Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПАЗ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СЫРОДЕЛИЯ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПАЗ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СЫРОДЕЛИЯ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

J-Z6 о

На правах рукописи Юрий Яковлевич СВНРИДЕНКО

СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПАЗ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СЫРОДЕЛИЯ

(Специальность 03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1979

Работа выполнена во Всесоюзном ¡научно-исследователь-ском институте маслодельной и сыродельной промышленности НПО «Углич».

Научный руководитель — кандидат биологических наук А. В. Гудков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Логинова Л. Г., кандидат технических наук Хан-дак Р. Н.

Ведущее предприятие—Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт Главного управления микробиологической промышленности при СМ СССР.

Зашита состоится «

^у^хЛ^Я^ ч _ # 1979 г. в «^С» час. на заседании Специализированного совета К-120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева. Адрес: 127550, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы значительно возрос удельный вес пищевых продуктов,- вырабатываемых с добавлением ферментов или ферментных препаратов. Использование энзимов при изготовлении продуктов способствует повышению их качества, сокращает сроки производства, в ряде случаев'повышает выход готовой продукции и облегчает контроль желаемых биохимических процессов. Наряду с прочно вошедшими в практику микробными, растительными и животным» протеазами, амилазами, пектин аза ми широкое применение находят и ферменты л и политического действия. В нашей стране применение липаз в народном хозяйстве сдерживается отсутствием достаточного количества эффективных продуцентов, поскольку для каждого технологического процесса необходимо иметь липазы с определенными свойствами.

Цель исследований. Интенсификация реакций лнполиза, сопровождающаяся накоплением продуктов гидролиза молочного жира в определенных количествах и соотношениях, вызывает улучшение органолептических показателей сыров. Вполне логично, что использование в сыроделии липолнтиче-скнх энзимов с определенной жирнокислотной специфичностью позволит управлять процессом лнполиза, и, как следствие это-' го, регулировать степень выраженности вкуса и аромата сыров. В изыскании микроорганизмов-продуцентов липаз, способных отщеплять из триацилглицеринов молочного жира различные композиции жирных кнелот, а также в предварительной оценке пригодности ферментов для сыроделия и заключается цель настоящей работы.

Научная новизна. Впервые в нашей стране выделены микроорганизмы— продуценты лнпаз с целью их использования в сыроделии. Изучено влияние условий культивирования на биосинтез липолитических ферментов, исследованы свойства препаратов липаз, изучена жнрнокнелотнай специфичность и кинетика лнполиза молочных субстратов. 3 продуцента и питательная среда для их культивирования признаны .предметом изобретений. -——----?

г

I I

Практическая ценность. На основании выполненных исследовании:

— разработаны к применены в полу производственных условиях лабораторные регламенты получения ферментных препаратов липаз 3-х культур;

— показана перспективность использования липолнтиче-ских ферментных препаратов в сыроделии, заключающаяся в усилении выраженности вкуса и аромата сыров и ускорении их созревания.

Апробации. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной научно-технической конференции молодых специалистов «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии- и сыроделии» в 1978 г. (г. Углич).

Объем работы. Диссертация включает 130 страниц основного текста, 32 таблицы, 25 рисунков, список, литературы — 157 наименований, в.том числе 107 иностранных авторов н приложения.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выделения чистых культур из естественных источников местообитания применяли метод разведении (Федоров, 1975). Их чистоту проверяли мнкроскопнрованием и рассевом на плотные среды (Егоров, 1976). Поддерживали культуры на «косяках» сусло- или мясопептонного агара и хранили при низкой температуре (4—8°С). Бактериальные культуры идентифицировали по Bergeh (1974); дрожжи — по Lodder (1970); грибы по Лгх (1970) и Милько (1974). В качестве субстратов для определения лнполитической активности экзолипаз микроорганизмов и ферментных препаратов липаз применяли оливковое масло, молочный жир, елнвкн различной жирности. Эмульсию оливкового масла получали по методу, опнеанному Лобыревой (1973), эмульсию молочного жира — эмульгированием 7,5% молочного жира в 3%-ном "водном растворе гуммиарабика (Ольштын, 1972),

Липолнтическую активность определяли алкалнметриче-скнм титрованием свободных жирных кислот (Рубан, 1973).

Содержание белка — спектрофотометрически по методу Waddel (1956).

Экстракция свободных жирных кислот проводилась в соответствии с методом ДееШ, Fitz-Gerald, Wood (1975).

Метилирование и идентификация высших жирных кислот— по Берчфпльду и Сторрсу (I9G4); фракционирование— газо-жндкостной хроматографией на хроматографе «Хром-4».

Планы многофакторных экспериментов по оптимизации составов питательных сред составляли в соответствии с руководством Бродского (1976), Дубовой и Федорова (1972).

ч

Выработку костромского сыра проводили в ваннах емкостью 250 л из сборного молока по действующей технологической инструкции. Опытные и контрольные сыры в возрасте 25 суток и по достижении кондиционной зрелости подвергались орган олегггической оценке.

РЕЗУЛЬТАТЫ ^ИССЛЕДОВАНИЙ СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЭКЗОЛНПАЗ

Для решения поставленной задачи необходимо было выделить микроорганизмы, липазы которых, имеют ряд отличительных признаков, обеспечивающих пригодность продуцентов для промышленной наработки липаз, а липаз — для сыроделия. Эти признаки следующие:

1) экзогенная природа фермента; 2); отсутствие пигмента и хороший рост продуцентов на СА и МПА; 3) способность с большой скоростью гидролизовать молочный жир; 4) высокий уровень н стабильность биосинтеза липаз при многочисленных пассажах продуцентов; 5) различная жирнокнслотиая специфичность ферментов' при действии на трнглицернды молочного жира.

Выделение культур, их идентификация, эмпирический подбор среды проводились совместно, с к. б. и. Лобыревой Л. Б. под руководством проф. д. б.н.РубанЕ.Л. в ИНМИ АН. СССР.

Из различных источников (сырое и пастеризованное молоко, сыр, масло, бытовые н промышленные сточные воды) выделено 634 культуры микроорганизмов н проверена их липо-литическа я активность. Культуры выращивали на жидкой питательной среде (среда 7, табл. 1) в аэробных условиях. В качестве субстратов для определения астивности использовали эмульсин оливкового масла и молочного жира.

Проверкой активности отцентрифугнрованной культураль-ной жидкости выявлены культуры, способные к.экзогенному образованию'липолнтнческих ферментов (627 культур): Количественное измерение активности экзолнпаз на субстратах позволило отобрать наиболее:активные штаммы (более 90 культур); Хорошо. росли на СА и. МПА около 50 культур, среди которых и проводился дальнейший отбор по другим признакам.

Стабильность биоеннтеза экзолнпаз—одна изважнейших характеристик продуцентов — изучалась по способности микроорганизмов к образованию ферментов на различных средах после многочисленных лассажей; Проверялось 13 различных сред, в числе которых были как минимальные синтетические, с добавкой того или иного индуктора (среды 1—4), так и

сложные органические среды с пептоном, соевой мукой, с добавлением факторов роста (среды 5—13, табл. I).

При проведении этих опытов были сделаны несколько важных для последующей работы -наблюдений. Активность бактерий и дрожжей, удовлетворявших первым 3-м требованиям, в процессе работы резко снизилась, что, вероятно, обусловлено спонтанной диссоциацией культур с утратой активности. Как продуценты лппаз он» оказались очень нестабильными, поэтому от дальнейшей работы с ними было решено отказаться. Полную противоположность бактериальным и дрожжевым культурам представляют микроскопические грибы. Их экзофермеиты обладают ярко выраженной индуцнбельной природой, н, проявляя высокую активность, стабильно образу* ются на большинстве проверенных сред (табл. 2). Установлено также следующее. Действие индуктора не подчиняется какому-либо определенному правилу. Оно зависит не только от химического состава самого индуктора, но и от состава питательной среды, которая применяется для выращивания ли-политическн активных культур. ■

Практически не отличающиеся и очень низкие величины активностей лнпаз всех культур на применявшихся субстратах наблюдались при выращивании их на средах 1—4, Среды 2, 3, 4 отличаются от 1-й добавкой индукторов (оливковое масло, трнстеарин, сливки). В данном случае индукторы практически не оказывают никакого влиянии на биосинтез экзо-липаз. В то же время индукторы, добавленные па фоне среды более сложного состава (среды 7, 8, 10), заметно повлияли на синтез экзолнпаз (табл. 3). Здесь правомерно говорить о двойной индукции, когда первичная индукция осуществляется лнпндамн таких сложных компонентов питательной среды, как соевая мука, а вторичная—трнацилглинерннами, добавленными на фоне питательной среды. Вторичные индукторы оказывают влияние на интенсивность этого процесса, но не могут его инициировать. При этом вторичная индукция может быть как положительной, так л отрицательной (репрессия). Оливковое масло в качестве вторичного индуктора вызывает повышение лнпазной активности всех грибных культур (табл. 3). Действие внесенного трнстеарина проявляется по-разному: понижается активность на обоих субстратах у Rh. nigricans 650, G. camlitlum 599, P. roqueforti 41 на присутствие трнстеарина реагирует увеличением активности липазы. У P. roqueforti 141 наблюдается повышение активности на оливковом масле и уменьшение на сливках. Индивидуальность воздействия вторичных индукторов в зависимости от вида и штамма учитывалась при разработке лабораторного регламента культивировании продуцентов.

Для выявления микроорганизмов, липазы которых облада-

Таблнца 1

Среды для культивирования микроорганизмов

Содержание компонентов в средах (%)

Компонент питательных сред 1 ¿2 3 4 5 6 7 а 9 10 И 12 13

Соевая мука....... _ _ .— _ 2,5 _ 2,0 2,0 0,5 2,0 0,5 2,5 0,5

Пептон.......... — — — — — 1,0 — — — — — — —

Дрожжевой экстракт .... — — . — — 4,0 0,2 —, — — — 4,0 0,5 - 0,5

Раствори мин крахмал . . . — — — — — 0,2 — — — — — — —

Сахароза ......... 2,0 2,0 2,0 2,0 —" — 0,2 0,2 0,2 0,2 — — —

Мочевнна ........ 0,2 0,2 0,2 0,2 — — 0,2 0,2 0,2 0,2 -г- — —

{мадо,....... . — — — — 0,1 — — — — — 0,1 0,1 0,1

КНаР04......... .0,01 0,01 0,01 0,01 — — — 0,2 0,2 0.2 0,5 0,5 0,5

К!НР04 .......... — — — — 0.5 — — — — — — — —

Ыа^НРО,......... 0,01 0,01 0,01 0,01 —

месь.......... 0,01 0,01 0,01 0,01 —

Л^БО,.......... — — — — — — 0,1 0,1 0,1 0,1 — — —

СаСОа.......... _ — — — — — 0Я 0,5 0,5 0,5 — — —

Слнекн ..........

Трнстеарнн ........

Оливковое масло ..... . 0,5 0,5 0,5

Таблица 2

Влияние состава среды на экзолипазную активность грибов

Культурц Субстраты Липолишчсская активность на с зедах (МЛ 0,05 N КОН)

7 8 0 10 11 12 13

Geo!гichum candtdum 509 Оливковое «асло . . . 20.3 185 9,7 17,5 12,8 23.4 10,7

Сливки ....... 1 7>3 6.2 0.9 5,9 ' 0 3,6 0,7

Penieilliuiti roqucforti -J I Олисковое масло . . . 21,3 15,9 12,8 20.1 13,4 20,1 14.7

Cm вин....... 14,9 ,8,2 ■ « 14,7 8,0 1C.G 4.7

Рсл!allium roquciofti 141 Оливковое плело . . . 23.0 20,4 7,7 * 23,0 11,9 Щ 10,7

Сливки ....... 11,4 13.0 7,1 10,3 5,4

Pcnicillitim cyanco-ful- Оливкозое масло . . , 43 3,0 0,9 2,7 0,9 2,1 0,0

vum 427 ......

Сливки ...... 4,0 1,5 0,0 3,0 0 1,4

Rbizopus nirgicans 650 . Оливковое масло . . . 11,0 . 4,2 4,0 1,5 3,5 5,4

Сливки ....... 11,0 4,1 2,2 0,2 4'? 11,0 1.0

15 30 60

120 180 время, мин

240

Рис* 2. Зависимость скорости гидролиза сливок липазами микроорганизмов. 01 продолжительности реакции: ; \

Р.

—ЙК; ...

ТаблицаЗ

Влияние индукторов на биосинтез экзолнпаз микроорганизмами

Л и политическая актив*

ность на субстратах (мл 0,05 N КОН)

Культуры Индуктор

оливковое сливки

масло

G. candidum 599 , . . Контроль ..... 18,3 6.2

Оливковое масло- . . 26.8 7,3

Г. roqueforti (1 . , . . Трнстеарии .... 17,5 5,9

Контроль ,•..,. 15,9 * 8,2

Оливковое масло . . 21,3 14,9

Три стеарин . . . . 20,1 14,7

P. roqueforti Ml* , , . Контроль ..... 20.4. 13,0

Ол паковое масло . . 23,6 11,4

Тристеарин . . . . 23,0 9,5

P. cyaneo-fulvum 427 Контроль ..... 3.0 1.5

Оливкозое масло . . 4,3 4,0

Rli. nigricans 6o0 . . . Тристеарин ...... 2,7 3,6

Контроль . . .... 4,2 4.1

Оливковое масло : , , 11,6 11,0

Тристеарин .... 1,5 0,2

гот различной жирнокислотной специфичностью, проводилось сравнительное изучение активности экзолнпаз на применявшихся субстратах. В процессе селекции отбирались штаммы; отличавшиеся : различной субстратной специфичностью. Из дапных табл. 2 видно, что соотношение активностей на оливковом масле и молочном жире у культур G. candidum 599; P. roqueforti 141 и Rh.- nigricans 650 — наиболее активных продуцентов — различно. Липаза Rh. nigricans 650 при выра-шноании гриба на большей части сред гндролизует оба субстрата примерно с равной скоростью. Липаза P. roqueforti 141 расщепляет оливковое масло примерно в 2 раза быстрее, чем-сливки. Скорость гидролиза оливкового масла липазой G. candidum 599 во много раз выше,-чем сливок. Это может быть следствием различной жирнокислотной специфичности ферментов. Указанное предположение обусловило выбор 3-х вышеназванных штаммов грибов в качестве продуцентов липаз.

Наилучшей для образования экзолнпаз культурами P. roqueforti 141 и Rli. nigricans 650 оказалась среда 12, для G. candidum 599 — среда 7. С целыо повышения уровня биосинтеза экзолнпаз микроскопических грибов и, следовательно, снижения себестоимости препаратов липаз с использованием математических методов планирования экспериментов была осуществлена оптимизация количественного состава питательных сред. В результате выход экзолнпазы G. candidum повы-

7 L

шеи. в 1,5 раза, Р. гочиеГогН— в 1,7 раза, Рк писала — в 2 раза. В табл. 4 представлены данные по оптимальным для накопления липаз условиям культивирования продуцентов. Они положены в основу лабораторного регламента получения ферментных препаратов липаз, . примененного сотрудниками отдела технологической микробиологии ИНМИ АН СССР1 для наработки препаратов липаз в полупроизводственных ус-. ловиях.

> Та блица 4

Оптимальные условия для биосинтеза.* экзолнпаз микрорганизмамн

Микроорганизмы

Параметры G, candidum P. roqueforti Rh. nigricans

рН среды.......... Продолжительность культивирования. ч , . . ....... Масло-индуктор....... 7,0 80—90 оливковое , 6,0 70—80 соевое 7,0 22—26 подсолнечное *

СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ

Изучение свойств препаратов, липаз, представляющих собой лиофилнзнрованнуго культуральную жидкость,, показало, что липазы микроскопических грибов —это кислые или слабокислые ферменты, стабильные, в широком диапазоне рН (табл. 5).,

У Rh. nigricans на молочном жире наблюдается 2 пика активности: при рН 4,0 и 7,0 — 8,0. При этом щелочная липаза обладает узкой зоной рН-стзбнльностн (4,5—6,5); Самую высокую активность все липазы проявляют при 45°С на обоих^ субстратах (липаза О. candidum на оливковом масле — при. 37°), Наибольшей термостабильностыо отличаются липазы Rh. nigricans, наименьшей — липаза Р, roqueforti. Удельная акпгвность препаратов лнпаз измерялась при оптимальных для каждого фермента условиях и оказалась на молочном жире примерно равной. На оливковом масле в несколько раз: выше удельная активность липазы G. candidum.

Изучение состава жирных кислот, отщепляемых препаратами липаз из трнглицерндов молочного жира, подтвердило: предположение о различной жирнокислотной специфичности ферментов отобранных нами продуцентов.

Липаза G. candidum проявляет явно-выраженную специфичность к цнс-9-ненасыщениым кислотам (табл. 6). Их доля среди высвобожденных жирных кислот, выше, чем содержание в исходном молочном жире, в -

Таблица 5

Свойства препаратов липаз "

Свойства G. candí dum Р, roqueforti Ph. nigricans

оливковое масло молочный ЖИр оливковое масло молочный жир оливковое масло 1 молочный жир

Оптимум pH......... 7,0-8,0 0,0 6,5 6,5 5,0 4,0; 7,0-8,0

pH-стабильность....... 4,0-10,0 4,0-10,0 4,0-10.0 3.0-10,0 4,5—6,5 3^-9,0;

4,5-6,5

Температурный оптимум, °С . . 37 45 45 . 45 45 45

Термостабильность, "С..... 3-37 3-55 3—i5 3^37 3-55 3-55

Удельная активность. -

/ мл 0,05 N КОН Л 6,15 1,55 2,0 1,30 2,40 1,40

\ мг белка /

Т а б л л ц з 6

Жирнокнслотвля специфичность липаз.

Свободные жирные. Содержание кислот

(% от общего количества)

кислоты (код) G. candidum P. roqueforti Rh. nigricans молочный жнр

6:0 __ 3,20 0,62 1,40

7:0 — — — следы

8:0 _ 0,98 1,77 1,20

9:0 — 4,40 — следы

10:0 2,62 5,39 3,10 2,36

11 :0 _ — 0,84. 0.19

■ 12:0 3.30 3,92 3,70 2,90

13:0 _ — 0.15 0,05

изо-14 :0 1,20 . — 0,23 0,24

14:0 4,70- 11,02 10.80 11,00

14: 1 1.75 2,69 1,62 0,84

14:2 _ 1,22 — следи

15:0 2.60 1.47 1,62 1,08

, 16:0 12.90 16.17 31,00 28.48

16: 1 0,70 0,98 3,60 1,13 .

17:0 Внутренний стандарт

18:0 15,50 11,52 8,04 13,40

13:1 45.00 25.00 26,80 30,91

19:0 — 4,66 — следы

18:2.. 9,75 3,18 3.50 2,64

18:3 _ 4,16 1,15 0.68

20:0 — — 1,40 0,50

Эфирные связи короткоцепочечных кислот липаза О- сап-с11(1ит гидролпзует значительно слабее: жирных,кислот строения С6—Сю среди высвободившихся меньше, чем в исходном молочном жире (табл. 7).

Та бли на 7

Групповая специфичность липаз

Группы жирных кислот % от общего количества свободных жирных кислот Иитакт-ный жир i

G. candi dum P. roquefort! RI). nigricans

Короткоиепочечные кислоты (С4— мо)........... Ненасыщенные кислоты . . . . 2,62 62,80 13,97 37,73 5,49 36,64 • 4,96 36,20

Липаза Р. гочиек)гН, в отличие от липазы О. сапсН<1шп, с большей скоростью высвобождает короткоиепочечные жнр-" ные кислоты. Их содержание во фракции свободных, жирных

л

Ен

О ■ О

м т

кса

6Н о

дацу

МО О ••

2

§ ■

4

«

о п

€

I

20 30 40 жирность.сливик, % Рис; Г. Влияние концентрации сзбстра?а на скорость гидролиза молочного жира,сливок липазами:

—С. <их^си.сАл*.т

' Р; у

кислот почти в 3 раза выше, чем в триглицерндах нелиполизи-рованного жира (табл. 6, 7). Липаза Rh. nigricans гидролизует эфирные связи практически всех выявленных в молочном жире кислот и примерно е тех же соотношениях, в^каких.они содержатся в молочном ж)<ре.

Полученные результаты свидетельствуют о видовой специфичности липаз. Знание жнрнокислотнои специфичности /имеет большое практическое значение. При использовании ли-■политических энзимов" в производстве сыров- можно предсказать и тем самым: регулировать состав свободных- жирных кислот—непосредственных вкусовых ингредиентов сыров.

В дальнейшем проводилась работа по изучению кинетики липолиза сливок с целью выявления: оптимальных режимов, Липолиз сливок может проводиться в оптимальных для-дейст-вия фермента.уеловиях,что позволит, с наименьшими затрата-ми:получить необходимую степень липолизированности субстрата: для-последующего, использования^. производстве пи-щевых.продуктоп. .

Зависимость, скорости' гидролиза* сливок.от: концентрации субстрата - (при оптимальных концентрациях ферментов) показана,: на рис. 1. Обсчет кривых, полученных для липаз Р.: roquefortj и Rh; nigricans, позволяет определить концентрации* субстрата, обеспечиваюшиехостояние насыщения ферментов. При действии липазы P. roquelorti максимальная скорость гидролиза наблюдается при жирности сливок не менее 32.3%, при действии липазы Rh. nigricans —11,2%. Зависимость скорости накопления свободных жирных кислот липазой G. candidum от концентрацнн субстрата носнт не гиперболический,, а сигмондный характер.: Максимальная скорость гидролиза наблюдается при жирности сливок: 60%. такая концентрация субстрата ц выбрана в- качестве оптимальной, обеспечивающей в условиях опыта максимальную скорость ферментативной реакшш. ■

Динамика гидролиза сливок при оптимальных концентрациях ферментов и субстрата показана на рис. 2; Для,всех кривых характерно наличие двухфазности в накоплении продуктов гидролиза, 2-я фаза начинается некоторое время спустя после начала реакции (30—60 мин). Переход от 1-й'фазы ко 2-й (лаг-фаза)- длится'5—40 мин. При подборе оптимальной степени лнполизированиости субстрата следует учитывать наличие обнаруженной лаг-фазы. Например, при действии препарата-. липазы P. .roqueforti количество свободных: жирных: кислот через 2 часа после начала' реакции будет оставаться примерно на том же уровне, которого оно достигло.в течение первого часа липолиза. Втех случаях, когда необходима высокая: степень, липолиза .без определенной, жирнокислотной специфичности, лучше - всего использовать липазу. Rh. nigri-

П.

Таблица 8

Оргаколептнческая оценка сыров с липазой в. сап<Шит

Возраст Варианты выработок Вкус н запах Консистенция Рисунок Общий

сыров, дней характеристика балл характеристика балл характеристика балл балл

Контроль Незрелый, пустой, кисловатый ....... — Твердая, резин иста я , . 22 Неравномерный 7 —

25 Опит 1 Кисломолочный . . . . 38 Удовлетворительная . . 23 Отличный 10 91

Опыт 2 Кисломолочный, слабо-выраженный , , . . 38 Удовлетворительная . . 23 Неравномерный 8 89

Контроль Кисломолочный, слабо-выраженный , . . , 38 Хорошая . '..... 24 Неравномерный 8 90

45, Опыт 1 Кисломолочный, слабо-выраженный , . . . 39 Отличная ...... 25 Неравномерный 9 93

Опыт 2 Кисломолочный . . . , 38 Хорошая ...... 24 Неравномерный 9 91

cans, поскольку она обладает более пьгеокнм сродством к данному субстрату н имеет наименьшую по продолжительности лаг-фазу.

ВЛИЯНИЕ ЛИПАЗ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ СОЗРЕВАНИЯ И КАЧЕСТВО КОСТРОМСКОГО СЫРА

• При выработке костромского сыра нспытывались ферментные препараты липаз G. candidum и P. roqueforti. Количества препаратов подбирались эмпирически и составляли для опытных вариантов сыров с липазой G. camlidum 20 и 40 г, с липазой P. roqueforti 40 и 60 г. В опытные ванны растворы ферментов вносили после пастеризации и охлаждения молока. С каждым препаратом липазы вырабатывалось 3 варианта сыров: 1-й — контрольный, 2-й и 3-й — опытные, отличающиеся количеством внесенного фермента.

В сравнении с контрольными опытные сыры с липазой G. candidum созревали быстрее (табл. 8). Уже в 25-дневном возрасте они были признаны кондиционно зрелыми и оценивались высшим сортом. При одинаковой оценке за вкус и консистенцию опытные сыры отличались между собой лишь по характеру рисунка. В 45-дневном возрасте произошла нивелировка в оргаиолсптических показателях опытных и контрольных сыров. Вместе с тем опытные сыры 1-го варианта имели более выраженный вкус и отличную консистенцию.

В целом добавление липазы G. candidum способствовало ускорению созревания сыра, сопровождавшемуся улучшением вкуса и консистенции опытных сыров.

Различия в свойствах препаратов липаз G. candidum и P. roqueforti нашлн отражение и в специфике воздействия на органолептнческие показатели сыров. 25-дневные сыры, выработанные с липазой P. roqueforti, характеризовались, независимо от доз препаратов, удовлетворительным, слабовыра-женным вкусом (38 баллов), удовлетворительной консистенцией и слепым рисунком и незначительно отличались от контрольных (табл. 9). В 45-дневном возрасте при удовлетворительной оценке контрольных сыров опытные сыры обладали более выраженным вкусом и ароматом. Особенно наглядно позитивное воздействие липаз на органолептнческие свойства проявились в опытных сырах 1-го варианта, характеризовавшихся хорошим вкусом и консистенцией.

Влияние липазы P. roqueforti выразилось в усилении выраженности вкуса сыра, улучшении консистенции, мало повлияв па продолжительность процесса созревания.

Результаты проведенных экспериментальных выработок свидетельствуют о перспективности данного способа регулирования лнполитнческнх процессов в сырах, позволяющего ока-

Таблица У

Органолептическаа оценка сыров с липамй Р. roquefortt

Возраст Вариан- Вкус и запах Консистенция Рисунок Общий

си роз, дней ты выработок характеристика балл * характеристика | балл характеристика балл балл

25 Контроль Слабая горечь, незрелый, кисловатый . . , . — Твердая, резнинстая . 22 Степой 7 —

Опыт 1 Удовлетворительный, слабовираженшй . . 33 Удовлетворительная , . 23 Слепой 7 88

Опыт 2 Уд о влет вор и тел и i и Л, слабой upa жени и н . , 38 Удовлетворительная , . 23 Cieno Л 7 88

45 Контроль Уд о вл ет в ор нтел ьн и й, слабовираженшй . . 38 Хорошая ...... 24 Неравномерный 8 90

Опит 1 Хороший вкус, слабови* раженный аромат . . 40 Отличная...... 25 Неравномерный 8 93

Опыт 2 Удовлетворительный, ела боа ы раженный • • ■33 Удовлетвори тельная , 23 Неравномерный 8 90

зьшать влияние как на выраженность вкуса и аромата сыров, так н на продолжительность их созревания.

Выводы

1. На основании исследования лнполнтической активности выделенных из природных источников 654'культур микроорганизмов отобраны 3 штамма микроскопических грибон, стабильно образующих высокоактивные экзолппазм {Gcolri-chum candidum Link BKMF-2017,' Pénicillium roqueforti Thom BKMF-2019, Rlnzopus nigricans Ehrenb BKMF-2018).

2- Разработаны лабораторные-регламенты* получения препаратов липаз, основанные на оптимальных для биосинтеза липаз условиях культивирования (состав питательной среды, , ее рН, продолжительность культивирования, природа масла-нндуктора) продуцентов. Указанные регламенты применены в полу производственных условиях для наработки опытных образцов препаратов липаз,

3. Установлено, что липазы штампов микроскопических грибов представляют собой кислые или слабокислые ферменты, активно расщепляющие молочный жир н оливковое масло в широком диапазоне рН (3,0—10,0). Наибольшая скорость гидролиза субстратов наблюдается при 37—45°. Различия в удельной активности препаратов липаз на молочном жире незначительны.

4. Определена специфичность липаз при гидролизе молочного жнра. Показано, что лнпаза Geotrichum candidum Link BKMF-2017 специфична к цис-9-ненасыщснным кислотам; липаза Pénicillium roqueforti Thom BKMF-2019—к жирным кислотам с короткой углеродной цепыо (С6—Сю); липаза Rltizopus nifïrïcans Ehrenb BKMF-2018 неспеннфична к длине углеродной цепи и степени насыщенности кислот молочного жира.

5. Выявлены оптимальные условия Для линолнза елниок препаратами липаз (концентрации ферментов, субстрата, продолжительность реакции). Установлено наличие двухфазностн в накоплении продуктов гидролиза молочного жира сливок.

6. Показана перспективность использования лпполитнче-ских энзимов в сыроделии, заключашаяся в усилении выраженности вкуса и аромата сыров с липазой P. roqueforti и ускорении созревания продуктов с лнпазой G. candidum.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы

I. Штамм гриба Geotrichum candidum Link BKMF-2017— продуцент лнлазы для сыроделия. Авторское свидетельство jVs 617473, в соавторстве.

2. Штамм гриба Pénicillium roquefort* Thom BKMF-2019— продуцент липазы для сыроделия. Авторское свидетельство № 608835, в соавторстве.

3. Штамм гриба Rhizopus nigricans Ehrenb BKMF-2018— продуцент липазы для сыроделия. Авторское свидетельство № 608836,в соавторстве.

4. Питательная среда для культивирования продуцентов ли политических ферментов. Заявка на изобретение № 255008/28—13/150097, полож. решение от 15.12. 1978, в соавторстве.

5. Лнполнтическая активность микроорганизмов, выделенных из различных источников. Прикл. бкох. и микробнол., 1978, 4, 499—503, в соавторстве.

6. Влияние состава среды на биосинтез и свойства экзолн-паз микроорганизмов. Прикл. биох. и. микробиол., 1978, 5, 677—681,в соавторстве.

7. Специфичность липаз микроскопических грибов на молочном жнре. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции «Вклад молодых специалистов в повышение качества и эффективности производства в маслоделии н сыроделии». Углич, 1978, 116—117.

Л 67538 13/1II—7Э г. Объем I п. л. Закал 406. Тираж 100

Типографии Московской с.-х. академик им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., -14