Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль токов ионов калия в формировании трансмембранных потенциалов действия клеток синусно-предсердного узла мыши

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль токов ионов калия в формировании трансмембранных потенциалов действия клеток синусно-предсердного узла мыши"

На правах рукописи

Гонотков Михаил Анатольевич

РОЛЬ ТОКОВ ИОНОВ КАЛИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ТРАНСМЕМБРАННЫХ ПОТЕНЦИАЛОВ ДЕЙСТВИЯ КЛЕТОК СИНУСНО-ПРЕДСЕРДНОГО УЗЛА МЫШИ

03.03.01 -физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 АПР 2015

Сыктывкар 2015

005567591

005567591

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

старший научный сотрудник Головко Владимир Александрович

Официальные оппоненты: Сафонова Татьяна Алексеевна

доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», кафедра общей физиологии, профессор

Кукушкин Николай Ильич

доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, лаборатория культур клеток и клеточной инженерии, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, г.Екатеринбург

Защита состоится « 27 » мая 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 004.017.02 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук по адресу: 167982, Сыктывкар, ГСП-2, ул. Первомайская 50, nivarlam@physiol.komisc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук по адресу: Сыктывкар, ул. Первомайская 50 и на сайге http://www.physiol.komisc.ru.

Автореферат разослан «_» апреля 2015 г.

Ученый секретарь И\ /

диссертационного совет* _/ Варламова Нина Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Синусно-предсердный (СП) узел состоит го спонтанно возбуждающихся клеток, которые задают ритм всего сердца. По данным Всемирной организации здравоохранения синдром слабости СП-узла или нарушение функции ведущего центра автоматии сердца стал распространенным заболеванием среди взрослого населения (моложе 45 лет) и все чаще диагностируется у детей (от 1 до 12 мес.) [Adan et al., 2003]. В связи с этим изучение ионного механизма генерирования спонтанных потенциалов действия (ПД) клетками СП-узла является одним из центральных вопросов электрофизиологии сердца.

За последнее десятилетие генетически модифицированные мыши стали удобной моделью для изучения электрофизиологии сердца. С использованием лабораторной мыши как модели получены новые знания о генетических, молекулярных и системных механизмах, которые участвуют в возникновении и поддержании сердечных аритмий, приводящих к остановке сердца [Ludwig et al., 2003; Stieber et al., 2003; Herrmann et al., 2011]. Несмотря на значительные успехи, в литературе имеется недостаточно информации об основных электрофизиологических параметрах ПД клеток СП-узла контрольных мышей (wild-type) и она противоречива [Mangoni, Naigeot, 2001; Verheijck et al., 2001; Cho et al., 2С03].

В настоящее время активно ведутся разработки лекарственных препаратов, воздействующих на клетки СП-узла, для коррекции частоты сердечных сокращений у людей, страдающих заболеваниями сердечно-сосуд истой системы. Основное направление исследований сосредоточено на выяснении механизмов регуляции автоматии СП-узла через ингибирование отдельных ионных токов. Поэтому изучение роли токов с участием ионов калия в генерировании внутриклеточных ПД клеток СП-узла является важной задачей электрофизиологии сердца

Активируемый гиперполяризацией ток ^обусловлен транспортом ионов Na+ и К+. У разных видов млекопитающих вклад тока If в спонтанную активность СП-узла оценивается от 3 до 30% [Vinogradova, Lakatta, 2009]. Однако физиологическая роль этого тока в генерации ПД СП-узла мыши неясна.

Выходящие калиевые токи играют важную роль в формировании фазы реполяризации и максимального диастолическош потенциала (Еыахс) ПД у клеток СП-области. В последнее время наиболее интенсивно изучаются кратковременный ток 1ю и ток задержанного выпрямления 1К, состоящий из быстрой и медленной составляющих [Boyett et al., 2000]. Однако участие этих токов в генерации ПД клеток СП-узла мыши остается невыясненным.

Нарушение гомеостаза К+ в плазме крови вызывает изменение активности калиевых каналов и влияет на длительность и амплитуду ПД во времени [Yang et al., 1996]. Длительность медленной диастолической деполяризации и потенциалов действия определяет частоту и силу сердечных сокращений. Использование модели с варьированием внеклеточного калия совместно с блокаторами отдельных калиевых токов позволит оценить вклад каждого калиевого тока в общую

сумму токов, которые участвуют в генерации ПД клеток СП-узла мыши.

Цель и задачи исследования. Выявить роль основных токов с участием ионов калия в генерировании фаз ПД у клеток СП-узла мыши.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Провести с помощью микроэлектродов идентификацию клеток СП-узла в области бифуркации его артерии. Определить основные электрофизиологические характеристики ПД разных типов клеток СП-области у мыши.

2. Оценить влияние Сэ+ и ивабрадина в качестве блокаторов тока, активируемого гиперполяризацией 1р на формирование ПД.

3. Определить действие 4-аминопиридина как блокатора кратковременного тока 1в в формировании фаз ПД у клеток СП-области.

4. Проанализировать эффекты Е-4031, блокатора быстрой компоненты выходящего из клетки калиевого тока, на формирование ПД у клеток СП-узла.

5. Изучить действие блокатора медленной компоненты калиевого тока -хроманола293В.

6. Проанализировать эффекты растворов с пониженной и повышенной концентрацией калия на фазы ПД и сравнить их с действием блокаторов.

7. Создать банк данных основных параметров ПД клеток СП-области для использования в экспресс-тестировании перспективных фармакологических препаратов и разработки модели генерации ПД клеток СП-узла мыши.

