"Скрытая" ВГВ-инфекция среди доноров крови и лиц, относящихся к группам риска инфицирования

Ганина, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
"Скрытая" ВГВ-инфекция среди доноров крови и лиц, относящихся к группам риска инфицирования
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме ""Скрытая" ВГВ-инфекция среди доноров крови и лиц, относящихся к группам риска инфицирования"

На правах рукописи

□ОЗДОоиоо

Гашша Анна Александровна

«Скрытая» ВГВ-инфекцня среди доноров крови и лиц, относящихся к группам

риска инфицирования

03.00.06 - вирусология 14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ЛЕК 2009

Москва-2009

003488086

На правах рукописи

Ганина Анна Александровна

«Скрытая» ВГВ-инфекция среди доноров крови и лиц, относящихся к группам

риска инфицирования

03.00.06 - вирусология 14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Михайлов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Семененко Татьяна Анатольевна

доктор биологических наук Ожерелков Сергей Викторович

Ведущая организация Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский Институт вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится ъ 2009г. в

часов ^^минут на заседании Диссертационного совета Д. 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ.Чумакова РАМН (142782, Московская область)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН

Автореферат разослан Ж, 2009г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук __"" О-А- Медведкина

Актуальность проблемы.

Вирусный гепатит В (ТВ) является одной из широко распространенных социально значимых вирусных, инфекций. Возможный неблагоприятный исход различных форм ГВ (развитие цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы) причиняет значительный социально-экономический ущерб. Каждый год в мире более 1 млн. человек умирают от хронических заболеваний печени [Шахгиьдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003].

В 1999-2008 гг. проявления эпидемического процесса ГВ в РФ приобрели принципиально новый качественный характер: продолжающееся снижение заболеваемости острыми формами сочеталось с увеличением регистрации клинически выраженного хронического ГВ (ХГВ) и сохранением высокого уровня и активно выявляемых скрытых форм инфекции. К 2008 г. показатель для острого ГВ (ОГВ) (4,04 на 100 тыс. нас.) по сравнению с 1999 г. (43,3 на 100 тыс. нас.) сократился в 6,1 раза, в то время как для ХГВ показатель заболеваемости увеличился в 1,6 раза (9,0 на 100 тыс. нас - 1999г и 14,19 на 100 тыс. нас. - 2008г). В результате заболеваемость ХГВ почти в 2 раза превысила уровень острых форм этой инфекции. Среди лиц, инфицированных ХГВ, особое место занимают бессимптомные «носители» вируса ГВ (ВГВ) («носителю) HBsAg), которые в подавляющем большинстве являются больными ХГВ без выраженных клинических проявлений заболевания. Эти лица, чаще всего, остаются скрытыми источниками инфекции на протяжении многих лет, а иногда и пожизненно.

Учитывая множественные пути передачи ГВ, ведущая роль в борьбе с этой инфекцией принадлежит массовой вакцинопрофилактике. Приказом МЗ РФ от 18.12.97 №375 и Федеральным законом «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней», принятым в 1998 году, вакцинация против ГВ вюпочена в Национальный календарь профилактических прививок.

большинстве случаев выявление вируса ограничивается определением HBsAg. Ранее утверждалось, что исчезновение HBsAg у пациентов с ВГВ-инфекцией ассоциировано с прекращением виремии и ремиссией заболевания. Однако результаты научных исследований свидетельствуют, что ДНК ВГВ в низких концентрациях может быть обнаружена в сыворотке крови и ткани печени с недетектируемым уровнем HBsAg. Сегодня доказано, что данный феномен можно зарегистрировать не только у больных при острой инфекции с самостоятельным разрешением, при хронической инфекции, но и у вполне здоровых лиц, претендующих на донорство.

Последнее определяет риск передачи HBsAg-негативной, «скрытой» формы инфекции. В научной литературе для обозначения «скрытой» формы ГВ используется несколько терминов: «оккультный» (occult), «молчащий» (silent) и латентный (latent) [Ш. Шерлок, 1999; Т.М. De Feo, 2005; A. Helmy, 2006].

. Эта форма заболевания характеризуется отсутствием позитивных результатов выявления сывороточных маркеров персистирования ■ вирусной инфекции (HBsAg и/или HBeAg) при сохранении вируса в организме.

Открытие «скрытой» формы ГВ поставило перед исследователями вирусных гепатитов ряд принципиальных вопросов:

• какова эпидемиологическая характеристика данной формы ГВ (широта распространения в регионах, различающихся по заболеваемости ГВ; группы риска, пути передачи и др.)?

• каковы молекулярно-биологические характеристики ВГВ и HBsAg, выявляемых у лиц со «скрытой» ВГВ-инфекции?

• каков серологический профиль маркеров «скрытой» ВГВ-инфекции, определяемый при использовании современных методов и диагностических препаратов?

Очевидно, что рутинный профиль серологических маркеров не всегда надежен для определения статуса ВГВ-инфекции, что делает актуальным разработку нового алгоритма скрининга доноров для выявления «скрытой» формы ГВ.

Анализ иностранной и отечественной научной литературы свидетельствует, что изучение «скрытой» ВГВ-инфекции находится на начальном этапе и является актуальной для медицинской науки и практического здравоохранения.

Исходя из этого, нами была выбрана следующая цель: эпидемиологическая и вирусологическая характеристика «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови и лиц, относящихся к группам риска инфицирования.

Для достижения поставленной цели определены задачи:

1. Разработать диагностическую иммуноферментную тест-систему (ИФТС) для выявления суммарных антител к core антигену ВГВ (анти-НВс).

2. Определить распространение «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови и лиц, относящихся к группам повышенного риска инфицирования ВГВ.

3. Сравнить частоту выявления «скрытой» ВГВ-инфекции среди населения регионов России, различающихся по интенсивности циркуляции ВГВ (Московская область и Республика Тыва).

4. Охарактеризовать ВГВ, обнаруженный у лиц с наличием «скрытой» ВГВ-инфекции (наличие мутантных форм вируса, уровень виремии).

5. Разработать алгоритм скрининга доноров крови для выявления «скрытой» ВГВ-инфекции.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная технология изготовления ИФТС для качественного определения анти-НВс ВГВ позволяет осуществлять серийный выпуск данного препарата. Диагностический набор реагентов по своим аналитическим характеристикам (чувствительность и специфичность) не уступает отечественным и импортным аналогам.

2. Частота выявления «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови зависит от интенсивности циркуляции ВГВ в исследуемом регионе. В низкоэндемичном регионе по заболеваемости ГВ, Москва и Московская область (заболеваемость ХГВ в 2008 г. - 4,57 на 100 тыс. нас.), она составила 0,28%. В

высокоэндемичном, Республики Тыва (заболеваемость ХГВ в 2008 г. - 20,61 на 100 тыс. нас.) - 9,4%.

3. Частота «скрытой» ВГВ-инфекции среди исследуемых групп лиц, проживающих на территории г. Москвы и Московской области, составила: доноры крови - 0,28%; лица, принимающих ПАВ - 1,35%; онкологические больные - 0,43%; медицинские работники - 0,65%. Среди доноры крови г.Кызыл, Республики Тыва -9,4%.

4. Основной причиной получения HBsAg-отрицателыгого результата при выявлении «скрытой» ВГВ-инфекции с помощью коммерческих диагностических препаратов стал низкий уровень репликативной активности ВГВ и низкая концентрация HBsAg (менее 0,1 нг/мл).

5. Разработанный алгоритм диагностики «скрытой» ВГВ-инфекции с использованием теста для выявления анти-НВс ВГВ и высокочувствительной (от 100 копий/мл) «гнездовой» полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет выявлять HBsAg-негативные формы данной инфекции.

Научная новизна.

Впервые определена распространенность «скрытой» ВГВ-инфекции среди различных групп населения г. Москвы и Московской области и доноров крови Республики Тыва.

Показано, что основным фактором, определяющим частоту выявления «скрытой» ВГВ-инфекции является интенсивность циркуляции ВГВ в изучаемом регионе.

При анализе аминокислотных последовательностей изолятов со «скрытой» ВГВ-инфекцией выявлены и охарактеризованы замены в S-гене ДНК ВГВ.

Установлено, что основной причиной развития «скрытой» ВГВ-инфекции на территории низкоэндемичного региона по заболеваемости ГВ (г. Москва и Московская область) является низкая концентрация HBsAg в сыворотке (плазме) крови исследуемых групп лиц.

Практическая значимость.

Разработана технология производства ИФТС для качественного определения анти-НВс ВГВ. Тест-система успешно прошла государственные испытания в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича. На базе ЗАО «ЭКОлаб» в 2006-2008 гг. выпущено шесть производственных серий ИФТС «ИФА-антиНВсоге».

Разработан алгоритм выявления «скрытой» ВГВ-инфекции для профилактики постгрансфузионного ГВ.

Внедрение результатов работы.

Утвержденный проект производства ИФТС для определения анти-НВс «ИФА-антиНВсоге» (ТУ 9388-042-70423725-2006) передан в серийный выпуск данного диагностического препарата.

Алгоритм для обнаружения «скрытой» ВГВ-инфекции используется в практической работе лаборатории вирусных гепатитов ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова и кафедры вирусологии и микробиологии Российского Университета Дружбы Народов.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены на Научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (май 2007, Москва), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (апрель 2008, Москва), на совместном заседании Ученого совета Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ.Чумакова РАМН (апрель 2009, Москва).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 в центральном журнале.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, состоящего из 20 работ отечественных и 187 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 рисунками, 2 схемами и 24 таблицами.

Собственные исследования.

1. Материалы и методы исследования.

1.1. Разработка ИФТС «ИФА-антиНВсоге». В качестве химических компонентов использовали 0,3% раствор 3,3',5,5' - тетраметилбензидина в димелтилсульфокислоте (ДМСО), ацетатно-цитратный буферный раствор, содержащий 0,01% перекиси водорода (рН=3,9 - 4,1), стоп-реагент - 0,5 М раствор серной кислоты.

Дня получения иммуносорбента применялся рекомбинантный HBcAg. В качестве штамма продуцента HBcAg использовали штамм E.coli К 802, несущий плазмиду рНВс - 24, который депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ-3486. В качестве твердого носителя использовали полистироловые 96-луночные планшеты средней связывающей способности фирмы «Costar» (США).

В качестве коньюгата использовали иммуноглобулиновую фракцию анти-НВс. Плазму с анти-НВс отбирали среди выбракованной на станциях переливания донорской крови, содержащей HBsAg или с повышенным уровнем активности сывороточных трансаминаз. Коньюгат анти-НВс с пероксидазой хрена получали перйодатным методом.

Для получения контрольного положительного образца использовали донорскую плазму, содержащую анти-НВс и не содержащую HBsAg, маркеров ВИЧ и ВГС. Для получения контрольного отрицательного образца использовали донорскую плазму, не содержащую анти-НВс и не содержащую HBsAg, маркеров ВИЧ и ВГС. Инактивацию плазмы проводили путем добавления 10% хлороформа от объема сыворотки. Флаконы с сывороткой прогревали в водяной бане при

температуре 56+1°С в течение 2 часов. После инактивации сыворотку оставляли охлаждаться до комнатной температуры и на 12 часов (на ночь) помещали в холодильник (2-8°С). Далее сыворотку центрифугировали в течение 1 часа при 8000 об/мин и температуре 8-10°С. Супернатант сливали, добавляли консервант (проклин и ципрофлоксацин до конечной концентрации 0,05% и 0,01% соответственно). Затем сыворотку фильтровали с использованием вакуумной установки.

