Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов химическими и иммунохимическими методами

Волкова, Рауза Асхатовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов химическими и иммунохимическими методами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов химическими и иммунохимическими методами"

На правах рукописи ии- "

Волкова Рауза Асхатовна

СИСТЕМА КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ХИМИЧЕСКИМИ И ИММУНОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2009

1 9 (-¡ОЯ ?п

003483604

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное Государственное учреждение науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится 10 декабря 2009г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребиадзора.

Автореферат разослан «_»_2009г.

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук

[Кектимиров Тагир Абдуллаевич| Петухов Валерий Георгиевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор биологических наук Доктор биологических наук

Далин Михаил Викторович Лютов Андрей Германович Куралесова Альбина Ивановна

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

О.Ю.Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Широкое применение медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), направленных на профилактику, лечение и диагностику инфекционных заболеваний, определяет повышенные требования к их эффективности и безопасности.

В современных условиях рынок иммунобиологических препаратов является международным, требования к их качеству регламентируются соответствующими международными правилами как на этапах лабораторных исследований - правила GLP (Good Laboratory Practice) и клинических испытаний - правила GCP (Good Clinical Practice), так и на этапе производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice).

Соблюдение международных правил обязательно для всех стран входящих в мировую систему ВТО (Всемирная торговая организация). Россия предпринимает меры по вхождению в ВТО и, следовательно, требуется организация работ по выполнению требований GLP, GCP и GMP как со стороны разрабатывающих и выпускающих МИБП организаций, так и со стороны ГИСК имЛ.А.Тарасевича.

В Российской Федерации в этом плане достигнуты определенные позитивные сдвиги. Так, утвержден ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля лекарственных средств», положения которого гармонизированы с Руководством GMP, принятым в Европейском союзе. Выполнение этих стандартов гарантирует высокий уровень осуществляемых функций предприятием и контролирующими органами.

Правила GMP устанавливают требования к персоналу, помещениям, оборудованию, документации, производству продукции, проведению анализов, системе обеспечения и контроля качества и др.

Анализ современного состояния вопроса о контроле качества свидетельствует о том, что эта деятельность базируется на нескольких элементах, в том числе: методики, валидация, техническое обеспечение/оборудование, стандартные образцы, документирование, персонал.

В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание, принята система мер по повышению качества лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения и микробиологической промышленности.

Одним из основных элементов системы обеспечения качества является валидация - составляющая GMP, которая подтверждает, что поддерживающие системы, оборудование, процессы и методы контроля находятся на должном уровне, поэтому производится продукт, соответствующий требованиям нормативной документации (WHO TRS 822, ГОСТ Р 52249, СП 3.3.2.1288).

Аналитические методы позволяют судить об адекватности функционирования системы производства.

мость валидации аналитических методов при контроле МИБП определена международными документами, рекомендациями Всемирной организации здравоохранения, а также отечественными нормативными документами.

В мировой практике разработка, промышленное освоение и методы контроля современных МИБП носят наукоемкий характер. Расширение номенклатуры МИБП, понимание механизмов иммунного ответа на молекулярном уровне, использование достижений генной инженерии требует разработки новых методов контроля или расширения области применения существующих, повышает требования к уровню их разработки, прежде всего, с учетом современных требований валидации. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой - Великобритании, Германии, Голландии, США и др.

Применение валидированных и стандартизованных методов является одним из необходимых условий выполнения международных стандартов ОЬР, вСР и йМР в Российской Федерации, а также требований к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. Однако в настоящее время применительно к контролю МИБП нет единого мнения, как устанавливать валидационные характеристики. Более того, понимание терминов еще не однозначно и окончательно не сложилось.

Контроль качества МИБП не может проводиться без стандартных образцов, которые используются и как мера сравнения, и для внутрилабораторного контроля качества работы аналитической лаборатории. В отсутствии эталонов порядок аттестации стандартных образцов становится не простой задачей, основой для создания стандартных образцов становится сама измерительная процедура. Аттестация должна проводиться валидированными методами, поскольку только при этом условии можно обеспечить корректное установление доверительного интервала для аттестованной характеристики стандартного образца и результата анализа, полученного при его использовании.

В связи с этим разработка методологии валидации и аттестации стандартных образцов МИБП, а также методических основ контроля качества МИБП с использованием современных химических, иммунохимических, молекулярно-биологических методов является актуальным.

Как известно, при разработке, производстве и контроле качества МИБП активно используются такие химические методы, как определение белка, консервантов, сорбента, иммунохимические методы, интенсивно разрабатываются и внедряются методы на основе амплификации ДНК. В связи с усовершенствованием приборной, реагентной базы возникает необходимость модернизации известных методов и разработки новых. С другой стороны, возрастающие научно-методические и технологические возможности конструирования новых МИБП, средств для генной терапии, в том числе получаемых с помощью методов современной биотехнологии и на-нотехнологии, остро ставят задачу совершенствования системы контроля медицинских препаратов. Поскольку эта проблема является многоплановой, т.к. включает научный, технологический, технический, человеческий факторы, то ее решение может быть постепенным. С нашей точки зрения, в первую очередь внимание должно

быть направлено на методики, их валидацию, внедрение и создание стандартных образцов. Одновременно такие исследования в большой степени помогли бы сформировать новое поколение специалистов, востребованных в сфере разработки, производства и контроля качества МИБП.

В связи с этим цель работы состояла в создании методологической базы контроля качества МИБП как основного элемента системы контроля качества данных препаратов.

Цель исследования

Создание методологической базы системы контроля качества МИБП на модели химических и иммунохимических методов.

Задачи исследования

• Разработка методологии валидации стандартизованных (определение белкового азота с реактивом Несслера и Ви-антигена методом РИЭФ) и вновь разрабатываемых методов контроля МИБП на примере определения БСА методом РИЭФ и ИФА, мертиолята атомно-абсорбционной спектрометрией, хлороформа колориметрическим методом, фенола методом ГЖХ.

Разработка стандартных образцов для определения показателей качества МИБП - содержания Ви-антигена, белка, БСА.

• Создание стандартных образцов для оценки работы лабораторий по контролю качества МИБП ГИСК имЛА.Тарасевича и предприятий-изготовителей МИБП на примере стандартных образцов содержания белкового азота, алюминия, мертиолята, молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов. .„

• Валидация ПЦР тест-систем на примере набора реагентов «АмплиСенс НВУ Монитор БЯТ» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ) для количественного определения ДНК вируса гепатита В в плазме крови человека.

Научная новизна исследования.

Впервые в отечественной практике разработана методология валидации стандартизованных и вновь разрабатываемых химических методов контроля МИБП. Установленные с использованием данного подхода показатели точности методик позволяют использовать научно обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП.

Впервые показана значимость предложенной методологии валидации химических методов контроля для стандартизации контроля количественных ПЦР тест-систем.

Впервые в области контроля МИБП внедрены стандартные образцы для оценки правильности определения белкового азота в очищенных анатоксинах, вакцинах, аллергенах, а также мертиолята и алюминия в сорбированных препаратах; показана целесообразность применения стандартных образцов для оценки соответствующих анализов в межлабораторных испытаниях.

Разработаны стандартные образцы как мера сравнения для определения специфически активного компонента (Ви-антигена, белка в иммуноглобулинах), приме-

си (БСА), стандартный образец для калибрования хроматографической системы при определении показателя «молекулярные параметры» в иммуноглобулинах.

Разработаны с учетом требований валидации методики количественного определения БСА методом РИЭФ, мертиолята с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-г.ЭТА, хлороформа по цветной реакции с резорцином, использующиеся при контроле МИБП.

Теоретическая значимость работы.

Теоретическая значимость работы определяется формированием научных основ методологии валидации химических и иммунохимических методов, использующихся в системе контроля качества МИБП, что необходимо для осуществления статистического подхода к контролю качества.

Практическая значимость работы

Практическая значимость работы определяется внедрением системы контроля качества МИБП на основе использования стандартных образцов и химических и иммунохимических методик с установленными валидационными характеристиками в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП.

Использование аттестованных образцов позволило стандартизовать условия проведения соответствующих анализов при контроле МИБП (определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине, белкового азота, мертиолята и алюминия в полуфабрикатах и готовой продукции анатоксинов и вакцин, БСА в культуральных вирусных вакцинах, белка и молекулярных параметров в препаратах иммуноглобулинов, аналитической чувствительности ПЦР тест-систем для выявления ДНК вируса гепатита В) на предприятиях по производству МИБП и ГИСК им. ЛА.Тарасевича и получать объективные данные.

Применение разработанных и охарактеризованных на основе проведенной валидации химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволило унифицировать определение БСА, мертиолята и хлороформа, а также использовать обоснованные критерии для сравнения результатов контроля в ГИСК им. ЛА.Тарасевича и на предприятиях-изготовителях МИБП при определении белкового азота, мертиолята, алюминия, БСА, белка с биуретовым реактивом.

Внедрение в практику результатов работы

ОСО содержания Ви-антигена (ОСО 42-28-383-2005) используется при контроле качества брюшнотифозной вакцины «Вианвак» (ФСП 42-0112-0274-05).

ОСО содержания белка в иммуноглобулинах (ОСО 42-28-340-08П) и ОСО для калибрования хроматографической колонки (ОСО 42-28-301-06П) используются при контроле зарубежных и выпускаемых в Российской Федерации препаратов иммуноглобулинов (ФСП 42-0504-6733-05, ФСП 42-0504-6732-05 и др.).

ОСО содержания БСА (ОСО 42-28-328-07) используется при контроле качества культуральных вирусных вакцин: герпетических (ФСП 42-0107-4707-03, ФСП 42-0022-3841-03), антирабических (ФСП 42-4046-07, ФСП 42- 0504- 7029-05), вакцины против клещевого энцефалита (ФСП 42-0070-5497-04), вакцины гепатита А (ФСП 42-0168-0478-06).

ОСО содержания белкового азота (ОСО 42-28-322-06П) используется для контроля правильности проведения анализа в полуфабрикатах анатоксинов и вакцин; в неинфекционных аллергенах (ФСП 42-0504-3763-04, ФСП 42-0504-3762-04, ФСП 42-0504-3764-04, ФСП 42-0010-1828-01, ФСП 42-0010-1739-01 и др.) используется ОСО содержания белкового азота ОСО 42-28-303-04.

ОСО содержания мертиолята (ОСО 42-28-334-09П, ОСО 42-28-334а-9П) и ОСО содержания алюминия (ОСО 42-28-ЗЗЗа-09П и ОСО 42-28-333-09П) используются для контроля правильности проведения соответствующих анализов в сорбированных препаратах (анатоксины и АКДС вакцины по ФСП 42-0504-5805-04, ФСП 42-0504-5804-04, ФСП 42-0504-4423-04, ФСП 42-0504-4424-04; ФСП 42-0010-437703, ФСП 42-0010-4375-03, ФСП 42-0010-4376-03; вакцины гепатита В по ФСП РШ00738/01-191107, ФСП 42-0505-5653-0 и др.).

ОСО содержания ДНК гена НВзА§ вируса гепатита В (ОСО 42-28-332-2007П) используется при контроле ПЦР тест-систем для выявления данного возбудителя в плазме и сыворотке крови человека (ФСР 2007/00584, ФСР 2007/00585, ФСР 2007/00586, ФСР 2007/00813).

Разработанные ОСО внесены в Реестр Национальных стандартов МИБП.

Определение БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза включено в МУК 4.1/4.2.588-96, ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» и проект общей фармакопейной статьи в ГФ XII (том 3), введено в НД на 6 культуральных вирусных вакцин на пяти производствах. Валидированная ИФА тест-система для определения БСА введена в НД на 3 живые культуральные вирусные вакцины (ФСП 42-0504-7362-06, ФСП 42-2975 -07, ФСП 42-0504-0988-07, ФСП 420504-0368-07). Колориметрический метод определения хлороформа введен в НД на 5 наименований антитоксических сывороток на трех производствах (ФСП 42-05046761-05, ФСП 42-0504-6561-05, ФСП 42-0504-5438-04, ФСП 42-0504-0745-05, ФСП 42-0504-3277-04).

Определение мертиолята с помощью атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-г.ЭТА включено в проект общей фармакопейной статьи для ГФХП (том 3) и используется при контроле мертиолята в МИБП в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

На основе материалов диссертации разработаны Методические указания 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М.,2004, а также проект общей фармакопейной статьи по валидации методов для ГФ XII. Материалы диссертации включены в лекции на ежегодном семинаре ГИСК им. Л.А.Тарасевича по вМР для сотрудников предприятий-изготовителей МИБП и использованы на обучающем семинаре ВОЗ по системе регулирования вакцин для Национальных органов контроля стран СНГ (г.Алма-Ата, 2008 г.).

Совокупность новых научных результатов, выносимых на защиту

1. Разработанная методология валидации химических методов контроля качества МИБП позволяет в соответствии с современными международными требова-

ниями оценить прецизионность, диапазон линейности и пределы определения стандартизованных и вновь разрабатываемых химических, иммунохимических, мо-лекулярно-биологических методов при количественном определении специфически активного компонента, консервантов и примесей.

2. Разработанные на основе методологии валидации методы оценки качества МИБП по содержанию Ви-антигена, БСА, хлороформа, мертиолята обеспечивают достоверность и воспроизводимость контроля МИБП в ГИСК и на предприятиях-изготовителях МИБП.

3. Разработанные ОСО содержания Ви-антигена, белка, БСА позволяют стандартизовать методы контроля специфически активного компонента и гетерологичных примесей МИБП.

4. Разработанные ОСО содержания белкового азота, ОСО содержания мертиолята и ОСО содержания алюминия позволяют проводить оценку стабильности результатов аналитической лаборатории при контроле данных показателей, а также проводить оценку работы аналитических лабораторий в межлабораторных испытаниях.

Личный вклад автора

Основные результаты получены в лаборатории биохимии и биотехнологии ГИСК им.Л.А.Тарасевича самостоятельно и под руководством автора в рамках исследований в соответствии с основными планами научных исследований ГИСК им.Л.А.Тарасевича - договора №№ 737/089/024 и 034/089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

Апробация материалов диссертации

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора - протокол № 9 от 23 июня 2009 г. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на VII и VIII съездах Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 1997, 2002 гг.; Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2007 гг.; Всероссийских конференциях по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004, 2006, 2008 гг.; Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005 г.; конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 2006 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 36 научных работ, в статьях -18 (в том числе 8 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 10 - в периодических издани-

ях), в материалах всероссийских и международных конференций - 14, Общая Фармакопейная статья - 1, методических указаний, утвержденых МЗ РФ - 1, методических рекомендаций, утвержденых Роспотребнадзором РФ - 1, утвержденных ГИСК им.Л.А.Тарасевича -1.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 275 источников, в том числе 90 -отечественных и 185 - зарубежных. Работа изложена на 276 страницах машинописного текста, включает 86 таблиц, 33 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования

Вакцины паротитная, коревая, паротитно-коревая и полуфабрикаты к ним, АКДС, АС, АД, АДС, антитоксические сыворотки (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулинические, противозмеиная) производства ФГУП «НПО «Микроген». Вакцина «Вианвак» и полуфабрикат к ней, производство ООО «Грит-вак». Вакцина «Typhim Vi» («Тифим Ви») производства Авентис Пастер, Франция. АКДС вакцина, анатоксины: дифтерийный, столбнячный, дифтерийно-столбнячный производства ОАО «Биомед» им.И.И.Мечникова, Петрово-Дальнее (далее «Био-мед»). Вакцины герпетическая, антирабическая, гриппозные, против клещевого энцефалита, гепатита В, гепатита А различных изготовителей.

Сыворотка прецишггирующая белки сыворотки крови рогатого скота (СРС) адсорбированная кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая и сыворотка преципитирующая белки сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС) кроличья диагностическая для судебно-медицинских целей жидкая, производство ФГУП Санкт-Петербургский НИИВС.

Сыворотка кроличья против Ви-антигена производство ООО «Гритвак».

Наборы для определения БСА производства фирмы "Cygnus Technologies, Inc.", США.

Наборы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) «АмплиСенс HBV Монитор FRT» производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ.

Международный стандартный образец ДНК вируса гепатита В (National Institute of Biological Standards and Control (NIBSC), Великобритания), содержащий вирус гепатита В генотип А, субтип adw2 - 5x105 международных единиц в ампуле (МЕ/амп).

Образцы от больных гепатитом В для ПЦР исследований были предоставлены клиническими инфекционными больницами № I и № 2 г.Москвы.

Препарат рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующей области HBsAg и HBcAg вируса гепатита В, любезно предоставлен к.м.н. Шипулиным Г.А., ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ.

Методы исследования

Определение химических показателей: общего и белкового азота с реактивом Несслера, белка по методу Лоури, белка с биуретовым реактивом, ионов алюминия комплексонометрическим методом, молекулярных параметров полисахаридов и иммуноглобулинов методом гель-фильтрации проводили по ФС 42-3874-99. Определение Ви-антигена проводили методом РИЭФ по ФСП 42-0112-0274-05.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографе 2695 «Alliance» фирмы Waters, США с детектором с фотодиодной матрицей, системой Empower, колонкой TSK-G 3000 SWXL, размером 7,8 х 300 мм, диаметром частиц 5 мкм с предколонкой.

Определение фенола методом ГЖХ проводили на хроматографе Fisons 8000 (Великобритания) с пламенно-ионизационным детектором, колонка SE-54 (неподвижная фаза - неполярный силиконовый каучук) диаметром 0,15 мм и длиной 20 м.

ИФА проводили в соответствии с инструкцией по применению набора «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США).

ПЦР проводили в соответствии с инструкциями по применению наборов «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) и «Cobas Amplicor HBV Monitor test» ( «Хоффманн JIa-Рош», Швейцария).

Рестрикционный анализ плазмиды рВН320 проводили согласно общепринятой методике [Маниатис Т., 1984].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Excel: расчет среднего арифметического, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего, достоверности различия средних, регрессионный анализ, дисперсионный анализ [Гланц С., 1999, Дерффель К., 1994].

Расчеты линейности и параллелизма при аттестации стандартных образцов проводили по программе «Паралайн» [Петухов, 2004].

Приготовление лиофилизированного ОСО содержания БСА для метода РИЭФ было проведено совместно с предприятием по производству бакпрепаратов Белорусского НИИЭМ.

Разработка программы проведения межлабораторпых испытаний определения белкового азота в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725 и статистическая обработка полученных результатов была проведена совместно с группой специалистов лаборатории метрологии ВНИИНП (руководитель - Гринэ М.М.).

Экспериментальные материалы, необходимые для аттестации ОСО содержания Ви-антигена и валидации метода РИЭФ для определения Ви-аитигена были получены совместно с сотрудниками лаборатории иммупохимической диагностики НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН РФ.

Экспериментальные материалы, необходимые для проведения валидации ИФА тест-системы "Cygnus Technologies, Inc.", США, были получены совместно с сотрудниками иммупохимической лаборатории Московского подразделения но производству бактерийных препаратов ФГУП «НПО «Микрогсн» МЗ РФ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ОЦЕНКИ ВАЛИДАЦИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СТАНДАРТИЗОВАННЫХ ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП.

1.1.Определение белкового азота с реактивом Несслера.

Содержание белкового азота отражает количество специфически активного вещества в анатоксинах (стандартизуются по активности на единицу содержания белкового азота) и аллергенах (стандартизуются по содержанию белкового азота). Определение белкового азота проводят после предварительного осаждения белка и его минерализации. Белковый состав анализируемых препаратов существенно различается, поэтому различаются способы осаждения белка: с помощью ТХУ для высокомолекулярных белков (для анатоксинов и вирусных вакцин) и с помощью ФВК для пептидов и низкомолекулярных белков (для аллергенов). Методики являются трудоемкими, состоят из нескольких этапов и занимают 5-6 дней. В связи с этим для контроля правильности определения белкового азота было необходимо разработать ОСО для обоих вариантов методики и с их использованием установить валидацион-ные характеристики в соответствии с современными требованиями.

1.1.1. Разработка стандартного образца для контроля правильности определения белкового азота.

Для неинфекционных аллергенов ОСО был разработан на основе амброзийно-го аллергена - ОСО(1), для остальных препаратов ОСО был разработан на основе раствора БСА (растворитель - 0,15 % калия хлорид, 0,01 % натрия гидрокарбонат, рН 6,8) - ОСО(И). Аттестованные характеристики стандартных образцов были определены в межлабораторных испытаниях с участием лабораторий, проводящих соответствующие виды анализа. Аттестованную характеристику устанавливали как интервал, в который должны укладываться результаты исполнителей с вероятностью 95 %, и рассчитывали как Хср.ср + 2 S (Хср.ср - общее среднее арифметическое, S -стандартное отклонение). Для ОСО(1) аттестованная характеристика составила 0,088 ± 0,009 мг/мл (п=40), для ОСО(Н) - 0,221 ± 0,013 мг/мл (п=180).

