Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са2+-АТРаза саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и канальная функция ее гидрофобного фрагмента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Са2+-АТРаза саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и канальная функция ее гидрофобного фрагмента"

АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ БЮХ1М1Т !м. О. В. ПАЛЛАД1НА

РГ6 од

- П

"'* На правах рукопису

ФЕДОРОВ Олексш Мнколайович

Са2+-АТРаза САРКОПЛАЗМАТИЧНОГО РЕТИКУЛУМУ СКЕЛЕТНИХ МЯ31В ТА КАНАЛЬНА ФУНКЦ1Я II Г1ДРОФОБНОГО ФРАГМЕНТУ

03.00.04.— Битлпя

Автореферат дисертаци на здобуття наукового ступеня доктора 61олопчних наук

КиГв 1993

Робота виконана в вщдш бю.хши м'яз1в 1нституту б10Х1М11 ¡м. О. В. Палладша Академи наук Украши.

Офвдйш опоненти:

доктор бтлопчних наук, професор ЦУДЗЕВИЧ Б. О.

доктор бюлопчних наук РИБАЛЬЧЕНКО В. К.

доктор бюлопчних наук, професор ПХАКАДЗЕ Г. О.

ПроЕидна установа 1нститут ф1зюлоги ¡м. О. О. Богомольдя

АН Украши

Захист дисертаци в¡дбудеться «-. 1993 р. о 14 годиш на заыданш спещал1зовано! .вчено! ради Д 016.07.01 для захисту дисертащй в Гнститут: бкшми ¡м. О. В. Палладша АН Украши за адресою: 252601, м. Ки1в-30, вул. Леонтовича, 9.

3 дисертацкю можиа ознайомитися в б^блютеш 1нституту бюх1мп ¡м. О. В. Палладша АН Украши.

Автореферат розшланий «

1993 р.

Вчений секретар спец1пл13овано1 вченоТ ради канд. б юл. наук

Кирсенко О. В.

" ЗАГАЛЬНА характеристика рсьоти

АКТУДЛЬШСТЬ ПРОБЛЕМ. Результат» багатол1тн1х доел!джень струк тури i фушщП саркоплаэматичного ретикулуму (СР)св1Дчать про кого роль в ШдтришЦ функционально необх1дно! коицент^ацП Ca2t всередии! míouhtíb, а також регуляцП м'язевого скорочення .

ЗПдно з даними л1тератури,кьчьк1сть кальц1ю,яка надходить в мшцити через сарколему по електро-та хемокерованим каналам, аедос татня для аютзацП скоротливиих б1дк1ьЛак,н1д час псюдипоко го потежпаяу д1'1 поь!дьний вх!дний калыиевий notin забезпечуе надходження в кард!ом!оцити 5-10 мкмоль Са2+ на 1 кг маси серця (Fazzard Н.А.,1977), а для розвитку максимального напруження м1о карду нс-обх!дно 80-100 мкмоль Са2+на 1 кг маси (Solero R.J.,1974).

Тому для серцевого та скелетних м"яз1в показано,що для забез печення 'ix скорочувально! активност! необх1дне надходження Са2+в кл1тину 1 вив!льнення його 1з CP (Pod

olsky R.Y,,1964).Якщо електрофШологами í б!оф}зиками досить гру нтовно вив чей i процеси та механ1зми входу Са2+в кл1тину,то мехам зм 1ндукцП вив1льнення його 1з ретикулуму та участь молекулярних структур,локалiзованих в мембранах остаинього.в цьому процес1 ва-лишаются проблематичними.

Анализ в1домостей про вплив р1зних 1нг1б1тор1в та 1ндуктор1в на вих!д Са£+ 1з CP дозволяв припустити наявн!сть р1зних 1зоформ або р!зних тип!в Са2+-канал1в в píshhx фракц1ях вказано! мембранной OTpyKTypH(ChleslM.,1988),в формуваннi яких не виключена 1 уча сть Са-АТРаэй(Смирнова М,Б.,198a,Martonosi Д.,1977).

Останне п1дтверджують сл1дуюч1 експериментальн1 дань а/ Са2+-АТРаза - 1нтеградьний 01лок;б/здатн1сть веэикульованих препарат!в CP до йонного фосфорилювання АДР при виход1 Са2+за fpa д1ентом концентрацП та синтезу ATP(Hasselbach W., 1976); в/суттеве п!двищення швидкост1 виходу Са2+в везикул CP п1д час функд1онуван ня Ca-ATPasH(Gerdes G., 1986), яке не можна пояснити smIhoio проник-hoctí IX л1п!дного матриксу.

Встроювання Пдрофобного фрагментуСа-АТРази в 0Шп£цний шар викликае неселективне эб1льшення пров!дност1 б1шар!в для одно- i двовалентних кат!он1в /Shamoo A.S., 1977/.

йонофорна пров1дн1сть Са2+сукцин1льованими препаратами Са-АТРаэи селективно 1нг1буеться 1аэ+,рутен1евим червоним в тих же концентрац1ях,що 1 в нативних мембранах саркоплазматичного рети

кулуму (Замараева М.В. ,1982).

Зв1дси зроблено припущення про те, що ПдрофоСний фрагмент (40-50 кДа) може формувати неселективний йонний канал .ГЗЬатоо А. Б., 1977). При цьому сл1д врахувати, що каналоутворюючу здатн!сть цього фрагменту вивчали за наявност! б!лку в високих концентрац! ях,коли пров1дн!сть бшарово! л1п1дно! мембрани могла зм!нитися п!д д!ею б!лк1в, як! напевно не являються каналоутворюючими (сойо вий 1нг1б1тор трипсину).Жорстк! умови вщплення фрагмент!в тртп'и чного г1дрол!зу Са2+-АТРази,а також досл1дження з використанням такт середовшц.як дека'1н, мабуть,можуть викликати суттев! стру ктурн1 вм1ни г1дрофо0ного фрагменту,що може супроводжуватися зни-женням селективност! 1 здатност! його проводити Са2+.

Таким чином, йонна пров!дн1сть Са-АТРази 1 структури,*що П забезпечують, лишаються невиясненними.що 1 виэначило напрямок дано! роботи.

МЕТА I ЗАДАЧ1. Метою ц1е'1 роботи було досл1дити здатн!сть Са2+~АТРази саркоплазматичного .ретикулуму пасивно проводити йони кальц1ю,а також вид1лити та охарактеризувати структури, що забезпечують изо здатн!сть.

В зв'яаку з поставленою метою треба було:

1). вид1лити Са2+-АТРазу високо! чистоти та активност1;

2). реконструювати одержаний фермент в л1посомах 1 добитися правильно! його ор!ентацП в них;

3). одержати г1дрофобний фрагмент Са2+-АТРази,реконструйовано1 в л1посомах(1), 1 солюбШзовано'! П форми(II);пор!вняти структур н1 особливост! (ам1нокислотний склад) цих фрагмент1в;

4). досл!дити йонпров!дн1 властивост1 одержаних фрагмент!в.

НАУКОВА НОВИЗНА I ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМ1СТЬ. Вперше доказано, що Са2+-АТРаза з високою г1дрол1тичною активн1стю 1 високою-здат-н!стю активно транспортувати йони кальц1ю мае каналоутворкяочий фрагмент.

Розроблено методичний спос1б одержання протеол!посом з г1-дрофобним фрагментом I за допомогою триптичного г!дрол1зу правиль но ор1ентовано! в л1посомах Са2+-АТРази,здатним э високою селекти вн1стю проводити йони кальц!ю за град1ентом концентрат'1. Пдрофо бний фрагмент II,одержаний 1а солюбШзованих препарат!в Са-АТРази СР тако'1 селективност! не мае.

СелективнЮть г1дрофобного фрагменту I до дво-,та однова- . лентних кат!он1в в1др!зняеться в1д тако! для вих1дного ферменту

к.

'Ялы® бишс HiiiLju.w аночекняы_ зм1:яуяня потенщалу-ревеос!ï- /яИ--------------

iip-hhî; ppecpcii v ир 1мм, c-.;'j ' ,.л„с- !ш до

рг-знюе цл.. лГРдзи i для пдрофобпоге С'Р^ • :нту/. »она!

канали.утворен! НдрофоЛиим ^рягыептсы в тл.;, проы>д<г.ь дьовалент i!i KaïioiM в так1й посл1доыю^т1 :

8а2 "> Ce?*' Mg2f> St2'> Cd2' Та;:1 îki'îôîтора кальЩезк-- u.jïo:-:j с як лантан,кя,нмк{,

И1кард<ш1н ,Дг'К&МёТои1 Д i альм у ют;: проы£!о'.;;ъ Фрагменту до калька. 1нг10уй"ть ï'i також 1мунн1 антит1ла проти г1дрофобного фрагменту.

ыйодимО'»«* i. омtяокиолгсрносо ^"елу у*™ тч~ £p:ir:.:::;tli,/I i IL' .юк^она i-ч рханиця по М-шнцевих амНюкислотах, по здатностх зв'язувати нони кальцИо. Показано-, що фрагмент I на 40ам1нокислот довший фрагмента II на д!лянцШ5-505 ач!нокислотних аалшпк1в.

Зроблено припущення про те, що селективне проведения йон!в кальц!ю Саг+-АТРазою TicHo эв'язано з П д!лянкою перв!сного лан-цюга м!ж 455-505 ам1нокислотними аалишкаыи.

ОСНОБНI ПОЛОЖЕНИЯ,ЯК1 ВИНОСЯТЬСЯ НА ЯАХКСТ:

- роярг.Ска н-туода од*р»якчя г1дро<;Обнсгс фрагменту Ол-

лГРази, peKOliCTp'VîîCLfiiiOî р .Ш[ос."-мал :

- т.~го,шо цоп ч'.'лгмент Оа АТРаги - канл/^Р^.^роч '-!v

пу калыпевнх клн-1. !"ih;

- •-•бгрунтушшя лс;;а;пзаии дШг.ки Са~ +-ЛТРа&и,яка румов-

чоhhv с-лектишистъ Оа-АТРази та и г1дрофионого фраг

мс-иту, к!ж '166 - 5С5 амШокислотяими валивками.

АГУСГ'ДЩП Р'ОБОТн. Осношп iio.îiOv.ei'HP росотц внкладот s обговорен! H ci'

1/ IV Всесоюзн1й конференцП по спектроскоп!'! б!опол!ме-

piB. (XspKiB,lQ8i).

ZI V Роеоор?ч1й конфвренц1 ' ao ôicxixiï м'ябШ. (Te.uaui, .

3/ VII Всесоюан1й конференцП по еколоПчШй ф1з1одогП.

(Ашхабад,1939).

4/ VI Всесоюзн1й конференцП no OloxiMi'i м'яз!в. (ТбШс1,

1989).

о/ кижяародисму снмпоз1ум!. транспорт ftoHiB i мехач1вм йоге

регуляцП. (Тб1л1с!.1989).

б/ IX Всесоюзному симпов1ум1. Б1офизика i ôioxiMia бюлогР-

4HOÏ рухлиеост! /М'язове скорочення/. (1б1л!с!,

1990).

г- я- 2< s

7/ FEBS 20-th.(Budapest. 1990).

ПУВД1КАЦ11. Основний sMicT роботи викладейо в 31 науков1й пу-

бл1кац11 .

СТРУКТУРА I OB'ем РОБОТИ. ДисертацХйна работа включав розд!ли: вступ, огляд л1тератури . (4 п1дрозд1ли),,власн1 досл1дження (4 п1дрозд!ли), заключения,висновкл, список використано! л!тератури (240 джерел).Робота викладена на 195 стор!нках машинописного тексту ). Текст дисертацП 1люстровано 20 табличлм1.1 46 матонками.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ

Досл1дження проводили на CP б1лих/швидких/ скелетних м'яз1в статевозр!лих безпородних крол!в обох статей,масою 2-Зкг.

Препарати CP 1 Са2+-АТРази вид!ляли з допомогою в!домого метода /Ритов В.Б.,1977/.

BmIct б1лку в об'ектах досл1дження визначали за JIoypl/Lowry et all., 1951/.

Форму 1 чистоту препарат1в CP контролювали за допомогою еле ктронного м1кроскопу / Lewis, Knith,1977/;визначення активност!. Са-АТРази 1 притаманноЧ м!тохондр1ям сукцинатдег!дрогенази /Гу-лидова,Сорокина,1967/;а також 5'-нуклеотидази - фермента плаз матичних мембран /Song S.,1967/.

Реконструкц1ю АТРази в л!посомах зд1йснювали в процес! Ix фор мування в присутност! 10%-ного гл1церину /Ритов В.Б.,1982/. Л1по соми формували на колонц1 1э смолою Dawex lxü; 60-100 М2Ш.

Пдрофобний фрагмент 1 одержували з допомогою трипсинол1за Са-АТРази, реконсгруйовано! в л1посомах,в присутност! гл1церину а подальшим диференц1йним центрифугуванням продукт!в триптично-го г1дрол1зу, фрагмент II -через трипсинол!з солюб1л1зовано1 Са-АТРааи з посл1дуючим розд1ленням на колонц1 з1 смолою Sephadex G 100.

Розм1ри Сг-АТРази i протеол!посом визначали за допомогою опти чного смешен!я /Левчук Ю.Н.,1981/.

Одержану п1сля триптичного г!дрол1зу сум!и б1лк1в досл!джува ли з допомогою електрофорезу в пол1акрилам1дному гел! /Weber,Osbo. гп,1969; Loemly,1970/.

Ам1нокислотний склад Са-АТРази, гидрофобного 1 г1дроф!льного фрагмент1в визначали на анал1затор! ам!нокислот ААА-881 /ЧСФР/в1д пов!дно в1домим рекомендаЦ1ям /Печенова и др. ,1987;Лукас,Сотело,

1982/;вм1ст N-KiHaeoHX ачШокислот та ЯН-труп - в1дпов!дно э доао могою в1домих метод!в /Edman,1970;Fllman,1953/.

АТРавну актиан1сть препарат)в CP,Ca-ATРази визнача ли за /Martonozi, VanderCoui,Fere-Los, 1964/.Про не! судили по твид коси накопичення неоргаШчного фосфату, кЫьюсть яксго визначалн за допомогою в!домого weTofla/Fiske-Subbarow,lQ£5/.

Концентрац1ю в!льних йон!в кальц1ю задавали з допомогою Са-ЕГТА буферу /Болдырев,1977/.

1нтенсивн1сп поглинапия Сай+мембранними препаратами 1 вив1 льнення його визначали.застосовуючи метод радюактивно! м!тки,вик ористовуючи i5Ca2+/Martonozl, Vandercoul,Feretos,1964/.

Питому рад!оактивн!сть зразк1в вим1рювали з допомогою р1дин-но-сцинтилляЩйного л1чильника SL-4000 "INTERTECHNIQUE"$paHiUfl.

Одержан! результата обробляли,застосовуючи загальноприйнят! методи вар!ашйно1 статистики/Кокунин В.А.,197Б;Плохинский,1980/.

К1льк1сть д!лянок i константи эв'язування йон1в кальцйо ви-зкачаяи з допомогою в1домого метода /Scatchard,1949/.

Антит1ла проти Пдрофобного фрагменту одержували.вводячи вну тр!шньошк1рно п1вням 1 куркам /маса 1-2 кг/ фрагмент в протеолхпо сомах/ 1 мг б1лка/з повним адьювантом Фрейнда з тижневим 1нтер валом на протяз1 1,5 и1сяц1; останн1й раз вводили внутр1шньом'я-зево. В досл1дах використовували сироватку кров! птиц1 1 глобул! ни (igG) !з жовтка яець.

Взаемод1ю антигена 1 антит!ла доол!дкували а допомогою К1ль-KlcHo'l реакцП эв'язування комплемента в MiKpOBaplaHTi/Levls.van Vunakls,l967/.

Шиск! б!шаров! л!п!лн i мембрани формували з допомогою в!до-мого методу /Mueller,Rudin, 1964/.На отвор! д!аметром 0,6 мм в те-флоновгй склянц! 1з розчину сум1ш1 фосфат ид 131X0 л 1 ну 1 холестерину / cniBBiflHooieHHH маси 2:1 /в п-гептан!.Концентрац1я Л1п1д1в в роз чин1 - 20 мг/мл.

Омиваючий №1 розчин micthb 10 мМ трис-НС1(рН 7,4) i необ х!дну к!льк!сть хлоридiB метая!в.Внутр!шн!й об'ем скляночки,залов нений водним роачином,становив 1 мл,об'ем зовШинього роэчину -9 мл.

В робот! використовували хлорсрЮнх електради,як1 збергга-лись в 2 М KCl з агаровим мостиком 1з 3%-ного розчину агар-агару в 0,2 М КС1.Поляриэац1йний потенц1ал м1ж електродами не перевищу-вав 1-1,5 мВ.

Швидк1стъ трансмембранного потоку■ вим1рювали за допомогою

операШйного п1дсшаовача, який дае амогу рееструвати потоки до 1 п1коамлера(пА).Р1знщдо потентатов подавали на мембрану в!д дке-рела.яке давало вмогу одержувати посПйну'напругу/до 100 мВ/,абс папругу.яка лпййно змШовапася 1а шввдкгстю 100 мВ/хв,що контро-лювалось цифровим вольтметром Щ-4300.Штенц1ал на електрод1,який енаходиться всередин! тефлоновса скляночки/з трьох стор!н мембра-ни/,приймали рШшм 0.

Струм реестрували на двокоординатному саыописц! типу 620,0.2 (Ш).

Для вилучення ферменту,який не встройся в мембрану,та зм1-ни йонного складу розчину з цис-сторон» мембрани застосовували ме тодику перфузП БЛМ.описану ран1ше (Мюллер, 1961).Перфуз1я 100-т£ мл розчину забезпечувала повну його зам! ¡¡у з цис-сторони мембран»

У вс1х дослгдах фермент 1 протеол!посоми вводили в ком!рк^ в цис-сторони БЛМ.ВмЮт б!лку,який мав високу Са-залежну АТРазщ активн1сть, складав 20-100 нграм/мл.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ ХАРАКТЕРИСТИКА САРК0ГО1АЗМАТЙЧ НОГО РЕТИКУЛУМУ ШВИДКИХ СКЕЛЕТНИХ М'ЯЗШ I ЙОГО Са-АТРази

На електронних М1крофотограф1ях ультратонких эр1з1в осад: фрагмент!в СР ф!ксованого глутаральдег1дом в 0з04. знайдено за) кнен1 везикули д1аметром 0,1-0,2 мкм/мал.1/.

Б1лковий компонент Са-транспортно1 АТРази складав в цих препаратах 60-80% загального вмЮту быка /мал. 2/.

Питома активн!сть Са-АТРази в везикулах С( досягае 1-2мкмол: Р1 на 1 мг б!лка за 1 хв 1нкубацП при 37°С/табл. 1/. Фрагменте р тикулуму в присутност! АТР 1 мг2+ поглннають 1.0-1.5 мкмоль Са2 за 1 хв на 1 мг б1лку /табл.1/. Електронном1кроскоп1чними доел дженнями показано,то одержана фракц!я СР практично не м!стить м1 тохондр1й 1 плазматичних мембран.Про це також св1дчить в!дсутн1с в н1й активност! сукцинатдеПдрогенаэи 1 б'-нуклеотидази/Бопг Б. 19б7/.Досить висока активШсть МАВН-оксидази - тестмаркерного фе менту ретикулуму. В препарат! виэначали також дом!шки актом!о

6

----- •• ттж^

НХЛ. 1 ЕиетггронноьШфо-

cKOiuuHa фотогра

•Jiia nponap?.tiB саркоплаэ матичного ретикулуму а»-летним »'яг1в »ролика.

X 40 ООО

зину.який мае високу Са-валеж-ну ЛТР-1"!Г/ Xli'.iiiUiClb.S liiKüi метою дгхШджувади вплив роэчи-н!в pisno'i йонно! сили на АТР-азну активн!сть ретикулуму i

МАЛ.2. Електрофореграма б1лк!в СР 1 Са-АТРази

1 саркоплазматичпий р«тикулу« г - Сг.-АТРаза

ГС1 ATPai öijjo!: iE

t'Jla

гз

щ

ш

N

("Ч'Й

PI

■!

J-

sktjmlwhhy ■ впяьил'.'оь в присутпо от! Marale при »исок1й йыщХй силя (0,6 М) активШсть ферменту актом!о тну росте,а ретикулуму не змпшеть сяД, наппаки при наявност! йон1£-кальц1ю /табл.2/. Це св!дчить про в!дсутн!сть- у препаратах ретикулуму актом1оэииу, що узгоджуеться з дан-ними л!тературк /Needham D.M.,Сояк-wel L.M., 1956/.

Са-АТРаза, видз'лена 1з СР,зг!дно даних е.дектрофорезудйстить незначШ доьпшки iiiumя б1лк1в/5-10%/. ЛкгивнЮТь П складала 3-5 мкмоль Pi/мг бз.лку за 1 хв /табл.1/.

Про чистоту Са-АТРази говорить також 1ммунох1м1чн1 досл!ди.Як видно з мал. 15, зв'язування антит!л з антигеном виражаеться одн1е>1

3-У-2/ 7

А

кривою, що говорить про наян1сть антит!л т!льки одного виду.

Проведеними нами досл1дженнями показано,що функц!ональна ак тивн1сть Са- АТРази в л1посомах,сформованйх 1з загальних л1п!д!в мозку( оптимальне вагове сп!вв1дношення бШж-.лШд 1:4)блйзька до тако! 1з загальних л1п1д1в СР швидких скелетних м'яз1в.0днак оск1льки одержання загальних лШд1в 1з СР трудом!стке 1- епряже не з техн1чними труднощами.а результати реактивацПСа-АТРази п!д час реконструкц11 П в л1посомах, сформоваш ; 1з л1п1д1в СР 1 мо-8ку однаков!,в подальших досл!дженнях використовували фракц!ю загальних л!п1д1в мозку.

ТАБЛЩЯ. 1 АКТИВНЮТЬ ТЕСТ - ФЕРМЕНТ № ФРАКЦ11 САРК0ПЛАЗМАТИЧН0Г0 РЕТИКУЛУМУ ШВИДКИХ СКЕЛЕТНИХ М'Я31В КРОЛИКА /М+ м з Б Д0СЛ1Д1В/

ТЕСТ-ФЕРМЕНТ |ГОМОГЕНАТ | М1Т0Х0НД | СР | Са-АТР | I I PiX I | аза |

I I II /солюб/ |

Са-АТРаза мкмольР1Умг. хв

Ю.8Ю.07 | - Ц.3+0.11 | 3.04±0.3б| НАКОПИЧЕННЯ Са2+ мкмольСа/мг.ХВ

| - | - 11.4±0.13 | - | 5'-НУКЛЕОТИДАЗА мкмольР1/мг.хв

|0.6±0.05 |1.0±0.07 |0.06±0.01| 0.05±0.0 | НАД-Нг-ОКСИДАЗА 10~7 М/мг.хв

11.110.17 |1.9±0.36 |1.1±030 | 0.6+0.14 | СУКЦИНАТДЕГ1Д /I Е550.60хв/мг

РОГЕНАЗА |9.8±1.7 |21.0±1.9 |1.2±0.4 | 0.6t0.21 |

1онофор А23187 1 1%-ний дезоксихолат натр1ю/Д0Х/ приводять до р!зкого виходу накопиченого кальц!ю.

Однак АТР-г1дрол1тична активн1сть Саг+-АТР-ази,реконструйо вано'1 в л!посомах без глШерину, Майже вдв!ч1 нижча,н!ж солюб!-л1зовано!/табл.З/. Найб1льш в!рог1дною причиною цього може бути р!знонаправлена ор1ентац1я молекул АТР-ази в л1посомах.

Щоб уникнути цього ми зд1йснювали реконструкц!ю Са2+-АТРа-зи в л1посоми,як описано /Ритов В.Б.и др.,1982/.В холатний розчин загальних л1п1д1в мозку,який м!стив 10% гл!церину 1 СаСЬг,вносили Са-АТРазу.Сумгш пропускали через колонку 1з смолою Dawex 1:1,50 -

Ь

ТАБЛИЦЯ.2 В1Ш1В Й0НН01 СШШ НА АКТИВШСТЬ АТР-ази АКТОМ 1ЮИНУ,САР КОПЛАЗМАТМЧНОГО РЕТИШУМУ, Са-АТРази СКЕЛЕТНИХ М'ЯЗШ КРОМКА /М*м 1з 5 ДОСЛ1Д1В//мкмоль Р1 на 1мг за 1 хв/

КАЛЫПЙ ! МАГН1Й

0.1 М КС1 | 0.6 М КС1 | 0.1 М КС1 | 0.6 и КС1

АКТОМ ЮЗИН

1.77±0.14 |1.5б±0.130 |0.83±0.01 Ц.46Ю.21 | > 0,05 | | < 0,05

САРК0Ш1АЗМАТИЧНИЙ РЕТИКУЛУМ 2.2210.13 |1.02Ю.075 |0.6Э±0.065 |0.65±0.056 | < 0,05 | | > 0,05

Са-АТРаза /СОЛЮБIЛ130ВАНА/ 5.4710.23 12.6010.11, 11.00Ю.076 ' |0.90±0.043

I < 0,05 | 1 0,05

100 МЕШ.При цьому АТР-Пдрол^тична активн1сть Са-АТРази як солюб1 л1зованих,так 1 реконструйованих в присутносп 10%-ного гл1церину препарат1В,а також швидк!сть АТР-залежного транспорту Са2+ в про теол!посомах 1 в везикулах СР близькь

Це моке св1дчити про те,що молекула ферменту в л!посомах ор1ентована переважно назови1,як 1 в мембранах СР,а саме:г1дро-Фобна частина /45 кДа/знаходиться в мембран!,прациауючи наск-р!зь,а г 1 дроф!льна /60 кДа/обернена в 1нкубац1йне середовище 1 до ступна для субстрат1в- Пдрол1зу -' АТР 1 переносу Саг+ .

Про вплив глЩерину на ор!ентац1ю Са-АТРаз п1д час встрою-вання в бШШдний тар св!дчать дан1 досл1дж'ень на ЕЛМ. Бстановле-но,що г1дроф!льна частина Са-АТРазй погано проводить йони каль-Шю, отже «изькопров1дна.Без глЩерину молекули АТРази встроюють-ся в БЛМ приблизно половина назовк! ком1рки<транс сторона) полови на в середину ком!рки(цис-сторона в1дносно л1посом - це зовн! л1-посоми).

• При внесенн! в ком1рку 10%-ного глщерину встроюваиня Са-АТРази зм!нк>еться 1 значна П частина /70-80?./ становиться в цих же умовах низькопров1дною,то0то ор1ентуеться г1дроф1льною части-ною в цис-сторону мембрани /мал.3/.На основ! приведених вище даних мокна зробити висновок: в присутност1 10%-го гл!церину Са-

ТАБЛИЦЯ.3 АТР-Г1ДР0Л1ТИЧНА I ТРАНСПОРТА АКТИВНОСТ! Са-АТРази САР КОПЛАЗМАТИЧНОГО РЕТЙКУЛУМУ ЗА Р13НИХ УМОВ РЕКОНСТРУКЦП

ПРЕПАРАТ

АТР-Г1ДР0Л13|ТРАНСПОРТ Са2+ мкмольР1/1мг|мкмольСа2+/ 1мг

за 1хв

за 1хв

/М+м 13 4 ДОСЛ1Д1В/

СШЮБ1Л130ВАНА Са-АТРаэа Са-АТРаза РЕКОНСТРУЙО -ВАНА В Л1ПОСОМЙ Са-АТРаза, РЕКОНСТРУЙОВАНА В ЛШОСОМИ.ШСЛЯ ОБРОБКИ ПРОТЕОЛ1ПОСОМ_ 1%-НММ ДОХ Са-АТРаза, РЕКОНСТРУЙОВАНА В Л1ПОСОШ В ПРИСУТНОСТI 107.-Г0 ГЛ1ЦЕРИНУ

5.8±0.2 3.2±0.4

5.4±0.5

5.2±0.55

?.5±0.2

5.3±0.4

АТРаза реконструюется г1дроф!льною частиною назови! лИюсоми.а Г1 дрофобною пронизуе П ст!нку .

Встановивши.що Са-АТРаза, реконструйована в л1посоми, здатна транспортувати кальЩй в АТР-залежному процес1,ми вир!шили доц1ль ним еивчити вплив окремих блокатор1в кальЩйових ток!в на Щй мо-дельн1й систем1. 3 великого числа блокатор!е були вибран! лантан

1 декаметон!й, як1 в!др1зняються своею природою,але взае-мод!ють з кальц1йзв'язуючими д1лянками/0ошопког е1 а11,1985;Скок, 1986/. Хоча обидва вони гальмують АТР-залежний транспорт кальц!ю /п!д '¡X впливом знижуеться константа швидкост1 реакцП .максимальна швидк!сть /,але характер '1к дП був дещо р!зним.

Так,декаметон1й пригн!чуе актиьний транспорт слабк1ше,н1ж лан тан: константа 1нг1бування лантаном/КЬ'була на порядок нижча, н!ж декаметон1ем(3.90*10"7±0.13*10_7М1'1.10*10~6±0 ЛОМО'^в^повШо) Лантан 1нг1буе активний транспорт кальц!ю конкурентно.Декаметон1й же 1нг1буе цей процес неконкурентно,причому д1я його п!дсилюеться за б1льш високих концентрац1й кальцш.Це можливо в тому випадку, якщо декаметон!й взаемод!е з кальц!йзв'язуючим центром,який зайня тий кальЩем.

В1домо також, що кофеТн.який стимулюе вив!льнення калыЦю 1з

р

МЛЛ.З ПСТСГОШ РОЗНО»!

лу пров!,яностп': ода

ИОКИХ ка!! ал ¡в, утворених

Са- АТРазоп В СКЫЕТРИЧНОМУ РОЗ'ПГНТ 1 им 0аС12П) 1

'■¡Ь' 0,9 ММ «.'¿012+10% Г7П ЦСРИНУ.НОРМ0ВАНА ПО В1ДН0-ШЕННЮ ЕЖЬ' ТРОПГСС1Д ¡С*Л г.И ГОоЧИН 1Б ид в.ч;.; ¡50 м'».

10 20 30 50

О лСм

СР.гальмуе його активне накопичення /Ритов 1977/.Нами вперше пока зано.що цей ефект спряжений ъ гаяьмуваннямАТР-г1драл1тично1 актив ноет! Са-АТРази.

Показано також.що добавления 0,1мМ кефеТпу в цис-сторони-'пр!'-цьому АТР-гтдролЬ'ична д!лянка рсзт«воваиа з транс-сторони/ -крен 1-" кв. принодить ло п1дви!5»:-иня чоовШост! модиф1ковано'1 Са-АТРа го*.» мембрани.Добавления к.офе'ту до и*чоди$1ковано1 мембрани на пр.; в!дн1сть ¡¡'V опливэе.

ис-ряконовтюь в можлньоот! реконструкц! 1 Са-АТРа?и _ л!ь> семах 1 в II с'2;:с.напрш>лсн1й срткг&цП ь них зг зберекенням АТГ--ззлежио'! траиспортно! актив^стьми ас<гл1дет.я такс*, мезшшу прше тн1сть Ферменту до пасиБНогс- ьивхлъненнл Са'-1"!» система СР.

Са-АТгаза.рекокютруйоьана ь лШисоми.сприяб п1двищенню Чх про никност 1 по в1дношенню до кальцию: вона на порядок и пор; г

ИЯНН1 з чиеппл! л1посок?^и,'.дкак 1ктенсклн1сть ьикоду катюна в 8 раз1в вк:ил,нк*. л1д ".ас входу/та*!».'}/.

Одержан! результата св!дчать про те.що Са-АТРазу молена роз-глядати як- молекулярну структуру,здатну приймати участь в пасивно му вив1льненн1 Саг+ 1з СР.

Щоб декпзати цс- б!льи грутговио,дослШузали Саг-*пров1д:псть АТР-ааа,рвкоиструйовано! в ВЛМ за Мюллером/1504/.Биявилосъ.що при введена! Са-АТРави в кемхрку & БЛМ зздбувавться стрибкоподЮне збгльшення швидкост1 трансмембранного потоку, який лочиваатьел звичайно через 2-3 хв п!сля внесения ферменту/мал.4/.

Сл!д в1дзначитити,що вилучити детергент /в даному випадку дезоксихолат натр!ю/,який застосовували п!д час вщЦлення фермен-

4-4-21

II

ту,пов1истю не вдаеться.тому були сумн1ви -може Шдвищешш провгд ноет! ЕЛМ - результат Ш детергента. В вв'язку з цим Оули поставлен! контрол!: зразки Са-АТРази,вид!лен1 в тих же умовах.але як1 збер!галися на протяз! доби при 4°С.Введения цих зразк!в в примем бранну д1лянку не впливае на Г! пров!дн!сть.Са-АТР-аза, одержана !з попередньо заморожених фрагмент1в СР.також неефективна .СтриО-копод1бне эбШшення проникност! БЛМ спостер1гавться т1льки при внесенн! в ком!рку св!жовид!лених препаратов АТР-ази.

МАЛ. 4

ПР0В1ДН)СТЬ БЛМ М0ДИФ1 КОВАНО'!: I - НЕАКТИВНОЮ Са2+АТРазою (MacLennan 1978); II - АКТИВНОЮ Саг<' АТРазою(влас

н! дан!);III - ДЕНАТУРОВАНОЮ Саг-+АТРазою(власн! дан1).

Проведеними нами досл1дами селективност! Са-АТРази по в!дно-шенню до дво-1 одновалентних кат!он!в показало,що БЛМ,ю модиф!-кована Ca-АТРазою,селективна до двовалентних кат!он1в/зм!щення потенц!алу реверс!! току при К+(цис) - 1 мМ,Саг+(транс) 1мМ дор! внюе 20±5 /табл.5/.

Йони кальц!ю ! кадм1ю конкурують за Са"+-селективний центр, чим пояснюеться слабке блокування в середоЕИдЦ з калыИем високо! концентрацПД виражене,ч!тке-за наявност! його в низьк!й концен-трац!'!.

Анал!зуючи дан! л!тератури 1 результати власних досл!джень,можна зроОити висновок.що вс! запропонован1 г!потези !ндукування виходу кальц!ю 1з СР не передбачають участ! специф!чного перенощика /Fa пег, Briggs,1983/, оск!льки Bin не може забезпечити необх!дну шви дк!стьсть процесу - 10~8 моль/см2за 1с.Думають,що цю функцш пови нен виконувати г!дроф!льний канал. Як такий припускаеться канал, який мае високу спор!днен1сть до поххдних д1г1дроп!р!дина /Falrhurst et al.,1983/,як! блокують потенц!алзалежн1 Са2+-кана ли в плазматичних мембранах /Костюк П.Г.,1986;Curt!ss,Catterall, 1984/, р!анодин- чутлив! канали(Ьа!,1989),г!потетичн! йонн! кана ли,як! демаскуються п!д час трипсикол1ву CP/Toog-oocl et al.,1682/; канали чутлив! до тапсигарг!ну /Thastruno 0. et all,1990).До них

..•ГАВЛИПЯ.-4- ПРКЯЯЗКСТЬ ЛШОСШ 3 РЕКОНСТРУЙОВАНШ В НйХ .'а-дТРаи с т.о кальцIñj Шч э ■; ДОСЛШБ»' V - нмоль Ca/i хв.1 мг 01лку; Vp -10~15 U -?а'смг хе;к, - хе"1

8 X i д i R И X ! Д

Пара ме- три Л1П0С0МИ i 1 ПР.ТГЁСЛНТСН соми АТРаза| 1 ЛГЛОСОМИ ПР0ТЕ0Л1 посоми i AIFasa IX дох

¥ 1 17.00 | ±0.12 | - 136.0 ±2.8 306.0 ±28.0

к 1.6*10~э ±0.1*10~э | 0.290 | ±0.003 | 0.027 ±0.0014 2.5 ±0.18 18.5 ±1.2

Vp 0.31 ±0.025 5.70 | ±0.5* j 5.30 ±0.4 48.00 ■сЗ.ОО 3GG0.0 ±140.0

* Р 0.05 по гЛдношеник', до л ПЭС01/:

/селеклившсть Са-АТРази ДО 2-валент-них кат юн 1 б-'

йон

АТРаз,

QCa / Gl

ТАВДИИЯ 5

змпцення потенц1алу

pebí;pcii и/кв/ i cnib-

В1ДНОШЕИНЯ ПРОВ1ДНОС-ТЕЙ / ПОТЕНЦ1АЛ НА МЕМБРАН? +100 нВ/, ЗА НАЯВНОСТI 1мМ

Ва2+ 0.S0±0.14 | CaCLg 3 TPAHC-CTOPO-

Саг+ 1.00±0.10 | НИ МЕМБРАНИ i 1 MM

Mg2+ • i.20±0,14 | 6.311.5 ДРУГИХ ХЛОРИДIB 3

Zn2+ 8.10±1.80 | ВДС-СТОРОНИ

Cd2+ 1.G2+0.60 |

к+ 1.06+0.20 | 20.0+5.0 /Оса, Qí " В1Д-

Б1ДП0В1ДН0/.

в!дносять i Са-АТРагу СР.зокрема í'i г1дрофобний фрагмент (de Msls Leopoldo,1991;MaeLennan,Reithmeeir,1982;Brandl et al, 1986).

Питания про каиалоутворююч1 властивост1 г!дрофобного фрагмен

ту 40-50 кДа i його селективиост! не ясне.ВиБчали ix в ¡коротких умовах видХлешга фрагмент1в триптичного г1дрол!ву Са-АТРази.До то го ж щ доел!дження проводились на фермент!,повн1стю позбавленому obo'ix функц!й: i Ндрол1тично1,i транспортно!.

Тому виникла необхшпсть пошуку умов реконструкцП Са-АТРа-зи i одержання П г!дрофобного Фрагменту для р!шення питания про вШюшення цього ферменту до пасивного транспорту Са2+в саркоплаз матичному ретикулум!.

ОДЕРЖАННЯ Г1ДР0Ф0БН0Г0 ФРАГМЕНТУ Са-АТРАЗИ САРК0Ш1АЗМА-

ТИЧНОГО РЕТИКУЛУМУ СКЕЛЕТНИХ М'ЯЗШ I ВИВЧЕННЯ ЙО^О : СТРУКТУРНИХ I Ф13ИК0-Х1М1ЧНИХ ВЛАСТИВПСТЕЙ.

Пошук умов одержання канально! структур« Са-АТРази CP прив!в до роэробки спец1ального методичного прийому.який эводився до реконструкцП функц!онально активного ферменту в лШосомах 1 посл!-дуючо! обробки протеолШосом трипсином на протяз1 5 кв.При елек-трофорез! б!лкови:< компонент!в протеол!посом i надосадово! р!дини в пол1акрилам1дному гел! fllAAT) виявлено два пептиди /мал. 5 /.Г1еп тид s Mr 40-50 кДа виявлено в прогеол!посомах,а другий.з Mr 50-60 KUa, - в середовищ! 1нкубацП.Бони практично не мають АТР г!дрол1 зуючо! здатност1 /табл.6/.

Зг1дно г1потетично'1 схеми локал!задП Са-АТРази в мембранах CP,фрагмент 45 кДа повн1стк> занурений в мембрану i формуе неселек тивний кат!онний каяал/Shamoo А.Е..Goldstein 0.А.,1377/.

Щоб перев!рити це припущення, ми внвчили здатшсть протеол1 посом,як! м1стять в соб! фрагмент 40-50кДа Са-/ТРази,проводите йо ни Са2+.Виявилось,що вже через 1-2 хв град!ент кальц1ю м!ж зовнШ нгм i внутр!шн1м середовищем протеолШосом вир!внюеться.

Протеол1посоми i л1посоми,оброблен1 трипсином в присутност! 1нг1б1тора трипсину 1з соевих боб1в,як про це сказано ран!ше, мають аначно меншу проникнуть до Са"+.

Блокатори кальтеьил tokIb - La2+,ed2+,HiKapfleniH,a також де каметон1й-1нП6ують кальц1еьу проь1дн1сть в протеолгпосомах з ri дрофобним фрагментом Са-АТРази на 70-90% .

Вкаэана вище висока здатнхсть г1дрофобного фрагменту 45 кДа проводити йони кальц!» наводила на припущення про те,«о в даному ьипадку п1д д1ею трипсину утворилась пора 1 в!дбуваеться проста дифуз1я кальцш.Зг!дно з даними л1тератури /Flelsher,1032;Gerdes, 1933;Eisenberg 1990/ просування йон1в вздовж каналу-не проста ди-

Т4

Фуз1я. Калмий, рухаючись вздовж каналу,взаемод1б з його фунгаио-нальними групм.ш.завдяки чему цей процес моде Сути описаний в тер м1нах реакцП першого порядку,а також к!нетики М1хаел1са-Ментена.

Враховуючи це.ми досл!джузали эалежШсть пасивного транспор ту калыцю через Пдрофобний фрагмент в1д його концентрацП.часу, присутност1 1нПб1тор1в калыдевих ток1в при вход! 1 виход1 ка т1она 1з протеол1посом.

Розрахунки показали,що константа швидкост! в лШосомах Суда 0,0016 кв'1, в протеол!псссмах а Са-АТРазою- 0,29 хв"\а с про геслЬюеома/ з Пдрофобним фрагментом 46 кДа 2,8 хв"1.

ЗПдно з цими даними.видалення Пдроф1льно1 /Пдрол1тично5/ частини ферменту приводить до росту швидкост1 пасивного транспорту калыпю через Пдрофобний фрагмент 45 кДа.який лишився в л1по-сомах.Вона вща,н!ж в л1посомах на три порядки.Вих1д Са2+1з проте ол!посом 8 Пдрофобним фрагментом перевшцував вх1д через нього в 4 рази,а проникн!сть - на порядок.

Про те.що при проходженн1 кальцИо через Пдрофобний фрагмент в1н взаемод!е з ФункцЮналышми групами його ст1нок,1 що це не проста дифуз!я, св1дчить 1 те.шо проникнуть через нього не»дося гае величин просто* дифузП 10~8М/см.2 сек.

За просто! дифузП Са2*на ВЛМ вольтамперна характеристика/ВАХ/мае вигляд прямо! л1н11 /мал.б /,в нашему ж випадку-це крива,що св1д чить про транспорт,Подальшу характеристик ПдрофоСного фрагменту 45 1\Ца ми одержали,досл1джуючи вплив блокатор!в кальцЮвих то к1в: лантану,кадмш, декаметонш, н1кзрдеп1ну-на пасивний транспорт йон!в кальц1ю через нього.

Наш! досл1дження показали,!®} лантан в концентрацП 10"4 М «ригнгчував пасивний транспорт качыаю через Пдрофобний фрагмент Са2*~-АТРази на80-90%;знижубться максимальна швидкЮть транспорту, та И константа,а також величина проникност1 протеол1посом,Конста нта 1нг1бування при цьому дор!внювала 10"7 М.1нг1бування лантаном носить конкурентний характер, константа п1внасичення ПдрофоСного фрагменту зрастаеЮ. 12±0.009 мМ Са -контроль 1 0.29+0.016-досл1д) Ми встановили.щр другий в1домий 1нг1б1тор калыдевих ток1в кадм1й пригШчуе пасивний транспорт калыцю через Пдрофобний фра гмент: максимальна швидк!сть цього процесу знижуеться в 6-раэ1в в пор!внянн! э контролем,константа шввдкосп - в 15 раз1в,проникн1-сть в 16. Константа 1нг1бування складае 4*10~8М.При цьому кадм1й гальмуе пасивний транспорт кальц1ю конкурентное його присутиост!

кон стаита ¡Пвнасичення дсстов!рно шдвищуеться.Ц! дан1 п!дтвер джен!

МАЛ. Б ЕЛЕКТРОФОРЕГРАМА ПР0ДУКТ1В ТРИПТКЧНОГО Г1ЛР0Л13У Саг+-АТРази.

'■ОШШ

■Г--2 б

Препарат

1 - РНКаза 23 ООО Да;

2 - овальОумьн /мономер/-45 ООО;

3 - овальбум!" /д1мер/ - 90 ООО;

4 - Са-АТРага 105 ООО;

5 - г!дрофобний фрагмент СаАТР-

ази - 40 ООО- 50 ООО;

6 - г1дрофШнии фрагмент Са-АТР-

ази - 50 ООО- 60 ООО Да.

С0ЛЮБ1Л130ВАНА Са-АТРаза Са-АТРазз РЕКОНСТРУЙО-ВАПА В Л1П0С0МИ Са-АТРаза, РЕКОНСТРУЙОВАНА В ЛШОСОШ В ПРИСУТН0СТ1 10Х-Г0 ГЛ1ЦЕРИНУ Г 1ДР0ГОБ!ШЙ ФРАГМЕНТ 45-кДа Г1ДР0Ф1ЛЬНИЙ ФРАГМЕНТ 55 кДа

5,8+0,2 3,2+0,4

5,2+0,55

0,45+0,12

0,22+0,07

ТАШЩЯ. б АТР-Г1ДР0Л1ТИЧНА АКТИВШСТЬ ТРИПТИ-ЧНИХ ФРАГМЕНТ!В Са-АТРази /мкмоль Р1/мг.хв./ М±м из 4 Д0СЛ1Д1В

на БЛМ: кадмш 1нг1бус пасивний транспорт каль'Цю через г1дрофоб-ний фрагмент 4БкДа конкурентно як при вход1 /з цис- сторони/, так 1 при виход!/з транс-сторони.

Ми такоя еиявили,що декаметон1й,який блокуе кальвдйзалежний транспорт натр1ю/ТотПпэ еЬ а1., 1984/1 активний транспорт кальц!ю /Федоров и др. ,1Э80/,ефективно гальмуе пасивний транспорт калыЦю при вход1 його в лшосоми через г!дрофобний фрагмент 45 кДа;макси мальна шввдмсть процесу знилсуеться в 8 раз!в,константа шввдкост! в 4 рази,величина пронжност! в 40 раз.Константа 1нг1бування в да ному випадку р!вняеться 4*10~8 М.Як 1 в випадку з активним транспортом кальц1ю, 1нг1буючий ефект декаметмию в в1дношенн1 пасивно го транспорту через фрагмент 45кДа носить неконкурентний характер - константа п!внасичення в його присутност1 знижуеться.а д1я де-каметошю, на в!дм1ну в1д впливу кадмрю ! лантану,бхльш виражень

50

за наяЕност1 калыцю в ви соких концентрациях . Однак на вих!д кальвдю 1з

! 0;;ЬТ,и«!ЕГ-:1/- ХАРАКТЕРИСТИКА за просто! ди-ФУу П 1.1) : НАОИВНОГО ъ^наюрту чегсз пд-роювкий фрагмент

мал. 5

4С 1Ы«1 < И ! .

У/

протеол!посом через гЪпрсфобний Фрагмент декаметоШй впливае знач но слабкШе: константа швидкос?! транспорту знижуеться в 1.3 рази, а проникнуть в 1.2 рази.Константа 1нг1бування р1вняеться 6.ОБ*"5 М.тобто ви'да, н!ж за дП декаметон!» при вход! кальц1ю.

Припустимо це можпз по?сшт< шм.чс при 5 их од 1 15 протеадЬ лосем гЧлр^-^ки Фрагмент калыг-й 1накве Бзаемод1е ¡з

сиккдл" !ц>ого 1!-рагк-г»гу. I декане-усяп», «кии до того я мохе Д1ятн г11 .чъкк ъоы;;/;\Л!>11П5 , !&81. ,ье ъдаген гройитп такого к ыш ву,.{<: лги :!аспв«' »г/ ь'*о;;! к«лшп"> 1 ¿ютыюму Я.го накопиченн*.

Ин ггроинкнют! „ти/.сом З'-'КЯкс-'ЛУ-ии не йлл^па1-;.

Мкард^Пй е марке-! ом похвк« д!г1дроп1рк

к-.шовик гальинвих кан&я!в илабматичяих мембран ••Зс.Ыаг^, 1935/.

Згшта з ¡«»ультагами наших досл1лкс-ш> и:оддотн.гальмув па-сиьний транспорт квл^цш а протеолШосомк через г1дро<Ьобний $?г<г мент 4Б кДа Са-АТРази : максима.1«, яз й®игк1сть зпижувться в З.б ра яи.констздта швид.чост! а гг.проиикнЮть •• в 50 раз.Ксисхаата 1нП буланвя при цьому склодае 1.4-10 ^М.1нг1бування н1кардеп!ном носить пошеурентний характер: в високих концептраЩях кальц!й ани-жуе ефект 1нг1б1тора.

Таким чином, гхдрейюлннй чрагмехг 45 кДа С;ч- дТРаля е кянэло:.!, под'бшш д1г 1ДР0ПЛРШ«ЮВИМ !«н-;лп!.( мембран т- СИСГС-Ш.В1Д р:гниютьел вони один е1д одного маеою - для осгониього воиа ргвнн егься 200 КДа, ■ дек1лька субошшкць 1 т1лькй одна в пров1Д-ною.длл г!дрсфс5ного ¿с-атэюсу ~ 45 кДа.До того ж дШдроп1рид1но ьий канал ровтазоьакий в район! цистерн/осаджуеться з важною Фрак гДею СР при центрифугуванн!/.Ми ж працювали з легко» фракц1ею

5"*

Г?

CP,в як1й в основному знаходиться Са2+АТР-аза .

В!льш швидке ьив!льненнл кальц!ю в пор1внянн! !з швидк1стю входу може св1дчить про те,що каналоутворюючий фрагмент Са-АТРази Скелетних м'яв!в асиметричний.що дае йому можлив!сть структурно забезпечувати як активний транспорт йон1в кальц!ю,так i пасивний його вих!д а утворенням АТР.