1.2. Выявление маркеров «скрытой» ВГВ-инфекции проводили в образцах сывороток крови. Характеристика групп лиц, от которых были получены образцы сывороток крови, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика групп населения, в которых проведено определение «скрытой» ВГВ-

инфекции

Группа Количество обследованных лиц Пол Средний возраст (лет) Источник

мужчины женщины

Низкоэндемичный регион по заболеваемости ГВ (г. Москва и Московская область)

Доноры крови 2492 1641 851 44,7 СПК, г. Орехово-Зуево

Лица, принимающие психоактивные вещества (ПАВ) 222* 206 16 30 СПК, г. Орехово-Зуев о

ВИЧ- инфицированные пациенты 117 73 65 31 Московский областной центр СПИД

Онкологические больные 233 131 102 57,3 МОНИКИ им. М.Ф. Владимирског о

Пациенты отделения гемодиализа (ГД) 183 110 73 44,4 МОНИКИ им. М.Ф. Владимирског о

Беременные женщин 330 29 Родильный дом г. Орехово-Зуево, 4-ая гор. б-ца г.Москва

Медицинские работники 155 25 130 46,8 г. Орехово-Зуево

Высокоэндемичный регион по заболеваемости ГВ (Республики Тыва)

Доноры крови 85 26 59 39,6 СПК, г.Кызыл

* Среди 222 лиц, принимающих ПАВ, у 166 пациентов обнаружены анти-ВГС, что составило 74,8%; у 8 (3,6%) больных отмечено сочетание анти-ВГС с антителами к ВИЧ.

Для аттестации чувствительности и специфической активности ИФТС «ИФА-антиНВсоге» дополнительно исследовались 837 образцов сывороток доноров крови (СПК, г. Орехово-Зуево).

U. Маркеры ГВ в исследуемых образцах сыворотки крови определяли различными методами:

I. Иммуноферментный анализ проводили с использованием следующих тест-систем:

1. «ИФЛ-HBsAg» (ЗАО «ЭКОлаб»), чувствительность - 0,1нг/мл,

выявляет основные субтипы HBsAg ВГВ;

2. «ДС-ИФА-HBsAg-O.Ol» (НПО «Диагностические системы»)*;

3. «HBs Ag-ИФ А-БЕСТ-0,01» (ЗАО «Вектор Бест»)*;

4. «ИФА-антиНВсоге» (ЗАО «ЭКОлаб»);

5. «ДС-ИФА-анти-НВс» (НПО «Диагностические системы»);

6. «Beïcro-HBcAg-антитела» (ЗАО «Вектор Бест»);

7. «ДС-ИФА анти-HBs» (НПО «Диагностические системы»);

8. «BeKTO-HBsAg-антитела» (ЗАО «Вектор Бест»);

9. «ДС-ИФА-анти-НВе» (НПО «Диагностические системы»);

10. «Векто-НВе-IgG» (ЗАО «Вектор Беста).

11. «Murex Anti-HBc (total)» (Abbott/Murex, Великобритания).

* ИФТС «flC-Ht£>A-HBsAg-0,01» и «iIBsAg-ИФА-БЕСТ-0,01» имеют чувствительность -0,01нг/мл, выявляют основные субтипы ВГВ, а также мутантные варианты HBsAg (К141Б, Q129H, M133L, K142S, P142S, Т143К, G145R).

Постановку тестов проводили по протоколу производителя.

И. Хемифлюоресцентный анализ на анти-НВс и HBsAg (чувствительность -0,04нг/мл, выявляет основные субтипы и мутантные варианты HBsAg ВГВ) проводили с помощью автоматического анализатора Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Швейцария). Постановку тестов проводили по протоколу производителя.

Ш. ДНК ВГВ определяли методом nested ПЦР с праймерами к консервативному участку ргесоге/соге генома ВГВ с чувствительностью не менее 100 копий/мл по результатам тестирования серии, предельных разведений образцов с

известной концентрацией ДНК ВГВ. Выделение ДНК из образцов сыворотки крови проводили методом экстракции фенол-хлороформом с использованием набора производства НПО «ЛИТЕХ» по протоколу производителя. Амплификацию в nested ПЦР проводили с праймерами, приведенными в таблице 2.

Условия первого раунда ПЦР были следующими: 94°С - 2 мин., затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 30 сек., отжиг при 56°С - 30 сек., и удлинение цепи при 12° - 45 сек. Продукт первой ПЦР амплифицировали во втором раунде ПЦР при тех же условиях, но при температуре отжига 55 °С. Полученный в ходе ПЦР продукт величиной 307 нт определяли в электрофорезе в агарозном геле (1,5%) в TBE.

Вирусную нагрузку ВГВ определяли с помощью набора «Биотитр В» производства НПО «Литех», основанным на технологии ПЦР в реальном времени, с линейным диапазоном определения концентрации ДНК ВГВ 104~ 107 копий/мл и пределом чувствительности 100 копий/мл. Постановку теста проводили по протоколу производителя в анализаторе COBAS TaqMan 48 (Roche Diagnostics, Швейцария).

Для образцов, положительных по ДНК ВГВ в ПЦР с праймерами к участку precore/core генома ВГВ, определяли последовательность S-гена. Амплификацию S-гена проводили в nested -ПЦР с праймерами, предложенными Basuni [Basuni A. and Carman W., 2004].

Таблица 2

Характеристика специфических праймеров, используемых для детекции ДНК ВГВ и __амплификации S-гена_^__

Участок генома ВГВ Последовательность Положение Направление

precore/core 5' - gca tgg aga cca ccg tga ac- 3' Внешний Прямой

precore/core 5' - gga aag aag tea gaa ggc aa - 3' Внешний Обратный

precore/core 5' - cat aag agg act ctt gga ct - 3' Внутренний Прямой

precore/core 5" - ggc aaa aaa gag agt aac tc -3' Внутренний Обратный

S-ген 5' - cct get ggt ggc tcc agt tc - 3' Внешний Прямой

S-ген 5' - cca caa ttc ktt gac ata ctt tcca - 3' (k=g/t) Вненпшй Обратный

S-ген 5' - gca cac gga att ccc gag gac tgg gga ccctg-3' Внутренний Прямой

S-ген 5* - gac ace aag ctt ggt tag ggt tta aat gtatacc-3' Внутренний Обратный

Поскольку целью амплификации S-гена являлся поиск точечных мутаций в вирусном геноме, при амплификации вместо Taq-полимеразы использовали более точную ДНК-полимеразу Pfu, обладающую корректирующей ("proofreading") активностью. Условия для обоих раундов ПНР были следующими: 94°С - 2 мин., затем 35 циклов: денатурация при 94°С - 45 сек., отжига при 55°С - 45 сек., и удлинение цепи при 72°С 1 мин. 30 сек.

Продукт ПЦР величиной 713 нт вырезали из геля и выделяли из агарозы с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Секвенирование проводили с использованием набора GenomeLab Methods Development kit (Beckman Coulter) в анализаторе CEQ 8800 (Beckman Coulter). Полученные последовательности сравнивали с референсными последовательностями, депонированными в базе данных GenBank, соответствующими «дикому типу» ВГВ и мутантным формам, несущим аминокислотные замены в «а»-детерминанте HBsAg.

Статистическая обработка. Применяли общепринятые методы вариационной статистики (вычисления значений квадратичного отклонения, доверительного интервала, достоверности различий меяеду сравниваемыми величинами, описанными для Т-распределения Стьюдента). Различия считали достоверными при р < 0,05.

2. Результаты и их обсуждение.

2.1 .Разработка иммуноферментной тест-системы для качественного определения анти-НВс ВГВ.

При разработке тест-системы был выбран конкурентный вариант ИФА. При наличии специфических анти-НВс в сыворотке крови они конкурируют с меченными специфическими антителами конъюгата за связывание с HBcAg подложки. Количество определяемых анти-НВс обратнопропорционально значению оптической плотности образца, т.е. чем больше антител в сыворотке, тем ниже сигнал.

Для выбора оптимальной концентрации HBcAg проводили его титрование. На планшет наносили различные концентрации антигена (1, 3, 5, 7 и 10 мкг/мл). В качестве тестируемых образцов использовали контрольные образцы: К+ и К' . Максимальные различия между значениями оптической плотности (ОП) в контрольном положительном образце (К+) и величиной значений ОП в лунках с

контрольным отрицательным образцом (К) были зафиксированы при концентрации HBcAg в количестве 5 мкг/мл. По значению коэффициента позитивности (0О=0Псыв./0Пкрит.) эта концентрация была признана оптимальной и использовалась в дальнейшей работе.

Конъюгат разводили и тестировали с использованием положительных сывороток, имеющих наименьшее значение коэффициента позитивности в аналогичных тестах. Используя значения коэффициентов позитивности данных образцов, необходимо было определить оптимальное значение оптической плотности К-, т.к. по этой величине рассчитывали критическое значение оптической плотности. При этом соблюдали следующие условия: ОП К> не выше 0,150 o.e., ОП К- не ниже 1,0 o.e. Полученные результаты показали, что разведение конъюгата 1: 10000 является оптимальным для данной системы.

Для исследования чувствительности и специфичности разработанной тест-системы и доказательства возможности ее использования в службе крови нами было проведено сравнительное исследование набора «ИФА-антиНВсоге» (ЗАО «ЭКОлаб») с отечественными и импортными аналогами.

Из 837 доноров, первично исследуемых в ИФТС «ИФА-антиНВсоге» (ЗАО «ЭКОлаб»), в 71 (8,5%) образце бьми обнаружены анти-НВс. Большинство из анги-НВс-позитивных образцов содержали либо анти-HBs, либо анти-НВе или анти-nBs+анти-НБе (таблица 3). Все анти-НВс-реактивные образцы не содержали HBeAg.

Из 71 образца, первично позитивных в ИФТС «ИФА-антиНВсоге», 71 были положительными в ИФТС «ДС-ИФА-анти-НВс», «Murex Anti-HBc (total)» и 70 в ИФТС «Beicro-HBcAg-антитела». В одном не совпавшем по анти-НВс образце (в ИФТС «Beicro-HBcAg-антитела») были обнаружены анти-HBs без анти-НВе (таблица 3).

Таблица 3

Результаты обнаружения анти-НВэ и анти-НВе в 71 образце сывороток крови первично позитивных по анти-НВс, обнаруженных в тесте «ИФА-антиНВсоге»

Маркеры ВГВ

«изолированные» анти-НВс (%) анти-НВс+анти- HBs (%) шти-НВс+анти-ЗВе (%) анти-НВс+анти-HBs +анти-НВе (%)

анти-НВс, п=71 3 (4,2%) 32(45%) 4(5,6%) 32(45%)

Наличие анти-HBs и анти-НВе свидетельствует о ранее перенесенном вирусном ГВ. Следовательно, обнаружение в этих образцах анти-НВс при помощи теста «ИФА-антиНВсоге» может служить доказательством ее специфичности.

Кроме того, для проверки специфичности ИФТС «ИФА-антиНВсоге» из первично анти-НВс-отрицательных образцов в ИФТС «ИФА-антиНВсоге» произвольно были выбраны 150 сывороток доноров крови, которые параллельно исследовались при помощи трех тестов для выявления анти-НВс («ДС-ИФА-анти-НВс», «Murex Anti-HBc (total)» и «BeKTO-HBcAg-антитела»). Все 150 образцов в трех представленных тестах показали отрицательный результат анализа на анти-НВс.

Таким образом, по результатам сравнения чувствительности и специфической активности разработанной тест-системы с отечественными и зарубежными аналогами показано, что представленный набор реагентов для качественного определения анти-НВс может быть использован в работе лабораторий службы крови.

2.2. Частота выявления анти-НВс в HBsAg-негативных образцах сывороток крови от доноров и лиц, относящихся к группам риска инфицирования.

Для выявления «скрытой» ВГВ-инфекции применяли следующий алгоритм:

1 этап. Сыворотку крови первично исследовали с помощью ИФТС «ИФА-HBsAg» (ЗАО «ЭКОлаб») для выявления основных субтипов HBsAg ВГВ в количестве не менее 0,1 нг/мл;

2 этап. При получении отрицательного результата первичного исследования на HBsAg проводили скрининг на присутствие анти-НВс;

3 этап. При получении позитивного результата анти-НВс анализа, образец исследовали с помощью ПЦР. Положительный результат теста на ДНК ВГВ подтверждает предположение о наличии «скрытой» ВГВ-инфекции. Отрицательный результат может быть следствием нескольких причин: перенесенный ГВ в прошлом или ложноположительный результат анализа на анти-НВс.

Чаще всего анти-НВс выявлялись среди лиц, принимающих ПАВ (27,92%); пациентов, находящихся на лечении ГД (20,04%) и ВИЧ-инфицированных (17,9%). Полученные результаты можно считать достоверными, поскольку для представителей этих групп лиц существует высокая вероятность встречи с вирусным агентом (рисунок 1).

Среди лиц, принимающих ПАВ, достоверных различий в частоте выявления анти-НВс (р>0,05) между группой с маркерами ВГС/ВИЧ и без них установлено не было (28,92% против 27%, соответственно).

Рис. 1. Частота выявления «изолированных» анти-НВс ВГВ среди HBsAg-oтpицaтeльныx доноров крови и трупп риска инфицирования ГВ

Более частое обнаружение «изолированных» анти-НВс среди пациентов ГД по сравнению с лицами без почечной патологии можно объяснить в рамках нескольких гипотез. Во-первых, в условиях иммунодефицита, свойственного уремии, возрастает

число больных с персистирующей НВУ-инфекцией, протекающей по неизвестным причинам с малой концентрацией HBsAg. Во-вторых, состояние иммунодефицита может быть причиной ослабления продукции анти-НВэ. В-третьих, "уремические токсины", возможно, предрасполагают к росту ложноположительных определений анти-НВс [Зубкин М.А., 2001].

Наряду с анти-НВс во всех ВИЧ-позитивных образцах определяли количество С04+ и РНК ВИЧ. При изучении взаимосвязи между присутствием «изолированных» анти-НВс, вирусной нагрузкой (количество копий/мл РНК ВИЧ) и концентрацией СБ4+ достоверных различий выявлено не было (р>0,05).

Из 2492 образцов, полученных от доноров крови низкоэндемичного региона (г. Москва и Московская область), негативных по HBsAg, 124 (4,98%) содержали анти-НВс. При этом 32/124 (25,8%) являлись кадровыми донорами. Среди доноров крови высокоэндемичного региона (г. Кызыл, Республика Тыва) анти-НВс удалось выявить у 25,29% исследуемых лиц (рисунок 2). Учитывая значительную разницу в показателях заболеваемости ХГВ между этими регионами, мы предполагали получить подобные результаты.

Москва Республика Тыва

исследуемый регион

Рис. 2. Частота выявления анти-НВс среди доноров крови низкоэндемичного (г.Москва, Московская область) и высокоэвдемичного (Республика Тыва) регионов по заболеваемости ГВ

2.3. Частота выявления ДНК ВГВ в сыворотках крови, содержащих анти-НВс ВГВ.

Полученные результаты показали наличие «скрытой» ВГВ-инфекции как среди доноров, так и среди групп риска инфицирования ВГВ, проживающих на территории г. Москвы и Московской области. В то же время, среди лиц с анти-НВс, проживающих на территории одного низкоэндемичного региона, частота выявления «скрытой» ВГВ-инфекции была сходной среди всех обследованных групп.

Полученные результаты можно сравнить с результатами аналогичных исследований, прошедших за последние несколько лет в различных странах Европы, где уровень заболеваемости ГВ один из наиболее низких в мире. В РФ (Московская область) показатель частоты выявления «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови (5,65%) находится примерно на том же уровне, что и в Польше (3,5%) (Brojer Е., 2006], Великобритании (4,0%) [F. Alhababi, 2003]; значительно ниже, чем во Франции (13%) [S. Ramia, 2008]; чуть выше, чем в Германии (0,6%) [М. Schmidt, 2006], Испании (0,97%) [S. Sauleda, 2006]. В группах риска показатель частоты выявления латентной ВГВ-инфекции в РФ (Московская область) оказался значительно ниже, чем в некоторых Европейских странах. Подобные расхождения в результатах работ, проведенных внутри одного низкоэндемичного региона по заболеваемости ГВ (Европа), а иногда и внутри одной страны, примерно в одно и тоже время, могут указывать на значительные различия в чувствительности и специфичности используемых тестов для выявления анти-НВс и ДНК ВГВ.

Наибольшая распространенность латентной HBV-инфекции оказалась среди лиц, принимающих ПАВ, - 1,35% (рисунок 3). При чем все случаи «скрытой» ВГВ-инфекции были выявлены у лиц, имеющих антитела к ВГС.

исследуемые группы

Рис. 3. Частота выявления ДНК ВГВ в образцах сывороток от доноров крови и лиц из груш риска инфицирования ГВ, содержащих анти-НВс ВГВ

Выявление «скрытой» ВГВ-инфекции среди медперсонала (0,65%) связана с их профессиональной деятельностью. К выходу на пенсию до 70% среднего , медперсонала и 40-50% врачей переносят вирусный ГВ [Руковишников М.Ю., 1996; Павлов Н.Н., 2004].

Установлены случаи латентной HBV-инфекции среди онкологических больных (0,43%), Их обнаружение можно объяснить прохождением этими пациентами длительных курсов лечения, которые сопровождаются обилием различных парентеральных манипуляций.

Согласно полученным данным «скрытая» ВГВ-инфекции распространена и среди доноров крови: г. Мосвсва, Московская область - 0,28% и Республика Тыва -9,4%. Из 7 доноров с HBsAg-негативной ВГВ-инфекцией (г.Москва, Московская область) 4 являлись первичными донорами, 3 - кадровыми донорами.

Несмотря на то, что среди ВИЧ-инфицированных показатель частоты выявления анти-НВс был одним из наиболее высоких, случаев «скрытой» ВГВ-инфекции в этой группе лиц выявлено не было. Подобные результаты были получены в исследованиях, проведенных в Испании. При этом М.Т. Perez-Rodriguez et al., 2009, считают, что при длительном выявлении «изолированных» анти-НВс ПЦР на ДНК ВГВ необходима только для пациентов, имеющих клинические симптомы заболевания печени.

Несмотря на высокую частоту выявления анти-НВс среди пациентов ГД, нам не удалось обнаружить в этих образцах ДНК ВГВ. Отчасти подобный результат можно объяснить очень низким уровнем виремии. Даже при развитии «классического» НВбА£-позитивного ГВ количество выявляемой ДНК среди лиц, страдающих хроническими заболеваниями почек, намного ниже, чем среди других пациентов (4х 10 г- 4*107). При развитии оккультного ГВ, количество вирусной ДНК может быть ниже пределов аналитической чувствительности используемого ПЦР-теста (меньше 102 копий/мл) [в^пз Б., 2006].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что частота «скрытой» ВГВ-инфекции отчасти связана с особенностями исследуемой группы лиц, но в большей степени зависит от эндемичности изучаемого региона. В данной работе нами проанализированы сыворотки от доноров крови, проживающих на территории района с повышенным уровнем циркуляции вирусов гепатитов (Республика Тыва). При этом частота выявления латентного ГВ в этой выборке лиц оказалась выше, чем среди лиц, относящихся к группам риска инфицирования ВГВ, но проживающих в низкоэндемичном регионе по циркуляции ВГВ (Москва и Московская область). Очевидно, что «скрытый» ГВ среди лиц, имеющих повышенный риск инфицирования вирусными гепатитами и проживающих на территории высокоэндемичных регионов, будет встречаться значительно чаще, чем в низкоэндемичных регионах.

2.4. Определение вирусной нагрузки в анти-НВс/ДНК ВГВ - положительных образцах сыворотки крови.

Значения вирусной нагрузки для образцов, положительных по ДНК ВГВ в ПЦР с чувствительностью порядка 100 копий/мл, приведены в таблице 4. Для 7 образцов концентрации ДНК ВГВ находились ниже предела количественного определения применяемого теста (< 103 копий/мл), в остальных 5 образцах концентрации ДНК ВГВ укладывались в предел количественного определения, но не превышали 3,5 х 104 копий/мл.

Полученные результаты по изучению вирусной нагрузки в анти-НВс/ДНК ВГВ-позитивных изолятах показывают, что по сравнению с другими формами

протекания ГВ, при латентной НВУ-инфекции вирусная нагрузка невысока (до 103 копий/мл). Следовательно, «скрытую» ВГВ-инфекцию можно рассматривать как одну из форм протекания хронической НВУ-инфекции.

Таблица 4

Уровни вирусной нагрузки ВГВ в образцах сывороток крови у лиц с выявленной «скрытой» ВГВ-инфекцией___

Группа № образца ДНК ВГВ, копии/мл

Доноры 1 <103

2 1,3 х 10'

3 <Ю'

4 < 10'

5 1,1 х 104

6 <10-*

7 <10"'

Лица, принимающие ПАВ I 2,4 х 10'

2 1,7 х 10'

3 3,5 х 104

Онкологические больные 1 <10'

Медицинские работники 1 <10'

2.5. Амплификация Я-гена ДНК ВГВ, выделенной из анти-НВс/ДНК позитивных образцов.

Далее проводили секвенирование с целью выявления мутаций в Б-гене ДНК ВГВ. Нам удалось амплифицировать Б-ген ВГВ для 8 из 12 изолятов, выявленных среди лиц с «изолированными» анти-НВс, позитивных по ДНК ВГВ (таблица 5).

По-видимому, отсутствие положительного результата при амплификации Б-гена в 4 образцах было связано с крайне низкими концентрациями вирусной ДНК, поскольку результат количественного определения ДНК ВГВ в этих 4 образцах -менее 103 копий/мл.

Таблица 5

Вирусологическая характеристика изолятов ВГВ, выделенных от пациентов с

выявленной «скрытой» ВГВ-шн >екцией

Группа № образца дак вгв, копии/мл Мутации в S-гене, связанные с изменением антигенных свойств HBsAg

Доноры 1 1,3x10* -

2 <10* -

3 1,1*10J

4 <10J -

Лица, принимающие ПАВ 1 1,7x10' -

2 3,5x10" Т118А, V128A,

Онкологические больные 1 <10J -

Медицинские работники 1 <10^ -

Анализ нуклеотндных последовательностей S-гена 8 изолятов ВГВ, выделенных от лиц со «скрытой» ВГВ-инфекцией показал отсутствие у всех изолятов, кроме одного, аминокислотных замен в В-клеточном эпитопе HBsAg, связанных с «избеганием» иммунного ответа - «избегающих» мутаций. Один вариант ВГВ, выделенный от пациента-наркомана (наркоман 3), содержал замену валина на аланин в позиции 128 (V128A), расположенную в пределах «а»-детерминанты HBsAg (аминокислоты 124-148).

Все проанализированные изоляты несли аминокислотную замену в позиции 118 - треонин на аланин (Т118А) в том же изоляте ВГВ, выделенном от пациента-наркомана №3, который содержал замену в позиции 128, или треонин на валин (T118V) у остальных 7 изолятов ВГВ. Данная аминокислотная позиция (118 а.а.) находится за пределами «а»-детерминанты. Однако, по литературным данным, замена Т118А может приводить к изменению антигенных свойств HBsAg и клиническому обострению при терапии иммуноглобулинами, направленными против ВГВ и обеспечивающими селективный прессинг для такого варианта вируса. Еще один вариант ВГВ, выделенный нами от другого пациента наркомана №2, содержал аминокислотную замену в позиции 57 (T57I), также за пределами «а»-детерминанты.

Мутантный вариант ВГВ, выделенный от пациента-наркомана №3, помимо замен в аминокислотных позициях 118 и 128, содержал еще одну аминокислотную замену в S-гене за пределами «а»-детерминанты, в позиции 172 (W172L). У этого же изолята отмечали более высокую вирусную нагрузку ВГВ - 3,5 х 104 копий/мл, тогда как у остальных вариантов ВГВ, не несущих значимых мутаций в HBsAg, концентрация ДНК ВГВ не превышала 2,4 х 103 копий/мл. При этом в 3 случаях вирусная нагрузка .была менее 103 копий/мл. Всего в 7 из 12 выявленных случаев «скрытой» ВГВ-инфекции вирусная нагрузка составляла менее 103 копий/мл, а в остальных 5 также была низкой, не достигая 105 копий/мл. Лишь в 1 из 12 (таблица 5) случаев «скрытой» ВГВ-инфекции негативный результат выявления HBsAg, по-видимому, был связан с наличием мутаций в S-гене ВГВ. Следовательно, основной причиной HBsAg-негативной ВГВ-инфекции в нашем исследовании являлся крайне низкий уровень репликации ВГВ, и как следствие, низкий уровень экспрессии HBsAg.

2.6. Результаты исследования анти-НВс-позитивных образцов сывороток крови от исследуемых групп лиц с помощью высокочувствительных иммуноферментных тестов.

Результаты сравнительных исследований высокочувствительных тест-систем, в которых использованы различные методы определения HBsAg, показали, что для выявления низких концентраций и мутантных форм HBsAg иммуноферментный анализ является более чувствительным методом по сравнению с хемифлюоресцентным анализом (таблица 6).

При исследовании с помощью тестов «ДС-ИФA-HBsAg-0,01», «HBsAg-ИФА-БЕСТ-0,01» и «Elecsys HBsAg II» анти-НВс-позитивных образцов сывороток, не содержащих HBsAg по результатам тестов с чувствительностью 0,1 ME/мл, HBsAg удалось обнаружить в 20 образцах сывороток, не содержащих ДНК ВГВ. Наибольшая частота выявления HBsAg при вторичном скрининге на данный маркер оказалась среди представителей гиперэндемичного района (Республика Тыва). При повторном исследовании анти-НВс - позитивных/ДНК ВГВ - негативных образцов в ПЦР, в которых удалось обнаружить HBsAg при вторичном скрининге, был получен

отрицательный результат. Можно предположить, что концентрация ДНК ВГВ в этих образцах оказалась ниже предела чувствительности используемого нами ПНР-теста, т.е. меньше 100 копий/мл. При исследовании сывороток от лиц, проживающих в Республике Тыва, в двух образцах удалось обнаружить латентную НВУ-инфекцию без анти-НВс. Помимо ДНК ВГВ, в данных образцах содержались в высоких концентрациях анти-НВз. Кроме того, с помощью высокочувствительной ИФТС в них удалось обнаружить НВбА§.

Таблица 6

Результаты сравнительного исследования высокочувствительных тест систем,

выявляющих мутангные варианты HBsAg

Группа «ДC-ИФA-HBsAg-0,01», п (%) «НВБАд-ИФА-БЕСТ-0,01», п(%) «Ексэуз HBsAg II», п (%)

Доноры (п=124) ДНКВГВ+ 0/7 0/7 0/7

ДНК ВГВ- 0/117 0/117 0/117

Лица, принимающие ПАВ (п-62) ДНКВГВ+ 0/3 0/3 0/3

ДНКВГВ- 5/59 (8,5%) 5/59 (8,5%) 2/59(8,5%)

Медицинские работники (п=23) ДНКВГВ+ 0/1 0/1 0/1

ДНК ВГВ- 0/22 0/22 0/22

Онкологические больные (п=29) ДНКВГВ+ 0/1 0/1 0/1

ДНКВГВ- 4/28 (14,2%) 4/28 (14,2%) 4/28 (14,2%)

Пациенты ГД (п=44) 3/44(6,8%) 4/44(9,1%) 2/44 (4,5%0

Население Республики Тыва (п=22) ДНКВГВ+ 6/8 (75%) 6/8 (75%) 0/8

ДНКВГВ- 2/14 (14,3%) 2/14 (14,3%) 0

Беременные женщины (п=40) 0/40 0/40 0/40

ВИЧ-инфицированные пациенты (п=21) 0/21 0/21 0/21

Полученные результаты указывают на необходимость внедрения высокочувствительных иммуноферменгных тестов для определения НВбА§, прежде всего, в регионах с повышенным уровнем циркуляции гепатотропных вирусов. Подобная мера позволит выявлять скрытые формы ГВ, распространенность которых среди лиц, проживающих в гиперэндемичных регионах нашей страны, является наибольшей.

С другой стороны, с помощью высокочувствительных тестов не удалось выявить HBsAg в анти-НВс/ДНК ВГВ - позитивных образцах. Полученный результат может быть либо следствием наличие мутации в S-гене ДНК ВГВ, либо очень низкой концентрацией HBsAg в периферической крови.

Несомненно, введение дополнительных исследований требует дополнительных материальных затрат, а также времени доя их проведения. Нами установлено, что качество трех отечественных коммерческих тест-систем для определения суммарных анти-НВс (ЗАО «Вектор Бест», НПО «Диагностические системы», ЗАО «ЭКОлаб») сопоставимо с импортными аналогами («Murex Anti-HBc (total)», Abbott/Murex, Великобритания).

2.7. Алгоритм скрининга доноров крови.

1этап

Исследование на HBsAg методом ИФА (чувствительность 0,01 МЕ/мл

брак

переливание

3 этап

брак

3. Выводы.

1. Разработана иммуноферментная тест-система для качественного определения суммарных анти-НВс ВГВ. Испытания данной системы показали, что по своим аналитическим характеристикам (чувствительность и специфичность) она не уступает отечественным и импортным аналогам.

2. Разработан алгоритм скрининга доноров крови для выявления «скрытой» ВГВ-инфекции и профилактики посттрансфузионного ГВ.

3. Впервые установлена распространенность «скрытой» ВГВ-инфекции на неэндемичной по гепатиту В территории, составившая 0,28% среди условно здорового населения (доноры крови); в группах повышенного риска инфицирования ВГВ данный показатель оказался несколько выше -1,35% среди лиц, принимающих ПАВ; 0,43% среди онкологических больных; 0,65% среда медицинских работников.

4. Установлена связь между частотой выявления «скрытой» ВГВ-инфекции и интенсивностью циркуляции ВГВ в регионе - так, в Московской области (регион с низкой интенсивностью циркуляции ВГВ) распространенность «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови составила 0,28%, а в Республике Тыва (регион с высокой интенсивностью циркуляции ВГВ) - 9,4%. Полученные данные свидетельствуют о влиянии интенсивности циркуляции ВГВ на распространенность «скрытой» формы инфекции в популяции.

5. Основной причиной получения HBsAg-oтpицaтeльнoгo результата при выявлении ВГВ, то ,есть «скрытой» формы ВГВ-инфекции, является низкий уровень репликативной активности ВГВ и низкая концентрация ИВбАб (менее 0,1 нг/мл). Показано, что мутации в «а»-детерминанте поверхностного антигена ВГВ являются причиной лишь небольшой доли случаев «скрытой» ВГВ-инфекции. Таким образом, повышение чувствительности тест-систем для выявления НВбАй и расширение спектра мутаций, выявляемых с их помощью, будет способствовать сокращению числа случаев «скрытой» формы данной инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ганина A.A., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Дмитриев ГШ., Михайлов М.И. Частота выявления скрытой ВГВ-инфекции среди доноров крови и в группах риска инфицирования ВГВ// Материалы VII Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, лечение и профилактика», г. Москва, 29-31 мая 2007 г. - М., 2007. - с. 16 -17.

2. Ганина A.A., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Дмитриев П.Н., Марданлы СТ., Михайлов М.И. Частота выявления «скрытого» ГВ среди лиц с наркотической зависимостью и доноров крови// Наркология. - М,, 2008, №9. - с.70 - 74.

3. Кюрегян К.К., Ганина A.A., Гордейчук И.В., Исаева О.В., Дмитриев П.Н., Марданлы С.Г., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Выявление «латентного» гепатита В у лиц, принимающих психоактивные вещества// Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии: Материалы четырнадцатой Рос. Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008 г., Москва. - М., 2008. - Т. 18, №5.-с.92.

4. Ганина A.A. Лабораторная диагностика и эпидемиология скрытого HBsAg-негативного гепатита В//Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛЛумакова. - М., 2007. - Т. 24. - с. 163-170.

5. Ганина A.A., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Дмитриев П.Н., Жуман Авад Б.А., Михайлов М.И. Молекулярная характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных от пациентов со «скрытым» ГВ// Тез. докл. V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». -М., 2008. - с. 101.

6. Исаева О.В., Кюрегян К.К., Попова O.E., Ганина A.A., Дмитриев П.Н., Жуман Авад Б.А., Михайлов М.И. Изучение вирусов, вызывающих гепатиты с помощью молекулярно-биологических методов// Тез. докл. IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 г. -Новосибирск, 2008. - с.365.

7. Гордейчук И.В., Громова Н.И., Ганина A.A., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю. Латентный гепатит В в клинической практике (уровень распространения в

различных группах населения)// Тез. DI Национального Конгресса Терапевтов, 8-10 ноября, 2008. - Москва. - 54-55.

8. Попова O.E., Ганина A.A., Замятина H.A., Кожанова Т.В., Клушкина В.В, Михайлов М.И. Частота выявления HBsAg среди доноров крови и в группах риска инфицирования вирусом гепатита В с использованием тест-системы с чувствительностью 0,01 ME/мл// Тез. УШ Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, лечение и профилактика», г. Москва, 26-28 мая 2009 г. - М., 2009. - с. 27.

Считаю своим приятным долгом выразить благодарность за помощь в работе над диссертацией научному руководителю, доктору медицинских наук, профессору М.И. Михайлову. Особую благодарность за помощь в выполнении исследования автор выражает руководителю K.K. Кюрегяну и всем сотрудникам лаборатории вирусных гепатитов ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. Глубокую признательность за плодотворное сотрудничество автор выражает зав. отделением гемодиализа МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского A.B. Ватазину; зав. отделением радиологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского П.Ю. Полякову; зав. лабораторией ВИЧ СПК г. Орехово-Зуево В.П. Чепуриной; зав. лабораторией ВИЧ ЦРБ Е.К. Листовской. Также я весьма признательна доктору медицинских наук, профессору Ильченко Людмиле Юрьевне и ученому секретарю Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН O.A. Медведкиной за помощь в оформлении диссертации.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ганина, Анна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Часть 1. Обзор литературы.

1.1 Актуальность изучения ВГВ-инфекции.

1.2 Таксономия и строение ВГВ.

1.3 Серологические маркеры инфицирования ВГВ при классической» ВГВ-инфекции.

1.4 Характеристика «скрытой» ВГВ-инфекции.

1.5 Причины «скрытой» ВГВ-инфекции.

1.6. Лабораторная диагностика «скрытой» ВГВ-инфекции.

1.7. Эпидемиология «скрытой» ВГВ-инфекции.

1.8. Передача ВГВ в случае «скрытой» ВГВ-инфекции.

1.9. Клиника «скрытой» ВГВ-инфекции.

Часть 2.

Глава 1. Разработка иммуноферментной тест-системы для качественного определения анти-НВс ВГВ.

2.1.1 Тесты для определения анти-НВс ВГВ.

2.1.2. Принцип метода.

2.1.3. Получение иммуносорбента.

2.1.4. Получение конъюгата.

2.1.5. Получение контрольных образцов.

2.1.6. Результаты исследования чувствительности и специфической активности разработанной тест-системы.

Глава 2. Собственные исследования.

2.2.1 Материалы и методы.

2.2.2 Распространение «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови и групп риска.

2.2.2.1. Частота выявления анти-НВс среди исследуемых групп.

2.2.2.2. Частота выявления ДНК ВГВ в сыворотках крови, содержащих анти-НВс.

2.2.2.3. Определение вирусной нагрузки в анти-НВс/ДНК ВГВ-положительных образцах.

2.2.2.4. Амплификация S-гена ДНК ВГВ, выделенной из анти-НВс/ДНК-положительных образцов.

2.2.2.5. Результаты исследования анти-НВс-позитивных образцов сывороток крови от исследуемых групп лиц с помощью высокочувствительных иммуноферментных тестов.

2.2.2.6. Алгоритм скрининга доноров крови.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему ""Скрытая" ВГВ-инфекция среди доноров крови и лиц, относящихся к группам риска инфицирования"

Актуальность темы.

Вирусный ГВ является одной из широко распространенных социально значимых вирусных инфекций. Возможный неблагоприятный исход различных форм ГВ (развитие цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы) причиняет значительный социально-экономический ущерб. Каждый год в мире более 1 млн. человек умирают от хронических заболеваний печени [20].

В 1999-2008 гг. проявления эпидемического процесса ГВ в РФ приобрели принципиально новый качественный характер: продолжающееся снижение заболеваемости острыми формами сочеталось с увеличением регистрации клинически выраженного хронического ГВ (ХГВ) и сохранением высокого уровня и активно выявляемых скрытых форм инфекции. К 2008 г. показатель для острого ГВ (ОГВ) (4,04 на 100 тыс. нас.) по сравнению с 1999 г. (43,3 на 100 тыс. нас.) сократился в 6,1 раза, в то время как для ХГВ показатель заболеваемости увеличился в 1,6 раза (9,0 на 100 тыс. нас - 1999т и 14,19 на 100 тыс. нас. - 2008г). В результате заболеваемость ХГВ почти в 2 раза превысила уровень острых форм этой инфекции. Среди лиц, инфицированных ХГВ, особое место занимают бессимптомные «носители» вируса ГВ (ВГВ) («носители» HBsAg), которые в подавляющем большинстве являются больными ХГВ без выраженных клинических проявлений заболевания. Эти лица, чаще всего, остаются скрытыми источниками инфекции на протяжении многих лет, а иногда и пожизненно.

Учитывая множественные пути передачи ГВ, ведущая роль в борьбе с этой инфекцией принадлежит массовой вакцинопрофилактике. Приказом МЗ РФ от 18.12.97 №375 и Федеральным законом «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней», принятым в 1998 году, вакцинация против ГВ включена в Национальный календарь профилактических прививок.

Качественная и своевременная диагностика - еще один способ контроля распространения ГВ. Основным маркером инфицирования ВГВ является поверхностный антиген (HBsAg). В лечебных учреждениях и в службе переливания крови РФ лабораторная диагностика ГВ осуществляется в соответствии с приказом №494/96 "О совершенствовании системы эпиднадзора за ГВ и ГС" от 29.09.1994. В большинстве случаев выявление вируса ограничивается определением HBsAg. Ранее утверждалось, что исчезновение HBsAg у пациентов с ВГВ-инфекцией ассоциировано с прекращением виремии и ремиссией заболевания. Однако результаты научных исследований свидетельствуют, что ДНК ВГВ в низких концентрациях может быть обнаружена в сыворотке крови и ткани печени с недетектируемым уровнем HBsAg. Сегодня доказано, что данный феномен можно зарегистрировать не только у больных при острой инфекции с самостоятельным разрешением, при хронической инфекции, но и у вполне здоровых лиц, претендующих на донорство.

Эта форма заболевания характеризуется отсутствием позитивных результатов выявления сывороточных маркеров персистирования вирусной инфекции (HBsAg и/или HBeAg) при сохранении вируса в организме.

• каковы молекулярно-биологические характеристики ВГВ и HBsAg, выявляемых у лиц со «скрытой» ВГВ-инфекции?

Анализ иностранной и отечественной научной литературы свидетельствует, что изучение «скрытой» ВГВ-инфекции находится на Начальном этапе и является актуальной для медицинской науки и практического здравоохранения.

Для достижения поставленной цели определены задачи:

5. Разработать алгоритм скрининга доноров крови для выявления «скрытой» ВГВ-инфекции. •

Положения, выносимые на защиту.

4. Основной причиной получения HBsAg-отрицательного результата при выявлении «скрытой» ВГВ-инфекции с помощью коммерческих диагностических препаратов стал низкий уровень репликативной активности ВГВ и низкая концентрация HBsAg (менее ОД нг/мл).

Научная новизна.

Практическая значимость.

Разработана технология производства ИФТС для качественного определения анти-НВс ВГВ. Тест-система успешно прошла государственные испытания в ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича. На базе ЗАО «ЭКОлаб» в 20062008 гг. выпущено шесть производственных серий ИФТС «ИФА анти-НВс».

Разработан алгоритм выявления «скрытой» ВГВ-инфекции для профилактики посттрансфузионного ГВ.

Внедрение результатов работы.

Утвержденный проект производства ИФТС для определения анти-НВс «ИФА-антиНВс» (ТУ 9388-042-70423725-2006) передан в серийный выпуск данного диагностического препарата.

Апробация работы.

Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (апрель 2009, Москва).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 в центральном журнале.

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Ганина, Анна Александровна

выводы

4. Установлена связь между частотой выявления «скрытой» ВГВ-инфекции и интенсивностью циркуляции ВГВ в регионе — так, в Московской области (регион с низкой интенсивностью циркуляции ВГВ) распространенность «скрытой» ВГВ-инфекции среди доноров крови составила 0,28%, а в Республике Тыва (регион с высокой интенсивностью циркуляции ВГВ) - 9,4%. Полученные данные свидетельствуют о влиянии интенсивности циркуляции ВГВ на распространенность «скрытой» формы инфекции в популяции.

5. Основной причиной получения HBsAg-отрицательного результата при выявлении ВГВ, то есть «скрытой» формы ВГВ-инфекции, является низкий уровень репликативной активности ВГВ и низкая концентрация HBsAg (менее 0,1 нг/мл). Показано, что мутации в «а»-детерминанте поверхностного антигена ВГВ являются причиной лишь небольшой доли случаев «скрытой» ВГВ-инфекции. Таким образом, повышение чувствительности тест-систем для выявления HBsAg и расширение спектра мутаций, выявляемых с их помощью, будет способствовать сокращению числа случаев «скрытой» формы данной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ганина, Анна Александровна, Москва

1. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь — вирусные гепатиты . 2-е издание, переработанное и дополненное. — М.: Амипресс, 1999. - 302с.

2. Бацких С.Н. с соавт. Латентная HBV-инфекция у доноров крови//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопролоктологии. — 2006. Том XVI, №1 - с. 27.

3. Веремейко Т.А. и др. Гуморальный иммунный ответ мышей линии BALB/c, иммунизированных химерными белками HBcAg, несущими эпитопы поверхностного белка вируса гепатита В//Вопросы вирусологии. — 2007. № 1. — с. 40-45.

4. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор, 6 выпуск, СПб, 2006.

5. Всемирная Организация Здравоохранения. Увеличение масштабов вирусной терапии в организациях с ограниченными ресурсами: директивы относительно лечения в общественном здравоохранении. Пересмотренное издание. 2004. http://www.aidsinfor.nih.gov.

6. Гаранжа Т.А. с соавт. Учет герпесвирусных инфекций в дифференциальной диагностике заболеваний печени// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопролоктологии. 2006. - Том XVI, №1 - с. 11.

7. Маевская М.В. Лечение хронических вирусных гепатитов//Лечащий врач. -2005.-№2.-С. 31-37.

8. Пузырев В.Ф. Применение рекомбинантного НВсоге-антигена для создания диагностической системы//Журнал микроб. 2004. - №6. - с. 76-80.

9. Романенко В.В. Эпидемиологические особенности гепатитов В и С и региональная тактика вакцинопрофилактики НВ-вирусной инфекции: Автореф. дис. . канд. мед. наук М., 2000.

10. Семенов С.И. и др. Широта распространении маркеров парентеральныхIвирусных гепатитов среди населения арктической зоны Республики Саха99

11. Якутия)//У1 Всероссийская научно-практическая конференция «Вирусные гепатиты — проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики»: Тезисы докладов. М., 2005. - с.305-306.

12. Сомова А.В. и др. Исследование сывороток крови доноров на вирусные гепатиты В и С с использованием ИФА и ГЩР//Новое в трансфузиологии.-2002.-Вып.30.-с.30-37.

13. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М.:ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. - 384с.

14. Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей. Практич. рук.: Пер. с англ./ Под ред. З.Г. Апросниной, Н.А. Мухина. М.: Гэотар Медицина, 1999.

15. Adachi S. et al. Impact of occult hepatitis В virus infection on development of hepatocellular carcinoma//Hep.Intl. 2007. - №1. - p. 169.

16. Akiba T. et al. Relationship between replication of hepatitis В virus and the localization of virus nucleocapsid antigen (HBcAg) in hepatocytes// J. gen. Virol. -1987. -№68. -p. 871-877.

17. Alhababi F. et al. The significance of "anti-HBc only" in the clinical virology laboratory//J of Clin Virol. 2003. - №27. - p. 162-169.

18. Allain J.P. Occult hepatitis В virus infection: implication in transfusion//Vox Sang. 2004. - Vol.86, №2. - p. 83-91.

19. Allain J.P. et al. Evidence that anti-HBc but not HBV DNA testing may prevent some HBV transmission by transfusion// Br. J. Haematol. 1999. - №.107. - p. 186195.

20. Almeida R.P. et al. Detection of HBV DNA by nested-PCR in a HBsAg and anti-HBc negative blood bank donor//J Clin Virorol. 2006. - Vol.36, №3. - p.231-234.

21. Altindis M. et al. Investigation of hemodialysis patients in terms of the presence of occult hepatitis B//Mikrobiyol Bui. 2007. - Vol.41, №2. - p. 227-233.

22. Araujo N.Metal. Occult Hepatitis В virus infection in HIV-infected patients. Evolution of biochemical, virological and molecular parameters// Hepatol.Res. — 2008. Vol.38, №12. - p. 1194-1203.

23. Basuni A. HBV vaccine-escape mutants. Hepatits В and D protocols / Basuni A. and Carman W. -2004. -p.l 15 124.

24. Behzad-Behbahani A. et al. Anti-HBc and HBV-DNA detection in blood donors hegative for hepatitis В virus surface antigen in reducing risk of transfusion associated HBV infection//Indian J Med Res. 2006. - №123. - p. 37-42.

25. Benerjee A. et al. Genetic variability of surface gene among anti-HBc only individuals in Eastern India//Hep.Intl. 2007. - №1. - p. 108.

26. Berrajah-Fki L. et al. Significance of "anti-HBc alone" serological profile in 284 patients suspicious of being infected with hepatitis В virus//Ann Biol Clin (Paris).2006. -Vol.64, №5. p. 451-455.

27. Besisik F. et al. Occult HBV infection and YMDD variants in hemodialysis patients with chronic HCV infection//J Hepatol. 2003. - Vol.38, №4. - p. 506-510.

28. Bhatti F.A. et al. Anti-hepatits В core antigen testing, viral markers, and occult hepatitis В virus infection in Pakistani blood donors: implications for transfusion practice// Transfusion. 2007. - Vol.47, №1. - p. 74-79.

29. Blum H.E. et al. Variants of hepatitis B,C and D viruses: molecular, biology and clinical significance//Digastion. 1995. - №56. - p. 85-95.

30. Blumberg BS. Australia antigen and the biology of hepatitis B// Science. 1977 -№197.-p. 17-25.

31. Branco F. et al. Occult hepatitis В virus infection in patients with chronic liver disease due to hepatitis С virus and hepatocellular carcinoma in Brazil// Arq. Gastroenterol. 2007. - Vol.44, №1. - p. 58-63.

32. Brechot C. et al. Hepatitis В virus DNA in HBsAg-negative patients. Molecular characterization and clinical implicatios//J of Hepatol. 1991. — Vol.l3(Suppl.4). — p. S49-S55.

33. Bremer C.M. et al. Transient occult hepatitis В virus infection in a blood donor with high viremia// Transfusion. 2009. - Apr.24.

34. Brojer E. et al. Characterization of HBV DNA+/HBsAg- blood donors in Poland identified by triplex NAT//Hepatology. 2006. - Vol.44, №6. - p. 1666-1674.

35. Busch M.P. et al. Should HBV DNA NAT replace HBsAg and/or anti-HBc screening of blood donors?// Transfus. Clin. Biol. 2004. - Vol.11, №1. p. 26-32.

36. Cacciola I. et al. Occult hepatitis В virus infection in patients with chronic hepatitis С liver disease//N. Engl. J. Med. 1999. - №341. - p. 22-26.

37. Candotti D. et al. Characterization of occult hepatitis В virus from blood donors carrying genotype A2 or genotype D strains// J. of Hepatology. 2008. - Vol.49, №4. - p. 537-547.

38. Cappel R. et al. Significance of persisting IgM anti-HBc antibodies in hepatitis В virus infection//J Med Virol. 1981. - Vol.8, №3. - p. 201-205.

39. Carman W.F. et al. Fulminant reactivation of hepatitis В due to envelop protein mutant of HBV that escaped detection by monoclonal HBsAg ELISA// Lancet. -1995. Vol.345. - p.1406-1407.

40. Carman W.F. Hepatitis В envelop variation after transplantation with and without hepatitis immune globulin prophylaxis// Hepatology. 1996. - №24. - p. 489-493.

41. Carman W.F. The cinical significance of surface antigen variants of hepatitis В virus// J Viral Hepat. 1997. - №4(Suppl 1). - p. 11-20.

42. Carman W.F. et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus//Lancet -2000. -№356 (9231). p: 769-770.

43. Chamarro A.J. et al. Reactivator! of hepatitis В in HIV-infected patient with antibodies against hepatitis В core antigen as only serological marker//Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005. - Vol.24, №7. - p. 492-494.

44. Chau C.H. et al. Serodiagnosis of recent hepatitis В infection by IgM class anti-HBc//Hepatology. 1983. - Vol.3, №2. - p. 142-149.

45. Chaudhuri V. et al. Evalution of serologic screening of blood donors in India reveals a lack of correlation between anti-HBc titre and PCR-amplified HBV DNA//Transfusion. 2003. - Vol.43, №10. - p. 1442-1448.

46. Chemin I., Trepo C. Clinical impact of occult HBV infections// J.Clin.Virol. -2005.- Vol.34, №1.-p. 15-21.

47. Chen M.N. et al. High prevalence of occult hepatitis В virus infection in patients with В cell non-Hodgkin's lymphoma// Ann Hematol. 2008. - Vol.87, №6. - p.475-80.

48. Chen W.N. et al. Horizontal Transmission of a Hepatitis В Virus Surface Antigen Mutant// J. Clin. Micr. 2000. - Vol.38, №2. - p. 938-939.

49. Chevrier M.C. et al. Detection and characterization of hepatitis В virus of anti-hepatitis В core antigen-reactive blood donors in Quebec with an in-house nucleic acid testing assay//Transfusion. 2007. - Vol.47, №10. - p. 1794-1802.

50. Colomina-Rodriguez J. et al. Significance of hepatitis В core antibody as the only marker of hepatitis В infection// Enferm Infec Microbiol Clin. 2005. - Vol.23, №2. - p: 80-85.

51. Datta S. et al. Genotype, phylogenetic analysis, and transmission pattern of occult hepatitis В virus (HBV) infection in families of asymptomatic HBsAg carriers//J Med Virol. 2006. - Vol.78, №1.- p. 53-59.

52. Davis G.L. Hepatitis B: diagnosis and treatment//South Med J. 1997. - №90. -p.866-870.

53. De Feo T.M. et al. Risk of transmission of hepatitis В virus from anti-HBc positive cadaveric organ donors: a collaborative study//Transplant Proc. 2005. -Vol.37, №2.-p. 1238-1239.

54. Dhedin N. et al. Reverse seroconversion of hepatitis В after allogenic bone marrow transplantation: a retrospective study of 37 patients with pretransplantant anti-HBs and anti-HBc// Transplantation. 1998. - №66. - p. 616-619.

55. Dikson R.C. et al. Transmission of hepatitis В by transplantation of livers from donors positive for antibody to hepatitis В core antigen// Gastroenterology. 1997. -№113.-p. 1668-1674.

56. E1-Zaatari M. et al. Hepatitis В virus DNA in serum of'anti-HBc only'-positive healthy Lebanese blood donors: significance and possible implications// J. Hosp. Infect. 2007. - Vol.66, №3. p. 278-282.

57. Farmaki K. et al. Evalution of the introduction of other markers of hepatitis В in routine testing// Vox Sang. 2006. - 91(Suppl.3). - p. 037.

58. Fabris P. et al. Occult hepatitis В vims infection does not affect liver histology or response to therapy with interferon alpha and ribavirin in intravenous drug users with chronic hepatitis С // J. Clin. Virol- 2004. Vol.29, №3. - p. 160-166.

59. Ferreira RC et al. Prevalence of hepatitis В virus and risk factors in Brazilian non-injection drug users// J. Med. Virol. 2009. - Vol.81, №4. - p. 602-609.

60. Faug Y. et al. Prevalence of occult hepatitis В virus infection among hepatopathy patients and healthy people in China// J. Infect. 2009. - Vol.58, №5. - p. 383-388.

61. Fietelson M.A. Biology of disease. Biology of hepatitis В virus variants//Lab Invest. 1994. - Vol.71, -p.324-349.

62. Freeman R., Hambling M.H. Routine use of counter-immunoelectrophoresis test for detecting antibody to hepatitis В virus core antigen//J of Clin Path. 1978. - №31. -p. 832-836.

63. French A.L. et al. Isolated hepatitis В core antibody is associated with HIV and ongoing but not resolved hepatitis С virus infection in a cohort of US women//J Infect Dis. 2007. - Vol.195, №10. - p. 1437-1442.

64. Fujii H. et al. Gly 145 to Arg substitution in HBs antigen of immune mutant of hepatitis В virus//Biochem Biophys Res Common. 1992. - Vol.184, p. 1152-1157.

65. Ganen D. et al. Hepatitis В virus infection natural history and clinical consequences// N. Engl. J. Med. - 2004. - №350. - p. 1118-1129.

66. Gandhi R.T. et al. Isolated antibody to hepatitis В core antigen in human immunodeficiency virus type-1-infected individuals// Clin Infect Dis. — 2003. — Vol.36, №12.-p. 1602-1605.

67. Garcia-Montalvo B.M. et al. Hepatitis В virus DNA in blood donors with anti-HBc as a possible indicator of active hepatitis В virus infection in Yucatan, Mexico//Transfus Med. 2005. - Vol.15, №5. - p. 371-378.

68. Gaspari G. et al. Unsatisfactory specificities and sensitivities of six enzyme immunoassays for antibodies to hepatitis В core antigen//J of Clin Micr. — 1989. -Vol.27, №9. p. 2067-2072.

69. Gerety R. Hepatitis В Core Antigen and Antibody, 1985/

70. Gerlich W.H. et al. Cut off levels of immunoglobulin M antibody against viral core antigen for differentiation of acute, chronic and past hepatitis В virus infection//J Clin Microbiol. 1986. - №24. - p. 288-293.

71. Ghiazza G.P. et al. HBV-DNA and HBcAb IgG in blood donors population//Vox Sang. 2006. - 91 (Suppl.3). - p. 041.

72. Gibney KB. Isolated core antibody hepatitis В in sub-Saharan African immigrants//J.Med.Virol. 2008. - Vol.80, №9. - p. 1565-1569.

73. Gonzales F.LJr. et al. Hepatitis В Virus DNA in Sera of Blood Donors and of Patients Infected with Hepatitis С Virus and Human Immunodeficiency Virus// Clin Diagn Lab Immunol. 2003. - Vol.10, №4. - p. 718-720.

74. Goral V. et al. Prevalence of occult HBV infection in haemodialysis patients with chronic HCV//World J Gastroenterol. 2006. - Vol.12, №21. - p. 3420-3424.

75. Greub G., Frei P.C. Presence of low levels of anti-FtBs antibody in so-called 'anti-HBc alone* subjects//Liver.-2001. Vol.21, №6. -p: 380-383.

76. Grob P. et al. Serological pattern "anti-HBc alone": report on a workshop//.! Med Virol. 2000. - Vol.62, №4. - p. 450-455.

77. Gutierrez C.et al. Molecular and serological evaluation of surface antigen negative hepatitis В virus infection in blood donors from Venezuela// J Med Virol. 2004. -Vol.73, №2.-p. 200-207.

78. Helmy A., AL-Sebayel M.I. Isolated antibody to hepatitis В core antigen in patients with chronic hepatitis С virus infection//World J Gastroenterol. 2006. — Vol. 12, №27. - p. 4406-4410.

79. Henning H. et al. Frequency and load of hepatitis В virus DNA in first-time blood donors with antibodies to hepatitis В core antigen//Blood. — 2002. №100. — p. 26372641.

80. Hess G., Arnold W. The clinical relevance of the antibody to hepatitis В core antigen (anti-HBc): a review//J Virol Methods. 1980. - Vol.2, №1-2. - p. 107-117.

81. Hofer M. et al. Frequent chronic hepatitis В virus infection in HIV infected patients positive for antibody to hepatitis В core antigen only. Swiss HIV Cohort Study//Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1998. - №17. - p. 6-13.

82. Honarkar Z. et al. Occult hepatitis В among chronic liver disease patients// Saudi Med J. 2005. - Vol.26, №4. - p. 601-606.

83. Hou J. et al. Epidemiology and Prevention of Hepatitis В Virus Infection// Int J Med Sci. 2005 - Vol.2, №1. - p. 50-57.

84. Hsu H.Y. et al. Surface gene mutants of hepatitis В virus in infants who develop acute or chronic infection despite immunoprofilaxis//Hepatology. — 1997. №26. - p. 786-791.

85. Hu Ke-Qin. Occult hepatitis В virus infection and its clinical implications//.! Viral. Hepatitis 2002. - №9. - p. 243-257.

86. Hui C.K. et al. Fibrosis progression in chronic hepatitis С patients with occult hepatitis В co-infection//J Clin Virol. 2006. - Vol.35, №2. - p. 185-192.

87. Hussain M. et al. Presence of intrahepatic (total and ccc) HBV DNA is not predictive of HBV recurrence after liver transplantation//Liver Transpl. 2007. -Vol.13, №8.-p. 1137-1344.

88. Ikeda K. et al. Antibody to hepatitis В core antigen and risk for hepatitis C-related hepatocellular carcinoma: a prospective study//Ann Intern Med. 2007. — Vol.146, №9.-p. 649-656.

89. Iannitto E. et al. Hepatitis В virus reactivation and ale-mtuzumab therapy// Eur. J. Haematol. 2005. - №74. p. 254-258.

90. Jilg W. et al. Individuals with antibodies against hepatitis В core antigen as only serological marker for hepatitis В infection: high percentage of carriers of hepatitis В and С virus//J Hepatol. 1995. - Vol.23. - p. 14-20.

91. Joller-Jemelka H.I. et al. Detection of HbsAg in "anti-HBc alone" positive sera//J. Hepatol. 1994. - Vol.29. - p. 269-272.

92. Jurinke C. et al. Application of nested PCR and mass spectrometry for DNA-based virus detection: HBV-DNA detected in the majority of isolated anti-HBc positive sera//Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 1998. - Vol.14. - p. 96102.

93. Kaminski G. et al. Evidence of occult hepatitis В virus infection among Omani blood donors: a preliminary study// Med Princ Pract. 2006. - Vol.15, №5. - p. 368372.

94. Kannangai R. et al. Liver enzyme flares and occult hepatitis В in persons with chronic hepatitis С infection// J Clin Virol. 2007. - Vol.39, №2. - p.101-105.

95. Kao J.H. et al. Occult hepatitis В virus infection and clinical outcomes of patients with chronic hepatitis C//J Clin Microbiol. 2002. - Vol.40, №11.- p. 40684071.

96. Kaviani M.J. et al. Occult hepatitis В virus infection and cryptogenic chronic hepatitis in an area with intermediate prevalence of HBV infection//World J Gastrenterol. 2006. - Vol.12, №31.- p. 5048-5050.

97. Kawatani T. et al. Incidence of hepatitis virus infection and severe liver dysfunction in patients chemotherapy for hematologic malignancies// Eur. J. Haematol. 2001. - №67. - p. 45-50.

98. Kazemi-Shirazi L. Hepatitis В virus DNA in sera and Liver tissue of HBsAg negative patients with chronic hepatitis C//J of Hepatology. 2000. - Vol.33. -p.785-790.

99. Kenbay M. et al. Is hepatitis С virus positivity a contributing factor to occult hepatitis В virus infection in hemodialysis patients//Dig Dis Sci. 2006. - Vol.51, №11.-p. 1962-1966.

100. Kidd-Ljunggren К, Miyakawa Y, Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis В viruses// J. Gen.Virol. 2002. - №83. - p. 1267-1280.

101. Kim M.J. et al. The significance of anti-HBc and occult hepatitis В vims infection in the occurrence of hepatocellular carcinoma in patients with HBsAg and anti-HCV negative alcoholic cirrhosis// Korean J. Hepatol. 2008. — Vol.14, №1. -p. 67-76.

102. Kim S.M. et al. Prevalence of occult HBV infection among subjects with normal serum ALT levels in Korea// J Infect. 2007. - Vol.54, №2. - p. 185-191.

103. Kim Y.S. Detection of Intrahepatic HBV DNA in HBsAg-negative liver diseases// Korean J Hepatol. 2006. - Vol.12, №2. - p. 201-208.

104. Kleinman S.H. et al. Frequency of HBV DNA detection in US blood donors testing positive for the presence of anti-HBc: implications for transfusion transmission and donor screening//Transfusion. 2003. - № 43. — p. 696-704.

105. Kleinman S.H. et al. Hepatitis В virus (HBV) DNA screening of blood donations in minipools with COB AS ampliscreen HBV test// Transfusion. 2005. -№45.-p. 1247-1257

106. Knoll A. Solid organ transplantation in HBsAg-negative patients with antibodies to HBV core antigen: low risk of HBV reaction// Transplantation. 2005. -Vol.79, №11.-p. 1631-1633.

107. Kobak A.C. et al. Living donor liver transplantation from hepatitis В core antibody positive donors// Transplant Proc. 2007. - Vol.39, №5. - p. 1488-1490.

108. Kuhns M.C. et al. New strategies for blood donor screening for hepatitis В virus: nucleic acid testing versus immunoassay methods// Mol Diagn Ther. 2006. -Vol.10, №2.-p. 77-91.

109. Kupski C. et al. Serologic and molecular profile of anti-HBc-positive blood bank donors in an area of low endemicity for HBV// Dig Dis Sci. 2008. Vol.53, №5.-p. 1370-1374.

110. Kusakabe A. et al. A weak association between occult HBV infection and Non-B, Non-C hepatocellular carcinoma in Japan// Hep.Intl. 2007. - №1. - p. 167.

111. Kwon C.H. et al. Change of hepatitis В virus DNA status in anti-HBc positive liver graft// Korean J Hepatol. 2006. - Vol. 12, №2. - p. 191-200.

112. Laguno M. et al. Prevalence and Clinical Relevance of Occult Hepatitis В in the Fibrosis Progression and Antiviral Response to INF Therapy in HIV-HCV Coinfected Patients// AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2008. - Vol.24, №4. - p. 547553.

113. Lavanchy D. et al. Hepatitis В virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control measures// J. Viral. Hepat. 2004 -№11.-p. 97-107.

114. Levicnik-Stezinar S. Hepatitis В surface antigen escape mutant in a first blood donor potentially missed by a routine screening assay// Clin Lab. 2004. - Vol.50, №1-2.-p. 49-51.

115. Levicnik-Stezinar S et al. Anti-HBs positive occult hepatitis В virus carrier blood infectious in two transfusion recipients// J Hepatol. 2008 - Vol.48, №6. - p. 1022-1025.

116. Lin C.L. et al. High prevalence of occult hepatitis В virus infection in Taiwanese intravenous drug users//J Med Virol. 2007. - Vol.79, №11. - p. 16741678.

117. Liu C.J. et al. Transmission of occult hepatitis В vims by transfusion to adult and pediatric recipients in Taiwan//J Hepatol. 2006. - Vol.44, №1. - p. 39-46.

118. Ly et al. Sensitivities of Four New Commercial Hepatitis В Virus Surface Antigen (HBsAg) Assays in Detection of HBsAg Mutant Forms//J Clin. Microb. -2006. Vol.44, №7. - p. 2321-2326.

119. Manzarbeitia C. et al. Safe use of livers donors with positive hepatitis В core antibody/ZLiver tranpl. 2002. - Vol.8, №6. - p. 556-561.

120. Manzini P. et al. Italian blood donors with anti-HBc and occult hepatitis В virus infection// Haematologica. 2007 - Vol.92, №12. - p. 1664-1670.

121. Mariscal L.F. et al. Hepatitis В infection of the liver in chronic hepatitis С without detectable hepatitis В virus DNA in serum//J Med Virol. 2004. - Vol.73. -p. 177-186.

122. Marusawa H. et al. Latent hepatitis В virus infection in healthy individuals with antibodies to hepatitis В core antigen//Hepatology. 2000. - №31. - p. 488-495.

123. Marusawa H. et al. Reactivation of latently infected hepatitis В virus in a leukemia patient with antibodies to hepatitis В core antigen// J. Gastroenterol. 2001. -№36.-p. 633-636.

124. Meng Q. et al. Automated multiplex assay system for simultaneous detection of hepatitis В virus DNA, hepatitis С virus RNA, and human immunodeficiency virus type 1 RNA// J. Clin. Microbiol. 2001. - №39. - p. 29372945.

125. Michalak T.I. et al. Occult lifelong persistence of infectious hepadnavirus and residual liver inflammation in woodchucks convalescence from acute viral hepatitis// Hepatology. 1999. - №29. p. 928-938.

126. Michalak T.I. et al. Low doses of hepadnavirus induce infection of the lymphatic system that does not engage the liver// J. Virol. 2004. №78. - p. 17301738.

127. Mine H.K. et al. Low rate of occult hepatitis В virus infection among anti-HBc positive blood donors in young volunteer donors in Korea//Vox Sang. — 2006. — 91(Suppl.3). p. 062.

128. Minuk G.Y. et al. Occult hepatitis В virus infection in a North American adult hemodialysis patient population//Hepatology. 2004. - Vol.40, №5. - p. 1072-1077.

129. Morapdpour D. et al. Chasing the escape mutant/ZHepatology. 1993. - №18. -p. 1011-1014.

130. Mrani S. et al. Occult HBV infection may represent a major risk factor of non-response to antiviral therapy of chronic hepatitis C//J Med Virol. 2007. — Vol.79, №8.-p. 1075-1081.

131. Mulrooney-Cousins P.M. et al. Persistent occult hepatitis В virus infection: Experimental findings and clinical implications// World J. Gastroenterol. 2007. — Vol.13, №43. - p. 5682-5686.

132. Murokawa H. et al. Epidemiology of blood donors in Japan, positive for hepatitis В virus and hepatitis С virus by nucleic acid amplification testing// Vox Sang. 2005. - №88. - p. 10-16.

133. Neau D.et al. Isolated antibodies against the core antigen hepatitis В virus in HIV-infected patient// HIV Medicine. 2004. - №5 - p. 171-173.

134. Nebbia G. et al. Predictors and kinetics of occult hepatitis В virus infection in HIV-infected persons//J Med Virol. 2007. - Vol.79, №10. - p. 1464-1471.

135. Niederhauser C. et al. Blood donor screening: how to decrease the risk of transfusion-transmitted hepatitis В virus?// SWiSS MeD Wkly. 2008. - Vol. 138, №9-10.-p. 134-141.

136. Nowak M.A. et al. Viral dynamics in hepatitis В virus infection//Proc Natl Acad Sci USA. 1996. - №93. - p. 4398-4402.

137. Offergeld R. et al. Human immunodeficiency virus, hepatitis С and hepatitis В infections among blood donors in Germany 2000-2002: risk of virus transmission and the impact of nucleic acid amplification testing/ EuroSurveill. 2005. - №10.

138. Ogata N. et al. Infectivity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis В virus that emerged in a vaccinated infant//J Infect Dis. 1997. -№175.-p. 511-523.

139. Ohtomo N. et al. Chemotherapy-induced HBV reactivation in an HBV carrier showing negative for HBsAg and HBsAb//Hep.Intl. 2007. - №1. - p. 119.

140. Oon C.J. et al. Molecular epidemiology of hepatitis В virus vaccine variants in Singapore//Vaccine. 1995. - Vol.13, - p. 699-702.

141. Owusu-Ofori S. et al. Pre-donation screening of blood donors with rapid tests: implementation and efficacy of a novel approach to blood safety in resource-poor settings// Transfusion. 2005. - №45. - p. 133-140.

142. Panhorta B.R. Epidemiology of antibody to hepatitis В core antigen screeninig among blood donors in Eastern Saudi Arabia. Need to replace the test by HBV DNA testing//Saudi Med J. 2005. - Vol.26, №2. - p. 270-273.

143. Palmenteiri B. et al. The clinical significance of occult HBV infection in acute Delta virus hepatitis in a case of immunosuppressive therapy for non-Hodgin's lymphoma// Exp.Onc. 2003. - Vol.25, №3. - p. 236-238.

144. Peres A.A. et al. Occult hepatitis В in renal transplant patients//Transpl Infect Dis. 2005. - Vol.7, №2. - p. 51 -56.

145. Perez-Rodriguez M.T. et. al. Clinical significance of «anti-НВс alone» in human immunodeficiency virus positive patients//World J. Gastroenterol. 2009. -Vol.15, №10.-p. 1237-1241.

146. Piroth L. et al. The evolution of hepatitis В virus serological patterns and the clinical relevance of isolated antibodies to hepatitis В core antigen in HIV infected patients//J Hepatol. 2002. - Vol.36, №5. - p. 681-686.

147. Pogany K. et al. Occult hepatitis В virus infection before and 1 year after start of HAART in HIV type 1-positive patients//AIDS Res Hum Retroviruses. 2005. -Vol.21, №11.-p. 922-926.

148. Pollicino T. et al. Molecular and functional analysis of occult hepatitis В virus isolates from patients with hepatocellular carcinoma//Hepatology. 2007. - Vol.45, №2.-p. 277-285.

149. Quarleri J. et al. Hepatitis В virus genotype distribution and its lamivudine-resistant mutants in HIV-coinfected patients with chronic and occult hepatitis B//AIDS Res Hum Retroviruses. 2007. - Vol.23, №4. - p. 525-531.

150. Rai R.R. et al. Prevalence of occult hepatitis В & С in ED1V patients infected through sexual transmission// Trop. Gastroenterol. 2007. - Vol.28, №1. - p. 19-23.

151. Raimondo G. et al. Occult hepatitis В virus infection// J.Hepatol. 2007. -Vol.46, №1.-p. 160-170.

152. Raimondo G. et al. Occult hepatitis В virus in liver tissue of individuals without hepatic disease// J. Hepatol. 2008. - Vol.48, №5. - p.743-746.

153. Ramezani A. et al Frequency of isolated hepatitis В core antibody in HTV-hepatitis С virus co-infected individuals// Int. J. STD AIDS. 2009. - Vol.20, №5. -p. 336-338.

154. Ramia S. Frequency and significance of antibodies against hepatitis В core (anti-HBc)//Epidemiol Infect. 2005. - Vol.133, №4. - p. 695-699.

155. Ramia S. et al. Occult hepatitis В virus infection in HIV-infected Lebanese patients with isolated antibodies to hepatitis В core antigen// Int J STD AIDS. 2008. -Vol.19, №3.-p. 197-199.

156. Rehermann B. et al. The hepatitis В virus persists for decades after patients' recovery from acute viral hepatitis despite active maintenance of a cytotoxic T-lymphocyte response//Nat Med. 1996 - Vol.2, №10. - p. 1104-1108.

157. Rodriguez-Friaz F. et al. Genetic alterations in the S gene of hepatitis В virus in patients with acute hepatitis B, chronic hepatitis В and hepatitis В liver cirrhosis before and after liver transplantation//Liver. 1999. - Vol.l9,№3. — p. 177-182.

158. Rodriguez-Inigo E. Hepatitis С Virus (HCV) and Hepatitis В Virus (HBV) can coinfect the same hepatocyte in the liver of patients with chronic HCV and occult HBV infection// J. of Virology. 2005.-Vol.79, №24. - p.15578-15581.

159. Rodrigues-Torres M. et al. Occult hepatitis В virus infection in the setting of hepatitis С virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) co-infection: clinically relevant or a diagnostic problem?//J Med Virol. 2007. - Vol.79, №6. - p. 694-700.

160. Roque-Afonso A.M. et al. Antibodies to hepatitis surface antigen prevent viral reactivation in recipient of liver grafts from anti-HBc positive donors//Gut. 2001. -Vol.40.-p. 95-99.

161. Roque-Afonso A.M. et al. HBs antigen mutants: prevalence, clinical and diagnostic implications//Pathol Biol. 2005. - Vol.53, №8-9. - p. 563-568.

162. Rossi D. et al. Occult hepatitis В virus infection of peripheral blood mononuclear cells among treatment-naive patients with chronic lymphocytic leukemia// Leuk. Lymphoma. 2009. - Vol.50, №4. - p. 604-611.

163. Roth W.K. et al. Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations for hepatitis С virus, hepatitis В virus, and HTV-1 in a blood-bank setting// Lancet. 1999. - №353. - p. 359-363.

164. Roth W.K. et al. NAT for HBV and anti-HBc testing increase blood safety// Transfusion. 2002. - №42. - p. 869-875.

165. Sauleda S. Serological and molecular markers hepatitis В virus in Spanish blood donors: evidence of occult hepatitis B//Vox Sang. 2006. - 91(Suppl.3). - p. 075.

166. Sagnelli E. et al. Diagnosis and clinical impact of occult hepatitis В infection in patients with biopsy proven chronic hepatitis C: a multicenter study// J. Med. Virol. 2008. - Vol.80, №9. - p. 1547-1553.

167. Schaefer S. Hepatitis В virus: significance of genotypes// J.Viral.Hepatitis. — 2005.-№12.-p. 11-124.

168. Schmidt M. et al. Anti-HBc screening of blood donors: a comparison of nine anti-HBc tests//Vox Sang. 2006. - Vol.91, №3. - p. 237-243.

169. Sengupta S. et al. Role of surface promoter mutations in hepatitis В surface antigen production and secretion in occult hepatitis В virus infection//J Med Virol. -2007. Vol.79, №3. - p. 220-228.

170. Shire N et al. Occult hepatitis В virus in an HIV-infected cohort. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 5-8 February 2006, Denver, CO Abstract 835.

171. Siagris D. et al. Occult hepatitis В virus infection in hemodialysis patients with chronic HCV infection//.! Nephrol. 2006. - Vol.19, №3. - p. 327-333.

172. Silva C.M. et al. Low rate of occult hepatitis В virus infection among anti-HBc positive blood donors living in a low prevalence region in Brazil//J Infect.2005. Vol.51, № 1. - p. 24-29.

173. Squadrito G. et al. Occult hepatitis В virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis С patients// Cancer.2006.-Vol.106, №6.-p. 1326-1330.

174. Stancoven К. et al. Significance of anti-HBc in the absence of other hepatitis В markers in a college-aged population// Intervirology. — 2005. — Vol.48, №5. p. 273-278.

175. Stebler C. et al. Prevalence of anti-HBc in swiss blood donors, a 4 months survey at the blood transfusion center Basel// Vox Sang. 2006. - 91(Suppl.3). — p. 079.

176. Tabor E. Infections by hepatitis В surface antigen gene mutants in Europe and North America// J Med Virol. 2006. - Vol.78, №1. - p. 43-47.

177. Tai P.C. e al. Novel and frequent mutations of hepatitis В virus coincide with a major histocompatibility complex class I-restricted T-cell epitope of the surface antigen// J. Virol. 1990. - №71. - p. 4852-4856.

178. Togashi H. et al. What can be revealed by extending the sensitivity of HBsAg detection to below the present limit?// J Hepatol. 2008. - Vol. 49, №1. - p. 17-24.

179. Torbenson M. et al. Occult hepatitis B// Lancet Infect. Dis. 2002. - №.2. -p. 479-86.

180. Torbenson M. et al. High prevalence of occult hepatitis В in Baltimore injection drug users// Hepatology. 2004. - Vol.39, №1. - p. 51-57.

181. Torres-Baranda R. et al. Occult hepatitis В in mexican patients with HIV, an analysis using nested polymerase chain reaction//Annals of Hepatology 2006; 5(1): January-March: 34-40.

182. Tsai S. et al. Cellular immune responses in patients with dual infection of hepatitis В and С virusese: dominant role of hepatitis С virus//Hepatology. — 1995. -№21.-p. 908-912.

183. Tsui J.I. et al. Prevalence and long-term effects of occult hepatitis В virus infection in HIV-infected women//Clin Infect Dis. 2007 - Vol.45, №6. - p. 736740.

184. Ueno Y. et al. Production of Monoclonal Antibodies against Recombinant HBeAg// Tohoku J. Exp. Med., 1990. - №161. - p. 253-255.

185. Vitale F. et al. Can the serological status of anti-HBc alone be considered sentinel marker for detection of occult HBV infection?// J Med Virol.-2008.-80(4):577-582.

186. Velati C. et al. HBV DNA detection in HBsAg negative/anti-Hbc positive Italian first time blood donors//Vox Sang. 2006. - 91(Suppl.3). - p. 082.

187. Weber B. et al. Hepatitis В virus markers in anti-HBc only positive individuals// J Med Virol. 2001. - Vol.64, №3. - p: 312-319.

188. Weber В., Muhlbacher A., Melchior W. Detection of an acute asymptomatic HBsAg negative hepatitis В virus infection in a blood donor by HBV DNA testing// J Clin Virol. 2005 - Vol.32, № 1. - p. 67-70.

189. White R, Perry RK, Parry VJ. Monolisa anti-HBc//Evalution report №03137. -2003.

190. Wursthorn K. et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B// Hepatology. 2006. - №44. p. 675-684.

191. Yakaryilmaz F. et al. Prevalence of occult hepatitis В and hepatitis С virus infections in Turkish hemodialysis patients//Ren Fail. 2006. - Vol.28, №8. - p. 729-735.

192. Yamamoto K. et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis В virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis В surface antigen//J Virol. 1994. - Vol.68. - p. 2671-2676.

193. Yamasaki K. et al. Is occult HBV a main risk factor in Non-B, Non-C hepatocellular carcinoma development//Hep.Intl. 2007. - №1. - p. 166.

194. Yoshikawa A. et al. Lengths of hepatitis В viremia and antigenemia in blood donors: preliminary evidence of occult (hepatitis В surface antigen-negative) infection in the acute stage//Transfusion. 2007. - Vol.47, №7. - p. 1162-1171.

195. Yotsuyanagi H. et al. Role of hepatitis В virus in hepatocarcinogenesis in alcoholics//Alcohol Clin Exp Res. 2004. - Vol.28, №8. - p. 181S-185S.

196. Yun S. Kim et al. The significance of anti-HBc and occult hepatitis В virus infection in alcoholic cirrhosis//Hep.Intl. 2007. - №1. - p. 167.

197. Zervou E.K. et al. Value of anti-HBc screening of blood donors for prevention of HBV infection: results of a 3-year prospective study in Northwestern Greece//Transfiision. 2001. - №4. - p. 652-658.

198. Zoulim F. New insight on hepatitis В virus persistence from the study of intrahepatic viral cccDNA// J. Hepatol. 2005. - №42. p. 302-308.

199. Zuckerman A.J. et al. Mutation in S region of hepatitis virus// Lancet. 1994. -Vol.343.-p. 737-738.

200. Zuckerman A.J. et al. Effect of hepatitis В virus mutants of efficacy of vaccination//Lancet. 2000. - Vol.355, - p. 1382-1384.

Информация о работе

Ганина, Анна Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

"Скрытая" ВГВ-инфекция среди доноров крови и лиц, относящихся к группам риска инфицирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы