Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль трансмембранного переноса протонов в клетке на ранних этапах репродукции и ингибирования активности вируса гриппа

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль трансмембранного переноса протонов в клетке на ранних этапах репродукции и ингибирования активности вируса гриппа"

РГб од

1 /} ШОП "¡393 АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ГОРЕВА Людмила Николаевна

РОЛЬ ТРАНСМЕМБРАННОГО ПЕРЕНОСА ПРОТОНОВ В КЛЕТКЕ НА РАННИХ ЭТАПАХ РЕПРОДУКЦИИ И ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ГРИППА

03.00.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1993

Работа выполнена в Белорусском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ, Минск

Научные руководители - Действительный член Российской АМН,

профессор В.И.Вотяков

- Доктор биологических наук .В.А.Кириллов

Официальные оппоненты - Доктор биологических наук,

профессор С.Н.Черенкевич

- Доктор биологических наук, профессор В.М.Мажуль

Ведущая организация - Институт вирусологии РАМН Защита состоится " /! " 1993г. в

/Г часов на

заседании специализированного совета Д.006.05.01 по защите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии АНБ по адресу: 220733, г.Минск, ул.Ф.Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АНБ.

Автореферат разослан - " у^ " /¿АЛ 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Л.М.Шейко

С Институт фотобиологии АН Беларуси

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы«- В настоящее время считается точно установленным, что вирус гриппа проникает в клетку путем рецепторного эн-доцитоза. При этом генетический материал вирусной частивд, попавшей в клетцу в составе эндосомы, оказывается отгороженным от цитоплазмы двумя барьерами - мембраной вирусной оболочки и эндосомы. Следующим этапом в онтогенезе вируса является высвобождение вирусного генома в цитоплазму, так называемая стадия раздевания вируса гриппа. Хотя механизм активации вирусного генома окончат пьно не установлен, доказано, что раздевание вируса гриппа триггируется снижением внутриэндосомального рН I Апси-с(, Ш?.). Несмотря на

то, что звкисление внутренней среды эндосом впервые показано И.И.Мечниковым более века назад, природа этого явления до сих пор не выявлена.

Известно, что вирусы не обладают способностью вызывать снижение рН среды. В то же время закисление окружающей среды активно мета-болизирующимн клетками - широко распространенное явление и показано для организмов самого различного происхождения: бактерий, дрожжей, высших растений и животных клеток. Одной из причин закисления, ранее признававшейся единственной, является выброс конечных продуктов метаболизма, имеющих кислую природу, например, молочной кислоты I Соч!«^, ). В дальнейшем для бактерий, дрожжей и растений был показан иной механизм - энергозависимый векторный перенос протонов Н*"- АТФазами ( 'клггчто, 49<$о ). В клетках животных одним из основных механизмов закисления среды является Иа+/Н+- обмен, протекающий с участием мембраносвязанного переносчика чувствительного к амилориду (/^п НсгДго^Миггг, ). На данный момент в науч-

ной литературе отсутствуют работы, в которых показано возможное участие вышеописанных клеточных систем в закислении внутренней среды эндосом.

Установление природы снижения внутриэндосомального рН, необходимого для реализации стадии раздевания вируса, позволит выявить неизвестные ранее физико-химические механизмы развития и регул)щии размножения вируса гриппа в клетке. Это создает условия не только для поникания механизма действия уже известных противогриппозны?-препаратов, в частности, ремантадина, но и для целенаправленного поиска и отбора ингибиторов активности вируса гриппа среди веществ,

блокирующих процессы закисления.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является выяснение механизма снижения внутриэндосомального рН и выявление возможности ингибирования гриппозной инфекции на стадии раздевания вируса гриппа путем торможения процессов закисления.

Поставленная цель достигалась путем решения следующих задач:

1. С помощью потенциометрического метода исследовать природу процесса закисления среды инкубации фибробластами эмбрионов кур.

2. Показать участие процессов закисления, осуществляемых мембрано-связанными системами фиоробластов эмбрионов кур, в снижении значений рН внутренней среды вируссодержащих эндосом.

3. Изучить возможность реализации антивирусного действия известного противогриппозного препарата ремантадина посредством блокирования процессов закисления.

4. Показать симбатность эффектов подавления закисления среды клетками и ингибирования репродукции вируса гриппа в клетке, что позволит выявить новый ряд веществ - ингибиторов процессов закисления, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гриппа.

Научная новизна работы отражена в следующих положениях, выносимых на защиту:

Закисление внутренней среды эндосом, формирующихся при инфицировании фибробластов эмбрионов кур вирусом гриппа осуществляется в результате функционирования Ка+/Н+- обменника и за счет диффузии молочной кислоты.

Одним из путей реализации антивирусного эффекта противогриппозного препарата ремантадина является подавление процессов, ответственных за закисление внутренней среды вируссодержащих эндосом.

Вещества, подавляющие процессы, ответственные за снижение внутриэндосомального рН, обладают выраженным противовирусным действием в отношении вируса гриппа.

Практическое значение. Разработанный подход к проблеме химиотерапии вирусных инфекций позволяет вести целенаправленный поиск и отбор ингибиторов активности вируса гриппа среди веществ, подавляющих процессы, ответственные за закисление внутренней среды вируссодержащих эндосом.

В результате исследований выявлен новый класс ингибиторов активности вируса гриппа - ингибиторов обмена и гликолиза.

Обнаружено, что соединения, относящиеся к калийсберегающим ди-

уретическим препаратам - амилорид, верошпирон и триампур обладают выраженной противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, что очень важно для химиотерапии и фармакологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторних процессов" ( Минск, 1988); Пленуме проблемной комиссии АМН СССР "Химиотерапия и химиопрофилактика гриппа и ОРЗ" ( Ленинград, 19Б9); Всесоюзном симпозиуме "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" ( Рига, 1989); Конференции "Биофизика мембран" ( Каунас, I99J); IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ ( Рига, IS9I).

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в Э работах.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы, насчитывающего 207 наименований. ¡«атериал изложен на 125 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 7 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И' МЕТОДЫ ИССЛВДОВАН'ЛЯ

Фибробласты эмбрионов кур ( ФЭК) получали из отдела культур клеток и питательных сред БелНИИЭМ МЗ РБ. Использовали двухсуточную монослойную культуру для вирусологической части эксперимента и сус-лензию трехсуточных клеток для биофизических исследований. ' Вирус гриппа штамм A/FPV Rostock ( H7NI) был получен из коллекции лузея вирусов института вирусологии АМН СССР. Вирус культивировали з аллантоисной полости IO-II суточных эмбрионов кур. ' В работе были использованы следующие вещества и препараты: ами-юрид ( Мв 266,1), уабаин ( Мв 728,6), иодацетат ( Мв 166,1) -'Сигма" ( США); ортованадат-натрия ( Мв 400), оксодолин и диакарб в форме таблеток) - отечественного производства; фуросемид ( в Ьорме таблеток) - Болгария; триампур ( в форме таблеток) - Германия; 'ипотиазид ( в форме таблеток) - Венгрия; противогриппозный препарат ремантадин ( Мв 217) был любезно предоставлен Я.Ю.Полисом ( институт органической химии АН1Латвийской республики); иммуноглобулин .-»ормальный - титр антител к вирусу кори 1:640, производства БелНИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РБ.

"рироду закисления среды клетками изучали потенциометрическим методом ( Антонов и др., IS75). Скорость трансмембранного перенос-протонов оценивали по смещению pH после добавления клеточной суспензии к изотоническому раствору..

- б -

Очистку и концентрацию вируса проводили по методу JCt'r>gsê«ry{ 1966). Осадок вируса суспендировали в 0,15 M растворе NaCf с рН 7,4.

Титр инфекционности вируса гриппа определяли методом негативных колоний под агаровым покрытием ( ЗМхг^еЩ , i960).

Исследование веществ на антивирусную активность проводили с помощью агар-диффузного скрининг-теста и методом редукции бляшек ( Вотяков и др. 1986).

Оценку проникновения вируса гриппа в клетку проводили по методу, основанному на инактивации вируса, не проникшего в клетку буфером с рН 2,0 ( SJephenson etа£. , 1976).

Начальные этапы взаимодействия вируса с клетками изучали с помощью электронно-микроскопического метода криофрактографии. Процедуры скалывания, травления, оттенения и напыления выполняли при вакууме 10~6торр на установке УЕЕ-4С ( Джеол, Япония). Реплики просматривали в электронном микроскопе ./Ш-ЮОСХ ( Джеол, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. ;

Для определения структурного состояния плазматических мембран использовали критерий направленности плоскости скола мембран { Кириллов, Конев, I9B4; Кириллов, 1990) и характер распределения внутримембранных частиц ( iranien , 1969).

Среднюю квадратическую ошибку высчитывали после троекратного повторения каждого опыта.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Участие диффузии молочной кислоты и КаУН*- обмена в процессе

раздевания вируса гриппа.

Потенциометрическим методом показано, что фибробласты эмбрионов кур С ФЭК) обладали способностью закислять среду инкубации как в присутствии, так и в отсутствие экзогенной глюкозы. С помощью ин-гибиторного анализа было выявлено, что протонофор карбонилцианид-хлорфенилгидр-^он ( ХКФ) не снижал скорость закисления среды клетками, как эть должно иметь место при выбросе протонов против градиента их концентрации, а напротив, резко повыпал ее. Классический ингибитор гликолиза - иодацетат практически блокировал закисление. Таким образом, закисление среды в присутствии экзогенной глюкозы связано в первую очередь с утечкой из цитоплазмы конечного продукта гликолиза - молочной кислоты. На рисунке I отражены результа-

ты измерений кинетики закисления среды клетками фибробластов эмбрионов кур в присутствии глюкозы.

рН С>05 Заселение среды

клетками ФЭК в присутствии глюкозы. ХКФ - 5 мкМ; иодацетат - I мМ.

--->—

В отсу'-'твие экзогенной глюкозы, за счет энергии эндогенных субстратов, происходит достаточно выраженный и продолжительный выброс протонов в среду. О том, что процесс закисления в этих условиях происходит за счет переноса протонов против градиента их концентрации, свидетельствует резкое снижение процесса

0,05рЦ

Рис. '¿. Закисление среды клетками ФЭК в отсутствие

Зми* глюк°зы.

--- ХКФ - 5 мкМ;

, ДЦВД - 0,5 мМ; амилорид - I мМ; ортованадат - 10 мкМ; уабаин - 0,5 мМ.

в ответ на внесение в инкубационную среду протонофора ХКФ ( рис, 2). Как видно из кривой 2, универсальный ингибитор протонных каналов ДЦЭД не снижал, а напротив - существенно повшал выброс протонов. Векторный перенос протонов против градиента концентрации может осуществлять также амилорид-чувствительный На+/Н+- антипорт. Действительно, при внесении амилорида мы наблюдали практически полное подавление процесса закисления среды инкубации клетками фибробластов эмбрионов кур, что указывает на решающее значение в исследуемом процессе функционирования Ка+/Н+- обменника. Так как движущей силой выороса протонов по механизму натрий-протонного обмена является градиент ионов натрия, необходимо было выяснить, как скорость закисления зависит от функциональной активности На,К- АТФазы плазматических мембран клеток ( рис.2). Ортованадат, который специфически блокирует На,К- насос, заметно снижал скорость закисления. Уабаин, который также избирательно ингибирует Ма,К- АТФазу, наиоо-лее эффективно ингибйровал закисление. Эти данные указывают на то, что в отсутствие экзогенной глюкозы значительный вклад в процесс закисления вносит Ма+/Н*"— обменник.

Таким образом, в присутствии экзогенной глюкозы подкисление осуществляется в основном конечным продуктом гликолиза, молочной кислотой, за счет диффузии ее протонированной формы в среду инкубации. Закисление в отсутствие экзогенной глюкозы - главным образом в результате функционирования высокоспецифической, гибкой системы контроля рН цитоплазмы: белкового натрий-протонного ^менника.

Учитывая кислотозависимость механизма раздевания вируса гриппа и то, что мембрана вирусиндуцированной зндосомы представляет собой вывернутый участок плазматической мембраны, можно допустить, что процессы закисления, описанные нами выле, используются вирусом на стадии раздевания. Кинетика закисления среды инкубации интактными и инфицированными вирусом гриппа фибробластами эмбрионов кур изображена на рисунке 3. Вирионы гриппа при добавлении к клеткам вызывают существенное снижение скорости закисления. При этом, вначале происходит пассивное защелачивание среды вирусной суспензией. Затем, через 5-15 сек ( в зависимости от количества добавленного вируса) после внесения вирусных частиц к клеткам процесс активного закисления восстанавливается, нос гораздо меньшей скоростью. Так, при множественности инфицирования 40 БОЕ/кл скорость закисления

рИ

7.4

7,3

/ мим

Рис. 3. Кинетика снижения рН среды инкубации нормальными ( I) и инфицированными вирусом гриппа ( 2) фиоробластями эмбрионов кур.

Толстой стрелкой отмечен момент внесения клеточной суспензии в клетку, тонкой - момент внесения вирусной суспензии.

среды клетками в отсутствие экзогенной глюкозы понижается почти на 70$. В , присутствии экзогенной глюкозы скорость снижается

на 50$. Как видно из данных, приведенных на рисунке 4, уменьшение

то

50

¿1

Л

!

гЬ

1

Рис. 4. Диаграмма зависимости отношения скоростей закисления среды инкубации фибробластами эмбрионов кур в опыте и контроле от множественности заражения вирусом гриппа.

I, 2, 3 - 5, 10 и 40 БОЕ/клеткй, соответственно.

а - закисление в отсутствие экзогенной глюкозы; б - закисление в присутствии экзогенной глюкозы. У0/Ук - отношение скоростей закисления в опыте и контроле.

о б а б об 1 2 3

скорости закисленил возрастает с увеличением множественности заражения клеток.

Связь снижения скорости закисления с эндоцитозом подтверждает специально проведенное исследование. При этом установлено, что иммуноглобулин, захватывающийся клеткой, подобно вирусу гриппа путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, вызывает подобно вирусу гриппа резкое снижение скорости закисления среды фибробластами эмбрионов кур как в присутствии, так и в отсутствие глюкозы.

Эффект снижения скорости закисления может быть связан с формированием в процессе инфицирования клеток вируссодержащих эндосом. Так, анализ электронно-микроскопических данных, полученных методом криофрактографии, позволяет проследить последовательность событий, происходящих на мембранном уровне на ранних этапах взаимодействия вируса гриппа с фибробластами эмбрионов кур. Вирусные частицы при инкубации с фибробластами эмбрионов кур не вызывали перераспределение внутримембранных частиц. Однако уже на первых минутах взаимодействия вируса с клеткой на поверхностях скола обнаруживались необычные линзоподооные структуры около 70 нм в диаметре, вогнутые на ЕР - поверхности и выпуклые на РР - поверхности плазматической мембраны. Вогнутые и выпуклые„линзы" наблюдались на поверхностях скола клеток проинкубированных с вирусом гриппа в течение I и 3 мин и отсутствовали в пятиминутных образцах. Образование в гидрофобной области бислоя линзоподобных структур в процессе раскалывания плазматической мембраны инфицированной клетки происходит в результате перехода плоскости скола с гидрофобной зоны клеточной мембраны на гидрофобную зону мембраны вируса, а затем снова на гидрофобную зону плазматической мембраны клетки. При этом переориентация плоскости скола осуществлялась по переферии области контакта вирусной частицы с клеточной поверхностью. Другими словами, вогнутые и выпуклые "линзы" представляют собой фрагменты ИР - и РР - поверхности, соответственно, мембраны вирусной оболочки. Следует отметить, что структуры типа "линз" выявлялись только в местах инвагинирования клеточной поверхности. Поскольку переориентация плоскости скола биологических мембран связана с изменением уровня ван-дер-ваальсо-вых сил в гидрофобной области бислоя и указывает на изменение структурного состояния мембран С Кириллов, Конев, 1984; Кириллов и др. 1989; Кириллов, 1990) затруднение раскалывания плазматической мем-

&ны ФЭК по гидрофобной зоне в местах посадки вирусных частиц сви-тельствует о локальной модификации ее структуры. Изменения пластической мембраны клетки на микроструктурном ( инвагинирование) ультраструктурном ( переориентация плоскости скола) уровнях под йствием вируса гриппа завершались "отшнуровыванием" в цитоплазму руссодержящей эндосомы. При этом мембрана отпочковавшейся эндосо-представляет собой инвагинировэнный вывернутый участок клеточ-й мембраны. Эндосомы имели диаметр от 200 до 600 нм и, как это дно при поперечном раскалывании, содержали от I до 5 вирусных стиц. Другими словами, после адсорбции на клеточной поверхности д действием вируса происходит инвагинирование и локальная переройка плазматической мембраны в местах посадки вирионов. Процесс оникновения вируса в клетку путем виропексиса завершается форми-ванием в цитоплазме вируссодержащей эндосомы. Результаты наших спериментов свидетельствуют о патофизиологической значимости ви~ синдуцированной перестройки плазматических мембран для проник-вения вируса гриппа в фибробласты эмбрионов кур посредством эн- ■ цитоза.

Учитывая вышеизложенное, наблюдаемое снижение скорости закисле-я можно объяснить тем, что при проникновении вируса гриппа в кле-у внешняя поверхность участка плазматической мембраны в зоне нтакта с вирусной частицей после инвагинации становится внутрен-й поверхностью эндосомы, а внутриэндосомальное пространство по ношению к цитоплазме остается внешним. Это приводит к тому, что отоны и молочная кислота начинают поступать внутрь вируссодер-щих эндосом, закисляя их содержимое до критического уровня, не-ходиг го для высвобождения вирусного генома. Таким образом, снижение внутриэндосомального рН до критического овня, необходимого для реализации процесса раздевания вируса иппа, обусловлено по крайней мере двумя факторами: переносом отонов по механизму Na'Vtf4'- обмена и диффузией конечного продук-гликолиза, молочной кислоты.

Ингибирование активности вируса гриппа путем подавления нат-й-протонного обмена и гликолиза.

Время, необходимое для достижения порогового значения внутриэн-сомального рН, при котором происходит раздевание вируса гриппа,

определяется активностью процессов обмена и гликолиза. Мо-

жно допустить, что блокирование этих процессов приведет к ингиби-рованию репродукции вируса гриппа в клетке на стадии раздевания.

В качестве инструмента воздействия на процессы закисления был использован известный противогриппозный препарат ремантадин, обладающий мембранотропным спектром действия. Как видно из данных, приведенных на рисунке 5, ремантадин при добавлении к клеткам вы-

Рис. 5. Диограмма зависимости отношения . скоростей закисления среды инкуоации фи-бробластами эмбрионов кур в опыте и контроле от концентрации ремантадина.

I, 2, 3, 4 и 5 - 25, 50, 125, 250 и 500 мкг/мл, соответственно, а - закислекие в отсутствие экзогенной глюкозы; б - закисле-ние в присутствии экзогенной глюкозы. V0/VK- отношение ска ростей закисления в опыте и контроле.

зывает снижение скорости закисления. Ингибирующий эффект возрастал с увеличением концентрации препарата. В частности, ремантадин в коь центрации 50 мкг/мл ( максимальная переносимая доза для фиброблас-тов эмбрионов кур) только на 10% снижает скорость закисления. Препарат в токсичной концентрации — 500 мкг/мл полностью подавлял процесс закисления.

В дальнейшем было установлено, что степень угнетения процесса закисления возрастает с увеличением времени предварительной обрабо' тки клепок ремантадином. Так, предварительная обработка клеток пре

паратом в концентрации 50 мкг/мл в течение 5 мин приводит к снижению скорости на 2Ь%, а при тридцатиминутной обработке эффект повышается до 60-65% ( рис. 6). Обращает на себя внимание, что на-

Ш

75

SO

I

а б i

козы.

Jl

а б 2

I

[il

о 6 3

fl

а б А

Рис. 6. Диаграмма зависимости отношения скоростей закисления среды инкубации фиб-робластами эмбрионов кур в опыте и контроле от времени предварительной обработки клеток ремантадином в концентрации 50 мкг/мл.

I, 2, 3, 4 - 5, 10, 20 и 30 мин, соответственно. а - закисле-ние в отсутствие экзогенной глюкозы; б -закисление в присутствии экзогенной глю-

отношение скоростей закисления в опыте и контроле.

блюдаемый ремантадин-зависимый эффект снижения скорости закисления практически не зависит от энергетического метаболизма клетки, то есть нали^, л либо отсутствия в среде инкубации экзогенной глюкозы.' Снижение скорости закисления можно объяснить следующим образом. Ремантадин при инкубации с клеткамч, благодаря своей липофильности, встраивается в белково-липидную мембрану ( VJtimk, ¿int., 1974). Это вызывает модификацию физического состояния плазматической мембраны клетки ( Харитоненков, 1982), и как следствие, изменение транспортной активности глюкозного переносчика и натрий-протонного об-менника. Такое подавление активности мембраносвязанных систем приведет к понижению уровня образования молочной кислоты в результате дефицита субстрата для гликолиза и угнетение функции натрий-

протонного обменника. Описанная цепь событий в конечном итоге пр| ведет к уменьшению количества кислых продуктов, поступающих во внешнюю среду.

Следует отметить, что общеизвестное противовирусное вещество рибовирин, в отношении которого известно, что оно блокирует гриппозную инфекцию на стадии синтеза нуклеиновых кислот, а не разде' вания, как показали наши эксперименты - не вызывал снижения скорости закисления среды инкубации клетками ФЭК как в присутствии, так и в отсутствие глюкозы.

Дальнейшее исследование показало, что в максимальной переносимой концентрации амилорид - специфический ингибитор натрий-протонного обмена, ортованадат и уабаин - ингибиторы На,К - АТФазы I различной степени подавляли закисление как по механизму На+/^-обмена, так и за счет диффузии молочной кислоты С рис. 7).

Рис. 7. Диаграмма 3£ висимости снижения скоростей закислени* среды фибробластами эмбрионов кур под действием амилорида ( I ), ортованадата ( 2 ) и уабаина ( 3

а - закисление в отсутствие экзогенной глюкозы; б - закисле ние в присутствии эк зогенной глюкозы. У0/М отношение скоростей закисления в опыте и контроле.

Изучение противовирусных свойств ингибиторов натрий-протонного обмена, Нл,К - АТФазы и гликолиза методом агар-диффузного скринин теста выявило, что амилорид, ортованадат, уабаин и иодацетат обла

гоо

АО

I

л

I

Й1

а 6 а В а о 1 2 3

гают противовирусным действием. Об этом свидетельствовало, в частности, наличие зоны ингибирования образования бляшек. Приу-нен з иетода редукции бляшек, позволяющего количественнс оценить антивирусную эффективность веществ, показало, что амилорид, ор.ована-цат, уабаин и иодацетат подавляют инфекционность вируса гриппа более, чем на £5% ( табл. I). Специальные вирусологические исследования otk. ít Л., 1975) подтверждают, что изученные нами

Таблица I. Антивирусная активность амилорида, ортованадата, уабаина, иодацетата и ремантадина, выявленная методом редукции бляшек на культуре клеток фибробластов куриных эмбрионов, инфицированных вирусом гриппа.

Вещество Диапазон концентраций: максимальная переносимая концентрация - минимальная активная концентрация, моль

Снижение титра ин- Хими' 'е-

фекционности виру- рапевти-

са в диапазоне ко- ческий

нцентраций по сра- индекс внению с контролем

if БОЕ/мл

амилорид 1,9 ' 10-4 - 2,3 • ■ ИГ5 ¿96,8 8

ортованадат 1.5 ' Ю"5 - 1,8 • ю~б >1,5 ¿96,8 8

уабаин 6,3 • Ю"6 - 4,1 • кг6 >1,4 ¿96,0 2

иодацетат 4,1 ' ю-6 - 2,1 • Ю"6 Я,4 296,0 J 2

ремантадин" 2,3 • Ю-4 - 6,9 ' 10~б >1,7 г98,8 33

- ремантадин приведен в кацестве референс-препарата.

вещества влияют на стадию раздевания вируса, а не на проникновение вирурных частиц в клетку-

Учитывая, что специфический ингибитор клеточного натрий-протонного обмена амилорид является диуретиком, представлялось перспективным исследовать ряд мочегонных препаратов на противовирусную активность в отношении вируса гриппа. Первичное изучение препаратов методом агар-диффузного скрининг-теста показало, что такие диуретики как фуросемид, гипотиазид, диакарб и оксодолин не оказывали заметного влияния на активность вируса гриппа. В то ге время амило-

рид, верошпирон и триампур обладали выраженным противовирусным действием в отношении вируса гриппа. Дальнейшее изучение методом редукции оляшек показало, что амилорид, верошпирон и триампур подавляют инфекционность вируса гриппа более, чем на 96% ( табл. 2)

Таблица 2. Характеристика антивирусного действия амилорида, верошпирона и триампура, полученная методом редукции бляшек на культуре клеток фибробластов эмбрионов кур, инфицированных вирусом гриппа.

Вещество Диапазон концентраций: максимальная переносимая концентрация - минимальная активная концентрация, мкг/мл

Снижение титра инфекционности вируса в диапазоне концентраций по сравнению с контролем

Химиотерапевт и-ческий индекс

Ц БОЕ/мл о> /о

амилорид 50 - - 6 Л,5 >56,8 8

верошпирон" 50 - - 6 Я,6 »£■7,5 8

триампур" 25 - - 12 >1,4 2

" - при расчете концентраций учитывался общий вес таблетки ( вещество + наполнитель).

Исследованные препараты относятся к двум различным группам диуретиков: салуретики С фуросемид, гипотиазид, оксодолин и даакарб) и калийсберегающие диуретики ( амилорид, верошпирон). Триампур явля ется комбинированным препаратом, в состав которого входят салуре-тик гипотиазид ( не обладает противогриппозной активностью) и ка-лийсборегающий диуретик триамтерен.Обращает на себя внимание то, что эффективными противовирусными свойствами в отношении вируса гриппа обладали только калийсберегающие диуретики ( табл. 2).

Следует отметить симбатность эффектов подавления процессов за-кисления среды клетками и репродукции вируса гриппа под действием ингибиторов натрий-протонного обмена, Иа.К- АТФэзы и гликолиза. Так как снижение внутриэндосомального рН происходит по механизму Ма+/Н+- обмена и за счет диффузии молочной кислоты, можно предпо-

ожить следующий механизм противогриппозного действия этих веществ, милорид, ортованадат, уабаин, иодацетат и ремантадин вызывают нижение скорости закисления внутренней среды вируссодержащих эн-,осом. Это приводит к увеличению периода времени, необходимого для .остижения критической для раздевания вируса величины внутриэндо-смального рН. В результате такой задержки произойдет образование |Торичной лизосомы за счет слияния вируссодержащей ондосомы и пер-1Ичнрй лизосомы.- Другими словами, вирусная частица вследствие сни-:ения скорости закисления внутриэндосомального пространства под .ействием этих ингибиторов просрочит время, отведенное ей на стада раздевания, и подвергнется деградации в лизосоме ( неинфекци-нный путь), что приведет к блокированию гриппозной инфекции в [8Л0М

Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что инги-ирующий эффект амилорида, ортованадата, уабаина, иодацетата, и емантадина на процесс раздевания вируса гриппа проявляется в ре-ультате снижения скорости закисления внутренней среды вкрусинду-,ир о ванных эчдосом вследствие уменьшения количества кислых про-уктов, поступающих внутрь эцдосом в виде протонов и молочной ки-лоты за счет подавления натрий-протонного обмена и гликолиза.

ВЫВОДЫ

1. Потенциометрическим методом установлено, что закисление реды инкубации фибробластами эмбрионов кур зависит от энергети-:еского метаболизма клеток. В присутствии экзогенной глюкозы заселение осуществляется за счет диффузии конечного продукта гли-:олиза молочной кислоты. В безглюкозной среде - в результате ■ранелонации протонов по механизму натрий-протонного обмена.

2. Показано, что проникновение вируса гриппа в фибробласты мбрионов кур посредством эндоцитоза, приводящее к формированию в [итоплазме вируссодсриащих эндосом, сопряжено с локальной перекройкой плазматических мембран клетки. Вирус гриппа вызывает ■акке значительное снижение скорости закисления среды фиброблас-'ами эмбрионов кур. Степень подавления закисления возрастает с величением множественности инфицирования.

3. Найдено, что в максимальной переносимой концентрации ингибитор натрий-протонного обмена амилорид, ингибиторы Ыа,К - АТФаэы ортованадат уабаин, ингибитор гликолиза иодацетат эффективно подавляют процесс закисления среды клетками.

. Впервые выявлено, что известный противогриппозный препарат ремантадин подавляет закисление среды фибробластами эмбрионов кур, осуществляемое как по механизму натрий-протонного обмена, так и . за счет выброса молочной кислоты.

5. Впервые l^наружено, что амилорид, ортованадат, уабаин, иод-ацетат, эффективно подавляющие пр цесс натрий-протонного обмена

и гликоли обладают выраженным антивирусным действием в отношении вируса гриппа. Установлено, что противогриппозньни свойствами обладали также верошпирон и триампур, являющиеся подобно ами-лориду калийсберегающими диуретическими препаратами. В то же время другая группа мочегонных препаратов, относящихся к салуретикам - фуросе..ид, гипотиазид, оксодолин и диакарб не проявляли антивирусного д.йствия в отношении вируса гриппа.

6. Совокупность полученных данных указывает на то, что снижение внутриэндосомальнбго рН необходимое для реализации стадии раздевания вируса гриппа осуществляется в основном за счёт диффузии молочной кислоты и ранслокации протонов по механизму натрий-протонного обмена и свидетельствует о возможности ингибирования размножения вируса гриппа в клетках фибробластов эмбрионов кур путем подавления натрий-протонного обмена и гликолиза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кириллов В.А., Зденок А.Н., Горева Л.Н., Судник Ю.Ы., Конев C.I Особенности закисления среды фибробластами эмбрионов кур/// Вести АН БССР. Сер.биол.наук. - I' 39.. - » I. - С.84-67.

2. Кириллов В.А., Рудник Ю.Ы., Горева Л.Н., Вотяков В.Й. Роль структурной динамики плазматических мембран клеток в ранних этапах репликативного цика вируса гриппа // Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецеп-торных процессов. - Мн., 1988. - С.58.

3. пириллов В.А., Горева Л.Н., Руденок А.Н., Конев C.B., Вотяков В.И. Участие NaVH4"- обмена и диффузии молочной кислоты в кислото-зависимом процессе раздевания виг -са гриппа // Доклады АН СССР. -

1589. - Т.309. - С.461-463.

4. Кириллов В.А., Горева Л.Н., Вотяков.В.И. Роль ингибирования клеточного На^/Н*- обмена и гликолиза в антивирусном действии // Бюллюте'нь экспериментальной биологии и медицины. - 1990. - № I. -С,33-35.

5. Кириллов В.А., Горева Л.Н., Владыко Г.В., Бореко Е.И., Русяев В.А., Вотяков В.И. Ингибирование активности вируса гриппа путем специфического блокирования клеточного Иа+/Н+- обмена // IX Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ. - Рига, 1991. - С.90.

6. Кириллов В.А., Горева Л.Н., Владыко Г.В., Бореко Е.И., Русяев В.А., Вотяков В.И. Подавление клеточного Иа+/Н+- обмена приводит к ингибированию активности вируса гриппа // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т.36. - » б. - С.35-37.

7. Кириллов В.А., Горева Л.Н., Вотяков В.И. Ингибирование гриппозной инфекции путем подавления клеточного натрий-протонного обмена и гликолиза, ответственных за реализацию кислотозависимого процесса раздевания вируса // Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций. - Рига, 1991. - С.63-67.

8. Кириллов В.А., Горева Л.Н., Владыко Г.В., Вотяков В.И. Исследование калиЯеберггаюцих диуретических препаратов на (тротивовирус-ную активность в отношении вируса гриппа // Вопросы вирусологии.

- 1992. - № 4. - С.218-219.

9. Кириллов В.А., Горегз Л.Н. В-ияние проникновения вируса гриппа в клетку на у.-ч.траструктурнув перестройку плазматических мембран // Вести АН Беларуси . Сер.биол,наук. - 1992. - № 5-6« - С.76-80.

Подписано к печати 19 0А.93ч. Формат 60X84 1/16

Усл.псч.л. i ,46 Тираж 4 00 эй. Бесплатно. Заказ ¿Д2.

ИПП Госэкоиомплапа Рсаг)тдлики Беларусь.