Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях

Алябьева, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях"

На правах рукописи

АЛЯБЬЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

СЕРОТИПЫ И УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ВЫДЕЛЕННЫХ У ДЕТЕЙ ПРИ РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

03.02.03. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па сопскаппс ученом степени кандидата медицинских наук

Москва -2014

6 НОЯ 2074

005554588

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научный центр здоровья детей»

Научный руководитель: Манпский Николай Андреевич,

доктор медицинских наук, заведующий лабораторным отделом Научно-исследовательского института педиатрии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр здоровья детей»

Официальные оппоненты:

Костюкова Натальи Николаевна,

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, ведущий научный сотрудник научной части Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Грубер Ирина Мироновна,

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией экспериментальной микробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Ведущая организации:

Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «4» декабря 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей п благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, |Щр://\улу\у.цаЬпс11.ги

Автореферат разослан 14 года.

Ученый секретарь Днссертац11онншх>-€едета; //

доктор медицинских наук ( ( ■'/ЫХтЗ&Ь' Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) является ведущей причиной респираторных инфекций бактериальной этиологии, включая острый средний отит (ОСО), синусит и внебольнпчную пневмонию. Кроме того, пневмококк может вызывать такие тяжелые инвазивные инфекции, как менипгит, бактериемия и бактериемичсская пневмония, которые связаны с высокой летальностью. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, от пневмококковых инфекций ежегодно умирают около 1 млн. детей в возрасте до 5 лет (Баранов Л.А., 2012).

В РФ показатель заболеваемости впебольничной пневмонией в детской популяции составляет 5-12%о, и он наиболее высокий у детей в возрасте младше 5 лет. При этом у 80% пациентов из указанной возрастной группы болезнь связана с пневмококком (Баранов А.А., 2008). При бактериальном менингите у детей до 5 лет пневмококк обнаруживают в 220% этнологически расшифрованных случаев, что соответствует 4-8 случаям на 100 000 детей этого возраста (Белошицкий И.С., 2012).

Самой частой клинической формой пневмококковой инфекции у детей является острый средний отит. К трем годам 80% детей переносят хотя бы один эпизод острого среднего отита, а к семи годам 40% детей переносят шесть и более рецидивов этого воспалительного процесса (Monasta L., 2012).

Широкое и нередко необоснованное назначение антибиотиков при респираторных инфекциях у детей без учета их этиологии служит одним из основных факторов, определяющих рост антибиотикорезистеитности пневмококка. За последние 30 лет распространенность устойчивых к антибиотикам штаммов пневмококка выросла во всем мире. В зависимости от региона доля нечувствительных к пенициллину изолятов колеблется от 5 до 50%, к макролидам - от 5 до 80% (Linares .1., 2010; Reinert R.R., 2009). Вызывает обеспокоенность появление пневмококков с множественной устойчивостью (т.е. полирезистентностыо - нечувствительностью к 3 и более группам антибиотиков), доля которых в некоторых странах достигает 30-50%. Резистентность ассоциирована с глобально распространенными генетическими линиями (клональными комплексами) пневмококка. Выраженная региональная вариабельность резистентности S. pneumoniae диктует необходимость получения данных о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России (Козлов Р.С., 2010; Сидоренко С.В., 2011).

В последние годы для профилактики пневмококковых инфекций широко используют пневмококковые гтолнеахаридные коиъюгированные вакцины, эффективность которых была показана во многих странах, внедривших пневмококковые коиъюгированные вакцины в Национальные календари иммунизации (Rodgers G.L., 2009; Mcintosh E.D., 2011; РаГшерт

P.P., 2012). Однако спектр циркулирующих серотииов S. pneumoniae может варьировать в разных странах, поэтому требуются региональные данные о наиболее актуальных серотипах пневмококка для создания новых вакцин и изучения их эпидемиологической эффективности (Rodgers G.L., 2009; Баранов Л.А., 2009; Сидоренко C.B., 2010).

Таким образом, пневмококковые инфекции являются серьезной клинико-мпкробиологической проблемой, заслуживающей особого внимания. Это объективно обосновывает необходимость дальнейшего слежения за серотипами пневмококка, распространенностью его резистентных штаммов, преобладающими генетическими механизмами лекарственной устойчивости, клональными характеристик циркулирующей популяции бактерий в целях улучшения профилактики и лечения заболеваний,связанных с этим возбудителем.

Степень разработанности темы исследования

Одни из первых работ по серотлпированшо пневмококков при помощи специфических сывороток принадлежат немецкому бактериологу Фреду Мейфельду (Neufeld F., 1909). К настоящему времени в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка, разделенных на серотипы и серогруппы но антигенной структуре (Lund Е„ 1960; McEllistrem M.С., 2012).

В последние годы наиболее актуальной представляется проблема резистентности пневмококков. Резистентность ассоциирована с глобально распространенными генетическими линиями (клональными комплексами) пневмококка. Литературные данные о региональных особенностях резистентности S. pneumoniae свидетельствует о необходимости получения сведений о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России (Козлов P.C., 2010; Сидоренко C.B., 2011), поскольку именно региональные данные крайне важны для понимания тенденций распространения серотипов и резистентности пневмококков fia конкретной территории. Первичная селекция и распространение резистентных штаммов микроорганизмов происходит в отдельных популяциях, затем устойчивые клопы могут распространиться на значительные территории, преодолевая границы государств и континентов. Идентификация устойчивости к антибиотикам, описание географии и динамики распространения резистентных штаммов имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку будут способствовать совершенствованию существующих антибактериальных препаратов и снижению вероятности возникновения резистентности.

Цель исследования

Охарактеризовать спектр серотипов и распространенность устойчивости к антибиотикам клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве.

Задачи исследования:

1. Описать актуальный серотииовой пейзаж клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве за 2009-2013гг.

2. Модифицировать схему тинирования, основанную на мультиплексной полимеразпой цепной реакции, в соответствии с данными об актуальных серотппах S. pneumoniae и сравнить серологический и молекулярный методы типнровання.

3. Определить распространенность устойчивости выделенных штаммов S. pneumoniae к основным антибактериальным препаратам.

4. Охарактеризовать клональную структуру полирезистептных штаммов S. pneumoniae. Определить молекулярные механизмы резистентности к макролидам у выделенных штаммов 5. pneumoniae.

5. Оценить диагностическую значимость выявления специфической ДНК при остром среднем отите у детей и определить структуру его бактериальных возбудителей.

Научная новизна

На основании исследования 863 клинических штаммов, выделенных от детей с респираторными инфекциями в период 2009-20 13гг. в г. Москве, охарактеризован современный серотнповой пейзаж пневмококков и установлено, что 69,4% из них относится к 6 доминирующим серотииам: 3, 6А, 6В, 14, I9F и 23F. Оценка полноты охвата циркулирующих серотипов имеющимися пневмококковыми конъюгированными вакцинами показала целесообразность использования вакцин с расширенным спектром серотипов (13-валентная пневмококковая коныогированная вакцина).

Получены новые данные о распространенности устойчивости к антибиотикам актуальных штаммов пневмококка, циркулирующих у детей в Москве в настоящее время. Показано, что 27% выделенных штаммов нечувствительны к пенициллину, 26% резистентны к макролидам, а 22% обладают полирезистентностью.

Показано, что ведущим молекулярным механизмом резистентности изучаемых штаммов S. pneumoniae к макролидам является рнбосомальное метилирование с участием гена егтВ, который определяется у 85% макролид-резистсптных штаммов, причем у 31% штаммов он сочетается с эффлюксным механизмом.

С помощью метода мультилокусного сиквенс-тииирования впервые охарактеризована популяционная генетическая структура полирезистептных штаммов S. pneumoniae в Москве н показано, что большинство из них (57%) относится к четырем клональным комплексам (СС63, CCI56, СС230 и СС320), которые распространены во всем мире.

Модифицирована схема мультиплексного молекулярного типирования пневмококков на основе полимеразпой цепной реакции, которая позволяет типировать 90,5% штаммов за первые три реакции.

Теоретическая и практическая значимость работы

Сведения о современном серотиповом пейзаже клинических штаммов пневмококков дают представление о полноте их охвата существующими пневмококковыми конъюгированными вакцинами на конкретной территории.

Полученные данные о сиквенс-типах S. pneumoniae, указывающие на генетическую гетерогенность штаммов, создают основу для мониторинга генетической структуры полирезистентных штаммов пневмококка в нашей стране. Информация о полученных сиквенс-типах размещена в международной базе данных PMEN.

Проведен сравнительный анализ серологического и молекулярного метода типирования пневмококка. Подтверждена надежность молекулярного метода и возможность его использования в рутинной практике.

Знания об этиологической структуре возбудителей острого среднего отита и распространенности устойчивых к антибиотикам штаммов пневмококка будут способствовать оптимизации эмпирической антибактериальной терапии респираторных инфекций.

Молекулярное типирование с помощью модифицированной мультиплексной ПЦР является адекватным и надежным методом, который можно использовать для идентификации серотипа у 90,5% циркулирующих штаммов пневмококка на основании первых трех реакций.

Впервые показана высокая чувствительность молекулярно-генетического метода непосредственно в биопробе при этиологической диагностике острого среднего отита у детей вне зависимости от приема антибактериальных препаратов, предшествовавшего сбору биоматериала.

Результаты исследований и разработок внедрены в научно-исследовательскую работу лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологин и лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД, а также в материалы лекций по рациональной антибактериальной терапии при болезнях дыхательных путей у детей и используются в учебной программе на кафедре педиатрии в ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.

Методология н методы исследования

Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с серотипами п антибиотикоустойчивостыо клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве. Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

В исследование включены штаммы S. pneumoniae, выделенные в лаборатории микробиологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр здоровья детей» в период с марта 2009 г. по апрель 2013 г. Пневмококк выделяли из образцов, полученных от детей из Москвы с симптомами острой респираторной инфекции предположительно бактериальной этиологии, с острым средним отитом, а также с хроническими болезнями легких (медиана возраста 3,5 года). В связи с тем, что эти штаммы пе были связаны с инвазивными пневмококковыми инфекциями, в пашей работе используется термин «неипвазивные штаммы».

Микробиологические методы исследования: Посев биоматериала производили па питательный агар (Columbia, Bio-Rad, Франция) с добавлением 3% донорской эрнтроцитарной массы крови человека и 3% лошадиной сыворотки. Образцы жидкости среднего уха (ЖСУ) наносили также на «шоколадный» агар, содержащий 10 мкг/мл НАД, который добавляли в предварительно охлажденную до 50-60°С среду. Посевы инкубировали в термостате с повышенным содержанием СО: (5%) при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч. Идентификацию пневмококка проводили на основании морфологических и культуральных свойств, а также с помощью теста с оптохином и реакции латекс-агглютинации (Slidex Pneumo-Kit, BioMerieux, Франция). Выделенные культуры Н. influenzae идентифицировали на основании изучения морфологии, культуральных свойств, потребности в факторах роста X и V в системе API N11 (BioMerieux, Франция). Бета-гемолитические стрептококки дифференцировали по чувствительности к бацитрацину (Bacitracin, HiMedia, Индия) и методом латекс-агглютинации с реагентом Slidex Strepto Kit (BioMerieux, Франция). Пневмококковые нзоляты хранили в бульоне (Nutrient Broth, HiMedia, Индия) с добавлением 17% глицерина при -80°С.

Серологическое тинирование S. pneumoniae проводили в реакции латексной агглютинации и/или реакции набухания капсулы по Нсйфельду, с помощью коммерческих тест-систем «ImmuLex™ Pneumotest kit» (Statens Serum Institut, Дания). Реакцию набухания капсулы определяли с помощью фазовоконтрастной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Нетипируемыми считали изоляты пневмококка, которые не агглютинировались ни одной из пудовых сывороток (пулы A-I и Р-Т).

Для определения чувствительности пневмококка к оксациллину, эритромицину, клиндамиципу и триметоприму/сульфаметоксазолу использовали диско-диффузионный метод (диски Bio-Rad, США). Результаты интерпретировали согласно рекомендациям МУК 4.2. 1890 - 04. Для штаммов S. pneumoniae, резистентных к оксациллину, определяли МПК пенициллина методом Е-теста.

Молекулярно-генетические методы. Молекулярное серотипирование пневмококков проводили с помощью мультиплексной ПЦР (М-ПЦР). Для этого использовали предложенные ранее праймеры, для следующих серотипов/серогрупп: 1, 3, 4, 5, 6А/В, 7F, 1С, 8, 9V, 10А, ПА, 12F, 14, 15А, 15В/С, 16F, 17F, Sgl8, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 31, 33F, 34, 35В, 35F, 38 (Pai R., 2006).

Разделение и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле.

Экстракцию ДНК из образцов ЖСУ проводили с помощью набора QIAamp DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Izasa, Барселона, Испания) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. В ЖСУ проводили поиск генетического материала четырех этиологически значимых отопатогенов (S. pneumoniae, S. pyogenes, II. influenzae и М. catarrhalis) с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Праймеры представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Праймеры дли идентификации генов lytA, отрР2, spy, copli

JVÜ Праймер Последовательность (5' - 3') Продукт (bp)

Streptococcus pneumoniae (McAvin J.C., 2001)

1 lytA - F ACGCAATCTAGCAGATGAAGC. 101

2 lytA - R TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC

3 lytA - зонд FAM-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG-BHQ1

Streptococcus pyogenes (CDC)

4 spy 1258 - F GCA СТС GCT ACT ATT ТСТ ТАС СТС АА 300

5 spy 1258 - R GTC АСА ATG ТСТ TGG AAA CCA GTA AT

6 spy1258 -зонд FAM-CCG CAA СТС АТС A AG GAT TTC TGT TAC CA- BHQ1

Moraxella catarrhalis (Greiner O., 2003)

7 сорВ - F GTGAGTGCCGCTTTACAACC. 71

8 сорВ - R TGTATCGCCTGCCAAGACAA

9 сор В - зонд FAM-TGCTTTTGCAGCTGTTAGCCAGCCTAA-BHQ1

Haemophilus influenzae (Maaroull Y. 2007)

10 отрР2-F GGTGCATTCGCAGCTTCAG 151

11 отрР2-R GATTGCGTAATGCACCGTGTT

12 отрР2-■зонд FAM -TTGTTTATAACAACGAAGGGACTAACGT-BHQ1

*Флуоресцентные метка 6-FAM, 6-флуоресцеин; Тушитель флуоресценции BHQ- 1, Black Hole Quencher-1.

Для определения генетических маркеров резистентности к макролидам (генов егтВ и meß в ДНК, выделенной из чистой культуры эритромицин-резистентных пневмококков, были использованы праймеры, предложенные Reinert R.R., et al (2008).

Для генотипирования штаммов pneumoniae использовали метод мультилокусного спквенс-типирования (MJ1CT). Подготовка матриц для секвепировапия включала амплификацию внутренних фрагментов генов «домашнего хозяйства»: чгоЕ, gdh, gki, recP, spi, xpt, ddl. Праймеры и условия амплификации приведены на сайте http://spneiimoniae.mlst.net/. Секвенировапие проводили с использованием наборов реагентов и оборудования фирмы Applied Biosystem (США) по методике, описанной производителем.

Анализ результатов секвенирования генов «домашнего хозяйства» с определением сиквенс-типов (Sequence Type, ST) проводили с использованием базы данных МЛСТ (http://spneumoniae.mlst.net). Штаммы, находящиеся в базе данных, сгруппированы в клональные комплексы на основании кластеризации методом eBURST (http://eburst.mlst.net/) для бактерий вида 5. pneumoniae.

Статистические методы: Статистическую обработку данных проводили с помощью программ SPSS 20.0 (SPSS Statistics, США) и Excel. Для сравнения распределения серотипов использовали таблицы сопряженности, х" или точный тест Фишера. Для сравнения долей использовали Z-критерий. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Личное участие автора в получении результатов

Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в выделении ДНК, постановке ПЦР, учете и интерпретации результатов серотипирования классическим и молекулярными методами. Микробиологическая часть исследования (культуральный посев, определение резистентности диско-диффузионным методом) осуществляли совместно с младшим научным сотрудником Пономарснко O.A. и заведующей лабораторией микробиологии к.м.и. Лазаревой A.B. в лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД. Секвенировапие культур S. pneumoniae проводили совместно с к.б.п. Пушковым A.A. в лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии ФГБНУ НЦЗД.

Положения, выносимые па защиту

1. До 70% циркулирующих в Москве штаммов S. pneumoniae среди детей с респираторными инфекциями представлены шестью ссротипами 3, 6А, 6В, 14, 19F и 23F.

2. Модифицированный алгоритм мультиплексной ПЦР для определения серогрупп и серогинов S. pneumoniae позволяет надежно идентифицировать серотип у 90,5% изолятов пневмококка за первые три реакции.

3. Более 20% циркулирующих в Москве штаммов pneumoniae обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. Эти штаммы относятся к

ограниченному числу серотипов и характеризуются выраженной клоналыюстыо.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

О достоверности результатов работы свидетельствует использование сертифицированных микробиологических методов, которые характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Проведен достаточный объем исследований, что позволило корректно осуществить статистическую обработку полученных данных. Комплексное молекулярно-генетическое определение серотипов S. pneumoniae позволило получить сопоставимые результаты с традиционными микробиологическим и методами серотипирования, что свидетельствует о достоверности полученных результатов.

Диссертация апробирована на заседании лабораторного отдела НИИ педиатрии ФГБНУ НЦЗД (протокол № 1 от 11.03.2014 г.).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на XIV, XV, XVI, XVII Конгрессах педиатров России, Москва, 2011, 2012, 2013, 2014; на XIV, XV, XVI Международных конгрессах по антимикробной терапии MAKMAX/ESCMID, Москва, 2012, 2013, 2014; на 5-ом Европейском Конгрессе педиатров (EUROPAED1ATRICS-2011), Вена, 2011; на 22-ом и 23-ем Европейском конгрессах по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCM1D 2012, 2013), Лондон, 2012, Берлин, 2013; на 30-ом Европейском Конгрессе по детским инфекционным болезням (ESPID 2012), Салоники, 2012.

Публикации

Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах, включая 5 статен в рецензируемых научных изданиях, 6 - в материалах конференций.

Структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 101 странице машинописного текста, иллюстрированы 15 таблицами, 7 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав описания результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспективных направлений дальнейшей разработки темы, списка сокращений и списка литературы. Библиографический указатель включает 150 источников литературы, из них 28 отечественных и 122 иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Спектр циркулирующих серотипов пневмококка

Всего в период с марта 2009 но апрель 2013 гг. собрано 863 штамма S. pneumoniae от 863 пациентов. Большинство штаммов получено из

назофарппгеальных мазков (п = 617, 71,5%) , 118 штаммов (13,7%) были выделены из образцов нижних дыхательных путей. Из ЖСУ было получено 128 (14,8%) штамма.

Из числа выделенных штаммов, 10 (1,2 %) штаммов не сохранилось для типнровапня, 18 (2%) штаммов были нетпппруемые. Таким образом, серотпп был определен у 835 (96,8%) пневмококковых штаммов. (Таблица 2, Рисунок 1).

Таблица 2

Распределение серотиноп S. pneumoniae с учетом покрытия ПКВа

Серотпп п % от общего Накопленный %

ПКВ7

4 6 0.7

6 В 107 12.8

9V 13 1.6

14 75 9

I8C 20 2.4

19F 181 21.7

23 F 84 10.0

Всего 486 58.2 58.2

Доп. для ПКВ13

1 3 0.4

3 63 7.5

5 0 0

6А 70 8.4

7F 10 1.2

19А 19 2.3

Всего 165 19.8 78

Не входящие в ПКВ

9N 12 1.4

1 OA 9 1.1

ПА 26 3.1

15В 29 3.5

15С 13 1.6

23А 17 2

37 11 1.3

Другие " 67 8

Всего 184 22 100

Все тппировапнме 835 96.8

Нетпппруемые 18 2

Не тнпировали 10 1.2

Всего 863 100

Примечание. аПКВ - пневмококковая конъюгнровампая вакцина "Другие серотипы с долей в распределении <1% включали 26 невакцнпных серотнпов (п):7С(1), 8(4), 9А (1), 10В (1), 11D(I), 12В (1), 12F (2), 13(2), 15А(3), 16F (5), 17F (6), 18А (1), 20 (1), 21 (1), 22F (3), 23В (3), 28А (2), 28F (1), 33F (3), 34 (6), 35В (2), 35С (5), 35F (7), 38 (1), 39 (2), 42 (2).

Среди выявленных 45 различных серотипов преобладали серотипы 3, 6А, 6В, 14, 19F и 23F, которые составили 69,4% распределения. Невакцинные серотипы были распространены в 22%, среди них доля серогруппы 15 составила 5,1%, серотипа IIA- 3,1% от общего числа штаммов. Остальные 26 серотипов встречались редко (доля каждого составляла < 1% от общего числа), суммарно составляя 8%. Серотип 19F имел самую высокую частоту встречаемости, которая составила >20%, причем его распространенность была еще выше у пациентов <48 мес. Напротив, серотипы 3 и 37, а также редкие серотипы преобладали у детей старшего возраста (>48 мес.). Доли остальных серотипов во всех возрастных группах различались статистически незначимо. Кроме того, штаммы пневмококка с редкими серотипами, доля которых составляла < 1% в общем распределении (категория «другие» на Рисуноке I), суммарно чаще встречались у детей старшего возраста (>48 мес.).

Рисунок 1. Распределение серотипов пневмококка в трех возрастных

группах

Примечание. Представлены 17 серотипов, частота встречаемости которых была более 1% (суммарно 90,9% от всех серотипов). Число наблюдений по возрастным группам составило: £24 мес. - п=234, 25-48 мес. - п=280, > 48 мес. - п=321.

Структура серотипов имела некоторые особенности в зависимости от локуса выделения пневмококка. Например, частота выявления серотипов 3 и 19А в образцах ЖСУ была выше, чем в других источниках, в то время как серотип 1 1А был выявлен исключительно в образцах, полученных из нижних дыхательных путей.

Учитывая незначительные различия в распределении серотипов пневмококка из разных источников, для дальнейшего анализа они были объединены как "неинвазивные штаммы".

Среди всех выявленных нами серотипов 7-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина (Г1КВ7) покрывает 58,2% (Таблица 2). 13-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина включает 6 дополнительных серотипов, тем самым увеличивая покрытие на 20%, в основном за счет серотипов 3, 6А и 19А. В исследованной коллекции не было обнаружено ни одного штамма, относящегося к серотипу 5. По сравнению с ПКВ7, Г1КВ10, имеющая на 3 серотипа больше (1, 5 и 7F), дает дополнительно 1,6% покрытия.

2. Молекулярное типировапие чистой культуры S. pneumoniae с помощью М-ПЦР

Опираясь на полученные результаты (Таблица 2), а также предыдущие исследования серотипового пейзажа 5. pneumoniae на территории РФ (Козлов P.C., 2011; Воронина Л.Г., 2013; ЬСатосова Л.К., 1990), мы изменили состав наборов праймеров для ПЦР с учетом частоты встречаемости отдельных серотипов в нашей стране (Таблица 3).

Таблица 3

Серотипы S. pneumoniae, определяемые в ходе М-ПЦР

№ ПЦР Определяемые серотипы

I 6А/В. 14. 19F, 23F

11 3, 11А, 15В/С, Sgl 8

111 9V, 15А, 19А, 34

IV 1, 7F, 10А, 33F

V 4, 12F, I7F, 38

VI 1С, 16F, 35В,35F

VII 8, 20, 31, 22F

Для молекулярного типирования было отобрано 420 штаммов, представлявших 34 различных серотипа. Проведение модифицированной М-ПЦР показало следующие результаты. После постановки ПЦР №1 серотип был определен у 67,4% штаммов, ПЦР №11 позволила типировать еще 14,3% штаммов, а с помощью ПЦР №111 серотип был установлен дополнительно у 8,8% изолятов. Следовательно, за первые три ПЦР серотип был выявлен у 90,5% пневмококков из нашей коллекции (Таблица 4). ПЦР №IV-VII дали возможность дополнительно типировать 4,5% штаммов, что в целом обеспечило использованной методике 95%-ое покрытие серотипов.

Таким образом, путем М-ПЦР серотип был определен у 95% (399 из 420) штаммов S. pneumoniae. У оставшегося 21 штамма не удалось

амплифицировать ни одного серотип-специфического продукта, хотя все эти изоляты дали положительный результат в ПЦР с праймерами для общего локуса cpsA, что указывало на их принадлежность к 5. pneumoniae. Результаты серологического типирования показали, что все с/«/)"-штаммы имели серотипы, для которых не были предусмотрены праймеры (Таблица 4).

Таблица 4

Результаты молекулярного типирования S. pneumoniae с помощью М-ПЦР

№ ПЦР серотип/серогруппа N Накопленный %

6Л/В 91а 21,7

I 14 15 25,2

I9F 122" 54,3

23F 55 67,4

3 28 74,0

II 11А 22 79,3

15 В/С 3" 80,0

18 7' 81,7

9V 7 83,3

III 15А 4 84,3

19А 26 90,5

1 1 90,7

IV 7F 2 91,2

10А 2 91,7

V 4 2 92,1

38 1 92,4

VI 16F 3 93,1

8 1 93,3

VII 20 2 93,8

31 3 94,5

22F 2 95,0

cpsA+ 2 Г1 100,0

Всего 420

Примечание. По результатам серологического тмпнровамня (п):

а6Д(з6), 6В (61); ' 18С (6), 181- (1);

6 19Г(П9), 19Д (3); '2 (1), 9N (5), ЮС (1), 101- (1), 13 (1), 15F (1),

" 15В (3); 21 (4), 23А(4), 28F(I), ЗЗВ(1), 39(1).

При сопоставлении серологического и молекулярного типирования S. pneumoniae обнаружено совпадение результатов у 396/399 (99,2%) штаммов. У оставшихся 3 штаммов серологически определен серотип 19Л, а методом ПЦР

- серотип 19Р. При помощи МЛСТ установлено, что два из этих штаммов относились к сиквеис-типу 5Т-8025 и один - к: $Т-5964, причем у ранее описанных штаммов из базы данных РМ1;Ы указанные сиквепс-типы имели серотип 19А.

3. Анализ антпбпотнк-орезисгентпостп пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов пол и резистентных штаммов

Чувствительность к антибиотикам была протестирована у 835 штаммов пневмококка. Резистентность к различным группам антибиотиков варьировала от 20% до 57% (Таблица 5). Наибольший уровень резистентности пневмококка наблюдался к триметоприму/сульфаметоксазолу (57%).

Таблица 5

Резистентность штаммов S. pneumoniae

Серотип" No. Доля (%) резистентных штаммов

Оксациллип" Эритро- Клинда- ТМП/ 11оли-

мицин мнцнн СМЗ" резисгентные

Нее 835 29 26 20 57 22

ссротпны

3 61 2 0 0 5 0

6А 66 23 18 5 75 8

6 В 105 16 46 39 63 31

IIA 25 0 0 0 16 0

14 76 64 43 29 77 40

15В 29 14 0 0 79 0

18С 19 1 1 0 0 26 0

19А 19 90 58 32 79 63

19F 177 57 52 44 79 48

23А 17 0 6 0 35 0

23F 81 32 6 4 64 6

Примечании.

" Включены 11 ссротипов, час гота встречаемое! и котрмх была >=2%. Суммарно они составляли 82,7% от всех выявленных ссротипов.

° IIa M1IK к пенициллину было исследовано 189/243 оксаци.тлип-рсчистептпых штаммов. Ич них 93% обладали M1IK к пенициллину > 0.06 мкг/м.т.

" Трнмегопрпм/су.тьфаметокеа юл.

' Устойчивые к 3 и более классам ашибиошков. Другие нолирсчисichтные серотппы (число peiHcieiiiiibix штаммов/всего штаммов): X (1/4), 4N (2/12), 4V (3/12). 15Л (1/3), 35С (1/5).

Доля штаммов со сниженной чувствительностью пли резистентностью к пенициллину составила 27%, к эритромицину были резистентны 26% изолягов. Среди исследованных штаммов пневмококка

полирезистснтностыо (устойчивость к 3 и более классам антибиотиков) обладали 22% изолятов.

Наиболее устойчивые к антибиотикам пневмококки выявлялись среди штаммов, относившихся к серотипу J9A. Уровень резистентности к антибиотикам пневмококков этою серотипа колебался ог 90% (17/19) к пенициллину до 32% (6/19) к клиндамнцину. Большинство (63%, 12/19) 19Л-штаммов обладали полирезистснтностыо. Также к категории высокой резистентности относились пневмококки серотипов 14 и 19F, устойчивость которых к пенициллину составляла 64% и 57%, соответственно, а к эритромицину - 43% и 52%, соответственно.

Пневмококки серотипа 3 в значительной степени сохраняли чувствительность ко всем тестированным антибиотикам. Только 1 штамм этого серотипа был нечувствительны к оксациллипу и 5% (3/61) штаммов были резистентны к ТМП/СМЗ. Ни один изолят пневмококка серотипа 3 не обладал полпрезнстептностыо.

Большинство штаммов серотипа 23F были чувствительны к оксациллипу. эритромицину, клиндамнцину. число полирезистентных штаммов составило всего 6% (5/81).

Резистентностью к макролидам обладали 26% (218/835) исследованных штаммов пневмококка. Для уточнения механизмов резистентности к макролидам у 157/218 (72%) эритромицин-резистентных штаммов была проведена ПЦР для выявления егтВ и теf гена.

Ген егтВ выявлен у 54% (85/157) штаммов, ген те/ имели 13% (20/157) штаммов. Оба гена обнаружены у 31% (48/157) исследуемых штаммов. У четырех эритромицин-резистентных штаммов ни один из генов не был выявлен (Таблица 6).

Таблица 6

Генетические детерминанты резистентности к макролидам у _S. pneumoniae_

Гены резистентности Кол-во штаммов %

егтВ^ 85 54

mef+ 20 13

ermB+/mef+ 48 31

crmB-/mef- 4 2

Всего 157 100

Для детекции генетических маркеров резистентности и анализа клонального родства изолятов 5. pneumoniae в соответствии с международными рекомендациями использован метод мультилокуспого сиквенс-типирования (МЛСТ).

Всего было выявлено 14 различных сиквенс-тииов (ST), входящих в 7 клональиых комплексов (Clonal Complex. СС). Наиболее многочисленными оказались следующие СС: СС320 (9/26), СС315 (6/26), СС156 (5/26) и СС81 (3/23), которые относились к глобальным клонам Tai\van19l-14, I>oland6B-20, Spain'A-3 и Spain"'1-1, соответственно (Таблица 7, Рисунок 2).

Таблица 7

Результаты rciioTiiiiiipoiiaiiiisi полпрезпетептпых шгамлюв

пневмококка _

СС Связь с глобальным клоном ST Серотип Устойчивость к пеннцпллппу Генотип устойчивости к макролидам

81 Spain-'1 -1 81 23 F R L'rmB+mef

81 23 F R* crmB+mcf

81 6Л R* ermB+mef

3~>0 Taiwan141-14 320 I9A R* crmB+mef

320 19Л R ermB+mef

320 19A R mef

320 I9F R ermB+mef

236 19Л R* ermB+mef

236 19F R ermB+mef

236 19F R eriuB у mef

315 Poland('"-20 315 6 В S ermB+mef

315 6B R ermB

315 6B R* ermB

6046 6 В R -

1032 6 В S ermB

386 6 В R ermB

63 Sweden |:,л-25 63 19Л R ermB

156 г. • l)V -v Spam -j 790 19Л R ermB+mef

663 19Л R ermB

143 14 R ermB

865 14 R* ermB

230 Denmarku-32 276 19Л R ermB+mef

30 1500 23F R* ermB+mef

Примечание. К, устойчивым (MIIK пешшил.пша > 0,06 мкг/мл или речнаагшый к оксацнллипу. если помечен *). S, чувепштельпыи (Ml IK пенициллина < 0,06 мкл/мл)

.276

. 1500 .63

.81 6046

.386 . 790 ,143

315

.663

. 865

1032

.320 .236

Рисунок 2. MJICT 26 полнрезистентных штаммов S. pneumoniae

Примечание. Показано распределение популяции исследованных штаммов, построенное с использованием eBURS Г-анализа. ST обозначены кружком с соответствующим номером. Размер кружка пропорционален числу изолятов, принадлежащих данному ST. Однолокусныс варианты соединены линиями.

Самым распространенным был СС320, представленный 9 изолятами с серотипами 19А и 19F, пять из которых относились к ST236 и четыре - к ST320. Следует отметить, что устойчивость к эритромицину у 8 из 9 изолятов данного СС была обусловлена наличием обеих детерминант резистентности -генов егтВ и mef.

Вторым по числу изолятов был СС315, включавший в себя сиквенс-типы ST315 (п=3), ST386 (п=1), ST1032 (п=1) и ST6046 (п=1). Все пзоляты СС315 относились к серотипу 6В. У четырех изолятов резистентность к эритромицину была обусловлена наличием только гена егтВ, у одного -присутствием двух генов (егтВ+те/), а у изолята с ST6046 не выявлено ни одного гена резистентности.

Изоляты, относящиеся к клональному комплексу СС156, были представлены ST143 (1/5), ST663 (1/5), ST790 (1/5) и ST865(2/5).

У всех изолятов СС81 устойчивость к макролидным антибиотикам была обусловлена наличием генов mef и егтВ. К ССЗО относился один изолят с STI500, который имел серотип 23F, был устойчив к макролидам и обладал двумя генами резистентности (ermB+mef).

Единичными изолятами были представлены СС63 и СС230, имевшие серотип 19А (Таблица 7.).

Таким образом, наиболее высокой генетической гетерогенностью характеризовались штаммы с серотипом I9A. Они принадлежали к 4 различным клональным комплексам СС63, CCI56, СС230 и СС320, связанным с глобальными клонами Swedenьд-25, Spain"4-3, Denmark,4-32 и Taiwan14, соответственно.

4. Детекция ДНК бактериальных отонатогспов и жидкости среднего уха у детей с острым средин отитом с использованием ПЦР п реальном времени

Молекулярные маркеры бактериальных возбудителей были исследованы в ЖСУ 311 пациентов с ОСО (Таблица 8). Методом ПЦР у 218 (70%) пациентов удалось выявить наличие ДНК хотя бы одного исследуемого патогена. Наиболее распространенным оказался пневмококк. Он был выявлен у 78%) (170/218) пациентов (Таблица 9). Следующими по частоте патогенами с серьезным отставанием, но примерно с одинаковой частотой стали 5. руо^епех (13%, 28/218) и М. сакитИаПх (11%, 23/218). Последней по частоте была //. ¡п^иешае, которая обнаруживалась у 5% (1 1/218) пациентов.

Таблица 8

Характеристика обследованных пациентов с ОСО

Показатели п (%)

Всего пациентов 311 100

Возраст (месяцев, медиана, Q1;Q3) 28 (1 1; 40)

Способ получения ЖСУ Тимпаноцентез 185 59

Спонтанный прорыв барабанной перепонки 102 33

11ет данных 24 8

Положительная Г1ЦР'1 Да 218 70

Пет 93 30

Положительная культура" Да 93 30

Нет 218 70

Примечание (здесь и и Ta6.iniu.ix 9, 10):

"Положительным результатом ПЦ1' считали выявление у пациента ДНК одного или нескольких из исследованных оюпани снов.

"Положительным кулыу ральиым результатом считали выделение из ЖСУ одною или нескольких пилон этнологически значимых бактерии. к котрым относило 5. рпешчоп'ше, ругщепе.ч, //. 'т)!иеП2ае и М. сч1агг1ш1Ы.

У всех пациентов параллельно с ПЦР проводили классическое микробиологическое исследование. Доля положительных результатов при ПЦР (70%>) была статистически значимо выше (р<0,001) доли положительных результатов при микробиологическом исследовании (30%) (Таблица 8).

Таким образом, с помощью ПЦР удастся выявить отопатоген дополнительно у 40% пациентов с ОСО. Прирост числа положительных результатов при ПЦР дали все исследованные патогены, однако наиболее часто обнаруживался S. pneumoniae (+108 пациентов), что повысило его долю в структуре возбудителей ОСО до 78% (Таблица 9).

Таблица 9

Структура бактериальных возбудителей ОСО и результаты параллельного бактериологического и ПЦР-исследования

Возбудитель Положительная ПЦР Положительная культура Параллельное исследование (п)я

Культура + - +

n % Ii % ПЦР + + -

Всего 218 100 93 100 89 129 4

S. pneumoniae 170 78 62 67 62 108 0

S. pyogenes 28 13 19 20 19 9 0

А/. catarrhalis 23 11 10 11 10 13 0

II. inluenzae 11 5 13 14 4 7 9

Примечание:'' Знак «+». положительный результат; знак «-», отрицательный результат.

ПЦР с праймерами для S. pneumoniae, S. pyogenes и М. catarrhalis дали положительный результат у всех пациентов, у которых указанные возбудители были выявлены микробиологическим методом, а в случае отрицательного ПЦР-исследования - культуры также были отрицательны (Таблица 9). У 9 пациентов с бактериологически подтвержденным //. /н/неигое-ассоциированным ОСО результаты ПЦР оказались отрицательными. При этом у 7 пациентов с положительной ПЦР на //. inluenzae был отрицательный культуральный результат по этому возбудителю, а у 4 пациентов положительные результаты обоих методов совпали.

ЖСУ для исследования получали двумя способами: при процедуре гимпаноцентеза или после спонтанного прорыва барабанной перепонки. Сведения о способе получения ЖСУ были получены для 92% (287/311) пациентов с ОСО. Доля положительных результатов при ПЦР в материале гимпаноцентеза и при спонтанном прорыве барабанной перепонки статистически не отличались (Таблица 10). Положительные результаты культурального исследования в обоих материалах также встречались примерно с одинаковой частотой [тимианоцентез - 31% (58/185) vs спонтанный прорыв -30%) (31/102), р=0,866]. Доли возбудителей как при ПЦР-исследованин, так и при микробиологическом анализе не зависели от способа получения материала. Таким образом, способ получения ЖСУ не влиял на результаты ПЦР-детекции и культурального выявления исследованных отопатогенов.

Прием антибиотиков значимо снижал долю образцов ЖСУ с положительным культуральиым результатом, при этом существенно уменьшалась доля пациентов, у которых высевался 5. pneumoniae, а доля выявления pyogenes возростала.

Исследование при помощи ПЦР показало иные результаты. Доля пациентов с положительными результатами ПЦР на фоне приема антибиотиков и не принимавших антибиотики отличалась статистически незначимо (Таблица 10). Структура выявляемых возбудителей также не менялась (р=0,649). Следовательно, антибиотики не оказывали значимого влияния на частоту ПЦР-п о л ож и те л ы i ы х р езу л ьтато в.

Таблица 10

Влияние способа получения ЖСУ п приема антибиотиков до взятия ЖСУ на долю положительных результатов ПЦР н микробиологического исследования у пациентов с ОСО

Результат Способ получения ЖСУ Прием ант ибиотика до взят ия ЖСУ

Ти.мнапонентез Спонтанный прорыв барабанной перепонки Р Нет Да Р

п=185 п=102 п=218 п=62

Положительная ПЦР 69% 72% NS 75% 66% NS

Положительная культура 31% 30% NS 37% 18% 0.005

Примечание'. NS, незначимые различия (/) > 0,0э)

ВЫВОДЫ

1. Серологический пейзаж штаммов S. pneumoniae у детей (медиана возраста 3,5 года) с респираторными инфекциями в г. Москве, обследованных в период с марта 2009 г. но апрель 2013 г., представлен 45 различными ссротипами. Установлено, что доминировали 6 серотнпов: 19F (21,7%), 6В (12,8 %), 23F (10%), 14 (9%), 6Л (8,4 %) и 3 (7,5%), которые составляют 69,4% от всех выявленных серотнпов и серогрупп. Пневмококковая конъюгированная 13-валентная вакцина охватывает 78%) выявленных серотнпов.

2. Предложенный протокол выполнения мультиплексной ПЦР, модифицированный в соответствии с данными об актуальных серотипах S. pneumoniae, позволяет за первые три реакции типировать 90,5% штаммов пневмококка и в результате перекрывает 95%) серотигтов. Результаты серологического и молекулярного типироваиия совпадают в 99% случаев.

3. Доля полирезпетентных штаммов S. pneumoniae, циркулирующих у детей в Москве, составляет 22%. Наибольший уровень резистентности пневмококка наблюдается к трнметоприму/сульфаметоксазолу (57%), нечувствительны к пенициллину 27% штаммов, а устойчивостью к макролидам обладают 26%) штаммов пневмококка.

4. Ведущим молекулярным механизмом резистентности к макролидам у изученных штаммов оказалось наличие гена егтВ, который встречается у 54% штаммов как единственная детерминанта и у 31% — в сочетании с эффлюксом, опосредованным /77с/-геном.

5. Циркулирующие в Москве полирезистентные штаммы S. pneumoniae в основном относятся к четырем глобальным клональным комплексам: СС81, СС156, СС315, СС320.

6. Определение специфической ДНК патогенов с помощью молекулярного метода при острых средних отитах непосредственно из образца жидкости среднего уха у детей, по сравнению с микробиологическим исследованием, позволяет дополнительно выявить возбудителей у 40% пациентов. При этом доля S. pneumoniae в этиологической структуре возбудителей возрастает с 67%) до 78%.

П Р А KT И'Ч ЕС К И Е Р Е КО INI Е Н Д А Ц И И

1. Для молекулярного типирования S. pneumoniae рекомендуется использование модифицированного протокола ПЦР, который позволяет надежно определить серотип >95%) пневмококков.

2. Для обеспечения адекватной эмпирической антибактериальной терапии пневмококковых инфекций целесообразно проводить локальный мониторинг устойчивости S. pneumoniae к антибиотикам.

3. Для оценки эффективности вакцинации пневмококковой коиъюгированной вакциной и ее влияния па серологический состав популяции S. pneumoniae обосновано применение серотипированпя пневмококка.

4. С целью улучшения этиологической диагностики острого среднего огита у детей рекомендуется использовать молекулярные методы выявления и идентификации патогенов.

ПЕРСПЕ КТИ ВПЫГ. ПЛИ 1>Л ВЛЕПИ Я ДАЛ ЬН Е И Ш Е И РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1. Дальнейший мониторинг циркулирующих серогипов на фоне массовой вакцинации пневмококковыми коныогнропаннымн вакцинами.

2. Продолжение исследований, направленных на выявление резистентных штаммов пневмококка и определения их клоналыюи принадлежности.

3. Продолжение изучения роли генов ermB и те/ в формировании уровня устойчивости S. pneumoniae к макролидам.

4. Изучение других молекулярных механизмов резистентности к различным классам антибиотиков и их распространенности в популяции S. pneumoniae.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Маяпскнй, H.A. Определение капсульных серотииов пневмококка методом мультиплексной ПЦР / H.A. Маяпскпй, Н.М. Алябьева, Т.А. Гречуха, В.Г. Пнпслпс, JI.C. Намазова-Барапова // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2010. - Т. 2. - №6. - С. 6-10.

2. Алябьева, Н.М. Идентификация и молекулярное типироваиие Streptococcus pneumoniae' с помощью метода RT-PCR / Н.М. Алябьева, A.B. Лазарева, O.A. Пономаренко, II.А. Маянский, A.M. Иваненко, Т.В. Куличепко, JI.C. Намазова-Барапова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2012. - Т. 14. - № 2. - приложение I. - С. 14-15.

3. Алябьева, Н.М. Серотиповон пейзаж и антибиотикочувствительность Streptococcus pneumoniae, выделенного у детей с острым средним отитом / U.M. Алябьева, A.B. Лазарева, O.A. Пономаренко, H.A. Маянский, A.M. Иваненко, Т.В. Кулпчснко, Л.С. Намазова-Барапова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2013. - Т. 15. - № 2. -приложение 1. - С. 12.

4. Маянский, H.A. Бактериальная этиология острого среднего отита у детей до 5 лет: роль Streptococcus pneumoniae / H.A. Маянский, Н.М. Алябьева, A.M. Иваненко, O.A. Пономаренко, Л.К. Катосова, A.B. Лазарева, Т.В. Куличепко, Л.С. Намазова-Барапова // Вопросы диагностики в педиатрии. -2013. - Т. 5. - № 3. - С. 5-13.

5. Баранов, A.A. Роль Streptococcus pneumoniae в структуре бактериальных инфекций у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы в 2011-2012 гг. / A.A. Баранов, Л.С. Намазова-Барапова, H.A. Маянский, Т.В. Куличепко, Т.А. Полунина, A.B. Лазарева, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, O.A. Пономаренко, И.Е. Колтунов, A.M. Иваненко, Е.А. Дегтярёва, Н.В. Кондратенко, A.A. Корсупскнй, К.В. Константинов, Д.А. Тулупов, М.А. Лазарева // Педиатрическая фармакология. - 2013. - Т. 10. - № 5. - С. 6-12.

6. Алябьева, Н.М. Молекулярное гиппроваппс Streptococcus pneumoniae методом мультиплексной полимеразпой цепной реакции с учетом распространенности серогппов в Российской Федерации / Н.М. Алябьева, Т.А. Блинова, O.A. Пономаренко, A.B. Лазарева, Л.К. Катосова, H.A. Маянский // Вопросы современной педиатрии. - 2013. -Т. 12.-№6.-С. 30-34.

7. Kulichenko, Т. Bacterial etiology of acute otitis media in children: the role of Streptococcus pneumoniae and correlation with nasopharyngeal colonization / T. Kulichenko, A. Ivanenko. T. Polunina. N. Alyabieva, O. Ponomarenko, A. Lazareva, L. Katosova, N. Mayanskiy, L. Namazova-Baranova // ISPPD-9 Abstracts in the Pneumonia Journal. -2014. - v. 3. - P. 41.

8. Alyabyeva, N. Detection and typing of Streptococcus pneumoniae by RT-PCR in clinical samples from children with acute otitis media / N. Alyabyeva, N. Mayanskiy, O. Ponomarenko, L. Katoso\a. L. Nama/ova-Baranova/7 Clinical Microbiology and Infection. - 2012. - v. 18. - Suppl. S3. - P. 362-363.

9. Alyabyeva, N. Serotype distribution and antibiotic resistance of S. pneumoniae isolated from children with acute otitis media in Russia / N. Alyabyeva, N. Mayanskiy, O. Ponomarenko, A. Lazareva, L. Katosova, A. lvanenko, T. Kulichenko, L. Namazova-Baranova // Abstract book. ESP1D-20I2, Thessalouiki. - P. 431.

10. Mayanskiy, N. Nasopharyngeal carriage of 5. pneumoniae in children with acute bacterial infection in Russia / N. Mayanskiy, N. Alyabyeva, A. Lazareva, O. Ponomarenko, L. Katosova, A. lvanenko, T. Kulichenko, L. Namazova-Baranova // Abstract book. ESP1D-2012, Thessaloniki. - P. 448.

11. Mayanskiy, N. Serotypes and antibiotic resistance of non-invasive Streptococcus pneumoniae circulating in pediatric hospitals in Moscow, Russia / N. Mayanskiy, N. Alyabieva, O. Ponomarenko, A. Lazareva, L. Katosova, A. lvanenko, T. Kulichenko, L. Namazova-Baranova, A. Haranov // International Journal of Infectious Diseases. - 2014. - v. 20. - 1'. 58-62.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ЖСУ - жидкость среднего уха

НАД - инкотпнамндадениндипуклеотид

MJICT - мультнлокуспое снквепс-типирование

М-ПЦР - мультиплексная нолпмеразная цепная реакция

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ОСО - острый средний огит

ПКВ - пневмококковая конъюгнрованиая вакцина

ПЦР - нолпмеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - по.тимеразиая цепная реакция в реальном времени

СС - (clonal complex) клональпыи комплекс

ТМП/СМЗ - триметоприм-сульфаметоксазол