Для оценки характеристик методики с использованием разработанных стандартных образцов в ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора (далее ГИСК) и на предприятиях провели 10-кратное определение белкового азота в ОСО одномоментно (внутрисерийная сходимость) и в разные дни (внутрилабораторная воспроизводимость).

При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ФВК в диапазоне 0,02 - 0,12 мг/мл коэффициент вариации не превышал 7,1 %. При оценке внутрилабораторной воспроизводимости методики определения белкового азота с применением ТХУ для верхнего диапазона концентраций (0,2 - 0,6 мг/мл) коэффициент вариации не превышал 6 %, для нижнего диапазона (около 0,01 мг/мл) - 16 %.

Для обоих вариантов методики коэффициент вариации при оценке воспроизводимости был в 1,5 - 2 раза выше коэффициента вариации при оценке сходимости.

Разработанные стандартные образцы в течение 3 лет направляли ежегодно на предприятия для проведения внутрилабораторного контроля качества данного вида анализа. Согласно отчетам предприятий в первый и второй год использования стандартных образцов на основе БСА отдельные результаты выходили за пределы аттестованной характеристики ОСО в 4 из 6 предприятий, в третий год - все полученные результаты были в пределах аттестованной характеристики, что свидетельствовало об удовлетворительной правильности анализа.

Через 3 года с использованием новой серии стандартного образца была проведена оценка сопоставимости результатов ГИСК и предприятий по производству МИБП, использующих методику определения белкового азота с осаждением ТХУ. Исследование состояло в проведении испытаний на растворе БСА с содержанием белкового азота 0,15 мг/мл. В работе принимали участие предприятие НИИПВЭ РАМН СССР (далее ИПВЭ), Ленинградский, Уфимский, Пермский, Томский НИИ вакцин и сывороток, Казанский НИИЭМ (названия предприятий даны на момент проведения испытаний). Каждый участник получил 5 ампул образца и провел одномоментно 10 определений по два параллельных определения из каждой ампулы.

Общее распределение результатов испытаний представлено на гистограмме (рис.1), из которой видно, что основная масса результатов находится в области 0,15 мг/мл белкового азота, Хер составило 0,147 мг/мл, 8 = 0,01 мг/мл, однако наметился дополнительный максимум в области 0,13 мг/мл, в основном за счет результатов участников №1 и№2. Несмотря на несимметричность, в целом распределение результатов не противоречит нормальному закону: медиана, равная 0,149 мг/мл, и среднее арифметическое, равное 0,147 мг/мл, практически совпадают, все результаты укладываются в интервал + 2Б. В связи с этим из расчетов не мог быть исключен ни один крайний результат.

Интервал

Рисунок 1. Распределение результатов всех участников испытаний

Таким образом, несмотря на удовлетворительные результаты при использовании ОСО содержания белкового азота по данным отчетов производственных лабораторий, межлабораторные испытания с новым образцом показали расхождение результатов, требующие установления источника расхождений.

1Л.2.0ценка валндационных характеристик методики определения белкового азота.

С целью выяснения возможных источников расхождения результатов, а также с целью оценки валидационных характеристик методики в соответствии с современными рекомендациями ВОЗ и стандартов ИСО, совместно с группой специалистов под руководством сотрудника лаборатории метрологии ВНИИНП Гринэ М.М была разработана программа межлабораторных испытаний по определению белкового азота с участием ГИСК и предприятий по производству МИБП, применяющих данную методику. Межлабораторные исследования провели дважды. Участники испытаний, кроме ГИСК, не повторялись.

В первых испытаниях участвовали ГИСК и три предприятия по производству МИБП, расположенные в г.Москве: ИПВЭ, предприятие НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, предприятие НИИВП. Для испытаний использовали 3 образца с концентрацией белкового азота около верхнего и нижнего предела содержания показателя в МИБП, а также в середине диапазона: ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,06 мг/мл и 2 серии очищенного дифтерийного анатоксина производства Пермского НПО «Биомед» с концентрацией около 0,2 и 0,3 мг/мл белкового азота.

Вторые межлабораторные испытания были проведены с участием ГИСК и трех других предприятий - Томского, Уфимского, Пермского филиалов ФГУП «НПО «Микроген». Для испытаний использовали ОСО содержания белкового азота с концентрацией 0,175 мг/мл, 2 серии очищенного дифтерийного анатоксина с концентрацией белкового азота около 0,1 и 0,12 мг/ мл, приготовленные для испытаний ОАО «Биомед» им.И.И.Мечникова, столбнячный анатоксин (Уфимский филиал ФГУП «НПО «Микроген») с концентрацией белкового азота по данным предприятия 0,45 мг/мл.

Все образцы были зашифрованы, коды проб не повторялись. Образцы исследовались каждым участником трижды: в первых испытаниях, благодаря участию только московских предприятий, удалось обеспечить одновременное проведение каждого этапа во всех лабораториях с интервалом в 1 неделю, во вторых испытаниях интервал у разных участников был от 1 недели до 2 мес. На предприятиях анализ проводили в химической группе ОКК. Результаты каждый участник оформил по разработанному нами протоколу, который включал указание конкретных условий анализа, результаты измерения оптической плотности и расчет белкового азота.

По данным оптической плотности, указанным в протоколе испытаний, мы провели построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота для каждого из участников с помощью программы Excel (таблица 1).

Все участники первых испытаний построение калибровочного графика проводили вручную. Нами было выявлено различие результатов, полученных участниками испытаний, и результатов, рассчитанных нами. Максимальное различие составило 0,014 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок составляет около 0,08 мг/мл. Наибольшие различия выявлены для участника №4.

Во вторых испытаниях все участники построение калибровочного графика и расчет содержания белкового азота проводили с помощью программы Excel, результаты, представленные участниками, и результаты, рассчитанные нами, практически совпали.

Таким образом, способ обработки первичных результатов может иметь значение при оценке результатов изучения прецизионности и правильности методики и должен быть указан в методике. В дальнейшем оперировали результатами, рассчитанными нами.

Таблица 1.

Результаты определения белкового азота в межлабораторных испытаниях по программе с учетом рекомендаций ГОСТ Р ИСО 5725.

Испы- Об- Статистическая Белковый азот, мг/мл, результат участника №

тания разец обработка 1 2 3 4

A Хер 0,073 0,066 0,058 0,067

к S, мг/мл 0,004 0,002 0,005 0,005

3 CV, % 5,8 2,3 8,7 7,6

н 3 В Хер 0,218 0,188 0,209 0,244

а S, мг/мл 0,021 0,012 0,006 0,013

о CV, % 9,8 6,4 3,1 5,2

а, Q С Хер 0,320 0,295 0,297 0,374

С S, мг/мл 0,010 0,028 0,020 0,014

CV, % 2,8 9,5 6,8 3,8

13 Хер 0,108 0,098 0,079 0,084

S, мг/мл 0,0025 0,007 0,006 0,010

CV, %" 2,3 7,36 7,4 11,9 '

сс s 12 Хер 0,123 0,130 0,110 0,114

3 f- S, мг/мл 0,0076 0,003 0,006 0,003

j с CV, % 6,1 2,4 5,5 2,6

s QJ 14 Хер 0,196 0,183 0,173 0,177

Л а. S, мг/мл 0,030 0,004 0,010 0,012

t- ffl CV, % 15,4 2,4 6,1 6,9

15 Хер 0,533 Результаты 0,501 0,511

S, мг/мл 0,048 не представ 0,008 0,025

CV, % 8,9 лены 1,5 5

Результаты статистической обработки по образцам представлены в таблице 2. Размах средних между лабораториями в первых испытаниях составил 0,015 мг/мл для наименьшей концентрации, и 0,079 мг/мл для наибольшей концентрации, что в пересчете на белок достигает значительной величины - 0. Ни 0,44 мг/мл соответственно.

Размах средних во вторых испытаниях для разных концентраций практически не отличался и был равен 0,02 - 0,032 мг/мл, однако размах отдельных результатов для наибольшей концентрации анатоксина достиг 0,095 мг/мл, что выше размаха в предыдущих испытаниях,.

Таким образом, на образцах анатоксинов, т.е. образцах, близких по составу к испытываемым в реальном производстве, колебания результатов оказались выше, чем на растворе чистого белка, каким является ОСО содержания белкового азота на основе БСА.

Таблица 2

Сводная таблица средних результатов (Хсрср) для каждой пробы, стандартное отклонение (Б) и коэффициент вариации (СУ).

Характеристика Содержание белкового азота в первых испыианиях, мг/мл

Образец А Образец В Образец С

Хсрср 0,067 0,215 0,322

Б, мкг/мл 0,00616 0,02320 0,03678

СУ, % 9,2 10,8 11,4

Размах средних, мг/мл 0,015 0,056 0,079

Характеристика Содержание белкового азота во вторых испытаниях, мг/мл

Образец №13 Образец №12 Образец №14 Образец №15

Хер ср 0,095 0,121 0,184 0,517

8, мг/мл 0,013 0,009 0,010 0,016

СУ, % 13,7 7,4 5,4 3,1

Размах средних, мг/мл 0,029 0,020 0,023 0,032

Оценка прецизионности.

Оценка стандартного отклонения для каждого участника (таблица 1) показала, что оно не постоянно и увеличивается с увеличением концентрации (рисунок 2).

Как видно из таблицы 1, коэффициент вариации результатов участников колеблется в первых испытаниях от 2,3 % до 9,8 %, во вторых испытаниях - от 1,5 % до 15,4 %, превышая коэффициент вариации, полученный в предыдущих исследованиях на образцах без шифрования.

Во вторых испытаниях у двух участников - №1 и №4 - коэффициент вариации достигает 10 - 15 %, что значительно выше, чем в первых испытаниях. В лаборатории №4 это связано с набором нового персонала, в лаборатории №1 - с использованием морально устаревшего оборудования.

Расчет предела прецизионности показал, что разница в содержании белкового азота около 0,1 мг/мл различается только на внутрилабораторном уровне.

ООбразец А

• Образец В

ООбразец С

Участники №1. №2. №3. №4

0,6 0.5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1

ООбразец _ №13

ООбразец - № 12

• Образец " №14 ООбразец №15

Участники: 1-№1, 2- №2, 3-N53,4-№4

Рисунок 2. Стандартное отклонение (S) результатов участников межлабораторных испытаний в зависимости от среднего значения белкового азота (S пропорционально площади окружности). А - Первые испытания. В - Вторые испытания.

Оценка правильности

Результаты участников различаются по смещению относительно общего среднего (рисунок 3).

В первых испытаниях, если исключить результаты участника №4 в связи с тем, что он не выполнил точно процедуру методики, участником №1 были получены несколько более высокие результаты (рис.3). Анализ протоколов испытаний данного участника показал, что это связано с использованием свежеприготовленных растворов 20 % ТХУ. На основании полученных результатов в методику введено требование периодического контроля концентрации исходного раствора ТХУ и приготовленных из негоЮ % и 20 % растворов.

Смещение средних результатов для каждого участника по отношению к общему среднему во вторых испытаниях оказалось меньше, чем в первых, и не превысило 0,02 мг/мл. На наш взгляд это связано с тем, что для участников вторых испытаний (за исключением участника №1) определение белкового азота в диапазоне концентраций 0,1 - 0,15 мг/мл является рутинным анализом, при проведении которого периодически используется ОСО содержания белкового азота.

'5 £

0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0

-0,01 -0,02 -0,03

■ Участник №1

■ Участник №2

■ Участник N«3 , ■ Участник №4

Образцы

Рисунок 3. Отклонение средних по лабораториям от общего среднего в первых испытаниях: 1 - образец А, 3 - образец В. 5 - образец С

Оценка линейности

Проведено изучение калибровочных графиков всех исполнителей: оценены линейность и коэффициенты наклона и сдвига.

Линейность оценивали несколькими способами. На основании коэффициентов корреляции и детерминации (> 0,99) и более чувствительным методом - по графикам остатков, подтверждена линейная зависимость оптической плотности от концентрации азота для всех участников испытаний. Для участника № 4 первых испытаний графики остатков (рис.4) свидетельствовали о практической идентичности калибровочных графиков в трех определениях. Аналогичный вывод можно было сделать в результате изучения изменения оптической плотности на единицу изменения содержания белкового азота и оценки коэффициента сдвига (рис.5). Этот факт объясняется тем, что исполнитель строил калибровочный график только в первой серии определений, а затем использовал полученный график для второй и третьей серии определений. Этим же объясняется наибольшая разница между результатами данного участника и нашими результатами обработки его первичных данных.

Таким образом, линейность калибровочного графика, как и следовало ожидать для стандартизованных методов, показана для всех участников межлабораторных испытаний, применение графиков остатков позволило выявить отступление от процедуры построения калибровочного графика одним из участников испытаний.

Рисунок 4. Графики остатков для калибровочного графика при определении содержания белкового азота участником №4.

S 0-017

<¡j> 0,012 s 0,007 = 0,002 ¡5-0,003 1-0,008 °-0,013 8-0.018 £ 0

-Q

"СГ

,018 0,02 0.022 0,024 0,026 0,028

Изменение оптической плотности, обусловленное изменением содержания азота в аликвоте калибровочного раствора, у.е./мкт

•День 1 №1 •День 2 №3

•День 2 №1 •День 3 №3

• День 3 №1

• День 4 №3

• День 1 №2 ОДень 1 №4

• День 2 Ns2 ОДень 2 №4

• День 3 Ме2 ОДень 3 №4

•День 1 №3

Рисунок 5. Сравнение остаточных стандартных отклонений для точек калибровочного графика при определении белкового азота в первых межлабораторных испытаниях участниками №№1-4.

Проведение испытаний и представление результатов по разработанным нами программе и формам отчетности в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725 позволили оценить воспроизводимость изучаемой методики на межлабораторном уровне и выявить отклонения от некоторых позиций, которые могут быть следствием нарушения регламентированной методики или допускаться аналитическими лабораториями из-за возможности неоднозначного понимания отдельных этапов вследствие недостаточно детального изложения процедуры. Указанные причины обусловили несогласованность результатов анализа между лабораториями. Для улучшения воспроизводимости методики разработана типовая стандартная операционная процедура определения белкового азота, которая предоставляется слушателям курсов по GMP в ГИСК. Кроме того, очевидно, что для своевременного выявления отклонений от методики целесообразно периодическое проведение межлабораторных испытаний, так как регулярное инспектирование сотрудниками

ГИСК им.Л.А.Тарасевича аналитических лабораторий предприятий -изготовителей МИБП в настоящее время не проводится.

На модели метода определения белкового азота в МИБП разработана методология валидации стандартизованных химических методик контроля МИБП, заключающаяся в оценке прецизионности в условиях получения независимых результатов (анализ не менее трех образцов в необходимом диапазоне концентраций, не менее, чем трехкратное /оптимально - пятикратное/ повторение анализа) и правильности методики при сравнении с аттестованным значением стандартного образца содержания белкового азота. Предложенный алгоритм обеспечивает число степеней свободы, необходимое для объективной оценки прецизионности.

Полученные результаты показали целесообразность для оценки линейности методики использовать анализ графиков остатков, что особенно важно для вновь разрабатываемых методик контроля качества МИБП.

Использование ОСО содержания белкового азота позволяет оценить правильность и стабильность проведения данного вида анализа в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях по производству МИБП. Проведенные межлабораторные испытания показали, что для объективной оценки работы лабораторий целесообразно использование не менее двух образцов с близким содержанием аттестуемой величины, чтобы, используя их в зашифрованном виде, исключить влияние субъективного фактора.

1.2. Определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак».

1.2.1.Аттестация ОСО содержания Ви-антигена.

Одними из немногих вакцин, в которых определение специфической активности проводится химическими методами, являются бактерийные полисахаридные вакцины. Вакцина «Вианвак» производства ООО «Гритвак» представляет собой раствор очищенного лиофилизированного полисахарида, полученного из Salmonella typhi. Специфическая активность обеспечивается содержанием 50 мкг/мл Ви-антигена, количество которого определяется РИЭФ. Метод предполагает использование калибровочного графика при каждом анализе. В качестве стандартного образца используют одну из серий брюшнотифозной вакцины «Вианвак», аттестованную как ОСО содержания Ви-антигена. Для аттестации ОСО используется очищенный лиофилизированный Ви-полисахарид, являющийся субстанцией вакцины (раствор, приготовленный по точной навеске). Однако, разные серии полисахарида различаются между собой в пределах требований нормативной документации, а готовые серии вакцины отличаются по составу от субстанции, что может влиять на результаты определения содержания Ви-антигена методом РИЭФ в целом, и на аттестацию ОСО в частности.

Было изучено влияние вышеуказанных различий на результат аттестации. Для того, чтобы избежать эффекта множественных сравнений, на одном стекле анализировали 3 образца: кандидат в ОСО - вакцина «Вианвак» (серия 181), субстанция к этой серии и субстанция вакцины «Вианвак» произвольно выбранной серии. Для каждого образца использовали 4 концентрации 5,10,15 и 20 мкг/мл. Эксперимент

повторяли 4 раза, меняя серию произвольной субстанции. В одном эксперименте, вместо производственной субстанции использовали вакцину «Тифим Ви», производство «Авентис Пастер» (Франция). С помощью программы Excel для каждого образца строили график зависимости «Концентрация Ви-антигена - высота «ракеты» и находили уравнение линейной регрессии. Для оценки значимости различий линий регрессии применяли регрессионный анализ, заключающийся в сравнении коэффициентов наклона Ь, коэффициентов сдвига а, сравнения двух линий в целом по F-критерию.

Результаты регрессионного анализа позволили сделать вывод о статистической незначимости различий линий регрессии зависимости «Концентрация Ви-антигена - высота «ракеты» для субстанций, расположенных на одной электрофоре-грамме. . . .

Однофакторный дисперсионный анализ также свидетельствовал об отсутствии статистически значимых различий между значениями содержания Ви-антигена в вакцине «Вианвак» серия 181, вычисленными по калибровочным графикам на основе разных субстанций. Отсутствие статистически значимых различий позволяет сделать вывод о возможности использования для аттестации ОСО содержания Ви-антигена любой субстанции, соответствующей требованиям НД, в том числе и субстанции, из которой приготовлен СО.

Вычисляли аттестованное значение как среднее арифметическое средних арифметических по выборкам и доверительный интервал для среднего арифметического.

Содержание Ви-антигена составило 42,1+ 2,2 мкг/мл, в следующей серии ОСО содержания Ви-антигена аттестованное значение составило 44,7+ 2,4 мкг/мл (ОСО 42-28-383-2005). ' " , •

Таким образом, для аттестации ОСО содержания Ви-антигена в ГИСК разработана схема, предусматривающая оценку значимости различий линий регрессий для субстанции кандидата ОСО, кандидата в ОСО и действующего ОСО; для повышения достоверности предусмотрено участие в аттестации двух лабораторий.

1.2.2.Валидация методики ракетного иммуноэлектрофореза, применяемого для определения содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак».

С целью установления линейности, предела обнаружения и предела количественного определения на 1 стекле располагали ОСО содержания Ви-антигена (серия 200) в 4-х разведениях, по 3 повтора на каждое разведение (всего 12 образцов) (рисунок 6). Для определения показателей точности метода (правильности и прецизионности) проводили эксперимент в двух лабораториях, повторяя процедуру не менее 3-х раз в каждой лаборатории, на одном и том же материале, получая тем самым возможность оценки воспроизводимости метода.

Строили график зависимости высоты пика («ракеты») от содержания Ви-антигена, для оценки линейности использовали регрессионный анализ. Коэффици-

ент корреляции составил 0,997, что свидетельствует о сильной прямой зависимости переменных.

..........' ' Рисунок 6. Типичная электрофореграмма

при оценке линейности метода РИЭФ для определения содержания Ви-антигена j | j f| || ¡! п |M с использованием вакцины «Вианвак» ||| ¡1 ;1 h ' серия 200 (ОСО содержания Ви-антигена).

1-3 -концентрация Ви-антигена 5 мкг/мл;

: 4-6 - концентрация Ви-антигена 10 мкг/мл; 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 7-9 - концентрация Ви-антигена 15 мкг/мл;

10-12-концентрация Ви-антигена 20 кг/мл

В соответствии с документами International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology (ICH-Q2B), 1996, предел обнаружения (ПО) и предел количественного определения (ПКО) впервые в практике контроля МИБП вычисляли по стандартному отклонению (Sx) для точки Х=0: ПО= Sx х 3,3; ПКО = S х 10, получили следующие величины: Sx= 0,32 мкг/мл, ПО = 1,1 мкг/мл, ПКО= 3,2 мкг/мл.

Используя ОСО содержания Ви-антигена, оценили воспроизводимость метода - стандартное отклонение воспроизводимости SR и предел воспроизводимости R в соответствии со схемой, разработанной для методики определения белкового азота.

Стандартное отклонение воспроизводимости изменялось от 1,8 до 7,6 мкг/мл в зависимости от разведения ОСО, наименьший разброс значений выявлен при разведении в 3,3 раза: SR = 1,8 мкг/мл. В связи с этим, данное разведение было выбрано для оценки содержания Ви-антигена при проведении анализа в дальнейшем. Предел воспроизводимости R для разведения в 3,3 раза составил 5,98 мкг/мл. Это означает, для того, чтобы быть уверенным, что содержание Ви-антигена в исследуемом образце соответствует требованиям нормативной документации (50+ 15 мкг/мл или 35 - 65 мкг/мл), полученные результаты должны находиться в пределах 35+6 < X < 65-6. т.е. 41-59 мкг/мл.

Таким образом, проведена аггеетания ОСО содержания Вп-атпгепа на основе опенки зависимости высоты ракет от концентрации Ви-антигена для различных серии очищенного полисахарида и накипи, а также с участием двух исполнителей. С помощью регрессионного и дисперсионного анализов было показано, что полученные результаты могут рассматриваться как выборка из одной совокупности, что позволило рассчитать аттестованную характеристику новой серии ОСО. С помощью разработанного ОСО установили валидациоипые характеристики метода РИЭФ для определения Ви-антигена, которые подтвердили возможность использования данного метода для количественного определения Ви-аптигена. Установленный предел

воспроизводимости является научно-обоснованной величиной для сравнения результатов контроля в ГИСК и на предприятии по производству препарата.

2.МЕТОДОЛОГИЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП И ОЦЕНКИ ИХ ВАЛИДАЦИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК.

2.1. Определение гетерологичных примесей в МИБП.

Культуральные вирусные вакцины могут содержать остаточные количества белков сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), прежде всего БСА, обладающих аллергезирующими свойствами, в связи с чем их количество должно контролироваться. Для этих целей использовался метод двойной радиальной иммунодиффузии в агаре (ДРИД), чувствительность которого не высока - 10 мкг/мл БСА. Для определения содержания гетерологичных белков можно использовать более чувствительные иммунохимические методы: РИЭФ и одиночную радиальную иммунодиф-фузию (ОРИД). Эти методы сопоставимы по аналитической чувствительности, однако по времени анализа и простоте выполнения РИЭФ обладает преимуществами, поэтому для дальнейшей работы был выбран данный метод.

2.1.1. Модификация и валидация метода РИЭФ для определения БСА в культуральных вирусных вакцинах.

Определение содержания различных антигенов с помощью РИЭФ широко используется в аналитической практике [Гааль Э., 1982, Остерман Л.А., 1983]. Для определения БСА за основу была взята методика, используемая в ИПВЭ для определения альбумина человека в вирусных вакцинах в пределах 30 - 100 мкг/мл. В качестве антигена на основании изучения свойств БСА различных производителей использовали БСА для вирусологических исследований производства БелНИИЭМ с содержанием БСА более 97 %. Кроличью сыворотку против БСА с титром не менее 1:500 получали по ФС 42-3874-99.

Были оптимизированы условия анализа и установлены валидационные характеристики методики: линейность в диапазоне 0,5 - 5,0 мкг/мл, ПО и ПКО составили соответственно 0,25 мкг/мл и 0,5 мкг/мл БСА, коэффициент вариации при оценке внутрилабораторной воспроизводимости не превысил 20 %. С помощью метода добавок показано отсутствие влияния аминопептида, гидролизина, среды 199, желатина, а также других компонентов вакцины на выявление БСА.

Валидационные характеристики методики РИЭФ позволяют проводить контроль инактивированных вирусных вакцин, содержание БСА в которых не должно превышать 0,5 мкг/мл. Отработанные условия РИЭФ позволили составить НД на методику, включить ее в состав МУК 4.1/4.2.588-96, ФС 42-3874-99 и использовать при контроле культуральных вирусных вакцин: коревой, паротитной, герпетической, ан-тирабической, клещевого энцефалита, гепатита А.

При внедрении методики было показано, что в препаратах коревой и паротитной вакцин (50 серий), контролирующихся на производстве в тесте анафилаксии, БСА методом РИЭФ не выявлялся. БСА также не выявлялся в очищенных концен-

трированных вакцинах клещевого энцефалита и антирабической вакцине производства ИПВЭ (40 серий). В антирабической вакцине, выпускаемой Уфимским ИБС (сейчас филиал ФГУП «НПО «Микроген»), в настоящее время благодаря улучшению технологии производства БСА также не выявляется (20 серий).

2.1.2. Разработка стандартного образца для определения содержания БСА методом РИЭФ.

При использовании разработанной нами методики РИЭФ содержание БСА в препарате оценивают по калибровочному графику, в качестве стандартного образца для которого применяют растворы БСА с концентрацией 0,5, 1,0, 1,5 и2,0мкг/мл. Учитывая, что определение БСА проводится на пределе чувствительности метода, особое значение приобретает приготовление стандартных растворов для калибровочного графика. В связи с этим совместно с БелНИИЭМ провели исследования, которые показали, что применение в качестве наполнителя пептона в концентрации 15 % обеспечивает стабильность в течение 5 лет лиофилизированного препарата с содержанием БСА 1-10 мкг в ампуле (розлив по 1 мл).

Разработали также жидкую форму ОСО содержания белка, содержащую 1 мг/мл белка с использованием в качестве растворителя солевого раствора (0,15 % хлорида калия, 0,01 % щдрокарбоната натрия, рН 6,8).

2.13. Модификация и валидация методики РИЭФ с применением сыворотки против белков сыворотки рогатого скота (СРС).

В связи с отсутствием отечественной коммерческой сыворотки против БСА изучили возможность использования сыворотки преципитирующей белки СКРС и СРС для судебно-медицинских целей (ЛенИВС). Исследования показали, что для выявления сывороточных белков в вирусных вакцинах целесообразно использовать сыворотку против СРС как более чувствительную.

Применение сыворотки против СРС позволяет выявлять помимо БСА другие белки сыворотки крупного рогатого скота, что является преимуществом по сравнению с сывороткой против БСА, так как позволяет вести более информативный контроль очистки культуральных вирусных вакцин.

Для определения содержания БСА использовали следующий прием: добавляли в исследуемый образец БСА до конечной концентрации 2 мкг/мл, по увеличению высоты ракеты в образце с добавкой по сравнению с образцом без добавки идентифицировали преципитат, соответствующий БСА. Типичные электрофореграммы представлены на рисунке 7, результаты определения — в таблице 3.

Как видно из рисунка 7 и таблицы 3 анализируемые вакцины содержат белки СКРС, однако в вакцинах отсутствует БСА, так как отсутствует увеличение его концентрации в пробе с добавкой БСА (лунки 6,8).

Рисунок 7. Определение содержания БСА в антирабической вакцине методом РИЭФ с применением сыворотки против белков СРС. 1-3 - ОСО БСА 0,5; 1,0; 2,0 мкг/мл соответственно. 4 - Контроль БСА 2 мкг/мл.

5,6 - антирабическая вакцина серия 32. 5 - с добавлением воды, 6 - с добавлением БСА в конечной концентрации 2 мкг/мл.

7,8 - антирабическая вакцина серия 34. 7 - с добавлением воды, 8 - с добавлением БСА в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Таблица 3.

Определение содержания БСА с применением сыворотки против СРС.

Лунка № Наименование образца Высота «ракеты», мм Содержание БСА, мкг/мл

1 пик 2 пик С добавкой БСА В вакцине

4 БСА 2 мкг/мл - 5 2,0 -

5 Вакцина 16 - - -

6 Вакцина+БСА 16 4,5 1,8 0

7 Вакцина 17 - - -

8 Вакцина+БСА 17 5 2,0 0

В связи с заменой сыворотки против БСА на сыворотку против СРС изучили специфичность, линейность, пределы определения, прецизионность и правильность определения БСА методом РИЭФ при использовании указанной сыворотки.

Кроме того, в связи с прекращением работы предприятия БелНИИЭМ и выпуска лиофилизированного ОСО содержания БСА, изучили возможность использования в качестве калибранта для построения калибровочного графика ОСО содержания белка, представляющий собой раствор БСА. Для этого на одном стекле в верхнем и нижнем рядах лунок располагали ОСО и раствор БСА, приготовленный по точной навеске. Каждый из указанных препаратов ставили в 5-ти разведениях, измеряли высоту «ракет», строили график и находили уравнение линейной регрессии.

Регрессионный анализ обеих линий зависимости «концентрация БСА - высота «ракеты» показал отсутствие статистически значимых различий коэффициентов наклона (Ь) и сдвига (а) линий регрессии, а также отсутствие различий в случае ис-

пользования в качестве калибровочного графика какой-либо линии регрессии в отдельности или объединенной линии регрессии.

Для оценки линейности использовали разные серии сыворотки преципити-рующей белки СРС. Коэффициент корреляции, который в среднем составил 0,996, и коэффициент детерминации, равный в среднем 0,991, свидетельствуют о сильной прямой зависимости концентрация БСА - высота «ракеты» для ОСО БСА в случае применения сыворотки против белков СРС.

Вычисленные предел обнаружения и предел количественного определения составили: ПО = 0,15 мкг/мл, ПКО = 0,5 мкг/мл БСА.

Оценку правильности провели по МИ 2336-2002 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки»: критерий Стьюдента, рассчитанный для разности между средним значением результатов анализа -1,88 мкг/мл, и номинальным значением стандартного образца - 2 мкг/мл, был ниже табличного, что свидетельствовало о незначимости систематической ошибки на фоне случайного разброса.

Промежуточную прецизионность оценивали с применением различных серий сыворотки против СРС и раствора БСА с концентрацией 2,0 мкг/мл. Коэффициент вариации составил 15 %, предел промежуточной прецизионности R„p составил 0,23 мкг/мл. С учетом прецизионности методики гарантировать, что содержание БСА в исследуемом образце меньше 0,5 мкг/мл (требование НД) можно при условии, что при единичном определении содержание БСА менее 0,27 мкг/мл. Применение сыворотки против белков СРС введено в проект методики для включения в ГФ XII.

Таким образом, нами модифицирован метод РИЭФ для определения БСА в вирусных вакцинах и при разработке методики установлены ее валчдационные характеристики - специфичность, линейный диапазон, предел количественного определения и предел обнаружения, правильность и прецизионность. Прецизионность методики устанавливали в условиях получения независимых результатов. Благодаря внедрению метода РИЭФ повысилось качество отечественных вирусных вакцин (герпетической, против клещевого энцефалита, гепатита А, аитирабической): в 95 % серий, отконтролнрованных в ГИСК, белки СКРС не выявляются, БСА отсутствует или его содержание ниже предела обнаружения методики.

2.1.4. Вплпдации ИФА тест-системi,i для определения БСА «Immu-noenzymetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», США).

В вакцинах коревой, краснушной и парогитной, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, содержание БСА не должно превышать 50 иг (или 0,05 мкг ) и прививочной дозе.

Для определения содержания БСА в таких количествах может быть использован иммуноферментный анализ, который обладает более высокой чувствительностью по сравнению е РИЭФ - до нескольких панограмм.

В настоящее время могут использоваться различные коммерческие тест-системы для определения БСА. Применяя тест-систему, необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики и показатели точности позволяют использовать данную тест-систему для решения конкретных задач, т.е. провести ее валидацию.

Выбор критериев оценки пригодности тест-системы зависит от области ее применения и может охватывать более широкий спектр показателей, чем те, что указаны производителем.

На Московском предприятии по производству бактерийных препаратов (филиал ФГУП «НПО «Микроген») для выявления содержания остаточного количества бычьего сывороточного альбумина в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих используют метод иммуноферментного анализа с применением тест-системы «Immunoenzimetric Assay for the Measurement of BSA» («Cygnus Technologies, Inc.», CatJ F030, США). Для подтверждения пригодности данной тест-системы для решения поставленной задачи совместно с производством была проведена ее валидация, в процессе которой оценили характеристики тест-системы: специфичность, линейность, предел обнаружения, предел количественного определения, диапазон определяемых величин, правильность и прецизионность. Для оценки характеристик использовали схему, разработанную на модели методики определения белкового азота: пятикратное повторение блока анализов, блок состоит из анализа 9 образцов в рабочем диапазоне - по три образца в нижней, средней и верхней части диапазона.

Анализ проводили в соответствии с инструкцией по применению тест-системы, используя 6 различных серий тест-системы в разные дни, разными операторами. Всего было проведено 5 определений с паротитной вакциной и 3 определения с коревой и паротитно-коревой вакцинами. Последние 3 определения проводили через 1 год как ревалвдацию тест-системы для подтверждения ее характеристик при анализе коревой и паротитно-коревой вакцин.

Для оценки специфичности и правильности использовали метод добавок. Вьивление в среднем составило для готовых серий вакцин 94 - 99,6%, а для полуфабрикатов вакцин - 86,5 - 97%, таким образом, специфичность и правильность тест-системы удовлетворительны.

Для оценки линейности с помощью программы Excel строили график зависимости «Концентрация БСА - оптическая плотность при 450 нм» с использованием стандартных образцов тест-системы (0,5-32 нг/мл), а также ОСО БСА (5-50нг/мл) и проводили регрессионный анализ.

Полученные значения коэффициентов корреляции (>0,997) и детерминации (>0,994) свидетельствуют о линейной зависимости оптической плотности от концентрации БСА при использовании изучаемой тест-системы.

Изучение зависимости «концентрация БСА - оптическая плотность при 450 нм», полученных с применением калибрантов тест-системы и ОСО БСА с одной стороны и калибрантов тест-системы и исследуемого препарата с другой показало параллелизм графиков. В качестве исследуемого препарата использовали паро-

титную вакцину с добавками БСА 5,10 и 20 нг и полуфабрикат паротитной вакцины с добавкой 32 нг. Аналогичные результаты получены при исследовании коревой вакцины.

Предел обнаружения и предел количественного определения, вычисленные на основании стандартного отклонения для нулевой концентрации, находились в пределах 0,24-1,83 нг/мл для ПО и 0,72-5,55 нг/мл для ПКО.

Полученные результаты несколько отличаются от данных производителя тест-системы, предполагающего использование для количественного определения БСА калибровочного графика с нижней концентрацией 0,5 нг/мл. Однако, применению данной тест-системы для выявления содержания остаточного количества БСА в паротитной, коревой и паротитно-коревой вакцинах и их вирусных сборах это не препятствует, поскольку предельное допустимое содержание БСА в готовом препарате - 50 нг/доза - существенно выше установленных пределов.

Прецизионность тест-системы в инструкции по применению не была указана. Мы установили данную характеристику по той же схеме, которую использовали для методик определения белкового азота и Ви-антигена. Предел промежуточной прецизионности для верхнего диапазона составил 15,3 нг/мл, т.е. гарантировать соответствие требованиям (< 50 нг/мл) при единичном определении можно при получении результата меньше разности (50 - 15,3) нг/мл = 35 нг/мл. Максимальный коэффициент вариации для одной плашки составил 13%, что несколько превышает величину, указанную для тест-системы -10%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной правильности и прецизионности тест-системы и позволяют использовать ее для контроля коревой, паротитной и краснушной вакцин, содержание БСА в них не превышает 50 нг/доза.

Применение валидированной тест-системы для определения БСА в других культуральных вирусных вакцинах (герпетической, антирабической, против клещевого энцефалита и др) показало, что содержание БСА в отечественных препаратах не превышает 50 нг/доза. Это дает основание ставить вопрос об изменении требований к содержанию БСА в отечественных культуральных вирусных вакцинах до 50 нг/доза и внедрению метода ИФА для его контроля.

2.2. Определение консервантов в МИБП.

Мертиолят применяют в качестве консерванта в сорбированных препаратах, а также в гриппозных вакцинах и бактериальных препаратах на основе лизатов условно-патогенных бактерий. Его содержание в вакцинах регламентируется в пределах 35-65 и 80-120 мкг/мл. В настоящее время появились вакцины без консерванта, в которых остаточное количество мертиолята не превышает 2 мкг/мл.

Препараты антитоксических сывороток (противодифтерийная, противостолбнячная, противогангренозная, противобутулиническая, противозмеиные) содержат в качестве консерванта хлороформ, который относится к умеренно токсической группе препаратов (группа «Б»). Содержание его в препаратах не должно превышать 0,5%, однако данная величина была расчетной и определение его не проводилось.

Фенол применяют в качестве консерванта для ряда медицинских биологических препаратов (неинфекционные аллергены, туберкулин, ряд вакцин). Фенол и его производные относятся к классу умеренно токсических веществ. Содержание его в различных препаратах находится в пределах 0,15 - 0,5 % и определяется спектрофо-тометрическим методом по ФС 42-3874-99.

В мировой практике для анализа содержания фенола широко применяется метод ГЖХ. Метод является весьма чувствительным и очень быстрым в исполнении, что особенно ценно при анализе большого числа образцов, в связи с чем целесообразно изучение возможности его применения для контроля МИБП.

С целью совершенствования методов контроля консервантов была поставлена задача с учетом современных требований к установлению валидационных характеристик разработать методики определения мертиолята в МИБП с использованием отечественного атомно-абсорбционного прибора КВАНТ-2.ЭТА, количественного определения хлороформа в антитоксических сывороточных препаратах, определения фенола с использованием метода ГЖХ.

2.2.1. Разработка и валидация методики определения содержания мертиолята в анатоксинах, вирусных и бактерийных вакцинах с помощью атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-г.ЭТА.

В настоящее время в РФ определение мертиолята в вакцинах проводят трудоемким колориметрическим методом по ФС 42-3874-99. Для оценки правильности проведения анализа в двух диапазонах концентрации мертиолята нами были разработаны ОСО содержания мертиолята, результаты аттестации которых представлены в табл. 4.

Таблица 4.

Результаты аттестации ОСО содержания мертиолята в сорбированных МИБП колориметрическим методом по ФС 42-3874-99.

ОСО 42-42 -28-334-06 П ОСО 42-42 -28-334а-06

Аттестованная характеристика -от 67,91 до 108,65 мкг/мл (п=18) Среднее арифметическое - 88,28 мкг/мл Стандартное отклонение - 9,7 мкг/мл Коэффициент вариации - 11,0% Стандартная ошибка среднего-4,87мкг/мл Доверительный интервал - 20,37 мкг/мл Аттестованная характеристика -от 42,84 до 56,48 мкг/мл (п=15) Среднее арифметическое - 49,66 мкт/мл Стандартное отклонение - 3,2 мкг/мл Коэффициент вариации - 6,4 % Стандартная ошибка среднего - 1,8мкг/мя Доверительный интервал - 6,82 мкг/мл

Согласно Европейской и Американской Фармакопеи, анализ мертиолята проводят в основном атомно-абсорбаиоппои спектрометрией, который значительно сокращает время проведения анализа.

В России разработан метод атомно-абсорбциониой спектрометрии с электротермической атомизацией на приборе КВАПТ-Х.ЭТА. Была поставлена задача разработать методику определения мертиолята в вирусных, бактерийных вакцинах и

анатоксинах атомно-абсорбционным методом с использованием отечественного оборудования.

Разработка методики помимо отработки оптимальных условий пробоподго-товки и анализа включала оценку валидационных характеристик методики.

Градуировку прибора провели совместно с разработчиками прибора, используя мертиолят фирмы «Serva», США.

Для оценки градуировки прибора анализировали в трех повторностях растворы с концентрацией мертиолята 0,025, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25, 1,50 мкг/мл. Отклонение полученной величины от номинальной для отдельных результатов достигло 10,6 %, для средних результатов отклонение не превысило 7,1 %. Предел количественного определения составил 0,005 мкг/мл.

На основании полученных результатов в методике предусмотрено использование трех повторностей, а также предусмотрена проверка градуировки прибора при каждом проведении анализа с помощью растворов мертиолята с концентрацией 0,5 — 1,25 мкг/мл, определяемое содержание мертиолята в этих растворах не должно отличаться от номинального более, чем на 8 %.

Для оценки правильности использовали сравнительное определение мертиолята в ОСО содержания мертиолята разработанной методикой и колориметрическим методом по ФС 42-3874-99, метод добавок, и определение мертиолята в ОСО и его разведениях.