Доапджена також зда?н!сть Пдрофобного фрагменту I вплива-ти на йонпров1дн! властивост! БЛМ.Цей фрагмент вводили в вигл?-;1 протеол!посом.В цьому випадку в1дбуваеться злиття протеол1посом з пласким 61шаром/Соколов,1982/,оск1льки виявляються дискретн! флук туацП току /мал.7 /, под!бн! описании для АТРази.

Однак частота утворення канал1в в БЛМ пситно нижча /особли во в розчин! хлориду кал!я/.Тому в кал!евому роэчин! встроювання Пдрофобного фрагменту зд1йснювали, вводячи сум1ш протеол!посом безпосередньо в примембранну д1лянку або добавляючи з цис-сторони БЛМ 5 мМ СаСЬс.

Вольтамперна характеристика модиф!кованих Ндрофобним фраг ментом БЛМ мае на графику такий же вигляд.як 1 для ц!льного фер менту .Це довволяе припуетити.що в протеол!пссомал з Ндрофобним Фрагментом,одержаним в результат! трипсннол!за реконстру йовано! б лШосоми АТРази, збер!гаеться потенщалчутлива д1лянка. Асиметричн!сть характеристики (БАХ)сЫдчить про збереження ор!ен тованост! п!д час встроювання Пдрофобного Фрагменту в БЛМ.

Кат!он-ан!онна селективность Пдрофобного фрагменту мало в!др!зняеться б!д тако'1 для вих!дного ферменту.Зм!щення потек-Шалу реверсП току при К+(транс)- 10 мМ; К'Чцис» 100 мМ р!вняеть ся 25±4 мВ для Пдрофобного фрагменту,а для fa-АТРэзи -30±2 мВ. Аналог!чн! эксперименти для Са-АТРази були поставлен! другими дос л!дниками/ЗЬатоо,MacLennan, 1974/(эм!щення потенц!алу реверс!! для Щльного ферменту 20 мВ/. Селективн!сть г!дрофобного фрагменту до дво-,одновалентних кат!он1в в!др1зняеться в!д тако! для вих!дного ферменту т1льки б!льш низьким значениям зм!щення потенц1алу ревер с!1/табл.7/.Йонн! канали.утворенн! г!дрофобним фрагментом в БЛМ, проводили двовалентн! катЮни в так!й посл1довност!: Ba2+> Са2+' Mg2+ - Zn2<" Cd2+ - К+ ^

Zn2+ 1 Cd2+ ефективно блокують т!к Са2+при Са2+fтранс)-1мМ, гп2+(цис) або Cd2+ (цис) - 1мМ,що було встановлено ! для Щльного ферменту.

Под!бну селективн!сть ми спостер!гали також з допомогою син-

ТЬ

тетичних — проникаючих йонГв/ФКБ'/! показали, що Ндрсфобнпй фрагмент Са-АТРази, включений в лнгосоми викориотаним нами методом, мае йоину селективн1сть под!бну кэльШевим каналам нейрон ¡в /Кос тюк П.Г. ,1986/ /мал.8 /: Ва2+>5г2+>Са21">1%2К'К+>На+ .

-АТРази; В РЮЧИНI, ЩО М1СТИВ 100 мМ КС1(Б) ;СТР1ЛК0Ю ВКАЗАНО М0-МЕНТИ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТУ.

У випадку з модиф1ковапими Пдрофобним фрагментом мембранами блокування пров1дност! йонами кадмш також виражено в роэчин! хло риду кая1я /мап.9 /.Разом з тим,пров1дн1сть г!дрофобного Фрагменту блокуеться кадм1ем слабше, н1ж нативно! АТРази.Мабуть.це можна пояснити зм!ною його конформацП и1сля в1дщеплення немемб-ранних д!лянок.Аналог1ЧИ1 результат» одержан! п1сля обробки трип сином реконструйованш АТРази.Разом з тим,зг1дно з деякими да-нкми 'птератури /ЗИалюо А. ,1974/ 1 нашим, гхдрофобнкй Фрагмент II Са-АТРази СР.одержаний п1д час г1дрол1зу трипсином П солюбШэо-вано! форми.тако"! селективност! не мае.На основ! цього можна було прииустити.що ггдрофобн! фрагменти Са-АТРази СР,одержан! за р1зних умов трипсинол1зу, структурно розр!зняються.

Виникла необх!дм1сть провести пор1вкяльне досл!дження Пдро-фобпин Фрагмент1в I 1 П Са-АТРази СР швидких скелетних м'яз1в кро ля,тобто,визначити "1х молекулярну масу,ам!нокислотний склад,М-к1н цев1 ам!нокислотн1 залишки, к!льк1сть ЗН-груп, а також досл!дити Са2+- зв'язуюч1 властивост!.

В результат! электрофорезу Пдрофобних фрагмент1в1 1 II Са-АТРази СРшв/'Дких скелетних м'яз1в_^кроля вияспилось, що молекулярна маса фрагменту I дето вшца,н1ж фрагменту II /мал. Ш/.Виходячи з рухливост! б1лк!в-св1дк1в, можна ор1ент.овно оц!нити молекулярну масу фрагменту I як 50 кДа.а фрагменту II - 45 кДа.Обидва фрагмен ти практично не мають АТР-г!дрол!тично! здатност!.Дан! триптично-

м

в

МАЛ. 7 ОДИНОК I !'А НАДИ , ЯК!

УТВОИСЮТЬСЯ в влм ГИД НТОЯЕСМ: Са-АТР ази В Р03ЧИН1, ЩО М1СТИВ 1 мМ СаС12 (А); I Г1ДР0Ф0БН0-ГО ФРАГМЕНТУ Са2+

ВЩНОСНА ПРОНИКНУТЬ.:%

tlo2+

*го

ICO

«о £0

olL

I Sr2t

Со2+-I

Л

' Na+

Bq2+

_Sr2+ Цд2 +

Zn2 + k-

I i ""

МАЛ. 8

В1ДНОСНА 'ПРОИКК-НЮТЬ ПРОТЕОЛШОСОМ 3 ГIДР050БНЫМ ФРАГМЕНТОМ I i II до

ЙОН1В Ба"+ , Ca2+,Mg2+,Zn2

Ьг-

Na+

го Г1дрол1эу /5'/солю бШзовано! Са-АТРази та посл!дуючого елект-

I г ; <

ТАБЛВД 7 8ШЩЕННЯ П0ТЕЩ1АЛУ РЕВЕРСИ U/мБ/ Í В1ДНОШЕННЯ ПРОВII КОСТЕЙ /ПОТЕНЦ1АЛ НА МЕМБРАН 1+100 МВ/.ЯК1 ВИНИКАЮТЬ Б ПРИСУТН0СТ1 1мМ CaCLg 3 ТРАНС-СТОРОНИ МЕМВРАНИ 1 1 мМ ДРУГИХ ХЛОРИДIB 3 ЦИС-СТОРОНИ /бса. Qi - В1ДП0ВЦШ0/./М+м 13 Б Д0СЛ1Д1В/

ЙОН АТРаза ИДРОКВКИЙ ФРАГМЕНТ

GC'a' Gi и Gca''Gi и

Ва2+ 0.90Ю. 14 0.7БЮ.06

Са2*" 1.00+0.10 1. ООЮ. 05

1.20Ю.14 б.ЗИ.6 1.24Ю. 30 4. ОЮ. Б

Zn2+ 8.1011.80 7.5010.50

Cd21 1.9210.60 1.78+0.30

к* 1.96±0.20 20.015.0 1.3510.20 16.0Ю.5

рофорееу св1дчать про те.що гХдрофобний фрагмент,одержашш п!д час г1дрол1эу Са-АТРази, реконструйованоТ % лШосоми, в1др1зняеть ся в!д одержаяого п1д час г1дрол!зу солюбШзованоТ Са-АТРази тим, що пргетичо 'сшадаеться з одного компонента, а друтий з део.ч /мая.10/.

3 результат1ь ам1нокислотного анал1зу викодить.що г1дрофоб ний фрагмент I приблиано на 100 амИгакислотиих залиаки довсий,н1ж Фрагмента 11/422 i 324 атноккслотних заяишки в!дпов1дно/табл.^/ Особливо р15наться ц1 фрагмента по к1лькост1 таких галшшв,

л/: ■-i;.;/:-\! : ¡к.\U-.'¿'j i !6.' I ':Y.,Í> "< r '"S i >: '

a tó^iíóHid/io i о/.В пдрофобному Фрагмент!' на три ггт*п». п 'р ) ч] мент i i; .'rmoof.OcHO ьч методой Ьлняна,

Вия.*«л«-;ц;»я И Ktuu^fci'K <->'.>Hf'KV.-jJiuTHKx залкшиь фр<и-мент1в 1 1

П .....- nvx ямл1: oefxvi сумии . <ilt..¡ /m'-vi.:-¿\

'он г; г'Чу ■ í ,'¡.í ^^ i - }!•• <:,: 'v.íviíi'ri : ü kihu'j^j ;ч • i •, ги.ао'п! ¡¡^e\ ^¿¿üjjiciii о чиновному вал!ком/59Х/ i аланпюм /32%/,з незначн1й К1ЛЬКОСТ1 виявленп riCT""«M \ r.Cn^psríHOL", ,'U»/ /¡.¿л, ;л wum" '"и"

Судячк по вмЮту !1-к1нцевих атнокислотних залигак1в/мал.11/, фрагмент I СИлыи ст1йкий до дИ трипсину, Hi ж фрагмент II.3 допомо гою методу электрофорезу на пластинах ПААГ /Лемл!,1970,/,який мае б1льш високу доззоляючу эдатн!сть,показано,що фрагмент 11 склада-еться в псптид1в,як1 дещо в1др!зняються за молекулярном масою/44 i 47 кДа/,а до складу фрагменту I входять пептвди.як! мають практично однакову молекулярну масу (50 иДа),( мал.10).

Приймаэти дс урлгя одаряю I д^нп !мгл. 10 i IS*» i анзл1Рв,»ги :¡Of>iV лмшелгдо'т/ .ioojiijiOBüicri) Оа-АТРйЗИ CP/Rrnnol . 1Q96/,MO;r:ií] iü'Ktíy .'ТИТ/, го .j.f.rM4iT í представлений в оснс«1-к^му л пома С-к1пц» г;».н Пол i п'. гл ['.лши >»р»«л»ту.як1 утворилися п1д чя" рогдапленн^ подшей гиеныо я:«ш»га по зс'.чгя-лх Lys 465-Val 466 I Arg1 ¿63 -А 1л 409 i ,у>к!лык.1!л мг,;ор!г.»«и в«?чгнонтами,эдертдшши при оодадь ¡bCf'-y тг,т»~и(1'.«1з; »rcsasiix вище г.ол!пептид1Е.До Фрагменту И в на •лому «чт.чцк/ 6 основному входять С-к}нцев1 íparnc-яти молекули wtuy.rfKi угк-рилисл оа ра;;у:юк rinprvjiey эв'-^ку A;g COS-Ala 506 i розщеплення зв'язк!в Arg 556-Asp 557,Lys 550-Gly 551 1 Lys 515-Gly Ria /M?.Ü. \?J.

Сокмолить догний з momhrhx.dio гходлть до окладу

пдрэфосакн'о фрагменту ií пол1пептид1в,не мае йонно! селективнос-т1,а фрагмент I проявляв цю властив!сть,можна думати.що д1лянка, яка включав эалипки ам!нокислот 465-505 пол1пептидного ланцюга 61,пку 1? с"Г.тп1 стм Cn-ATPasn селегаввсо прзгидяги йочч

капъц'к-. PobMiiueiiim uio'j ;ч л.-лгкк fo-i гЛ С.э-АТРази, panp~nonow-üoí М^Лс-икансы ßüaacuiO на мал. 13.

Д!лпя№> г1лрс£о0яогу фрагмг-нту i /'465-505/,яка нзд?е йому С^ - оелгчглшп сть,мIcTiiTb трд «шпики глутайассо! кислоти.Мо* на припустити.щр один i3 них або вс! вони можуть визначати здат-HiCTb г1дрофобного фрагменту селективно зв'язувати 1 проводити йо ни Са2+ .

1пА о -го 1 й ЬА V 1 / * f /иг — -«о -го « 1 и« W У /л 20 У/ Uflfi

1пА го уо -s а »О it « У ' V^L* ¿¿-—"^ -но -го 20 4о ■го 40 -ÍD г II В t

20 « ! / ■го Uni ■40 •lo го чо i г и

МАЛ. 9 ВШИВ КАДМГО НА ПРОНИКНЮТЬ Ш М0ДИФ1 КОВАНОí I-' Са-АТР-АЗОЮ, I I-ПДРОФОБНйМ ФРАГМЕНТОМ.

I-A - 1 В СИМЕТРИЧНОМУ Р03ЧИН1 KCL;2-B ТИХ ЖЕ УМОВАХ 3 ЦИС-СТОРОНИ МЕМБРАНИ ДОБАВЛЕНО 2 мМ OdCLa-I-B - 1 В СИМЕТРИЧНОМУ Р03ЧИН1 10 Ш CaCL2;2 В ТИХ ЖЕ УМОВАХ 3 ЦИС-СТОРОНИ МЕМБРАНИ ДОБАВЛЕНО 2 мМ CdCLg.

II - Г1ДРОФОБНЙЙ ФРАГМЕНТ Са-АТРа^[,П03НАЧЕННЯ TI Ж.

Про це також св1дчать результат« визначення констант 1 д!ля-нок вв'язуванНя йон!в калыцю в г!дрофобних фрагментах I i II: по казано.що в фрагмент! IÍ центр!в зв'язувалня йон!в кальЩю э висо кою спор1днен1стга менше i константа зв'язування його в цих цент-

22~

пах h®"j:,-ií)ü в Фрагмент! j/тйОл.«/.

f-дрн! дан i датть нгч"яив!сть эапроис'нувди ¿цшич того rlsroTisv Са-ЛТРазп,яч реконстр/^оьано! б aiпасомн,так i со-.i;''i6i..i¡iao::a:bм Г кпн. 14).

З&жнйьши в АТРаз1 aMiHoracjioTHi залишки перв1г.«пго "•''«'»".п а - Д'1 Г'а^и лг.'гчми,»«к1 ¡rv пчскга/лъ г;м!:1 фарми П аалскула -.!а.к,""Г

МАЛ. 10 ЕЛЕКТРОФОРЕГРАМА Г1ДРОЮБ-

(-IMV фр/Ч'МСртТР ÍVTj-nyf/.«««"

ШД ЧАО ОБГОБКИ ТРИПСИНОМ Са-АТР ази CP ШВИДКИХ СКЕЛЕТНИХ М'Я31В КРОЛИКА, РЕКОНСТРУИОВАНО! В ЛIПОСОМИ /ФРАГМЕНТ I (5,6)/ 1 СОЛЮБIЛI30BAH0Í /ФРАГМЕНТ И (?)/.

1 - ТРИПСИН /23 кДа/;

2 - КАТАЛАЗА /60 кДа/:

3.4 - Оа-ДТРала/ЮО кДа/

чан'1999) покапав,п;а замi на амХиски'.-пот в шяожетмх "09,771,700, 799,^00,908 приводить до поело! ьтратн тропопортн"! i г1дрсл1тп-Hoi функцП 0а-АТРа?и.

зг1дпо 3 Н'ЮПМИ данимн рилуч«?<ш! Д1ДЯККИ nepBiciioro яашдоа • 'а~АТР"чч в положениях 465-£00лриводить до -»трати мкаи- з ьисоким onopjдненннм до |альц1ю,ко ь повнЫ Mipi iiiдтворджусться данлки í.'a¡; Деннзча,якнй показав,що ai.siua амшокислот 309 i 7/1 молю ¡юру шити функц1ю д1лянки Са-АТРази,яка делить м1ж цими ам!нокислотами з Тиму Ч11СЛ1 i д tлянок •íF.R-fiOti.a» установлено наша

Таким чином, г i драК^ний ((фрагмент Са-АТРаан саркопла-'мггичцо-го ретикулуму швидких скелетних м'яз1в кролика, одержаний оброб-кою ферменту трипсином п1сля його реконструкц!! в л1посоми (фрагмент I),в!др1зняеться молекулярном масою в1д г!дро4обного Фрагмен ту.одерканого п1сля г i д рол j у/ о ojlioOI л i зовано! фсрми ферменту (фра гмент I í).

Фрагмента I 1 II псм!тпо р!зияться к1льк!стю залдашв л i -вину, прол1ну,гл1цину,лейцину,мет1он1ну i цисте!ну.В фрагмент! II внявлеиа ыенша к!льк1сть центров високоэф!нного вв'язування Са2+ ,i константа зв'язування нижча,н!ж у фрагменту I.

Виходячи з установлено! первЮно! структури Са-АТРази CP

1 2 3 4 5 6 7

ТАДШЯ. 8 АМ1Н0КИ0Л0ТНЯЙ СКЛАД Са-АТРази CP I П Г1ДР0ЮБНИХ ФРАГМЕНТ IB I i II

AMIНО- Ca - ФРАГ- ФРАГ-

КИСЛО АТФАЗА МЕНТ МЕНТ

ти I II

Lys 49/54/* 20 12

His 7/12/ 3 2

Arg 35/БО/ 23 23

ASP 48/89/ 30 26

Thr 47/62/ 21 23

Ser 60/57/ 24 22

Glu 84/99/ 37 28

Pro 42/46/ 26 16

Qly 63/67/ 32 35

Ala 78/86/ 37 35

Cys 18/24/ llAAiV 8***

Val 78/82/ 32 28

biet 24/34/ 15 5

Ile 67/72/ 33 27

Leu 90/95/ 49 31

Туг 20/22/ 11 11

ТгрН.о.**/14/ H.O. Н.о.

Phe 33/36/ 18 15

ВСЬОГО 833/1001/422 ЗАЛИШКИ .

* В ЛУЖКАХ ПРИВЕДЕН I ДАШ РОБОТИ /BRANDL,1986/ ** НЕ ВИЗНАЧАЛИ *** ВИЗНАЧЕНО ЗА МЕТОДОМ ЕЛМАНА /1959/.

МАЛ.11

N-KIHHEBI АМ1Н0КИСЛ0ТН1 ЗАЛИШКИ Г1ДР0Ф0БНИХ ФРАГМЕНТ IB I 1 II Са-АТФаэи СР ШВИДКИХ СКЕЛЕТНЫХ М'Я31В КРОЛИКА.

О

©

Asp ûlu Thr î E Gty 4U Ьeil 6m ser Туг Trp Val Pro

МАЛ.12

пршстший ПЕПТЙДНИЙ СКЛАД Г1ДР0ЮБНИХ ФРАГ КЕНТ IB, ЯК1УТВ0РИЛИСЯ П1Д ЧАС ТРИПТИЧНОГО ri ДРСШЗУ Са-АТРази, РЕКОН СТРУЙ0ВАН01 В лшосоми /I/ ТА СОЛЮВ1Л130ВАН01 /II/.

/ McLennan, Reithmeer, 1932; Brandl et al.,

19бв/ам1нокислотного складу 1 М-к1нцевого анал!зу П г1дрофобних фрагментов, мокна припустити, що д!лянка 465-505 ам!нокислотних

CXhMAlílHHE РОЯМШЕН НЯ <ЁН/'МШУ 4Cü-f>'Jíi нл e.?.-Aivaan,

РАПГ^ТНЮ^ Mí ' '1 ) !" ■

-Ч . l-r.-f . Olí - дглянка перетво рения, пф - фосфор:: .шОвйнмЯ . Г« !Н- ,°г ' "су вання нуклетвд!в,ОСК - зв'яаування каль-цш,0Ш - шари1ра,ГТ0 -Пдрофобна трансмем-Сранна д1лянка./Мак Леннан,1986/.

ТАБЛ.9 ЗВ'ЯЗУВАННЯ Са2+ Г1ДР0Ф0БНИМИ ФРАГМЕНТАМИ I i II Са-АТРази;(М±м 1з 4 Д(УЛ!Д1В )

I КОНСТАНТА ЗВ'ПЗУВЖ! | I !04 M'1 I

зв'г^увлння

:Р ¡ ТРАГ- I ФРА Г ■ I I МЕНТ IIМЕНТ И!

I. HÍCGK0Ï СПОРIЛНЫ!0СГ I 17300.01 4300.0! 1340.0 ! П. СЕРЕЛНЬО! СПЭРЩ1ЕН0СП i 18,0| 39,61 110,0 | Ш.НИЗЬКО! СП0Р1ДНЕН0СТ1 ¡ 0.Я1 2,0!

ЗВ'ЯЗУВАННЯ

ШИРИ ЗВ'ЯЗУБАННЙ, | нмоль/мг б!лку I

CP I ФРЛГ-!ФРЛГ- i

! МЕНТ 11 МЕНТ III

I. ВИС0К01 СПОР 1Д? TOîOCT I

i Î . СРЕДНЬО! тор ГДНЕНС.Я I

7,361 3,04 I U\0| 63,01 23,ô I

llI.HIi3bK.0l СП0Р1Д11ЕН0СТ1 |4b00,0| 427,51 328,0

запищав молекули Са-АТРази та П конформац!йна укладка визначають селективнЮть до Са2+ .

МАЛ.14 А-СХЕМА Г1ДРОЛ13У АТРази ТРИПСИНОМ В - Са-АТРаза В ЛШОСОМАХ I - Г1ДРОФОБНИЙ ФРАГМЕНТ

III - ПДР0Ф1ЛБНИЙ ФРАГМЕНТ

С - С0ДЮБШ30ВАНА Са-АТР аза;

II - Г1ДРОФОБНИЙ ФРАГМЕНТ

IV - Г1ДРСФ1ЛЬНИЙ ФРАГМЕНТ.

В1ШЮ АНТИТ1Л ПРОТИ Са-АТРази I II Г1ДРОФОБНОГО ФРАГМЕНТУ НА АКТИВНЮТЬ ФЕРМЕНТУ I ПАСИВНИЙ ТРАНСПОРТ КАЛЬЦШ

Як в1домо з л1тератури,специф1чних 1нг1б1тор1в для Са-АТРази таких,як для Na+,Kf-АТРази(тетродотоксин) нема. В цьому в!дношеин1 антитХла являться досить специф!чиими !нг!б!торами цього ферменту.

В сь!тл! развитку цих уявлень ми поставили coOi метою одержат« антит!ла до Са-АТРази CP i П Шрофобного фрагменту,a також вивчити '1х впдйв на Са-АТРазну активн!сть 1 Са2+ - пров1дн!сть в •досл!дах на модельних бШп!дних системах,

Виявилось, що антит1ла, одержан! проти солюбШзовано! Са-АТРази /АЛСагАТРази реконструйовано! в лШосоми /Б/1 ТТ Пдрофоб кого фрагменту /В/ в!дпов!дно, значно ефективнше взаемод1ють в солюбШзованою Са-АТРазою.Одкаковий р!вень реакцН .приблизно 70% /по oci ординат/ ф!ксацП комплементу,досяеазться за концентрацП солюбШзовано! Са-АТРази /0,006 мкг/мл/ /по ocl абсцисс/ на де-к!лька порядк1в менше,н!ж в присутноет! двох других И препарат1в /75 мкг/мл/.Контролем служила сироватка кров i нормальних курей з солибШзовако» Са-АТРаво;о. Низькдй р!вень взавмодП антит1л з ан тигенами, реконструйованими в л1посоми,може св1дчити про те.що ма ксимальна к!льк!сть регкцШгаздатних детерм!нант знаходиться на солюб!л!зован!й Са-АТРаз!,а cave в 'íí Пдрофобному фрагмент!.Це п!дтверджуеться i тим.що п!сля реконстругаШ Са-АТРази в л1посо-

6 utin.3? С

|Í5~0í)0|

J—i

'Ч 0%

ё Щ I Н

С

II у

- Л- ¡ЛдрофоСаиго фраггаенту ллдрофооний фрагмент,поябевлеиий л'п i д 1v.антитчла проти ип атр">.-:-и зб'л: ,,г. ; оол^э!

л«'оеояа:1 фермент, а сри ре-конотруки! I його в л«и"---«-мы*, прсцссха кож рхзко упов1льнюртт-ся.гт^ ср*д"итг ~ро "¡а,п. ~-.-/СГа-'а ргьан-гуорго! в л 1 пооома/ шенпо г1ярофо0н< г.- д1ля!)к.*\ ¡р: ,

■ иигначадссь шцо, ти доипджували також вплив 1ммунних т1л проти солюб1л1зовано']' Са-АТРази. г1лпофпбнпг<">

1 дьи^оми.ка и*.:инни" р"» 1 ««««г. в 1 з протеол!посом в пдрофобним Фрагментом 45кДа;на активн1сть солюб1л1бовано'1 Са-АТРази 1 актиьний транспорт каяыпю протекало сомами. Згшю з одержаними даними 1ммунн1 т1ла сир-сватки кров! проти пдрофобного Фрагменту- Т1льки б дуже висеких концентрац1ях 1нг1бують актнБн1сть Са-АТРази. Проте щодо активного транспо

г. .

рту Са*- вони ефективн! ще в розведенн! 1:600, коли пом1тно пригШчують цей процес. Сл1д в1дзначити,що в цьому випадку наш! результата узгоджують.-.я ъ даними ¡ЗшпМа,. »одеродмки р пссл1 ал:; на )- [У-.т 1 ■.!г/.п'/м 1.

"\:>цда.> такс*. ьстыкжлепо,»} 1>1МУ1»и 'Пла смроватки кров! про тк 1 а- А1 Ггг:и 1нг1''*'/""ть актившш тргшсиорт калыЦм, а"^ и-1 г-.плжа-кть на г и'.р'.'лгпгпг,' гцатнР:ть Ферменту. 1нг1бувания активного транспорту' калыию в експ-рим^нтач на везикулах гладких м'яглв ак'стерлгалн гакож 1нш1 д.-слШшки (УегЫз!,19851.

Япдно 3 одержаними результатами контрольна гипрваткя в рог; веиеич« 1:200-1:800 знижуе пасиЕний вх!д кальцЛо в лШосоми а пе-колструйованим в них г1дрофо0ним фрагментом Са-АТРази в середньо му на 35%; константа швидкост! резким складат 0,58 кг."1 , а максимальна швчакЮь - 0 32 мкмоль 'мг.чв.

Аптисироватки проти антш ен1в во1х 3-х форм в аналог1чних розведеннях 1нг1бують пасивний вх!д кальщю в протеол!посоми з г! дрофобним фрагментом на 84;83;187% в1дпсв1дно.Константа швидкост! реакцП в шх випадках ручалась 0. ^в"1;0,гс-хв"1;0,15Х1;"1;а мак симагьна швидкЛоь 0.21:0.2?; и 0 лгмкмоль/мг. ;:в в1дпов1дко.

Константа 1нг10уваннл 1ымушиши сироватками входу Са^+в протео л1поооми в 2-3 рази нкжче ¡аэнтроло/!: 449/. Так, для сироватки прети ссигобШзоваио! Са-АТРази вока сюшдае 1:131В, г1дрофобкого фрагменту 1:1045,проти Са-АТРази,реконструйовано! в лШосоми- 1:1859.

Це 1нг1бування носить конкурентом характер - аптит1ла конкурують з Са2+,внасл1док чого п1двищувалась константа М1хаел1-

са: 0,05 мМ в контрод!, 0,49 мМ в присутност! антит1л проти

г ъ &

МАЛ. 15 ВЗАеМОДШ АНТИТ1Л ПРОТИ; А - солюб1л1вовано'1 Са-АТРази; В - Са-АТРази реконструйовано!

в л1посоми; . В - Пдрофобного фрагменту;

3 АНТИГЕНАМИ:

1 - солюбШзованоЮ Са

АТРАзою;

2 - Са-АТРазою реконст

руйованою в лШосбми;

3 - Пдрофобним фрагмен

том.

4 - контроль (нормальна сироватка + 1.+2.+3)

солюб1л1вованоЧ Са-АТРази, 0,60 мМ проти Пдрофобного фрагменту, 0,54 мМ проти солюбШзовано! Са-АТРази в л1посомах.

в жовтка йбць не1мун!зованих $урей не впливають на па сивний вх!д Са2+в прогеолШосот э Пдрофобним фрагментом, Тод! як сиров-атка 1х кров! пригн!чуе його На 35%.Антитхла 18 жовтка проти Ндро-фобного фрагменту пригН1Чують пасивний вх!д Са2+ на 40%/0.38 ±0.02 6 мкмоль/мг.хв в контрол! 1 0.23+0.18 в досл1д1/,тод! як си-роват ка проти цього фрагменту - на 83Х/0.61 ыкмоль/мг. хв в кон-трол1 1 0.17 в д0сл1д1/.

Тут,мабуть,позначавться це 1 неспециф!чна д!я окремих компо-

кВ

пёнт!в сироватки кров!,здатиих впливати на проникн1сть СШп!д:го-го матриксу.

П1д час йивчення впливу антит!л ¡1а пасивний вих!д СаРл 5а л!посом показано б1льш, н!к РО%-не 1нг1бування /2.0+0Д4мкмоль/ мг.хв -контроль;1Д+0.10 мкмоль/мг.хв -досл!д/.Сироватка контроль но"! птша фактично не впливала на ней процес. Сироватка проти со-любШзовано! Са-АТРази /в розведет 1:200/ пригнхчуе вих1д Са2+на 52,67. /константа швидкост! реакцГГ 4.68хв_1-проти ?,1.0хв~г л контроле У макс - 1.1 мкмоль/мг.хв проти 2.0 мкмоль/мг. хр в гсоптро ль Ириблизно з так!й же мар1 цей процес пригн1чують сироватки проти г!дрофобного Фрагменту 1 Са-АТРази,реконструйовано! в л1по-соми. Це 1нг1бування носить 'неконкурентний характер -кальц!й в ви соких концентраЩях не впливав на д!ю 1нг1б1тора. Константа 1нг1бу вання виходу для сироватки проти солюб1л1зовано! Са-АТРази складае 1:200, сироватки проти Пдрофобного фрагменту - 1:254, для сйворо тки проти Са-АТРази реконструйовано! Б л1посоми - 1:581.

Р!зний характер !нг!бування входу I виходу Са2+ в протеол1-посомах з г!дрофобним фрагментом досить ц1кавий 1 може св!дчить з одного боку про стурктурну асиметр!» г!дрофобного фрагменту Са-АТРази СР,а з другого - про те,що м!сця селективного зв'язу гзання Са2+ експонован! на зовгишнш сторон! протеол!посом 1 дсюту пн! для конкурентно! взаемодП з аитит!лами.

Неконкурентне !нг1бування остшш!ми виходу Са2+13 протеол!-посом мокна пояснити конформащйними зм1нами г1дро({10бного фрагменту та Са-АТРази.

ВИСНОВКИ

1 Розроблено спос!б одержання препарат!в протеол!посом з переваж но однонаправленою ор!ентац1ею Са-АТРази саркоплазматичного ре-тикулуму швидких скелетних М'яз1в крол!в.Показана !х здатн! сть проводити йони кальЩю. I Ияяхом обробки трипсином протеол!посом з реконструйованоюСа-АТР азою саркоплазматичного ретикулуму скелетних м'яз!в одержано г! дрофобний фрагмент I ,який мае йонну селективШсть под!бно каль ц!евим каналам нейрон!в:Ва2+> ;Згг+~- ;Са2+'> ;М£2+> -Дп2+> -,На+. Пдрофобний фрагмент П.одержаний при триптичному г1дрол!з! со любШзовано! форми Са-АТРази саркоплазматичного ретикулуму та ко! селективност! не мав. Блокатори кальщввих ток!в:Ьа3+,Сс1г+,

н1карди л!н,декаметон!й на 70% 1нг1бували калъц1вву пров!дн1сть в протоол!посомах з г!дрофобним фрагментом Са2+-АТРаеи саркоп-лазматичного ретикулуму.

3.ВстаноЕлеиа р1зниця в ам1нокислотному склад1 г1дрофобних фрагме нт!в [III Са-АТРази: фрагмент I мае полШептидний ланщог дов ший в середньому на 40 ам!нокислотних залиитв,н1ж фрагмент П. В фрагмент! I б1льше залишк!в лизину,прол1ну,гл1цину, лейцину, на 20% б1льше ЗН-груп. Н-к1нцевою аы!нокислотою фрагменту I е в основному валхн, фрагменту II - аспараг!нова ! глутам!нова кис-лоти, а таксис аланхн 1 вал!н.

4.В фрагмент! И менше д!лянок вв'язувания Са2+високого споргднен ня,а константа 1х д!ссоц!ацП нижча.нщ в фрагмент! I. Зроблено припущення.що д!лянка м!ж 465-506 ашнокислотними зали шками молекули Са-АТРази ! П конформал!йна укладка визначають селективн1сть до Са2+.

5.3д!йснена реконструкц1я Са-АТРази ! протеол!посом а 11 Пдрофоб ним фрагментом в б Шаров 1 фосфол!п!дн! мембрани.Встановлено ак тивуючий вплив трансмембранного потенц!алу 1 йон!в кальцШ'иа встроювакня очищених Са-АТРази 1 г!дрофобного фрагменту.

6. Са-АТРаза саркоплазматичлого ретикулуму та П г!дрофобний фрагмент I створвють в ЕЛМ йонтранспортуюч! структури типу потенц! алзалежних кальц1евих канал!в плазматичних мембран збудливих кл.1тин,йи1 !нг!Оуються £п2+;Мп2+;Сс!2+ ! активуються кофе'Июм. Вперше встаяовлено !нг!буючий вплив кофе!ну на АТР-г!дролаз ну активн!сть Са-АТРази саркоплазматичного ретикулума.

7. КаныЦевий Канал,який формуеться Са-АТРазою та 11 г!дрофобним фрагментом I,- ас!ыетричний -вввдк!сть вйходу кальц!я з про-теол1посом з цими об'ектами перевжцувала ивидк!сть входу.

8. Антит!ла, одергг.ан! проти Са-АТРази та П г1дрофобного фрагменту 1,ефективно взаемод!ють з солюбШзоваиим ферментом; п!д час реконструввашш Са-АТРази ! П г1дрофсбного фрагменту в л1посо ми ця взаемод!я р!зко знимувалась. »

Зроблено припуцення.що !муногенн! властивост1 мае г!дрофобний Фрагмент Са-АТРази сарколлазматичкого ретикулуму.

9. Одержан! дан! св1дчать про те.що Са-АТРаза СР може приймати участь в пасивному вив1льненн1 Са2+ з СР м'яз1в.

50

ВЫВОДЫ

i Разработан choclo получения jjj«пиратов протео/пяс-чл« о кр-- и-муществешю одномат гчда-.шюй орлен .ацией сяй — лтрязи сарко-плавмятиЧеского рлтикучумэ бн^трих сксдгггтгс глгп пр.-»-??. Пола? лна их способно! "rf, проводят;- ионы калнлчя Hpi 'коро ста иасоаЕного Е^сда Caí> na порядок выше, чем его входа в протеолипосомы.

•> iiym^.i сбработг." ппал'гс;.; лр« ¿ силишйсом о ¡¿екино i nv иш домной Са2+-АТРазой саркоплазматического ретикулума скелетных мышц получен гидрофобный фрагмент (I),который обладает ионной селективностью подобно кальциевым каналам нейронов: Ва£+> ;Sr2+> ;С02+-> ;Zn2+>; К+-> ;Na+.

Гидрофобный фрагмент II, полученный при триптическом гидролизе солюбилизированной формы Са2+-АТРазы оаркоплазматического ретикулума, такой селективностью не обладал. Блокаторы капьпИ'-ьы« токов: 1аЗ+,Cd2*,никзрзяякя. догепкетс•

чнй на "01 инп!б|Ц-.'ьчкч кальин^зую проводимость i протес липе ~гмач с гидрофобным фрагменаом 0а2+- ATFasu сарксплазматн-ческого ре гикулула.

3. Установлено различие в змшхшслотнсн составе гидрсфюОиых Фрагментов 1 и 1! Са2+-АТРазы: фрагмент 1 имеет полипеп т;шну?.1 цепь длиннее в среднем на 40 аминокислотных остатков, ••.V. фрагмент II.В фрагменте I больше остатков лнзяча,нролина, глицина, лейцина, на 20% больше SH-rpym.N-кониевой аминокислотой фрагмента i является в основном валин, фрагмента II - аспарагиновая и глут»миновая кислоты, а тзмте агспия и

В цЛИН.

4. Со фрагменте II mcí!lil¿ участков связывания Са£+с высоким сродством, а константа их диссоциации ниже, чем во фрагменте I.

Сделано предположении. что уч^-ток между 46F-PQP гинпр-

пклотнымп остатками маккулы СаТч-АТРаси и ~е ксчЛ-армзшнач-нал укладка опр-.-деллю:' сс-лектиьность к СаСь

5. Осуществлена реконструкция Са£+-АТРази п прогеолипосом с ее гидрофобным фрагментом в бислойные фосфолипиднь'е мембраны. Установлено активирующее влияние трансмембранного потенциала

ST

и ионов кальция на встраивание очищенных Са2+-АТРааы и гидрофобного фрагмента.

б. Са2+-АТРаза саркоплазматического ретикулума и ее гидрофобный фрагмент ] образуют в БЛМ ионтранспортирующие структуры типа потенциалзависимых кальциевых каналов плазматических мембран возбудимых клеток, которые ингибируются Zn2-t-,Mn2+, Cd2t и активируются кофеином. Впервые установлено ингибирущее влияние кофеина на АТР-гидролазную активность Са2+-АТРазы сар коплазматического ретикулума.

. 7. йонофорные свойства Са2+-АТРазы и ее гидрофобного фрагмента I проявляют асимметричность -скорость выхода кальция из проте олипосом с этими объектами превышала скорость входа.

8. Антитела, полученные против Са2+-АТРазы и ее гидрофобного фрагмента I, эффективно взаимодействовали с солюбилизирова-Нным ферментом; при реконструировании Са2+-АТРазы и ее гидрофобного фрагмента в липосомы - это взаимодействие резко снижалось. Сделано предположение, что иммуногекными свойствами обладает гидрофобный фрагмент Са2+-АТРазы саркоплаз-матического ретикулума.

9. Полученные данные свидетельствуют о том, что Са2+-АТРаза СР Может принимать участие в пассивном высвобождении Са2+ из СР мышц.

СПИСОК ОСНОВНИХ P0BIT, 0ПУВЛ1К0ВАНИХ ПО ТЕШ ДИСЕРТАЦП 1. Федоров А,Н. Регуляция активности Ca2+,Mg2+-ATPa3U.//Биохимия животных и человека.Респ.межвед.сборник.-1978.-N 2.- С.84-90.

• 2. Федоров А.Н. фотографирование флюоресцентных пятен в ультрафиолетовом светр.//Рацпредложение.Киев,Институт биохимии ВН СССР.-1979.-N 31. 3. Федоров А.Н..Григорьева В.А., Ромась И.К..Буханевич А.М. Влияние с-АМР-зависимого фосфорилирования на Mg2+,Ca2+- АТРазнк активность, и Са2 накопление саркоплазматического ретикулума (СР) быстрых скелетных мышц. //Циклические нуклеотиды.Тезись до(аадов III Всесоюзного сишозиума(Канев, май 1980 г.) Киев. Наукова думка.-1980.- С.127.

4. Левчук Ю.Н.,Федоров А.Н..Курский М.Д. Размер Mg2+,Ca2+-ATPa3t по данным спектроскопии оптического смешения.//IV Всесоюзная ■ конференция по спектроскопии биополимеров.Харьков. 8-10 сентября,1981. -С.111. 5. Курский М.Д..Кондратюк Т.П..Осипенко A.A..Федоров А.Н..Три

--горьева-ВгА:"" Эндогенное" фосфорилиро.чание фрагментов саркоплазматического петикулума скелетных мшщ кролика,//Биохимия.-1382.-Т.47, N 1. -С.34-42.

6. Кондратюк Т.П..Курский М.Д..Федоров А.Н..Осипенко А.А.,Мешкова Л.И..Литвиненко Е.А. Характеристика субстратов эндогенного фосфорилирования фрагментов саркоплазматического ретиклума быстрых скелетных мышц кролика.//Биохимия. -1982. - Т.47, N" б.-С,950-956.

7. Федоров А.Н..Григорьева P.A..Ромась И.И.,Осипенко A.A.,Сдия-

ченко, H.H..Курский М.П.,Майков^ Л.И. Влияние сАЫР-зависимого фосфорилирования на активность Mg2+,Ca2+- А'ГРазы и транспорт Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме белых скелетных мышц кролика.//Укр.биохим.журн.-1984.-Т.56, N 2. -С.141-146.

8. Федоров А.Н.,Ромась И.И..Пискарев В.Б. Влияние с-АМР-зависи-мого фосфорилирования на функцию кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума быстрых скелетных мышц.//Био-

хим.механизмы регуляции генетической активности.Респ.симпозиум. Кане в. 22-23 мая 1984 г.

9. Ромась И.И.,Федоров А.Н..Пискарев В.Б. Роль протеолипида 68 кДа В с-АМР-зависимом регулировании активности Ca2+,Mg2+~ АТРазы и транспорт кальция в саркоплазматическом ретикулуме быстрых скелетных мышц кролика.//V Всесоюзная конференция по биохимии мышц.Тезисы докладов.Телави.-1985.-С.85.

0. Федоров А.Н., Курский М.Д.,Скок В.И. Влияние бис-четвертичных аммониевых соединений на Mg2*-,Ca2+-ATPasHK> активность и транспорт Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме скелетных мышц.//Докл.АН УССР.Сер.Б.Геол.,Хим.И Биол.Наук .-1985.N 9. -С.78-80.

1. Лишко В.К.,Федоров А.Н.,Курский М. Д..Бойцицкий В. М. .Пискарев В.Б.,Ромась И.И. Канальные свойства гидрофобного фрагмента (Mr 40-50 кДа)Мг2+,Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика.//Докл.АН УССР.Сер.Б., Геол.Хим.И Биол.науки.-1986, М 5.-С.72-74.

2. Курский М.Д..Федоров А.Н..Пискарев В.Б.,Ромась И.И.,Бойцицкий В.М.Способ получения гидрофобного фрагмента Mg2+,Ca2+- АТРазы саркоплазматического ретикулума с:елдетных мышц.// Рацпредложение. Киев. Институт биохимии АН УССР.-1986.-N 220.

3. Курский М.Д..Федоров А.Н.,Бойцицкий В.М..Пискарев В.Б..Ромась И.И.Са2+-транспортирующие свойства гидрофобного фрагмента

40-50 кДа Са2+АТР-азы саркоплазматического ретикулусма скелетных мышц кролика.//Биол.мембраны -1987.-Т.4, H 11.-С.1189-1194.

14. Войцицкий В.М., Федоров А.Н., Курский М.Д. .Кучеренко Н.Е., Тугай В. А. .Ромась И.И. .Назаренко М.М. .Пискарев В,Б. Участие Са2+-АТРазы и ее гидрофобного фрагмента в освобождении Са2+ из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц.// Биохимия. -1988.-Т.55., N 9. - С.1427 - 1431.

15. Войцицкий В.М., Федоров А.Н..Кучеренко Н.Е. .Курский М.Д., Хижняк C.B..Пискарев В.Б.,Ромаcl И.И. Канальная функция гидрофобного фрагмента Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика в ранний период воздействия рентгеновским излучением.//Радиобиология.-1988.Т.28, N. -С.450-4Б4.

16. Войцицкий М.Д. .Назаренко М.М. .Курский М.Д. .Кучеренко Н.Е., Федоров А.Н.,Тугай В.А..Пискарев В.Б..Ромась И.И. Проницаемость гидрофобного фрагмента Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мкпц кролика для ионов Са2+, К+ И Na+.//Молек. генетика и биофизика. -1988. -ВЫП. 13. -С. 3-8.

17. Федоров А.Н.,Курский М.Д. .Захарченко А.Н..Луговской Э.В., Дерзская С.I'. .ГГискарев В.В.,Ромась К.К.//Структурные и физико-химические особенности гидрофобного фрагмента Са-АТРазы скелетных мышц,получаемого при различных условиях ее гидролиза трипсином.//Биол.мембраны.-19S9.-Т.б,N U.C. 1154- 1159.

18. Шатурский 0.Я. .Курский М.Д. .Федоров А.Н. .Мешкова Л.И. .Пискарев В.Б..Чактурия А.Н.'Канальные свойства Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мыац кролика.// Докл.АН УССР.Сер.Б.Геол.,Хим. и Биол.науки.-1989.-N 12,- С.67-70.

19. Преображенская Т.Д. .Войцицкий В.М. .Федоров А.Н. .Пискарев В.Б. Влияние радиации йа стимулированный выход Са2+ из везикул саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика. //VII Всесоюзная конференция по экологической физиологии. Тезисы докладов.Ашхабад. Ылым.-1989.-С.249-250.

20. Федоров А.Н.,Ермекова В.М. .Диброва Т.Л. .Пискарев В.Б. .Ромась И.И. Кальциевая проводимость гидрофобного фрагмента Са2+~АТ-Разы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика.//Транспорт ионов и механизм его регуляции.Тезисы докладов международного симпозиума.ТСилиси,9-12 ноября.Мецниенре-ба.-1939.-С. 79.

Федоров А.Н.,Диброва Т.Л..Ермекова В.М. .Пискарев В.Б.,Ромась Й.И.//Ишунохимическая идентификация гидрофобного Фрагмента 40-50 кДа С'а-АТРаги саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролей./'VI Есесоюзнал конференция по биохимии мышц. 5-7 декабря 1989 г., Тбилиси,1989,-С.

Шатурский 0.Я.,Курский М.Д.,ДиОрова Т.Л..Федоров А.Н..Пискарев В.Б..Чаитурия А.Н. Ионпроводящие свойства Са2+-АТРазн саркоплавмчтичесюто рохикул^ма ^кел^пшх ыьшц проликя и ^ пшрофобнгп фрагмента. / /Биол. мембраны. -1990.-T.7.N 9, -С.933-944.

Войцицкий В.М..Федоров А.Н..Луговской Э.В..Дерзская с.Г., Хижняк С.В. .Курский М.Д..Кучеренко Н.Е. Влияние ионизирующей радиации на структуру гидрофобного фрагмента Са2+- АТРа-зы саркоплазматического ретикулума. Радиобиология.-1990. -Т.30, N 1. -С.16-19.

Шатурский О.Я..Курский М.Д..Федоров А.Н. .Мешкова Л.И. .Пискарев В.Б. .Чантурил А.Н./'/'Влияние трансы-мСрачное потенциала на пассивный транспорт ионов через бпслойные липидниг мембраны мед ифиипроЕ анные Са- ДТРагеО саркоилаг мат ичес i :ог о ре тик-; лу -Мл. • - Есесок'сньш симпозиум сноФигпка и биохимия биологической подвижности- мышечное сокращение•.Тбилиси.- 1990.-0.63. Schatursky u.J.,Kursky M.D. .Pedorov A.N. .Meshkova L. 1. ,!Jis-karev V.B..Chanturija A.N. Ionconductive properties of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase of rabbit skeletal muscle and it's hydrophobic fragment.//FEES,20-th .meeting of tne federation of European biochemical societies.Abstracts.Budapest ,Hungary,august.19-24,1990.-P-Th. 273. Тугай В.А.,Федоров А.Н.Роль Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц в транспорте кальция.//Биохимия животных и человека.Респ.межведомственный сборник.-1990.-N 14.-С. 11-23.

Войцицкий В.М. .Федоров А.Н..Степанов Ю.В..Назаренко М.М., Преображенская Т.Д.,Мельничук И.В..Кучеренко Н.Е. Участие Са2+-А1Разы и ее гидрофобного фрагмента в регуляции мышечного сокращения.//IX Всесоюзный симпозиум.Биофизика и биохимия биологической подвижности /мышечное сокращение/. Тбилиси. -1990. -С. 57

О.Уа. Schaturskii, М. D.Kurskii.A.N.Fedorov,V.B.Piskarey.A.N. Chanturya.The ion-conducting properties of Ca2+ ATPase in

S5

rabbit skeletal muscle sarcoplasmic reticulum.Biomedic, Sience.-1991.-V.2.-p.374-378.

29. Федоров O.M. ,Чевп1ло I.A. .Курський М.Д.Механ1зм Ш-укцИ ' можлив1 молекулярн! структури, що заОезпечують вих!д кальц 1з саркоплазматичного ретикулуму м'яз!в.//М1хв1домчий зб1рн! "Моледаярна генетика i б1оф1зика.-1992.-Вип.17.-С. 42 - 50

30. Федоров О.М. ,Чевп1ло I. А. .Шатурський О.Я.,П1скарьов В.В МешковаЛ.I-Вплив 1нг1б1тор1в кальц!йвих канал1в на функщ Са2+-АТРази саркоплазматичного ретикулуму скелетн; м'яз1в.//Укр.б1ох1м. з'1вд. Тези допов!дей.-1992.toiB.Вида УСТА.ч.1С.103.

31. Курский М.Д. .Диброва Т.Л.Ермекова В.М..Чевпило И.А..Шатурск .0.Я..Афонина Г.Б..Пискарев В.Б. Влияние антител прот

Сае+-АТРаз и ее гидрофобного фрагмента и пассивный транспо Са2+.// Укр.бИО XHM.KypH.-1992.-T.64,N 6.-С.48-54

Jtf^

Шдп. до друиу ci OX ti . Формат 60 X 84'/,

Ilanip друк. № 3. Спос1б друку офсетний. Умовн. друк. арк. 1,0%. Умовн. фарво-в1дб. J, . Обл.-вид. арк. Л,О . Тираж <3.0 .Зам. № У-Л . Бсзплатко.

Ф1рмц <ВШОЛ» 252151, КиГв, «ул. Волинська, (¡0.