТВОРЕ ПИТОНА Х-100 ^ I

Свектрально-лхминесцентные исследования показали, что. тритон Х-100 оказывает наименьшее химическое воздействие на. ■ пигменты, в связи с чем водный раствор 8 того детергента был выбран в качестве растворителя для исследования фотосенсиби-лиэированних реакций.

Известно; что водные коллоидные растворы пигментов ве об- : яададт сенсибилизируюцей активностью. Добавление детергента к водному раствору пигмента приводит к тому, что щрк концен-• трации ПАВ близкой к КИП хлорофилл явдяетсяфотосенсибклиэа- ■ тором некоторых окислительяо-восстановительныхреамрЛ, причем максимальная скорость реакция достигается в области Коая хлорофилла / О.Цб-ныЯ раствор тритона Х-100 /. Поскольку . \ К^д различных пигментов неодинакова, мы проводяли реакции в 0,5Л -но« растворе детергента дм достихевяя заведомо полной солвбллазадай всех, пигментов.' >

Г ' В качестве акцептора алектродов в освовнсм тзольаэьался ■;'■ метклвиологен. Фотосодспбилизягровшшое восстановление этого . ; красителя, обладающего нормаль ним окгслитеяьно-восстаяовитель-

ным потенциалом, близким к аотенциалу ферредоксина, мохет . рассматриваться как модель первой фотохимической системы фо-\ тосинтеза. ' / ■■'...'. ; : ^

Ре акта* в анавробт^ Т14*?1""^ Вследствие высокого отри-дательного окиолжтельно-восстановителъного потенциала иетил-виологена круг доноров,восотанавливашдах этот акцептор, довольно ограничен. К ним относятся аскорбиновая кислота, фе-вулгидразин, тхомочевина а цкетеин / Ерин я др., 1966,1370 А В сравнительном аспекта следовало выяснить возможность осу-иестаденяя фотохимической реакция с мегилвиологеном в растворе детергента.

В качестве доноров электрона использовались различные органические веибства.иринимавдие участие в метаболизме растительной клетки, а также ряд неорганических соединения.

Аскорбиновая кислота, восстановленный штохром С, солянокислый гидразин, феквлгяграэин, метиошш, гидрохинон, резорцин, пирокатехин, пирогаллол и серкистокнояый натрий не показали фотосенсибаляэированного восстановления иетилвиоло-гева. Вероятно, усложнение модальной системы, связанное с жесткой фиксацией пигмента в иицелдо детергента, накладывает дополнительные ограничения яа взаимодействие веществ в тройной системе донор электрона - пигмент - акцептор электрона. Отсутствие контакта мелду реагентам» может объясняться стери-чесвими факторами, либо электростатическими явлениями на мицелле детергента.

Фотосенсвбилиэлрованное восстановление метихвиологеяа тяомочеввной в растворе тритона Х-100 наблшается при рН 8,5 и выше. Максимальное восстановление ыетилваологена фиксируется с сенсибилизаторами хлорофиллом "а* и феофктином "а" при рЦ 12/табл. II А ' "

Аналогичное восотаковлеике мв'МШиюлогеиа найдщшется с аллилтовмочевивой к сернистым натрием. С этими донорами аяект-роков , как ж с тиомочевшшй, рвэпкца между реакцией в мицел-лярвоы растворе ЛАВ я в органическом растворителе была того же порядка, что и между различными органическими растворителями.

Донором электрона, показавшим двукратное увеличение активности при реакция в растворе тритона Х-100 по сравнен»® с реакцией в органическом растворителе, является циотеин, С увеличением рН глубина я скорость фотосеасибмллэированнот ж>гстановления метилвиологена возрастают. Максимальное ппсотаи'т^-нво его ори рН 12 равно 60£ / табл. Ш /.

Таблица II ' Фотосенсисшшэирсванное различными пигментами восстановление -метвлвяологеня / в процентах от его начального количества / аскорбиновой кислотой / аск. к-та / и тисмочевиаой / тиомоч,/ в вакууме. Реакция в тритоне Х-100 / тритон / при рн 12

Донор Растворитель Янгмект-сеясибялвзатор

хлоро- хлоро- филл"а*фвял"б* феоФв— тан. а" бактер. байте! вярндин хлород прото— >» хлороф.

век. к-та этанол пиридин тритон 7,1 7,5 5,6 с О 1.9 2,4 3,2 2,5 4,8 6,6 Ь,0 7,5

этанол 7,5 12,2 15,0 2,5 4.6 12,0

тиомоч« пиридин 7,2 13,0 27,6 5,5 7.7 15,6

тритон 13,5 12, В 13,5 . — 4,0 12,8

Таблице III Скорость / и глубина / в процентах от начального количества метилвиологеиа / фотосенсв-билизнрованного хлорофилло« "а" восстановления нетидвиологеиа цистешимв тритоне Х-100

ра 5,5 6,0 6,5 7,0 8,0 9,0 10,0 II .0 12,0

4Ь вакуум ¡И воздух 0,4 0,0 0,* С.1 0,5 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 0,7 О.й 1.0 1,2 1.1 1.4 1.3 1,8

4 вакуум вогдух 6,4 9,6 18,7 17,6 22.5 25.6 38,4 41,6 46,5 43,1 51,3 48,0 51.3 48,0 61,0 87,0

Pesmaq в а?воСннк тсдовшрс. Следует подчеркнуть, что списанные реакция иэучалиоь в анаэробных условиях, поскольку кислород,являясь сильных окислсителем, активно конкурирует о метидвиологеном при взаимодействии с донором электрона к окисляет восстановленный краситель.

Однако нами било обнаружено значительное повышение глубины и скорости сенсибилизированного хлорофиллом "а" восста-нгзлеявя метилвиологева твомочевиноЗ в растворе тритона Х-100 в присутствии воадуха. Эффект наблюдался при проведении реакции бе» перемеашванвя реакционное смеси, в противнем случае восстановления мегжлвжвдоггва не гро исходило. *

Это явление могло было быть связанна! о новым механвэ-мом фотос&исибнлнэироваяноЯ. реакции, что и определило даль-нейгчй путь исследования. Прездв всего влияние кь лорода изучалось на фото реакции ыетнлвнологена о различными донорами мектрова.

С аллилтиомо «виной, также, как с тяомочевиной, наблюдалось значительное повышение глубины и скорости фотосенсн— Оилиэированного хлорофиллом "а" восстановления метвлвиолеге-иа на воздух" по сравнению с реакцией в аакууке.

Интервал значений pH, при котором отмечается севсибвля-»ироаавная реакция о цистешюы, составляет 5,5-12 в вакууме и 6,5-12 на воздухе. Конечная глубина реакции в вакууме превышает глубину во'становлени! метилвиологена в аэробных ус-*лвнях. Однако, измерения показали, что при pfi 7-12 скорость реакции в первые минуты освещения в присутствии воздуха была больше, чем при реакции в анаэробных условиях / таСл III /

Восстановления пигмента в вакууме при фотореакцик с цлетешюм в растворе детергента вабл'шать не удалось» При реакции в присутствии воздуха ооняружкваюгея обратимые изменения в длинноволновом максимуме поглощения пигмента, что может евщдетельет: овать о фотовосста исвлер ля аигмэнта-секси-билизатора» Указанные различия фотореакязи ¡-«тштваодогена и хлорофилла "а" о щгтевном в присутствии и отсутствие воздуха возможны в тем случае, если механизм реакции в аэробных и анаэробных условиям неодинаков.

Скорость ж глубина фотосенсибилиэироианнохч; чосстялавлв-вия метилвиологена восстановленных глютатионои г акаэ^пчих и

аэробных условиях к« различается. Однако, путем введения в систему «оэированного количества кислорода, удалось набдвдатъ ' увеличение скорости реакции по сравнению с вакуумной условиями при рН 9-12^ максимальная скорость реакции наблодаласъ ори парциальном давлении кислорода 25 ш рт. ст.

Применение в качестве донора электронасмеси восстановленного и окисленного глютатнонов /Йил£«г,Р*1в*ег,1968 / показало, что при рН 9-11 скорость реакции и её конечная глубина в присутствии воздуха вше, чем в анаэробных условиях.

Присутствие кислорода при использовании аскорбиновой кислоты, восстановленного цитохрома С, гидразина, метвонина, гидрохинона, пирокатехина, резорцина,' пирогаллола, сервисто-кнслого натрия и сернистого натрия яе приводило к увеличению фогохшическов активности пигментов по сравнению с реакцией в вакууме.

Итак, фотосенсибилиэированная реакция восстановления мв-твлвиодогена, протекающая в присутствии кислорода с увеличен : аием глубины и скорости реакции, имеет место лишь с использованием тиомочетнны/алшт-ижсчезннн, цястенна и глетатиола. Наиболее четко данное явление наблюдалось с тисмочевиной, потому и летальные исследования фотосенсибилизированноЯ реакция в присутствии кислорода воздуха производились о зтям донором электрона»'. ■■■'.■■■■

III. ®ОТОСШСа®ШШРОВАШиЕ РЕАКЦИИ с тиоилшша В ПРИСУТСТВИИ КИСЛОРОДА,

'=■ Проводя реагащо {отосенсибилизировашюго хлоро^яллом "а" восстановления матилвислогааа тиомочевиной при рН10 без перемешивания раствора, т.е.в присутствии растворенного кислорода воздуха, мы наблюдали, что освещаемая зона раствора постепенно приобретала синдо окраску восстановленного кетилви-ологева. При взбалтывании метидюлологен окислился кислородом воздуха; освещение без взбалтывания снова приводило к восста- ,, новлеилю красителя. Те хе явления наблвдались и в вязком спирто-глкцериновом растворе.

Трудно сокневатюя в том, что в зоне освещения образу-.стся безтклородная среда за счет энергичного фотосенсибиля-. ямровагшого восстановления кислорода тяомочавиной /Оа±**оа,

Х927 /, Медленная даЗДузия кислорода через фазовую границу яе пополняет потребляемый ори сенсибилизированной реакция кислород, что делает воэмокник наблюдение эа восстановлением нетилвиологена.

Влияние яявлетц кислорода и вд сшш^ Глубина и скорость реакции возрастают с увеличением парциального давления . кислорода в системе. Насыщения скорости реакция ори атмосферном давления кислорода не достигается.

Освещение вызывает необратимое кодкисление среды на 1,5-3 единицы рЯ*. что влечет аа собой тодоокенне восстановления метилвиолсгена, Применение буферных сред показало* что реакцию удвется наблвдать, начиная от рН 8,5 и скорость «6 возрастает примерно в сорок раз с увеличением рН от 6,5 до 12. Следует отметить* что при разной скорости реакции* конечная глубина воестановления метялввологена во всех опытах достигает 80-9QÍ.

^оуовосстановленве пигмента. Иа не могли обнаружить восстановления глорофвлла'а" тиежочевиной в вакууме при рН раствора тритона 1-100 В-12.Пра реакция в присутствии, воздуха при рН ааблвдаетса отчетливое фотовоостановле-нве пигмента с образованием восстановленной формы в максимумом поглощения БЭТ ям. При встряхивания реакционной смеси по окончания реакции,-^красная" форма хлорофилла с хорошей обратимость!) превраюется в исходный пигмент i

^рользовяяяе различных 'тгр^^ятод- В качестве фотосев-сибиллзаторов мы испытывали такие' хлорофилл"б", фесфвтняГа? протохлорофилл и бактераохлорофмлл. Со всеьги пигментами на-блвдалнеэ те. же. закономерности, что а с хлорофиллом "а"- увеличение глубины я скорости реакция в аэробных условиях по сравнению саааэробныма, тот же интервал значений рН, способ-ствувдих цротекааип реакции / рН 8,5-12 /, увеличение скорости и глубины реакции в возрастанием царшшлъяого давления кислорода в реакционной среде.

- При фотосенсибилизярованноЯ реакция с тиомочевиной в присутствии кислорода бея акцептора электрона не удалось до. лучить четких спектров поглощения восстановленных форм ис— , следовашшхпнгиертов. ВаОлвдалвсь только обратимые изноце— пия в длинноволновой максимуме, поглощения пигментов после освошнкя реакцвоивоВ смеси в срасутствиа воздуха я после- . ^

дуюием встряхивания. ■

Таблица 1У Фотосенсибвлаэированяое различными пигментами восстановление тиомочевиной метихвиодогенв / в процентах от óго начального количества / в присутствии воздуха в тритоне Х-100,

пигмент рН 8,0 8,5. 9 10 II 12

хлорофилл "а" 0,0 78,5 : 85,5 94,0 93,0 - 96,0

хлорофилл "в* 0,0 ,70,6 В7.5 96,3 85,0 90,0

феофитин "а" 0,0 96,0 90,6 , 96,0 95,4 94,5

протох^рофилл 0,0 0,0 70,6 77,0 73,6 72,6

бектервохлорофнял 0,0 0,0 0,0 32,0 32,0 33^0

росс^ановще^ие. gypetjrgppq, электрона. В качестве акцепторов электрона в исследуемой реакции использовались сафранин, метиловый красный и цитохрои с. С первшш двумя веществами наблхщалисьте же закономерности, что и о метилвяологеяом -значительно большая глубина и скорость фвтосенсябилязжрован-ного восстановления твомочевяной в присутствии кислорода по сравнению с реакцией в вакууме, увеличение скорости'восстановления на воздухе ори повышении рЯ среды. ■

1 5вестно, что в растворе тритона J-IOO при щелочных эна- / ченвях рН набледается фотосеясвбилкэяровааное хлорофиллом Ьоо-становлевие цвтохрома С в вакууме-/ Красновский, МихчЯлова, 1968,1970 А Добавление тиомочевины увеличивает глубину фотосекс ибилиэированне^реамши. Присутствие воздуха способствует возрастании глубины восстановления белка прь№еош> в два раза по сравнению с реакцией в вакууме и в 3,3 раза по сравнение о реакцией в вакууме без тиомочевины.

Следует отметить, что метвлвнологея является кофактором фотосенсубплиэяропанного вооотановяенкя цитохрома С тиомочевиной, ускоряя реакцию И увеличивая глубину восстановления белка, ^ . , *

15. ФОТОРШШИ С ТИОМОЧШШСй В ВОДШД СРЕДАХ: ПШШШ ШДОРАСТВОРГО&Л СЙКИВШ^ЮТА ПЫАТОПОМИРША.

Восстановление метилвкологена. вотосенеибяляэвровавноо

гематопорфирйшжьяорстановдение метвлвяологена тиомочевиной в водкой среде без добавления детергента протекает в вакууме медленно и неглубоко. Скорость реакции значительно увеличивается в присутствии кислорода. Реакция в аэробных условиях обнаруживается при рН 8,5 и скорость её возрастает примеры в пятнадцать раз с повышением щелочности раствора до {Л 12.

Следует обметить, что добавление к водной среде глицерина / до 703 / или детергента / 0,S£ / увеличивает восстановление акцептора электрона в аэробных условиях на 2Q&. Это объясняется, по-видимому, более полной оолюбклизацней геыа-топорфирииа, так как в воде часть молеку.- пигмента находятся-в виде днмеров или агрегатов, о чем свидетельствует расварение полос поглощения и снижение высоты максимумов по сравнению о глицериновыми или мяцелляркымн растворами.

Дотууоудтановление ceftcaOtuprçayoya, Освещение гемато -порфир и на с тиомочевиной в присутствии кислорода в водных растворах при pR 8-12 ведет х свидению оптической плотности по всему спектру поглощения пигмента, параллельно о чем ва-блццается рост максимума при 6S0-660 нм. В первые минуты ос-.веяендя при 465 нм набЛццается небольшое увеличение поглощения, которое снижается ори дальнейшем освещении. Обратимые изменения поглощения в максимумах 465 нм и 650-660 нм, наблюдаемые при энергичном встряхивании реакционной смеся с воздухом после окончания освещения указываю»-на фотовосстановление гематооорфирина.

Акцептор алектоона- Еасснер я'Кемеи / 196? 4

используя в качестве донора электрона аскорбиновую кислоту и дитноэритритол, наблюдали фотосенсвбилианраванное копроаорфи— ривом восстановление ферредоксина в трис-буферном растьоре при рН 7,85-7,9 в вакууме. Восстановление белка достигало 47^, тогда.как темновое восстановление ферредоксива дитвовитом протекает на 64-55? /Wbatley, ®«g«ea, Атпоа, 1963 А

Фотосенсибилизированное гематопорфирином восстановление ферредоксина тиокочевиной изучалось нами яря рН 9-П в анаэробных в аэробных условиях. При реакщи в вакууме наблюдалось . 17-252 восстановления белха, а в присутствии кислорода - от . S3$t до 555Ï. Таким образом,глубина восстановления ферредоксина в фотосенсябилизирсо&анвой гегаатопорфирвном реакции в присутствии кислорода выше, чем при аналогичной реакции в анаэроб

робных условиях, что соответствует опытам о метиявиохогевом;

Г. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ КИСЛОРОДА ЮТ <ЮТОСПЬ-

СШИИЗИРОВМИОЙ РЕАКЦИИ С ТИОНЭЧШШЙ

Реакция фотосенсвбилиэнрованиого скасления тишочевшш кислородом давно исследовалась в работа Гаффрова / 1927 /. Было найдено, что квантовав выход этой реакции равен единице*' Вследствие этого кислород в реакционной среде с тяомочевиной быстро потребляется на её фотосснсибалнэврованное окисление, поэтому дальнейшее восстановление метилвиологена протекает уие в анаэробных условиях. Однако возникал вопрос о причинах значительно большей глубины реакции без откачивания воздуха по сравнению о реакцией в вакууме. -

Напрашивались следующие предположения! I/ продукты фотохимического взаимодействия хлорофилла с тиомочевнпой являются более активными фотосенсвбнлнэаторвмц, чем исходный пигмент. 2/ при фотосекснбкянэированноы окислении кислородом тисмочевкны образуется новый, более активный донор влектрона. Ни исследовали обе зги возможности.

При фотореакции хлорофилла "б" с тиомочевиьой в аэробном растворе тритона Х-100 при рН6,5-П наблюдается падение оптической плотности, расширение и смещение к 660 нмалиняо-волыового максимума поглощения пигмента/ в агавовом спирте при этом образуется продукт в максимумом €79 вм / Краснове-' . кий, Саоожвикова, 1966 /. Оказалось, что атот продукт не отличается по сеисабилхзирупцей активности от исходного пит-, мента.

Как уже указывалось, освещение хлорофилла *а" е тиомоче-викой в присутствии воздуха при рН 9-11, приводит к образованию восстановленной формы пигмента* При векуумированяи раствора с полученной таким образом "красной" восстановленной . формой хлорофилла, трубку Тунберга зцергичпо встряхивают. Это способствует диффузии.воздуха над раствором в реакционную среду, где кислород окисляет восстановленный пигмент. Ори втом в спектре поглощения наблюдается исчезновение максимума 530нм и-обратимое увеличение оптической плотности длинноволнового максимума поглощения 670 нм. Если после откачивания из "головхи" трубки Тунберга прилить раствор метилввологеш.

наблюдается восстановление красителя» Этотгошл демонстряру- -ет, -что восстеновление метилвиологена не достигается о водою "краевой" форш хлорофилла "а*. Кроме того, на одкта следует, что реакция делится на фотохимическую стадии восстановления хлорофилла о тиомочевиноЯ и кислородом и темповую стадию восстановления метилвиологена в вакууме. ." , V Разделение стадий реакции, бшо достигнуто о применений ем низких температур* В буферный раствор тритона Х-100 с со-любьянзированныы хлорофиллом "а", тномочевиной и метилвиоло-геном добавлялись спирт и глицерин У соответственно 7 и 7,25( / и исследовалась реакция в присутствии воздуха при низких температурах. ■ \ . /■

Сиорооть фотосенснбилнзхрованного восстановления метил-внологеяа понижается о уменьшением температуры вплоть до -ЭО°С, При более низких температурах освещение в течеаие 20-30 минут вообще не приводит к восстановлению акцептора электрона. Однако, если осветить реакционную смесь в течение 30 минут при низких температурах / от -70°С до —40°С /, а затем оставить её в темноте в неподвижности при комнатной температуре, то со временем я ней постепенно развивается синяя окраска восстановленного метывиологена. Аналогичный реэуль— ' таг наблюдает» и при быстром нагревании реакционной смеси . пооле освещения, «ели ее взбалтывать раствор. Из »тих данных можно заключить, что проц&с накопления активных промежуточных продуктов фотосенсибжлвзироваоного окисления тиомочевииы протекает и при -70°С, тогда как для темповой стадии восстановления метилвиологеиа необходимы более высокие температуры.■ ' Из наложенного ясно;, чтовосстановление акцептора злек- -трона' в темвовоЧ стадии,реакции; осуществляют вещества, обра-' _'*-эоваииыв в результате фотосенсябклнзированной реакции донора >злектрона с:кислороде«. Эти активные восстановителя являются V сравяительно устоИчивыкн и долгое®увдеыи соединениями -вва-кууме они сохраняют способность к восстановлению ыетигвиоло— гева в течение многих часов. ?

Кинетика первичных процессов, юеакши в присутствии воз-" -. ;духа измерялась под лучом- возбухдавдего. света." За . течением реакции следили по изкшешиб оптической плотности'в максимуме метилвиологена при 400. ша. В начале реакции наблюдается иа-•;■ аукционный период, который объясняется локальным потреблеаи- >

ем кислорода ори $отосенсйбнлвзированном окислении тиомоча-вины, Когда _весь кислород выбирается из реакцвонвоЯ среди, скорость восстановления метвлвиологеиа увеличивается, что отрахается в быстром росте кинетической кривой.

Если после"освещения пробирку с реакционной смесью - встряхнуть / при этом происходит окисление восстановленного красителя /, а затем снова освещать ту ие.реакционную смесь, индукция сокращается и.скорость реакции растет от цикла в циклу освещения, встряхивания и нового освещения. Это объясняется накоплением долгохивуцих продуктов сенсибилизированного окисления, которые реагирует с кислородом медленнее, чем восстановленный метнлвнологен,

фрисртхрльио-иосстя яегмгууртщ^ рпто^тувц

Таблица 7 Потенциалы / -г*т*г/ системы хлорофилл + тномоче-вина ♦ метилвиологеа в распоре тритона 1-100 ори различных рН

начальный. потенциал системы до освещения а ¿ов - после пяти минут освещения дЕ| в дЕ^ - изменение потенциала после пуска и встряхивания с воздухом

~ разница между потенциалом до освевекиц и ... после, освещения

Вакуум . Воздух

ро "V- ^сон _,». V ^ОН дЕ2

9 155 240 122 90 310- ^ 133 4 233

10 250 295 185 97 420 225 329

II 250 300 240 150 465 230 308

12 260 438 218 185- 495" 256 310

5>ектродно-активными могут быть; различные вещества, как имевшиеся в среде / метилвиологен, тиоыочевина /, так и образованные в ходе реакции / восстановленный метилвнологен, продукты фотореакцни тиомочевины и кислорода /. Осложняющим обстоятельством является то, что кислород, адсорбируясь на платине, образует соединения, которые могут действовать каш ока-

слителх. Кроме того, при взаимодействии тнамочевинн о платанов* на поверхности электрода образуются прочные соединения, о трудом удаляемые химическими методами. Все это приводит к тому, что интерпретация значений элентродных потенциалов представляется крайне затруднительной.

Качественная картина изменения потенциала платинового электрода при фотореакции такова / табл 7 Л При реакции на воздухе изменение потенциала системы больше, чем при реакции в вакууме при прочих одинаковых условиях / температуре в рН реакционной смеси /. После реакции в аэробных условиях потенциал системы при встряхивании не доходит до первонрчаль- * ной величины,а после реакции в вакууме я последующего пуска воздуха превышает исходную величину потенциала системы на воздухе.Эти явления могут быть связаны с отравлением электрода ткомочевиной и продуктами ев окисления.

Природа новых восстановителей. Итак, восстановление акцепторов электрона при сенсибилизированной реакции в аэробных условиях осуществляют вещества, образованные при фотохимическом окислении тиомочевины кислородом. Здесь возможно участие как продуктов окисления тиомочевины, так и продуктов восстановления кислорода„

Окисление восстановленного метилвиологена кислородом сопровождается образованием ререкиси водорода. В начальной ста— дни реакции в аэробных условиях одновременно присутствуют как восстановленный метнвдвиологен, так и кислород. Из экспери -ментов гуревича / 1959 - 1962 / але'дует, что метиловые крае -вый и ортодияитробензол более активно восстанавливаются аскорбиновой кислотой, феявлгвдразином и цнстеином / темновш путем / в Присутствии кислорода или перекиси водорода и ионов меди или железа в качестве катализаторов. Однако, в условия*, описанных Гуревичем, нам не удалюсь наблшать восстановления метилвиологена. Следует предположить, что продукты, образующиеся при индуцированном окислении указанных доноров электрона,, не обладают достаточным потенциалом дня восстановления метилвиологена.

Добавление перекиси водорода с ионами мели в реакционную среду, где проводилось фотосенсибилиэираванкое восстановление метильиологена тпомочевшюй вля замедляло реакцию, или вообще останавливало ей - течение реакции зависело от соотно-

тельннй потенциал становится достаточным для восстановления метялвиологева.

ОЕСУЗДШЙБ РЕЗУЛЬТАТОВ . ^

Согласно современник представлениям, пигмент,,поглотивший квант света и перешедший в синглетное,а затем в триплет-кое возбужденное состояние, реагирует с одним из партнеров окислительно-восстановительной реакции, отдавая или приникая электрон, в результате чего образуется пара кон-радикалов. £алее ион-радикал пигмента вступает во взаимодействие с дру-г гвм партнером реакция я преврааается в исходник пигмент. Результатом этих процессов является восстановление акцептора электрона,окясление донора электрона л возвращение пкгмента-сеноибвлизатора в первоначальное состояние. Хлорофиллу, таким образом, отводится роль непосредственного переносчика электродов от донора к акцептору электрона, независимо л» типа первичной фотореакции. Характер первичных фотохимических реакций возбужденной молекул« хлорофилла определяется рядом факторов: природой среды, способностью реагярущих веществ к комолексообразовавия, природой я состоянием пигмента, окислительно-восстановительным потенциалом донора и акцепторе елек-трона я т.д. ■

Дальнейшая судьба прбдуктов фотопревращекия акцепторов и доноров влектрояа до си* пор не привлекала достаточного внимания. Считалось, что в результате рода последовательных превращений эти фотопродукты переходят в устойчивые соедвне-ния, не влияющие в дальнейшем на ход реакции; сенсибилизируемой хлорофилломи его аналогами. Следует подчеркнуть, что результаты данной работы показывают'вёаьохкость протекания фотосенсибилвзяровашшх реакций с участием продуктов фото- : окислёняя доноров алектрона. -.■■■■'■.

Основываясь ва современных представлениях, можно предположить следующий механизм изученных реакций: возбужденная > светом молекула хлорофилла в оинглетном / Хл° / идя тршь- ; детном / Хх* / состоянии первоначально реагирует с кислородом, образуя "мояьоксид" хлорофилла /-ХлО^./ яля сявглетный кислород, которые далее взаимодействует с докером электрона, ' давая продукт его фотосенсибилжзжрованаого окисления'■/ Дох /:

il X* + hit -Хлт

. 2. £ят ♦ 02 —, 'JUÛJ* . . 3. «• Д —Хл + Лад

Далее, в тершовом акте реакции Д^ реагирует о метвлваодоге-ном, приводя к его восстановлению: '

4« ДрЖ + Ю -»• ИВГ ♦ Д^

Иьхно полагать, что э?к сравнительно дохгохивущае вещества / лот / являются продукта*™ фотосенсибилазированного окисления ¿Н-ооединениЯ я представляю» собой сухьфановае кислоты. Однако, наряду с долголивупдаш сошюенжями.в восстановлена* метилвиодогена в тройной системе при освещения могут принимать участие и коротяохивущие продукты фотореавции < кислорода с тиокочевиной. . .ï

Параллельно указанным реакциям / 1-4 / протекает в другие," например, восстановление пигмента-сенсибилизатора новыми восстановителями / Д^ /, окисление кислородом фотавозбужценно-го пвгоента, новых восстановителей а восстановлена ого иегш-виологева с образованием перекиси водорода, которая, в свою '-'..; очередь, может сама окислять компоненты реагирующей системы. Конечный результат Затосенснбилизиравааной реакции зависит от сложного переплетения скоростей всех атих реакций. Возможность наблюдения восстановления ыотидвиологева в присутствии, кислорода связана с тем, что скорость фотосенсибилвзиравая-кого окисления твомочевияы кислородом значительно превышает, скорости остальных вышеуказанных реакций с кислородом, а тайне с тем, что возникашше при етсы восстановители являются достаточно долгожавущими соединениями.

Следует отметить, что при"реакции в аэробных условиях -с цистеивом и глюгатиоиом параду с образованием активных воо- . «ановителей и внборкоа кислорода из реакционной смеси, реакция протекает по общепринятому, механизму сенсибилизации, согласно которому возбужденный хлорофилл вначале фотовоостанав-лава'ется донором электрона или фотоояисляется акцептором , электрона. Сеосибилвэярованиое окисление цвстенна я глютати-она- кислородом характеризуется не таким высоким квантовым вы- -ходом,как окисление тиомочевшш. Кроме того, вещества, обра- -

зованные при фотореакции с кислородом, являются у цистевда и глккатиоиа лабильными и быотро окисляющимися, поэтому разнице в глубина и скорости реакции в аэробных и анаэробных условиях с «тимн донорами электрона не столь разнтельна, как в , случае с тиомочевиной. Однако, более высокая скорость восстановления красителей в щжсутствви кислорода дает основание полагать, что и в случае этих ¿H-соединенкЯ при реакции о кислородом образуются более сильные восстановители.

Следует иметь в виду, что ори фотохимических реакции в растворах детергентов пигменты жестко связаны о мицеллами 1UB, тогда как остальные компоненты реакции поступает из вод-* ной фазы. Способность протекания реакции в присутствии кислорода в такой системе имеет сложный характер, зависящий от мнопц факторов. Особое значение приобретает диффузия реагентов. Электронный перенос, сенсибилизируемый пигментами,; зависит также от расположения молекул пигмента, а также донора и акцептора электрона по отношению друг к другу, что обусловливается мицеллообрвзупдиыи и солюбжлвзврухшши свойствами самого детергента.

Итак, описанная реакция фотосенсибидиззрованного восстановления метилвиологена, сопряженная с окислением кислородом некоторых сульфгвдрильных соединений, характеризуется парадоксальны* эффектом - образованием в результате реакции фотохимического окисления более активных восстановителей, 4ем исходные доноры электрона.

Результаты опытов, проведенных в модельных'системах, позволяет высказать предположение о возможной роли подобных продуктов ирн.фотоокиелнтелышх реакциях в фотосинтеэируиянх организмах. Известно, что возбужденный хлорофилл может подвергаться обратимому или необратимому окислению кислородом. Предполагается, что о зтим связаны процессы фотодеэагрега-кии агрегированных форм пигментов и разрушение пигментов в -процессе метаболизма / Ланг, Воробьева, Красновский, 1968 /.

Кроме прямого взаимодействия о пигментом кислород может . - участвовать в фотосенснбжлизированяом окислении различных . восстановленных метаболитов. Приводя к окислешш промежуточных переносчиков электрона, кислород может способствовать регу-лировавшо работы электроытранслортной цепи. Веконец, окисляя восстановленный ферредоксян, кислород мож*»г являться конеч-

яым акцептором электрона &«нр«1 ,1974 /,

. В последнее время широко дискутируется вопрос, явля- -ется ли фотозавяснмое поглощение кислорода неотъемлемой часть» фотосинтеза /ВеЪяхчГгаосЬ, 1969 /. Этот процесс стимулируется различными классами соединений, включая способные ' к обратимому окисленио-аосстансвлёни» красители, хиноны, фер-редоксины и другие соединения, изолированные из зеленых растений. В результате фотосинтетического поглошекия кислорода ламеллярными системами хлоронластов наблшаетса образована« супероксидного аииоя-радикала кислорода / Шувалов, Красаово-кий, 1975 А -

Кы уже указывали на известные работы о том, что в виде супероксидных анион-радикалов кислород мокет включаться в различные реакции восстановления; приводя, например, к восстановление цнтохрома С, сопряженного с окислением ксамтиио-вых или фяавиясюых производных, Имеются данные* что супероксидный анион-радикал включается такие в зависимое от аскор-бата фотосннтетическое фотофоофорилироваиие /Ср«1, 1973 /,

' При разнообразных воздействиях на фотосдиетический аппарат фотоактнвяая форма хлорофилла может выйти из организованной системы переноса электрона. При атом возможно замыкание накоротко отдельных ветвей переноса алектрома, при которых фотосеясибихиэированные пигментами реакции могут проходить помимо главных метаболических путей. "

В атом случае возможны реакции фотосеяснбилизированного окиоления кислородом .эндогенных доноров алеитрона, в том числе и сульфгидрнльных соединений, из которых могут образовываться более активные восстановители, отдащие электрон фер-редоксииу а вврилвннуклеотндам. .Таким мокет бить путь включения кислорода в систему реакций фотосинтетичсского переноса алектрона.. .

■ та* ■ в ы в о дл . .

'* I. Изучена солвбвлизакия хлорофилла ж его адалогов в йодных растворах поверхностно-активных веществ / ШВ /, об- . . яадащих различной химической.природой: использовалась неио-ногенный тритон Х-100 / полиоксиэтклерованный иэооктялфенол/, катиояо&ьтившдй ЦТАБ / цетилтриметиламмоиий-бромнд / и аии-

оноактивныВ ДСН / додецилсульфет натрия /. Солюбилязацня пигментов в детергентах осуществляется, вероятно, ве только за счет гидрофобных взаимодействие / иеаду фитолом молекулы пигмента иуглеводородной частью мицелл ПАВ /, но и при помощи тех же полярных группировок, которые ответственны за агрегацию пигментов.

. 2, Исследование спектров поглощения, и лшинесцевции хлорофилла и его аналогов.в водных растворах ПАВ показало, что лучие всего пигменты солюбвлизируются в тритоне I-IOO, который, кроме того, не приводит к химическим изменениям в структуре пигментов.; СТАВ способствует разрыву карбоцикли-ческого кольца молекул пигментов в их дезагрегации при щелочных значениях jfl растворов, ДСН - феофнтинизации и егре-. гация пигментов при низких значениях рН. Наряду о мономер-выки формами пигментов в растворах ЛАВ наблвдаются ло»в-: несцирувкше агрегированные формы бактериовиридина, прото-. хлорофилла и феофитина, которые, по-видимому, связаны с мицеллами ПАВ. ;

3. В качестве . акцептора злехтрона при фотосенсибвли- -знровашшх пигментами реакциях использовался, главным образом, метилвиологен, нормальный окислительно-восстановительный потенциал которого блиэок к потенциалу ферредоксина. Фотосен-сибилизированное восстановление метвлвиологена различными . донорами электрона в раствоге тритона Х-100 в вакууме протекает подобно, реакциям в органических растворителях.

4. В присутствии кислорода Значительно увеличиваются глубина и скорость фотосенснбнлнэировакаого хлорофиллом "а" восстановление метилвиологена.тиомочевиной при щелочных ана- . чениях рН растворе тритона Х-ХОО. При реакции в азробвнх условиях были активны й другие сульфгидрилыше соединения ; / аллвлтиомочевина, цвстеия и глюгатион /. На основе исследования кинетики реакции и с этими донорами электрона било ; показано увеличение глубины щ скорости фотовосстановления метилвиологена в присутствии кислорода по «равнению с анаэ- . робвнми условиями. -

5. Подробное исследование фотосенсибилизировааной реакции в присутствии кислорода проводилось о использованием тяомочевшш. Кроне метилвиологена в качестве акцепторов электрона применялись такхе сафранин, метиловый красный и цито-

хром С. Скорость фотосенсибнлизированного восстановления всех акцепторов электрона тиомочеоииой увеличивается о возрастанием рИ я количества кислорода в системе.

6. В отсутствие акцептора злеитрояа восстановлению тиомочевшоА в азробкнх условиях подвергается хлорофилл "а", в то время как в той жа системе в вакууме восстановленвя пигмента не наблюдается. Использование других фотосенсибилж-мтороа - аналогов хлорофилла - показало их тожяествеиаость о хлорофиллом "а".

7*. Фотосенсибилизированное восстановление метилииоло- -"■ гена тжомочевияой в аэробных условиях протекает а в водной сред» с использованием водорастворимого аналога хлорофилла -гештооорфирина. В »том случае наблюдаются те же вамшомер* -ноети, что и враствора тритона Х-100, В изробных и аназроФ» -них условиях в водной сраке исследовалось фотосенсибилжаь-рованное гемитоцорфиривш восстановление ферредоискна, причем глубина его восстановления в опытах des удалении кислорода была выяе, чем при реакции в вакуума.

В. Изучение механизма фотосенсибалиэациж в присутствии кислорода показало, что реакции можно' разделить ва две ст»-дии - световую, осуществляемую яри низких температурах / до -70°С /, при которой происходит фотосеясибилизирофанное окисление тиомочевины кислородом, и темновую, при которой ыетнл-виологеи восстанавливается.новыми веществами, образующимися в световой стадии процесса. Согласно предложенному механизму фотосенсибилизации в азробиых условиях, ответственны« за увеличение глубины и скорости восстановления акцепторов электрона могут быть оульфиновые кислоты / продукты фотосен-сибилизированного окисления кислородом 5Н-ооединений /.

9. Вискавано предположение о возможней роли подобного механизма фотосенсибилизации в присутствии кислорода и в фо-тосинтезирущих клетках. В атом случае кислород, выделяемый второй фотосистемой фотосинтеза, может приводить к образованию более активных восстановителей, чем исходныедоноры электрона; эти соединения могут, в свою очередь, использоваться При работе первой фотосистемы.

-а/—

Список работ, опубликованных по теме диссертации

* - щ-

' I. Црон Г.П., Луганская А.Н., Красновский A.A. Фотовосстановление метклвяологена, сенсибилизированное хлорофиллом и его аналогами; использование даотекна и тиомочевяка в качестве доноров злектрона. ДАН СССР, ^74. 221. 1967.

2. Красновский A.A., Луганская А.Н., Роль кислорода при фотосенсабилизированном хлорофиллом восстановлении метклвиоло-гена и других красителей. ДАН СССР, Iftj. 1441, 1963

3. Луганская A.U., Красновскиа A.A. Роль кислорода в фотосеясхбмиэкровавяом хлорофиллом восстановлены» метклвяоло-гека ■ других красителей. II Всесоюзный бвохим. съезд, секция 19, стр. 77, Таисент, 1969 .

4. Луганская А.Н., Красновсклй A.A. Иооледоваляе меха! нкзма фотосенсибилмирс ванных хлорофиллом окислительно-вос ста-

новятелышх реакций в присутствии кислорода. иолехулярпая био-логяя, 848, 1970,

5. Луганская А.Н., Красновский A.A. Спектральные свойсп хлорофилла я его аналогов в водных растворах ооверхвостно-ах-ТЕвных маестя. Известия АН СССР ( » печати ).

6. Луганская А.Н., КрасновсяяИ A.A. Участие кислорода в фотосенсябялязкрованном хлоро^жллом восстановлении метилвя-ологена в водном растворе детергента, Баэфяэика ( в печати >.

. 7. Кроодавскяй А.А,, Лугаяская A.B. Фотосенснбилизиро-ванвов воостааовяевие метилвиологеиа и ферредоксина в водных средах в присутствия кислорода. ДАВ! ОССРЧ д печати ).

; M s.fsts- :

i...1 1Ътйпянт_ВЗЛТ. mj.CeDOBa.n.5. aamJtW. tlü*