Научная новизна исследования. Впервые с помощью микроэлектродных отведений установлено месторасположение клеток истинного и скрытого водителей ритма в области артерии СП-узла у мыши. Определены и проанализированы основные электрофизиологические параметры ПД клеток водителя ритма и правого проводящего СП-пучка. Обосновано выделение ПД клеток правого проводящего СП-пучка в отдельный тип. Установлено, что скорость фазы медленной диастолической деполяризации замедляется на 50% при экспозиции концентрации ивабрадина 1.6 мкМ. Выявлено действие высокой и низкой концентраций [К+]о на генерацию ПД клеток водителя ритма СП-узла мыши. Выявлено, что длительность фазы плато у клеток, работающих в режиме истинного водителя ритма, и у клеток типа предсердных удлиняется на 50% при концентрации 4-аминопиридина 0.6 и 0.1 мМ соответственно. Выяснена функциональная роль быстрой (1&) и медленной (1Ь) составляющих выходящего из клетки калиевого тока в формировании ПД клеток СП-узла.

Научно-практическая значимость исследования. Полученные результаты дают экспериментальную и теоретическую основу для разработки математической модели генерации ПД клетками истинного и скрытого водителей ритма, что важно при разработке новых клинических подходов к управлению ритмом генерации сердца, а также для поиска и тестирования фармакологически перспективных препаратов. Карта распределения клеток водителей ритма может бьггь использована при выделении изолированных клеток СП-узла мыши для их идентификации. Характеристики ПД контрольных мышей могут быть полезными для выявления происходящих изменений у мышей с вызванными нокаутами генов, ответственных за синтез белков потенциал-образующих каналов в СП-узле.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В области артерии СП-узла сердца мыши зарегистрированы и охарактеризованы ПД клеток, работающих в режиме истинного и скрытого водителя ритма, клеток правого проводящего СП-пучка и клеток типа предсердных.

2. Существует чувствительный к 4-аминопиридину ионный ток, который участвует в формировании фазы плато ПД клеток СП-узла.

3. Ток, чувствительный к Cs+ и ивабрадину, принимает участие в формировании фазы медленной диастолической деполяризации на всем ее протяжении.

4. В формирование фазы реполяризации ПД у клеток истинного водителя ритма СП-узла мыши вносят вклад быстрая (1^) и медленная (1^) составляющие калиевого тока задержанного выпрямления.

5. Изменения Емакс, амплитуды ПД, dV/dtMaKc, скорости диастолической деполяризации у клеток СП-узла мыши в диапазоне внеклеточной концентрации калия от 0.64 до 10.8 мМ в перфузируемом растворе описываются кривой колоколообразной формы.

Апробация диссертации. Материалы работы были представлены на 37th World Congress of the International Union of Physiological Sciences (Birmingham, 2013), V Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения с международным участием (Москва, 2012), VII-XII молодежных научных конференциях Института физиологии «Физиология человека и животных — от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009-2013), на 3 8th Meeting of the European Working Group on Cardiac Cellular Electrophysiology (Maastricht, 2014). Диссертационная работа апробирована на заседании ученого совета ИФ Коми НЦ УрО РАН (2014).

Личное участие автора в получении результатов. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались лично и совместно с научным руководителем.

По материалам диссертации опубликованы две статьи в журнале, рекомендованном ВАК, и 12 тезисов.

Легитимность исследования. При обращении с животными соблюдали все правила этики (Guide for the Саге and Use of Laboratory Animals, изложенные в публикации-The National Institute of Helth. NIHNo. 85-23, в редакции 1996 г.). Протоколы экспериментов одобрены независимым локальным комитетом по этике Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (протокол № 1 от 04.05.2009).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 100 машинописных страницах, состоит из общей характеристики работы, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов). Работа содержит 16 таблиц и 29 рисунков. Библиография состоит из 13 3 источников (16 — отечественных и 117 - зарубежных авторов).

Работа выполнена в лаборатории физиологии сердца Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук в период прохождения курса аспирантуры (2009-2011 гг.) и является разделом плановой

5

темы НИР «Механизм формирования функциональной электрической гетерогенности миокарда» (№ ГР 02.200 950623), поддержана грантами Президиума УрО РАН (проекты № 11-4-НП-438; № 12-П-4-1054; № 12-У-4-1022) и РФФИ (проекты № 09-04-098812; № 12-04-32288 мол_а).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первая глава диссертации является обзором литературы по рассматриваемой проблеме и состоит из шести основных разделов, содержащих сведения о морфофункциональных характеристиках клеток СП-узла мыши, роли тока, активируемого гиперполяризацией, 1р роли тока, чувствительного к 4-АП, 1ш, калиевого тока задержанного выпрямления 1к в формировании автоматии. Описывается влияние [К+]о на автоматшо. Каждый раздел завершается постановкой актуальной задачи.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

Эксперименты были проведены на самцах мышей альбиносов (п= 150) массой 30±5 г, содержавшихся в питомнике экспериментальных животных Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар). Мыши были обездвижены мгновенным смещением шейных позвонков. После вскрытия грудной полости извлекали сердце, предварительно отпрепарировав нижнюю и верхнюю полые вены. Изолированное сердце переносили в чашку Петри с контрольным раствором Тироде следующего состава (мМ/л): NaCl - 140, NaHC03 - 10, КС1 - 5.4, СаС12 - 1.8, MgS04 - 1, глюкоза - 10, HEPES - 5, рН = 7.4. Готовый препарат размером 3x2x0.3 мм включал СП-область, фрагмент crista terminalis и сегменты верхней и нижней полых век Препарат был помещен субэндокардом вверх в экспериментальную камеру, перфузируемую раствором Тироде (31°С). Раствор перед поступлением в камеру аэрировали газовой смесью: 95% 02 и 5% С02. Скорость протока раствора равнялась 10 мл/мин.