При использовании метода добавок полученные результаты практически совпали с расчетными, различие не превысило 3,8 %.

Отклонение результатов от номинальной величины разведений ОСО не превысило 8 %, принтом коэффициент наклона графика зависимости выявленной концентрации от расчетной был близок к 1. Таким образом, правильность методики удовлетворительна.

Оценка повторяемости и промежуточной прецизионности (внутрилаборатор-ной воспроизводимости) разработанной методики проведена с использованием ОСО содержания мертиолята и 3-х серий различных сорбированных препаратов. Все образцы анализировали в трех повторностях трижды в разные дни (для каждого образца п=9). Колебания результата определения мертиолята в параллельных пробах при анализе сорбированных препаратов незначительно превышают колебания результатов при анализе чистого раствора мертиолята. Таким образом, трехкратное определение мертиолята в каждом образце достаточно и для сорбированных препаратов. Стандартное отклонение полученных результатов колебалось в пределах от 0,57 до 5,56 мкг/мл, коэффициент вариации не превышал 8,26 %.

В соответствии с отработанной методикой провели определение консерванта в 200 сериях сорбированных препаратов отечественного и зарубежного производства, а также остаточное количество мертиолята в 6 сериях вакцины гепатита В отечественного и зарубежного производства. Полученные результаты совпадают с паспортными данными в пределах воспроизводимости методики.

Таким образом, нами разработана и валидирована методика определения мертиолята с использованием отечественного атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA, что сократило время анализа в 5 раз и позволило определять остаточные количества мертиолята. Валидационные характеристики методики (линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения) позволяют рекомендовать ее для количественного определения мертиолята в анатоксинах, сорбированных вакцинах и в бактерийных препаратах на основе лизатов условно-патогенных культур, а также для определения остаточного количества мертиолята в вакцинах без консерванта. Контроль более 200 серий сорбированных препаратов показал, что различие между результатами ГИСК и паспортными данными не превышает прецизионности методики.

На методику разработана типовая стандартная операционная процедура и проект общей фармакопейной статьи для ГФ XII.

2.2.2. Разработка и валидация методики количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках.

На основе способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, окрашенное в малиновый цвет - метода, принятого в судебной медицине для качественной реакции на хлороформ, отработали оптимальные условия для количественного определения хлороформа. Метод прост в исполнении и не требует дополнительного дорогостоящего оборудования.

Количественное определение хлороформа в антитоксических сыворотках проводили по стандартному раствору хлороформа, в качестве которого использовали реактив фирмы «Сигма» (США). Показана линейность методики в диапазоне 0,1 -0,5% (v/v), предел количественного определения - 0,1 %.

Провели оценку правильности результатов количественного определения хлороформа с помощью метода добавок. Процент выявления хлороформа составил от 92 % до 100 %.

При оценке внутрисерийной сходимости метода (10 проб из одной ампулы препарата) коэффициент вариации составил 2,6 %. При оценке повторяемости (четыре определения в день в течение восьми дней) коэффициент вариации для середины диапазона составил 4,8 %, для предела количественного определения не превысил 12 %.

Результаты определение хлороформа в 60 сериях антитоксических сывороток показали, что содержание хлороформа находилось в пределах от 0,05 % до 0,3 %.

Поскольку использование хлороформа в качестве консерванта при низких концентрациях вызывает сомнение, ГИСК им.Л.А.Тарасевича рекомендовал предприятиям, выпускающим антитоксические сыворотки, исключить использование хлороформа в качестве консерванта. Хлороформ используют для очистки препарата от липопротеидов, в связи с этим разработанный метод включен в Фармакопейные статьи на антитоксические сыворотки для определения остаточного содержания хлороформа, содержание которого не должно превышать 0,1 %. Метод

используется при контроле 5 наименований антитоксических сывороток и внедрен на 3 производствах.

2.2.3. Изучение возможности применения методики определения фенола в МИБП с помощью газожидкостиой хроматографии

В качестве внутреннего стандарта выбрали бензиловый спирт - соединение, наиболее близкое по структуре к анализируемому веществу.

Для совместной хроматографии фенола и бензилового спирта была использована капиллярная колонка с неполярным силиконовым каучуком в качестве неподвижной фазы. Подобранные параметры хроматографии обеспечили приемлемое взаимное деление компонентов смеси с одной стороны, и полное отделение от пика растворителя, с другой стороны.

Нами были установлены критерии пригодности хроматографической системы: время полного разделения пика внутреннего стандарта и пика фенола не должно превышать 10 минут; число теоретических тарелок/м (ступень разделения, на которой устанавливается сорбционлое равновесие) должно быть не менее 700-900.

Установленные валидационные характеристики методики: ПКО - 50 мкг/мл фенола; выявление от 98,7 % до 102,3 % добавленного фенола и сопоставимость с результатами определения фенола стандартизованным методом; коэффициент вариации при оценке повторяемости не более 1,6 %, - свидетельствуют о возможности применения разработанных условий ГЖХ для определения фенола в аллергенах и вакцинах.

3. РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ХИМИЧЕСКИХ И ИММУИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИБП.

При контроле МИБП используется около 30 унифицированных химических, физико-химических и иммунохимических методик по ФС 42-3874-99. Метрологическое обеспечение методик требует создания стандартных образцов как меры сравнения и для контроля правильности проведения анализов.

При производстве и контроле МИБП используются в качестве меры сравнения различные биологические стандартные образцы. До середины 70-х годов прошлого века ОСО при выполнении химических анализов МИБП не применялись.

Основной вопрос при аттестации ОСО - это установление аттестованной характеристики в отсутствии эталонных образцов. Единого алгоритма для этого нет, а подход ГОСТ 8.532 для МИБП не может использоваться из-за небольшого количества квалифицированных лабораторий. В связи с этим была поставлена задача разработать ОСО как меры сравнения для методов определения белка с биуретовым реактивом, Ви-антигена и БСА методом РИЭФ, а также ОСО для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы при определении белкового азота, мертио-лята и ионов алюминия. Разработка ОСО для определения Ви-антигена, БСА, белкового азота и мертиолята изложена в соответствующих разделах.

3.1.Разработка стандартного образца для определения содержания белка в препаратах иммуноглобулина.

Препараты иммуноглобулина в настоящее время выпускаются 7 предприятиями РФ и являются препаратами массового применения. Иммуноглобулины стандартизуются по содержанию белка, определяемому с биуретовым реактивом [Гавриленкова В.Ю. с соавт., 1971].

С целью разработки стандартного образца содержания белка в препарате иммуноглобулина нами проведено определение белка в кандидате в ОСО наиболее объективным методом - по белковому азоту с реактивом Несслера с последующим пересчетом на белок. В работе участвовало 4 оператора, каждый провел 10 определений. На основе полученных результатов рассчитали аттестованную характеристику как среднее арифметическое и доверительный интервал. Аттестованная характеристика составила (9,52+0,27) % белка при доверительной вероятности 0,95, стандартная ошибка среднего составила 0,135 %. У четырех операторов Хер отличались менее, чем на 0,2 %, стандартное отклонение каждого оператора не превышало 0,2%.

Содержания белка в кандидате ОСО было подтверждено с биуретовым реактивом. В ГИСК Хер составило 9,47 %, стандартное отклонение - 0,086 %, результаты двух лабораторий ОКК предприятий, выпускающих препараты иммуноглобулинов, свидетельствовали об отсутствии статистически значимых различий с результатами ГИСК.

С разработанным ОСО проведена оценка воспроизводимости методики определения белка с биуретовым реактивом, изложенной в ФС 42-3874-99 - стандартное отклонение не превысило 0,085 %. Стандартное отклонение средних составило 0,13 %. Это означает, что при доверительной вероятности 0,95 возможные колебания средних результатов будут находиться в интервале до + 0,26 %. Предел воспроизводимости составил 0,36 %.

Анализ результатов контроля более 200 серий препаратов иммуноглобулина на содержание белка в ГИСК показал, что различие между результатами контроля в ГИСК и на производстве в 90 % серий не превышало 0,26 %. Таким образом, разработан порядок аттестации новых и последующих серий ОСО содержания белка в иммуноглобулинах с использованием межлабораторных испытаний. С помощью ОСО оценена воспроизводимость методики определения белка с биуретовым реактивом, на основе которой проводится сравнительный анализ результатов в ГИСК и на производствах.

3.2. Разработка стандартного образца для калибрования хроматографической колонки при определении молекулярного состава иммуноглобулинов методом гель-фильтрации.

Препараты иммуноглобулинов (^О) получают из донорской крови по методу Кона. Качество сырья, степень его очистки, возможные нарушения технологического процесса получения и хранения иммуноглобулина сказываются на его качестве. В результате могут наблюдаться процессы агрегации и фрагментации молекул имму-

ноглобулина G. Допустимое количество агрегатов и фрагментов ограничено в соответствии с требованиями на препарат и рекомендациями ВОЗ. Молекулярный состав иммуноглобулинов определяется методом гель-фильтрации по ФС 42-3874-99. При фракционировании препаратов иммуноглобулина может быть выявлено до 6 фракций (полимеры, димеры, мономеры, Fab и Fab2 фрагменты, низкомолекулярные пептиды). При определении молекулярных масс фракций иммуноглобулина для калибровки колонки требуется 6-7 калибрантов.

Разработка ОСО иммуноглобулина для калибровки хроматографической колонки позволит заменить импортные белки-калибранты и сократить время проведения калибрования колонки.

В связи с этим была изучена возможность применения одной из серий препарата иммуноглобулина в качестве стандартного образца для калибровки колонки.

Методом гель-фильтрации в образце выявлено 4 фракции. Изучение стабильности препарата показало постоянство его фракционного состава в течение 3 лет хранения. Несмотря на увеличение содержания Fab-фрагментов с 9,32 % до 16,17 %, что связано с деградацией молекул IgG под действием остаточного количества протеолитических ферментов, процесс фрагментации не изменил количество фракций иммуноглобулина. Было показано, что аттестуемой характеристикой для каждой фракции IgG может служить коэффициент распределения - Kav.

ОСО иммуноглобулина используется на предприятиях РФ, выпускающих препараты иммуноглобулинов, для калибрования хроматографической колонки при проведении контроля молекулярного состава препарата методом гель-фильтрации. Его применение позволило помимо калибрования колонки оценивать пригодность хроматографической системы для контроля, тем самым способствовало повышению качества данного вида анализа на предприятиях и стандартности продукции.

В настоящее время для контроля молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов широко используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), рекомендованный Европейской Фармакопеей. В связи с этим изучили разработанный ОСО методом ВЭЖХ. Фракции характеризовали по времени удерживания на колонке. Были выявлены те же основные фракции, которые выявлялись методом гель-фильтрации, а также три фракции низкомолекулярных фрагментов, которые не разделялись методом гель-фильтрации. Таким образом, характеристика ОСО может быть дополнена результатами ВЭЖХ и использоваться для оценки пригодности хроматографической ВЭЖХ системы по количеству выявляемых фракций.

3.3. Разработка стандартных образцов и прецизионность комплексоно-метрического метода определения ионов алюминия.

Комплексонометрический метод определения алюминия в сорбированных препаратах - анатоксинах, вакцине АКДС, клещевого энцефалита, гепатита В и гепатита А - был отработан в ГИСК и внедрен в практику контроля МИБП в соответствии с рекомендациями ВОЗ в начале 80-х годов прошлого века (МУ 1982 г.). В связи с тем, что определение ионов алюминия в сорбированных препаратах прово-

дится после минерализации исходного образца, для оценки правильности проведения всего анализа был разработан стандартный образец на основе сорбированного столбнячного анатоксина, с помощью которого проведена оценка прецизионности комплексонометрического метода в межлабораторных испытаниях.

Межлабораторные испытания были проведены с участием 7 предприятий по производству МИБП, в каждом испытании участники проводили 10-кратное одномоментное определение ионов алюминия. Межлабораторные испытания показали, что коэффициент вариации результатов участников не превышал 9,9 %.

В связи с тем, что в вакцине гепатита В содержание ионов алюминия меньше, чем в анатоксинах, и находится в пределах 0,35 - 0,65 мг/мл, в 2006 г. разработали дополнительный ОСО с меньшим содержанием ионов алюминия. В настоящее время используются два стандартных образца содержания ионов алюминия, результаты аттестации которых представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Результаты аттестации стандартных образцов с высоким и низким содержа-

нием ионов алюминия

ОСО 42 - 42-28-333-06 П ОСО 42-42-28-333а -06

Аттестованная характеристика -от 0,67 до 0,87 мг/мл (п = 23) Среднее арифметическое - 0, 77 мг/мл Стандартное отклонение - 0,05 мг/мл Коэффициент вариации - 6,49 % Доверительный интервал - 0,10 мг/мл Аттестованная характеристика -эт 0,30 до 0,46 мг/мл (п = 28) Среднее арифметическое - 0,38 мг/мл Стандартное отклонение - 0,04 мг/мл Коэффициент вариации -10,5 % Доверительный интервал - 0,082 мг/мл

Анализ результатов применения разработанных ОСО содержания алюминия на предприятиях по производству МИБП показывает, что при его использовании стандартное отклонение результатов не превышает установленного при аттестации ОСО. Однако, сравнение результатов определения ионов алюминия в ГИСК с данными паспорта за последние 3 года показывает, что, хотя препараты соответствуют требованиям НД, различие с паспортными данными не превышает двух стандартных отклонений (Б) только при контроле вакцины гепатита В, при контроле анатоксинов различие превышает + 2 Б в 20 % отконтролированных в ГИСК серий. В связи с этим требуется уточнение прецизионности комплексонометрического метода определения ионов алюминия, целесообразно проведение на регулярной основе межлабораторных испытаний для оценки воспроизводимости методики с одной стороны, с другой стороны возникшая ситуация свидетельствует о целесообразности возобновления регулярного инспектирования лабораторий ОКК сотрудниками ГИСК им.Л.А.Тарасевича МИБП для своевременного выяснения возможных источников расхождения результатов с целью недопущения выпуска некачественной продукции.

4. ВАЛИДАЦИЯ ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА В.

4.1. Разработка стандартного образца содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В.

В настоящее время в России разрабатывается большое количество тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе для выявления ДНК вируса гепатита В.

С целью создания системы контроля качества отечественных тест-систем на основе полимеразной цепной реакции была поставлена задача создания отраслевого стандартного образца содержания ДНК HBV. Поскольку все изучаемые тест-системы для выявления ДНК HBV использовали праймеры к области гена HBsAg вируса гепатита В, стандартный образец разрабатывали на основе рекомбинантной плазмиды рВН320, несущей вставку участка ДНК генома вируса гепатита В, кодирующего области HBsAg и HBcAg вируса гепатита В. Проведенная нами оценка чистоты выделенной в препаративных количествах рекомбинантной плазмиды рВН320 и ее подлинности показала, что препарат соответствовал данным, полученным авторами. Поскольку первоначально наборы реагентов для количественного определения ДНК были недоступны, для оценки числа копий ДНК рекомбинантной плазмиды рВН320 использовали двустадийную полимеразную цепную реакцию с двумя парами праймеров к области HBsAg HBV и метод лимитирующих разведений [Taswell С., 1981, Rodrigo A.G. et al.1997]. По количеству положительных результатов ПЦР из общего количеству исследованных ПЦР реакций программа QUALITY рассчитывает количество копий ДНК в исходном образце в объеме пробы (в данном случае - 10 мкл), а также %2 (критерий Пирсона), стандартную ошибку и вероятность появления данного значения %2. Затем проводили пересчет количества ГЭ на 1 мл исследуемого образца. Концентрация ОСО составила 1,5 х106 + 0,4 ГЭ/мл или копий/мл.

Для подтверждения установленной концентрации провели одновременное определение наличия ДНК HBV в разведениях ОСО и первого Международного стандартного образца ДНК HBV, предварительно выровняв растворы по концентрации. Для обоих образцов последнее разведение, в котором был получен положительный результат, было одинаковым.

Раствор ОСО ДНК стабилен в течение 8 лет хранения при температуре не выше минус 68 °С (срок наблюдения).

4.2. Валндацип тест-системы «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦН11НЭ Роспотрсбпадзора) для количественного определения ДНК вируса гепатита В с гнбрлдизацнонно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме «реального времени».

ПЦР тест-системы для выявления ДНК/РНК возбудителей инфекционных заболеваний представляют собой комплекты всех необходимых реагентов для определения целевых ДНК или РНК. Тест-системы для выявления возбудителей

инфекционных заболеваний (неколичественные), в том числе и на основе ПЦР, оцениваются по специфичности, пределу обнаружения, диагностической эффективности, которая включает специфичность, чувствительность и воспроизводимость в испытаниях на клинических образцах. ПЦР тест-системы для количественного определения ДНК/РНК возбудителей инфекционных заболеваний (в основном вирусных), как правило, применяются уже после выявления возбудителя, т.е. они предназначены не для диагностики, а прежде всего для оценки вирусной нагрузки. В связи с этим по нашему мнению к ним должны предъявляться требования, аналогичные требованиям к количественным аналитическим методикам. Это побудило нас применить разработанные нами методические основы валидации количественных аналитических методик к испытаниям количественных ПЦР тест-систем.

Данные тест-системы основаны на гибридизационно-флуоресцентной детекции результатов амплификации в режиме «реального времени», содержание нуклеиновых кислот пропорционально показателю С,, характеризующего количество циклов, необходимых для появления сигнала.

Работу провели на примере тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В «АмплиСенс НВУ Монитор ШТ» (ФГУН ЦНИИЭ Роспот-ребнадзора), которая состоит из двух комплектов реагентов: комплект для выделения ДНК из клинического материала и комплект для проведения ПЦР с одновременной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» (П1Т). Расчет количества копий ДНК в исследуемом образце проводится автоматически по калибраторам тест-системы, полученный результат пересчитывается относительно внутреннего контрольного образца, который добавляется во все образцы.

Специфичность тест-системы подтвердили на образцах плазмы крови доноров с отрицательными результатами ИФА на наличие HBsAg и отрицательными результатами ПЦР на наличие ДНК НВУ. Исследовано 12 образцов плазмы донорской крови при помощи изучаемой тест-системы. Во всех 12 образцах получены отрицательные результаты (О в исследуемых образцах не определяется).

Для определения линейного диапазона использовали ОСО ДНК гена HBsAg, стандартный образец предприятия (СОПр) ДНК НВУ на основе плазмы крови и клинический образец - плазма крови больного гепатитом В. Анализ стандартных образцов проводили с использованием исходной концентрации и разведений в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625 и 1:3125, для клинического образца использовали десятикратные разведения. ОСО разводили ТЕ-буферным раствором, остальные образцы - сывороткой крупного рогатого скота.

Графики зависимости концентрации ДНК НВУ (^ копий/мл) от логарифма разведения и расчет уравнения линии регрессии представлены на рисунке 8.

Коэффициент детерминации более 0,99 свидетельствует о линейности тест-системы в диапазоне ]£ концентрации от 5х102 до 107 копий/мл ДНК вируса гепатита В. Однако, если рассчитать исходную концентрацию с учетом разведения, более, чем 25-кратное разведение, приводит к завышению результатов в 1,5 раза и более (таблицы 6 и 7, завышенные результаты выделены жирным шрифтом), что свиде-

тельствует о непостоянстве коэффициента при разведении образцов. Это следует учитывать при проведении пробоподготовки, в случае необходимости целесообразно использовать разведение не более, чем в 25 раз.

-осо

—в—СОП 37

-«—Клинический образец

3 4

разведение, 1я

Рисунок 8. График зависимости концентрации ДНК НВУ копий/мл) от ^ разведения при исследовании ОСО ДНКнвзл8, СОПр ДНК НВУ и клинического образца. Уравнения линии регрессии: у0со = - 0,9887х + 6,8059 Я2 = 0,9969 Усопр = - 0,7395х + 5,1845 Я2 = 0,989 Уклин овр- = -1,0037х + 8,7813 Я2 = 0,9963

Изучение прецизионности проводили с СОПр ДНК НВУ в исходной концентрации и его 5-кратных разведений, а также с использованием клинического образца и его десятикратных разведений. Все образцы были зашифрованы. Номера шифров не повторялись. Каждую концентрацию исследовали три оператора в двух повторах в один день, в течение трех дней. Результаты статистической обработки представлены в таблицах 6 и 7.

Как вадно из таблиц 6 и 7, стандартное отклонение увеличивается с увеличением концентрации, коэффициент вариации не превышает 86 %, что является удовлетворительным для данного вида анализа, по существу, заменяющего микробиологические или вирусологические тесты. Однако это требует особой тщательности и внимания при работе с образцами на пределе количественного определения.

Провели оценку воспроизводимости изучаемой тест-системы с помощью образцов, содержащих ДНК НВУ на пределе количественного определения, путем 8-кратного исследования разными исполнителями ОСО ДНК НВУ, разведенного до концентрации 5х102 копий/мл, а также исходного ОСО.

Стандартное отклонение (Б) воспроизводимости изучаемой тест-системы для нижнего диапазона концентраций концентрации ДНК НВУ (5x102 копий/мл) составило 6,9 х102 копий/мл, коэффициент вариации (СУ)-112%, для верхнего диапазо-

на концентрации ДНК НВУ (105 копий/мл) стандартное отклонение составило 4,96 х 104 копий/мл, СУ - 35 %.

Таблица 6.

Результаты определения ДНК НВУ в СОПр ДНК НВУ

Разведение CV, Хер,(коп/мл) с

Оператор кратность lg Хер коп/мл S, коп/мл % учетом разведений

исх 0 116050 49819 43 1,2x105

1 5 0,69 34300 10081 29 1,7x10'

25 1,39 8335 2703 32 2,1х105

125 2,09 2797 665 24 3,5x10'

исх 0 131533 50436 38 1,3x105

2 5 0,69 30633 17264 56 1,5x103

25 1,39 7585 6552 86 1,9x10'

125 2,09 1621 1191 74 2,0 хЮ'

исх 0 177333 39535 22 1,8x10'

3 5 0,69 36970 29244 79 1,8x10'

25 1,39 10838 2932 27 2,7x10'

125 2,09 2392 1397 58 3,0 хЮ'

625 2,79 716 295 41 4,5 хЮ'

Таблица 7.

Результаты определения ДНК НВУ в клиническом образце

Разведение Хер, S, CV, % Хер (коп/мл) с уче-

Кратность lg коп/мл коп/мл том разведений

10 1 46091667 36886010 80 4,6x10s

100 2 3515000 1808563 51 3,5x10s

1000 3 348500 128881 37 3,5x10s

10000 4 40583 18868 46 4,1x10s

10000 5 5588 2590 46 5,6x10"

100000 6 1246 1002 80 1,2x10'

Для оценка правильности провели сравнительное определение содержания ДНК HBV в клинических образцах исследуемой и референтной тест-системой «Cobas Amplicor HBV Monitor test», «Хоффманн JIa-Рош» (Швейцария), в которой используется гибридизация продуктов амплификации со специфическими олигонук-леотидными зондами и детекция полученного продукта с помощью ИФА.

Определение концентрации ДНК HBV проводили на образцах от пациентов с положительными результатами ИФА на наличие HBsAg и положительными результатами ПЦР на наличие ДНК НВУ. Всего было изучено 10 образцов. В 6 из 10 изу-

ченных образцов концентрация ДНК НВУ были выше верхнего предела определения тест-системы сравнения. В связи с тем, что тест-система сравнения имеет более узкий диапазон линейности (от 200 до 200000 копий/мл) определить коэффициент корреляции не удалось, в остальных 4 образцах результаты различались не более, чем на 0,21 С учетом авторских испытаний, различие результатов не превышало 0,3 что свидетельствует об удовлетворительной правильности изучаемой тест-системы.

Установленные характеристики тест-системы: специфичность, линейность в диапазоне от 5x102 до 107 копий/мл, воспроизводимость + 0,3 ^ и правильность в пределах 0,3 ^ позволяют использовать тест-систему для количественного определения ДНК НВУ.

Определение вирусной нагрузки в клинических образцах от 8 пациентов, до начала противовирусной терапии и через 4 недели после начала лечения, показало возможность оценки эффективности проводимой противовирусной терапии. У шести пациентов вирусная нагрузка снизилась на 2 ^ и более, у одного - на 1,57 у одного пациента осталась без изменения - снижение на 0,17

Таким образом, на основе методологии валидации аналитических методов контроля МИБП с помощью разработанного ОСО содержания ДНК гена НВ5А£ вируса гепатита В проведена валидация количественной ПЦР тест-системы для выявления вируса гепатита В. Линейность, диапазон определяемых величин, предел количественного определения, воспроизводимость и правильность тест-системы позволяют использовать ее для количественного определения ДНК вируса гепатита В в плазме и сыворотке крови.

При разработке, производстве и контроле качества МИБП широко используются химические и иммунохимические методы (определение белка, консервантов, сорбента, гетерологичных примесей).

Особенностью МИБП является вариабельность состава и отсутствие эталонной базы. В связи с этим ответственность за создание и поддержание определенного уровня измерений ложится на разработчика методики. Наши исследования показывают, что именно при разработке аналитической методики необходимо устанавливать ее валидациопные характеристики, а также процедуру их подтверждения в дальнейшем.

Другой особенностью МИБП п отсутствие эталонной базы является то, что сама аналитическая методика становится основой для создания стандартных образцов. Это обуславливает чрезвычайную важность подробного описания методики, условий ее проведения и объективного установления валидациопных характеристик.

Нами определен оптимальный комплекс факторов, лежащий в основе системы контроля МИБП химическими и иммунохимическими методами.

В результате проведенных исследований предложена методология оценки валидациопных характеристик аналитических методов. Установлена прецизионность методик, включенных в нормативные документы па МИБП и вновь разрабо-

тайных. Показана возможность использования методологии оценки валидационных характеристик при изучении и стандартизации ПЦР тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В.

Для получения объективной информации о состоянии аналитической работы при контроле ряда основных химических показателей вакцин календаря прививок нами разработаны стандартные образцы содержания белкового азота, мертиолята, ионов алюминия. Использование данных образцов при организации межлабораторных испытаний может быть дополнением к системе контроля МИБП, которая предусматривает контроль на производстве и ГИСК им.Л.А.Тарасевича, а также альтернативой инспекционным проверкам аналитических лабораторий, регулярное проведение которых в настоящее время не регламентировано.

Проведение контроля качества МИБП с использованием методик, разработанных или охарактеризованных в соответствии с предложенной методологией валида-ции, будет способствовать получению объективных результатов и недопущению недоброкачественных препаратов в практику здравоохранения, что является основой политики в области контроля качества как производителей МИБП, так и ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича, курирующего данные препараты.

ВЫВОДЫ

1. Определен оптимальный комплекс факторов, являющихся основой системы контроля качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохими-ческими методами:

- стандартизированные методики контроля с установленными валидацион-ными характеристиками;

- стандартные образцы для определения показателей качества и для внутрила-бораторного контроля качества аналитической работы, аттестованные валидирован-ными методами;

- составление методики в соответствии с требованиями к написанию стандартной операционной процедуры, предусматривающее указание критериев пригодности полученных результатов;

- критерии пригодности использующегося оборудования

- критерии достаточной квалификации персонала.

- соответствующие помещения, условия окружающей среды, реагентная база.

2. Установленные валидационные характеристики стандартизованных (определение белкового азота, Ви-антигена) и вновь разработанных (определение БСА, мертиолята, хлороформа, фенола) химических и иммунохимических методов анализа МИБП обеспечивают получение объективных результатов. Для стандартизованных методов устанавливают прецизионность и правильность; для вновь разрабатываемых методов устанавливают линейность, прецизионность, правильность, предел обнаружения, предел количественного определения в зависимости от назначения методики.

3. Впервые в отечественной практике контроля МИБП на модели методики определения белкового азота проведены испытания по оценке прецизионности на межлабораторном уровне. Испытания и анализ полученных результатов, проведенные в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725 с привлечением специалистов в области математической статистики и метрологии, позволили идентифицировать источники расхождения результатов участников.

4. Предложенный алгоритм оценки прецизионности: получение независимых результатов с использованием не менее 3 образцов в необходимом диапазоне концентрации и не менее, чем трехкратное повторение анализа (оптимально - пятикратное), - позволяет обеспечить объективную оценку показателя. При проведении оценки целесообразно использование зашифрованных образцов.

5. Проведенная оценка прецизионности химических и иммунохимических методик контроля качества МИБП позволяет впервые в отечественной практике использовать данную характеристику для научно-обоснованного сравнения результатов контроля в ГИСК им.Л.А.Тарасевича с результатами предприятий-изготовителей МИБП при определении Ви-антигена методом РИЭФ (СУ = 8 %), белкового азота с реактивом Несслера (СУ = 7-16 %), белка с биуретовым реактивом (СУ = 1,4 %), БСА методами РИЭФ (СУ = 16 %) и ИФА (СУ = 8 %), мертиолята атомно-абсорбционным методом (СУ = 8-10 %), хлороформа колориметрическим методом (СУ = 12 %), ионов алюминия комплексонометрическим методом (СУ = 10,5 %).

6. Впервые в практике контроля МИБП разработанные ОСО содержания белкового азота, мертиолята и ионов алюминия, предназначенные для оценки правильности проведения соответствующих анализов, позволяют предприятиям по производству МИБП оценивать стабильность результатов определения белкового азота в полуфабрикатах анатоксинов, мертиолята и ионов алюминия в сорбированных препаратах.

7. Разработана и унифицирована методика определения БСА в культу-ральных вирусных вакцинах с использованием метода РИЭФ, которая позволила достоверно определять отсутствие не только БСА, но и других белков СКРС в культуральных вирусных вакцинах.

8. Разработанная чувствительная методика определения консерванта -мертиолята в вакцинах, анатоксинах и лизатах бактериальных культур с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТА.ЭТА позволяет определять содержание мертиолята и его остаточные количества.

9. Разработка и внедрение методики количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках позволили определять остаточное содержание хлороформа в антитоксических сыворотках, которое не должно превышать 0,1 %.

10. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания ДНК гена НВбА§ вируса гепатита В позволил провести валидацию и унифицировать методы контроля воспроизводимости и аналитической чувствительности количественной тест-системы для выявления ДНК НВУ методом полимеразной цепной реакции.

Практические рекомендации

1. Разработанную методологию валидации аналитических методов целесообразно использовать предприятиям по производству МИБП при валидации стандартизованных методов для оценки прецизионности и правильности, а также при установлении валидационных характеристик вновь разрабатываемых методов.

2. Рекомендуется с помощью разработанных стандартных образцов проведение внутрилабораторного контроля качества аналитической работы при определении основных химических показателей вакцин календаря прививок - белкового азота, мертиолята и ионов алюминия.

3. Рекомендуется на регулярной основе проводить межлабораторные испытания по основным видам анализа химических показателей (белковый азот, мертиолят, ионы алюминия) с целью мониторинга воспроизводимости данных методов в ГИСК им.Л.А.Тарасевича и на предприятиях по производству МИБП.

Список опубликованных печатных работ по теме диссертации.

1. Волкова, P.A. Применение метода ракетного иммуноэлектрофореза для анализа вирусных вакцин / Р.А.Волкова, Т.А. Седова // Сборник трудов ГИСК. -Москва, 1989.-С. 116-122.

2. Волкова, P.A. Методы очистки и концентрирования инактивированных вирусных вакцин. Адьюванты. // В кн. Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней. - Пермь, 1993. - Т. 1. - С.79 - 93.

3. Рунова, О.Б. Методы качественного и количественного определения фенола и его производных в биологических средах / О.Б. Рунова, P.A. Волкова // Клиническая лабораторная диагностика. -1996. -№5. - С. 15-19.

4. Волкова, P.A. Разработка стандартных образцов для анализа химических и физических показателей качества МИБП / P.A. Волкова, В.Г. Гавриленкова, Т.М. Каргина // Материалы VII съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 1997.-Т. 1.-С. 426-427.

5. Волкова, P.A. Совершенствование методов контроля химических показателей качества МИБП. Определение белка в сорбированных препаратах. Определение протеолитической активности плазмина в иммуноглобулине до и после активизации плазминогена / P.A. Волкова, В.Г. Гавриленкова, Т.М. Каргина // Материалы VII съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 1997. - Т. 1. - С. 430 - 431.

6. Каргина, Т.М. Препарат иммуноглобулина в качестве калибранта для метода гель-фильтрации / Т.М. Каргина, P.A. Волкова, В.Ю. Гавриленкова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000. - № 1. - С. 84 -86.

7. Рунова, О.Б. Количественное определение фенола в аллергенах и вакцинах методом газожидкостной хроматографии / О.Б. Рунова, P.A. Волкова // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. - № 7. — С. 12 -14.

8. Волкова, P.A. Молекулярно-генетическая диагностика гепатита В / P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, Н.В. Шалунова, В.Г. Петухов, Асади Мобархан А.Х., С.М., Беглова В.В., Покровский Г.А., Шипулин, О.Ю., Шипулина, Г.О. Шайхаев, А.Б.Комаров, Г.В.Спирина, М.Ю.Кириллов// Генодиагностика в современной медицине: сб. тезисов III Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2000. - С. 208211.

9. Волкова, P.A. Тест-системы для выявления ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции / P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, Н.В. Шалунова // Биопрепараты. - 2001. -№ 2. - С. 14 - 18.

10. Волкова, P.A. Стандартизация и сертификация ПЦР тест-систем / P.A. Волкова, Т.А. Бектимиров // Генодиагностика инфекционных заболеваний: сб. тезисов IV Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2002. - С.402-403.

11. Гринэ, М.М. Сравнительный ретроспективный анализ алгоритмов обработки данных, полученных при аттестации отраслевого стандартного образца (ОСО) содержания белкового азота / М.М. Гринэ, Т.М. Конакова, P.A. Волкова, Г.Е Фролова // Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций: материалы I Всероссийской конф. по вак-цинологии. - Москва, 2004.-С. 17.

12. Устинникова, О.Б. Аттестация отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине / О.Б. Устинникова, P.A. Волкова, Н.П. Ванеева // Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций: материалы I Всероссийской конф. по вакцинологии. - Москва, 2004. - С. 72 - 73.

13. Безруков, В.М. К оценке диагностической ценности ПЦР тест-систем по результатам Государственных испытаний / В.М. Безруков, P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, Т.С. Шобухова // Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. - 2005. - № 2. - С. 53 - 55.

14. Устинникова, О.Б. К вопросу об аттестации отраслевого стандартного образца содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине / О.Б. Устинникова, P.A. Волкова, Н.П. Ванеева // Биопрепараты - 2005. - № 1(17). -С. 24- 26.

15. Устинникова, О.Б. К вопросу о валидации ИФА-тест-системы / О.Б. Устинникова, P.A. Волкова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина // Молекулярная медицина и биобезопасность: сб. тезисов Второй конф. с междунар. участием. - Москва, 2005 .-С. 271.

16. Бектимиров, Т.А. Стандартизация ПЦР тест-систем / Т.А. Бектимиров, P.A. Волкова // Биопрепараты. - 2005. - № 2 (18). - С.29-31.

17. Медуницын, Н.В. О программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препарпатов при регистрации в Российской Федерации / Н.В. Медуницын, В.М. Бондаренко, P.A. Волкова, В.Г.

Жуховицкий, В.М. Безруков, A.B. Шобухов // Биопрепараты . - 2006. - № 1(25). -С.23-26.

18. Эльберт, Е.В. Разработка ОСО содержания ДНК вируса гепатита В на основе рекомбинантной плазмиды рВН320 / Е.В. Эльберт, P.A. Волкова, Г.А. Шипу-лин, О.Ю. Шипулина II Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций: сб. тезисов Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2006. - С.112.

19. Устинникова, О.Б. Применение ИФА тест-системы для определения БСА в препаратах вирусных сборов и вакцин коревой, паротитной и паротитно-коревой культуральных живых сухих / О.Б. Устинникова, P.A. Волкова, А.Ю. Звона-рев, М.Н. Кулякина // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: сб. материалов конф. - Нижний Новгород, 2006.-С. 134.

20. Волкова, P.A. Валидация метода ИФА с использованием тест-системы «Immunoenzymetric assay for the measurement of BSA" для определения БСА в препаратах вирусных сборов и готовой продукции коревой, паротитной и паротитно-коревой вакцин / P.A. Волкова, О.Б. Устинникова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина // Вакцинология - 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: сб. тезисов Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2006 . - С. 29 - 30.

21. Устинникова, О.Б. Оценка характеристик метода определения содержания БСА в паротитной вакцине и вирусных сборах с помощью иммуноферментного анализа / О.Б. Устинникова, P.A. Волкова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина // Биопрепараты . - 2006. - № 3 (23). - С. 24 - 27.

22. Каргина, Т.М. Применение атомно-абсорбционного спектрометра с электротермическим атомизатором для анализа мертиолята в сорбированных вирусных, бактерийных вакцинах и анатоксинах / Т.М. Каргина, Ю.М. Садагов, JI.JI. Короли, P.A. Волкова // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: сб. тезисов науч. - практ. конф.. - Москва, 2006. - С.47.

23. Гринэ, М.М. Валидация количественных аналитических методик. Опыт применения концепции международного стандарта ИСО 4259 в исследовании метрологических возможностей методики определения химических показателей иммунобиологических препаратов / М.М. Гринэ, Т.М. Конакова, P.A. Волкова, Г.Е. Фролова // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: сб. тезисов науч. -практ. конф. - Москва, 2006. - С.36-37.

24. Волкова, P.A. Опыт применения МУ 3.3.2.1886-04 / P.A. Волкова, Т.А. Бектимиров // Биопрепараты. - 2006. - № 4 (24). - С.25-26.

25. Волкова, P.A. Валидация метода ракетного иммуноэлектрофореза для определения БСА в вирусных вакцинах / P.A. Волкова, О.Б. Устинникова // Клиническая лабораторная диагностика. -2007. -№9. - С. 70 -71.

26. Волкова, P.A. Современные препараты для выявления генетического материала возбудителей инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции / P.A. Волкова, Е.В. Эльберт // Генодиагностика инфекционных болезней — 2007: сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2007. - Т. 1. -С. 11-12.

27. Эльберт, Е.В. Результаты испытаний препарата «Амплисенс HBV Мо-нитор-FRT» тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» / Е.В. Эльберт, P.A. Волкова, В.Г. Петухов, B.C. Зайцев, Г.А. Михайловская, Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007: сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва,

2007.-Т. 1.-С. 325-326.

28. Волкова, P.A. Валидация методов контроля микробиологических препаратов / P.A. Волкова, Т.А. Бектимиров // Фармация. — 2008. — №5. - С. 12 — 15.

29. Пустошилова, Н.М. Проблемы определения белка в биопрепаратах / Н.М. Пустошилова, Л.В. Шуленина, О.Б. Рунова, P.A. Волкова // Фармация. —

2008.-№5.-С. 15-18.

30. Волкова, P.A. Определение показателей точности тест-системы для оценки паротитной и коревой вакцин / P.A. Волкова, О.Б. Устинникова, А.Ю. Звонарев, М.Н. Кулякина, В.М. Колышкин II Фармация. - 2008. - № 6. - С. 5 — 7.

31. Творогова, М.Г. Результаты оценки качества выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатита В и С методом ПЦР по данным ФСВОК в 2007-2008 годах / М.Г. Творогова, В.П. Чуланов,P.A. Волкова, А.Б. Судариков, М.И. Михайлов, В.Н. Малахов // Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Справочник / Под. ред. Г.Г. Онищенко, А.Б. Жебруна. - С - Пб., 2009. - С. 70-73.

32. Волкова P.A. К вопросу о валидации аналитических методов. /Р.А.Волкова// Справочник заведующего КДЛ. -2009. -№ 4. - С. 44-49.

33. Бектимиров, Т.А. Методы контроля медицинских биологических препаратов, вводимых людям. / Т.А. Бектимиров, В.В. Блоха, P.A. Волкова, В.Ю. Гав-риленкова, Т.Е. Елизарова, Т.М. Каргина, Д.Т. Леви, Н.И. Донская, Н.В. Медуницын, Л.В. Минакова, H.A. Озерецковский, В.Г. Петухов, В.Ф. Рунова, Т.А. Седова, И.В. Черняховская, Н.В. Шалунова, С.М. Штанчаева, Е.В. Эльберт // Методические указания. МУК 4.1/4.2.588-96. - Москва, 1996. - 98 с.

34. Волкова, P.A. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов / P.A. Волкова, В.Ю. Гавриленкова, Т.М. Каргина, С.М. Штанчаева, Э.И. Конду, Е.В. Эльберт, В.Ф. Рунова, В.В. Блоха, И.В. Черняховская // Фармакопейная статья ФС 42-3874-99. - Москва, 1999. - 77 с.

35. Бектимиров, Т.А. Составление, рассмотрение, введение в действие стандартных операционных процедур / Т.А. Бектимиров, P.A. Волкова, Д.Т. Леви,

H.B. Медуницын, A.A. Мовсесянц, В.Г. Петухов // Методические рекомендации № 11-3/11-09.-Москва,2003.-19 с.

36. Бектимиров, Т.А. Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов / Т.А. Бектимиров, P.A. Волкова, Н.В. Медуницын, A.A. Мовсесянц, В.Г. Петухов, Т.М. Каргина, В.Ю. Гавриленкова, О.Б. Устинникова, В.И. Малкова, Е.В. Эльберт // Методические указания 3.3.2.1886-04. - Москва, 2004. -39 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АС - Анатоксин столбнячный

АД - Анатоксин дифтерийный

АДС - Анатоксин дифтерийно-столбнячный

АКДС - Вакцина коклюшная с дифтерийно-столбнячным анатоксином БСА - Бычий сывороточный альбумин ГЖХ - Газо-жвдкостная хроматография ГИСК - ФГУН ГИСК им. Л. А.Тарасевича Роспотребнадзора ИФА - Иммуноферментный анализ МИБП - Медицинские иммунобиологические препараты МУ - Методические указания ОКК - Отдел контроля качества ОСО - Отраслевой стандартный образец ПКО -Предел количественного определения ПО - Предел обнаружения ПЦР - Полимеразная цепная реакция РИЭФ - Ракетный иммуноэлектрофорез СП - Санитарные правила СОП- Стандартная операционная процедура СОПр - Стандартный образец предприятия СРС - Сыворотка рогатого скота СКРС - Сыворотка крупного рогатого скота ТХУ - Трихлоруксусная кислота ФВК - Фосфорновольфрамовая кислота

Подписано в печать 05.11.2009. Формат 60x84/32. Гарнитура «Тайме». Печать цифровая. Усл. печ. л 12 Тираж 100 экз. Заказ 165. Отпечатано в ООО «Реглет» 661-60-89; 790- 47-77 www.reglet.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Волкова, Рауза Асхатовна

Введение.

Список сокращений.

Глава 1.Обзор литературы.

1. Новый этап развития вакцинологии.

2. Методы получения вакцин.

2.1. Методы получения и очистки вирусных вакцин.

2.2. Методы получения очищенных полисахаридных вакцин.

2.3. Культуральные вирусные вакцины.

3. Система обеспечения качества - один из основных элементов GMP.

3.1. Валидация аналитических методов.

3.2. Проведение валидации.

3.3. Показатели точности.

3.4. Управление качеством.

315. Стандартные образцы как средство метрологического обеспечения аналитических методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).

4. Методы контроля показателей качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохимическими методами:.

5. Методы лабораторной диагностики вирусных гепатитов на основе амплификации нуклеиновых кислот.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты и обсуиедение.

З.Г.Разработка* методологии оценки валидационных характеристик з стандартизованных химических и, иммунохимических методов контроля качества МИБП.

1.1.Определение белкового азота с реактивом Несслера. 98,

1.1.1. Разработка стандартного образца для контроля правильности определения белкового азота.

1.1.2.Оценка валидационных характеристик методики определения белкового азота.

1.2. Определение Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине

Вианвак».

1.2.1 .Аттестация ОСО содержания Ви-антигена.

1.2.2. Валидация методики ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ), применяемого для определения содержания Ви-антигена в брюшнотифозной вакцине «Вианвак».

3.2.Методология разработки новых химических и иммунохимическнх методов контроля качества МИБП и оценки их валидационных характеристик.

2.1. Определение гетерологичных примесей в МИБП.

2.1.1. Модификация и валидация метода РИЭФ для определения бычьего сывороточного альбумина (БСА) в культуральных вирусных вакцинах.

2.1.2. Разработка стандартного образца для определения содержания

БСА методом РИЭФ.

2.1.3. Модификация и валидация методики РИЭФ с применением сыворотки против белков сыворотки рогатого скота (СРС).

2.1.4. Валидация ИФА тест-системы для определения*БСА на примере «Immunoenzymetric Assay for the Measurement of BSA»

Cygnus Technologies, Inc.», США).

2.2: Определение консервантов в МИБП.

2.2.1. Разработка и валидация методики определения содержания мертиолята в анатоксинах, вирусных и бактерийных вакцинах с помощью атомно-абсорбционного спектрометра KBAHT-Z.3TA.

2.2.2. Разработка и валидация методики, количественного определения хлороформа в антитоксических сыворотках.

2.2.3. Изучение возможности применения методики определения фенола в МИБП с помощью газожидкостной хроматографии.

3.3. Разработка стандартных образцов для химических и иммуно-химических методов контроля качества МИБП.

3.1 .Разработка стандартного образца для определения содержания белка в препаратах иммуноглобулина.

3.2. Разработка стандартных образцов для внутрилабораторного контроля качества аналитических работ при контроле МИБП. ^ ^

3.2.1. Разработка стандартного образца для калибрования хроматографической колонки при определении молекулярного состава иммуноглобулинов методом гель-фильтрации. ^

3.2.2. Разработка стандартных образцов и прецизионность комплексонометрического метода определения ионов алюминия.

3.4.Валидация ПНР тест-систем для количественного определения

ДНК вируса гепатита В.

4. 1 .Разработка стандартного образца содержания ДНК reHaHBsAg вируса гепатита В.

4.2. Валидация тест-системы «АмплиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) для количественного определения ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме «реального времени».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов химическими и иммунохимическими методами"

В современных условиях рынок иммунобиологических препаратов является международным, требования к их качеству регламентируются соответствующими международными правилами как на этапах лабораторных исследований - правила GLP (Good Laboratory Practice) и клинических испытаний — правила GCP (Good Clinical Practice), так и на этапе производства - правила GMP (Good Manufacturing Practice).

Соблюдение международных правил обязательно для всех стран входящих: в мировую систему ВТО (Всемирная торговая» организация). Россия; предпринимает меры»по вхождению в ВТО и, следовательно, требуется организация работ по-выполнению требований GLP, GCP и GMP как со стороны разрабатывающих и выпускающих МИБП организаций, так и со стороны ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

В Российской Федерации в этом плане достигнуты определенные позитивные сдвиги. Так, утвержден ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля лекарственных средств», положения которого гармонизированы с Руководством GMP, принятым в Европейском, союзе. Выполнение этих стандартов гарантирует высокий уровень, осуществляемыхфункций предприятием и контролирующимиорганами.

Правила GMP устанавливают требования* к персоналу, помещениям, оборудованию,- документации; производству продукции, проведению анализов,.системе обеспечения, и контроля качества и др.

Аналитические методы.позволяют судить об адекватности функционирования системы производства.

Валидация метода - это процесс установления пригодности метода или методики для оценки качества конкретной продукции в соответствии с требованиями нормативных документов (WHO 1999, ICH Q2A и Q2B, Eurachem 1998). Необходимость валидации аналитических методов при контроле МИБП определена международными документами, рекомендациями Всемирной организации* здравоохранения, а также отечественными нормативными документами.

В мировой практике разработка, промышленное освоение и методы контроля современных МИБП носят наукоемкий характер. Расширение номенклатуры МИБП, понимание механизмов- иммунного* ответа на молекулярном уровне," использование, достижений генной инженерии требует разработки новых методов контроля- или расширения области применения-существующих,. повышает требования к уровню их разработки, прежде всего, с учетом современных требований валидации. Данный подход широко используется в работе национальных органов контроля в странах с развитой экономикой — Великобритании, Германии, Голландии, США и др.

Применение валидированных и стандартизованных методов является одним из необходимых условий выполнения международных стандартов GLP, GCP и GMP в Российской Федерации, а также требований к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. Однако в настоящее время применительно к контролю МИБП нет единого мнения, как устанавливать ва-лидационные характеристики. Более того, понимание терминов еще не однозначно и окончательно не сложилось.

Контроль качества МИБП не может проводиться без стандартных образцов, которые используются и как мера сравнения, и для внутрилаборатор-ного контроля качества работы аналитической лаборатории. В отсутствии-эталонов основой для создания стандартных образцов становится сама- измерительная процедура. Аттестация должна проводиться валидированными, методами, поскольку только при этом условии можно обеспечить корректное установление доверительного интервала для аттестованной характеристики стандартного образца и результата анализа, полученного при его использовании.

В связи с этим разработка методологии, валидации и аттестации стандартных образцов МИБП, а также методических основ контроля качества МИБП- с использованием* современных химических, иммунохимических, мо-лекулярно-биологических методов является-актуальным.

Как известно,-, при разработке,» производстве и. контроле качества1 МИБП широко, используются;такие химические методы^ как определение-белка, консервантов,- сорбента:, иммунохимические методы, интенсивно' разрабатываются и внедряются методы на основе амплификации ДНК. В связи с усовершенствованием приборной, реагентной базы возникает необходимость модернизации известных методов и разработки новых. С другой стороны, возрастающие научно-методические и технологические возможности конструирования новых МИБП, в том числе получаемых с помощью методов современной биотехнологии и нанотехнологии, остро ставят задачу совершенствования системы контроля медицинских препаратов. Поскольку эта проблема является многоплановой, т.к. включает научный, технологический, технические, человеческий факторы, то ее решение может быть постепенным. С нашей точки зрения, в первую очередь внимание должно быть направлено на методики, их валидацию, создание и внедрение стандартных образцов.

Цель исследования.

Задачи исследования.

• Разработка методологии валидации стандартизованных (определение белкового азота с реактивом Несслера и Ви-антигена методом РИЭФ) и вновь разрабатываемых методов контроля МИБП' на примере определения БСА методом РИЭФ и ИФА, мертиолята атомно-абсорбционной спектрометрией, хлороформа колориметрическим методом; фенола методом ГЖХ.

•1 Разработка стандартных образцов для определения, показателей' качества МИБП — содержания Ви-антигена, белка, БСА.

• Создание стандартных образцов для оценки работы лабораторий по контролю качества МИБП ГИСК им.Л.А.Тарасевича и предприятий-изготовителей МИБП на примере стандартных образцов содержания белкового азота, алюминия, мертиолята, молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов.

• Валидация ПЦР тест-систем на примере набора реагентов «Ам-плиСенс HBV Монитор FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ) для количественного определения ДНК вируса гепатита В в плазме крови человека.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АС - Анатоксин столбнячный

АД - Анатоксин дифтерийный

АДС - Анатоксин дифтерийно-столбнячный

АКДС - Вакцина коклюшная с дифтерийно-столбнячным анатоксином

БСА - Бычий сывороточный альбумин

ГЖХ - Газо-жидкостная хроматография

ГИСК - ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора

ИФА — Иммуноферментный анализ

МИБП - Медицинские иммунобиологические препараты

МУ - Методические указания

ОСО - Отраслевой стандартный образец

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

ПО - Предел обнаружения

ПКО - Предел количественного определения

РИЭФ - Ракетный иммуноэлектрофорез

СП - Санитарные правила

СОП - Стандартная операционная процедура

СОПр - Стандартный образец предприятия

СРС - Сыворотка рогатого скота

СКРС - Сыворотка крупного рогатого скота

ТХУ - Трихлоруксусная кислота

ФВК - Фосфорновольфрамовая кислота и

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Волкова, Рауза Асхатовна

ВЫВОДЫ

1. Определен оптимальный комплекс факторов, являющихся основой системы контроля качества МИБП химическими, физико-химическими и иммунохимическими методами:

- стандартизированные методики контроля с установленными валида-ционными характеристиками;

- стандартные образцы для определения показателей качества и для внутрилабораторного контроля качества аналитической работы, аттестованные валидированными методами;

- составление методики в соответствии с требованиями к написанию стандартной операционной процедуры, предусматривающее указание критериев принятия полученных результатов;

- критерии пригодности использующегося оборудования

- критерии достаточной квалификации персонала.

- соответствующие помещения, условия окружающей среды, реагент-ная база.

2. Установленные валидационные характеристики стандартизованных (определение белкового азота, Ви-антигена) и вновь разработанных (определение БСА, мертиолята, хлороформа, фенола) химических и иммунохимических методов контроля МИБП обеспечивают получение объективных результатов. Для стандартизованных методов устанавливают прецизионность и правильность; для вновь разрабатываемых методов' устанавливают линейность, прецизионность, правильность, предел обнаружения, предел количественного определения в зависимости от назначения методики.

3. Впервые в отечественной практике контроля» МИБП на модели методики определения белкового азота проведены испытания по оценке прецизионности на межлабораторном уровне. Испытания и анализ полученных результатов, проведенные в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 5725 с привлечением специалистов в области математической статистики и метрологии, позволили идентифицировать источники расхождения результатов участников.

5. Проведенная оценка прецизионности химических и иммунохи-мических методик контроля качества МИБП позволяет впервые в отечественной практике использовать данную характеристику для научно-обоснованного сравнения результатов контроля в ГИСК им.Л.А.Тарасевича с результатами предприятий-изготовителей МИБП при определении Ви-антигена методом РИЭФ (СУ = 8 %), белкового азота с реактивом Несслера (CV = 7-16 %), белка с биуретовым реактивом (CV = 1,4 %), БСА методами РИЭФ (CV = 16 %) и ИФА (CV = 8 %), мертиолята атомно-абсорбционным методом (CV = 8-10 %), хлороформа колориметрическим методом (CV =12 %), ионов алюминия комплексонометрическим методом (CV = 10,5 %).

6. Впервые в практике контроля МИБП разработанные ОСО содержания белкового азота, мертиолята и ионов алюминия, предназначенные для оценки правильности проведения соответствующих анализов, позволяют предприятиям по производству МИБП оценивать стабильность результатов' определения* белкового азота в полуфабрикатах анатоксинов, мертиолята и ионов алюминия в сорбированных препаратах.

7. Разработана и унифицирована методика определения БСА в культуральных вирусных вакцинах" с использованием метода РИЭФ, котораяпозволила достоверно определять отсутствие не только БСА, но и других белков СКРС в культуральных вирусных вакцинах.

8. Разработанная чувствительная методика определения консерванта - мертиолята в вакцинах, анатоксинах и лизатах бактериальных культур с помощью отечественного атомно-абсорбционного спектрометра КВАНТ-Z-ЭТА позволяет определять содержание мертиолята и его остаточные количества.

10. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В позволил провести валидацию и унифицировать методы контроля воспроизводимости и аналитической чувствительности количественной тест-системы для выявления ДНК HBV методом полимеразной цепной реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

При разработке, производстве и контроле качества МИБП широко используются такие химические методы, как определение белка, консервантов, сорбента, иммунохимические методы, контроль которых проводится унифицированными методами. Интенсивно разрабатываются и внедряются методы на основе амплификации ДНК.

В результате проведенных исследований предложена методология оценки валидационных характеристик аналитических методов. Установлена прецизионность методик, включенных в нормативные документы на МИБП: определение Ви-антигена и БСА методом РИЭФ, БСА методом ИФА, алюминия комплексонометрическим методом, белка с биуретовым реактивом, остаточного хлороформа с резорцином, а также разработанной методики определения мертиолята атомно-абсорбционным методом на отечественном оборудовании определения фенола методом ГЖХ, коэффициенты вариации методик при оценке внутрилабораторной воспроизводимости в диапазоне определяемых концентраций следующие:

Характеристика прецизионности аналитических методик контроля МИБП

Наименование МИБП Определяемый Метод Пределы CV, показатель, определения содержания %

Анатоксины, Белковый азот С реактивом 0,05-0,4 мг/мл 7 вирусные вакцины Несслера(ТХУ) <0,05 мг/мл 16

Неинфекционные Белковый азот С реактивом 0,05-0,4 мг/мл 8 аллергены Несслера(ФВК) 0,01-0,03 мг/мл 11

Иммуноглобулины Белок С биуретовым 9,5-10,5 % 1,4 реактивом*

Сорбированные препа- Ионы алюми- Комплексо- 0,3- 1,0-мг/мл 10,5 раты ния нометрический-

Анатоксины, вакцины Мертиолят Атомно- 35 - 65"мкг/мл 8 сорбированные абсорбционный 80-120 мкг/мл 10

Культуральные БСА РИЭФ <0,5 мкг/мл 16 вирусные вакцины ИФА <0,05мкг/мл 8

Брюшнотифозная Ви-антиген РИЭФ- 35-65мкг/мл 8 вакцина

Антитоксические Хлороформ Колориме- 0,15 % 4,8 сыворотки трический 0,1 % 12

Аллергены, вакцины Фенол ГЖХ 0,2 - 0,3 % 1,6 в единичных случаях. Контролем МИБП по химическим показателям занимались, как правило, высококвалифицированные кадры с высшим специальным образованием, которое позволяло при появлении проблем с интерпретацией результата благодаря знаниям, а также используя многократное повторение анализа делать выводы о корректности полученных результатов. К сожалению, многие достижения в послеперестроечные годы были упущены.

В 80-х годах прошлого века в странах с развитой экономикой во всех отраслях начала внедряться система качества, а затем система обеспечения качества. В области производства МИБП это нашло выражение в документах по требованиям GMP ВОЗ, Европейского Союза, FDA США [147,152]. Новая система делала акцент не столько на контроль готовой продукции, сколько на обеспечение качества производства препарата в целом.

Обеспечение качества подразумевает систему мер, гарантирующих должное состояние производственных помещений, инженерных систем, оборудования, квалификацию персонала, документирование в соответствии с требованиями системы качества, периодический внутренний аудит. В свою очередь, в основе обеспечения качества контроля лежит проведение контроля валидированными методиками и мониторинг результатов контроля на основе установленных валидационных характеристик методики.

Особенностью МИБП является вариабельность состава и отсутствие эталонной базы. В связи с этим ответственность за создание и поддержание определенного уровня измерений ложится на разработчика методики, наши исследования показывают, что именно при разработке аналитической методики необходимо устанавливать ее валидационные характеристики, а также методику их подтверждения в дальнейшем.

Современная международная аналитическая практика стремиться сделать измерительную' процедуру своеобразным инструментом, позволяющим получать стабильные результаты. Можно сказать, что перед аналитиками стоит задача превратить методику в «производственный» процесс - процесс получения результата. Поэтому также как для обеспечения надлежащего производственного процесса необходимо соблюдать требования GMP, так и для обеспечения качества аналитических работ необходимо соблюдать свои требования [19,162].

Нами определен оптимальный комплекс факторов, лежащий в основе системы контроля МИБП химическими и иммунохимическими методами:

- стандартизированные методики контроля с установленными ва-лидационными характеристиками;

- методики, составленные в соответствии с требованиями к написанию стандартной операционной процедуры, предусматривающее указание критериев принятия полученных результатов и формы отчетности;

- критерии пригодности использующегося оборудования;

- критерии достаточной квалификации персонала;

- соответствующие помещения, условия окружающей среды, реа-гентная база.

Другой особенностью МИБП в отсутствие эталонной базы является то, что сама измерительная процедура становится основой для создания стандартных образцов. Это обуславливает чрезвычайную важность подробного описания методики, условий ее проведения и объективного установления валидационных характеристик.

Для получения объективной* информации о состоянии аналитической работы при контроле ряда, основных химических показателей вакцин календаря^ прививок. нами разработаны^стандартные образцы содержания белкового* азота, мертиолята, ионов алюминия. Использование данных, образцов при организации межлабораторных испытаний может быть, дополнением к системе контроля МИБП, которая предусматривает контроль на производстве и

ГИСК им.Л.А.Тарасевича, а также альтернативой инспекционным проверкам аналитических лабораторий.

По нашему мнению использование стандартных образцов и валидированных методик - основа обеспечения качества аналитической работы, поэтому именно перед разработчиками методик контроля МИБП стоит задача обеспечить такой уровень разработки, чтобы реализация измерительной процедуры стала технологическим процессом — процессом производства результатов.

Как показали межлабораторные испытания, работа по валидации методик достаточно дорогостоящее мероприятие, приходится сохранять баланс в отношении затрат на проведение валидации и получаемых сведений на основе анализа рисков. Действительно, неразумно оценивать точность, используя сложный алгоритм, если известно, что точность исходных данных или требуемая точность измерений невысоки [31]. С другой стороны остается актуальной проблема обоснования выбора и применимости конкретного алгоритма обработки данных, а также проверки соответствия реальных исходных данных требованиям формального аппарата [41]. Распространенной ошибкой является недооценка роли планирования эксперимента в расчете на то, что статистическая обработка компенсирует допущенные недочеты.

Можно указать две причины, по которым проведение полноценной валидации затруднено:

- высокая стоимость и длительность квалифицированных работ по валидации методики, поэтому объем валидации должен решаться с точки зрения соотношения польза - стоимость, т.е. на основе анализа рисков;

- отсутствие на местах специалистов в области метрологии и статистики, что не позволяет квалифицированно планировать эксперимент по оценке точностных показателей и соответственно проводить статистическую обработку.

Статистические методы, которые даются в учебниках по статистике (например, [13,36]), а также общие рекомендации руководств ICH, Eurachem и т.д. важны для понимания вопроса. Однако только специалист в области метрологии и прикладной математики может учесть все особенности при планировании эксперимента, а это основа для последующих расчетов. Также как в биохимии, например, для определения белка существуют разные методы (Лоури, биуретовый, по белковому азоту, спектрофотометрический и др.), и только специалист может квалифицированно выбрать метод, максимально адекватно отражающий действительное содержание белка в конкретном препарате, так и в математической статистике для оценки доверительного интервала аттестуемой величины необходимо знать число степеней свободы в эксперименте, а это, пожалуй, самая трудная для неспециалистов задача. Все зависит от способа получения результатов (способа сбора информации). Поэтому так важно, чтобы планирование экспериментов в области валидации осуществляли совместно специалисты в конкретной аналитической области (биохимии, химии, физики, иммунологии т.д.) и специалисты в области метрологии и математической статистики. Первые формулируют такие вопросы как, что является измеряемой величиной, специфичность, влияющие факторы, предположительная область линейности и диапазон определяемых величин. Специалисты в области метрологии и статистики, в свою очередь, планируют эксперимент так, чтобы обеспечить наименьшие затраты и квалифицированно использовать методы математической статистики при определении прецизионности и правильности. В идеале аналитики должны обладать базовыми знаниями в области статистики, а метрологи — помимо знания математической статистики должны обладать базовыми знаниями в соответствующей аналитической области.

Проведение контроля качества МИБП методиками, разработанными или охарактеризованными в, соответствии с предложенной методологией валидации будет способствовать получению-объективных результатов и недопущению недоброкачественных препаратов в практику здравоохранения, что является основой политики в области контроля качества как производителей

МИБП, так и ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича, курирующего данные препараты.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Волкова, Рауза Асхатовна, Москва

1. Адлер Ю.П., Шпер В.Л. Интерпретация контрольных карт Шухарта. Методы менеджмента качества, 2003, №11, С.34-41.

2. Адлер Ю.П., Шпер В.Л. Умеем ли мы измерять? Часть 1. На чем приходится стоять. Партнеры и конкуренты, 2006, № 5, С. 17-23.

3. Аладышева Ж.И., Береговых В.В., Мешковский А.П., Левин Л.М. Основные принципы проведения валидации на фармацевтическом производстве. М., Издательский дом «Русский врач», 2005, 186 с.

4. Апарин П.Г., «Полисахаридные вакцины против бактериальных инфекций». Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук, М., 2004, 290 с.

5. Богомолов Ю.А. ГСИ информационная основа СМК. Методы оценки соответствия. 2008, №3, С. 4-7.

6. Борисов В. А., Гаврилов Б.М., Горшков В.Б., Карпюк. М.Л. Межлабораторная аттестация стандартных образцов при малом количестве лабораторий. Стандартные образцы, 2006, №2, С.35-41.

7. Волкова Р.А., Каргина Т.М., Гавриленкова В.Ю., Рунова В.Ф. Способ определения фенола в аллергенах. Авторское свидетельство № 989410 от 14 сентября 1982 г.

8. Гааль Э., Медьеши П.М., Верецке И. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М. «Мир», 1982.

9. Гавриленкова В.Ю., Каргина Т.М. Разработка методов химического контроля биологических препаратов. Определение фенола в вакцинных препаратах и аллергенах. Сб.трудов «Стандарты, штаммы, методы контроля бактерийных препаратов», М.1978, С. 192-196.

10. Гавриленкова В.Ю., Рунова В.Ф., Черняховер С.И., Черняховская ИВ. Определение белка в сыворотке и у-глобулине. Сб.трудов «Вакцины и сыворотки», 1971, вып. 10, С. 139-143.

11. Галактионов B.F. Иммунология, М.: Академия, 2004, 480 с.

12. Гланц Стентон., «Медико-биологическая статистика», М.: Практика, 1999, 455 с.

13. ГОСТ 8.315-97. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации. Минск, 10 с.

14. ГОСТ 8.532-2002 ГСИ. Стандартные образцы состава веществ и материалов. Межлабораторная метрологическая аттестация. Содержание и порядок проведения работ, 15 с.

15. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений. Издание 2002 г. с Изменениями № 1 и 2, принятыми в мае 2001 и августе 2002 гг.

16. ГОСТ 15189-2006. Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности.

17. ГОСТ 15195-2006. Лабораторная медицина. Требования к лабораториям референтных измерений.

18. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006. Общие требования к компетентности испытательных и калбровочных лабораторий. М., 2006, 25 с.

19. ГОСТ Р 50779.42-99 (ИСО 8258-91). Статистические методы. Контрольные карты Шухарта.М., 1999, 32 с.

20. ГОСТ Р 52249-2004 Национальный стандарт Российской Федерации. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. М., 2004,211 с.

21. ГОСТ 52351-2005. Контроль объекта аналитический. Термины- и определения.

22. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений., Часть 1., Основные положения и определения.,Госстандарт России, М., 2002, 23 с.

23. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений. Госстандарт России, М., 2002.

24. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002. Точность (правильность и* прецизионность) методов и результатов/измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений. Госстандарт России,. М., 2002.

25. ГОСТ Р ИСО* 5725-4-2002*. Точность, (правильность, и прецизионность), методов и результатов измерений. Часть 4. Основные4 методы определения правильности стандартного метода измерений. Госстандарт России, М., 2002:

26. ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности. Госстандарт России, М., 2002.

27. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений., Часть 6., Использование значений точности на практике. Госстандарт России, М., 2002, 42 с.

28. Государственная Фармакопея СССР, выпуск X, 1971, С.986-987.

29. Государственная Фармакопея РФ, выпуск XII, 2007.

30. Грановский В.А., Сирая Т.Н. Методы обработки экспериментальных данных при измерениях. Л., Энергоатомиздат, Ленинградское отд., 1990.

31. Грачев В.П., Дзагуров С.Г., Миронова Л.Л., Шалунова Н.В. Проблема использования культур клеток в производстве вирусных вакцин и вопросы контроля их безвредности. — В.сб.: Руководство по вакцинному и сывороточному делу, М., 1978, С.176-184.

32. Грищенко Е.Д. Лабораторное дело. 1962, № 1, С.36-39.

33. Дворкин В.И. Внутрилабораторный контроль качества точности результатов измерений по стандартам ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ 5725-6-2002. Партнеры и конкуренты, 2003, №1, С.26-39.

34. Деминг Э. Выход из кризиса. Новая парадигма управлениями людьми, системами и процессами. М.: Альпина Бизнес Букс, 2007, 370 с.

35. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М. «Мир», 1994, 270 с.

36. Джей А. Берзофски, Айра Дж. Берковер., Взаимодействие антиген-антитело., Иммунология., Том 3, гл.23., М. «Мир», 1989, 358 с.

37. Дзагуров С.Г. , Быченко Б.Д. Термины и определения, относящиеся к стандартным образцам биологических препаратов, используемых в медицине. Сб. трудов «Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов». М., 1982, С. 1-6.

38. Добровинский И.Е., Государственная служба стандартных образцов веществ и материалов. Стандартные образцы, 2005, №1, С.11-14.

39. Добровинский И.Е., РЕМКО Комитет ИСО по стандартным образцам. Стандартные образцы, 2005, №1, С.43-48.

40. Довбета Л.И., Лячнев. В.В., Сирая Т.Н. Основы теоретической метрологии. Учебное пособие. Под ред. В.В'.Лячнева. С-Пб, СПбГЭТУ «ЛЭТИ», 1999.

41. Калмановский В.И. Продолжение легенды о прецизионности. Партнеры и конкуренты, 2003, №12, С. 25-28.

42. Калмановский В.И., Брюханов В.А. Попытки ревизовать нормы и правила, проверенные метрологической практикой, не приведут к успеху. Законодательная и прикладная метрология, 2006, №2 (84), С.22-29.

43. Каргина Т.М. Физико-химические иммунохимические свойства препаратов иммуноглобулинов и усовершенствование методов их контроля. Автореф.дисс.канд.биол.наук. М., 1988.

44. Каргина Т.М., Рунова В.Ф., Гавриленкова В.Ю. Изучение молекулярного состава препаратов иммуноглобулинов методом гель-фильтрации. Журн.эпидемиолог.и микробиол.- 1987, 12, С. 74-77.

45. Лаврищев А.А. О способах материализации духов и качественной относительности измерения. Законодательная и прикладная метрология, 2006, №2 (84), С.53-58.

46. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов, М.: Медицина, 1984., 224 с.

47. Маниатис Т., Э.Фрич, Дж.Сэмбрук, «Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование» М., 1984.

48. Медуницын Н.В., Вакцинология, М., «Триада-Х», 2004, 233 с.

49. Международный словарь терминов в метрологии VIM (Русско-англо-французско-немецко-испанский словарь основных и общих терминов в метрологии. ИПК Издательство стандартов, 1998)

50. Методические указания по применению физико-химических и химических методов контроля МИБП. М. МЗ СССР, 1982. Рунова В.Ф., Гавриленкова В.Ю, Черняховская И.В, Максимова Г.А., Волкова Р.А., КондуЭ.И.

51. Методические указания по применению физико-химических методов контроля медицинских биопрепаратов. М. МЗ СССР, 1977. Рунова В.Ф. Гавриленкова В.Ю, Максимова Г.А., Черняховская И.В., Волкова Р.А., Полякова Т.М.

52. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С (Серологические маркеры и методы их выявления). Вирусные гепатиты:Достижения и перспективы. 2001, № 2(12):

53. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Клиническая лабораторная диагностика, 2000, № 4., С.25-32.

54. Немов В.В. Физико-химические, биологические свойства и методы контроля препаратов иммуноглобулинов. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Л., 1989.

55. Носырев П., Носырева М., Рассказова Т., Корнеева Н. Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория и практика. Часть 1. Теория. «Ремедиум» № ю., 2003, С.62-64.

56. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопным методом. М.»Мир», 1983.

57. Паркани М., Кпих Г., Разбери С. Аккредитация и обеспечение качества. 2001, Т.6, №6.

58. Петров Р.В. Иммунология. М., Медицина, 1983, С.301.

59. Петухов В.Г. Метод параллельных линий для количественной оценки качества стандартных образцов и других медицинских иммунобиологических препаратов в иммуноферментном анализе. БИОпрепараты, 2004, 1(13), С.19-23.

60. Петухов В:Г. Отраслевые стандартные образцы. Основные положения, порядок разработки, изготовления, аттестации, утверждения и регистрации. Методические рекомендации. Утверждены Ученым советом ГИСК им. Л.А.Тарасевича., М., 2003, С.4.

61. Производство лекарственных средств. Валидация. Основные положения. МУ 64-04-001-2002; Мин. пром., науки и технологии РФ., 2003, 15 с.

62. Пумпен П.П., Дищлер А.В., Козловская Т.М., Бычко В., Грен Э.Я., Ривкина М.Б., Гринберг А.П., Кукайн Р.А. Клонирование ДНК вируса гепатита В в Escherichia coll Доклады Ан СССР, 1982, С. 1022-1024.

63. Пустошилова, Н.М., Л.В. Шуленина, О.Б. Рунова, Р.А. Волкова Проблемы определения* белка в биопрепаратах. Фармация. 2008, №5, С. 15-18.

64. РМГ 29-99; ГСИ. Метрология. Основные термины и определения

65. Руководство ЕВРАХИМ/СИТАК. Количественное описание неопределенности в аналитических измерениях. Пер. с англ. под ред. Л.А.Конопелько. С.-Птб., ВНИИМ им.Д.И.Менделеева, 2002.

66. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств. Ассоциация Российских фармацевтических производителей. М.2007.

67. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология». Фармация, 2008, Т.4, С.4.

68. Руководство по выражению неопределенности измерения. Пер. с англ. под ред. В.А.Слаева. С.-Птб, ВНИИМ им.Д.И.Менделеева, 1999.

69. Рунова О.Б., Волкова Р.А. Методы качественного и количественного определения фенола и его производных в биологических средах. Клиническая лабораторная диагностика, 1996 г., №5, С.15-19.

70. Самсонова B.C., Холчев Н.В., Аллилуев А.П., Шандалов В.И., Клюйкова Т.М. Фракционирование Vi-антигена S.typhi методом гель-фильтрации на сефадексе G-200. Ж. микробиол., 1973, Т.50, №10, С. 3-7.

71. СП 3.3.2.1288-03 «Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов», Минздрав России, М., 2003, 80с.

72. Степанов А.Б. Судебная химия. М.Медгиз. 1947, С.67.

73. ФСП № 42-00120274-00 «Вакцина брюшнотифозная Vi-полисахаридная, жидкая».

74. Фармакопейная статья ФС 42-3874-99 Физико-химические, химические и иммунохимические методы контроля медицинских биологических препаратов, МЗ РФ ФГК., 2000.

75. Фримель Г. Иммунологические методы. М., «Медицина», 1987, 480 с.

76. Шаевич А.Б. Стандартные образцы для аналитических целей. М., «Химия», 1987.

77. Abeyguanawardane С., Williams T.C., Sunner J.C., Development and validation of an NMR-based identity assay for bacterial polysaccharide. Annal. Biochem. 2000, V.279, P.226-240.

78. Abravaya K., Carrino J.J., Muldoon S., Lee H.H. Detection of point mutation with a modified ligase chain reaction (GAP-LCR). Nucleic Acids Research. 1995, V. 23, P. 675-682.

79. Adler S.P., Hempfling S.H., Starr S.E., Plotkin S.A., Riddell S. Safety and immunogenicity of the Towne strain cytomegalovirus vaccine. Pediatr Infect Dis J. 1998, V.17 (3), P.200-206.

80. Aguilar J.C., Rodriguez E.G. Vaccine adjuvants revisited. Vaccine, 2007, V.25, P.3752-3762.

81. Albumin. Structure, biosynthesis, function, ed.by T.Peters, I. Sjoholm, Oxf., 1978.

82. Allison A.C., Bayars N.E. Immunological adjuvants: desirable properties and side effects. Mol.Immunol., 1991, V.28, P.279-284.

83. Arya S.C. Salmonella typhim Vi antigen-negative isolates in India and prophylactic typhoid immunization. Natl. Med. J. India, 2000, V.13, P.220.

84. Balentine R. Methods in Enzimology. 1957, V.III, P.984-995, Academic Press, N.Y.

85. Bansai A.k. Bioinformatics in microbial biotechnology a mini revew. Microbial Cell Factories, 2005, V.4, P.19-29.

86. Barr E., Sings H.L. Prophylactic HPV vaccines: new interventions for cancer control. Vaccine, 2008, V.26, P.6244-6257

87. Bartle K., Elstub J., Novotny M., Robinson R. Use of modified Tenax GC column packing for the direct gas chromatographic analysis of phenol in water. J.Chromatogr. 1977, V.135, №2, P.351-358.

88. Beale A. The production of viruses for human vaccines from animal cells in culture. In: Animal Cell Biotechnology (Spier R., Grittiths J., eds), Butterworths, 1992, P.189-200.

89. Berzovsky J.A., Ahlers J.D., Janic J., Morris J., Oh S., Terabe M., Belyakov I.M. Progress on new vaccine strategies against chronic viral infections. J. Clin. Invest. 2004, V.l 14 (4), P:450-462.

90. Biological standardization and Control, WHO, A Scientific Review commissioned by the UK National Biological Standards Broad (NBSB), Geneva, 1997, 58 p.

91. Bockisch B,Grunwald T, Spillner E, Bredehorst R.Immobilized stem-loop structured probes as conformational switches for enzymatic detection of microbial 16S rRNA. Nucleic Acids Res. 2005, V.33(ll),1. Р.101.

92. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, V.72, P.248-254.

93. Brewer, J. M. (How) do aluminum adjuvants work? Immunol. Lett. 2006, V.102, P.10-15.

94. Briles DE. Hollingshead S, Brooks-Walter A, Nabors CS. Ferguson L. Schilling M, et al. The potential to use PspA and other pneumococcal proteins to elicit protection against pneumococcal infection. Vaccine, 2000, V.18 (16), P.1707-1711.

95. Brisson M., Van de Velde N., De Wals P., Boily M.C. The potential cost- effectiveness of prophylactic human papillomavirus vaccines in Ganada. Vaccine, 2007, V.25, P.5399-5408.

96. Bustin S.A., Benes V., Praft M.W. Quantitative real-time PCR a perspective. J.Mol.Endocrinol. 2005, V.34 (3), P.597 - 601.

97. Byars N., Allison A., Harmon M. W., Kendal A. Enhancement of antibody responses to influenza В virus haemagglutinin by use of a new adjuvant formulation. Vaccine, 1990, V.8> P.49-56.

98. Chen W.N., ©on C.J. Changes in the antigenicity of a hepatitus В virus mutant stemming from lamivudine therapy. Antimicrob Agents Chemother. 2000-V. 44(6), P: 1765.

99. Coleman P.F. Detection hepatitis В surface antigen mutants. Emerg. Infect.is. V. 12: 198-203, 2006.

100. Compton S. J, Jones C.G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assayAnal. Biochem. 1985, V.151, P.369-374.

101. Cooper C.L., Davis H.L., Angel J.B., Moris M.L., Elfer S.M, Seguin I. et al. CPG 7909 adjuvant improves hepatitis В virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected pations. AIDS, 2005, V.19, P.1473-1479.

102. Cox, J. C., and A. R. Coulter. Adjuvants, a classification and review of their modes of action. Vaccine, 1997, V.15, P.248-256.

103. Cuervo M.L.C., Perez L.R., Oviedo M., Costa L., Perdomo V. Relationships among physic-chemical and biological tests for a synthetic Hib-TT conjygate vaccine. Vaccine, 2007, V.25, P. 194-200.

104. Deiman B, van Aarle P, Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Mol Biotechnol. 2002, V. 20(2), P. 163-179.

105. Detmer A., Glenting J. Live bacterial vaccines. A review and identification of potential hazards. Microbial Cell Factories, 2006, V.5, P.23.

106. Don R.H., Сох P.T., Wainwright B.J., Baker R., Mattick J.S. "Touchdaun" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic. Acids Res., 1991, V. 19 (14), P. 4008.

107. Don R.H., Сох P.T., Mattick J.S. A 'one tube reaction' for synthesis and amplification of total cDNA from small numbers of cell. Nucleic. Acids Res. 1993, V. 21 (3), P.783.

108. Edelman R. Vaccine adjuvants. Rev.Infect.Dis., 1980, V.2, P370-383.

109. Edelman R., Levine M.M. Summary of international workshop on typhoid fever. Rev. Infect. Dis., 1986, V.8, P.329-349.

110. Edevag G., Eriksson M., Granstrom M. The development andstandardization of an ELISA for ovalbumin determination in influenza vaccines. J.Biol.Stand. 1986, V. 14, N 3, P. 223-230.

111. EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method valydation and related topics. 1998.

112. EURACHEM/CITAC Guide, 2000. Quantifying uncertainty in analytical measurement. EURACHEM 2000 second edition.

113. European Pharmacopoeia. 2007. Sixth ed. V.l

114. Fahy E., Kwoh D.Y., Gingeras T.R. Self-sustained sequence replication (3SR): an isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCR Methods Appl. 1991,V. 1(1), P.25-33.

115. French N, Nakiyingi J, Carpenter LM, Lugada E, Watera C, Moi K, et al. 23-Valent pneumococcal polysaccharide vaccine in ШУ-1-infected Ugandan adults: double-blind, randomised and placebo controlled trial. Lancet, 2000, V.355 (9221), P.2106-2111.

116. French N. Use of pneumococcal polysaccharide vaccines: no simple answers. J Infect. 2003, V.46 (2), P.78-86.

117. Gay C.G., Richie T.L. Advances in immunology and vaccine discovery. Report of the US-European Commision workshop. Vaccine, 2007, V.25 (41), P.7007-7011.

118. Garcon N., Chomez P., Van Mechelen M. GlaxoSmitliKline adjuvant systems in vaccines: concepts, achievements and perspectives. Expert Rev. Vaccines, 2007, V.6(5), Pi723-729.

119. Giannini S.L., Hanon E., Moris P. et al. Enhanced humoral and memory В cellular immunity using HPV 16/18 LI VLP vaccine formulated with the MPL/aluminium salt combination (AS04) compared to aluminium salt only. Vaccine, 2006, V.24, P.5937-5949.

120. Gluck R. In: New developments in rabies control. Second International IMVI —Essen/WHO Simposium, Kent. 1989, P. 493^199.

121. Goel, N., D. H. Zimmerman, and K. S. Rosenthal. Ligand epitope presentation system vaccines against herpes simplex virus. Front. Biosci. 2005, V.10, P.966-974.

122. Goel, N., Q. Rong, D. Zimmerman, and K. S. Rosenthal. A L.E.A.P.S. heteroconjugate vaccine containing a T cell epitope from HSV-1 glycoprotein D* elicits Thl responses and protection. Vaccine, 2003, V.21,P!4410-4420.

123. Gonozol E, Ianacone J; Ho WZ, Starr S, Meignier B, Plotkin S. Isolated gA/gB?- glycoprotein complex of human cytomegalovirus envelope induces humoral and cellular immune-responses in human volunteers. Vaccine, 1990, N 8, P.130—136.

124. Good manufacturing practice for biological products, WHO Technical Report, Series № 822, 1992.

125. Gornall, A. G., Bardawill, С J. and David M.M. J. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J.Biol. Chem. 1949, V. 177, P.751-766.

126. Gotschlich EC, Liu TY, Artenstein MS.Gotschlich E.C., Lin. T.Y. Human immunity to the meningococcus. 3. Preparation and immunochemical properties of the group A, group B, and group С meningococcal polysaccharides. J. Exp. Med. 1969, V.129, P. 13491365

127. Granstrom M., Eriksson M., EdevagG. A sandwich ELISA for bovine serum in viral vaccines. J.Biol.Stand. 1987, V.15, P.193-197.

128. Gregoriadis G. Immunological adjuvants: a role for liposomes. Immunol. Today, 1990, V.l 1, P.89—97.

129. Guidance for Industry. "Analytical Procedures and Methods Validation". U.S.Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. August. 2000, 37 p.

130. Handson P.D., Hanrahan P.D. A rapid gas chromatographic method for the determination of free phenol in blood. J.Agric.Food Chem. 1983, V.31, N2, P.447-448.

131. Hoist, J. ef al. Serum bactericidal activity correlates with the vaccine efficacy of outer membrane vesicle vaccines against Neisseria meningitidis serogroup В disease. Vaccine, 2003, V.21, P.734-737.

132. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures, ICH-Q2A, 1994, 5p.

133. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, 1996, 8p.

134. ISO 3534-2: 1993 Statistics-Vocabulary and symbols- Part 2: Statistical quality control.

135. ISO 5725 (parts 1-6): 1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results.

136. ISO/IEC 17025:2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.

137. IUPAC 2002.Harmonized guidelines for single-laboratory validation of analysis methods. Pure Appl.Chem. 2002, V.74, N 5, pp. 835-855.

138. Ivanoff B. Typhoid fever, global situation and WHO recommendations. South-East Asian. Trop. Med. Public Health, 1995, V.26, P.49.

139. Jacobs J., Jones C., Bailie J. Characteristics of human diploid cell designated MRC-5. Nature, 1970, 227, P. 168-170.

140. Jennings H.J., Lugowski C.W., Ashton F.E. The structure of the capsular polysaccharide obtained from a new serogroup (L) of Neisseria meningitidis. Carbohydr. Res. 1983, V.l 12, N1, Р.Ю5-111.

141. Jennings H.J., Roy R'., Gaman A. Inductions of meningococcal group В polysaccharide-specific IgG antibodies in mice by using an N-propyonylated В polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. 1986, V. 137, P.1708-1713.

142. Jones G.L. Peptide vaccine derived from malarial surface antigen: effect of dose and adjuvant on immunogenicity. Immunol. Letters, 1990, p 24, P.253-260.

143. Jones K.E, Patel N.G, Levy M.A, Storeygard-A, Balk D; Gittleman J.L, et al. Global trends in emerging infectious diseases. Nature, 2008; V.451, P;990-993.

144. Kamisango K., Kamogawa C., Sumi M-l et al. Quantitative detection of hepatitis В virus by transcription-mediated amplification and hybridization protection assay. J. Clin. Microbiol. V. 37 (2), P. 310314, 1999

145. Karthigesu V.D., Mendy M., Fortutin V. et al. The ligase chain reaction distinguishes hepatitis В virus S-gene variants. FEMS Microbiol. Lett. V. 1995,V.131 (2), P.127-132.

146. Kazzaz, J. ef al. Encapsulation of the immune potentiators MPL and RC529 in PLG microparticles enhances their potency. J. Control. Release, 2006, V.l 10, P.566-573.

147. Kelly, D. F., and R. Rappuoli. 2005. Reverse vaccinology and vaccines for serogroup В Neisseria meningitidis. Adv. Exp. Med. Biol., V.568, P.217-223.

148. Kjeldal, J. Z, Zeitschrift fur Analytische Chemie, 1883, 22, P.366-382.

149. Klugman KP, Madhi SA, Huebner RE, Kohberger R, Mbelle N, Pierce N. A trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine in children with and those without HIV infection. N Engl J Med. 2003, V.349 (14), P.1341-1348.

150. Knight, M. I, Chambers. P.J. Problems associated with determining protein concentration: a comparison of techniques for protein estimations.Mol. Biotechnol. 2003, V.23, P. 19-28.

151. Koff W.C., Hoth D: E. Development and testing of AIDS vaccines. Science, 1988, V.241, P.426—432.

152. Kohler G. Milstein C. Contenuous cultures of fused'cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 1975, 256, 495-497.

153. Koski, G. K., and B. J. Czerniecki. Combining innate immunity with radiation therapy for cancer treatment. Clin. Cancer Res. 2005, V.ll, P.7-11.

154. Krajden M., Comanor N., Rifkin O., Grigiriev A., Minor J.M., Kapke G.F. Assesment of hepatitis В virus DNA stability in serum by the Chiron Quantiplex branched-DNA assay. J.Clyn.microbiol. 1998, V.36(2), P.382-386.*

155. Krug, A., G. D. Luker, W. Barchet, D. A. Leib, S. Akira, and M: Colonna. Herpes simplex virus type 1 activates murine natural interferon-producing cells through Toll-like receptor 9. Blood, 2004, V.103, P.1433-1437.

156. Kwoh D.Y., Davis G.R., Whitfield K.M. et al. Transcription-basedamplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format.Proc Natl Acad Sci U S A., 1989, V. 86(4), P.1173-1177.

157. La'ulu S.L., Roberts W.L. The analytic sensitivity and mutant detection capability of six hepatitis В surface antigen assays. Am J Clin Pathol., 2006, V. 125(5), P.748-51.

158. Laurell C.B. Electroimmunoassay.Scand.J.Clin.Lab.Invest., 1972, V.29,suppl. 124, P.21-37.

159. Lemercinier X., Jones C., Corbel M.J., Yost S.E. Analytical procedures used in the control of bacterial glucoconjugate vaccines. Pharm. Sci., 1997, V.3, P.19-23.

160. Lemercinier X., Martinez-Cabrera I., Jones C. Use and validation of NMR test for the identity and O-acetyl content of Salmonella typhi Vi capsular polysaccharide vaccines. Biologicals, 2000, V.28, P. 17-24.

161. Lewis R.N. Variations in the sensivity of proteins to the protein assay. Anal.Biochem. 1979, V.99, P. 136-141.

162. Lifely M.R., Moreno C., Lindon J.C. An integrated molecular and immunological approach towards a meningococcal group В vaccine. Vaccine, 1987, V.5, P.ll-26.

163. Lindberg A.A. Polyosides (encapsulated bacteria). C.R. Acad. Sci. Paris, 1999, V.322, P.925-932.

164. Liu T.Y.,Gotschlich E.C. , Dunne F.T., Jonssen E.K. Studies on the meningococcal polysaccharides. II Composition- and chemical properties of the group В and С polysaccharide. J: Biol. Chem. 1971, V.246, N15, P. 4703-4712:

165. Loeffler Ji Henke N, Hebart H, Schmidt D, Hagmeyer L, Schumacher U, Einsele H*. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the light cycler system. J Clin Microbiol. 2000; V. 38(2), P.586-590.

166. Looney R.J., Steigbien R.T. Role of the Vi antigen of Salmonella typhi in resistanse to host deference in vitro. J. Lab. Clin. Med., 1981, V.108, P.506-516.

167. Lowry О. H, Rosebrough N.I, Farr L., Randall RJ. Measurement with the Folinphenol reagent J. Biol. Chem. 1951, V.193, P.265-275.

168. Ly T.D., Servant-Delmas A., Bagot S. Sensitivities of four new commercial hepatitis В virus surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms. J Virol. Methods. 2006, V. 135(1), P.109-117.

169. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Survey fad Summary Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 2002, V. 30(6), 1292-1305.

170. MayJ.C., Del Grosso A.V., Barron P.P., J.Biol.stand., 1980, V.8, P.209-218.

171. May J.C., Sih J.T.C. Protein nitrogen unit precipitation procedure for allergenic extracts: collaborative study. J. Assoc.Off.Anal.Chem. 1981, V.64 (6), P.1435-1438.

172. McAleer W.J., Buynack E.B., Maygelter R.Z., Nampler D.E., Miller W.J., Hilleman M.R. Human hepatitis В vaccine from recombinant yest. Nature, 1984, V.307, P.178-180.

173. Metz В., Jiskoot W., Mekkes D., Kingma R., Hennink W.E., Crommelin D.J.A., Kersten G.F.A. Quality control of routine, experimental and real-time aged diphtheria toxoids by in vitro analytical techniques. Vaccine, 2007, V.25, P.6863L6871.

174. Minor P. Adventitious viral" agent in biological products.-Dev.BioLStand., 1989, 70, P.l 73-179.

175. Mond J.Jl, Vos Q., Lees A., Snapper C.M. T cell independent antigens. Curr. Opin. Immunol., 1995, V.7, P.349-354.

176. Musser J. M. The next chapter in reverse vaccinology. Nat Biotechnol, 2005, V.24, P. 157-158.

177. Netea M. G., Van der Meer J. W. M., SutmuUer R. P., Adema G. J., and JuUberg B.-J. From theThl/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrob. Agents Chemother, 2005, V.49, P:3 991-3996.

178. O'Braen Т.С.,-Maloney C.J., Tauraso N.M. Quantitation of residual host protein in chicken embrio-derived vaccines by radial immunodiffusion. Applied Microbiol., 1971, V.21 (4), P.780-782:

179. Oka T, Honda T, Ohkuma K, Sakoh M, Nonaka S: Influenza vaccine: enhancement of immune response by application of carboxy-vinylpolymer. Vaccine, 1990, V.8; P.573—576.

180. Palach B. New vaccine approach for seasonal and pandemic influenza. Vaccine, 2008, V.26, P.6232-6236.

181. Parry C.M., Hien T.T., Dougan G., White N.J., Farrar J.J., Phil D. Typhoid fever. New.J. of Med., 2002, V.347, P. 1770-1782.

182. Pashine A., Valiante N. M., J. B. Ulmer. Targeting the innate immune response with improved vaccine adjuvants. Nat. Med. ll(Suppl.), 2005, S63-S68.

183. Pass RF, Duliege AM, Boppana S, et al. A subunit cytomegalovirus vaccine based on recombinant envelope glycoprotein В and a new adjuvant. J Infect Dis. 1999, V. 180(4), P.970-975.

184. Pass, R., Zhang, C., Simpson, T. et al. Cytomegalovirus (CMV) Envelope Glycoprotein В (gB) Vaccine in Young Women, in Infectious Diseases Society of America, 2007, San Diego California.

185. Peltola H., Kaythy M., Virtanen M., Makela P.H.Prevention of Haemophilus influenza type b bacterremic infections with the capsular polysaccharide vaccine. N.Engl.J.Med. 1990, V.310, P.1561-1566.

186. Peterson, G. L A simplification of the protein assay method of Lowiy et al. which is more generally applicable. Anal. Biochem. 1977, V.83, P.346-356.

187. Petricciani J. Cells, science and health.- In: Continuous Cell Lines as Substrates for Biologicals (Hayflick L., Hennessen W., eds), Dev. Biol.Stand.,,1989; 70, P.3-10.

188. Petricciani J. Historical background, objectives and overview. In: Safety of Biological Products Prepared from Mammalian Cell Culture (Brown F., Griffiths E., Horaud F., Petricciani J., eds.). Dev. Biol. Stand., 1998, 93, P.3-4.

189. Phanuphuk P., Phanpanich Т., Wongurai S., Sirivichayakil S-, Sriwanthana В., Panrnuong W., Utaisen O., Chutivongse S. Comparative immunogenicity study of four plasma-derived hepatitis В vaccines in Thai young adults. Vaccine, 1989, V.7, P.253—256.

190. Pizza, M. Et al. Identification of vaccine candidates against serogroup В meningococcus by whole-genome sequencing. Science, 2000, V.287, P:1816-1820.

191. Pulendran В., Ahmed R. Translating innate immunity into immunological memory: implications for vaccine development. Cell, 2006, V.124, P.849-863.

192. Recomendations for the production and control of Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine. In: WHO Expert Committee on biological standardization. Fourty ninth report. WHO Technical Report Series 897. Geneva, 2000. P.26-60.

193. Robbins J.D., Robbins J.B. Reexamination of protective role of the capsular polysaccharide (Vi-antigen) of Salmonella typhi. J. Infect. Dis., 1984, V.150, P.436-499.

194. Robinson H.L. New hope for an AIDS vaccine. Nat. Rev. Immunol. 2002, V.2, P.239-250.

195. Rock K. L., Hearn A., C.-J. Chen, Shi Y. Natural endogenous adjuvants. Springer Semin. Immunopathol. 2005, V.26, P.231-246.

196. Rodrigo A.G, Goracke P.C., Rowhanian K., Mullins J.I. Quantitation of target molecules from PCR-bases limiting dilution assays. AIDS Res. human retrovir., 1997, 13, p. 737-742.

197. Rone J.K., Friedstrom S. Severe systemic reactions to typhoid vaccination: two cases and review of the literature. Mil. Med., 1990, V.155, P.272-274.

198. Rosental K.S. & Zimmerman D.H. Vaccines — all things considered. Clin Vaccine Immun, 2006, V.13, N8, P.821-829.

199. Sadettin S. Ozturk, Wei-Shou Hu. Cell Culture technology for pharmaceutical and^ cell-based therapies. Cell Culture Technology — An Overview. Medium Development (A. Burgener and M.Butler). Taylor & Frarcis., New York London., 2006, P.755.

200. Saldanha J. Standardization: a progress report. Biologicals. 1999, V.27(4), P.285-289:233:. Sapan, С. V, Lundblad R£L, Price N.C . Colorimetric protein assay techniques.Biotechnol. Appl. Biochem: 1999, V.29; P.99-108.

201. Schwartz J.S. Pneumococcal vaccine: clinical efficacy and effectiveness. Annals Intern. Med.,.1982, V.96, P.208-220.

202. Sedmak J. J., and Grossberg S.E. A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250. Anal. Biochem. 1977, V.79, P.544-552.

203. Sessardic D:, Xing D.K., Crane D., Corbel M.J. Requirments for validalternative assays for testing of biological therapeutic agents. Develop.Biol.Stand. 1996, V.86, P.311-318.

204. Shephard H.R. New golden age of vaccines. Sabin Vaccine Rep., 1999, V.3,P.3-5.

205. Shewhart W.A. Statistical Methods from the Viewpoint of Quality Control (Graduate School, Department of Agriculture, Washington, 1939; Dover, 1986), P.120-121.

206. Simmonds P., Balfe P., Peutherer J.E., Ludlum C.A. Bishop J.O., Brown AJ. Human immunodeficiency virus-infected individual contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cell and low copy numbers. J. Virol., V.64 (2), 1990.-P.864-872.

207. Singh, M., M. Briones, G. Ott, and D. O'Hagan. Cationic microparticles: a potent delivery system for DNA vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, V. 97, P.811-816.

208. Singh M., Kazzaz J., Ugozzoli M., Malyala P., Chesko J., and O'Hagan D. T. Polylactide-co-glycolide microparticles with surface adsorbed antigens as vaccine delivery systems. Curr. Drug Deliv. 2006, V.3, P.115-120.

209. Smith B.J., Chapmen J.R. In Molecular Biomethods Handbook, Rapley R., Walker J.M. eds. Human Press: Totowa, NJ 1998,chapter 41, P.544-552.

210. Smith P. K, Krohn R.I, Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 1985, V.150, P.76-85.

211. Stratton ICR'. Durch SJ. Lawrence RS, editors. Vaccines for the 21 st century: a tool for decision-making. Washington- D.C.: National Academy Press; 2000.

212. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.

213. Biotechniques. 1992, V.13(3), P.444-449.

214. Tam J. P. Synthetic peptid vaccine design: synthesis and properties of a high density multiple antigenic peptide system. J.Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, V. 85, P. 5409

215. Taswell C. Limiting dilution assays for the determinationof immunocompetent cell frequencies. J.Immunology. 1981, V.126, p.1614-1619.

216. Templeton N.S. The polymerase chain reaction. History, methods and applications. Diagn Mol Pathol., 1992, V.l(l), P. 58-72.

217. TerAvest A.R., Van Steenis G. and Osterhaus A.D. A comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay and counter current electrophoresis for the detection of bovine serum albumin in virus vaccines. J.Biol.Stand., 1987, V.15, P.245-250.

218. Tettelin H., Saunders N.J., Hecdelberg J., Jeffries A.C., Nelson K.E., Eisen J.A., Ketchum K.A. et al. Complete genome sequence of Neisseria meningitidis serogroup В strain MC58. Science, 2000, V.287, P.1809-1815

219. Tomai M.A., Johnson A.G. T cell and interferon-gamma involvment in the adjuvant activ of detoxified endotoxin. J.Biol.Resp. modifiers, 1989, V.8, P.625-630.

220. Tyagi S, Kramer FR. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol. 1996;V.14(3), P.303-308.

221. Ulmer J.B., Valley U., Rappuoli R. Vaccine manufacturing challenges and solutions. Nat.Biotechnol., V.24 (11), 2006, 1377-1383.

222. USP. General Chapter <1225>, Validation of compendial methods, United States Pharmacopeia XXV, National Formulary, XXV, Rockville, MD, The United States Pharmacopeial Convention, 2002, P.2256-2259.

223. Virlogeus-Payant I., Popoff M.Y. The Vi antigen of Salmonella typhi. Bull. Inst. Pasteur, 1996, V.94, P.237-250.

224. Vogel F.R., Powell M.F. A summary compendium of vaccine adjuvants and exipients. In "Vaccine designee: the subunit and adjuvants approach", 1995, P.234-250. N.Y., Plenum Publ.Corp. Powell M.E., Newman M.J. ed.

225. Walker G.T. Empirical aspects of strand displacement amplification. PCR Methods Appl. 1993, V. 3, P. 1-6.

226. Wang A.M., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA. 1989, V.86(24), P.9717-9721.

227. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, Harrison LH, Bennett NM, Lynfield R, et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N Engl J Med. 2003, V.348 (18), P.1737-1746.

228. WHO Expert Committee on biological standardization.

229. Technical Report Series 800 АКДС и вакцина против полиомиелита

230. WHO Expert Committee on biological standardization. Technical Report Series 814. Inactivated fly vaccines

231. WHO Expert Committee on biological standardization. Technical Report Series 872,904. 1998, 2002. Viral vaccines

232. WHO Expert Committee on biological standardization. WHO Technical Report Series 932. Geneva, 2004. P. 137.

233. WHO Expert committee on biological standardization. WHO Technical Report Series 924, Geneva, 2004, P. 102-128.

234. WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements by department of vaccine and other biologicals, WHO Geneva, 1993, P.47.

235. WHO guide to manufacturing practice (GMP) requirements. Part 2: Validation. WHO Geneva, 1999.

236. Wilie-Reece, U., Wu, C.Y., Flynn, В J., Kedl, R.M. & Seder, R.A. Immunization with H1V-1 Gag protein conjugated to a TLR7/8 agonist results in the generation of HIV-l Gag-specific Thl and CD8+Tcell responses. J. Immunol., 2005, V.174, PI7676-7683.

237. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)~ amplification of specific DNA sequence s using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics. 1989,V. 4(4), P.560-569.

238. Zanetti A.R., Van Damme P., Shouval D., The gloubal impact of vaccination against hepatitis B: a historical overview. Vaccine, 2008, V.26, P.6266-6273.

239. Zimmerman, Di H., Rosenthal K. S. The LEAPS approach to vaccine development. Front. Biosci. 2005, V.10, P.790-798.

240. Zuckerman A.G. Prospects for vaccines against HIV. BMG, 1988, V.287, P. 86-88.

Информация о работе

Волкова, Рауза Асхатовна
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов химическими и иммунохимическими методами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы