Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Симбиоз Burkholderia cenocepacia с почвенными простейшими в разных экологических условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Симбиоз Burkholderia cenocepacia с почвенными простейшими в разных экологических условиях"

На правах рукописи

Каминская Анастасия Александровна

Симбиоз ВигкИоШепа сепосерааа с почвенными

простейшими в разных экологических условиях

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗ177233

Москва - 2007

003177233

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н Ф Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Пушкарева В И

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Раковская И В Доктор медицинских наук, профессор Немцева Н В

Ведущая организация: ГОУ ВПО ММА им Сеченова Защита диссертации состоится « 14 » декабря 2007 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001 007 01 в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул Гамалеи, 18)

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « К» ноября 2007 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор

Е В Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В общей эпидемиологии и концепции природной очаговости инфекционных болезней до недавнего времени господствовали представления о циркуляции возбудителей как практически единственной форме их существования - в виде непрерывных эпидемических и эпизоотических процессов В последние десятилетия, по мере накопления сведений о закономерных перерывах в циркуляции патогенных микроорганизмов в природе и обществе, формировались представления о межэпизоотических и межэпидемических периодах — как сезонных, так и многолетних В условиях, затрудняющих или исключающих циркуляцию возбудителей, она сменяется стадией резервации - устойчивым их сохранением, в том числе в окружающей среде - почвах и водоемах (Гинцбург A JI, Романова Ю М , 1997, Литвин В Ю , 1986, 1991; Литвин В Ю и др , 1998, Пушкарева В И , 1997)

Относительно недавно установлено (Литвин В Ю и др , 1998, 2000, Collwell R R et al, 1985, 1996, Oliver J D , 1993 ), что неблагоприятные для существования и размножения условия среды неспорообразующие бактерии способны переживать, переходя в покоящееся, некультивируемое состояние (НС), которое является обратимым и может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды Способность к переходу в НС к настоящему времени выявлена для многих (более 30 видов) патогенных бактерий ( в основном грамотрицательных ), в том числе и для псевдомонад 4 видов

Основным местообитанием псевдомонад и буркхолдерий (грамотрицательных неферментирующих палочек) в природе является ризосфера ряда растений, где они существенно влияют на другие микроорганизмы за счет продукции антифунгапьных, бактерицидных и антипротозойных веществ, а также вступают в симбиотические отношения со свободноживущими почвенными

простейшими, которые могут служить их резервуарными хозяевами (Пушкарева ВИ, 1994)

Оставались неизвестными способность Burkholdena cenocepacia переходить в покоящееся состояние и факторы среды, индуцирующие этот процесс

Биопленки как «фиксированная» форма существования микроорганизмов в окружающей среде известна давно (Сукачев ВН, 1947) Патогенные бактерии, основной средой обитания которых являются почвы и водоемы (иерсинии, вибрионы, легионеллы, листерии, кампилобактеры, клебсиеллы, сальмонеллы, псевдомонады и др ) прикрепляются к «неживым» субстратам - почвенным частицам или существуют в ассоциациях с водорослями, ризосферой растений, простейшими, ракообразными и другими организмами

Псевдомонады и экологически близкий им род Burkholdena известны как возбудители болезней человека, животных и растений В cenocepacia вызывает внутрибольничные инфекции, прежде всего у лиц, страдающих кистозным фиброзом (муковисцидозом) и хроническим гранулематозом, у иммунокомпрометированных больных, а также у пациентов, при лечении которых использовали катетеры и имплантаты (искусственные клапаны сердца, линзы, челюстно-лицевые протезы и др ) Установлено, что бактерии колонизируют поверхности различных материалов, образуя биопленки (Donlan R M , Costerton JW, 2002, Gauthier Y et al, 1989, Girardeau JP, 1982) Доказана способность буркхолдерий формировать биопленки на пораженных органах и тканях (Шагинян И А , Данилина Г А , 2007).

Выявлены тесные биоценотические связи В cepacia (cenocepacia) с почвенными и водными простейшими - амебами, инфузориями (Пушкарева В И , 1994, 2006, Пушкарева В И и др , 1992, 2005, Landers Р et al, 2000, Marolda С L et. al, 1999), однако их участие в формировании биопленок неизвестно

Цель работы — оценка возможности и условий перехода Burkholderia cenocepacia в некультивируемое (покоящееся) состояние, а также способности к формированию биопленок в сообществе с простейшими

Задачи исследования

1 Оценить структуру и численность популяции В сепосераст в разных экологических условиях при параллельном использовании бактериологического метода и тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2 Определить возможность перехода В сепосераЫа в покоящееся состояние при воздействии ряда абиотических и биотических факторов

3 Изучить фенотипическую изменчивость основных свойств буркхолдерий в разных экологических условиях

4 Разработать методические подходы для получения и количественной оценки биопленок, формируемых бактериально-протозойным сообществом в искусственных и естественных средах

5 На ультраструктурном уровне с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) продемонстрировать динамику взаимодействий буркхолдерий с фагоцитирующими простейшими и исход внутриклеточных событий в планктонных и биопленочных сообществах

Научная новизна

- Впервые описан переход В сепосераст в покоящееся (некультивируемое) состояние при взаимодействии с почвенными простейшими ТрупГоптш и в их отсутствие Установлены динамика и сроки этого процесса при температурах, соответствующих холодному сезону в почвах умеренных широт

- Выявлены не известные ранее изменения культурально-морфологических свойств, биохимической активности и пигментообразования вегетативных клеток буркхолдерий в разных экологических условиях

- Впервые разработана оригинальная технология получения биопленок, сформированных бактериально-протозойной ассоциацией на модели (В сепосераст + Т рупйэптпз) и выявлена ведущая роль инфузорий в их образовании.

- Впервые с помощью КЛСМ детально охарактеризована в динамике ультраструктура планктонных и биопленочных (неподвижных) клеток бактерий и

простейших Установлен паразито-хозяинный тип симбиотических отношений при обеих формах существования

Практическая значимость работы

Важная роль простейших в активной жизнедеятельности В сепосерааа и их длительной резервации в объектах окружающей среды определяют целесообразность микробиологического анализа бактериально-протозойных ассоциаций при мониторинге как природных водоемов, так и объектов окружающей среды стационаров Такой анализ должен включать, наряду с традиционными методами, применение тест-систем на основе ПЦР для выявления некультивируемых (покоящихся) форм буркхолдерий

Оригинальный метод, представленный в диссертации, оформлен в виде Методических рекомендаций. «Технология получения бактериально-протозойных биопленок» (2007 г), утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Технология получения бактериально-протозойных биопленок предназначена для микробиологов и может найти применение в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся проблемами симбиологии, экологии бактерий и простейших в природных и урбанизированных экосистемах

Материалы диссертации представлены на VI международном конгрессе Экватек - 2004 «Вода экология и технология» (Москва, 2004), на 1-й и 2-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005, Рязань, 2007), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007)

Материалы диссертации используются при чтении лекций студентам кафедры инфектологии ГОУ ВПО ММА им Сеченова

Апробация работы Диссертация апробирована на конференции отдела природноочаговых инфекций ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН 18 июня 2007 года

Публикации

По результатам исследований опубликованы 6 работ Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы (53 отечественных и 75 зарубежных источников) Работа изложена на 114 страницах, иллюстрирована 7 таблицами, 30 рисунками

Работа выполнена в лаборатории экологии возбудителей инфекций Формирование биопленок изучали в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (руководитель лаборатории - Академик, д б н Гинцбург A JT ) Ультраструктуру ассоциантов с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа изучали под руководством к б н Мойсеновича М М (кафедра физиологии микроорганизмов МГУ им М В Ломоносова)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Культивирование и идентификация Burkholderia cenocepacia

В экспериментах использовали клинический штамм В cenocepacia L67 геномовар Illa (выделен в госпитале им Н Н Бурденко, предоставлен к м н Чернухой М Ю), В cenocepacia 370, геномовар Illa (клинический изолят, выделенный в госпитале им Н Н Бурденко), а также мутанты этого штамма, полученные методом инсерционного мутагенеза в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (Beb + с умеренной способностью, Beb ++ с повышенной способностью, Beb - с резко сниженной способностью формировать биопленки)

Бактериальные культуры выращивали на плотных и жидких питательных средах: Luria-Bertani (LB) и селективной среде для псевдомонад — цитримид-агаре (ЦА) (Difco), а также в почвенной вытяжке и в смешанной среде LB + почвенная вытяжка (в соотношении 1 1) При культивировании мутантов использовали антибиотики канамицин и ампициллин в концентрации 100 мкг/мл

среды Посевы инкубировали при 28°С (температурный оптимум) в течение 1-3 суток

Идентификацию и оценку биохимической активности изолятов, полученных в ходе опытов, проводили параллельно на тест-системах API 20 NE ( BIO-Meneux; France) и BBL CRYSTAL E/NF ( Becton Dickinson, USA ) Дополнительно изоляты идентифицировали в ПЦР, которую ставили с парой праймеров Eub 16-1 (5' - AGGGTTGGATTCTGGCTCAG - 3') и CeMu Vi 16-2 (5' -CCGACTGTATTAGAGCCA - 3') для выявления последовательности 16S и 23 S рибосомальной РНК длиной 463 п н Гемолитическую активность изолятов тестировали на 5 % кровяном агаре

Цитопатогенность буркхолдерий оценивали в тесте на аксенической культуре инфузорий Tetrahymena pyriformis по 5-балльной шкале (Пушкарева ВИ, 1994)

Некультивируемые клетки буркхолдерий в ходе длительных экспериментов выявляли параллельно бактериологическим и молекулярно-генетическим (ПЦР) методами с дополнительными контролями (положительными и отрицательными). Образцы ПЦР-проб подвергали предварительной очистке на сефадексе (Емельяненко Е Н и др , 1994, Троицкая В В и др , 1996, Емельяненко Е Н ,1998)

Культивирование и заражение Tetrahymena pyriformis Аксеническую культуру свободноживущих инфузорий Tetrahymena pyriformis штамм GL (коллекция ГУ НИИЭМ им Гамалеи РАМН) поддерживали в 3% сердечно - мозговом бульоне при температуре 20-25° С

Заражение инфузорий проводили во флаконах со средами (стерильная вытяжка из дерново-луговой карбонатной почвы, дистиллированная вода, сердечно-мозговой бульон) путем внесения бактериальной культуры в количестве, необходимом для получения 106 м к/мл (по оптическому стандарту мутности) с микробной нагрузкой 100 м к на 1 особь инфузории Контролем служили те же среды, содержащие буркхолдерий (без инфузорий). Образцы культивировали при температурах 4° и 25° С

Биопленки выращивали в пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа емкостью 3 мл при 28°С в LB-бульоне, в смешанной

среде LB + почвенная вытяжка (в соотношении 11), в водной почвенной вытяжке (иловато-болотная почва) Контролем служили те же среды, содержащие В cenocepacia соответствующих штаммов (без инфузорий), а также аксеническая культура простейших Образцы исследовали в динамике от 24 до 72 часов

Концентрацию простейших подсчитывали в камере Горяева по формуле, принятой для эукариотных клеток

Реверсию покоящихся форм буркхолдерий осуществляли через 9 суток и 2 месяца после того, как буркхолдерии не выявлялись бактериологически, но их ДНК регистрировали в ПЦР В сердечно-мозговой бульон, обогащенный 5% фетальной сывороткой (индуктор реверсии), вносили 1 мл суспензии с некультивируемыми клетками. Высевы на L-агар (LA) и учет колоний проводили на 1-е, 2-е, 3-е сутки после инкубации проб при 30°С

Измерение оптической плотности биопленок и планктонной субпопуляции буркхолдерий определяли на фотометре lEMS Reader MF «Labsystems» (Швеция) при длине волны 540 нм Количество сформировавшейся биопленки оценивали фотометрически по интенсивности окрашивания спирта красителем кристалл-виолетом. Фоновые показатели регистрировали в лунках, содержащих «чистые» питательные среды и культуру простейших

Ультраструктурную организацию биопленочной ассоциации Tetrahymena pyriformis и Burkholderia cenocepacia изучали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с фиксацией образцов биопленок 5% и 10% параформальдегидом и обработкой специально подобранными флуоресцентными красителями (см результаты) Препараты просматривали на (KJICM) Zeiss Axiovert 200М LSM 510 (Zeiss, Германия) Серию оптических срезов получали с одного, либо синхронно с двух каналов Для возбуждения флуоресценции использовали 488 нм и 514, 543 нм полосы аргонового лазера Использовали объективы 100х/1,4 oil (Plan -Apochromat) и 40х/1,3 oil (Plan-Neofluar) Все эксперименты повторяли трижды

Статистическую обработку результатов осуществляли по программе Excel 2000 (Microsoft Inc , 1999), Statistica for Windows v 5 0 (Statsoft Inc, 1995)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вегетативные и покоящиеся формы ВигкЬок1епа сепосерааа в процессе взаимодействия с инфузориями

В серии длительных экспериментов с применением бактериологического метода и ПЦР оценены в динамике численность и состояние популяции В сепосераст в ассоциации с инфузориями Те^аИутепа рупйэпгт и без них - в воде, сердечно-мозговом бульоне и почвенной вытяжке при 25° и 4°С

В стерильной воде как при 4°С, так и при 25°С буркхолдерии не переходили в некультивируемое состояние на протяжении срока наблюдений (4 месяца) В ассоциации с инфузориями при низкой температуре буркхолдерии не выявлялись через 2 месяца ни бактериологически, ни при ПЦР-анализе, что очевидно свидетельствует о выедании бактерий простейшими При оптимальной температуре (25°С) наблюдали длительное совместное существование буркхолдерий с инфузориями, что свидетельствует об установлении симбиотических отношений в ассоциации

В сердечно-мозговом бульоне при 25°С кривая численности бактериальной популяции в ассоциации с простейшими имела Б — образную форму, типичную для искусственной питательной среды, как при 25°С, так и при 4°С Низкая температура вызвала более резкое снижение численности вегетативных клеток буркхолдерий, однако они сохранялись на протяжении срока наблюдений (3 мес ) В почвенной вытяжке при 25°С популяция бактерий длительно существовала (3 мес) как совместно с инфузориями, так и в их отсутствие (рис 1 А) Напротив, при низкой температуре 4 °С в почвенной вытяжке бактериологически зарегистрировано постепенное падение численности буркхолдерий. через месяц в ассоциации сохранялось не более 100 вегетативных клеток бактерий на 1 мл Численность инфузорий при этом не превышала ЮОосУмл , отмечены разрушенные клетки и цисты Через 2 месяца буркхолдерии бактериологически не выявлялись, а инфузории были представлены незначительным числом сохранившихся цист (рис 1 Б) В то же время ПЦР выявляла специфическую ДНК буркхолдерий и в более поздние сроки в расчетной концентрации около 103м к /мл (рис.1 Б)

А

недели

Б

недели

Рис. 1. Динамика численности В.сепосерас1а в почвенной вытяжке.

А-при 25° С, Б-при 4° С;

_ - бактериологически выявленные В. сепосерааа из ассоциации с

инфузориями; - то же - без инфузорий.

Столбики - выявленные в ПЦР некультивируемые клетки.

В контрольном образце (без инфузорий) при низкой температуре отмечали ускоренное падение концентрации вегетативных клеток буркхолдерий, так что уже к 9 суткам они не высевались (рис 1 Б) Регулярные посевы на протяжении 4 месяцев ни разу не выявили роста колоний на питательных средах Однако результаты ПЦР к концу наблюдений свидетельствовали о наличии некультивируемых бактериальных клеток в достаточно высокой расчетной концентрации около 104м к/мл (рис 1 Б)

Специальная проверка сроков сохранения в почвенной вытяжке внеклеточной ДНК буркхолдерий показала, что она могла служить матрицей в ПЦР лишь до 2 недель Это подтверждает, что в опытных образцах сохранялись клетки В сепосерас|'а в некультивируемой форме

Получены и прямые свидетельства жизнеспособности покоящихся клеток В сепосераст в сердечно-мозговом бульоне, обогащенном фетальной сывороткой, они частично реверсировали в вегетативное состояние с полным восстановлением исходных свойств

Выявлена популяционная изменчивость вегетативных форм буркхолдерий при взаимодействии с инфузориями в разных средах обитания как при 25°, так и 4°С Б — И. диссоциация, снижение биохимической активности, замедление роста при высевах на плотный агар Важно отметить высокий уровень цитопатогенности у пигментообразующих клонов буркхолдерий В процессе перехода в некультивируемое состояние пигментообразование в популяции В

сепосераст снижалось, вплоть до его отсутствия у последних колоний

***

Таким образом, данные эксперименты показали, что сезонная смена температурного режима почв и водоемов умеренных широт способна вызывать циклическую трансформацию популяции В сепосераа'а — от активной жизнедеятельности при благоприятных температурах к состоянию покоя при низких температурах и обратно Важно отметить, что температурный фактор в этих процессах действует на бактериальную популяцию не только непосредственно (что известно), но и косвенно, опосредуясь через популяцию хозяев

Формирование биопленок ассоциацией Те^аИутепа рупГогпт и Вигк1юК1епа сепосерааа

Способность бактериально-протозойной ассоциации к формированию биопленок изучали как в искусственной среде (ЬВ), так и в среде, приближенной к естественной (почвенная вытяжка)

Качественная оценка сформировавшихся биопленок. При визуальной оценке через 2 суток в большинстве лунок отмечали наличие сформировавшихся (зрелых) биопленок, причем простейшие явно стимулировали этот процесс (табл 1) В ЬВ-бульоне накопление биомассы было наибольшим, в смеси бульона с почвенной вытяжкой - умеренным и в почвенной вытяжке - наименее выраженным При этом буркхолдерии всех исследуемых штаммов, в том числе мутанта, с резко сниженной способностью к формированию биопленки, в сообществе с простейшими вели себя сходным образом и образовывали более интенсивную биопленку (табл 1)

Таблица 1. Способность ВигкЪоШепа сепосераст разных штаммов к формированию биопленок в ассоциации с простейшими и в их отсутствие.

варианты опытов, штаммы Эффект (BLB) эффект (в ЬВ/ПВ) эффект (вПВ)

1 Т pynformis + В сепосераст 370(исходный) +++/++++ +++ +/++

2 В сепосераст 370(исходный) ++ ++/+++ +

3 Т pynformis + мутант Bcb+ +++/I 1 1 1 +++

4 Beb + ++/+++ ++/-H-+ +

5 Т pynformis + мутант Beb ++ 1 1 1 1 + 1 1 1 l/l 1 1 1 1 ++

6 Bcb++ 1 II 1 +++

7Tpyriformis+ мутант Beb- ++/+++ ++ +

8 Beb- _ _ _

Примечание ЬВ - бульон, ЬВ/ПВ - почвенная вытяжка, ПВ - почвенная вытяжка Интенсивность накопления биомассы от +++++ - максимальная до + - минимальная, - отсутствие биопленки

Оценка интенсивности формирования биопленок фотометрией выявила следующее В LB-бульоне мутант, обладающий наибольшей способностью к образованию биопленок (Bcb++), демонстрировал максимальное накопление биомассы как в отсутствие простейших, так, особенно, в ассоциации с ними Клетки буркхолдерий исходного штамма и мутанта (Bcb+) с умеренной способностью к формированию биопленки в ассоциации с инфузориями также весьма интенсивно формировали биопленку Показательно, что мутант Beb-, который без простейших не проявлял активности, в ассоциации с инфузориями формировал биопленку, хотя и слабую В менее богатой среде (LB+почвенная вытяжка), а также в почвенной вытяжке эта закономерность сохранялась, однако количество биопленок было значительно ниже Мутант Beb- в отсутствие инфузорий ни в одной испытанной среде не формировал биопленку (рис 2)

Планктонные инфузории, культивированные в LB-бульоне и смеси LB + почвенная вытяжка, снижали численность в присутствии бактерий исходного штамма и мутантов Beb +, Beb ++, причем весьма стремительно через 72 часа в смешанной среде вегетативные инфузории не обнаруживались В то же время при взаимодействии с бактериями мутанта с резко сниженной способностью к формированию биопленки (Beb-) простейшие достигали максимальной концентрации (105ос/мл), что свидетельствует об отсутствии цитопатогенного эффекта у буркхолдерий данного штамма

Особо следует подчеркнуть, что в почвенной вытяжке инфузории не испытывали заметного воздействия буркхолдерий в планктонных субпопуляциях простейшие находились в вегетативной форме, оставались подвижными, без морфологических изменений, размножались с такой же скоростью, как и в аксенической культуре

***

Полученные результаты указывают на то, что простейшие заметно стимулируют формирование биопленок бактериями и поддерживают существование бактериальной популяции в составе биопленок По-видимому, формирование биопленок происходит с участием простейших, а возможно, и

□ В.сепосерааа в ассоциации с простейшими ш В.сепосерааа без простейших

Примечание: фоновые значения в интервале от 0 до 0,05.

Рис. 2. Биомасса биопленок, сформированных В.сепосерааа разных штаммов в различных средах в асссониации с Т.рупй>птш и без них (фотометрическая оценка).

других сочленов почвенных и водных биоценозов и это может служить одним из механизмов устойчивого существования возбудителей сапронозов в почвах и водоемах.

Ультраструктурный анализ ассоциации Те^аИутепа рупК)гпт и ВигкЬоШепа сепосераЫа в биопленке методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

Ультраструктурный анализ ассоциации инфузорий и буркхолдерий методом КЛСМ проводили в динамике через 7, 18 и 36 часов после формирования биопленки.

Были подобраны условия, при которых формировались биопленки, пригодные для последующей окраски. Эффективность окраски биопленок достигнута при комбинациях различных красителей (акридиновый оранжевый + флуоресцеиндиацетат и акридиновый оранжевый + флуоресцеиндиацетат + бромистый этидий).

В ранние сроки взаимодействия В.сепосераст и Т.рупйэптш (7 часов инкубации образцов) на поверхности стекол формировался тонкий слой - ранняя биопленка (рис.3 А).

Рис. 3. Биопленка К сепосерасш (исходный 370); 7 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон. А - биопленка на ранних стадиях формирования; Б - инфузория вблизи формирующейся биопленки.

1 - макронуклеуе; 2- цитотль;3—делящиеся бактериальные клетки на поверхности коргекса инфузории; 4 -бактериальные клетки вматриксе.

Рис. 4. Взаимодействие буркхолдерий (мутант ВсЬ++) с инфузориями; 7 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон.

А - инфузория на поверхности формирующейся биопленки В.сепосераси, фагосомы с буркхолдериями; Б - слияние фагосом в более крупную - гигантскую. I - макуншукюус; 2 -фагосома;3 -гигантская вакуоль; 4 - л]гюсома;5 - бактериальные клетки в матрнксе.

В этот срок обнаруживали инфузорий как на поверхности монослоя биопленки, так и вблизи формирующейся биопленки (рис.3 Б). Клетки простейших сохраняли овальную форму, по периметру располагались неповрежденные реснички со значительным количеством прикрепившихся бактерий. На фоне темной цитоплазмы выделялся макронуклеус, окруженный множеством фагосом (от 4 до 25), с разной наполненностью бактериальными клетками (рис.4 А). Количество и размеры фагосом варьировали у разных инфузорий.

В некоторых инфузориях наблюдали гигантские пищеварительные вакуоли, образовавшиеся в результате слияния нескольких фагосом, которые занимали практически всю эндоплазму (рис.4 Б). Вокруг фагосомы концентрировались мелкие лизосомоподобные гранулы, что свидетельствует об активном переваривании части бактериальных клеток (рис.4 Б).

Рис. 5. Взаимодействие буркхолдерий (мутант ВсЫ-+) с инфузориями; 7 часов, КЛСМ, маркер 10 (А) и 5 микрон (Б).

А - фагосомы, заполненные буркхолдериями и микроколония вне клетки простейшего; Б - микроколонии.

1 - макронуклеус; 2 - фагосомы, наполненные бактериальными клетками; 3 - мнкроколонии.

Множество бактерий было адгезировано на кортексе инфузорий в виде одиночных клеток, групп и больших скоплений (рис.4 А). Вместе с тем наблюдали делящиеся бактериальные клетки, не подвергшиеся деструкции, что свидетельствовало об их активном физиологическом состоянии (рис.3 Б).

Кроме того, уже на ранних стадиях образования биопленок в присутствии инфузорий возникали «микроколонии» буркхолдерий характерной круглой формы (рис.5 Б), сходные с упакованными в фагосомы простейших и, возможно, оставшиеся такими после распада фагосом (рис.5 А). Контрольные образцы (без инфузорий) представляли собой скопления бактериальных клеток с обычной морфологической структурой.

В более поздний срок (18 часов) совместного инкубирования бактерий и простейших наблюдали большое количество инфузорий, погруженных в биопленочный матрикс (рис.6 А, Б).

Рис. 6. Взаимодействие буркхолдерий мутант (ВсЬ++) с инфузориями;

18 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон.

А, Б - клетка инфузории, погруженная в толщу биопленки. 1 - макронуклеус; 2 - цигозоль; 3 - перистом; 4 - бактериальные клетки в матриксе.

Рис. 7. Начальная стадия деструкции простейших под воздействием

буркхолдерий (мутант ВсЫ-+); 18 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон. А, Б - выход внутреннею содержимого клетки инфузории. 1 - макропуклеус; 2 - лизис эндоплазмы; 3 - разрыв мембран фапосом и выход их них бактерий в цитоплазму простейшего; 4 - бактериальные клетки в матриксе.

Рис. 8. (А, Б, В) - различные стадии деструкции клеток простейших под воздействием буркходдерий (исходный 370); 36 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон.

При этом большинство клеток тетрахимен претерпевали значительные изменения ультраструктуры: выход внутреннего содержимого, лизис эндоплазмы (рис.7 А), а также заметное нарушение внутренних структур инфузорий. Наблюдали разрыв мембран фагосом и выход из них буркхолдерий в цитоплазму простейшего (рис.7 Б).

В более поздние сроки взаимодействия (36 часов) в толще зрелых биопленок, сформированных мутантом (Beb ++), иногда встречали отдельные фрагменты клеток инфузорий (рис.8 А, Б, В). Кроме того, обнаружены специфические образования - микроколонии буркхолдерий (рис.9 А), которые не наблюдались в контрольных образцах (рис.9 Б).

Что касается простейших, то в поздние сроки клетки-хозяева претерпевали полную деструкцию с выпадением из эндоплазмы в окружающую среду фагосом, заполненных бактериями (рис.10 А, Б). Вероятно, далее происходит распад и этих

структур с освобождением неповрежденных буркхолдерий.

***

Таким образом, на ультраструктурном уровне продемонстрированы взаимодействия между буркхолдериями и простейшими по сценарию отношений «паразит-хозяин», которые, как и ранее описанные для планктонных ассоциаций, имеют место и в биопленках.

Рис. 9. Взаимодействие буркхолдерий мутант (ВсЫ-+) с инфузориями, зрелая биопленка; 36 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон. А- структура зрелой бпопленки в присутствии простейших; Б - то же - в отсутствие простейших. 1 - микроколонии.

Рис. 10. Взаимодействие буркхолдерий (исходный 370) с инфузориями, зрелая биопленка; 36 часов, КЛСМ, маркер 10 микрон. А - фрагменты клеток инфузорий, окруженных «характерными» микроколониями; Б - увеличенный фрагмент рис. 10 А. 1 - микроколонии; 2 - фрагменты цитоплазмы простейшего.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эксперименты продемонстрировали, что на состояние и численность популяции В cenocepacia наиболее существенно влияет температурный режим. Так, в «летнем» температурном режиме (25°С) во всех средах буркхолдерии в некультивируемое состояние не переходили — как в ассоциации с инфузориями Т pyriformis, так и без них Напротив, низкая температура (4°С) в почвенной вытяжке индуцировала переход буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние, причем без простейших этот процесс протекал значительно быстрее

Популяция В cenocepacia продемонстрировала высокую экологическую пластичность, которая проявляется в адаптивной изменчивости ряда важных признаков при изменении экологических условий (S - R диссоциация, снижение ферментативной активности, цитопатогенность, пигментообразование, замедление роста, образование покоящихся клеток)

Качественный и количественный анализ биопленок, сформированных бактериально-протозойным сообществом в разных экологических условиях выявил важную роль инфузорий в накоплении пленочной биомассы В cenocepacia исходного штамма и мутанты Bcb+, Bcb++ во всех средах (LB— бульон, ЬВ/ПВ и почвенная вытяжка) образовывали биопленки, тогда как мутант Beb-, с резко сниженной способностью к формированию биопленки, ни в одной среде самостоятельно не образовывал их Простейшие стимулировали этот процесс во всех вариантах опытов, в том числе и в ассоциации с мутантом Bcb-

Ультраструктурный анализ биопленочной ассоциации Т pyriformis и В cenocepacia в динамике (7-36 часов) методом KJICM выявил следующее: на ранних стадиях формирования биопленок в присутствии инфузорий возникали скопления буркхолдерий в виде «микроколоний», по форме аналогичные фагосомам с бактериями, выпавшим во внеклеточное пространство, в поздние сроки (36 часов), когда биопленки достигали высшей зрелости, количество таких микроколоний возрастало

Роль простейших в этих процессах неоднозначна на ранних стадиях взаимодействия с бактериями они выполняют функцию хищников, утилизируя часть планктонной субпопуляции В сепосерасю, затем межпопуляционные взаимодействия переходят в отношения «паразит-хозяин», благодаря размножению в фагосомах инфузорий, устойчивых к фагоцитозу бактериальных клеток, как это детально расшифровано у ряда патогенных бактерий (Пушкарева ВИ, 1994)

Устойчивые к фагоцитозу буркхолдерии после выхода из фагосом активно размножались и накапливались в окружающей среде Не исключено, что именно с этим связано стимулирующее воздействие простейших на формирование биопленок

Сформировавшиеся биопленки, очевидно, способствуют лучшей защите бактерий от неблагоприятных факторов среды, а также распространению и устойчивому существованию буркхолдерий в природных экосистемах

выводы

1 Впервые установлено образование покоящихся (некультивируемых) форм у ВигкИоШепа сепосераст Бактериальные клетки буркхолдерий в почвенной вытяжке переходили в покоящееся (некультивируемое) состояние при низкой температуре (4°С) уже через 9 суток В ассоциации с простейшими образование покоящихся форм замедлялось до 2 месяцев

В температурном режиме 25°С ВигкЬоИепа сепосераст в некультивируемое состояние не переходили - как в ассоциации с инфузориями ТеЦаНутепа рупАэтт, так и без них, в «бедной» и «богатых» средах

2 В длительных экспериментах (4 месяца) при смене «летнего» температурного режима на «зимний» выявлена изменчивость ряда важных свойств ВигкЬо1с1епа сепосераст замедление роста на плотных средах до 4-7 суток, Б-Я диссоциация, снижение скорости ряда биохимических реакций, уменьшение оксидазной активности и пигментоообразования Выявлена связь цитопатогенности в популяции ВигкЬоШепа сепосераст с пигментообразованием в протистоцидном тесте цитопатогенность буркхолдерий снижалась с уменьшением числа пигментообразующих клонов

3 Впервые в естественной среде получены биопленки, сформированные бактериями ВигкИоМепа сепосераст, а также их ассоциацией с почвенными инфузориями Установлена стимулирующая роль простейших в накоплении пленочной биомассы

4 Установлено, что в ассоциации с простейшими мутантные штаммы буркхолдерий резко повышали способность к формированию биопленок, в том числе штамм ВсЬ-

5. Впервые методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследована ультраструктура бактериально-протозойных сообществ (планктонных и биопленочных) в динамике. Продемонстрирована частичная утилизация планктонных буркхолдерий в пищеварительных вакуолях инфузорий Устойчивые к перевариванию бактериальные клетки сохранялись

неизмененными, размножались, вызывали гибель простейших и накапливались в окружающей среде

6 Симбиотические отношения в бактериально-протозойных биопленках складывались по типу «паразит - хозяин» Как и в планктонных ассоциациях, благодаря незавершенности фагоцитоза поддерживались существование и численность бактериальной популяции в биопленках Цитопатогенное действие буркхолдерий возрастало по мере созревания биопленок В биопленочной ассоциации формировались особые «микроколонии» буркхолдерий на месте их выхода из разрушенных фагосом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Пушкарева В И, Каминская А А , Величко В В Burkholderia cepacia популяционная динамика в водной среде // Мат-лы международного конгресса Экватек - 2004 «Вода экология и технология» Москва - 2004 - т II - с 769

2 Пушкарева В И , Величко В В , Каминская А А , Литвин В Ю Burkholderia cepacia в разных экологических условиях численность и изменчивость бактериальной популяции // Журн микробиол, эпидемиол и иммунобиол 2005 - №3 - с 39 - 44

3 Каминская А А Паразитизм в простейших Burkholderia cepacia в зависимости от факторов окружающей среды // Мат-лы научно-практ конф молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Суздаль -2005-с 66-68

4 Каминская А А, Пушкарева В И, Ермолаева С А, Степанова ТВ, Алексеева Н В , Андреев А Л Роль ассоциации простейших Tetrahymena pyriformis и бактерий Burkholderia cepacia в формировании биопленок // Успехи соврем биологии 2007 - т 127 - №1 - с 44-49

5 Каминская А А , Пушкарева В И , Ермолаева С А , Мойсенович М М Бактериально-протозойные биопленки на модели Burkholderia cepacia и Tetrahymena pyriformis // Мат-лы IX съезда Всеросс научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва - 2007- с 108

6 Каминская А А , Пушкарева В И , Мойсенович М М Ультраструктурное исследование ассоциации Tetrahymena pyriformis и Burkholderia cepacia в биопленке с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа // Мат-лы научно-практ конф молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Рязань - 2007 - с 126 — 127.

Подписано в печать 10 11 2007 Формат 60x84/16

Тираж 90 экз_Заказ 99_Объем 1.3 п л

Copy General копировальные центры тел Уф 775-08-44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каминская, Анастасия Александровна

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Симбиоз с простейшими кяк стратегия существования патогенных бактерии в почвах и водоемах

1.1. Общие сведения об экологии свободноживущих простейших и патогенных бактерий.

1.2. Ультраструктурные закономерности внутриклеточного паразитизма бактерий в простейших.

1.3. Некоторые молекулярно-генетические механизмы паразитизма патогенных бактерий в простейших.

1.4. Покоящиеся (некультивируемые) формы патогенных бактерий.

Глава 2. Роль бактсрнальпо-протозоГшых ассоциаций в формировании бноплсиок.

Глава 3. Материалы и методы исследований

3.1. Культивирование и идентификация Burkholderia cenocepacia.

3.2. Культивирование инфузорий.

3.3. Совместное культивирование Burkholderia cenocepacia и Tetrahymena pyriformis.

3.4. Количественный учет Burkholderia cenocepacia и Tetrahymena pyriformis

3.5. Подготовка проб и постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.6. Постановка протистоцидного теста для оценки гетерогенности популяции Burkholderia cenocepacia по признаку цитопатогенности.

3.7. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия для ультраструктурного анализа бактериалыю-протозойной ассоциации.

3.8. Статистическая обработка результатов.

Результаты исследований

Глава 4. Вегетативные и покоящиеся формы в популяции Burkholderia cenocepacia в процессе взаимодействия с простейшими

4.1. Моделирование бактериалыю-протозойной ассоциации в искусственных и естественной средах.

4.2. Влияние абиотических (температура и рН) и биотических (простейшие) факторов на переход буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние.

4.3. Адаптивная изменчивость популяции B.cenocepacia и условия длительной резервации покоящихся форм.

Глава 5. Роль ассоциации простейших Tetrahymena pyriphormis и бактерий Burkholderia cenocepacia в формировании биоплеиок

5.1. Свойства исходного штамма В. cenocepacia 370 и его изогенных

5.2. Технология получения биопленок в ассоциации Burkholderia cenocepacia и Tetrahymena pyriformis.

5.3. Качественная оценка сформировавшихся биопленок.

5.4. Количественная оценка планктонных популяций бактерий и инфузорий.

Глава 6. Ультраструктурный анализ ассоциации Tetrahymena pyriformis и Burkholderia cenocepacia в биоплепке с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Симбиоз Burkholderia cenocepacia с почвенными простейшими в разных экологических условиях"

В общей эпидемиологии и концепции природной очаговости инфекционных болезней до недавнего времени господствовали традиционные представления о циркуляции возбудителей как практически единственной форме их существования - в виде непрерывных эпидемических и эпизоотических процессов. В последние десятилетия, по мере накопления сведений о закономерных перерывах в циркуляции патогенных микроорганизмов в природе и обществе, формировались представления о межэпизоотических и межэпидемических периодах - как сезонных, так и многолетних. В условиях, затрудняющих или исключающих циркуляцию возбудителей, она сменяется стадией резервации - устойчивым их сохранением, в том числе в окружающей среде - почвах и водоемах (Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., 1997; Литвин В.Ю., 1986; 1991; Литвин В.Ю. и др., 1998; Пушкарева В.И., 1997).

В настоящее время хорошо известна способность многих патогенных бактерий существовать и размножаться в объектах внешней среды - почвах, водоемах и др. (Литвин В.Ю. и др., 1998). Относительно недавно установлено (Литвин В.Ю. и др., 2000; Collwell R.R. et.al., 1985; 1996; Oliver J.D., 1993 ), что неблагоприятные для существования и размножения условия среды неспорообразующие бактерии способны переживать, переходя в покоящееся, некультивируемое состояние (НС). Оно определено как состояние бактериальных клеток, проявляющих метаболическую активность, но не способных к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста на жидких или плотных средах. При смене условий существования клетки могут быть рекультивированы, т.е. могут вновь приобрести способность к размножению и росту на обычных средах. Феномен перехода в НС в последнее время привлекает пристальное внимание исследователей, поскольку образование некультивируемых форм (НФ), по-видимому, может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды. Способность к переходу в НС к настоящему времени выявлена для многих (более 30 видов) патогенных бактерий ( в основном грамотрицательных), в том числе и для псевдомонад 4 видов.

Известно, что основным местообитанием псевдомонад и буркхолдерий в природе является ризосфера растений (маис, пасленовые, лилейные), где они существенно влияют на другие виды за счет продукции антифунгальных, бактерицидных и антипротозойных веществ. Указывается на симбиотические связи этих возбудителей со свободноживущими почвенными простейшими, которые могут служить резервуарпыми хозяевами для возбудителей сапронозных инфекций, в том числе и для Burkholderia cepacia (cenocepacia) (Пушкарева В.И., 1994).

Оставалось неизвестным, способны ли Burkholderia cenocepacia переходить в покоящееся состояние и каковы абиотические и биотические факторы, участвующие в этом процессе.

Биопленки как «фиксированная» форма существования микроорганизмов в окружающей среде известна давно (Сукачев В.Н., 1947). Патогенные бактерии, основной средой обитания которых являются почвы и водоемы (холерные вибрионы, легионеллы, листерии, кампилобактеры, клебсиеллы, сальмонеллы, псевдомонады) прикрепляются к «неживым» субстратам - почвенным частицам или существуют в различных ассоциациях: с водорослями, ризосферой растений, простейшими, ракообразными и другими организмами. Изучение экологических закономерностей формирования биопленок дает возможность выявить роль абиотических и биотических факторов в реализации данной стратегии существования микроорганизмов в природе.

Псевдомонады и экологически близкий им род Burkholderia являются возбудителями болезней человека, животных и растений (синегнойная инфекция, сап, мелиоидоз, гниль лука и др.). B.cenocepacia вызывает внутриболышчные инфекции прежде всего у лиц, страдающих кистозным фиброзом (муковисцидозом) и хроническим гранулематозом, у иммунокомпрометированных больных, а также у пациентов, при лечении которых использовали катетеры и имплантаты (искусственные клапаны сердца, линзы, челюстно-лицевые протезы и др.). Установлено, что бактерии способны колонизировать поверхности различных материалов, образуя биопленки (Donlan R.M., Costerton J.W., 2002; Gauthier Y. et. al., 1989; Girardeau J.P., 1982). Доказана способность буркхолдерий формировать биопленки на пораженных органах и тканях (Шагинян И.А., Данилина Г.А., 2007).

Выявлены тесные биоценотические связи В. cepacia (cenocepacia) с почвенными и водными простейшими (амебами, инфузориями) - основными природными хозяевами и резервуарами многих потенциально патогенных бактерий (Пушкарева В.И., 1994; 2006; Пушкарева В.И. и др., 1992; 2005; Landers P. et. al., 2000; Marolda C.L. et. al., 1999), однако их участие в формировании биопленок неизвестно.

Цель данной работы - оценка возможности и условий перехода Burkholderia cenocepacia в некультивируемое (покоящееся) состояние, а также способности к формированию биопленок в сообществе с простейшими.

Задачи:

1. Оценить структуру и численность популяции B.cenocepacia в разных экологических условиях при параллельном использовании бактериологического метода и тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Определить возможность перехода B.cenocepacia в покоящееся состояние при воздействии ряда абиотических и биотических факторов.

3. Изучить фенотипическую изменчивость основных свойств буркхолдерий в разных экологических условиях.

4. Разработать методические подходы для получения и количественной оценки биопленок, формируемых бактериально-протозойным сообществом в искусственных и естественных средах.

5. На ультраструктурном уровне с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (KJICM) продемонстрировать динамику взаимодействий буркхолдерий с фагоцитирующими простейшими и исход внутриклеточных событий в планктонных и биопленочных сообществах.

Научная новизна:

- Впервые описан переход B.cenocepacia в покоящееся (некультивируемое) состояние при взаимодействии с почвенными простейшими T.pyriformis и в их отсутствие. Установлены динамика и сроки этого процесса при температурах, соответствующих холодному сезону в почвах умеренных широт.

- Выявлены не известные ранее изменения культурально-морфологических свойств, биохимической активности и пигментообразования вегетативных клеток буркхолдерий в разных экологических условиях.

- Впервые разработана оригинальная технология получения биопленок, сформированных бактериально-протозойной ассоциацией на модели (B.cenocepacia + T.pyriformis) и выявлена ведущая роль инфузорий в их образовании.

- Впервые с помощью KJICM детально охарактеризована в динамике ультраструктура планктонных и биопленочных (неподвижных) клеток бактерий и простейших. Установлен паразито-хозяинный тип симбиотических отношений при обеих формах существования.

Практическая значимость работы

Важная роль простейших в активной жизнедеятельности B.cenocepacia и их длительной резервации в объектах окружающей среды определяют целесообразность микробиологического анализа бактериалыю-протозойных ассоциаций при мониторинге как природных водоемов, так и объектов окружающей среды стационаров. Такой анализ должен включать, наряду с традиционными методами, применение тест-систем на основе ПЦР для выявления некультивируемых (покоящихся) форм буркхолдерий.

Оригинальный метод, представленный в диссертации, оформлен в виде Методических рекомендаций: «Технология получения бактериально-протозойных биопленок» (2007г), утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Технология получения бактериально-протозойных биопленок для ультраструктурного изучения методом KJICM может найти применение в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся проблемами симбиологии, экологии бактерий и простейших в природных экосистемах.

Материалы диссертации представлены на VI международном конгрессе Экватек - 2004 «Вода: экология и технология» (Москва, 2004), на 1-й и 2-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005; Рязань, 2007), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).

Материалы диссертации используются при чтении лекций студентам кафедры инфектологии ГОУ ВПО ММА им. Сеченова.

По результатам исследований опубликованы 6 работ.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каминская, Анастасия Александровна

Выводы

1. Впервые установлено образование покоящихся (некультивируемых) форм у Burkholderia cenocepacia. Бактериальные клетки буркхолдерий в почвенной вытяжке переходили в покоящееся (некультивируемое) состояние при низкой температуре (4°С) уже через 9 суток. В ассоциации с простейшими образование покоящихся форм замедлялось до 2 месяцев.

В температурном режиме 25°С Burkholderia cenocepacia в некультивируемое состояние не переходили - как в ассоциации с инфузориями Tetrahymena pyriformis, так и без них, в «бедной» и «богатых» средах.

2. В длительных экспериментах (4 месяца) при смене «летнего» температурного режима на «зимний» выявлена изменчивость ряда важных свойств Burkholderia cenocepacia: замедление роста на плотных средах до 4-7 суток; S-R диссоциация; снижение скорости ряда биохимических реакций; уменьшение оксидазной активности и пигментоообразования. Выявлена связь цитопатогенности в популяции Burkholderia cenocepacia с пигментообразованием: в протистоцидном тесте цитопатогенность буркхолдерий снижалась с уменьшением числа пигментообразующих клонов.

3. Впервые в естественной среде получены биопленки, сформированные бактериями Burkholderia cenocepacia, а также их ассоциацией с почвенными инфузориями. Установлена стимулирующая роль простейших в накоплении пленочной биомассы.

4. Установлено, что в ассоциации с простейшими мутантные штаммы буркхолдерий резко повышали способность к формированию биопленок, в том числе штамм Bcb-.

5. Впервые методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследована ультраструктура бактериалыю-протозойных сообществ (планктонных и биопленочных) в динамике. Продемонстрирована частичная утилизация планктонных буркхолдерий в пищеварительных вакуолях инфузорий. Устойчивые к перевариванию бактериальные клетки сохранялись неизмененными, размножались, вызывали гибель простейших и накапливались в окружающей среде.

6. Симбиотические отношения в бактериально-протозойных биопленках складывались по типу «паразит - хозяин». Как и в планктонных ассоциациях, благодаря незавершенности фагоцитоза поддерживались существование и численность бактериальной популяции в биопленках. Цитопатогенное действие буркхолдерий возрастало по мере созревания биопленок. В биопленочной ассоциации формировались особые «микроколонии» буркхолдерий на месте их выхода из разрушенных фагосом.

Заключение

Оценка состава и численности B.cenocepacia в разных экологических условиях, с параллельным использованием бактериологического метода и ПЦР, приводит к следующим заключениям. В стерильной воде, как при 4°С, так и при 25°С буркхолдерии не переходили в некультивируемое состояние на протяжении срока наблюдений (4 месяца). Однако в ассоциации с инфузориями при низкой температуре буркхолдерии не выявлялись через 2 месяца ни бактериологически, ни при ПЦР-анализе. Очевидно, это свидетельствует о выедании бактерий простейшими.

Длительное совместное существование буркхолдерий с инфузориями при оптимальной температуре (25°С) свидетельствует об установлении симбиотических отношений по типу «паразит - хозяин», аналогичных установленным ранее для разных бактерий - иерсиний, листерий, эризипелотриксов, а также псевдомонад 5 видов (Пушкарева В.И., 1994; Литвин В.Ю. и др., 1998).

Весьма отчетливо проявлялось влияние температуры среды на состояние и численность бактериальной популяции. Так, в почвенной вытяжке при 25°С популяция бактерий длительно существовала как совместно с инфузориями, так и в их отсутствие. Напротив, низкая температура (4°С) индуцировала в тех же условиях переход буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние, причем без простейших этот процесс протекал гораздо быстрее: уже на 9 - е сутки рост прекращался при положительных результатах ПЦР-анализа. Инфузории поддерживали существование буркхолдерий в вегетативном состоянии до 2 месяцев, а через 3 и 4 месяца ПЦР-анализ продолжал регистрировать покоящиеся бактериальные клетки, сохранявшиеся в среде, а, возможно, и внутри образовавшихся цист инфузорий.

В поверхностных горизонтах почв и водоемов умеренных широт столь низкие температуры характерны для зимних сезонов и можно полагать, что буркхолдерии способны переживать их, переходя в покоящееся состояние параллельно с формированием цист и иных зимующих форм простейших. О резервуарной роли почвенных амеб рода Acanthamoeba свидетельствуют существование и размножение в них В. cepacia (cenocepacia) (Landers P. et. al., 2000; Marolda C.L.et. al., 1999). Ранее это было доказано при детальном ультраструктурном анализе внутриклеточного паразитизма Pseudomonas (Burkholderia) cepacia (cenocepacia) в инфузориях Tetrahymena pyriformis (Пушкарева В.И. и др., 1992).

В ходе длительных экспериментов популяция В. cenocepacia продемонстрировала высокую экологическую пластичность в различных температурных условиях: это и S - R диссоциация, и снижение ферментативной активности при низкой температуре, и замедление роста, и, наконец, образование покоящихся бактериальных клеток. Особо следует отметить изменчивость пигментообразования, которое снижалось (вплоть до отсутствия) по мере перехода популяции буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние. Важной представляется связь пигментообразования с цитопатогенностыо, высокий уровень которой отмечен именно у пигментообразующих клонов буркхолдерий.

Известно, что псевдомонады и буркхолдерии синтезируют пигменты, которые обеспечивают выживаемость видов в среде обитания, представляющие собой полициклические соединения, несущие функцию витаминов, сидерофоров. По мнению Rhame F.S. (1980) пигменты, в частности пиоцианин, обладают антипротозойными свойствами и защищают бактериальные популяции от выедания хищными простейшими в процессе фагоцитоза.

Целенаправленное исследование взаимодействия пигментообразующих штаммов псевдомонад с почвенными амебами - Tetramitus, Naegleria, Hartmanella выявило цитотоксическое воздействие на клетки простейших (Groscop J. A., Brent М.М., 1964).

Подводя итоги экспериментов, отметим, что в почве (воде) как первичной естественной среде обитания В. cenocepacia численность, структура и свойства бактериальной популяции способны контролироваться температурой и симбиотическими связями с простейшими. Сохранение буркхолдерий при крайне неблагоприятных условиях может обеспечиваться их переходом в покоящееся (некультивируемое) состояние, что впервые продемонстрировано в данных опытах. Диапазон экологической толерантности В. cenocepacia есть следствие адаптивной изменчивости бактериальной популяции - преобладания тех или иных клонов в ее структуре.

Экологическая «многоликость» В. cenocepacia - как почвенных бактерий, фитопатогенов (бактериальная гниль лука) и, вместе с тем, возбудителей ряда болезней человека (вероятно, сапронозной природы) вполне очевидна, однако ничего неожиданного и уникального в этом нет. Pseudomonas (Burkholderia) cepacia (cenocepacia) были описаны более полувека назад именно как фитопатогены, а их патогенность для человека и клиническая значимость - в 80-х г.г. прошлого века (Беляков В.Д. и др., 1990; Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2003). Уже тогда при сравнении изолятов ризосферного и клинического происхождения по 120 признакам были показаны их сходство (по ферментативной активности, спектру углеродного питания и др.) и различия адаптивного характера: более высокая антибактериальная активность у первых и преобладание гемолитических свойств у вторых (Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990).

Полипатогенность псевдомонад объясняли сходством ряда признаков, важных для возбудителя, у теплокровных животных и растений, а с другой стороны - универсальностью факторов патогенности бактерий (Беляков В.Д. и др., 1990; Смирнов В.В., Киприанова Е.А.,1990). Широкая полипатогенность В. cenocepacia (от растений до человека) не является чем-то исключительным, вполне укладываясь в рамки эпидемиологически новой проблемы - «патогенные бактерии, общие для человека и растений» (Литвин В.Ю. и др., 1996; 1998). Растущее эпидемиологическое значение этих буркхолдерий, занимающих разнообразные экологические ниши в природе, на наш взгляд, определяют актуальность исследований в следующих направлениях:

- условия образования покоящихся бактериальных клеток и их реверсии в вегетативное состояние;

- возможность и формы устойчивого сохранения буркхолдерий в цистах простейших и других гидробионтах;

- резервуарная роль растений и пути их колонизации;

- вирулентность и клональная структура бактериальной популяции в разных условиях существования.

Вторая часть работы посвящена анализу существования бактериалыю-протозойного сообщества при формировании биопленок в различных экологических условиях. Наше внимание было сфокусировано на абиотических (состав культуральных сред, температура) и биотических (простейшие) факторах среды, контролирующих процесс формирования биопленок в модельных водных экосистемах. Качественный анализ образцов позволил визуально оценить, при каких условиях происходит наибольшее накопление пленочной биомассы. B.cenocepacia 370 исходного штамма и его мутанты с разной способностью формировать биопленки, в оптимальных температурных условиях (при 28°С) и богатых средах (LB-бульоне и его смеси с почвенной вытяжкой) через 2 суток на поверхности и стенках лунок образовывали тонкие пленки. В почвенной вытяжке они были едва заметны. Мутант с резко сниженной способностью к формированию биопленки, ни в одной среде не проявлял этого признака.

Картина кардинально менялась, когда к бактериальным популяциям подселяли инфузорий. Уже через 2 суток, как в искусственной среде, так и в почвенной вытяжке, наблюдали интенсивное накопление биопленок. Даже мутант(ВсЬ -), сам по себе не формировавший биопленки, проявлял это свойство. Максимальная биомасса накапливалась через 3-4 суток инкубации. Характерно, что такие сроки накопления биопленок отмечены для легионелл, псевдомонад и вибрионов (Costerton J.W. et.al., 1987; Costerton J.W. et.al., 1995; Matz С. et. al. 2004; 2005).

При количественной оценке наибольшее накопление биопленки выявлено при взаимодействии мутанта Bcb ++ с инфузориями в LB-бульоне; буркхолдерии остальных штаммов в сообществе с простейшими также обладали выраженной способностью к формированию биопленки. В почвенной вытяжке все они проявляли это свойство, хотя биопленок было значительно меньше.

Интересно отметить двоякую роль простейших при взаимодействии с буркхолдериями в процессе формирования биопленок. С одной стороны, они выполняют функцию хищников, утилизирующих часть планктонной субпопуляции бактерий, что соответствует результатам, полученным для синегнойной палочки и холерных вибрионов в сообществе с морскими жгутиконосцами (Flagellatae) - другими хищными простейшими (Matz С. et. al. 2004; 2005). С другой стороны, в ходе этого процесса селектируются устойчивые к перевариванию бактериальные клетки, размножение которых переводит межпопуляционные взаимодействия в русло «паразито-хозяинных», как это детально расшифровано у ряда патогенных бактерий, включая и B.cepacia (cenocepacia) (Пушкарева В.И. и др., 1992). Сформировавшиеся биопленки способствуют распространению и устойчивому существованию возбудителей в природных экосистемах (Matz С. et. al., 2005).

Сами инфузории (по-видимому, их планктонная субпопуляция) стимулировали процесс формирования биопленок во всех вариантах опытов, причем продукция биомассы нарастала линейно в течение 3-4 суток. Утилизации простейшими самих биопленок (данные не приводятся) не происходит.

Учитывая полученные результаты, можно предположить, что простейшие заметно способствуют существованию бактериальной популяции в составе биопленок. Своеобразие данной экологической ниши патогенных бактерий позволяет считать формирование биопленок с участием простейших, а возможно, и других сочленов биоценоза, одним из механизмов устойчивого существования возбудителей сапронозов в почвах и водоемах.

Ультраструктурное исследование ассоциации T.pyriformis и B.cenocepacia в биопленке методом KJTCM выявило следующее.

В ранних биопленках (через 7 часов) популяция простейших представляла собой морфологически неизмененные, активно фагоцитирующие особи, заполненные различным количеством фагосом (от 4 до 25). В некоторых инфузориях наблюдали формирование гигантских пищеварительных вакуолей за счет слияния нескольких мелких фагосом. Подобные структуры характерны для псевдомонад и буркхолдерий, взаимодействующих с простейшими, что было показано в нашей лаборатории ранее с применением трансмиссионной электронной микроскопии (Пушкарева В.И., 1992). Помимо локализации внутри клеток-хозяев (эндосимбиоз) на кортексе инфузорий адгезировались большие скопления буркхолдерий (экзосимбиоз). Большое количество пищеварительных вакуолей в ранние сроки взаимодействия ассоциации свидетельствует об установлении отношений между популяциями буркхолдерий и простейших по типу «хищник-жертва». В более поздние сроки (18 часов) вышедшие из фагосом, активно делящиеся бактерии, очевидно, устойчивые к перевариванию, вызывали значительные морфологические изменения (лизис эндоплазмы, нарушение внутренних структур) у большинства инфузорий, погруженных в биопленочный матрикс. Аналогичный сценарий имел место при ультраструктурном анализе взаимодействия псевдомонад (буркхолдерий) и простейших методом трансмиссионной электронной микроскопии. Бактерии, резистентные к фагоцитозу, выходили неповрежденными в эндоплазму, размножались и разрушали клетку-хозяина.

По мере накопления биомассы и «созревания» пленок цитопатогенное воздействие буркхолдерий возрастало и через 36 часов можно было видеть лишь отдельные фрагменты клеток инфузорий. С уверенностью можно утверждать, что в процессе взаимодействия T.pyriformis с B.cenocepacia симбиотические отношения по типу «хищник-жертва», имеющие место в первые часы взаимодействия, в более поздние сроки изменяются на отношения по типу «паразит-хозяин» с фатальным исходом для популяции простейших. Устойчивая к фагоцитозу часть буркхолдерий после выхода из фагосом активно размножалась и накапливалась в окружающей среде. Пассируясь естественным образом через интактные клетки инфузорий, вероятно, они способны повышать вирулентность популяции.

Следует отметить, что уже на ранних стадиях формирования биопленок в присутствии инфузорий возникали скопления буркхолдерий в виде «микроколоний», по форме аналогичных фагосомам, заполненным бактериями и выпавшим во внеклеточное пространство. В поздние сроки (36 часов), когда биопленки достигали высшей зрелости, количество таких микроколоний возрастало на 40 - 50 % в отдельных препаратах. Очевидно они «остались» на месте разрушенных фагосом в тех же границах, повторяя их форму.

Совокупность представленных в диссертации экспериментальных исследований вносит новый вклад в оригинальное направление медицинской микробиологии и экологической эпидемиологии - изучение общих закономерностей, факторов и механизмов существования патогенных бактерий в биоценозах почв и водоемов. Это направление исследований, традиционное в работе лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН на протяжении 20 лет, обозначено (Литвин В.Ю. и др., 2004) как «Биоценотические основы природной очаговости сапронозов».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каминская, Анастасия Александровна, Москва

1. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990, 135 с.

2. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий, М., Медицина, 2005, 242 с.

3. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге. В сб: Экология возбудителей сапронозов. М., 1988, С. 80.

4. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1997,3: 116 121.

5. Диденко Л.В., Константинова Н.Д., Романова Ю.М. и др. Новый метод концентрирования бактериальных суспензий для трансмиссионного электронно-микроскопического анализа. Молекул, генетика, 1996,4: 35 -39.

6. Диденко Л.В., Константинова Н.Д., Романова Ю.М. и др. Ультраструктурная организация клеток Sallmonella typhimurium при длительном голодании и переходе в некультивируемое состояние, Молекул, генетика, 2000, 3: 21 26.

7. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. М.: Высшая школа, 1981, 605с.

8. Ермолаева С.А., Романова Ю.М., Тартаковский И.С. Вклад системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентность факультативных внутриклеточных паразитов. Вестник РАМН, 2005, 1: 44-48.

9. Емельяненко Е.Н. Некультивируемые формы иерсиний и листерий в почве и при взаимодействии с растениями. Дисс.канд.биол.наук, М., 1998, 123с.

10. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 2004,40(11): 1 12.

11. Каминская А.А. Паразитизм в простейших Burkholderia cepacia в зависимости от факторов окружающей среды. Мат-лы научно-практ.конф. молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль, 2005, С. 66 68

12. Кормилицина М.И., Барановский П.М., Ананова Е.В. Ассоциации франциселл с инфузориями в эксперименте. В сб: Патогенные бактерии в сообществах. М., 1994, С. 65 70.

13. Куликовский А.В., Павлова И.Б., Айвазян М.А., Дроздова Т.Д. Поведение микробной популяции во внешней среде. Вестник с.-х. науки. 1990,12: 101-104.

14. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах. В сб: Экология возбудителей сапронозов. М., 1988, С. 20 34.

15. Литвин В.Ю. Природная очаговость сапронозов новое в концепции Е.Н.Павловского. Мат-лы XII Всес. конф. по прир. очаговости болезней. М., 1989, С. 98 -99.

16. Литвин В.Ю. Потенциальная патогенность и случайный паразитизм микроорганизмов. В сб: Потенциально патогенные бактерии в природе. Москва, 1991,С. 9-30.

17. Литвин В.Ю. Холера как природноочаговая сапронозная инфекция. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол, 1995, 6: 24-27.

18. Литвин В.Ю. Механизмы устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (новые факты и гипотезы). Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1997,4: 26 31.

19. Литвин В.Ю. Сапронозные аспекты энзоотии чумы. Успехи соврем, биологии, 2003, 123(6): 543 547.

20. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармарус принт, 1998,256 с.

21. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы. Вестник РАМН, 2000,1: 7-13.

22. Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблема и факты. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.,. 1996, 2: 101-104.

23. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И Емельяненко Е.Н. Биоценотические основы природной очаговости сапронозов. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004,4: 102-108.

24. Меркуров А.Э., Тартаковский И.С., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Константинова Н.Д., Попов В.Л. Инфузории как хозяева легионелл в природе. Мат-лы XII Всес. конф. по прир. очаговости болезней. М., 1989, С. 101 -102.

25. Мидоуз П. Прикрепление водных ьактерий к твердым поверхностям. IX Междун. конгресс по микробиологии. М., 1966, С. 361.

26. Никулынин С.В., Онацкая Т.Г., Луконина Л.М., Бондаренко А.И. Изучение ассоциаций почвенных амеб с бактериями возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.,. 1992, 9-10:2-4.

27. Олсуфьев Н.Г., Петров В.Г., Шлыгина К.Н. Об обнаружении возбудителей эризипелоида и листериоза в воде ручьев. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1959, 3: 89 94.

28. Павловский Е.Н. Природноочаговые болезни человека. М.: Медгиз, 1960, 326 с.

29. Погорелов В.И., Пинигин А.Ф., Марамович А.С., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Изучение взаимодействия холерных вибрионов синфузориями Tetrahymena pyriformis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1995,2: 22-27.

30. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование). Дисс. докт. биол. наук, Москва, 1994, 210с.

31. Пушкарева В.И. Методы экспериментального изучения хозяев и путей циркуляции возбудителей инфекций в почвенных и водных сообществах. В сб: Патогенные бактерии в сообществах (механизмы и формы существования). М., 1994, С. 35-42.

32. Пушкарева В.И. Паразитизм в простейших как стратегия существования патогенных бактерий в почвах и водоемах. Успехи соврем, биологии. 2006, 126 (4): 323 333

33. Пушкарева В.И., Величко В.В., Каминская А.А., Литвин В.Ю. Burkholderia cepacia в разных экологических условиях: численность и изменчивость бактериальной популяции. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 2005, 3: 39 44.

34. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белякова Г.А. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1997, 3:3 -6.

35. Пушкарева В.И., Константинова Н.Д., Литвин В.Ю., Попов В.Л. Псевдомонады как паразиты простейших. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1992, 2:4-10.

36. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Тартаковский И.С. Популяционная динамика Yersinia pseudotuberculosis в ассоциации с инфузориями

37. Tetrahymena pyriformis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1989, 1:17-20.

38. Романова Ю.М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. Дисс. докт. биол.наук,-М., 1997, 161 с.

39. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990,264 с.

40. Соколенко А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов. Автореф. дис. канд. биол. наук.- Саратов, 2000, 18 с.

41. Сукачев В.Н. Основы теории биогеоценологии. М. АН СССР, 1947, 283 с.

42. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. М.: Медицина для всех, 2002,200 с.

43. Томов А., Цветкова Е., Курдова Р. Взаимодействие на амеби с легиолни и туларемийни бактерии. VII конгресс по заразни и паразитни болезни, Вилиноград. 1992, С. 17.

44. Троицкая В.В., Четина Е.В., Аляпкина Ю.С., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Некультивируемые формы Yersinia pseudotuberculosis в почвах природного очага псевдотуберкулеза. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1996, 5: 13-15.

45. Филипченко А.А. Экологическая концепция паразитизма и самостоятельность паразитологии как научной дисциплины. Уч. зап. МГУ. 1937, Вып. 13 (4): 4-7.

46. Хаусман К. Протозоология. М.: Мир, 1988,334 с.

47. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae 01). Мол. генетика, миробиол., вирусол., 1993, 6: 1822.

48. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики организации генома и метаболизма. Мол. генетика, вирусол., микробиол. 2003, 2: 39 41.

49. Abd Н., Johansson Т., Golovlid J., Sandstrom G., Forsman M. Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellanii. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69(1): 600 606.

50. Alexander M. Why microbial predators and parasites do not eliminate their prey and hosts. Ann. Rev. Microbiol. 1981,(35): 113 133.

51. Anand C.M., Skinner A.R., Malic A., Kurts J.B. Interaction of L.pneumophila and a free living amoeba (Acanthamoeba palestensis). J. Hyg. 1983,91 (2): 167-178.

52. Byrd J.J., Hu H-S., Colwell R.R. Viable but nonculturable bacteria in drinking water, Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57: 875-878

53. Boyd A., Chakrabarty A.M. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol. 1995, 15: 162-168.

54. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs. Phytopathology 1950,40:115-117.

55. Cianciotto N.P., Eisenstein B.J., Mody C.N., Toews G.B., Engleberg N.C. A Legionella pneumophila gene encoding a species-specific surface protein potentiates initiation of intracellular infection. Infect. Immun. 1989, 57: 1255 -1262.

56. Colwell R.R. An indirect fluorescent antibody staining procedure for detection of Vibrio cholerae serovar 01 cells in aquatic environmental samples. J. Microbiol. Methods. 1984,2: 221-331.

57. Colwell R.R., Brayton P.R., Grimes D.J e.a. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implication for the release of genetically engineered microorganism. Bio/Technology. 1985, 3: 817-820.

58. Colwell R.R., Bryton P.R., Herington D. et al. Vieable but nonculturable V.cholerae revert to culturable state in the human intestine, World J.Microbiol, and Biotechnol. 1996,12: 28-31.

59. Colwell R.R., Kaper J., Joseph S.W. Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and other vibrios: occurrence and distribution in Chesapeake Bay. Sciens. 1977,198:394-396.

60. Costerton J.W., Cheng K.-J, Geesy G.G., Ladd T.I., Nickel J.G., Dasgupta M. and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu. Rev. Microbiol. 1987, 41:435-464

61. Costerton J.W., Geesy G.G. Cheng K.-J. How bacteria stick. Sci Am. 1978, 238: 86-95.

62. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M. et. al., Microbiol, biofilms. Ibid. 1995,49: 711-745.

63. Daley R.J., Hobbie J.E. Direct counts of aquatic bacteria by modified epi-fluorescent technique. Limnol. Oceanogr. 1975,20: 875-882.

64. Davey, M.E., and O'Tool, G.A. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. Microbiology and Molecular Biolodgy Reviews 2000, 4: 847-867.

65. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002,15: 167-193.

66. Eren J., Pramer D. Application of immunofluorescent staining to studies of the ecology of soil microorganisms. Soil Sci. 1966,101: 39-45.

67. Fields B.S., Fields S.R., Chin Loy J.N., White E.N. Attachment and entry of Legionella pneumophila in Hartmannella vermiformis. J. Infect. Dis. 1993, 167: 1146- 1150.

68. Fliermans C.B., Schneider C., Schmidt E.L. Direct measurement of bacterial stratification in Minnesota lakes. Arch. Hydrobiol. 1975, 76: 248-255.

69. Forst, S.A., and Roberts, D.L. Signal transduction by the EnvZ-OmpR phosphotransfer system in bacteria. Res Microbiol 1994, 145(5-6): 363-73.

70. Fransisco D.E., Mah R.A., Rabin A.C. Acridine orange epi-fluorescent technique for counting bacteria in natiral waters. J. Trans. Am. Microsc. Soc. 1973, 92:416-421.

71. Gauthier Y., Isoard P. et. al. L'adhesion des bacteries sur les surfaces. Ind. alimetagr. 1989, 106(1-2): 31.

72. Girardeau J.P.Adherence bacterienne. "6 eme Reun. Microbial. INRA. Murat-le-Quaire. Versailles. 1982. P. 9.

73. Groscop J.A., Morgan M.B. The effects of selected strains of pigmented microorganisms on small free-living amoebae. Canadian J. of Microbiol. 1964, 10: 579-584.

74. Hales L.M., Shuman H.A. The Legionella pneumophila rpoS gene is required for growth within Acanthamoeba castellanii. J. Bacterid. 1999, 181: 4879 4889.

75. Hill I., Gray T. Application of fluorescent antibody technique to an ecological study of bacteria in soil. J. Bacteriol. 1967,93: 1888-1896.

76. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. Appl. Environm. Microbiol. 1977, 33 (5): 1225-1228.

77. Hall J., Voelz H. Bacterial endosymbionts of Acanthamoeba sp. J. Parazitol. 1985,71:89-95.

78. Holler C, Witthuhn D, Janzen-Blunck B. Effect of low temperatures on growth, structure, and metabolism of Campylobacter coli SP10. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(2): 581-587.

79. Islam M. S., Rahim Z., Alam M.J. e.a. Association of Vibrio cholerae 01 with the cyanobacterium, Anabaena sp., elucidated by polymerase chain reaction and transmission electron microscopy. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.1999, 93 (1): 36-40.

80. Jadin J.B Free-living pathogenic amoebae. Acta leprol. 1975, 59:57.

81. Jones J.G., Simon B.M. An investigation of errors in direct counts of aquatic bacteria by epi-fluorescence microscopy, with reference to a new method for dyeing membrane filters. J. Appl. Bacteriol. 1975,39: 1-13.

82. Keevil C.W. Rapid detection of biofilms and adherent pathogens using scanning confocal laser microscopy and episcopic differential interference contrast microscopy.Water Sci. Thechnol. 2003, V. 47 (5). P. 105-116.

83. Kilvington S., Price S. Survival of Legionella pneumophila within cyst of acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure J. Appl. Bacteriol. 1990, 68 (5): 519-525.

84. Kondo K, Takade A, Amako K. Morphology of the viable but nonculturable Vibrio cholerae as determined by the freeze fixation technique. FEMS Microbiol. Lett. 1994,123 (1-2): 179-184.

85. Kogure K., Simidu U., Taga N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria, Can.J.Microbiol., 1979,25: 415 420.

86. Kogure K., Simidu U., Taga N. Effect of Sceletonema costatum (Grev.) Cleve on the growth of marine bacteria. J. Exp. Mar. Biol. And Ecol. 1979, 36: 201-215.

87. Lamothe J., Thyssen S., Valvano M.A. Burkholderia cepacia complex isolates survive intracellularly without replication within acidic vacuoles of Acanthamoeba polyphaga. Cellular Microbiol. 2004, 6 (12): 1127- 1138.

88. Landers P., Kerr K.G., Rowbotham T.J. e.a. Survival and growth of Burkholderia cepacia within the Free-Living Amoeba Acanthamoeba polyphaga. Eur. J. Clin.Microbiol.Jnfeck.Dis. 2000,19 :121-123.

89. Lieo M.M., Tafi M.C., Canepari P. Nonculturable Enterococcus faecalis cells are metabolically active and capable of resuming active growth. Syst. Appl. Microbiol. 1998,21(3): 333-339.

90. Linder K, Oliver J.D. Membrane fatty acid and virulence changes in the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55(11): 2837-2842.

91. Ly T.M.C., Muller H.E. Ingested Listeria monocytogenes survive and multiply in protozoa. J. Med. Microbiol. 1990, 33: 51 54.

92. Marolda, С., Hauroder, В., John, M., Michel, R., and Valvano, M. Intracellular survival and saprophytis growth of isolates from the Burkholderia cepacia complex in free-living amoebae. Microbiology 1999,145: 1509-1517.

93. Matz C., Bergfeld Т., Rice S.A. and Staffan Kjelleberg. Microcolonies, quorum sensing and cytotoxicity determine the survival of Pseudomonas aeroginosa biofilms exposed to protozoan grazing. Environment. Microbiol. 2004, 6(3): 218-226.

94. Mats, С., 1., McDougald, D., Moreno., A. M., Yung, P. Y., Yildiz, F. H., andKjelleberg, S. Biofilm formation and phenotypic variation enhance predation-driven persistence of Vibrio cholerae. PNAS 2005,46:16819-16824.

95. Matz C.and Kjelleberg S. Off the hook how bacteria survive protozoan grazing. Trends in Micribiolology. 2006, 13 (7): 302-307.

96. McKay A.M. Nonviable bacterial pathogens, 3ett. Appl., Microbiol., 1992, 14: 129-135.

97. Oliver J.D. Formation of viable but nonculturable cells. Starvation in bacteria (ed. S.Kjellenberg). Plenum Press, New York, 1993, p.239.

98. Olsson-Axelsson D., Waldenstrom J., Broman T. et. al. Protozoan Acanthamoeba polyphaga as a potential reservoir for Campylobacter jejune. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71: 987-992.

99. Pedersen K. Factors regulating microbial biofilm development in system slowly flowing seawater. Eppl. Environ. Microbiol. 1982, 44: 1196-1204.

100. Rhame F.S. The Ecology and Epidemiology of Pseudomonas aeruginosa. (Ed) L.D. Sabath, 1980, Bern, 31-50.

101. Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural environment. Appl. Environ. Microbiol. 1986, 52(3): 531-538.

102. Roszak D.B., Grimes D.J.,Colwell R.R. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can.J.Microbiol., 1984, 30: 334-338.

103. Rowbotham T.J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. Jornal of Clinical Pathology 1980. 33:1179- 1183.

104. Rowbotham T.J. Current views on the relationships between amoebae, legionellae and man. Israel J. Med. Sci. 1986,22: 678 689.

105. Segal G., Shuman H.A. The Legionella pneumophila utilized the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect, and Immun. 1999, 67(5): 2117 2124.

106. Shapiro J.A. Bacteria as multicellular organism. Sci.Am.1988,256:82-89.

107. Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organism. Annu.Rev.Microbiol. 1998, 52: 81-104.

108. Signoretto C., Lleo M.M., Tafi M.C., Canepari P., 2000, Cell wall chemical composition of Enterococcus Faecalis in the viable but nonculturable state. Appl. Environ. Microbiol., May; 66 (5): 1953 1959.

109. Stepanovic S., Cirkovic I., Ranin L. et. al. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.Lett Appl Microbiol. 2004, 38: 428 432

110. Stoodley P., Sauer K., Davies D.S., Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu.Rev.Microbiol. 2002, 56: 187-209.

111. Taylor S.S., Ahonen L.J., Frans A.A. de Leij FA, Dale JW1.fection of Acanthamoeba castellanii with Mycobacterium bovis and M. bovis BCG and survival of M. bovis within the amoebae. Appl. Environ. Microbiol. 2003, P. 4316-4319.

112. Thom S., Warhurst D., Drasar B.S. Association of Vibrio cholerae with fresh water amoebae. J. Med. Microbiol. 1992, 36: 303 306.

113. Tezcan-Merdol D., Ljungstrom M., Winiecka-Krusnell J., Linder E., Engstrand L., Rhen M. Uptake and replication of Salmonella enterica in Acanthamoeba rhysodes. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70(6): 3706.

114. Wang W., Shor L.M., Le Boeuf E.J. Wikswo JP, Kosson DS. Mobility of protozoa through narrow channels. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(8): 4628 -4637.

115. Watnick P., Kolter R. Steps in the development of Vibrio cholerae El Tor Biofilm. Mol. Microbiol. 1999, 34(3): 586 -595.

116. Zimmerman R., Itturiaga R., Becker-Birck J. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number there of involved in respiration. Appl. Environm. Microbiol. 1978, 36 (12): 926-935.