Исследуемые блокаторы ионных каналов растворяли в небольшом количестве бидистиллированной воды и соответствующие аликвоты добавляли в солевой раствор до необходимой концентрации. Продолжительность действия блокаторов -15-30 мин, после чего проводили отмывку препарата до стационарного уровня.

Система регистрации потенциалов действия

Установка для измерения и регистрации ПД состояла из микроэлектродов, электронно-лучевого осциллоскопа с видеокамерой (Canon, Япония), аналогово-цифрового преобразователя типа Е14-140 (L-Card, Россия), усилителя с измерителем сопротивления микроэлектрода и калибратора.

Микропипетки изготавливались путем вытягивания на микрокузнице

(Пущино, Россия), из боросиликатного стекла (Sutter Instruments, Великобритания) и стекла «Пирекс» (Пущино) с наружным диаметром 1.2 мм и внутренним диаметром 0.8 мм. Пипетки заполнялись 2.5 М KCl. Мгасроэлектро-ды имели начальное сопротивление от 25 до 70 MW [Коспок, 1960; Мещерский, 1960; Кожечкин, 1975].

Введение микроэлектрода в клетку осуществляли с помощью механического микроманипулятора типа КМ-1 с антивибрационной подушкой (Пущино, Россия). Применяли усилитель для микроэлектродных исследований типа Electro 705 (V/PI, США) с низким уровнем шумов и частотной полосой пропускания от 0 до 5 кГц.

Документированы и проанализированы следующие параметры ПД: амплитуда ПД, максимальный диастолический потенциал (Е^), потенциал порога (ПП), спонтанная деполяризация (СД), длительность пикаПД на уровне 20 (ДЩу, 50 (ДПД50), 90 (ДПД^) и 100% (ДПД100) реполяризации, длительность фазы медленной диастолической деполяризации (ДД), длительность общею цикла генерации ПД (ОДПД), максимальная скорость нарастания ПД в фазу 0 (dV/dtu¡ux), скорость фазы плато (V2), скорость фазы конечной реполяризации (V3) и скорость диастолической деполяризации (V4). Границу между медленной диастолической деполяризацией (фаза 4) и быстрой деполяризацией (фаза 0) определяли графически: строили касательные, а с точки их пересечения опускал}! перпендикуляр. Значимость различий параметров ПД определяли в программе BIOSTAT 4.03. Данные приведены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Использовали непараметрический критерий Вилкоксона для связанных выборок и U-кригерий Манна-Уитни для несвязанных. Различия считали значимыми при р<0.05.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биофизические параметры трансмембранных потенциалов действия синусно-предсердной области

Клетки водителя ритма СП-узла мыши располагались вдоль артерии СП-узла. ПД клеток ИВР, зарегистрированные в зоне бифуркации артерии СП-узла, характеризовались самой медленной скоростью ПД в фазу 0, равной в среднем 3±1 В/с (пполосог=27), низким уровнем Емахс, наиболее продолжительной длительностью потенциала действия на уровне 90% реполяризации и самой высокой скоростью V4. ПД клеток СВР зарегистрированы около поперечпога гребешка и вдоль той части артерии СП-узла, которая располагается ближе к нижней полой вене. Параметры ПД клеток СВР отличались от ИВР более быстрой скоростью ПД в фазу 0, в среднем 20±9 В/с (пполоаж=21); большей амплитудой ПД (62 мВ против 55 мВ), уровнем Ема.с, менее продолжительной длительностью ПД и более низкой V4. ПД клеток правого проводящего СП-пучка зарегистрированы около поперечного гребешка, в той его части, которая находится ближе к нижней полой вене и вдоль СП-клапана (n t=7). Параметры ПД клеток правого

проводящего СП-пучка отличались от клеток типа СВР более высокой амплитудой ПД, коротким пиком ПД, высокой скоростью фазы быстрой деполяризации (в среднем 150 В/с) и наличием выраженной фазы ранней деполяризации. От клеток сократительного миокарда предсердия они отличались наличием фазы МДД (табл. 1;рис. 1).

Таблица 1

Электрофизиологические характеристики потенциалов действия пейсмекерных клеток, зарегистрированных со стороны _субэндокарда синусно-предсердной области сердца мыши

Параметры Клетки истинного водителя ритма п = 27 Клетки скрытого водителя ритма п = 21 Клетки правого проводящего пучка п = 7 Клетки предсердия п = 10

ЕмахС| -54±4** -60±5 -72±7" -

ПД, мВ 55±4** (504-64) 62±7 (534-74) 93±12" (72-5-102) 97±5** (924-106)

ПП, мВ -42±5" -50±5 -67±7* -79±6**

ДПДго, мс 40±6" 28±9 9±3** 6±2~

ДПДм, мс 53±6 50±9 37±7 12±3**

ДПД и, мс 81 ±5 79±9 65±6 42±9"

ОДПД, мс 192±19 198±15 201±18 195±16

ДД, мс 93±17 97±18 109±18 -

dV/dtuaK, в/с 3±1** (1.5-5) 20±9 (вч-40) 149±36** (100^-200) 141±27" (1034-187)

v2, В/с -1.4±0.3* -0.9±0.2 -1±0.2 -5.5±1.5**

V3, В/с -0.9±0.3 —1±0.2 -1.3±0.3 -1.4±0.4**

V4, мВ/с 133±41** 92±28 48±7 _

Примечание. ПП - потенциал порога, ДПД^, ДПД^и ДПД^- длительность потенциала действия на уровне 20%, 50% и 90% реполяризации; ОДПД - общая длительность потенциала действия; V2 -скорость фазы плато; V3-скорость фазы конечной реполяризации; V4-скорость изменения медленной диастолической деполяризации (фаза 4). п - количество препаратов; * - р<0.05, ** - р<0.01, по отношению к скрытому водителю ритма.

Эффекты ионов Cs\ блокатора тока I,, на потенциалы действия клеток синусно-предсердной области

Изучено влияние ионов Cs+ как блокатора тока, активируемого гиперполяризацией 1р в диапазоне концентрации от 0.5 до 10 мМ. В первой серии экспериментов частота генерации ПД клетками СП-узла мыши составила в среднем 215 имп/мин (п=11). Установлено, что у клеток ИВР наиболее чувствительными к Cs+ оказались длительность и средняя скорость фазы МДД (фаза 4). Пороговая концентрация Cs+ составляла около 0.15 мМ (п=4). Цезий в концентрации 1 мМ увеличивал д лительность МД Д на 78% и замедлял ее скорость на 58%. Длительность ДПД^ увеличивалась в среднем на 20% и в итоге частота генерации ПД у клеток, работающих в режиме ИВР, замедлялась в среднем на 42± 12% (п=6) по сравнению с контролем. Повышение концентрации Cs+ в солевом растворе до 3 и 5 мМ не вызывало достоверного снижения V,. Отметим, что при этом частота генерирования ПД замедлялась на 10-15% по сравнению с этим показателем при концентрации 1 мМ Cs+ за счет удлинения МДЦ и ДПД^ на 5-10%.

нусно-предсердного узла очерчены пунктирной линией. Буквами указаны примеры потенциалов действия: а, б - клетки, работающие в режиме истинного водителя ритма; в, г - скрытый водитель ритма; д - правый проводящий пучок; е - предсердные клетки. Анатомические ориентиры: ВПВ и НПВ - верхняя и нижняя полые вены; МПП -межпредсердная перегородка; ПГ - пограничный гребешок (crista terminalis)\ красная линия - артерия синусно-предсердного узла.

Повышение концентрации Cs+ в солевом растворе от 5 до 7.5 и 10 мМ вызывало прекращение спонтанной генерации ПД у клеток СП-мыши за счет блокирования фазы быстрой деполяризации на 5 мин экспозиции. Эффект высокой концентрации Cs+ обратим через 40-50 мин после перфузии в нормальном растворе.

В последующем мы исследовали эффекты ионов Cs+ в концентрации 1 мМ на клетки типа ИВР с частотой генерирования ПД в среднем 313±26 имп/мин (п=27). Как и в первой серии экспериментов, наиболее чувствительными к Cs+ (1 мМ) были МДД и V4. Однако эффект 1 мМ Cs+был слабее, чем в первой серии экспериментов. В частности, у клеток ИВР V4 снизилась на 32% (от 134±27 до 91±25 мВ/с; р<0.05), а МДД увеличилась на 36% (от 87±16 до 118±23 мс; р<0.05), в результате частота генерации ПД замедлилась на 16% (р<0.05).

Таким образом, у клеток СП-узла мыши с dV/dtMaM,, равной в среднем 3 В/с Cs+ (1 мМ), блокатор тока 1р активируемого гиперполяризацией, замедлял V4 на 60-70%, а частоту генерации ПД - на 42% по сравнению с контролем. Ток, чувствительный к Cs+, вносит существенный вклад в генерацию фазы МДД. При высокой частоте генерации ПД у клеток ИВР СП-узла сердца мыши происходило снижение эффекта Cs+.

Эффекты ивабрадина, блокатора тока I,, на потенциалы действия клеток синусно-предсердной области

В данной серии экспериментов исследовали эффекты ивабрадина в диапазоне концентрации от 0.01 до 3 мкМ на генерацию ПД у клеток типа ИВР и СВР. Анализ графика дозо-зависимости У4 от концентрации ивабрадина показал, что пороговая концентрация ивабрадина для клеток типа ИВР СП-узла мыши составила около 0.085 мкМ. Концентрация ивабрадина, вызывающая 50% замедление (ЕС50) У4, равна около 1.57 мкМ.

У клеток ИВР ивабрадин (3 мкМ) на 5 мин экспозиции вызывал снижение амплитуды спонтанной деполяризации на 25% (от 12±2 до 9±2 мВ; р<0.01) и увеличение длительности МДЦ на 61% (от 83±10 до 134±24 мс; р<0.01), в результате У4 снижалась на 56% (от 147±25 до 67±16 мВ/с; р<0.01). Частота генерации ПД в результате снижалась на 24% по сравнению с контролем (р<0.01) (рис. 2 А).

У клеток СВР ивабрадин (3 мкМ) на 5 мин экспозиции вызывал снижение амплитуды спонтанной деполяризации на 33% (от 12±2 до 8±2 мВ; р<0.01) и увеличение длительности МДЦ на 56% (от 87± 17 до 136±23 мс; р<0.01). В результате скорость У4 снизилась на 50% (от 12б±20 до 63±12 мВ/с; р<0.05). Следует отметить, что ивабрадин (3 мкМ) также увеличивал ДПДШ в среднем на 18% (от 114± 14 до 134±28 мс; р<0.05), в результате чего частота генерации ПД снижалась на 26% (р<0.01) по сравнению с контролем (рис. 2 Б).

Таким образом, выявлено, что ивабрадин замедляет частоту генерации ПД за счет увеличения длительности и снижения скорости фазы М ДД.

А

Рис. 2. Эффекты ивабрадина на генерацию ПД клеток типа ИВР (А) и СВР (Б).

Эффекты 4-аминопиридина, блокатора тока 1(о, на потенциалы действия клеток синусно-предсердной области

Исследован дозо-зависимый эффект 4-АП в диапазоне концентрации от 0.1 до 5.0 мМ на основные электрофизиологические параметры ПД клеток СП-области. У клеток ИВР 4-АП при концентрации 0.5 мМ наиболее заметно влиял

на ДПД20 или фазу «плато» ПД, вызывая ее удлинение на 43%. Это сопровождалось замедлением с!У/ск в среднем на 17%. Длительность ДПД^ удлинялась на 24%. Повышение концентрации 4-АП до 1 мМ вызывало увеличение ДПД20 на 85% и замедление ¿У/сймакс на 56% по сравнению с контролем. Повышение концентрации 4-АП от 1 до 5 мМ приводило к значимому замедлению частоты генерации ПД на 14%. При этом ДПД,0, ДПД90 и сГУЛЙ значимо не изменялись по сравнению с аналогичными показателями

макс г

при 4-АП в концентрации 1 мМ. Следует отметить, что 4-АП не влиял на длительность фазы конечной реполяризации (рис. 3 А, Б).

У клеток предсердия блокатор 4-АП в концентрации 0.1 мМ удлинял ДПД20 в 1.5 раза по сравнению с контролем. Повышение концентрации 4-АП (0.2, 0.5 я 1.0 мМ) вызывало дозо-зависимое трехкратное увеличение длительности фазы «плато» ПД, что сопровождалось снижением ёУ/Лмакс и амплитуды на 15-20% по сравнению с контролем (рис. 3 В, Г).

Рис. 3. Влияние 4-АП на генерацию ПД клеток ИВР и клеток предсердных у спонтанно сокращающихся полосок СП-области мыши [Сопо1коу, Со1оуко, 2013].

Примечание. О - контроль, • - 4-АП (5 мМ). А, В - ПД тех же клеток, которые приведены на Б, Г при сжатой шкале времени (х5).

100 мс

Пороговая концентрация 4-АП для ДПД^ клеток ИВР СП-узла мыши составила 0.4 мМ, концентрация, вызывающая 50% увеличение (ЕС50), - 0.6 мМ. У клеток предсердия ЕС50 равнялась 0.1 мМ. Повышение концентрации 4-АП от 1 до 5 мМ не приводило к дальнейшему изменению ДПД20.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у клеток ИВР СП-узла мыши блокатор 4-АП удлиняет фазу «плато» и не оказывает влияние на фазу конечной реполяризации. Это сопровождается снижением йУ/сЗ^^ и амплитуды ПД на 15-20% по сравнению с контролем. Эффект 4-АП был выражен сильнее у клеток предсердия, чем у клеток ИВР СП-узла мыши.

Эффекты Е-4031, блокатора тока на потенциалы действия киегоксинусно-предсердной области

Исследованы эффекты Е-4031, блокатора быстрой компоненты калиевого тока, в диапазоне концентрации от 0.01 до 1 мкМ на основные электрофизиологические характеристики ПД. Анализ данных показал, что пороговая концентрация Е-4031 для V3 ниже 0.01 мкМ, тогда как концентрация, вызывающая 50% замедление (ЕС50), для V3 равна 0.45 мкМ.

Блокатор Е-4031 (0.5 мкМ) вызывал увеличение ДПД^ и ДП Д100 (в среднем на 25-30%) (п=5, р<0.01). Скорость V2 замедлялась на 26%, а скорость V3 - на 50%. При этом амплитуда ПД снижалась на 15% за счет снижения уровня Емакс. В результате этого частота генерирования ПД снижалась на 28% по сравнению с контролем (п=5,р<0.01). Повышение концентрации Е-4031 от0.5 до 1 мкМ приводило к снижению амплитуды ПД у клеток типа ИВР на 30% в основном за счет снижения уровня Емак<; на 13% (от -53 до -46 мВ; п=5, р<0.01). Длительность ДПДэд увеличилась на 33% (п=5, р<0.01). Скорость V2 замедлилась на 33%, а скорость V - на 60% (от 1 до 0.4 В/с; п=5, р<0.01). Д лительность МДД увеличилась в среднем на 37%, a V4 замедлилась почти на 50%, в результате чего частота генерации ПД снижалась в среднем на 25% (п=5, р<0.01) по сравнению с контролем (рис. 4 А).

У клеток предсердия блокатор Е-4031 в концентрации 1 мкМ вызывал снижение амплитуды ПД на 13% (от 94±5 до 79±7 мВ; п=4, р<0.05). Длительность ДПД)0 возросла более чем в три раза (от 38±4 до 84±14 мВ; п=4, р<0.05). Скорость V2 снизилась на 46% (от 5.4 до 3 В/с; п=4, р<0.05), а скорость V3 - на 67% (от 1.7 до 0.55 В/с; п=4, р<0.05) (рис. 4 В).

Таким образом, анализ экспериментальных данных показал, что у клеток ИВР блокатор Е-4031 в диапазоне концентрации от 0.01 до 1 мкМ дозо-зависимо снижает скорость V3 и увеличивает ДПД100. В результате блокирования быстрого компонента выходящего калиевого тока, частота генерации ПД замедлялась f среднем на 25% по сравнению с контролем. Эффект Е-4031 (1 мкМ) был наиболее выражен у клеток предсердия, тогда как на клетки типа ИВР и СВР Е-4031 (1 мкМ) оказывает равное воздействие.

Эффекты хроманола 293В, блокатора тока на потенциалы действ1я клеток синусно-предсердной области

Исследовали эффекты антиаритмика III класса хроманола 293В с целью выяснения роли медленной компоненты выходящего калиевого тока задержанного выпрямления, I

У клеток ИВР на 10-й мин экспозиции хроманола 293В в концентрации 5 мгМ наблюдали увеличение уровня Емакс на 6 % (от 52±2 до 55±1 мВ; n=5, pO.Ol). Амплитуда спонтанной деполяризации увеличилась на 33% (от 12±2 до 16±3 кВ; п=5, р<0.05). Скорость V4 возрастала в среднем на 60% (от 129±35 до 207±66 мВ/с; п=5, р<0.01). Длительность ДПД^ удлинялась на 16% (от79±9 до 92±15 мс; пг5, р<0.01). Следует отметить, что хроманол 293В снижал V2 и V3 на 20 и 22% (п=5, р<0.01) соответственно. При этом частота генерирования ПД у клеток ШР снижалась на 6-24% (в среднем 7%) (n=5, р<0.01) по сравнению с контролем (pic. 5 А).

А

Рис. 4. Эффекты Е-4031 (1 мкМ) на конфигурацию ПД клеток ИВР (А) и СВР (Б) СП-узла мыши и клеток предсердия (В).

На 10-й мин экспозиции хроманола 293В (5 мкМ) у клеток СВР наблюдали снижение амплитуды спонтанной деполяризации на 31% (от 13±1 до 9±3 мВ; п=5, р<0.05). Длительность ДПД^ удлинялась на 15% (от 82±13 до 94±14 мс; п=5, р<0.05). Значение ¿У/Л^ снижалось на 33% (от 15±8 до 10±7 В/с; п=5, р<0.01). Скорости У2 и У3 замедлились на 18 и 27% (п=5, р<0.01) соответственно. Скорость У4 замедлилась на 3 5% (от 136±30 до 90±30 мВ/с; п=5, р<0.01), вследствие чего частота генерирования ПД у клеток СВР снизилась на 15% (п=5, р<0.01) по сравнению с контролем (рис. 5 Б).

У клеток предсердия на 8-й мин экспозиции хроманола 293В (5 мкМ) происходило увеличение ДПД^ почти в два раза (от 3 8±4 до 74± 19 мс; п=5, р<0.01). Значение с1У/Лмакс снизилось на 34% (п=5, р<0.01). Скорости У2 и У3 замедлялись на 26 и 56% (п=5Гр<0.01) соответственно (рис. 5 В).

Таким образом, выявлено, что чувствительными к действию хроманола 293В оказались параметры, связанные с величиной порогового потенциала, ДПД^ и скоростью У2 и У3.

Эффекты гипо- и гиперкалиевых растворов на генерацию ПД клеток синусно-предсердной области мыши

Были исследованы эффекты [К+]о в диапазоне концентраций от 0.65 до 10.8 мМ. Концентрация К+ в солевом растворе, равная 5.4 мМ, принята за контроль. Гипокалиевые растворы характеризуются двухфазным эффектом: на 10-й мин экспозиции препаратов СП-области в гипокалиевом растворе величина ПД

повышалась на5-10мВза счет гиперполяризации Емакс. После 10 мин экспозиции наблюдали монотонное снижение овершута и деполяризацию мембраны, которые продолжались до 20 мин экспозиции. Поэтому далее приведены данные, полученные на 25-30-й мин экспозиции гипокалиевых растворов.

А

ОмВ

-62 «В

В

Рис. 5. Эффекты хроманола 293В (5 мкМ) на конфигурацию ПД клеток ИВР (А) и СВР (Б) СП-узла мыши и клеток предсердия (В) [Со1оуко, Соп^коу, 2013].

Влияние гипокалиевых растворов на клетки ИВР. Снижение [К+] от 5.4 до 2.7 мМ приводило к снижению Е^ на 13% и амплитуды ПД на 35%. Длительность МДД и ДПДад увеличилась на 26%. Значение йУ/ё^ ПД снижалось на 62%, а скорости У2 и У3 замедлялись на 40 и 50% соответственно. Скорость У4замедлялась на 37%, в результате чего частота генерирования ПД снижалась на 23%.

Дальнейшее понижение [К+]о от 5.4 до 1.3 мМ приводило к снижению Е и амплитуды ПД на 20 и 53% соответственно. Длительность ДПД90увеличилась на 32%, при этом происходило замедление У2, У3 и У4 в среднем на 50%. Длительность МДД и частота генерации ПД клетками значимо не изменялись по сравнению с показателями, выявленными при 5.4 мМ [К+]о. Экспозиция [К+]о 0.65 мМ вызывала наибольшее снижение Емакси амплитуды" ПД на 29 и 57% соответственно. Длительность ДПД^увеличилась на27%, скорости У2и У3 снижались на 58 и 62% соответственно. Значение V, снижалось на 47%, а значение сГУ/А ПД- на 67%. Частота генерации ПД при этом значимо не изменялась по сравнению с 5.4 мМ [К+]о.

Влияние гипокалиевых растворов на клетки типа СВР. Эффекты

гипокалиевых растворов (2.7, 1.3 и 0.65 мМ) на параметры ПД клеток СВР оказались во многом сходными с воздействием на параметры ПД клеток ИВР. При снижении концентрации калия в растворе от 5.4 до 1.3 мМ продолжительность ДГ1Д20 увеличивалась в среднем в полтора раза, V, и У4 замедлялись в три и два раза соответственно. При этом с!\7скмгшс снижалась в 10 раз по сравнению с контролем. Наблюдали деполяризацию мембраны клеток вопреки закону Нернста до -34 мВ, шум Емакс, укорочение диастолической деполяризации и невозможность развивать фазу быстрой деполяризации П Д.

Влияние гиперкалиевых растворов на клетки ИВР. Повышение концентрации ионов калия в растворе от 5.4 до 10.8 мМ вызывало уменьшение Емакс в среднем на 10 мВ. В результате этого амплитуда ПД снижалась в среднем на 25 мВ. Также наблюдали снижение ¿У/сЦ^ иУ(в два раза по сравнению с контролем.

Влияние гиперкалиевых растворов на клетки СВР. Повышение [К+]о от 5.4 до 10.8 мМ вызывало увеличение Емакс в среднем на 15 мВ, в результате чего амплитуда ПД снижалась на 30 мВ. При повышении [К+]о скорость У'3 у клеток типа СВР снижалась в два раза. При этом наблюдали также снижение величины с!У/ск почти в три раза и V - в два раза по сравнению с контролем.

мнкс ^

Таким образом, исследование влияния [К+]о в диапазоне концентрации от 0.65 до 10.8 мМ на параметры ПД клеток, работающих в режиме ИВР и СВР, показало, что амплитуда ПД, Емакс, с1У/скмакс и У4 были наиболее чувствительными к понижению и повышению концентрации калия и, будучи изображенными графически, имели колоколообразный вид (рис. 6). В гипокалиевых растворах (2.7,1.3 и 0.65 мМ) у клеток ИВР СП-узла мыши происходило увеличение ДДД,0 в среднем на 28%.

140%

Емакс

Рис. 6. Изменение Емакс, амплитуды ПД, с1У/сКиакс и У4 клеток ИВР СП-узлэ мыши при варьировании концентрации внеклеточного калия в растворе Тироде.

Примечание: * - р<0.05; ** - р<0.01, по отношению к концентрации калия 5.4 мМ.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В главе на основании результатов собственных исследований и оценки данных литературы рассматриваются параметры ПД клеток СП-узла мыши, функциональная роль токов 1р 1ю, 1Кг и в формировании автоматии клеток СП-узла мыши.

* * *

Таким образом, впервые нами охарактеризованы и выделены в отдельный тип ПД клеток правого проводящего СП-пучка, отличающиеся по конфигурации от ПД клеток типа СВР и клеток сократительного миокарда предсердий (табл. 1). На основании полученных экспериментальных данных и их анализа заключили, что нам удалось создать базу данных о 15 основных параметрах ПД четырех типов клеток в СП-области сердца мыши. Впервые на клетках ИВР СП-узла мыши охарактеризованы эффекты блокаторов тока, активируемого гиперполяризацией 1р - ионов Сб+ и ивабрадина, а также изучено влияние специфических блокаторов выходящих калиевых токов. На основании полученных результатов мы полагаем, что ток ^участвует в формировании фазы медленной ДД и его вклад в генерацию ПД составляет 20±4%. Ультрабыстрый калиевый ток I фактически не участвует в генерации ПД клеток ИВР СП-узла мыши, тогда как вклад тока 1(о составляет 14%. Медленная составляющая калиевого тока задержанного выпрямления, ток участвует в формировании фазы «плато» и фазы конечной реполяризации, и его вклад в автоматик» клеток ИВР СП-узла мыши составляет 7%. Быстрая составляющая калиевого тока задержанного выпрямления, ток ^участвует не только в формировании фазы конечной реполяризации, но и в формировании МДД. Вклад тока 1&в генерацию ПД клеток ИВР СП-узла мыши составляет 25%. Вклад ионов калия в реполяризацию составляет около 30%, а в частоту генерации ПД -23% (табл. 2; рис. 7).

100 мс

100 нс -

Рис. 7. Влияние блокаторов токов с участием ионов калия и гипокалиевого раствора на конфигурацию ПД клеток ИВР СП-узла мыши [Со1оуко, Оопо(коу 2014] 16

Таблица 2

Сравнение эффектов блокаторов токов с участием ионов калия и гипокалиевого раствора на ПД клеток ИВР СП-узла мыши

Блокзтор

Е-4031 | Ивабрадин

Сэ

4-АП

Хроманол 293В [10,

Концентрация ДПД* ВДД ОДПД

1 мкМ +33% +37% +25%

3 мкМ 0% +60% +24%

1 мМ

0% +36%

5 мМ +54% 0%

+16% +14%

5 мкМ +16% 0% +7%

2.7 мМ +26% +26% +23%

ВЫВОДЫ

1. В центральной части синусно-предсердного узла мыши и на периферии с помощью микроэлектродной техники со стороны субэндокарда идентифицированы разные типы клеток водителя ритма и определены их основные электрофизиологические параметры потенциалов действия. Обосновано выделение четырех типов клеток: истинно пейсмекерные клетки, клетки типа скрытого водителя ритма, потенциалов действия клеток правого проводящего синусно-предсердного пучка и потенциалов действия клеток рабочего миокарда предсердия.

2 У клеток истинного водителя ритма цезий (1 мМ) и ивабрадин (3 мкМ) замедляли частоту генерирования потенциалов действия на 16 и 24% соответственно за счет увеличения длительности фазы медленной диастолической деполяризации и замедления ее скорости.

3. Блокатор транзиторного калиевого тока (1^ 4-аминопиридин (0.1-5 мМ) увеличивает длительность потенциалов действия на уровне 20% реполяризации на 61-73% у клеток истинного водителя ритма, в результате чего происходит увеличение д лительности потенциалов действия на уровне 90% реполяризации на 37% и замедление частоты генерации потенциалов действия на 14%.

4. Блокатор быстрой составляющей выходящего из клетки калиевого тока (1Ь) метансульфонанилид дигидрохлорид, Е-4031 (0.01-1 мкМ), снижает длительность потенциалов действия на уровне 90% реполяризации на 28% и замедляет скорость фазы конечной реполяризации на 44% у клеток истинного водителя ритма. При этом частота генерации потенциалов действия синусно-предсердного узла мыши снижается на 25%.

5. Блокатор медленной составляющей калиевого тока хроманол 293В (5 мкМ) увеличивает длительность потенциалов действия на уровне 90% реполяризации на 16% и снижает частоту генерирования потенциалов действия на 7% у клеток истинного водителя ритма.

6. У клеток, работающих в режиме истинного водителя ритма, при варьировании [К+]о от 0.65 до 10.8 мМ амплитуда потенциалов действия, Еымс, йУ/ск^ и скорость диастолической деполяризации изменяются колоколообразно. Снижение [К+] от 5.4 до 0.65 мМ приводит к увеличению длительности потенциалов действия на уровне 90% реполяризации в среднем на 28%.

7. В результате проведенного исследования впервые определены и проанализированы основные электрофизиологические параметры четырех

типов клеток синусно-предсердной области мыши. Это создает экспериментальную и теоретическую основу для разработки математической модели генерации потенциалов действия клеток истинного и скрытого водителя ритма, что важно для поиска и тестирования перспективных фармакологических препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из списка ВАК РФ:

Гонотков М. А., Головко В. А. Отрицательный хронотропный эффект ионов цезия на генерацию трансмембранных потенциалов клеток синусно-предсердного узла у мыши // Бюл. эксп. биол и мед. 2011. Т. 152(8). С. 128-131; Bull. Ехрег. Biol. Med. 2011. Vol. 152(2). P. 169-172. (WOS 0.341).

Гонотков M. А., Головко В. А. Аминопиридин удлиняет фазу плато потенциалов действия клеток синусно-предсердного узла мыши // Бюл. эксп. биолимед.2013. Т. 156 (7). С. 9-12;Bull.Ехрег. Biol. Med. 2013. Vol. 156(1) Р" 4-6 (WOS 0.341).

Другие публикации:

1. Gonotkov М. A., Golovko V. A. Cesium effects on the transmembrane action potential of the sinoatrial node in young and old mice //Eur. J. Heart Failure 2009 Vol 8(2). P:281.

2 Гонотков M. А. Электрическая активность клеток синусно-предсердного узла мыши при варьировании внеклеточного калия// Материалы докл. IX Всерос. mojt науч. конф. Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар, 2010.

3. Гонотков М. А., Головко В. А. Чувствительный к 4-аминопиридину ток участвует в генерации потенциалов действия клеток синусно-предсердного узла мыши// Тезисы V Всерос. с междунар. участием шк.-конф. М., 2012. С. 45.

4. Гонотков М. А. Эффекты ивабрадина на потенциалы действия клеток типа истинного водителя ритма в синусно-предсердном узле мьнпи // Материалы докл. II Всерос. (XVII) мол. науч. конф. «Молодежь и наука на Севере», 22-26 апреля2013 г., Сыктывкар (в 2-х т.). Т. I. Биол. науки. Сыктывкар, 2013. С. 172-173.

5. Golovko V. A., Gonotkov М. A. The effects Е 4031 and 4 chromanol on action

potentials true pacemaker cells ofmouseSAnode//J. Mol. Cell. Cardiol 2013 Vol 65 P. 132 (WOS 5,218).

6. Gonotkov M., Lebedeva E. and V. Golovko. May the transient outward current 4-aminopyridine sensitive contribute to the "plateau" of the action potential in mouse sinoatrial node? //Proc. Physiol. Soc. V. 28.2012. P. 25-26. (WOS 2.602).

7. Gonotkov M., Golovko V. Achromanol-sensitive outward potassium current contributes to the repolarization of action potential in mouse sino-auricular node cells // 37th Congress of IUPS (Birmingham, UK) (2013) Proc 37л IUPS PCB052 (WOS 2.602).

8. Golovko V., Gonotkov M. The contribution of currents involving potassium ions in the formation of action potential in trae pacemaker cells of mouse sino-auricular node// Cardiovasc. Res. 2014. V. 103. P. 102-103. (WOS 5.808).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДПД20 ДПД,,,, ДПД 90 и ДПД100- длительность потенциала действия на уровне 20%, 50%, 90% и 100% реполяризации, мс

МДД - медленная диастолическая деполяризация, мс Е - максимальный диастолический потенциал, мВ

махе

ИВР - истинный водитель ритма

СВР - скрытый водитель ритма

О ДПД - общая длительность потенциала действия, мс

ПД - потенциал действия, мВ

СП-узел - синусно-предсердный узел

dV/dt - максимальная скорость нарастания ПД в фазу быстрой

макс

деполяризации, В/с

[К+] - концентрация свободных ионов калия вне клетки, мМ

V2 - скорость фазы «плато», В/с

V3- скорость фазы конечной реполяризации, В/с

V,- скорость медленной диастолической деполяризации (фаза 4), мВ/с

4-АП - 4-аминопиридин

Подписано в печать 20.03.2015 Компьютерный набор. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x90V, Бум. IQ allround. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1.0. Тираж 100. Заказ 131.

Информационно-издательский отдел Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Республика Коми, г. Сыктывкар, ГСП-2,167982, г. Сыктывкар, ул.Первомайская, д.50