Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте

Хохлов, Александр Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте"

Ю31Т22Э4

На правах рукописи

Хохлов Александр Анатольевич

СИСТЕМЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХЕМОСЕНСОРНЫХ КЛЕТОК. РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ.

Специ&чыюсть «Биофизика» 03 00 02

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 6 мЮч 2СС

Пущино 2008

003172294

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущая организация.

доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич доктор биологических наук, профессор Чемерис Николай Константинович кандидат физико-математических наук Кокоз Юрий Моисеевич

Институт биологического приборостроения РАН

Защита состоится « 03 » июля 2008 г в 15 30 часов на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, по адресу 142290, Московская обл , г Пущино, ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г Пущино

Автореферат разослан « 30 » мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физ-мат наук

НФ Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Традиционно считалось, что у позвоночных главный обонятельный эпителий (МОЕ) специализируется на восприятии обычных запахов, а вомероназальный орган ответственен за распознавание относительно узкого класса пахучих веществ (феромонов), детерминирующих социальное и половое поведение животных Между тем, исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о том, что восприятие животными ряда феромонов происходит при участии МОЕ Процесс восприятия простых пахучих стимулов, не участвующих в химических коммуникациях животных, основательно изучен и прослежен от связывания молекул запаха с рецептирующей поверхностью обонятельных нейронов МОЕ до возбуждения нейронных сетей обонятельной луковицы В частности, установлено, что запахи распознаются специализированными рецепторами, относящимися к суперсемейству гептаспиральных рецепторов, сопряженных с сигнальными каскадами с помощью G-белков Связывание молекулы запаха с рецептором приводит к активации аденилатциклазы, быстрому повышению уровня циклического аденозинмонофосфата (сАМР) в обонятельной цилии, активации сАМР-зависимых катионных каналов и генерации рецепторного потенциала Вопрос о том, какие клетки МОЕ и при участии каких рецепторных и сигнальных механизмов детектируют феромоны, остается открытым

Методами иммуногистохимии недавно показано, что 1) в МОЕ функционирует субпопуляция клеток, которые экспрессируют не гептаспиральные рецепторы запахов, а рецептор-гуанилатциклазу (RGC), 2) определенная популяция клеток МОЕ экспрессирует G-белок гастдуцин и ионный канал TRPM5 — ключевые элементы каскада вкусовой трансдукции Вполне вероятно, что клетки данных популяций являются феромон-чувствительными, хотя прямые доказательства этого на данный момент отсутствуют В силу сказанного, одним из направлений исследований нашей лаборатории является попытка выяснить физиологическую роль RGC- и гастдуцин/П1РМ5-положительных клеток МОЕ, которые по косвенным признакам, скорее всего, выполняют хемосенсорную функцию В частности, предполагается установить природу химических стимулов, на которые способны отвечать эти неканонические хемосенсорные клетки, и исследовать сигнальные процессы, запускаемые в этих клетках химическими стимулами

Существует несколько специфических проблем, препятствующих эффективному анализу популяции неканонических хемосенсорных клеток МОЕ Во-первых, химические вещества, специфически стимулирующие неканонические хемосенсорные клетки, в целом, не идентифицированы Во-вторых, данная субпопуляция слишком мала (~1%), что ставит прежде всего чисто количественную проблему при их идентификации среди клеток диссоциированного обонятельного эпителия и делает проблематичным эффективное использование таких методов клеточной физиологии, как patch clamp и Са2+ imaging Помимо этого, морфологические критерии практически неприменимы для идентификации одиночных клеток МОЕ В частности, в процессе выделения большинство обонятельных нейронов теряют обонятельные

цилии, наличие которых является характерным морфологическим признаком этих клеток Задача идентификации неканонических хемосенсорных клеток могла бы быть решена с помощью трансгенных животных, у которых различные хемосенсорные клетки МОЕ экспрессируют различные флуоресцентные маркерные белки Учитывая все эти обстоятельства, а также то, что в нашей лаборатории предполагалось использование трансгенных и нокаутных животных, необходимо было создать новую методическую и приборную базу для исследования сенсорных клеток МОЕ

Цель исследования

Создание новой методической и приборной базы для анализа физиологической активности неканонических хемосенсорных клеток, функционирующих в обонятельном эпителии

Основные задачи исследования

1 Разработать мультиволновой осветитель на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах для идентификации и исследования одиночных хемосенсорных клеток методом флуоресцентной микроскопии

2 Разработать двухканальный олфактометр для поддержания и регистрации электрической активности изолированного обонятельного эпителия и стимуляции его газовыми пахучими стимулами заданной концентрации

3 Исследовать роль субпопуляции, гастдуцин-положительных рассеянных хемосенсорных клеток в генерации ответов на 2-гептанон - синтетический феромон мышей

4 Для интерпретации полученных данных разработать математическую модель суммарного электрического ответа обонятельного эпителия, генерируемого при участии нескольких популяций хемосенсорных клеток

Научная новизна работы

Создана методика и автоматизированный комплекс устройств для стимуляции и регистрации электрофизиологичеких ответов обонятельных эпителиев Параметры получаемых стимулов оценены с применением сочетания аналитических методов и экспериментальных подходов С помощью созданной методики и устройств исследованы электрические ответы обонятельных эпителиев мыши на ряд синтетических веществ и синтетический феромон мышей 2-гептанон Используя сравнительный анализ животных дикого типа и животных с нокаутированным геном гастдуцина, показано, что субпопуляция гастдуцин-положительных хемосенсорных клеток обонятельного эпителия мыши вносит значительный вклад в генерацию ответа на 2-гептанон Создан осветитель с уникальными характеристиками для микрофотометрических исследований одиночных клеток. С помощью данного осветителя впервые продемонстрирована секреция АТР вкусовыми рецепторными клетками

Научно-практическая ценность.

Созданный комплекс аппаратуры и разработанные подходы значительно расширили методические возможности для исследования обонятельной и вкусовой систем млекопитающих Проведенные с использованием разработанной аппаратуры эксперименты позволили получить данные, которые вносят существенный вклад в понимание физиологической роли рассеянных хемосенсорных в восприятии

социально-значимых химических стимулов Разработанный на основе сверхярких светоизучающих диодов осветитель обеспечивает более гибкое управление возбуждающим сетом, лучшую чувствительность и соотношение сигнал/шум по сравнению с промышленным аналогом на сканирующем монохроматоре Благодаря этому обстоятельству, осветитель может существенно повысить эффективность исследований клеточных систем, прежде всего одиночных клеток, при использовании методов флуоресцентной микроскопии и фотометрии Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены на научных конференциях ИБК РАН в 1999-2000 гг, на Международной конференции «Внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003 г), на 4 съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 12 -15 мая 2008 г) Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в _7_ печатных работах, в том числе, _4_ статьях в реферируемых журналах Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на +Ó страницах с использованием 2/ рисунков и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы Список литературы содержит 2(х> ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались самцы мышей линии С57В1 в возрасте 10-12 недель Генетически модифицированные мыши С57В1 с нокаутированным геном G-белка гастдуцина были любезно предоставлены проф Маргольским РФ (Margolskee RF, Mount Smai School of Medicine, New York, USA) и поддерживались в ИБК РАН Мыши усыплялись в атмосфере углекислого газа, декапитировались, после дисекции черепа удалялись носовая перегородка и обонятельная выстилка Половинки черепа инкубировались в растворе Игла (NaCl-145mM, KCl-5,0mM, СаС12-1,0шМ, MgS04-l,0mM, Hepes-10,0mM, Glucose-10,ОтМ, рН7,3) при температуре 22-24°С

Электроолфактограмма (EOG) - трансэшггелиальный потенциал, отражающий суммарную электрическую активность клеток обонятельного эпителия -регистрировалась в середине эндотурбинаты III при помощи стеклянного микроэлектрода (диаметр кончика 25-35 мкм), заполненного агаром (1%), сопротивлением 0,1 Мом Референтным электродом служил металлический Ag-AgCl электрод, который помещался в небе животного Сигнал усиливался разработанным (Хохлов, Колесников, 2000) усилителем (Ку =10-10000), фильтровался ФНЧ (Бесселя 6-го порядка, 20Гц) и оцифровывался (500 Гц) с помощью АЦП DigiData 1200 (Axon Instruments Inc, США) Запись сигнала на диск персонального компьютера и управление стимуляцией производились программой Clampex 8 0 (Axon Instruments Inc, США) Для анализа ответов на данное вещество EOG регистрировалась не менее 3-х раз и затем усреднялась Анализ данных проводили при помощи программы Clarapfit 8 0 (Axon Instruments Inc, США) Газообразные стимулы подавались в электрофизиологическую камеру олфактометром (Хохлов, Колесников, 2002), обеспечивающим изменение концентраций пахучих веществ в диапазоне 10"4 - 0,56

от концентрации насыщенного пара В качестве стимулов использовались синтетические вещества изоамилацетат, изомасляная кислота, изовалериановая кислота, анизол, цинеол, а-пинин, 2-гептанон (AIdnch) Для выяснения вклада различных сигнальных каскадов использовались ингибиторы аденилатциклазы (АС) -MDL12330A и SQ22536, фосфолипазы С (PLC) - U73122 и фосфодиэстеразы (PDE)-IBMX (все Sigma-RBI, США)

Изменение концентрации цитозольного кальция в клетках COS-1 и вкусовых клетках производилось при помощи ICCD-камеры IC-200 (Photon Technology International, США), микроскопа Axioscope-2 (Рис 1) и водно-иммерсионный объектива Achroplan-40, NA=0 8 (Zeiss, Германия) Клетки загружали 2-4 мкМ Fluo-4АМ (Molecular Probes) в течение 35 минут в присутствии 0,002% плюроника при комнатной температуре Флуоресценция возбуждалась на длине волны 480 нм при помощи разработанного осветителя на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах (SLED) с волоконно-оптическим выходом для микрофотометрических

исследований клеток (Хохлов и др, 2007) Диапазон излучения возбуждения и эмиссии сужали интерференционными фильтрами 480±10 нм и 535±20 нм (Chroma, США), соответственно Флуоресцентные изображения

регистрировали каждые 0 5-2 сек при помощи программы Imaging Workbench 5 2 (INDEC Biosystems, USA)

Часть экспериментов, в которых проводился сравнительный анализ характеристик разработанного

осветителя, была проведена при помощи фотометра М40 (Photon Technology International, USA) в режиме счета фотонов, инвертированного

флуоресцентного микроскопа Axiovert 100S (Zeiss, Germany) и объектива Neofluar achroplan 40х (Zeiss, Germany) Для возбуждения флуоресценции Са2+ зонда FIuo-4 (Molecular Probes) использовался сканирующий

монохроматор DeltaRAM™ (Photon Technology International, USA) Для сбора и анализа данных использовалась программа Felix (Photon Technology International, USA)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I Электрофизнологические исследования обонятельной системы. 11. Олфаючшетр.

В качестве одного из подходов для выяснения природы химических стимулов, на которые отвечают неканонические хемосенсорные клетки, предполагалось изучение ответов обонятельного эпителия на запахи С этой целью нами был разработан

Фотометр

Светоизлучающий диод SLED

Св/фильтр возбуждения

□CCD-камера

Св/фильтр

Дихроическое 'зеркало

М/объектив

Клетка*1

Рис 1 Схема экспериментальной установки для мониторинга внутриклеточного кальция

олфактометр, который был оснащен двухканальным генератором пахучих стимулов и позволял поддерживать и регистрировать электрическую активность изолированного эпителия, а также стимулировать его пахучими стимулами в виде калиброванной смеси воздуха и насыщенных паров пахучих веществ (Рис 2а) Насыщенный пар пахучего вещества получался путем насыщения воздуха, продуваемого над поверхностью чистого вещества (Рис 26) Разведение насыщенного пара до требуемой концентрации достигалось за счет динамического смешивания его со струей чистого воздуха, подаваемого из дросселирующего устройства Коэффициент разведения задавался отношением расхода смеси в сборной ветви к расходу смеси в прямой ветви Отведением части приготовленной смеси в боковую ветвь достигалось равенство расхода смеси на выходе и входе Это позволяло включать необходимое количество ступеней разведения в любой комбинации и получать ряд дискретных

Генератор ^имул а

_ Канал-1

! Вещество-1 lZ.iL р^

БеГ^

1,78

¡Цр^-Вь |

¡ЕПЗ

3,16

10,0

- 10,0

вщ

Термостат 20°С _ _

Канал-2 !

ПК

Система регистрации

Электрофизиологическая камера с эпителием

компенсация дрейфа

разведение = (С^+О,

Насыщенный пар

пара ^воздуха/' пара

^тимул

Разбавленный пар

Пневмо- М 7 дроссели ] [

стим ~^пара

Вакуум

Рис 2. А) Двухканапьный олфактометр Б) Принцип приготовления газообразного стимула заданной концентрации

концентрации вещества.

Электрофизиологическая камера обеспечивала поддержание жизнедеятельности

обонятельного эпителия и, что не менее важно, его изоляцию от окружающей среды, те от посторонних запахов Система регистрации и управления, контролируемая либо вручную, либо компьютером, обеспечивала синхронизацию аппликации стимула, регистрации EOG и автоматическую компенсацию дрейфа трансэпителиального потенциала

Калибровка концентрации смеси, нагнетаемой стимулятором в камеру, осуществлялась при помощи газоанализатора ADC2250 (BioScientific Ltd, Англия) С этой целью вместо паров вещества на вход стимулятора подавалась поверочная газовая смесь (углекислый газ 3,55%±0,001, кислород 10%, азот - остальное), для разведения которой при калибровке использовштся азот Как показали проведенные контрольные эксперименты, концентрация С02 в смеси приготовленной генератором стимулов была стабильна, воспроизводима и отличались от расчетной не более чем на ±5%

Кинетические параметры стимулов определялись в экспериментах, в которых вместо пахучего стимула в камеру подавался подогретый воздух, и малоинерционным датчиком (микротермистором СТЗ-18а) регистрировалась температура в месте расположения эпителия Измеренные таким образом время нарастания и время спада фронта температуры воздуха оказались равными 81±10,5 мс и 130±20,6 мс, соответственно Эти оценки являются адекватной характеристикой кинетики концентрационных изменений, поскольку 1) процессы переноса вещества и тепла в газе аналогичны и описываются идентичными дифференциальными уравнениями (Сунцов, 1959), 2) постоянная времени микротермистора составляла 21±3 мсек

12. Регистрация электрической активности обонятельного эпителия.

В ответ на короткие (<1с) пахучие стимулы обонятельный эпителий обычно генерировал отрицательные по знаку электрические потенциалы величиной 1 - ЮмВ (Рис 3) Аппликация селективных ингибиторов аденилатциклаз MDL12330A или SQ22536 на апикальную поверхность МОЕ приводила к дозозависимому ослаблению

Рис 3 Электрические ответы обонятельного эпителия на пахучие вещества различной химической природы

ответов для всех пахучих веществ, использовавшихся в наших экспериментах Поскольку 1уПЭ1Л2330А и 5022536, которые существенно отличаются по химической структуре и, следовательно, по спектру неспецифических эффектов, оказывали

1 мВ

практически идентичные эффекты на EOG, можно утверждать, что основной мишенью этих веществ действительно была аденилатциклаза. Кривые ингибирования, полученные для MDL12330A и SQ22536 (Рис.4а, б) удовлетворительно аппроксимировались уравнением:

WRo=1/(1+[I]/[I],,2), (1)

где: R и R0 - амплитуды пиков EOG с ингибитором и в контроле, соответственно, [I]—

S 1.04т в

|о,8

5 0,6

s 0.4

и о

£ 0,2' О

0,0

MDL12330A

♦ анизол, 29мкМ а изоамипацетат, 27мкМ дцинеол, 29мкМ

х изовалериановая к-кта,26мкМ^ —расчет

0,1

1,0 10,0 100,0 1000,0 Концентрация MDL12330A, мкМ

о 0,8

г J 0,6

з: 0,4

Ж 5 0,2

0,0

SQ 22536

♦ анизол, 29мкМ о иэоамилацетат, 27мкМ лцинеол, 29мкМ х изовалериановая к-кта,26мкМ —расчет

0,1

1,0 10,0 100,0 1000,0 Концентрация SQ 22536, мкМ

Рис.

4. Относительная амплитуда ответов на различные запахи (символы) в присутствии МРШЗЗОА (А) и 3022536 (Б) при различных концентрациях ингибиторов. Непрерывные кривые соответствуют уравнению (1) с параметрами [1]1а = 59,2мкМ (А) и [1]1/2 = 101,ЗмкМ (Б). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (п=3-5).

концентрация ингибитора, [1]ш - концентрация полуэффекта. При использовании этих ингибиторов в концентрациях, превышающих концентрацию полуэффекта вдвое и более, ответы на указанные запахи, исключая феромоны, практически отсутствовали (Рис.5). Исчезал и ответ на аппликацию раствора 1ВМХ -неселективного ингибитора РБЕ, который вызывает кратковременное повышение сАМР в цитоплазме обонятельных нейронов, тем самым имитируя обонятельный

н 1,2

а>

Ii.*

1о,£Н

0,4-

о,г

0,0-

□ control

SMDL12330A, 130 мкМ ■ SQ22536, 300 мкМ

ш.

(п=3)

2 (п=3)

3 4 (п=5) (п=4)

(п=3)

6 (п=3)

7 8 (п=3) (п=3)

Рис. 5. Аппликация MDL12330A и SQ22536 в концентрациях более двукратных

полуэффектов приводила к праетически полному

исчезновению потенциала EOG. Потенциалы пиков EOG нормированы на величину пика ответа на иэоамилацетат. Вещества: 1-изоамилацетат (27мкМ); 2-анизол (29мкМ); 31 изомасляная к-та (26мкМ); 4-изовалериановая к-та

(25мкМ); 5- цинеол (29,5мкМ);

6- а-пинин (26мкМ); 7- евгенол (28 мкМ); 8- 1ВМХ (ЮОмкМ). В скобках-число животых. ответ. Таким образом, в полном соответствии с существующими представлениями.

полученные данные (Рис.4, 5) указывали на то, что у млекопитающих распознавание обычных запахов, т.е. не связанных с химическими коммуникациями животных, осуществляется обонятельными нейронами, в возбуждении которых ключевую роль играет аденилатциклазный сигнальный каскад (Chen et al., 2000; Wong et al., 2000). Учитывая, что MDL12330A ингибирует аденилатциклазу необратимо, в дальнейших экспериментах использовался исключительно SQ22536.

При исследовании чувствительности МОЕ к 2-гептанону - синтетическому феромону мышей - было установлено, что ответы на феромон по своей амплитуде и форме были близки к таковым на изоамилацетат, который является классическим пахучим стимулом, традиционно используемым для исследования процессов трансдукции в обонятельных нейронах. Однако по сравнению с изоамилацетатом, относительное ингибярование ответов на 2-гептанон в присутствии SQ22536 было слабее в широком диапазоне концентраций обоих веществ (Рис. 6а). Кривая ингибирования ответов на 2-гептанон проходила достоверно ниже таковой для

3.001 0,010 0,100 0,316 1,000 0,1 1 ю 100 1000

Относительная концентрация Концентрация SQ 22536, мхМ

Рис. S. А) Ответы на феромон 2-гептнон ингибируются SQ22536 (10 мкМ, 15 мин) слабее, чем на изоамилацетат в широком диапазоне концентраций обоих веществ. Ось абсцисс - относительная концентрация паров веществ в стимуле. Б) Кривые ингибирования ответов на изоамилацетат (27 мкМ, 1 с) и 2-гептанон (29 мкМ, 1 с). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (п=3-5).

изоамилацетата (Рис.66). Это указывало на возможный вклад в EOG клеток других типов, т.е., не обонятельных нейронов, которые используют не аденилатциклазный, а, например, фосфолипазный каскад для трансдукции феромонов (Lin et ai., 2004, 2007; Elsaesser et al., 2005). В пользу подобной точки зрения свидетельствовали следующие результаты. Если помимо ингибитора аденилатциклазы SQ22536, обонятельный эпителий инкубировался в присутствии ингибитора фосфолипазы С U73122, то ответы на изоамилацетат и на 2-гептанон ингибировались примерно в равной степени (Рис. 7).

Сравнение Рис.6 и Рис.7 явно свидетельствует о том, что в обонятельном эпителии функционирует популяция клеток, которая использует фосфолипазный каскад для трансдукции 2-гептанона (Lin et al., 2004). В частности, это могли быть гастдуцин-положительные клетки (Finger et al., 2003), которые действительно были выявлены нами (совместно с Ю.Е. Яценко) при иммуно-гистохимическом исследовании срезов МОЕ мыши с помощью антител к гастдуцину (Рис.8).

Возможный вклад гастдуцин-положительных клеток в потенциал EOG оценивался в экспериментах, в которых исследовались ответы обонятельного эпителия мышей с удаленным (knock-out) геном, кодирующим а-гастдуцин. Оказалось, что в отличие от животных дикого типа (Рис.6), ответы обонятельного эпителия нокаутных мышей на изоамилацетат и 2-гептанон ингибировались SQ22536 практически в равной степени в широком диапазоне концентраций запахов (Рис.9а) и концентраций ингибитора (Рис. 96).

Таким образом, проведенные эксперименты (Рис.6 - 9) свидетельствовали о том, что в обонятельном эпителии функционирует субпопуляция хемосенсорных клеток, которые экспрессируют G-белок гастдуцин, сопрягающий рецептор запахов с фосфолипазным каскадом, и что

Рис.8. Иммунофлуоресценция срезов МОЕ, обработанных первичными антителами к а-Ggust (Santa Cruz) и вторичными антителами, меченными AlexaFluor-488 (Molecular Probes) (масштаб 75 мкм). Специфическая флуоресценция в области эмиссии флуорофора свидетельствует об экспрессии гастдуцина в отдельных клетках МОЕ.

гастдуцин-положительные клетки специализируются в распознавании феромонов, по крайней мере, 2-гептанона. Исходя из этих представлений, мы разработали математическую модель электрического ответа обонятельного эпителия на запахи, которую использовали в дальнейшем для анализа экспериментальных данных. В ! простейшем варианте модель предполагала, что электроолфактограмма является 1 аддитивной суммой поверхностных потенциалов, генерируемых за счет суммарной электрической активности, соответственно, обонятельных нейронов и неканонических хемосенсорных клеток, например, гастдуцин-положительпых.

SQ22536 10 мкМ, U73122 4 мкМ

О изоамилацетат

0,(Я

0,001 0,010 0,100 0,316 1,000 Относительная концентрация

Рис.7. SQ22536 (10 мкМ, 15 мин) вызывает практически идентичное ингибирование ответов на изоамилацетат (27 мкМ, 1 с) и 2-гептанон (29 мкМ, 1 с) в присутствии ингибитора PLC U73122 (4 мкМ). Ось абсцисс - относительная концентрация паров веществ в стимуле. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (п=3).

0,010

0,100

0,316

1,ооо

Относительная концентрация

Рис.9. А) Ответы гастдуцин-нокаутных

10 100 1000 Концентрация БСЗ 22536, мкМ

мышей на 2-гептанон и изоамилацетат ингибируются 8022536 (10 мкМ, 15 мин) примерно в равной степени в широком диапазоне концентраций обоих веществ. Ось абсцисс - относительная концентрация паров веществ в стимуле. Б) Кривые ингибирования ответов гастдуцин-нокаутных мышей на изоамилацетат (27 мкМ, 1 с) и 2-гептанон (29 мкМ, 1 с). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (п=3-5).

1.3. Моделирование электроолфактограммы. 1.3.1. Исходные положения модели.

Морфологически обонятельный эпителий преимущественно представляет собой однослойную упорядоченную клеточную структуру, в которой обонятельные нейроны и поддерживающие клетки одинаково ориентированы. Синхронная активность обонятельных нейронов при стимуляции запахом приводит к появлению электрического тока, текущего поперек этого слоя так, что при этом одна граничная поверхность слоя будет поверхностью источников зарядов, а другая - стоков. Протекание тока в окружающей этот слой проводящей среде (слизи, покрывающей поверхность МОЕ, и окружающих тканях) приводит к возникновению потенциала EOG, регистрируемого на поверхности эпителия. Если клетку эпителия представить как диполь, момент которого пропорционален трансмембранному току, то математически потенциал такой структуры может быть описан как потенциал двойного электрического слоя (Смайт, 1954). Отметим, что приближение такого рода традиционно используется для моделирования потенциалов других возбудимых тканей, например сетчатки (Ehrhardt and Baumann, 1977) и коры головного мозга (Гутман, 1980). Потенциал границы такого слоя, образованного клетками одной популяции, будет пропорционален произведению относительной плотности клеток, образующих эту популяцию, и их среднего момента (Жадин, 1984).

Если клеточная система образована несколькими независимыми популяциями клеток, то, согласно принципу суперпозиции, потенциал гетерогенной системы будет равен сумме потенциалов двойных электрических слоев, генерируемых каждой из этих популяций. Вклад отдельно взятой популяции будет пропорционален моменту данного типа клеток, взвешенному на относительную плотность клеток (Гутман, 19В0). Такого представления было бы достаточно для адекватного описания олфактограммы, но на сегодня даже качественно не установлены звенья сигнальной цепи рассматриваемых рассеянных хемосенсорных клеток, а оценки параметров

элементов трансдукционного каскада канонических обонятельных нейронов у разных исследователей значительно расходятся (например Lowe, Gold, 1993, Zufall, 1990) Это обстоятельство делает невозможным прямое моделирование клеточных токов (моментов) Тем не менее аддитивность вклада различных клеточных субпопуляций в электрический потенциал упорядоченной ткани, которая следует из качественного анализа, проведенного выше, позволяет использовать иной подход для количественного анализа ответов обонятельного эпителия на запахи

Согласно существующим представлениям о работе сигнальных каскадов, активация клетки от связывания лиганда с рецептором до генерации клеточного ответа представляет собой последовательную цепь биохимических реакций первого порядка (активация рецептора - G-белка - эффекторного фермента - синтез вторичного мессенджера - открытие/закрытие каналов, ток которых пропорционален концентрации вторичного мессенджера) Такая цепь реакций описывается системой дифференциальных уравнений первого порядка (Корниш-Боуден, 1979), а решение такой системы уравнений для концентрации вторичного мессенджера позволило бы определить тип функции, которая может быть применена для формального математического описания изменения потенциала обонятельного эпителия во времени Общее решение такой системы уравнений при условиях, что константы скоростей прямых реакций много больше таковых для обратных реакций, было найдено Бэйлором и соавторами, которые использовали данное приближение для анализа электрической активности фоторецепторных клеток (Baylor et al, 1974) Ими было получено следующее выражение для описания рецепторного потенциала R

R = Ai(l-exp(-b,t)f exp(-b2(t-t,)) , (2)

Действуя по аналогии, мы постулировали, что потенциал двойного электрического слоя, генерируемого при участи клеток двух различных субпопуляций, будет равен

R = Ai(l-exp(-b,t)f exp(-b2(t-ti)) + A2(l-exp(-b3t))2 exp(-b4(t-ti)) , (3)

где R ~ измеряемый потенциал в виде EOG, А;, А2, bt - b4, tu t2 - постоянные коэффициенты, t - время В дальнейшем мы использовали уравнения (2) и (3) для аппроксимации (путем подбора коэффициентов методом наименьших квадратов) ответов па пахучие вещества

1.3.2. Анализ экспериментальных данных.

В случае изоамилацетата оказалось, что ответы как нормального обонятельного эпителия, так и с удаленным гастдуцином удовлетворительно моделируются выражением (2) (Рис 10) Это свидетельствовало о том, что ответы на обычный запах генерировались преимущественно при участии одной популяции хемосенсорных клеток Без сомнения, это должны были быть обонятельные нейроны, использующие аденилатциклазный каскад для генерации ответа В этой связи трансмембранные потенциалы, описываемые уравнением (2) при bi=100 мс"1 и Ь2=200 мс"1, мы условно назвали «АС- компонентой»

Поскольку в случае мышей дикого типа ингибиторный анализ трансэпителиальных потенциалов, генерируемых в ответ на 2-гептанон, свидетельствовал об определенном вкладе клеток с фосфолипазным каскадом (Рис 6), можно было думать, что такие ответы не удастся описать с помощью уравнения (2) Как и ожидалось, ответы нормального эпителия на 2-гептанон можно было описать

только с использованием уравнения (3) В этом случае, кинетические константы

О 1.0

0,8

0,6

Ш к га г г га со о

g- 0,4

О.

О 0,2 X

0,0

О 1.0 о

15 20 Время, с

15 20 0 5

Время, с

Рис 10 Кинетический анализ нормированных усредненных ответов на изоамилацетат мышей дикого типа (А) (п=4) и мышей с нокаутированным геном гастдуцина (Б) (п=3) Ответы обоих типов животных адекватно описываются уравнением (2) со значениями параметров А,=1, Ь,=10000 мс', Ь2=280 мс\ ?,=550 мс (А) и А,=1, Ь,=10500 мс"', Ьг=290 мс \ (,=500 мс (Б) Сплошные линии - ответ, символы (О) -расчет по уравнению (2)

первого слагаемого брались равными таковым, полученным для ответов на изоамилацетат, т е для АС-компоненты, (Рис 11 а) Остальные параметры варьировались, чтобы обеспечить наилучшую аппроксимацию экспериментальных ответов Как видно из Рис 11а, двухкомпонентное уравнение (3) действительно А Б

Время, с Время, с

Рис 11 Кинетический анализ нормированных средних ответов мышей дикого типа на 2-гептанон в контроле (А) (п=4) и после аппликации антагониста PLC U73122 (4 мкМ) (Б) (п=3) Ответ в контроле адекватно описывается уравнением (3) со значениями параметров А, =1, Ь,=10000 мс 1, Ь,=280 мс \ t,=550 мс, и Аг =0,5, Ь3=220 мс \ Ь4=80 мс1, 12=2500 мс (А) После аппликации U73122 АС-компонента ответа (А, =1, Ь,=11000 мс1, 62=280 мс \ t,=500 мс) сохранялась, а PLC-компонента (Ь3=200 мс \ Ь4=80 мс"1, t,=1B00 мс) практически отсутствовала (А2 =0,025) (Б) Линии сплошная -ответ, штрихпунктирная -АС-, штриховая - PLC-компонента, символы (О) - аппроксимация по уравнению (3)

позволяло адекватно описать ответы на феромон Характерно, что в ответах эпителия мышей дикого типа на 2-гептанон, зарегистрированных после аппликации U73122 -антагониста PLC (Рис 116), медленная компонента (Ь3=200 мс"1 и Ь4=80 мс"1)

СЗ 1.0

0 ш

к 0,8 х

1 0,6

о о

§■ 0,4

О 0,2 X

0,0

15 20 Время, с

практически отсутствовала (Л2=0,025) (Рис 116) В этой связи мы приписали ее вкладу клеток, испотьзующих фосфолипазный каскад, и назвали ее «PLC-компонента»

Если наша модель аддитивного вклада обонятельных нейронов и неканонических хемосенсорных клеток в EOG верна, то в случае мышей с нокаутированным геном гастдуцина, следовало бы ожидать, что относительный вклад PLC-компоненты в ответы на феромон будет существенно или пренебрежимо меньше по сравнению с животными дикоп) типа в зависимости от вклада гастдуцин-положительных хемосенсорных клеток Аппроксимация ответов эпителия нокаутных мышей на 2-гептаноа (Рис 12) с использованием уравнения (3) показала, что нокаут

Рис 12 Кинетический анализ нормированных усредненных

ответов мышей с нокаутированным геном гастдуцина на 2-гептанон (п=4) Ответ адекватно описывается уравнением (3) со значениями параметров Л,=7, Ь,=11000 мс\ Ьг=280 мс"1, t,=500 мс, и Аг =0,15, b3=220 мс1, b4=30 мс1, ¡2=2500 мс Нокаут гастдуцина уменьшает относительный вклад PLC-компоненты в 3 раза Линии сплошная - ответ, штрихпунктирная - АС-компонента, штриховая - PLC-компонента, символы (О) аппроксимация по уравнению (3)

гастдуцина действительно уменьшает относительный вклад PLC-компоненты в 3 раза A¡/A i=0 5 для мышей дикого типа и A/At=0 15 для нокаутных мышей Неполное исчезновение PLC-компоненты у нокаутных мышей (Рис 12) и практически полное исчезновение ее в эксперименте с антагонистом PLC у мышей дикого (Рис 116) в ответах на 2-гептанон, скорее всего, связано с тем, что субпопуляция рассеянных хемосенсорных клеток, использующих фосфолипазный каскад для трансдукции феромонов, включает не только гастдуцин-положительные клетки

II. Микрофл}ориметрия клетки

Собственная флуоресценция клеток и, в большей степени, флуоресценция, индуцированная специфическими зондами представляет собой физическое явление, которое характеризует состояние клетки и позволяет судить о кинетике и направлении протекающих в ней процессов В наиболее традиционном варианте при исследовании клеток фотометрическими методами используется возбуждение флуоресценции и измерение эмиссии на 1-2 длинах волн Между тем, многие задачи биологии клетки требуют мультиволнового возбуждения, а в ряде случаев -измерения спектральных характеристик возбуждения и эмиссии флуоресценции Типичная проблема состоит в том, что структура клетки является весьма сложной и гетерогенной Поэтому спектры возбуждения зависят, как правило, от локального микроокружения Плотность клеток, тип клеток и их состояние - все эти параметры также могут влиять на эффективность возбуждения на данной длине волны

Традиционным решением является использование осветителей на основе ксеноновых ламп - достаточно нестабильных источников света - в сочетании с оптическими фильтрами или монохроматорами В первом случае имеет место плохо перестраиваемая система с ограниченным набором длин волн (две, как правило) Во втором - платой за широкий спектральный диапазон является потеря светосилы и/или чувствительности Например, в светосильных монохроматорах на дифракционных решетках, которые обеспечивают возбуждение на произвольных длинах волн, фоновая засветка составляет порядка 0 05-0 08% от интенсивности возбуждающего света в силу неидеальности решеток и наличия спектров выше первого порядка и по ряду других причин Наличие фоновой засветки в монохроматорах является принципиально неустранимым, что ограничивает соотношение сигнал/шум и делает невозможным повышение чувствительности метода за счет увеличения мощности лампы (Lakowicz, 1999) Эта проблема соотношения сигнал/шум наиболее остро стоит при микрофлуориметрии одиночных клеток, поскольку в этом случае приходится иметь дело с предельно низкими световыми потоками

В последнее время на смену традиционным ламповым источникам излучения для возбуждения флуоресценции приходят источники на основе сверхярких излучающих полупроводниковых диодов (SLED) Для них характерны высокая стабильность, большая яркость, простота управления и субмиллисекундный диапазон изменения светимости при изменении управляющего сигнала, а также малое энергопотребление и отсутствие излучения в ИК-диапазоне Полуширина спектра излучения SLED обычно в пределах 20-50 нм и может быть скорректирована светофильтрами В настоящий момент промышленно выпускаются SLED для диапазона длин волн 365 - 1000 нм, что покрывает практически весь спектральный диапазон, необходимый для клеточных исследований (Sipior et al, 1997) Имеются опытные образцы SLED практически для всего ультрафиолетового диапазона.

Для обеспечения материальной базы клеточных исследований, проводимых в нашей лаборатории, нами был разработан осветитель на SLED с волоконно-оптическим выходом для микрофлуориметрии клеток Осветитель обеспечивает излучение на следующих длинах волн (максимум спектральной плотности) 340 нм (10 мВт), 385 нм (30 мВт), 440 нм (70 мВт), 480 нм (50 мВт), 530 нм (20 мВт) при длительной нестабильности мощности излучения <0,1 %/час и контролируемый управляющей программой FeliX (PTI) (Хохлов и др, 2007) Сравнительный анализ характеристик показал его высокие эксплутационные свойства

II.1. Шумовые характеристики.

Нами проведено сравнение шумовых характеристик разработанного осветителя и промышленного осветителя на ксеноновой лампе UXL-75XE (75 Вт) (Ushio, Япония) в составе сканирующего монохроматора DelfaRAM (Photon Technology International, США) Для этого излучение обоих осветителей регистрировалось фотодиодом ФД-7 на линейном участке характеристики, и фототек усиливался инструментальным операционным усилителем (140УД17) Собственные шумы этой измерительной системы были пренебрежимо малы по сравнению с шумами измерявшихся фототоков Шумы лампы оказались на два порядка более интенсивными, чем шумы SLED (Рис 13) Кроме того, из Рис 13 видно, что для обоих источников световой

поток флуктуирует преимущественно в диапазоне 0.01-1 Гц. Последнее означает, что флуктуации флуоресцентного сигнала клеток, индуцируемые шумами световых источников, принципиально неустранимы за счет фильтрации, поскольку характерное

А Б

частота, Гц

Рис.13. Спектры мощности флуктуации фототока при регистрации излучения SLED TIWR7600M64 Р™ = 480 нм) (А) и монохроматора Delta RAM (480 нм) с ксеноновой лампой UXL-75XE (75 Вт) Б) в эквивалентной полосе длин волн. При равной интегральной интенсивности излучения шумы лампы на два порядка более интенсивны, чем шумы SLED.

время кинетики биологических процессов, исследуемых с помощью флуоресцентных зондов, преимущественно лежит в секундном и даже в субсекундном диапазонах (Baryshnikov et al., 2003). Существенно более интенсивные шумы лампы и наличие фонового света в осветителе на монохроматоре по сравнению с осветителем на SLED должны приводить к худшему соотношению сигнал/шум. Это действительно наблюдалось в экспериментах (Рис.14), в которых регистрировались Са2+-сигналы в

и.

500 600 Время, с

400 600 600 Бремя, с

Рис.14. Регистрация Са2^-сигнапа в цитоплазме индивидуальных клеток СОЗ-1при аппликации АТФ. Са^-сигнапы регистрировались от одной и той же клетки с помощью фотометра М40 при возбуждении флуоресценции с использованием либо Б1-ЕО-осветителя (А), либо монохроматора ОеКаРАМ (Б). Линии над кривыми - аппликация АТФ (1 мкМ).

цитоплазме индивидуальных клеток COS-1, нагруженных Са2+-зондом FIuo-4 (Molecular Probes), при стимуляции последних агонистами пуринорецепторов (Хохлов и др, 2007) Отношение сигнал/шум было 16 в случае осветителя на SLED и 6 8 для монохроматора Относительное изменение интенсивности эмиссии (AF/F) в случае монохроматора (AF/F = 2 0 ±0 2, п=3) несколько ниже, чем в случае осветителя на SLED (AF/F = 24 ±02, п=3) Это было ожидаемо и обусловлено тем, что при использовании монохроматора возбуждающий свет содержал компоненту в области эмиссии Fluo-4 за счет наличия фоновой засветки, которая проникала в канал регистрации за счет неидеальности дихроичного зеркала и отражения от образца и объектива. Благодаря своим улучшенным характеристикам разработанный осветитель позволил провести ряд исследований на уровне одиночных клеток, некоторые из которых описаны ниже

Следует отметить еще ряд важных преимуществ разработанного осветителя работа в режиме мультиволнового возбуждения, возможность модуляции излучения SLED в килогерцовом диапазоне частот, большое время службы SLED, составляющее -30000 часов (характерное время работы ксеноновых ламп варьирует в диапазоне 400-800 часов), низкая, по сравнению с лампами, стоимость

11.2. Исследование одиночных клеток.

Хотя исходной посылкой для создания осветителя на SLED было желание существенно расширить возможности микрофотометрического метода для исследования одиночных хемосенсорных клеток обонятельного эпителия, его разработка значительно опередила наш прогресс в области выделения и идентификации этих клеток В этой связи осветитель был использован прежде всего для исследования физиологических процессов во вкусовых клетках В частности, решалась следующая задача (совместно с Романовым и Рогачевской)

Вкусовые хемосенсорные клетки не имеют аксонных проекций и коммуницируют с окончанием афферентного нерва, выделяя АТР, как афферентный нейротрансмиттер Какие клетки в гетерогенной популяции клеток вкусовой почки способны секретировать АТР, было неизвестно С целью выяснить это использовался метод биосенсора В качестве последнего использовались клетки COS-1, которые генерировали Са2+-ответы на внеклеточный АТР при участии эндогенных P2Y-рецепторов (Рис 15) Их чувствительность к внеклеточному АТР оказалась

AF/F 7

AF/F

3 2

Рис 15. Кальциевые ответы одной и той же клетки СОвИ, регистрируемы по флуоресценции Сазонда Р1ио-4 при аппликации АТР в различных концентрациях На вставке показана концентрационная зависимость ответов Средний порог чувствительности клетки СОЗ-1 составил порядка 50 ± 10 нМ (п=5)

100

........

1000 АТР.нМ

ATPImkM 300 НМ IOOHM 50 НМ

достаточно велика, и, в среднем, порог чувствительности составил порядка 50 ± 10 нМ (п=5) (Романов и др., 2007)

Упрощенная схема экспериментов, в которых исследовался выброс АТР вкусовыми клетками в ответ на деполяризацию, представлена на Рис.16. Вкусовая сср-камера

Рис.16. Схема эксперимента по регистрации выброса АТР вкусовыми клетками при помощи метода биосенсора.

клетка, активность которой контролировалась электрофизологически методом patch clamp, располагалась в непосредственной близости от клетки-сенсора. В ответ на деполяризацию вкусовая клетка секретировала АТР, который активировал пуринорецепторы на мембране клетки-биосенсора, что приводило к мобилизации Са2+ в цитоплазме последней и вызывало эмиссию зонда (Рис. 17).

1 ' 2

.......ч

■»•«.. .J,..* *. ' "• ...... ■ _____,.;• ... . . .••_ ••. . . "

Рис.17. А) Регистрация выброса АТР вкусовыми клетками. Флуоресценция кпетки-сенсора COS-1 в процессе электрической стимуляции соседней вкусовой клетки. Б) Са2*-ответ клетки АТР-биосенсора (п=3), выраженный в относительном изменении эмиссии (AF/F). Верхняя кривая иллюстрирует изменение электрического потенциала на мембране вкусовой клетки. Цифры на кривой AF/F Са2+-ответа соответствуют моментам получения кадров изображений 1 и 2 (А).

10 мВ

-70 мВ I ! -70 мВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, нами был разработан и смонтирован 5 канальный осветитель, управляемый компьютером и излучающий на длинах волн - 340, 380, 440, 480 и 530 нм, что обеспечивает возбуждение практически всех флуоресцентных зондов, используемых в клеточных исследованиях, и всех флуоресцентных GFP-подобных белков Осветитель был испытан в экспериментах с одиночными клетками с использованием методов микрофотометрии и Са2+ imaging Было продемонстрировано, что осветитель обладает хорошими техническими характеристиками, в частности, он обеспечивал лучшую чувствительность и соотношение сигнал/шум по сравнению с промышленным осветителем на монохроматоре Это удалось достичь благодаря использованию вместо ксеноновой лампы сверхярких излучающих полупроводниковых диодов (SLED) в качестве источника излучения Диоды обеспечивают интенсивное излучение в узком спектральном диапазоне, эффективно управляются с помощью электронной схемы и практически безинерционны в масштабах кинетики подавляющего большинства изучаемых внутриклеточных процессов Немаловажным преимуществом созданного осветителя является низкая стоимость SLED при практически неограниченном времени их эксплуатации по сравнению с характерным временем жизни (400-800 часов) непрерывно-излучающих ламп Одним из биологически значимых результатов, которые удалось получить исключительно благодаря использованию разработанного осветителя, была демонстрация того, что вкусовые клетки секретируют афферентный нейротрансмитгер АТР при участии АТР-проницаемых ионных каналов

Другим результатом проведенной работы было создание полуавтоматического олфактометра, который позволяет поддерживать и регистрировать электрическую активность изолированного обонятельного эпителия до 5 часов и стимулировать его пахучими стимулами с известными кинетическими параметрами в виде калиброванной смеси воздуха и насыщенных паров пахучих веществ с помощью разработанного двухканального генератора пахучих стимулов Используя созданную систему в комплексе с ингибиторным анализом, были проведены эксперименты по регистрации ответов обонятельного эпителия на различные синтетические пахучие вещества. На примере синтетического феромона мышей 2-гептанона установлено, что распознавание социально-значимых запахов - феромонов -происходит при участии как минимум двух различных клеточных популяций хемосенсорных клеток Одну из них составляют обонятельные нейроны, использующие аденилатциклазный каскад для трансдукции пахучих стимулов, а другую образуют клетки, использующие фосфолипазный каскад, и котгрые, возможно, специализируются на обнаружении феромонов

Из литературных данных известно, что в обонятельном эпителии популяция клеток, использующих фосфолипазный каскад, гетерогенна и, в частности, включает гастдуцин-положительные клетки Результаты ингибиторного анализа с использованием антагонистов аденилатциклазы и фосфолипазы физиологических ответов обонятельного эпителия мышей дикого типа и мышей с нокаутированным геном гастдуцина показали, что нокаут гена G-белка гастдуцина модифицирует ответы на 2-гептанон Для адекватного описания ответов на запахи и оценки вклада отдельных клеточных субпопуляций в генерацию суммарного ответа обонятельного эпителия нами была создана математическая модель Данные ингибиторного анализа

и математического моделирования свидетельствовали о том, что субпопуляция неканонических, в частности гастдуцин-положительных хемосенсорных клеток, в которых функционирует фосфолипазный сигнальный каскад, специфически активируется феромоном мышей 2-гептаноном, то есть, может специализироваться на распознавании социально-значимых запахов Отметим, что гастдуцин-положительные клетки не имеют аксонов и не формируют классические химические синапсы с соседними клетками или с нервными окончаниями (Fmger et al, 2003) Поэтому возникает вопрос, каким образом такие клетки могут кодировать сенсорную информацию и передавать ее в ЦНС Возможное объяснение состоит в том, что по аналогии со вкусовыми клетками, гастдуцин-положительные клетки МОЕ могут секретировать нейротрансмнтгер при участии ионных каналов (Romanov et al, 2007)

ВЫВОДЫ

1 Разработан и создан мультиволновой управляемый осветитель на основе сверхярких светоизлучающих диодов Осветитель обеспечивает возбуждение практически всех флуоресцентных зондов для клеточных исследований и флуоресцентных GFP-подобных белков, лучшую чувствительность и соотношение сигнал/шум по сравнению с промышленным осветителем на монохроматоре Разработанный осветитель успешно апробирован при исследовании одиночных клеток, в том числе, способности вкусовых клеток секретировать АТР

2 Разработан и построен олфактометр для длительного поддержания электрической активности обонятельного эпителия и регистрации его ответов на запахи Олфактометр включает двухканальный генератор газообразных пахучих стимулов, который обеспечивает воспроизводимость концентрационных и кинетических параметров стимулов с точностью ±5% и ±12 %, соответственно С помощью разработанного олфактометра изучены электрические ответы обонятельного эпителия мыши на ряд синтетических пахучих веществ и синтетический феромон мышей 2-гептанон

3 На примере 2-гептанона с использованием ингибиторного анализа установлено, что распознавание социально-значимых запахов происходит при участии как минимум двух различных популяций хемосенсорных клеток - обонятельных нейронов с аденилатциклазным каскадом и клеток, использующих фосфолипазный каскад трансдукции Создана математическая модель, адекватно описывающая ответы на запахи и позволяющая оценить вклад отдельных клеточных субпопуляций в генерацию суммарного ответа эпителия

4 Показано, что нокаут гена G-белка гастдуцина модифицирует ответы на 2-гептанон обонятельного эпителия мышей Подобные изменения ответов наблюдаются при ингибировании фосфочипазы С в клетках эпителия мышей дикого типа. Это свидетельствует о том, что гастдуцин-положительные клетки, в которых функционирует фосфолипазный сигнальный каскад, могут специализироваться в распознавании этого и, возможно, других феромонов

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

Хохлов А А. Колесников С С Установка для регистрации электроретинограммы //

Приборы и техника эксперимента 2000 2,159-160 Хохлов А А. Колесников С С Установка для стимуляции и измерения электрической активности обонятельного эпителия // Приборы и техника эксперимента 2002 6, 113-117

Хохлов А А. Романов Р А, Зубов Б В, Пашинин А Д, Колесников С С Осветитель на излучающих диодах для микрофотометрических исследований клеток // Приборы и техника эксперимента 2007 3,128-131 Романов Р А, Хохлов А А. Быстрова М Ф , Рогачевская О А, Яценко Ю Е, Колесников С С Мониторинг выброса АТФ из одиночных клеток методом биосенсора // Биологические мембраны 2007 24, 333-339

Патенты

Колесников С С, Хохлов А А. Хохлов А М Камера для электрофизиологических исследований рецептирующих эпителиев // Патент РФ №215348 С1,7 С12 М1/00,1/34 (бюл №30 от 27 10 2001)

Тезисы докладов Хохлов А А. Шишков М И, Колесников С С Микроперфузная электрофизиологическая установка для исследования рецепторов // II Съезд биофизиков России Москва, 1999 Тезисы докладов М 1999 2,632-633 Хохлов А А Регистрация электрической активности сенсорных эпителиев как экспресс-тест функционального состояния трансдукционного каскада // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, 2003 Материалы конференции Пущино 2003 с 16-18

Подписано в печать 29 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 487 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Хохлов, Александр Анатольевич

I. Введение

II. Обзор литературы

11.1. Строение основной обонятельной системы

11.2. Трансдукция обонятельного сигнала обонятельными рецептирующими нейронами

11.3. Трансдукция обонятельного сигнала другими обонятельными нейронами

11.4. Электрическая активность других клеток обонятельного эпителия

11.5. Принципы распознавания и кодирования запахов

11.6. Электрическая активность обонятельных эпителиев

III. Материалы и методы

111.1. Животные

111.2. Регистрация ответов обонятельного эпителия

III.4. Флуоресцентная микроскопия и микрофотометрия

IV. Результаты и обсуждение

IV. 1. Олфактометр 21 IV.2. Регистрация электроолфактограмм 25 IV.3. Моделирование электроолфактограмм. Исходные положения модели.

IV.4. Анализ экспериментальных данных.

IV.5. Микрофлуориметрия клетки

IV.6. Шумовые характеристики.

IV.7. Исследование одиночных клеток.

IV. 8. Обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте"

Обоняние - способность определять запах веществ, рассеянных в воздухе.Обонятельная система позвоночных и млекопитающих состоит из двух связанных подсистем - основной и дополнительной, расположенных в носовой раковине. Традиционно считалось, что.у позвоночных главный обонятельный эпителий (МОЕ) специализируется на восприятии обычных запахов, а вомероназальный орган (VNO) ответственен за распознавание относительно узкого класса пахучих веществ (феромонов), детерминирующих социальное и половое поведение животных. Однако исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о том, что VNO свойственна более широкая химическая чувствительность, в то время как восприятие животными ряда феромонов происходит при участии МОЕ. Процесс восприятия простых пахучих стимулов, не участвующих в химических коммуникациях животных, основательно изучен и прослежен от связывания молекул запаха с рецептирующей поверхностью обонятельных нейронов МОЕ до возбуждения нейронных сетей' обонятельной луковицы. В частности, установлено, что запахи распознаются \ специализированными рецепторами, относящимися к суперсемейству гептаспиральных рецепторов, сопряженных с сигнальными каскадами с помощью G-белков. Связывание молекулы запаха с рецептором приводит к активации аденилатциклазы, быстрому повышению уровня циклического аденозинмонофосфата (сАМР) в обонятельной цилии, активации сАМР -зависимых катионных каналов и генерации рецепторного потенциала. Вопросы о том, какие клетки МОЕ и при участии каких рецепторных и сигнальных механизмов детектируют феромоны, остаются открытыми.Методами иммуногистохимии недавно показано, что: 1) в МОЕ функционирует субпопуляция клеток, которые экспрессируют не гептаспиральные рецепторы запахов, а рецептор-гуанилатциклазу; 2) определенная популяция клеток МОЕ экспрессирует G-белок гастдуцин и ионный канал TRPM5 - ключевые элементы каскада вкусовой трансдукции.Вполне вероятно, что клетки данных подтипов являются феромончувствительными, хотя прямых доказательств этого не существует. В силу сказанного, одним из направлений исследований нашей лаборатории, является попытка выяснить физиологическую роль этих субпопуляций клеток МОЕ, скорее всего выполняющих хемосенсорную функцию. В частности, предполагается установить природу химических стимулов, на которые способны отвечать эти неканонические хемосенсорные клетки, и исследовать сигнальные процессы, запускаемые в этих клетках химическими стимулами.Существует несколько специфических проблем, препятствующих эффективному анализу популяции неканонических хемосенсорных клеток МОЕ. Во-первых, данная субпопуляция слишком мала (1% числа нейронов), что значительно затрудняет их идентификацию среди клеток диссоциированного обонятельного эпителия и делает проблематичным эффективное использование таких методов клеточной физиологии как patch clamp и Са2+ imaging.Морфологические критерии для решения задачи идентификации одиночных клеток МОЕ практически неприменимы. В частности, в процессе выделения большинство обонятельных нейронов теряют обонятельные цилии, наличие которых является характерным морфологическим признаком этих клеток. Кроме того, обонятельные нейроны постоянно обмениваются, развиваясь из базальных клеток. Незрелые нейроны приобретают цилии только когда их рецептирующая апикальная мембрана достигает поверхности эпителия. Задача идентификации неканонических хемосенсорных клеток могла бы быть решена с помощью трансгенных животных, у которых различные хемосенсорные клетки МОЕ экспрессируют различные флуоресцентные маркерные белки. Еще одной проблемой является то, что химические вещества, специфически стимулирующие неканонические хемосенсорные клетки, в целом, не идентифицированы. Учитывая все эти обстоятельства, а также то, что в нашей лаборатории предполагалось использование трансгенных и нокаутных животных, в качестве основной цели данной работы было сформулировано создание новой методической и приборной базы для анализа физиологической активности неканонических хемосенсорных клеток, функционирующих в обонятельном эпителии. Решались следующие задачи: 1. Разработать мультиволновой осветитель на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах для идентификации и исследования одиночных хемосенсорных клеток методом флуоресцентной микроскопии.2. Разработать двухканальный олфактометр для поддержания и регистрации электрической активности изолированного обонятельного эпителия и стимуляции его газовыми пахучими стимулами заданной концентрации.3. Исследовать роль субпопуляции гастдуцин-положительных рассеянных хемосенсорных клеток в генерации ответов на 2-гептанон - синтетический феромон мышей.4. Для интерпретации полученных данных разработать математическую модель суммарного электрического ответа обонятельного эпителия, генерируемого при участии нескольких популяций хемосенсорных клеток.В результате выполненной работы: 1. Был разработан и построен двухканальный олфактометр, который позволяет поддерживать и регистрировать электрическую активность изолированного обонятельного эпителия до 5 часов и стимулировать его пахучими стимулами в виде калиброванной смеси воздуха и насыщенных паров пахучих веществ. Идея создания данного прибора возникла при анализе современных тенденций в электрофизиологии. Дело в том, что классическая микроэлектродная техника, а затем и метод patch clamp, революционизировавший клеточные исследования и позволивший решить многие задачи от регистрации активности одиночных ионных каналов до анализа экспрессии генов в одиночных клетках, вытеснили на какое-то время некогда традиционные электрофизиологические методы исследования. В частности, исследователи практически отказались от измерения трансэпителиальных токов и потенциалов, которые, естественно, уступают по своей информативности современным методам клеточной биологии. Тем не менее, в последние годы возродился интерес к относительно простым электрофизиологическим методикам, таким как экстраклеточное отведение или методика Усинга для измерения электрической активности эпителиев (Ussing andZerahn, 1951), которые позволяют осуществлять экспресс-анализ функционального состояния биологических объектов с разными уровнями организации. Связано это с рядом обстоятельств, из которых в контексте данной работы следует отметить следующее. Современные методы молекулярной биологии и генной инженерии позволяют манипулировать рецепторными, канальными и сигнальными белками, либо подавляя экспрессию данного белка (knock-out, sRNA interference), либо усиливая его экспрессию, либо вводя точечные мутации. Простые электрофизиологические методы часто дают возможность выявить функциональные последствия подобных манипуляций. В качестве примера отметим, что мыши с нокаутированным геном аденилилциклазы типа 3, которая в норме специфически экспрессируется в обонятельных нейронах, становились полными аносмиками по отношению к простым запахам, что успешно выявлялось по олфактограмме (Wong et al., 2000)., 2. Была проведена разработка мультиволнового осветителя на сверхярких излучающих диодах для исследования одиночных хемосенсорных клеток методами флуоресцентной микроскопии, в том числе, с использованием флуоресцентных зондов. Основанием для постановки такой задачи явилось следующее. Если исключить дорогостоящую конфокальную микроскопию, традиционным для флуоресцентных приложений является использование осветителей на основе ксеноновых ламп - достаточно нестабильный источник света - в сочетании с оптическими фильтрами или монохроматорами. В первом случае имеется плохо перестраиваемая система с ограниченным набором длин волн (две, как правило). Во втором, платой за широкий спектральный диапазон является потеря светосилы и/или чувствительности. Например, в светосильных монохроматорах на дифракционных решетках, которые обеспечивают возбуждение на произвольных длинах волн, фоновая засветка составляет порядка 0.05-0.08% от интенсивности возбуждающего света в силу неидеальности решеток и наличия спектров выше первого порядка (Lakowicz, 1999). Наличие достаточно интенсивного «паразитного» света является одним из основных факторов, ограничивающих чувствительность регистрации и недостаточное соотношение сигнал/шум. Между тем, нами планировались: идентификация клеток с помощью флуоресцентных маркерных белков, исследование одиночных клеток с помощью флуоресцентных зондов и использование нескольких красителей одновременно. Для этого были необходимы мультиволновое монохроматичное возбуждение и идеальное спектральное разделение возбуждения и эмиссии.Достоинством излучающих диодов является то, что они работают в узком спектральном диапазоне относительно длины волны максимального излучения (^ тах^ Ю нм), уже выпускаются диоды с А™ах в широком спектральном диапазоне (320-1500 нм), диоды эффективно управляются электронным образом* и практически безинерционны в масштабах кинетики подавляющего большинства изучаемых внутриклеточных процессов. Немаловажным обстоятельством является низкая стоимость излучающих диодов и практически неограниченное время эксплуатации. Для сравнения, время непрерывного излучения ксеноновых ламп обычно составляет 400-800 часов. Опыт работы с монохроматором фирмы PTI (Photon Technology International, США) и проделанные расчеты давали основание1 думать, что разработка и создание управляемого осветителя на сверхярких излучающих диодах позволит нам существенно улучшить чувствительность фотометрического метода и исследовать одиночные клетки с большей эффективностью.Разработанные и построенные приборы были апробированы с использованием биологических объектов, и, тем самым, была продемонстрирована их эффективность. В частности, было показано, что по сравнению с фирменным сканирующим монохроматором использование осветителя на излучающих диодах позволяет увеличить чувствительность фотометрического метода и существенно улучшить соотношение сигнал/шум на фоне уменьшения скорости выгорания флуоресцентных зондов. Последнее весьма важно при исследовании одиночных клеток. Использование олфактометра, генерирующего воспроизводимые пахучие стимулы, позволило провести сравнительный количественный анализ чувствительности к запахам мышей дикого типа и мышей с нокаутированным геном гастдуцина. Данное исследование показало, что электроолфактограмма (EOG) является достаточно информативным параметром, по которому можно судить об относительном вкладе различных клеточных субпопуляций в электрический ответ МОЕ на запах данного типа. Последнее в сочетании с ингибиторным анализом, в принципе, позволяет идентифицировать пахучие вещества, специфически стимулирующие исследуемую субпопуляцию клеток. б

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Хохлов, Александр Анатольевич

1. Разработан и создан мультиволновой управляемый осветитель на основе сверхярких светоизлучающих диодов. Осветитель обеспечивает возбуждение практически всех флуоресцентных зондов для клеточных исследований и флуоресцентных GFP-подобных белков, лучшую чувствительность и соотношение сигнал/шум по сравнению с промышленным осветителем на, монохроматоре.Разработанный осветитель успешно апробирован при исследовании одиночных клеток, в том числе, способности вкусовых клеток секретировать АТР.

2. Разработан и построен олфактометр для.длительного поддержания электрической активности обонятельного эпителия и регистрации его ответов на запахи.Олфактометр включает двухканальный генератор газообразных пахучих стимулов, который обеспечивает воспроизводимость концентрационных и кинетических параметров стимулов с точностью ±5% и ±12 %, соответственно. С помощью разработанного олфактометра изучены электрические ответы обонятельного эпителия мыши на ряд синтетических пахучих веществ и синтетический феромон мышей 2-гептанон.3. На примере 2-гептанона с использованием ингибиторного анализа установлено, что распознавание социально-значимых запахов происходит при участии как минимум двух различных популяций хемосенсорных клеток - обонятельных нейронов с аденилатциклазным каскадом и клеток, использующих фосфолипазный каскад трансдукции. Создана математическая модель, адекватно описывающая ответы на запахи и позволяющая оценить вклад отдельных клеточных субпопуляций в генерацию суммарного ответа эпителия.4. Показано, что нокаут гена G-белка гастдуцина. модифицирует ответы на 2-

гептанон обонятельного эпителия мышей: Подобные изменения ответов наблюдаются при ингибировании фосфолипазы С в клетках эпителия мышей дикого типа. Это-свидетельствует о.том; что гастдуцин-положительные клетки, в которых функционирует фосфолипазный сигнальный каскад, могут специализироваться в распознавании этого и, возможно, других феромонов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Хохлов, Александр Анатольевич, Пущино

1. Бронштейн А.А. Обонятельные рецепторы позвоночных. // Л., «Наука»,.1977. 160.

2. Винников ЯЛ., Титова Л.К. Морфология органа обоняния. // М., «ГИ мед.Лит», 1957. 296.

3. Вулис Л.А., Кашкаров В.П. Теория струй вязкой жидкости. // М., «Наука», 1965. 331.

4. Гулаков И.Р., Холондырев СВ. Метод счета фотонов в оптико-физических измерениях. //Минск, «Университетское». 1989. 256.

5. Гутман A.M. Биофизика внеклеточных токов мозга. // М., «Наука», 1980.1841-,

6. Дулевич В.Е.,. Коростелёв А.А., Мельник Ю.А. и др. Теоретические основы радиолокации. // М., «Сов.радио». 1964. 731.

7. Жадин М.Н. Биофизические механизмы формирования электро-энцефалограммы. // М., «Наука», 1984. 196,

8. Зайдель А.Н. Ошибки измерений физических величин. // -Пб. «Лань», 2005. 112. Р. Идельчик И.Е. Справочник по гидравлическим сопротивлениям. // М. «Машиностроение», 1975. 574.

9. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. // М., «Мир», 1979. 280. И. Лойцянский Л.Г. Механика жидкости и газа. // М., «Наука», 1970. 905.

10. Минор А.С., Персод К.Ч. Оптическая регистрация как метод исследования ответов на пахучие вещества в обонятельной луковице. // Сенсорные системы. 2001. 15(3), 179-194.

11. Мирошников • М.М. Теоретические основы оптико-электронных приборов. // Л., «Машиностроение». 1988. 696.

12. Плонси Р., Барр Р. Биоэлектричество. Количественный подход. // М., «Мир», 1992. 366.

13. Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Яценко Ю.Е., Колесников С. Мониторинг выброса АТФ из одиночных клеток методом биосенсора. // Биологические мембраны. 2007. 24,333-339.

14. Сунцов Н.Н. Методы аналогий в аэрогидродинамике. // М., «Физматгиз», 1959. 319.

15. Тихонов В.И. Статистическая радиотехника. // М., «Сов.радио». 1966. 678.

16. Хохлов А.А., Колесников С. Установка для регистрации электроретинограммы. // Приборы и техника эксперимента. 2000. 2, 159-160.

17. Хохлов АА, Колесников СС. Установка для стимуляции и измерения электрической активности обонятельного эпителия. // Приборы и техника эксперимента. 2002. 6,113-117.

18. Хохлов А.А., Романов Р.А., Зубов Б.В., Пашинин А.Д., Колесников С. Осветитель на излучающих диодах для микрофотометрических исследований клеток. // Приборы и техника эксперимента. 2007. 3, 128-131.

19. Altenhofen W, Ludwig J, Eismann E, Kraus W, Bonigk W, Kaupp UB. 1991. Control of ligand specificity in cyclic nucleotide-gated channels from rod photoreceptors and olfactory epithelium. // Proc Nat. Acad Sci USA. 88-21, 9868-9872.

20. Bakalyar HA, Reed RR. Identification of a specialized adenylyl cyclase that may mediate odorant detection. // Science. 1990.250,1403-1406.

21. Balasubramanian S, Lynch JW, Barry PH. Calcium-dependent modulation of the agonist affinity of the mammalian olfactory cyclic nucleotide-gated channel by calmodulin and a novel endogenous factor. // J Membr Biol. 1996.152,13-23.

22. Baylor DA, Hodgkin AL, Lamb TD. The electrical response of turtle cones to flashes and steps of light. // J. Physiol. 1974. 242, 685-727.

23. Baryshnikov SG, Rogachevskaja OA, and Kolesnikov SS. // J. Neurophysiol. 2003. 90, 3283-3294.

24. Belluscio L, Gold GH, Nemes A, Axel R. Mice deficient in G0if are anosmic. // Neuron. 1998.20,69-81.

25. Lancet D, Ben-Arie N, Cohen S, Gat U, Gross-Isseroff R. Olfactory receptors: transduction, diversity, human psychophysics and genome analysis. // Ciba Found. Symp. 1993.179,131-141.

26. Bernhardt SJ, Nairn M, Zehavi U, Lindemann B. Changes in TP3 and cytosolic Ca2 + in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of sweet taste in the rat. // J Physiol. 1996. 490, 25-36.

27. Berridge M J. Inositol trisphosphate and calcium signaling. // Nature. 1993. 361(6410), 315-325.

28. Berridge MJ, Lipp P, and Bootman MD. The versatility and universality of calcium signaling. // Nature Rev Mol Cell Biol. 2000.1,11-21.

29. Blanchard DC. A simple method for the production of homogeneous water drops down to one micron radius. // Coll Sci. 1954. 9, 321-328.

30. Boekhoff I, Kroner C, Breer H. Calcium controls second messenger signalling in olfactory cilia. // Cell Signal. 1996. 8,167-171.

31. Borisy FF, Ronnett GV, Cunningham AM, Juilfs D, Beavo J, Snyder SH. Calcium/Calmodulin-activated phosphodiesterase expressed in olfactory receptor neurons //J.Neurosci. 1992. 12, 915-923.

32. Borisy FF, Hwang PM, Ronnett GV, Snyder SH. High affinity cyclic AMP phosphodiesterase and adenosine localized in sensory organs. // Brain Res. 1993. 610, 199-207.

33. Borisy FF, Ronnett GV, Cunningham AM, Juilfs D, Beavo J, Snyder SH. Calcium/calmodulin activated phosphodiesterase selectively expressed in olfactory receptor neurons. // J. Neurosci. 1991. 12, 915-23.

34. Breer H, Boekhoff I. Odorants of the same odor class activate different second messenger pathways. // Chem Senses. 1991. 16, 19-29.

35. Bruch RC. Signal transducing GTP-binding proteins in olfaction. // Comp.BiocheaPhysiol. 1990. 95A, 27-29.

36. Brunet LJ, Gold GH, Ngai J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. // Neuron. 1996.17, 681-693.

37. Buck L, Axel R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognishion. // Cell. 1991. 65, 175-187.

38. Buck LB. Information coding in the vertebrate olfactory system. // Annu Rev Neurosci. 1996. 19, 517-544.

39. Buiakova 01, Scott JW, Farbman A, Kream R, Grillo M, Franzen L, Richman M, Davis

40. M, Abbondanzo S, Stewart CL, Margolis FL. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. // PNAS. 1996. 93, 9858-9863.

41. Calof AL, Chikaraishi DM. Analysis of nuerogenesis in a mammalian neuroepithelium: proliferation and differentiation of an olfactory neuron precursor in vitro. // Neuron. 1989. 3,115-127.

42. Chaput MA, Chalansonnet M. Recording the slow potentials evoked by odors in the olfactory mucosa of awake animals. // J Neurosci Methods. 1997. 75,193-198.

43. Chaput MA. EOG responses in anesthetized freely breathing rats. // Chem Senses. 2000. 25,695-701.

44. Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A novel metabotropic glutamate receptor is a taste receptor for monosodium L-glutamate. // Nat.Neurosci. 2000. 3, 113-119.

45. Chen S, Lane AP, Bock R, Leinders-Zufall T, Zufall F. Bloking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "ГРЗ-odors". // J Neurophysiol. 2000. 84, 55-580.

46. Chen T.-Y., Yau K.-W. Direct modulation by Ca2 + calmodulin of cyclic nucleotide- activated channel of rat olfactory receptor neurons //Nature. 1994. 368, 545-548.

47. Chess A., Simon I., Cedar H., and Axel R. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. // Cell. 1994. 78, 823-834.

48. Cheesman GH, Kirkby HM. An air dilution olfactometer suitable for group threshold. // Quart J Elcp Psychop. 1959. 11, 115-123.

49. Clapp TR, Stone LM, Margolskee RF, bCinnamon SC. Immunocytochemical evidence for co-expression of Type Ш receptor with signaling components of bitter taste transduction. //Neuroscience. 2001. 6, 2-10.

50. Cometo-Muniz JE, Cain WS, Abraham MH. Quantification of chemical vapors in chemosensory research. //Chem Senses. 2003. 28, 467-477.

51. Cowan CM, Roskams AJ. Apoptosis in the mature and developing olfactory neuroepithelium. // Microsc Res Tech. 2002. 58, 204-215.

52. Daval G, Leveteau J, MacLeod P. Electro-olfactogramme local et discrimination olfactive chez la Grenouille. J Physiol (Paris). // 1970. 62,477-488.

53. Daval G, Leveteau J, MacLeod P. Analyse topographique de I'electro-olfactogramme chez la grenouille J Physiol (Paris). // 1980. 76, 559-567.

54. Day JA. Small droplets from rapturing air bubble films. // Rech Atmos. 1963.Г, 191-197.

55. Defer N, Best-Belpomme M, Hanoune J. Tissue specificity and physiological relevance of various isoforms of adenylyl cyclase. // Am J Physiol Renal Physiol. 2000. 279, 400-416.

56. Dravnieks A. Instrumental aspects of "olfactory research. // In: Methods in Olfactory Research (Moulton DG, Turk A, Jonllnston JW Jr., eds). // NY., Acad Press., 1975. 437.

57. Duchamp-Viret P, Chaput MA, Duchamp A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. // Science. 1999. 284,2171-2174.

58. Dulac C, Torello AT. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. //Nat Rev Neurosci. 2003. 4, 551-562.

59. Eggermont J. Calcium-activated Chloride Channels. (Un)known, (Un)loved? // Proc Am Thorac Soc. 2003. 1, 22-27.

60. Eldering HG. The theory of optimum spectral filtering. // Infr.Phys. 1964. 4, 231-237.

61. Elsaesser R, Montani G, Tirindelli R, Paysan J. Phosphatidyl-inositide signalling proteins in a novel class of sensory cells in the mammalian olfactory. // Eur J NeuroSci. 2005. 21, 2692-2700.

62. Ezeh PI, Scott JW, Davis LM. Regional distribution of rat electroolfactogram. // J Neurophysiol. 1995.73,2207-2220.

63. Finger T, Bottger B, Hansen A, Anderson KT, Alimohammadi H, Silver WL. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. // PNAS. 2003. 100, 8981-8986.

64. Firestein S, Shepherd GM, Werblin FS. Time course of the membrane current underlying sensory transduction in salamander ofactory receptor neurones. // J Physiol. 1990. 430, 135-158.

65. Firestein S, Shepherd GM. A kinetic model of the odor response in single olfactory receptor neurons. // J Steroid Biochem Mol Biol. 1991. 39, 615-620.

66. Firestein S, Werblin F. Odor-induced membrane currents in vertebrate olfactory receptor neurons. // Science. 1989. 244, 79-82.

67. Firestein S, Zufall F, Shepherd GM. Single odor sensitive channels in olfactory receptor neurons are also gated by cyclic nucleotides. // J.Neurosci. 1991. 11", 3565-3572.

68. Firestein S., Zufall F. The cyclic nucleotide gated channel of olfactory receptor neurons // Semin. Cell Biol. 1994. 5, 39-46.

69. Flaugh PL, O'Donnell SE, Asher SA. Development of a new optical wavelength rejection filters.//Appl.Spectrosc. 1984. 386, 847-850.

70. Friedrich RW, Korsching SI. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. // Neuron. 1997. 18, 737-752.

71. Frings S, Reuter D, Kleene SJ. Neuronal Ca -activated CI channels: homing in on an elusive channel species. // Prog Neurobiol. 2000.60, 247-289.

72. Getchell TV. Analysis of intracellular recordings from salamander olfactory epithelium. / /BrainRes . 1977. 123, 275-286.

73. Getchel TV, Shepherd GM. Adaptive properties of olfactory receptors analysed with odour pulses of varying durations. // J Physiol. 1978. 282, 541-560.

74. Getchell TV. Functional properties of vertebrate olfactory receptor neurons. // Physiol Rev. 1986. 66,772-818.

75. Getchell ML, Zielinski B, DeSimone JA, Getchell TV. Histological and histochemical studies of the secretory components of the salamander olfactory mucosa: effects of isoproterenol and olfactory nerve section. // J Comp Physiol. 1987.160,155-168.

76. Gibson AD, Garbers DL. Guanylyl cyclases as a family of putative odorant receptors. // Annu Rev Neurosci. 2000. 23, 417-439.

77. Gold GH. Controversial issues in vertebrate olfactory transduction. // Ann Rev Physiol. 1999.61,857-871.

78. Halpern M. The organization and function of the vomeronasal system. // Annu Rev Neurosci. 1987.10, 325-362.

79. Hayashi S, Hazama A, Dutta AK, Sabirov RZ, Okada Y. Detecting ATP release by a biosensor method. // Sci. STKE. 2004.258,114-119.

80. Haynes L, Yau KW. Cyclic GMP-sensitive conductance in outer segment membrane of catfish cones. //Nature. 1985. 317-6032,61-64.

81. Hazama A, Hayashi S, Okada Y. Cell surface measurements of ATP release from single pancreatic beta cells using a novel biosensor technique // Pflugers Arch. 1998. 437, 31-35.

82. Herness S, Zhao F, Kaya N, Lu S, Shen T, and Sun X. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. // J Physiol. 2002. 543, 601-614.

83. Holcomb JD, Mumm JS, Calof AL. Apoptosis in the neuronal lineage of the mouse olfactory epithelium: regulation in vivo and in vitro. // Dev Biol. 1995. 192, 307-323.

84. Hornung ЕЕ, Mozell MM. Factors influencing the differential sorption of odorant molecules across the olfactory mucosa. // J Gen Physiol. 1977. 69, 343-361.

85. Hosoya Y, Yoshida H. t-Fber die bioelektrische Erscheinung an der Riechschleimhaut. // Jpn J Med Sci Biol III Biophys. 1937. 5, 22-23.

86. Huang Y-J, Maruyama Y, Lu K-S, Pereira E, Plonsky I, Baur J.E, Wu D, Roper SD. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter // J. Neurosci. 2005. 25, 843-847.

87. Hume RI, Role LW, Fischbach GD. Acetylcholine release from growth cones detected with patches of acetylcholine receptor-rich membranes // Nature. 1983. 305,632-634.

88. Imanaka Y, Takeuchi H. Spiking Properties of Olfactory Receptor Cells in the Slice Preparation. // Chem Senses. 2001. 26, 1023-1027.

89. Ivic L, Pyrski MM, Margolis-JW, Richards LJ, Firestein S, Margolis FL. Adenoviral vector-mediated rescue of the OMP-null phenotype in vivo. // Nat Neurosci. 2000. 3, 1113-1120.

90. Jemiolo B, Harvey S, Novotny M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. // Proc. NatlAcad. Sci. USA. 1986. 83, 4576-4579.

91. Wachowiak M, Cohen LB. Representation of Odorants by Receptor Neuron Input to the Mouse Olfactory Bulb. //Neuron. 2001. 32, 723-735.

92. Jones DT, Masters SG, Bourne HR, Reed RR. Biochemical characterization of three stimulatory GTP-binding proteins. The large and small forms of Gs and the olfactory-specific G-protein, Golf. // J.Biol.Chem. 1990. 265, 2671-2676.

93. Jones DT, Reed RR. Golf. An olfactory neuron specific-G-protein involved in odorant signal transduction. // Science. 1989. 244,790-795.

94. Juilfs DM, FuUe H-J, Zhao AZ, Housley MD, Garbers DL, Beavo JA. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal. // PNAS. 1977. 94, 3388-3395.

95. Jung A, Lischka FW, Engel J, Schild D. Sodium/calcium exchenger In olfactory raceptor neurones of Xenopus laevis. //Neuroreport. 1994. 5,1741-1744.

96. Kauer JS, White J. Imaging and coding in the olfactory system. // An Rev Neuro Sci. 2001.24,963-979.

97. Kaupp U.B. Family of cyclic nucleotide gated ion channels // Curr. Opin. Neurobiol. 1995. 5, 434-442.

98. Kaur R, Zhu XO, Moorhouse AJ, Barry PH. IP3-Gated Channels and their Occurrence Relative to CNG Channels in the Soma and Dendritic Knob of Rat Olfactory Receptor Neurons. // JMembrBiol . 2001.181,91-105.

99. Kawai K, Sugimoto K, Nakashima K, Miura H, and Ninomiya Y. Leptin as a modulator of sweet taste sensitivities in mice. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97, 11044-11049.

100. Kent PF, Mozell MM, Murphy SJ, Hornung DE. The interaction of imposed and inherent olfactory mucosal' activity patterns and their composite representation in a mammalian species using voltage-sensitive dyes. // J Neurosci. 1996. 16,345-353.

101. Kent PF, Mozell MM. The recording of odorant-induced mucosal activity patterns with a voltage-sensitive dye. // J Neurophysiol. 1992. 68, 1804-1819.

102. Khayari A, Math F, Trotier D. Odorand-evoked potassium changes in the frog olfactory \ epithelium. // Brain Res. 1991. 539,1-5.

103. Kimbell JS, Godo MN, Gross EA, Joyner DR, Richardson RB, Morgan KT. Computer simulation of inspiratory airflow in all regions of the F344 rat nasal passages. // Toxicol Applied Pharmacol. 1997. 145, 388-398.

104. Kleene SJ. Origin of the chloride current in olfactory transduction // Neuron. 1993. 11, 123-132.

105. Kleene SJ. High-gain, low-noise amplification in olfactory transduction. // Biophys J. 1997.73,1110-1117.

106. Kolesnikov SS, Zhainazarov AB, Kosolapov AV. Cyclic nucleotide-activated channels in the frog olfactory receptor plasma membrane. // FEBS Lett. 1990. 266, 96-98.

107. Kramer RH, Siegelbaum SA. Intracellular Ca2+ regulates the sensitivity of cyclic nucleoti de-gated channels in olfactory receptor neurons. //Neuron. 1992. 9, 897-906.

108. Krautwurst D, Yau K-W, Reed RR. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. // Cell. 1998. 95, 917-926.

109. Kurakhashi T, Yau KW. Co-existence of cationic and chloride components in odorant- induced currant of vertebrate olfactory receptor cells. // Nature. 1993. 363, 71-74.

110. Kurakhashi T, Menini A. Mechanism of odorant adaptation in the olfactory receptor cell. //Nature. 1997. 385, 725-729.

111. Leinders-Zufall T, Ma M, Zufall F. Impaired odor adaptation in olfactory receptor neurons after inhibition of Ca /Calmodulin kinase II. // J Neurosci. 1999. 19,1-8.

112. Leinders-Zufall T, Rand MN, Shepherd GM, Greer CA, Zufall F. Calcium entry through cyclic nucleotide-gated channels in individual cilia of olfactory receptor cells: spatiotemporal dynamics. // J Neurosci. 1997.17,4136-4148.

113. Levy NS, Bakalyar HA, Reed RR. Signal transduction in olfactory neurons // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 39, 633-637.

114. Lide DR (ed). Handbook of Chemistry and Physics. // NY. «CRC-press», 1971. 761.

115. Lin W, Arellano J, Slotnick B, Restrepo D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. // J Neurosci. 2004. 24, 3703-3710.

116. Lin W, Margolskee R, Donnert G, Hell SW, Restrepo D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. // PNAS. 2007. 104, 2471-2476.

117. Lischka FW, Zviman MM, Teeter JH, Restrepo D. Characterization of Inositol-1,4,5- Trisphosphate-Gated Channels in the Plasma Membrane of Rat Olfactory Neurons. // Biophys J. 1999. 76,1410-1422.

118. Liu D, Liman ER. Intracellular Ca2+ and the phospholipids PIP2 regulate the taste transduction ion channel TRPM5. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003.100,15160-15165.

119. Lowe G, Gold GH. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. // J Physiol. 1991. 442, 147-168.

120. Lucas Ph, Ukhanov K, Vrese Leinders-Zufall T, Zufall F. A Diacylglycerol-Gated Cation Channel in Vomeronasal Neuron Dendrites Is Impaired in TRPC2 Mutant Mice: Mechanism of Pheromone Transduction. //Neuron. 2003. 40, 551-561.

121. Mackay-Sim A, Kesteven S. Topographic patterns of responsiveness to odorants in the rat olfactory epithelium. // J Neurophysiol. 1994. 71, 150-160.

122. Mackay-Sim A, Shaman P, Moulton DG. Topographic coding of odorant quality: patterns of epithelial responsivity in the salamander. // J Neurophysiol. 1982. 48, 584-596.

123. Mackay-Sim A, Shaman P. Topographic coding of odorant quality is maintained at different concentration in the salamander olfactory epithelium. // Brain Res. 1984. 297, 207-216.

124. Marchand J.E., Yang X., Kauer J.S. Zonal expression patterns of olfactory receptors in salamander epithelium using gene specific probes. // Chem Senses. 2001. 26,1044.

125. Morimoto T, Popov S, Buckley KM, Poo MM. Calcium-dependent transmitter secretion from fibroblasts: modulation by synaptotagmin I. //Neuron. 1995. V. 15. P. 689-696.

126. Masukawa LM, Kauer JS, Shepherd GM. Intracellular recordings from two cell'types in an in vitro preparation of the salamander olfactory epithelium. // Neurosci Lett. 1983. 35, 59-64.

127. Mombaerts P. Mollecular biology of odorant receptors in vertebrates. // An Rev Neuro Sci. 1999. 22,487-509.

128. Mombaerts P, Wang F, Dulac C, Chao SK, Nemes A, Mendelsohn M, Edmondson J, Axel R. Visualizing an olfactory sensory map. // Cell. 1996. 87, 675-686.

129. Morimoto T, Popov S, Buckley KM, Poo MM. Calcium-dependent transmitter secretion from fibroblasts: modulation by synaptotagmin I // Neuron. 1995. 15, 689-696.-

130. Moulton DG, Beidler LM. Structure and function in the peripheral olfactory system. // Physiol Rev. 1967.47,1-52.

131. Mozell MM. Olfactory mucosal and neural responses in the frog. // Am J Physiol. 1962. 203, 353-358.

132. Mozell MM. Evidence for sorption as a mechanism of the olfactory analysis of odors. // Nature. 1964. 203,1181-1182.

133. Mozell MM. Evidence of a chromatographic model of olfaction. // J Gen Physiol. 1970. 56,46-63.

134. Mustaparta H. Spatial distribution of receptor-responses to stimulation with different odours. //Acta Physiol Scand. 1971. 82,154-166.

135. Nakamura Г., Gold G.H. A cyclic nucleotide-gated conductance in olfactory receptor cilia//Nature. 1987. 325, 442-444.

136. Ngai J, Dowling MM, Buck L, Axel R, Chess A. The family of genes encoding odorant receptors in the channel catfish. // Cell. 1993. 72, 657-666.

137. Noe J, Tareikis, E, Boekhoff I, Breer H. Sodium/calcium exchenger in rat olfactory neurons. // Neurochem Int. 1997. 30, 523-531.

138. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca in taste cells via activation of muscarinic receptors. // J Neurophysiol. 2002. 87, 2643-2649.

139. Okano M, Takagi SF. Secretion and electrogenesis of the supporting cell in the olfactory epithelium. // J Physiol. 1974. 242, 353-370.

140. Ottoson D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. // Acta Physiologica Scandinavica. 1956. 35 (122), 1-83.

141. Ottoson, D. The electro-olfactogram: A review of studies on the receptor potential of the olfactory organ. // In: Handbook of sensory physiology V.4. (Beidler LM, ed). Berlin, Springer-Verlag, 1971. 95-131.

142. Parmentier M, Libert F, Schurmans S, Schiffmann S, Lefort A, Eggerickx D, Ledent C, Mollereau C, Gerard C, Perret J. Expression of members- of the putative olfactory in mammalian cells. //Nature. 1992. 355, 453-455.

143. Paysan J, Breer H. Molecular physiology of odor detection: current views. // Eur J Physiol. 2001. 411, 579-586.

144. Pifferi S. Pascarella G, Boccaccio A, Mazzatenta A, Gustincich S, Menini A, Zucchelli S. Bestrophin-2 is a candidate calcium-activated chloride channel involved in olfactory transduction. //PNAS. 2007.103,12929-12933.

145. Potter H, Chorover SL. Response plasticity in hamster olfactory bulb: peripheral and central processes.//Brain-Res. 1976.116,417-429.

146. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig A, Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to rapid changes in Ca2+.i.//PNAS.2003. 100, 15166-15171.

147. Reisert J, Bauer PJ,' Yau K-W, Frings S. The Ca-activated CI channel and its control in rat olfactory receptor neurons. // J Gen Physiol. 2003. 122, 349-364.

148. Reisert J, Matthews HR. Na+-dapandant Ca + extrusion governs response.recovery in frog olfactory, racaptor calls. // J Gen Physiol. 1998. 112, 529-535.

149. Reisert J, Yaul K-W, Margolis FL. Olfactory marker protein modulates the cAMP kinetics of the odour-induced response in cilia of mouse olfactory receptor neurons. // J Physiol. 2007. 585, 731-740.

150. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. // Cell. 1993. 73, 597-609.

151. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB. Information coding in the olfactory system: Evidence for a stereotyped and highly organized epitope map in the olfactory bulb. // Cell. 1994. 79, 1245-1255.

152. Restrepo D., Miyamoto Т., Bryant B.P., Teeter J.H. Odor stimuli trigger influx of calcium into olfactory neurons of the channel catfish // Science. 1990. 249,1166-1168.

153. Restrepo D., Okada Y., Teeter J.H. Odorant-regulated* Ca2 + gradietns in rat olfactory neurons // J. Gen. Physiol. 1993. 102, 907-924.

154. Romanov RA, Rogachevskaja OA, Bystrova MF, Jiang P, Margolskee RF, Kolesnikov SS. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells // EMBO J. 2007. 26, 657-667.

155. Ronnett GV, Parfitt DJ, Hester LD, Snyder SH. Odorant-sensitive adenilate cyclase: rapid, potent activation and desensitization in primary olfactory neuronal cultures. // PNAS. 1991. 88, 2366-2369.

156. Sbarbati F Osculati A. The taste cell-related diffuse chemosensory system. // Progress in Neurobiology. 2005/ 75, 295-307.

157. Sbarbati A, Merigo F, Benati< D, Tizzano M, Bernard! P, Crescimanno C, Osculati F. Identification and characterization of a specific sensory epithelium in the rat larynx. // J Comp Neurol. 2004. 475,188-201.

158. Scalia F, Winans SS. The differential projections of the olfactory bulb and the accessory olfactory bulb in mammals. // J Comp Neurol. 1975. 161, 31-55.

159. Scherberger RF, Happ GP, Miller FA, Fasset DW. A dynamic apparatus for preparing air-vapor mixtures of known concentrations. // Ind Hyg J. 1958. 19,494-498.

160. Schild D, Restrepo D. Transduction Mechanisms in Vertebrate Olfactory Receptor Cells. // Physiol.Rev. 1998. 78,429-466.

161. Schwartz EA. Depolarization without calcium can release gamma-aminobutyric acid from a retinal neuron // Science. 1987. 238, 350-355.

162. Scott JW, Brierley T. A functional map in rat olfactory epithelium. // Chem Senses. 1999. 24, 679-690.

163. Scott JW, Davis LM, Shannon D, Kaplan C. Relation of chemical structure to spatial distribution of sensory responses in rat olfactory epithelium. // J Neurophysiol. 1996. 75, 2036-2049.

164. Scott JW, Scott-Johnson PE. The electrolfactogram: A review of its history and uses. // Microsc Res Tech. 2002. 58,152-160.

165. Scott JW, Shannon DE, Charpentier J, Davis LM, Kaplan С Spatially organized response zones in rat olfactory epithelium. // J Neurophysiol. 1997. 77, 1950-1962.

166. Scott-Johnson PE, Blakley D, Scott JW. Effects of air flow on rat electroolfactogram. // Chem Senses. 2000. 25, 761-768.

167. Sipior J, Carter GM, Lakowicz JR, Rao G. Blue light-emithing diode demonstrated as an ultraiolet excitation source for nanosecund phase-modulation fluorescence lifetime measurements. // Rev.Sci.Instrum. 1997. 68, 2666-2670.

168. Sklar, P.D., Anholt, R.H. & Snyder, S.H. The odorant-sensitive adenylate cyclase of olfactory receptor cells: different stimulation by distinct classes of odorants. // J.Biol.Chem. 1986. 261,15538-15543.

169. Spehr M, Spehr J, Ukhanov K, Kelliher KR, Leinders-Zufall T, and Zufall F. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. // Cell Mol Life Sci. 2002. 63,1476-1484.

170. Stewart WB, Kauer JS, Shepherd GM. Functional organization of rat olfactory bulb analyzed by the 2-deoxyglucose method. // J. Сотр. Neurol. 1979.185,715-734.

171. Tachibana M, Okada T. Release of endogenous excitatory amino acids from ON-type bipolar cells isolated from the goldfish retina. // J. Neurosci. 1991. 11, 2199-2208.

172. Thommesen G, Doving KB. Spatial distribution of the EOG in the rat; a variation with odour quality. // Acta Physiol Scand. 1977. 99, 270-280.

173. Trinh K, Storm DR. Vomeronasal organ detects odorants in absense of signaling through main olfactory system. //Nat Neurosci. 2003. 6, 519-525.

174. Trotier D, MacLeod P. Intracellular recordings from salamander olfactory receptor cell. // Brain Res. 1986. 374, 205-211.

175. Trotier D. Electrophysiological properties of frog olfactory supporting cells. // Chem Senses. 1998. 23, 363-369.

176. Tucker D, Shibuya T. A physiologic and pharmacologic study of olfactory receptors. // Cold Spr Harb Symp Quant Biol. 1965. 30,206-215.

177. Ussing HH, Zerahn K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. // Acta Physiol Scand. 1951. 23,110-127.

178. Van As W, Kauer JS, Menco BPM, Koster EP. Quantitative aspects of the electro- olfactogram in the tiger salamander. // Chem Senses. 1985. 10,1-21.

179. Vassar R, Ngai J, Axel R. Spatial segregation of odorant receptor expression- in- the mammalian olfactory epithelium. // Cell. 1993. 74, 309-318.

180. Vogalis F, Hegg CC, Lucero MT. Ionic conductances in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. // J Physiol. 2005. 562(3), 785 - 799.

181. Wayman GA, Impey S, Storm DR. Ca2+ inhibition of type Ш adenylyl cyclase in vivo. // J. Biol. Chem. 1995. 270 , 21480-86.

182. Wei J, Wayman GA, Storm DR. Phosphorylation and inhibition f type Ш adenylyl cyclase b calmodulin-dependent protein kinase П in vivo. // J Biol Chem. 1996. 271, 24231-24235.

183. Wong ST, Trinh K, Hacker B, Chan GCK, Lowe G, Gaggar A, Xia Z, Gold GH, Storm DR. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in trans-genic mice. Neuron. 2000. 27, 487-497.

184. Yan C, Zhao AZ, Bentley JK, Lougheny K, Ferguson K, Beavo JA. Molecular cloning and characterisation of a calmodulin-dependent phosphodiesterase enriched in olfactory sensory neurons. //PNAS. 1995. 92, 9677-9681.

185. Young SH, Poo M. Spontaneous release of transmitter from growth cones of embryonic neurones //Nature. 1983. 305, 634-637.

186. Youngentob SL , Margolis FL. OMP gene deletion causes an elevation in behavioral threshold sensitivity. //Neuroreport. 1999. 10,15-19.

187. Youngentob SL, Kent PF, Sheehe PR, Schwob JE, Tzoumaka E. 1995. Mucosal inherent activity patterns in the rat, Evidence from voltage-sensitive dyes. // J Neurophysiol. 73, 387-398.

188. Youngentob SL, Kent PF. Enhancement of odorant-induced mucosal activity patterns in rats trained on an odorant identification task. // Brain Res. 1995. 670, 82-88.

189. Youngentob SL, Margolis FL, Youngentob LM. OMP gene deletion results in an alteration in odorant quality perception. //Behav Neurosci. 2001. 115, 626-631.

190. ZagottaWN, Sigelbaum SA. Structure and function of cyclic nucleotide-gated channels. // Annu.Rev.Neurosci. 1996. 19, 235-263.

191. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D, Zuker CS, Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes, Different receptor cells sharing similar signaling pathways. // Cell. 2003. 112, 293-301.

192. Zufall F, Leinders-Zufall T. Identification of a long-lasting form of odor adaptation that depends on the carbon monoxide/cGMP second-messenger system. // J Neurosci. 1997. 17, 2703-2712.

Информация о работе

Хохлов, Александр Анатольевич
кандидата физико-математических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Системы для анализа физиологической активности хемосенсорных клеток, разработка и применение в физиологическом эксперименте - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы