Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сайт-направленная реконструкция ДНК. Изучение структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе из Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сайт-направленная реконструкция ДНК. Изучение структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе из Escherichia coli"

Г "

од

2 к /ГООдаРСТВЕННЬЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ ' J " ' Г.' ;-'и СЕЛЕКЦИИ БРОМЬШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

СИПРАШВИЛИ ЗУРАВ ЗУРАБОВЙЧ

САЙТ-НАПРАВЛЕННАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ ДНК. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ В УРИДИНШЯОРИЛАЗЕ ИЗ ESCHERICHIA COLI.

(03.00.03 - Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории биоорганической химии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель: кандидат химических наук,

заведующий лабораторией биоорганической химии В.П.Вейко

Официальные оппоненты: доктор, химических,- наук Ю.Ф.Дрыгин

кандидат биологических наук М.М.Вустин

Ведущее учреждение - Институт молекулярной биологии РАН.

Защита диссертации состоится 1 ноября 1994г. в _ часов на

заседании Специализированного совета Д 098.12.01. при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, I Дорожный проезд, дом I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНШгенетика.

Автореферат разослан_сентября 1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

-Лктуаяызсеть теш дкссерггцкл. Сайт-направленный муктенез яв-няется одним из наиболее эффективных методов введения направленных замен в последовательность ДНК при реконструкции генетического материала, а такм получения белков с направленными изменениями в амшокксдат'юй последовательности. Разработка новых и оптимизация /же существующих методов мутагенеза позволяет более эффективно проводить-реконструкцию ДЬ'К и получать информацию о стру^стуряо-фушщи-эпальных отношениях в белках.

Исследование струстурно-функционажьных отвсаеких в уридинфос-¡жрилазе позволяет выявить участraí белковой глобулы, определяющие ¡ззриентативяую акткзчостъ в этом ферменте. Эти данные, кроме фундаментальных- знаний о1 пршщплаг функционирования урцдавфсхйоршазы, зсзволяют.. целенаправленно создавать соединения, -ннгЕбирувдие актив-гость этого белка. Последнее особенно актуально в связи с резким лзелшчеяием уровня биосинтеза уридквфэсфорилазн в расовых клетках. Г.о. понимание принципов функционирования уридинфосфорилазы ведет к :оздашга .высокоэффективных химиотерапевтических агентов для лечения онкологических заболеваний. .

Сказанное выпе и определяет актуальность теш исследования.

.Цггь рзбши. Целью работы. являлась оптимизация сайт-направленного мутагенеза ДНК с применением полимеразкой цепной реакции и исследование с помощью .предложенных методов структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе.- ферменте катаболизма нуклеозк-5св в E.coli.

• Еаучязя пазкзва работы. При проведении-исследования предложены ноше подходы к сайт-направленной реконструкции ДНК, позволяющие доводить протяженные'изменения в первичной аминокислотной последовательности белков. Отработана методика введения точечных замен в аминокислотной последовательности белков с применением полимеразной' депной реакции. С использованием этих- подходов существенно упроща-этся поиск функционально-вккных фрагментов и отдельных аминокислотных. остатков в белковой молекуле.

Впервые применено сочетание, введения спонтанных мутаций в состав структурной -части гена .уридинфосфорилазы (обработка ДНК бисуль-¡jjítom натрия..in vitro) с доследующим-.отбором мутантных форм фермента in vivo (выращивание культуры влрисутствии 5-фтор-2*-дезоксиу-эддина). Показано, что использование данного подхода в сочетании с >-залимеразной. цепной реакцией позволяет эффективно .изучить роль отдельных аминокислотных остатков в функционировании белка.

Создан экспрэссиошшй вектор, в составе которого клонировал гибридный ген тиыидинфосфорилазы E.coli под контролем промоторной области уридинфосфорилазы из E.coli. Показано, что денная конструкция обеспечивает высокий уровень (до 48% от общеклеточных белков) экспрессии гибридного гена в Е. coli.

Сконструирован рекомбинантный экспрессионный вектор, содержа- . щий синтетический ген эглина С - ингибитора протеинаь. Показано, . что созданная конструкция обеспечивает высокий уровень биосинтеза - • . белка в условиях- гетерологичной экспрессии. Получен штамм-продуцент соответствующего белка, позволяющий-нарабатывать не'менее 0,4 г/л Эглина С. Сконструированный штамм может использоваться для наработки препаративных количеств.полипептида, имеющего высокий терапевтически эффект при лечении воспалительных процессов.

Получении изучен ряд мутантных форм уридинфосфорилазы из Е. coll. Показано, что в белке отсутствуют как внутри-, так к межмолекулярные дисульфидные связи. Выявлена определяющая роль Cysl36 з Формировании белковой глобулы и возможное его участие в образовании активного центра фермента. Исследована функциональная роль остатков гистидинов в проявлении белком ферментативной активности. Показано, что только Н122 участвует в поддержании (формировании) активного центра фермента. Показано, что участок Р61-Р72 выполняет важную 'функциональную роль в ферменте, участвуя в связывании-ионов фосфа- -та. Показано, что N- и С-концевые фрагменты уридинфосфорилазы играют, важную роль в формировании активной четвертичной структуры фермента.

Прзхшческая ценность работа. Создан экспрессионный вектор, обеспечивающий высокоэффективную траскрипцию и трансляцию генов. На основе вектора сконструирован штамм-продуцент тимидинфосфорилазы из Е. coli, обеспечивашяй экспрессию целевого фермента до 0,8 г на литр культуральной вдкости. Создание- штамма-продуцента позволяет выделять препаративные количества белка и использовать его для ферментативного синтеза производных дезоксипирьщдинов, широко'применя-. тшцихся в химиотерапии онкологических заболеваний.

Создан шта^м-продуцент высокоспецифического ингибитора протеи-наз - Зглин С, обеспечивающего уровень биосинтеза белка не менее 0,4 г/л культуральной згадкости. -

С использованием полимеразной цепной реакции разработаны новые подходы к сайт-направленной реконструкции ДНК, позволяющие существенно упростить получение как точечных, так и протяженных му-

таций в составе белков.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов,и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, еызодов и списка -литературы. Объем диссертации составляет 139 страниц основного текста, а такке 26 рисунков и 2 таблиц.

Апрпбгщкя ргбсти. Материал« исследования, на тему диссертации опублцлюваяы в 4 статьях v. представлены на IV"конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии" r.ilyssiEo 1994г., а такие на семинарах секции биоивкенерии белков и нуклеиновых кислот Учен ого совета ГссШИгенетика.

Cikcs'.i сскр^ажЛ. Использованы международные однобуквенные трехбуквенные латышские. сокращения названий аминокислот, символ "d" в формулах дезоксирибоолигонукпеотидов опущен, UDP - уридинфосфори-лаза, DeoA - тимидкнфосфорилава, CytR белок-репрессор, CRP - белок-активатор катаболизма, сАМР - циклический 3'-5'-АМР, PCR - по-лииеразная цепная реакция, PL - полилинкерная область, ss - одноце-почечнач.ДНК^йз - двуцепочечнач ДНК, н.п. -.нуклеоткдная пара, w.'t. - дикий тип, FUDR - 5-фтор-2'-дезоксиуридин, PCR - полимераз- • ная цепная реакция.

''ЛТЕК1ДЛУ И 1ЛГГ0ДЫ.

"Вактергага'иыэ итаммн и шизки^а.' В работе использовали бакте- " риалызые штаммы E.coll К-12: АМ273 F' (thi thy Ämet-udp AdeoA), C600* F'Cthi thr leu Дрго-lac Ämet-udp гесА ), любезио предоставленные А.С.Мироновым (Гос.НШгенетикя), и С600 (w.t.), полученный из музея Гос.НЖгенетика. В работе использовали следующие плазмиды: сконструированную ранее плазмиду рШ77 (Брикун И.А. и др., 1989), содержащую ген udp, и pUC18 из коллекщш музея Гос. НШгенетика.

Препарата ®ериеетш. В работе использовали зндонуклеазы рестрикции SacI, BamHI, Sal6I фирмы, "Biolabs"(США), Т4-ДНК-лигазу и Т4-полинуклеотидкиназу фирмы "Amersham"(Англия), РНКазу А - "Sigma" (США), модифицированную Т7-полшеразу и Taq-полимеразу производства НПО "Ферментас"(Литва).

Оштез ш:1яч5дгзотекрз:бануша«пздав проводили в' лаборатории би-ооргаяической химии Гос.НИИгенетика твердофазным фосфоамидитным методом (McBrlde L.J., Caruthers М.Н., 1983). Оптимизацию структуры олигонуклеотидных праймеров и анализ первичной последовательности

фрагментов ДНК проводили с использованием пакета программ "DNA-sun", разработанного в лаборатории математического моделирования биологических процессов (А.А.Миронов, Гос.НИИгенетика).

Ашшфкацня ДНК. Полимеразную цепную реакцию (PCR) проводили с.использованием набора "Амплификация"(НПО "Ферментас", Литва) на приборе РНС-3 "Techne"(Англия).

Скрининг рекоибннантннг клонов проводили при помощи PCR, используя реверсивный (CAGGAAACAGCTATGAC) и универсальный (БТААААСБ-ACSGCCAGT) праймеры (Gussov et al., 1989).

Сайг-направленный мутагенез для конструирования мутантных форм уридинфосфорилазы, проводили с использованием.PCR.

Периичпун иосдэдпватеха¡¡ость gffiC определяли по методу Сзнгера (Sanger F., 1977) с использованием набора "Сиквенс II"(ШО "Ферментас" , Литва).

Фэраентатаюзу» активность тимидинфосфорилазы и уридинфосфорилазы определяли согласно (Schwartz М., 1971, Leer J. С. et al., 1977). Уровень накопления эглина С в клетках E.coll тестировали согласно (Fink Е. et al., 1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЯ

Наличие в клетках E.cöli 'ферментативной системы катаболизма-нуклеозидов, а также белков, осуществляющих транспорт нуклеозидов из окружающей среды, позволяет бактериям использовать нуклеозиды в качестве единственного источника углерода и азота. Центральной реакцией метаболизма нуклеозидов в E.coll является расщепление ö-N-гликозилной связи нуклеозида с участием соответствующей нуклео-зидфосфорилазы и освобождение пуринового или пиримидинового основания и сахаро-фосфатного остатка (рибозо-, или дезоксирибозо-1-фос-фата), которые, после соответствующих превращений, являются источником углерода.для клеток E.coll.

Все гены, ответственные за биосинтез ферментов катаболизма нуклеозидов; идентифицированы и охарактеризованы. Показано, что четыре гена - deoC, deoA, deoB и deoD, кодирующее ферменты дезоксири-боальдсшазу, тиьшдинфосфорилазу, фосфопентомутазу и пуриннуклеозид-фосфорилазу». соответственно, картируются в составе единого dea-crie-рана, а гены, ответственные за синтез других ферментов катаболизма нуклеозидов (уридинфосфорилазы udp, цитидиндезамйназы cdd, адено-зиндезамиЕазы add), а такие гены , кодирувдие белки транспортной

системы нуклеозидов nupC, nupG и tsx распределены по всеЛ хромосоме E.coli.

Множественная регуляция генов катаболизма нуклеозкгсл с участием бэлков-репрессоров (CytR, DeoH) и активирующего комплекса cAMP-CRP, a такае катаболитчувствительность промоторного участка этих гэнов, позволяет осуществлять эффективный биосинтез ферментов катаболизма нуклеозидов.

Одно из центральных мест среди ферментативной системы катаболизма нуклеозидов зашагает урвдивфосфорялгза- (UDF). В литературе откечено, что в раковых клетках млекопитающих наблюдается резкое увеличение уровня биосинтеза UDP. Знание структурно-функциональной организации этого фермента создает предпосылки при разработке хими-отералевтическпх врэпаргтов^ингибиторов, требующихся дг: подавления пролиферации раковых клеток человека.

Наиболее рациональным методом в изучении структурно-фушщио-пальных отношений в белках, при отсутствии кристаллографических данных по третичной структуре, является сайт-направлений мутагенез. Среди существующих на сегодняшний день методов изменения генетического материала особую популярность приобретает использование псиимерззной цепной реакции (PCR), позволяющей не толыга веодить в ДНК точечные замены, но и реконструировать нуклеотядну» последовательность в целом. Именно поэтому в работе, направленно:"! на изучение структурно-функциональных отношений в UDP,из-E.coli, был избран данный метод реконструкции ДНК.

1. Конструирование зйспрессвонкаго вектора р-ЙШР и получение штата E.coli, обоспечяягячзго тжокзй? уровень С'зхзгнтеза урадга;$ос$орихззи.

Ранее ген udp был клонирован в составе гибридной шазмиды pUD7 I обнаружен высокий уровень экспрессии уркдинфосфорклззы в клетках î.coli. Плазмида рГО? содержала фрагмент ДНК, размером 3200 п.н., :остояции из гена udp (921 п.н.) и участка хромосомы E.coli (2279~ [.н. ), локализованного в дистальной области данного гена. Предпола-алось, что наличие С-концевого фланкирования хромосомалышм участ-ом гена udp, стабилизирует структуру гена в составе мультикопийно-о вектора, а также способствует обеспечению высокого уровня био-интеза уридинфосфорилазы в бактериальных клетках. Для выяснения оли данного участка ДНК в функционировании гена udp, ш провели

. - б -

субклонирование udp с гибридной плазмвды pUD7 на мультикопийный вектор pUCia (рис.1).

На первом этапе проводили амплификацию регуляторной и структурной частей гена udp при помощи олигонуклеотидов 1-4 (1.TTTTGAGC-TCCTGCAGAAT6AAAQ, 2.TTTTK3ATCCCTCCTCTGTEAATC, 3. TTTTSSATCCATBTCCAA-STCTG, 4.TTTT6TCGACTTAJAGCAGACG), позволяющих ввести дополнительные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции в. дистальной и проксимальной области гена, а также непосредственно между промотор-операторным участком и тршшетным кодоном старта трансляции уридинфосфорилазы. Таким образом, были получены два фрагмента ДНК: регуляторной области гена udp размером 169 п.н. (PUap. рис.1), фланкированный сайтами эндонуклеаз рестрикции SacI и BamHI и структурной области udp (762 п.н., Sudp), ограниченный сайтами BamHI и SalGI. Фрагмент ДНК, содержащий регуляторную область гена udp, гидролизовали соответствующими эндонуклеаз ами рестрикции и клонировали в составе плазмиды pUC18. Сконструированная плазмида получила название pUUDPP. Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК, содержащего структурную область гена udp под контролем регуляторной области на плазмиде pUUDPP, позволило получить плазмиду pUUDP, несущую в своем составе полноразмерный ген уридинфосфорилазы.

Таким образом, были сконструированы два мультикопийных вектора, содержащих регуляторную область гена udp (pÜUDPP) и полноразмерный ген уридшфосфорилазы (pUUDP).

Плазкидой pUUDP трансформировали штамм E.coll С600*, несущий на хромосоме протяженную делецию, захватывающую ген metE и udp. Уровень биосинтеза уридинфосфорилазы анализировали денатурирующим ПААГ-электрсфоргзом (рис.2). Анализ белкового профиля штамма С600*, содержащего мультикопийную плазмиду pUUDP выявил высокий уровень•биосинтеза UDP. На основе измерения удельной активности уридинфосфорилазы в бесклеточном экстракте данного штамма было определено, что количество уридинфосфорилазы в клетке сотавляет 48% от суммарных общеклеточных белков. Это соответствует 0,4 г фермента на 1 л культуральной жидкости.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов получена новая' рекокбинантная длазмида, обеспечивающая высокий уровень биосинтеза уридинфосфорилазы в клетках E.coli. Показано, что фрагмент ДНК (2250 п.н.). фланкирующий дистальную область гена udp не участвует в стабилизации гена, так же как и не влияет на экспрессию гена уридинфосфорилазы. Высокий уровень биосинтеза данного белка может

- ? -

.1. Схема конструирования рекомбинантшх зкспрессионных векторов рШВРР и pUUDP,

Рис.2. Электрофоретическое разделение белков общего 'лизата клеток E.coli: 1.-белки-маркеры (14,4, 20,1, 30,0, 43,0, 67,0, 94,0 кДа). 2.-С600*. 3.-С600* (pUUDP).

У

быть вызвав особенностью катаболитчувствительного промотор-операторного участка регулаторной области гена udp.

2. Евяетругтронгякэ окслресагоннсго вектора pUTFP и получение итаика Е. coli, сбсспс'^кс;г'цого уровень Ьястсггсза

к^ЯВДфосфарнлзсц.

Для проверки вышевысказанного предположения был проведен ряд экспериментов, по конструированию экспрессконных векторов на основе мультакопмйной плазмигы - pUUDPP, позволяющих исследовать эффективность биосинтеза других белкоз под контролем регуляторнод области гена udp.

Первоначально в качестве такого объекта бш избран ген тими-динфосфорилазы (deoA) из E.coli, регуляция экспрессии которого от-лкчазтся от регудяшш экспрессии гена уридизфосфсрилазы участием дополнительного, помико CytR, белка-репрессора DeoR. Создание гибридного гена (структурная область гена deoA под контролем регуля-торкои области гена udp) позволяло исследовать роль Puä> в эффективной транскрипции и трансляции тиыидкнфосфорилазы. • ■

Стратегию конструирования зкшрессиоякого вектора, содержащего ген тшидинфосфорклазы, строили на основе прямой амшгкйнкации структурной области гена deoA с хромосомы штамма С600 (w.t.) непосредственно с бактериальных клеток (озшгонуклеотады 5.ТГГГБ!ЗАТССАТ-GTTGTTTCTCßC- и 6.T7TTGTCGACTTATTCGCTGAT) / ОлиГонуклеотид 5'компле-' ■ ментареп N-концевой области структурной части гена deoA и несет в своем составе стартовый кодон трансляции АТ6, а также фланкирован сайтом эндонуклеазы рестрикции BamHl. Олигонуклеотид 6 комплементарен дистальной области гена deoA и вносит дополнительный сайт реет- . -рикции SalGl. -

В результате амплификации был получен фрагмент ДНК длиной 1345 п.н., содержащий структурную область гена deoA и фланкированный сайтами рестрикции BamHl и SalGl, который клонировали в составе рекомбкнантной плазмлды pUUDPP. Сконструированная плазмида получила название-pUTPP (рис.з).

Плазмидой рШРР трансформировали штамм E.coli АМ273 и уровень биосинтеза DeoA анализировали с помощью ПААГ (рис.4). Количественное содержание тимидинфосфорилазы, определенное сканированием поли-акриламидного геля на денситометре "LKB 2202" (Швеция), составило 51Z от суммарных белков. Исходя уя литературных данных об удельной

Рис.3. Схема конструирования рекомбинантного экспресеионного векто-• pa pUTPP.

3 А 5

.. г

isr

6

iCD

jO

n i.

Рис.4. Электрофоретическое разделение белков общего лизата клеток E.coll: 1,7.-белки-маркеры (14,4, 20,1, 30,0, 43,0, 67,0, 94,0 кДа).. 2-5.-АМ273 (pUTPP, 2.-5мкл, З.-Юмкл, 4.-40 мкл, 5.-50мкл, 6.-АМ273.

- и -

активности фермента и измерения количества общеклеточных белков, установили, что тямидинфосфоридаза составила 49Z от суммарных об-щеклеточннх белков. Это коррелирует с данными денситометрии и соответствует 0,6 г фермента на 1 л культуракьной жидкости.

Следовательно, в результате проведенной работы был сконструирован зкспрессионный вектор pUTPP, обеспечивающий высокий уровень биосинтеза тимидинфосфорилазы.

Таким образом, становится очевидным, что регуляторная область гена udp обеспечивает эффективную экспрессию "родного" гена (ури-динфосфорилгза), а такке гибридного, - содержащего тимидинфосфори-¿.азу. Однако, интерес представляло изучение экспрессии чужеродного для бактериальных клеток гена под коптролем промотор-операторной области уридинфосфорилазы, что могло бы служить референс-системой в исследовании роли регуляторнон области гена udp в аффективном биосинтезе данных белков. В качестве репортерного гена, позволявшего провести исследование такого рода, был избран химически синтезированный ген эглнна С - ингибитора протеинаа.

3. зяспрэсжккага вектора pUESIS и пслучегмэ

вхгкна E.coli, сбэспзчпзагззго вксоккЯ уровень бкосшггега ~рс'?::г".;аз - sr^rsa С. "

Зглшш В а С (70-звенше полипептиды, отличающиеся только одной .аминокислотной заменой K35Y). - белковые ингибиторы протеиназ, выделенные из пиявок Hirudo medicinal is. Они эффективно кнгибируют а-химотрипсик, хиказу,' субтилизнн, протеиназы нейтрофилов (зластаза и катепсин G). По своим ингнбирущим свойствам эглин С, первичная аминокислотная последовательность которого приведена нике, аналогичен эндогенным ингибиторам протеинаа человека - «2-мгкроглобулину и ой-антитрилскну, слугззли в иорме для защиты нижних дыхательных путей от протеолктического действия зластазы из нейтрофилов.

1 10 20 30 40 50 60

TEFesaKSFPEYVGKTVDQAREYFTLHYPQyDVYFLPEGSPYMLmRVRVmTCT 70

NYVNHVPHVG ■

Ген эглина С химически синтезировали в лаборатории биоорганической химии (Гос.НИйгенетика). Структурную часть синтетического

гена фланкировали сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и Hindi Ii, введение которых позволяло проводить конструирование целевого зкспрессионного вектора на основе мультикопийной плазмиды pWDPP. Созданная рекомбинантная плазмида получила название plfEG18 (рис.5). Отбор рекшбивантных клонов после проведения трансформации штамма Е. coli С300 (w.t.) осуществляли прямой амплификацией ДНК клонов-с использованием универсального и реверсивного синтетических олигонуклеотидав. Соответствие нуклеотидной последовательности гена запланированной анализировали сиквенсом гена эглина С на плазмиде, выделенной из целевых клонов.

Штамм C60Q (w.t.) трансформировали плазмкдой pUE618 и наличие биосинтеза полипептида определяли ПААГ-электрофорезом (рис.б), а уровень накопления эглина С - по ингибированию сс-химотрипсина. Количество эглина С достигало не-менее 300-400 мг на 1л культуральной жидкости, что свидетельствует об эффективном бноскнтесс ингибитора протеиваз в клетках E.coli.

Таким образом, на основе клонирования и исследования экспрессии некоторых генов, кодирующих ферменты E.coli (урид1шфосфорилаза и тимидинфосфорилаза), а такке ингибитора протеиназ из пиявок Hirudo medicinalis (эглин С) в составе плазмиды pUUDPP были сконструированы италам E.coli с высоким уровнем накоплена этих белков в бактериальных клетках. Выявлена рель участка хромосомы, флаикиру- -юшдя дисталыг/г; область гена udp в экспрессии уридинфосфорилазы. Данные, приведенные в работе,- позволяют утверждать, что, независимо от фданкировгдшя гена udp дистальным фрагментом хромосомы на первоначально создсижой плазмиде pUD7, промотор-операторный участок гена уридинфосфорплазы обеспечивает высокоэффективную транскрипцию и трансляцию генов в условиях гошдогичной и гетерологичнон этепрес-сии.'

4. Ucaz3£iззгзкз етитгггур^о-^ука^юнальнцх отношсшй в уридки-£за£оряхазе is E.coli uaso^a агЕагонуглешзщ-калранЕзгаюго uyxsrescsa с пзкиаизцкзи PCR.

4.1. Кцап si^asraepiiSTKsa урцдккфос&зриггзы.

Уридшфосфорилаза из E.coli, первичная аминокислотная последовательность которой представлена ниже, - шестисубъединичный бело:-:, с молекулярной массой одной субъединицы 27,5 кДа.

BamHI

Рис. 5. Рекомбинантшй зкспрессионный вектор pUE618. 1 2 ъ h 5

■ -iflR

"'f'Bi

^ i; £ * • ■ • - • • -i Ii f г -

Рис.6. Электрофоретическое разделение белков общего лкзата клеток E.coli:'1.-белки-маркеры (14,4, 20,1, 30,0, 43,0, 67,0, 94,0 кДа). 2-4.-С600 W.T. (p,UEG18, 2.-30&КД, 3.-20мкл, 4.-50мкл). 5.-рекомбинавтный эглин С ("Sigma",CfflA).

10 20 30 40 50 60

MSKSDVFHLGLTKNDLQSATLAIVPGDPDRVEKI ААЬШ№УКЬАЗЖЕРТтаНА^0Ж

70 80 90 100 110 120

PVIVCSTGIGSPSTSIAYEELAQLSIRTFLRIGTTGAI O.PH INv tffl VLVTTASVRLDQAS

130 140 150 160 170 180

LHFAPLEPPAVADFECTTALYEAAKSIBATTHVSVTASSDTFYPGQERYDTYSSRYVRHF

190 200 210 220 230 240

KBSME&'QAMQYMraMESAT^^ 250

AVKIVVEAARRLL

UDP состоит из 253 ак и не содержит выраженных кластеров заряженных и гидрофобных аминокислот. Обращает на себя внимание высокое содержание остатков аланина, глицина и валина (до ЗОХ на субъединицу), что макет обуславливать конформационную "подвитнссть" полипептидной цепи UDP. В молекуле уридинфосфорилазы локализованы три цис-теиновых остатка: С65, С136 и С206.

4.2. ВЕадащ:о cejeítseísíx цутацкй в гене udp с нспользовалкем - ssnsKscsscro уутагкзсза.

i

Начальный этап работы заключался в получении статистического набора мутантов UDP,.анализ которых позволял в дальнейшем проводить целенаправленные аминокислотные замены в феркензе.

Для этого в работе использовали селективный мутаген - бисульфит натрия, применение которого in vitro на фрагменте ДНК, содержащем только структурную область гена udp, позволяло избе;-хать введение нежелательных мутаций в рсгуляторную область данного гена.

Действие бисульфита натрия основано на дезаминировании цитиди-на до урацила, следствием чего является специфическая транзиция. в . молекуле ДКК G:C пары на А:Т пару. Наиболее эффективно химическая

модификация гена in vitro, при применении бисульфита натрия, проис-. ходит в случае использования однонитевой ДНК. С этой целью, при помощи ассимметричной амплификации (олигонуклеотиды 3 и 4.) с плазми-ды pUUDP нарабатывали одноцепочечный фагмент ДНК, содержащий структурную область гена udp, который и обрабатывали бисульфитом натрия. Повторная аыпхификаши мутагеннзированной ДНК до дьунитезого фрагмента позволила клонировать структурную часть гена урэдинфосфорила-

' - 15 -

зы под контролем регуляторяой области гена udp в составе плазмиды pUUDPP.

Полученной лигазной смесью трансформировали штамм E.coli АМ273 и бактериальные клетки рассовали на селективной среде, содержащей 5-фтор-2'-дезоксиуридин. Реципиентный штамм АКЕ73 несет на хромосо-^ ме протяженные делении, захватывающие гены udp и deoA, что позволяет клеткам в присутствии тимидина расти на среде, содержащей FUDR. В случае наличия интагсгаого гена udp на плазмиде, обеспечивающей экспрессию кативной уридиьфосфорилазы, происходи расщепление 5-фтор-2'-дезоксиуридина до 5-фторурацила и девоксирпбозо-1-фосфа-та, что приводит к включению 5-фторурацила в структуру рибонуклеиновых кислот, необратимому нарушению кх функций и, соответственно, гибели бактериальны;: клеток. Очевидно, что экспрессия мутантной UDP со сниженной активностью иди потерявшей способность к деградации FtiDR, будет в первом случае замедлять, а во втором случае не повлияет на рост ¡слеток. Б соответствии с этим на селективной среде отбирали клоны с нормальной и умеренной скоростью роста. Из отобранных мутантных клонов выделяли плазмиду и на основе определения нуетеотадвой последовательности гена-udp были локализованы следующие а^зтокислотныэ гзчеш: точечные мутации A19R, Н179Т, I228S и двойные замены T138V Е142К, C65S S70S (табл.1). Изучение фермента-кзной актизностк полученных спонтанных мутантоз UDP позволило в дальнейшем проводить целенаправленное исследование роли отдельны?: - • аминокислот л участков полипептидвой цепи в функционировании ури-динфосфорилазы.

4.3. "сслздсвагяз прэдЕогаггеней йосфат-свтквшзщеЯ области в ураяжфос^гржгзе. (патял Россиаиа).

Т.к. фермент осуществляет перекос фосфат-иона на углеводный остаток нуклеозида, первоначальный интерес представляла лгасализация центра связывания иона фосфата в молекуле уридинфосфорилавы.

Из литературных данных известно,' что для многих фосфорилсвязы-ваощих белков присоединение иона фосфата осуществляется в характерном центре, обозначенном как петля Россмана. Классическая структура ■ петли Россмана представляет собой последовательность аминокислот, образующую ßccßtfB-звено и относится к сверхвторичной структуре полипептидной цепи. Участие петли Россмана в связывании иона фосфата может быть объяснено тем -фактом, что обычно петля имеет конформаци-

Таблица 1. Синтетические олигодезогссирибонукяеотиды, использованные в работе. Ферментативная активность уридинфосфорилззы из E.coli и ее мутантвых'форм.

1 1 1 N 1мутанта ак замены ¡ 1 Активность 1 UDP 1 2 ' N Pr i Структура | 'мутагенных i олигонуклеотидов |

1 UDP - 1 100 Asp 1

I 1. C135D 1 12. CAGCGCAGTCGTATCTTCSAAAT |

1 2. Р61-Р72 1 7. ATGGTAAACCTTATCGTCTGCTC ' |

8. GQTAQAC6G6AACCGCCGATACC |

1 з. C65S G70S 1 - '

I 4. C65S етос Ser 1

1 5. C65S 1 100 9. GATACCGSTAGA6SAGACGATAAC ¡

¡ Ser !

! 6. C136S 1 * 10. CCAGCGCAGTCGTAGATTCGAAATC ¡

Ser 1

! 7. C206S 1 11. GGCCCTGACTTGCAGACATGGTC !

1 8. C65S C206S i - SalGI & i 1

1 9. 1-1В8ак. 1 21. TTTTGTCGACTTATTCCATTTCAT |

Val 1

1 10. F134V 1 50 14. CGTACATTCGACATCAGCGACA |

Gly ' ' !

1 11- Р13.-Г 1 13. CGTAC.ATTC6CCATCAGCGACA I

Val 1

i 12. T137Y 1 100 15. CAGCGCAGTCACACATTCGAAAT 1

1 Val 1

1 13. T138V ¡ 70 16. AACCAGCGCAACCGTACATTCG ¡

! 14. T1S3V Е142К ¡

] 15. A13Í3 i

1. 16- Н179Т i 100

i IV- I228S i Asn 1

1 18. H47N 1 100 17. GAATTCGCGGTTAGATGCCAGC |

Asn 1

1 19. H1Q1N 1 100 18. CATTAATATTCGQCTGAATAGCG ¡

Asn 1

! 20. H122N 1 40 19. GGTGCGAAGTTCAGGCTCGC |

Asn 1

1 21. i H152N' 1 100 20. •ACGCCAACGTTAGTTGTCGCG j i

За 1002 принята удельная ферментативная активность урздикфосфорилазы дикого типа, составлявшая в экспериментах 130 ед/ыт. Прочерки в таблице обозначает отсутствие ферментативной активности UDP, а * - отсутствие биосинтеза белка.

снноэ гестксе основание"и cava по себе мскет'проявлять подвижность, не нарушая структуру белка в целом. На основе данных по связыванию иона фосфата участком полнпептидной цепи, формирующей петлю Россмана, било показано, что обьг-шов фосфат-связывающих белках отсутствует классическая структура петли. В подобных белках чаше встречается вырокденкая структура петли Россмана, характеризующаяся наличием остатков пролила, определяющих поворот полкпептидной цепи и участвущих в форшгоовании петли.

Интерес представляет структура фосфат-связывавдего центра ферментов катаболизма нуклеозидов. В литературе приведены данные по третичной структуре некоторых из этих ферментов: тимидияфосфорилазы E.coli и пуриннуклеозидфосфорилазы из эритроцитов человека. На основе. рентгеноструктурного анализа тюздинфосфорилагы показано, что ион. фосфата локализуется вблизи петли, образованной между двумя последовательными ß-структурами, захватывающими а-спираливованный участок полилептидной цепи. Структура петли представлена следующей аминокислотной последовательностью: S-T-G-G-V-S. Ион фосфата распо-логается ассимметркчяо по отношению к центру данной петли, и в его связывании задействованы аминокислоты из центральной л-спирали и приближенного ß-лшста. В целом структура петли "сохраняет мотив описанного звена петли Россмана, однако, татке не является его классическим представителем. Аналогично тимидинфосфорилазе, в молекуле пуриннуклеозидфосфорилазы также выявлена выровденная структура петли Россмана. - - -

Анализ первичной аминокислотной последовательности уридинфос-форилазы, а также литературные данные по фосфат-связывающим белкам позволили выявить участок полилептидной цепи ШР между остатками Р61-Р72, предположительно ответственный за формирование структуры петли Россмана. Данный участок фланкирован остатками пролина, определяющими поворот между двумя антипараллельными ß-листами, и обогащен остатками глицина, обеспечивающими конформационную подвижность петли.

Исследование роли участка P61-F72 в функционировании уридин-фосфорилазы проводили при помощи олкгонуклеотид-направленного мутагенеза.

Мы разработали новый подход в реконструкции ДНК и проведении олигонуклеотид-каправленного мутагенеза на основе полимеразной цепной реакции. Подход основывался на следующем: как известно, инсер-ция одной или двух пар нуклеотидов в любом участке структурной об-

ласти гена приводит к нарушению рамки считывания. В случае, если через определенное количество нуклеотидов ввести делению такого яе количества нуклеотадных пар, происходит восстановление рамки считывания и, соответственно, видоизменение структуры триплетных кодо-нов, что.приводит к полной замене аминокислотной .последовательности данного участка полипептидной цепи. Очевидно, что выбор места введения инсерции/делеции в нуклеотидной последовательности гена (кодирующей шш комплементарной цепи ДНК), а такие количество введенных нуклеотидов (один или два нуклеотида) определяют последующий аминокислотный состав видоизмененного полипептидного участка белка. Предварительный расчет структуры реконструированного фрагмента ДНК позволяет определить и выбрать аминокислотную последовательность мутантного полшептида. -

Для реализации разработанного подхода при проведении олигонук-леотид-направленного мутагенеза области полипептидной цепи Р61-Р72 уридинфосфорилазы использовали олигонуклеотиды 7 и 8 (табл.1). Оли-гонуклеотид 7 вносил дедецию двух нуклеотидов (6Т) непосредственно за триплетным кодоном Р61, а олигонуклеотид 8 - инсерцию такого же количества нуклеотвдных пар (АА), не затрагивающих'кодон F72. Анализ данного участка ДНК при помощи пакета программ "DNA-sun", показал, что именно делеция двух нуклеотидов в кодирующей цепи и инсер-ция АА-пары в комплементарной'цепи ДНК позволяет произвести запланированную 3ai.c;ry аминокислотного состава участка Р61-Р72, а также предотвращает возникновение STOP-кодона трансляции. Ватао отметить, что при проведении такой реконструкции мы не затрагивали кодоны Р61 и Р72, определяющих поворот гкшшеотздной цепи. Разработанный подход реконструкции ДНК на основе олигонуклеотид-надравленного мутагенеза позволил получить мутантную уридинфосфорклазу с заранее рассчитанной аминокислотной заменой протяженного участка поишеп-тидной цепи Р51-Р72. Мутагенез данного района был направлен на существенное изменение состава петли - замену гидрофобных аминокислот, которыми обогащен участок, на гидрофильные: 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 К Р V I VCS.TG I GGPS Дикий

5'....AAACCTCTTATCGTCTeCTCTACCeSTATCGGCSeCCCGTCT... 3' тип UDP

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 KPYRLLYRYRRFPS Мутантный

5'...AAACCrfATCGTCTGCTCTACCaSTATCCGCGSTTCCCGTCT...3' ТИП UDP

Сконструированный по этой схеме ген уридинфосфорилазы с видоизмененной последовательностью участка P61-F72 клонировали в составе плазмиды pUCl8. После отбора рекомбинантных клонов и анализа нуклеотидной последовательности гена udp в составе гибридной плаз- . миды, экспрессию мутантной формы уридинфосфорилазы изучали в штамме Е.coli С600*. Данный шта.ш содержал протяженную деления гена udp на хромосоме, что давало возмкягость в этом и в последующих экспериментах использовать его в качестве рецнпиентного штамма для изучения ферментативных свойств мутантных форм уридинфосфорилазы. Уровень биосинтеза мутантной формы UDP практически полностью совпадал с уровнем экспрессии дикой аллели гена udp (рис.7), однако активностью фермент не обладал (мутант 2, табл.1).

Отсутствие активности мутанта 2 с локальной заменой гидрофобных аминокислот на гидрофильные в области Р61-Р72, вероятно, свидетельствует об изменении структуры петли Россмана, следствием чего и является потеря ферментативной активности уридинфосфорилазы. Подтверждением значимости исследуемой области также является изменение ферментативных свойств UDP при введении дополнительных одиночных' мутаций в "данной области. Так, мутантная форма уридинфосфорилазы с заменой аминокислот C55S G70S, полученная на основе химической модификации структурной области гена udp, также не.обладала активностью.

Таким образом, анализ мутантов уридинфосфорилазы с точечными заменами аминокислот внутри предполагаемой петли Россмана (мутант 3) и локальной мутацией.области Р61-Р72 (мутант 2) указывает на то, что фрагмент полипептидкой цегш P51-F72 выполняет важную роль в функционировании молекулы, вероятно, отвечая за связывание- иона фосфата.

4.4. Кзучепкэ роли цястепязз а йгаяцекпч>ават:и Щ».

Особый интерес вызывало выяснение роли цистеиновых остатков в уридинфосформазе.

Как известно, цистеиновые остатки в белках могут выполнять различные функции, находясь в свободном (SH-групш) или в ковалент-носвязанном состоянии (S-S связь). Анализ роли цистеинов в белках разного класса указывает на то, что цистеиновые остатки могут выполнять вакную функцию по стабилизации третичной и четвертичной

1 Е 3 4

Рис.7. Злектрофоретическое разделение белков общего'лизата клеток Е.сОП: 1.-С600* (рШ0РР61-Р72). 2.-С600* (рЦШР). 3.-С600*. 4.-белки-маркеры (14,4, 20,1, 30,0, 43,0, 67,0,94,0 кДа).

структуры белка, образуя дисульфидные связи, и, тем самш, придавая стабильность молекуле в целом. Помимо этого, цистеиновые остатки часто локализуются непосредственно в каталитически активном центре ферментов, предопределяя свойства данных белков. Из этого следует, что выяснение ролл циетеияов является ватасй задачей при исследога-нии структурно-функциональной организации любого белка.

Как уже было сказано выше, в урвдинфосфорилазе находятся три цистеиновых остатка - С65, С136 и С206. Изучение роди цистеиновых остатков в молекуле UDP проводили на основе получения мутантных форм по данным остаткам. Мутагенез был направлен на замену остатков. цнстеина на серин, наиболее вероятной заменой в эволюционном процессе развития белков (Dayhoff М.О., 1972). Нами была использовала эффективная схема проведения сайт-направленного мутагенеза, позволяющая конструировать мутантные белка с направленными точечными заменами аминокислот в любой области полипептидной цепи (рис. 8).

На первой стадии PCR проводили ассимметрнчный синтез фрагмента гена udp для получения одноцепочечной ДНК, содержащей необходимую замену. Для этого, в реакционную смесь вводили олигснуклеотид, несущий запланированную зачину (праймеры 9, 10, или 11, табл.1) и олигояуклеотвд, колплемеятарный регуляторной области гена udp (праймер 1), в соотнощенни 1/100. Полученную однонитевую ДНК использовали на второй стазки FCS з виде полинуклеотяда совместно с-дистальнкм пракмером, комплементарным С-концевой области гена udp, для амшшфикашш поляоразкерного гена, содержащего требуемую мутацию: Использование в качестве ДНК-катрицы структурной области гена udp в составе фага ssM13tgl30 позволяло исключить возможность образования фрагментов ДНК, содер-тапак интачтнкй ген урндинфосфорилазы, натачие которого существенно осла-шило бы отбор целевых мутаитнкх клонов. Это вызвано тем, что на второй стадии PCR, при наработке полноразмерного :-:!утантнсго гена, олкгонуклеоткц 1 не имеет комплементарной шсзени на ДНК-матрнцэ (т.к. отсутствует регуляторнач область гена udp), что позволяет ачплифицировать исключительно целевую мутантную ДНК. Амплкфицирозанный полнсразмерный ген udp с введенной заменой и фланкированный сайтами эндояуклеаз рестрикции SacI и SalQI, подвергали гидролизу соответствующей! рестриктазами и клонировали в составе плазмиды pUC18.

Применение эффективного подхода в проведении сайт-направленного мутагенеза, позволило сконструировать ряд рекомбинантных плаз-мнд. содержащих мутантные гены udp с заменами C65S,. C136S и C206S.

j - 22 -

5. PL UDF sstgl3D-udp

3'

3'

5'Prl 3'. Îpcri .

5' PL V -A

PCR2

ssPri—РгЭ(10Д 1)

saPrl —Рг9(10,11 )

3' PL*.

istgl30-Sudp

о'-

" Рг4 °

PCR2

5. PL S PL „

0_,_;_s_:_,_О

Я1-

dsudp '5'

Restriction Cloning

Рис.8. Схема проведения сайт-направленного мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакций (PCR).

Экспрессию мутантных форм уридинфосфорилазы исследовали в штамме С600*. Анализ профиля суммарных общеклеточных белков данного штамма . . (рис.9), показал,,..что введенные замены C65S и C206S в уридинфосфо-рилазе не сказываются на уровне экспрессии данного гена. При этом мутация C65S (мутант 5) не влияет на активность-UDP, в то время как замена C206S (мутант 7) приводит к полному отсутствию ферментативной активности уридинфосфорилазы (табл.1).

Особый интерес представляла мутация G135S. Оказалось, что введение данной замены приводит к полной потере биосинтеза уридинфосфорилазы, что может быть обусловлено деградацией белка с существен- -но нарушенной третичной структурой под действием протеиназ E.coli.

Отсутствие биосинтеза уридинфосфорилазы при введении замены C136S предопределило конструирование мутантной UDP, несущей двойную мутацию C65S C206S (мутант 8) на фоне дикой аллели С136. Уровень биосинтеза у полученного мутанта уридинфосфорилазы бш практически идентичен уровню биосинтеза интактного белка (рис.9), но, как и следовало ожидать (по аналогии с мутантом C206S), белок ферментативной активностью не обладал (табл.1). Наличие биосинтеза уридинфосфорилазы у мутантов 5, 7 и 8 свидетельствовало об отсутствии структурирующих дисульфидэдх связей мезду остатками цистеинов С65, C13S и С206 внутри субъеДиницы фермента. Однако, оставался открытым вопрос о наличии мелмолекудярной дисульфиднсй связи, в образовании которой может принимать участие С135. -

Для проверки этой гипотезы, ш провели замену в мутанте 6 (C136S) 136 серина на аспарагиновую кислоту. Данная аминокислота была выбрана, как аминокислота, содержащая боковой радикал, по размеру наиболее схожий с боковым радикалом остатка цистеина, и несущий отрицательный заряд, как и тиольная группа цистеина.

В результате проведенного мутагенеза биосинтез уридинфосфорилазы, нарушенный заменой C136S, был полностью восстановлен •(рис.10). Несмотря на то, что сконструированная мутантная форма UDP, несущая замену C136D, не подвергалась, в отличие от мутанта C136S, протеолиау, ферментативной активностью белок не обладал (мутант 1, табл.1), что могло указывать на важную структурно-функциональную роль как С135, так и всего участка, окружающего эту аминокислоту.

Восстановление биосинтеза уридинфосфорилазы заменой C135D, свидетельствовало об отсутствии мкксубъединичной дисульфидной связи з молекуле фермента, в формировании которого потенциально мог

Л" —> <•>--- ■

Рис.9. Эдектрофоретическое разделение бежов общего лизата клеток E.coli: 1.-С600* (pUUDP). 2.-С600* (pWDPC55S). 3.-С600* (pUUDPC136S)r 4.-С600* (pUUDPC206S). 5.-С600* (pUUDPC65S C2Q6S). 6.-С600*. 7.-бедки-маркеры ( 14,4, 20,1, 30,0, 43,0, 67,0, 94,0 кЛа).

• ...... - ,

< ;

' 'i '3

. .-„'т.-*- ' •*•• ' ^¿^J^J.;*. ' Д^-'-

Рис.10. Эдектрофоретическое разделение белков общего лизата клеток E.coli: 1,6.-белки-маркеры (14,4., 20,1, 30,0,' 43,0,). 2.-0600" (pUUDP). 3.-С600* (pUUDPC136S). 4.-С600* (pUUDPC136D). 5.-С600*.

6

участвовать цистеин 136. Помимо этого, способность аспарагиновой кислоты, благодаря наличию отрицательно заряженного бокового радикала, Ъбразовывать ионную связь позволяло предположить, что 136С участвует в формировании внутримолекулярного солевого мостика с остатком аминокислоты, несущей положительный заряд. Аминокислотами, способными участвовать в взаимодействиях подобного рода могут быть аргинин, лизин, аспарапш или глутанин.

4.5. Изучение рот п^пх^гзгзяг, струяЕэдг; С1СЗ, в пропзлажгт ферменгзпппзЯ гжг^гостзз урсп'^ос^ормлзза.

Ключевая роль С135, возможно, не ограничивается только структурной функцией данной аминокислоты в формировании солевого мостика в пределах субъединицы урщивфосфорилазы. • Вероятно, С135 несет определенную функциональную роль, образуя связь, формирующую участок' полипептидной цепи, принимающий участие в связывании субстрата. В частности, на основе рентгеноструктурного анализа одного из ферментов катаболизма нуклеозидов - пуриннуклеозидфосфорилазы исследована роль отдельных аминокислот в функционировании белка. Пуришуклео-звдфосфорилаза является трехсубьединичным белком и содержит четыре цистеиновых остатка на субъедлницу фермента. Показано, что молекула не имеет внутри- к межсубъединичных дисульфиднкх-связей. Оказалось,, что из четырех цистеинов, только С31 находится в непосредственной близости от активного центра фермента, участвуя в стабилизации кон-формации центра связывания цуклеозида.

В случае, если С136 в уридкнфосфорилазе выполняет аналогичную роль в формировании активного центра фермента, то локальное изменение ковформации участка полипептидной цепи должно оказать влияние на ферментативную активность белка. Такого рода изменения в конфор-мации могут быть внесены заменами близлежащих к С136 аминокислот, на аминокислоты, боковые радикалы которых схожи или существенно отличаются от исходных. Решение подобной задачи во многом зависит от правильности выбора заменяющей аминокислоты.

Участок полипептидной цепи, окружающий С136, представлен следующими аминокислотными остатками:

130 132 134 136 138 140 142 .АУАОРЕСТТАЬУЕА

Обращает на себя внимание наличие гидрофобного ароматического остатка F134 и последующих за С126 двух остатков треонина, замены которых могут привести к достаточно выраженным изменениям в прост-1 ранственном расположении остатка цистеина. В случае замены F134 нами были выбраны остатки глицина и валина. Остаток глицина не содержит бокового радикала и, несмотря на вносимую им дополнительную конформационную свободу исследуемого участка, не может имитировать -фенилаланкн. В отличие от глицина, остаток валина обладает достаточно гидрофобным боковым радикалом, затормаживающим информационные переходи участка полипептидной цеци, но в большей степени, чем глицин, имитирующим боковой радикал фекилаланина. В качестве аминокислот, заменяющих остатки Т137 и Т138, мы выбрали остаток валина. Такая замена была обусловлена близостью строения боковых радикалов этих аминокислот. Существенным различием в строении треонина и валина является отсутствие у последнего гвдроксилькой группы в составе бокового радикала, которая, в случае треонина, способна образовывать водородные связи, стабилизирующие структуру данного участка полилептвдной цепи. Разрушение такого рода водородных связей, мохет приводить к локальному нарушению конформации фрагмента белковой молекулы, что должно неизбежно сказаться на пространственном расположении остатка цистеина 136.

Действительно, проведенные замены привели, в случае мутации F134S (мутант 11), к полной потере ферментативной активности ури-" динфосфорилазы, в' отличие от замены F134Y (мутант 10), приводящей - только к снижению активности белка.

Особый интерес представляли мутанты T137Y и T138Y, у которых ферментативная активность составляла 100Х (мутант 12) и 70% (мутант 13). Неравноценность изменения ферментативной активности при введении вышеописанных мутаций подчеркивает важность конформации исследуемого участка в формирована активной белковой молекулы. Эти данные подтверждаются мутациями T138V Е142К (мутант 14), полученными з ходе проведенной вами химической модификации структурной части гена udp. -

Следовательно, анализ сканирующих мутаций вокруг С136 указывает на важную структурно-функциональную роль этого аминокислотного остатка в формировании и поддержании активного центра уридинфосфо-рилазы из Е.соН.

- 27 -

4.61 Нзученке роли гиствдкноа в (ёуихцноняратгакии UDP.

Изучение структурно-функциональной роли участка полипептидной цепи уридинфосфорилазы, содержащей С136, позволило продолжить исследование отдельных аминокислот, способных катализировать фермента-■ тивную реакцию превращения уридина. Особый интерес в этом аспекте представляло исследование роли гистидинов в функционировании уридинфосфорилазы.

Как известно, гистидин содержит имидааольный боковой радикал (рКа-6,0). При нейтральных значениях pH остаток данной аминокислоты • сравнительно легко присоединяет ион водорода из раствора, и (шш) участвует в передаче протона на боковой радикал близлежащей амино- ■ кислоты. В связи с этим, гистидин часто находится в активном центре фермента и выполняет важную роль при каталитическом превращении субстрата.

Первоначальные попытки изучения роли гистидинов в UDP проводились при помощи химической модификации фермента. Уридинфосфорилазу из E.coli подвергали селективной химической модификации с использованием диэтштирокарбоната (Drabikowska A.K., 1990). Авторы показали, что модификации подвергаются три гнстидиновых остатка на одну субъединицу UDP. При этом из трех модифицируемых остатков, только один защищается уридияом. На основе изучения активности модифицированных белков было такие показано, что только-один из трех модифицируемых гистидинов важен для ферментативной активности UDP. Одна- • ко, ни один из этих аминокислотных остатков, включая функпионаяь-но-значимый остаток гистидина, локализованы не были. Кроме этого, ' следует отметить, что з первичной аминокислотной последовательности UDP находится семь гистидинов. Отсутствие химической модификации ■ оставшихся четырех остатков гистидина из семи, авторы обсуждению не подвергали, что и предопределило исследование роли остатка данной аминокислоты в функционировании UDP.

Исследование роли гистидинов в уридинфосфорилазе проводили при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза. В работе использовали олигонуклеотиды 17-20 (табл.1), позволяющие вводить мутации H47N, H101N, H122N и H152N. Аспарагин был выбран как аминокислота, содержащая аминогруппу в боковом радикале, что дает, возможность данной аминокислоте функционировать в качестве донора или акцептора водорода, имитируя боковую цепь остатка гистидина. Кроме того, такая мутация является наиболее вероятной заменой в эволюционном про-

- 28 -

цессе развития-белков (БауЬоГГ М.О., 1972).

Олигонуклеотид-направленный мутагенез проводили по вышеописанной, схеме введения точечных замен в последовательность гена. После отбора рекомбинантных ¡слонов,' содержащих соответствующие замены, уровень биосинтеза мутантных форм уридинфосфорилазы анализировали в составе штамма С600* (рис.11). Анализ зксспрессии мутантиого гека ийр, содержащего замены Н47Ы, Н101М, Н122М Н152К .и Н179Т (получек- -ный химической модификацией гена udp при помощи бисульфита натрия), обнаружил, что биосинтез мутантных форм уридинфосфорилазы осуществляется на уровне биосинтеза ШР дикого типа. Исследование ферментативной активности сконструированных мутантов показало, что замена Н47И (мутант 18, табл.1), Н101К (мутант 19), Н152Н (мутант 21), а также Н179Т (мутант 16) не сказалась на активности уридквфосфсрила-зы. Что ле касается замены Н122И (мутант 20), то фермент обладал остаточной 40% активностью по сравнению с уридинфосфорилазой дикого типа.

Как и следовало ожидать, введение аспарагияа вместо гистидина не повлияло на структурную организацию уридинфосфорилазы, о чем свидетельствует наличие высокого уровня биосинтеза мутантных 'форм белка. Помимо э?ого, наличие 100£ активности у мутантов, содержащих замены Н47Л, Н101М, Н152М и Н179Т указывает на "то, что данные остатки гистидина, по видимому, не оказывает влияния на функционирование уридинфософрклазы. В этом аспекте особый интерес представляет мутант 20, обладавший сниженной активностью. Полученные наш данный" дают возможность предположить, что Н122, так же, как и аминокислоты окружающие С136, выполняют важную функциональную роль в поддержании активного центра уридинфосфорилазы. Анализ наших результатов указывает на их соответствие данным (БгаЫко^зка А.К., 1990) и, более того, позволяют локализовать функционально-значимый остаток гистидина Н122, как аминокислоты, участвующей в формировании активного центра уридинфосфорилазы.

Выявление роли гистидинов в функционировании уридинфосфорилазы позволило продолжить исследование структурно-функциональных отношений в данном ферменте, которое в дальнейшем было направлено на изучение влияния С-концевой области 1ГОР на формирование активной муль-тимерной формы белка.

1 2.3456 7$

Рис.11. Электрофоретическое разделение белков общего лизата клеток Е.соН: 1.-C60Ü* (pUUDP). 2.-С600* (pUUDPH47N). 3.-С600* (pUUDPHlOlN). 4.-С600* (pUUDPH122N). б'.-СбОО* (pUUDPH152N). * 6.-CS00* (pUUDPH179T). 7.-C600*. 8.-белки-маркеры (14,4, 20,1, 30,0, 43,0, 67,0,94,0 кДа).

- so -

4.7. Изучение роли С-концевой о&пастк ур:;цкк$осфорняззи в ' Йункционкровашш банка.

Мз литературных данных известно, что урвдинфосфорилаэа. из штамма E.coli К12 является шестисубъедикичным белком с молекулярным весом одной субъедиюшд 27,5 кДа (Cook W.J." et al., 1937). Эти данные подтвердились изучением четвертичной структуры урвдинфосфорила-• зы из E.coli Kl2 при помощи электронной микроскопии. Оказалось, что шесть субъедшшц фермента располагаются трылеракн в двух слоях с осью симметрии третьего порядка (Цулрун В.л. и др., 1991). Махно предположить, что подобная четвертичная структура олигомерного бедка формируется с участием !ч- и С-концевых доменов при осуществлении межсубъедикичного контакта. Представляло интерес исследование роли данных участков полипептидной цепи в структурировании нативвсй молекулы уридинфосфорилазы. В связи с тем, что Ктконцевая область в белках выполняет характерную функцию начала фолдинга полидёптиднон цепи, проведение мутагенеза в этой области уридинфосфорилазы могло давать неоднозначные результаты, связанные, прежде всего, с непрогнозируемым протеолизом неправильно сформированного фермента. Поэтому, основное внимание было уделено структурно-функциональной рож С-концевой области ур;щикфосфорилаза в формировании мудьтимервой Форш белка.

Мы разработали эффективный подход, который давал возможность в течение однократной реакции PCR и последующего субклонирования конструировать экспрессионние плазмады, содержащие делеции в заранее определенной С-концевой ^ласти гена. Разработанный нами метод заключался в использовании олигонуклеотида, комплементарного запланированному участку С-концевой области гена и несущего в своем составе уникальный сайт рестрикции (например, сайт, с помощью которого осуществляли клонирование гена), а также триплетный кодон терминами трансляции белка. При помощи такого олигонуклеотида, а также олигонуклеотида, комплементарного проксимальной части гена, возможна амплификация гена укороченного размера и дальнейшее его клонирование в составе зкспрессионного вектора. Очевидно, что введенный "стоп"~кодона позволит завершить процесс трансляции мутаятного белка в запланированном месте полипептидной цепи.

Схема проведения такого мутагенеза на примере уридинфосфорилазы представлена на рис.12. Отсутствие активности при введении замены C206S, на фоне высокого уровня биосинтеза мутанта 7, а также

ЭаШГ

ЦРР АТТ/

у рШБР

Зас1 , _ _

РСЕ

Бас! тгтчг,,Ф ЗаЮ1

иЕ>Р ТАА 5

Рис. 12. Схема конструирования плазмиды рЦШР'

приведенные данные по четвертичной структуры уридинфосфорилазы, позволяли проводить направленный мутагенез для введения стоп-кодона трансляции по 198 аминокислоту (олигонуклеотид. 21, табл.1), тем самим осуществляя делеци» 55 концевых аминокислотных остатков в молекуле фермента.

Анализ уровня биосинтеза делеционной формы уридкнфосфоршшзы показал, что сконструированная рекомбинантная плазмида обеспечивает высокий уровень экспрессии гена udp укороченного размера (рис.13),: однако полученный'мутантный белок активностью не обладал (ыутант 9). Следует отметить, что ферментативная активность отсутствовала и в мутанте 15 (табл.1), содержащем замену A19R в N-концевой области уридинфосфорилазы, полученном химической модификацией структурной области гена udp. Эти данные позволяют предположить, что К-концевой и С-концевой домены в молекуле фермента выполняют характерную для олигомерных белков роль по формированию натквной молекулы уридинфосфорилазы. Мутация в Н-конаевой области бедка (A13R), вероятно, нарушает топологию контакта отдельных субъедкниц UDP, следствием чего может являться неправильная агрегация мономеров при формировании гексамерной структуры фермента. Делеция 55 аминокислотных остатков в С-концевой области уридинфосфорилазы не вызывает снижения уровня биосинтеза мутантного белка по сразкениш с уридинфосфорила-зой дикого типа, что свидетельствует о сохранении правильного пути фолдинга оставшейся N-концевой области белка. При нарушении пути фолдинга мутантный белок был бы неизбежно разрушен под действием протеиназ E.coli (например, мутант 6; табл.1). По-видимому, внесенная делеция приводит к ухудшении контакта между субъединицами белка, что вызывает образование фермента с нарушенной четвертичной структурой.

Такие нарушения в структуре приводят не только к отсутствию ферментативной активности уридинфосфорилазы, но и к изменению общих -свойств белка. В частности, исследование локализации мутантных форм UDP показало, что, в отличие от уридинфосфорилазы дикого типа, локализованной в цитоплазме, мутанты 9 и 15 находились в мембранной фракции клеточных стенок. Эти данные подтверждают высказанное пред- . положение об участии N- и С-концевого доменов в 'осуществлении мелс-субъединичного контакта при формировании нативной активной четвертичной структуры уридинфосфорилазы.

Таким образом, проведенный анализ сконструированных мутантных форм уридинфосфорилазы позволяет создать предположительную модель

1 г 3 4

Рис.13. Электрофоретическое разделение белков общего лизата клеток Е.соП: 1.-С600 \ 2.-С600* (рШЮР). 3.-С600* (рШГОР'). 4.-белки-маркеры (14,4 , 20,1, 30,0 , 43,0 , 67,0 , 94,0кДа).

структурно-функциональной организации данного фермента."В уридин-фосформлазе, шестисубъединичном белке, несмотря на наличие трех цистеиновых:остатков, отсутствуют как внутри-, так и межмолекулярные дисульфидные связи. Особая роль принадлелмт С136, котсрий, вероятно, участвует в формировании активного центра фермента. В поддержании активного центра уридинфосфорилазы, на ряду с аминокислотами, окружающими С136, также участвует Н122. Участок полипепткд-ной цепи Р61-Р72 образует вырагденную .структуру петли Россмана и отвечает за связывание фосфат-иона. N-- и С-концевые участки поли-пептиднок цепи выполняют характерную для олигомерных белков функцию образования меясубъединичных контактов и формирования кативной четвертичной структуры уридинфосфорилазы. Рентгеноструктурный анализ данного фермента в дальнейшем позволит подтвердить гаи внести коррективы в предложенную модель структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы.

вывода

1. Сконструированы экспрессионные пдазьявды, позволяющие проводить эффективную транскрипцию и трансляцию генов под контролем про-моторной области уридинфосфорилазы. Показано, что хромосомальный участок дистальной области гена udp не влияет на уровень экспрессии. . . ... ...

2. На основе полученных рекомбинантных плаэмид сконструированы штаммы-продуценты уридинфосфорилазы (В-6840), ткмидинфосфорилазы из Е. coli (В-6841) и эглина С из Hirudo medicinalis. Показано, что уровень биосинтеза уридинфосфорилазы, тимидинфосфорилазы и эглина С в Е. coli составляют не менее 0,4; 0,6 и 0,4 г/л., соответственно.

3. С использованием методов амплификации отработаны методы сайт-направленной реконструкции ДНК для исследования структур-но-функциональкых отношений s белках. Методы основаны на:

- сдвиге и возвращении рамки считывания в структурной области гена при помощи олигонукжеотид-специфического мутагенеза;

- использовании однонитевого фрагмента ДНК для проведения сайт-направленного мутагенеза; .

- введение стоп-кодона трансляции в С-концевой области гена для конструирования белков укороченного размера;

4. С помощью сайт-направленного мутагенеза изучены структурно* функциональные отношения в урадинфосфорилазе из Е. coli. В хо-

де исследования выявлено, что:

. - в уридинфосфорилазе остатки цистеинов не участвуют в образовании как внутри-, так и межмолекулярных дисульфздных связей;

- остаток С136 имеет важное функциональное значение в формировании активного центра фермента; .

- остаток Н122 участвует в поддержании активного центра ури-динфосфорилазы;

- участок полипептидной цепи Р61-Р72 в уридинфосфорилазе играет важную роль в функционировании молекулы фермента, возможно, отвечая за связывание иона фосфата;

- N- и С-концевые участки полипептидной цени уридинфосфорилазы формируют места мексубъединичных контактов, участвуя в образовании нативной четвертичной структуры белка.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. A.M.Mikhailov, E.A.Smirnova, V.L.Tsuprun, I.Y.Tagunova, B.K.Yainshteln, E.Y.Linkova, A.A.Komissarov, Z.Z.Siprashvili, A.S.Mironov "Isolation, crystallisation in the macrogrävitation field, prelimanary x-ray investigation of uridine Phosphorylase from Escherichia coli К-12", Biochemistry International, 1992, V.26', No4, 'PP.607-615. ' '

2. В.П.Вейко, 3.3.Сипрашвили,.К.И.Ратманова, Л.Б.Гулько, • Р.В.Андрюхина, В.Г.Дебабов "Клонирование и экспрессия в Escherichia coli тимвдинфосфорилазы под контролем промотора уридинфосфорилазы", Биотехнология, 1994, N4, С.2-4.

3. В.П.Вейко, 3.3.Сипрашвили, Л.Б.Гулько, К.И.Ратманова, Р.В.Андрюхина, А.А.Миронов, А.С.Оскпов, А.К.Соколов, В.Г.Дебабов • "Сайт-направленная реконструкция ДНК. Изучение структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе из Escherichia coli", депонированная научная работа в ВИНИТИ N1311-B94 от 27.05.1994.

"4. В.П.Вейко, 3.3.Сипралшили, К.И.Ратманова, Л.Б.Гулько, А.А.Миронов, Р.В.Андрюхина, В.Г.Дебабов "Изучение структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы из Escherichia coli", ДАН (в печати).

5. В.П.Вейко, 3.3.Сипралшили, К.И.Ратманова, Л.Б.Гулько, Р.В.Андрюхина "Исследование структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе из Е.coli", VI конференция Российской Федерации. Новые направления биотехнологии. г.Пущино 24-26 мая, 1994г. ст. 70.