Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль Са2+ как вторичного мессенджера в индукции защитных реакций в культуре клеток Allium сера L.

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль Са2+ как вторичного мессенджера в индукции защитных реакций в культуре клеток Allium сера L."

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМШ НАУК yKPAÏHH 1НСТИТУТ КЛГГИНИОГ БЮЛОПК ТА ГЕНЕТНЧНОК 1НЖЕНЕРЛ

р Г Б ОД - 2 ОПТ

ДЯЧОК Юл!я BUeiliBH«

РОЛЬ Са,+ ЯК ВТОРИННОГО МЕСЕНДЖЕРА В ШДУКЦ« ЭАХИСНИХ РЕАКД1Й В КУЛЫУР1 КЛтШ ЛШит сера Ь.

03.00.25 — кл1тиниа б1олог!и

Автореферат дисертацП на здобуття паукового ступеня кандидата бюлопчннх наук

На правах рукопнсу УДК 576.535:577.121

КиТ» 1995

Дисертащею е рукопис

Робота виконана в лабораторП 1муи1тету рослин

1нституту кл1тшшоТ б1олог11 та генегичноТ ШжеиерН HAH Укра1ни.

Науковнй KepiBiraK: доктор б'юлогЫних наук, професор

ДМИТР1СВ Олсксшдр Петрович

Оф!ц1йн1 опоненти: доктор бшлопчних наук

САРНАЦЫСА Верее« Васил1вна

кандидат 61олог1чнйх паук ПОГРЕБНЯК Натал!« Як1вна

Пров)дна оргашзащя: Нац!ональннй Университет ¡м.Т.Шевченка

Захист диссртацП в1Дбудеться ХГ _1995 р. о'^год. на эас1данн1

спец1ал1эовано1 вчено! ради Д.01.19.01 при 1нститут1 кл1тинно1 бюлогЦ та генетично! шженерИ HAH Украши за адресою: Ки1в, вул. Заболотного, 148. Поштова адреса: 252143, KjiIb - 143, вул. Заболотного, 148, 1КБП НАНУ

3 днсертац!ЕЮ можна оэнайомитись в б'1блютеш 'шституту

/

Автореферат роз!сланий "/**) " j JC 1995 р.

Вчепий секретар спец!ал1зовано1 ради, кандидат бшлопчннх наук Л.В. Малишева

ЗАГЛЛЬНЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуалынсть проблеми. Застосування xImiwhx засоб!в захисту рослин, неэважаючи на ефективйсть, мае багато негатишшх паслЦкш, поы'язаиих, в першу чергу, 1з забруднеиням навколишнього середйвнща. Тому в багатьох лаборатор!ях св!ту проводяться ¡нтенсивн! пошуки еколопчно безпечннх 3aco6iB захисту рослин. Усп1х цих пошук1в багато в чому залежить в!д з'ясувашш молекулярних механЬгпв, ЯК1 лежать в основ! ({лтснмущтету. У в!дп0в1дь на спробу Ыфшування рослшш включають механ!зми ¡ндукопано! стШкоЫ, до числа якнх належать: синтез низькомолекулярних антибютичних речовин — ф1тоалексишв (ФА) (Bailey, Mansfield, 1982, Метлицкнй, Озерецковская, 1986), синтез патоген-эалежних бЫк'т (Doller, 1983), в1дкладеиня л'тпна та калозн (Kaussetal., 1991), та in. В ¡дома, шо шдукцЫ захнсних реакцШ вшбуваеться пнаслЦок розп)знавашш рослиною певннх метаболiTiв патогена — т. з. 6iorennilx слхитор1В (Озерецковская и др., (984; Dixon, Lamb, 1990; Mansfield, 1990). Але молекулярна природа мехатзмш трансдукш! м!кробних сигнал!в в клтшах рослнн для актнвацИ захнсних реакши залншаеться нев1домою. ОстаннЫ часом з'явились дан1 щодо участ! Саг+ в ¡пдукий окремих захнсннх реакШй у рослин (Kurosaki et at., 1987; Kohle et al., 1987) riepeeipKa гшотезн про калъшеву сигнал1зашю при po3ni3iiaBa!nii патогена рослнною нотребуе експерименталышх дослщжень, супроводжуваних прямими виьпрамн змш концентрацП ннутршшьокл ¡тинного Са2+ у в1дпов1дь на ураження. Корисною модельною системою для проведения таких дослщжень е суспензШна культура клпип пибуяi (Allium сера L.). В naiuifi лабораторп було встановлеио, що у вщпошдь на шфшування патогеном Botrytis cinerea або на обробку ел1ситором в тканинах цнбул! синтезуюгься фтмлекснни, ям булн ¡дентнфшаван! як 1,3-д1он-5-октил-цнклопентан

та 1,3-дюи-5-гексил-циклопентан (цибулши 1Д i 2Д) (Дмитров та 1н., 1987). 1ншою захисною реакшею цибул1 на спробу Ыфжування патогенными мжрооргатзмамн е мехашчне змщнення юйтинно? стшкн за рахунок в1дкладеш!я 1,3-р-глюкана калози. Використовуючи ni flai pi3Hi захисш реакци як маркери ¡ндуковано! стШкост!, ми виршили дослщити участь Са2+ в трансдукцП сигналу для реал1заци ф1Т01мушю1 ВШПОВЫ.

Мета роботц. Робота присвячена вивченню рол1 Са2+ як вторинного месенджера в ¡ндукцн ф1Т01муни01 в1дпов1Д1 в культур1 клггин цибул! на приклад1 двох pi3iwx захисних реакцШ — синтеза ФА та калози. Для досягиення uiei мети були поставлен! так1 завдання:

1. Отримати культуру юитин Allium сера та з'ясувати умови пшукиП в нш синтезу ФА та калози.

2. Вивчити вплив речовин — aronicTiB та антагошстш pi3inix еташв шляху кальШево! сигнал1зац» — на ¡идукщю захисних реакцШ в культур! кл!тин цибулЬ

3. За допомогою кальщйчутливих флуоресцентних зопд!в дослшити вплив ¡ндуктор1в захисних реакцШ на концентрацию виьного цитоплазматичного Са2+ в юптинах Allium сера.

Наукова иовизна i практична uiHHicTb роботи. Вперше вид1лено ф1тоалекс»ши цибулши 1Д i 2Д з суспенз!йно! культури клтш А. сера. Пццбраш оитнмалыи умови для 1ндукци синтезу ФА i калози в суспензН клтш цибуль Виявлена необхщнкть Са2+ для пщукцп захисних реакцШ в оброблених елюитором клшшах А. сера. Показана залежн!сть Са2+ струм!в через плазматичну мембрану, як! виникають внасл1док 1ндукщ5 захисних реакцШ, в!д цАМФ. Вперше за допомогою кальцШчутливого флуоресцентного зонду 1ндо-1 доведено вшшкнення транз1ентного

калъщевого сигналу в протопластах цибул1 у вщпов!дь на обробку елкитором. Внзначеиня рол1 Са2+ як вторишюго месенджера в ¡ндукцп захнсннх реакадй може бути внкористане для розробки нових, альтернативиих метод1в захисту рослин.

На захнст внносяться положения:

1. СуспеизШна культура к л ¡тин А. сера може бути використана як модельна система для досл1дження мехашзм>и трансдукцП мжробних сигнал)в в клнинах рослин для активаца захисннх реакшй.

2. Са2+ виконуе функцн вторннного месенджера в ¡ндукцн двох захисних реакцш — синтезу ФА та у творения калози — в клтшах суспензШно! культури А. сера.

Апробашя роботн. Результаты дисерташйноТ роботи доповщались на 3-му М1жнародному конгресс з молекулярно! бюлоп! рослин (Тасон, США, 1991); 2-ому Роайському симпоэ1ум1 "Нов! методн бютехнолоп? рослин" (Пущино, 1993); 11-му М1жнародному 6|оф1зичному конгреа (Будапешт, Веигр1я, 1993); 1\/-му ввропейському конгреа з клпннно? бюлогй (Прага, Чех1я, 1994); М^жнародному конгресс по рослинним тканииам I культур! кл!тин (Флоренщя, 1талш, 1994); 9-му Конгрес! бвропейсько! ФедерацИ Сшлок ф1зюлог1в рослин (Брно, 1994); М>жнародному симпозиум! "Бютехнолопя та генетична ¡нженер1я рослнн" (Ки?в, 1994); 3-ому Росшському симпозиум! "Нов! методи бттехнолопГ рослин" (Пущино, 1995); 23-ому ЗЧзд! Федерацп бвропейських Бюх'1м1чних Сгплок (Базель, Швейцария, 1995).

Публжаш?. По материалах днсертацн опубликовано 8 ро61т.

Структура та об'ем роботи. Дисерташя складаеться з вступу, огляду лггератури, опису матер!ал1в 1 методш досл(джеиня, викладення результате та 1х

обговорення, заключения, висновюв та списка лператури, який м»стить 267 найменуваиь. Робота представлена на 115 сторЫках, мютить 31 малюнок та п'ять . таблиць.

ОБ'бКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛГДЖЕНЬ

Об'ектом дослщжень була цибуля рщчаста (Allium сера L.) сорта Скв1рський. Експеримснти проводили з цибулииамн, вегетуючими рослинами i, в основному, з калусною та суспеизШною культурами кл1тин цибул!.

Отримання калусио! та суепензШно! культур Allium сера проводили за стаидартиими методиками (Калинин, Сарнацкая, 1978).

Препарат грибного елкитора (КФ) отримували э культурального ф1льтрату Botrytis cinerea теля вирощування м!цел1ю гриба на протяз'1 14 д!6 на редкому середовшц) Чапека (Перковская, 1991). В дослщах по ¡ндукцИ синтезу ФА 400 мг кл'тш переносили в скляш Koni4Hi колби емшетю 100 мл, в яких було 20 мл буфера: (А) 0.1 мМ KCl, 0.1 мМ MgCl2, 0.088 М сахарози, pH 5.6 в доелдах з участю ЕГТА; (Б) 1 мМ СаС12, 0.1 мМ KCl, 0.1 мМ MgCl2, 0.088 М сахарози, pH 5.6 в yeix iiiiUHX досл1дах. Перед перенесениям кштин в безкальшеве середовище, клшми ДВ1ЧИ вщмивали розчином А ¡з додаванням 5 мМ ЕГТА.

Синтез ФА в суспензП кл1тин ¡ндукували додаванням 1 мл КФ. Сумарний BMici ФА 1Д та 2Д визначали за допомогою високоефективно? рщшшо! хроматограф» (ВЕРХ) на прилзд! НРС (Чсхословаччина) з прямофазною аналогичною колонкою Sepharon SGX В систем! гексан-д^егиловий еф[р (3:1) (Dmitriev et al., 1990). Сумарну юлыасть ФА 1Д i 2Д розраховували у вшносних

одиницях на одиницю ваги сиро!" маси к л ¡тин..

Для шдукшГ синтезу калози кл1тини з суслензШиоГ культури цибул!, осаджеш на капроновому ф1льтр| (300 мг), ресуспендували в буфер1 для ¡ндукш! синтезу калози: 0.1 M Tpic/HCI (pH 6.9), який micthb 2% сахарози i 5% поживного середовтца BDS. Концентрация калъц1ю становила 1 мМ, кр!м дослЩв за участю ЕГТА, коли Са2+ в середовшш був вщсутшй. Синтез калози ¡ндукували додаванням хпозану в концеитрацп 0.2 мг/мл. Bmîct калози в екстракт! клггин визначали по флуоресцетш анипнового блакитного (Kohle et al., 1987) i виражали y мг-екв1валентах пах1мана/мг бшку.

Протопласта вид1ляли з nip'n етиольованих рослин цибу.'и. Для ¡золяцп використовували 0.5 M розчин сахарози, який мктив 1 мМ CaCI2, 0.2% (в/о) целкШзша, 0.2% (в/о) мацерозима та 0.4% (в/о) оиозуки.

Для навантаження флуоресцентного зонду ¡ндо-1 використовували протопласти безпосередньо ni с ля ввд1лення. Навантажений здШснювали за модифШованим методом Bush and Jones (1987). Для цього протопласти ресуспендували в 1мл розчииу WSB, до якого перед там додавали 15 мкМ ¡ндо-1. Склад розчину: 1 мМ СаС12, 0.1 мМ MgCl2, 0.1 мМ KCl, 20 мМ галактози, 0.5 M маттолу, 10 мМ диметнлглутарово! кислота (pH 4.5). Пгсля навантаження зонду протопласти переносили в розчин вим1рювання WSÄ, аиалопчний за складом WSB, але замютв диметилглутарово! кислота niit м1стив t0 мМ MES (pH 6.0).

Вим)рювання флуоресценцН ¡ндо-1 в суслензП протопласт« проводили на спектрофлуоримстр! СДЛ-2 (ЛОМО, Роспя); довжина хвил1 збудження 350 им, спектральна ширина иилини 5 нм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА tX ОБГОВОРЕННЯ

1. Розробка иодсльноТ систем» для досл!джения мсхамзжв шдукцН захисних реакций Allium сера

Отрпмання культури кл!тии иибул! in vitro

Калусну культуру цибул1 вирощували на р!зних модиф!кащях двох середовшц, MS (Murashige, Skoog, 1962) та BDS (Dunstan, Short, 1977).

Оптимальним' для росту калуса в «явилось середовшце BDS IV - середовнще BDS з додаванням 3 иг/л 2,4-Д, 0.1 мг/л БАП i 0.5 мг/л НОК, 7.5 мг/л екстракта др!ждшв та 250 иг/л гщрол^зату казеТна. На середовищ! BDS IV наприкшц!

8-тижиевого периоду культивування калус являе собою досить пухку жовту тканину з трохи слиэькою поверхнею. СуспензШна культура мае вигляд калаиутно! 3aeici клтш, яка мостить невелик! глобулярт грудки.

Дал! треба було з'ясувати, чи накопичуються ФА в калус1 цибул1, i 1йД|брати оптимальн! умови для ШдукшПх синтезу.

Синтез ФА в калуснш тканин! иибул1

Виявилось, що в калуснш тканиш цибул» при вирощуванш П на агаризованому поживному середовинц BDS IV в1дбувавться синтез ФА 1Д та 2Д.

Для визначення в серсдовицу компонента, який вциграе роль шдуктора накопичення ФА, дослщжували залежшсть иакопичення ФА в калус! цибул!, вирощуваноиу на середовиии BDS IV, вщ концентрацН кожного з гормон!в, що

входять до складу цього середовища. установлено, що i3 збмьшешшм концентрацЛ НОК накопичення ФА зростае. Навпаки, эбмьшення концентрацЦ 2,4-Д в середовищ! iiiriöye накопичення ФА в калусн!й тканин!. Змша конценграцН БАП не впливала ¡стотно на к!льк1сть ФА у калуы А. сера.

Таким чином, в культ/pi клтш А. сера за певних умов в!дбуЕаеться синтез ФА. Така культура в принциш може бути об'ектом для досл1дження ¡ндукцп захисних реакций у цибул!. Проте дослщження молекулярних мехашзм!в 1ндукованих захисних реакцШ крате проводит на суспензШнШ культур! КЛ1ТИН. В гомогеншй суспензН, на в 1дм¡ну в|д калуса, sei кл!тнни п!дпадаютъ п!д вплив дослщжуваних речовин. Тому подальш! дослшження проводили на суспенз!йн!й культур! клтш А. сера.

2. 1ндукован! захнеш реакц!! в суспеиэШнШ культур! Allium сера

1ндукц!я синтезу ФА в суспензШнШ культур! кл!тин А. сера

Виявилось, що спори та культуральний ф1льтрат ф1топатогенного гриба Botrytis cinerea, а також деяк! пекпштичн! ферменти здатн! ¡ндукувати накопичення ФА в суспензШшй культур! кл!тин цибул!.. Найбиьшу ел!Ситорну активн!сть виявляла сум!ш пектолличних фермеипв: 0.1% (в/о) целюлази + 0.1% (в/о) пектинази (26 вщн. од./г).

Досл!джено динамшу синтезу ФА 1Д та 2Д в суспснзшшй культур! клтш цибул!, оброблешй КФ. Протягом 17 год теля обробки КФ накопичення ФА в культур! клпнн не в!дбуваеться. Максимальне накопичення ФА в культуральному фкчьтрап кл!тин А. сера спостер!гаеться через 48 год шеля додавання елюитора i досягае приблизно 12 вщн. од./г, п!сля чого к!льк|сть ФА в середовищ! nociyr/oBo зменшуеться.

Вплив гормон1в на 1ндукований синтез Фд в суспензшшй культур! А. сера Юльмсть ФА, синтезованих суспекз^ею клтш цибул1 у в1дпов1дь на обробку елкитором КФ, эалежить в!д гормонального складу середовища, на якому вирощували культуру перед додаванням елкитора. Виявилось, що по аналоги з конститутивним синтезом ФА, концентращя в середовинн 2,4-Д > 2x10"7 М, шпбувала ¡вдукований синтез ФА.

Додаваиня до поживного середовища кр1м 2,4-Д ще 5х10"7М НОК або 2х10"6 М кЫетина частково зшмало 1ипбуючий ефект 2,4-Д на ¡ндукований синтез ФА. На рис. 1 видно, що додавання до поживного середовища 3x10'5 М 2,4-Д та 2x10"6 М кШетина приводить до 1ндукцп синтезу ФА у В1ДПов1ць на обробку

ел!ситором при низькому ршш конститутивного синтезу, тобто дозволяе моделювати в культур! клтш процес !ндукцП синтезу ФА в !нтактн!й

рОСЛИШ.

Це дозволяе використовувати суспензШну культуру клтш А. сера як модельну систему для вивчення мехашзм1в ¡вдукцП ФА — в!дпов1д1, осьмльки нона мае три необхщш риси: 1) це гомогенна суспензия; 2) за

30

!ао

§

№

S 15

р

Ц 10

я о н

ё 5

Рис. 1. Сйнтез ФА в суспенэШнШ нормальних умов ФА в нш не синтезуються; культур! Allium сера при р!зному

гормональному склад! поживного 3) фд синте3уються в суспензшшй. культур! у середовища: *

1—Эмг/л2,4-Д; .

2 - 3 т/л 2,4-Д та 0.6 «г/л кшет.ша; в!дпов1дь па обробку елкитором.

3 — 3 мг/л 2,4-Д та 1 мг/л НОК;

О — кокститутивний синтез, С — 1мдукований синтез

Для дослцження механ!зм!о трансдукщ! сигналу при "розп1энаванн1" патогена зослиною важлнво анал!зувати »¡ндукц1Ю р1зних захисних реакшй. Синтез ФА е }дним з компонентов комплексно? ¡мунно! в!дпов!д1 у А. сера. 1пшою важливою >ахнсною реакц!ею на ¡нф!кування патогенними мжрооргашзмами е мехашчне змщнеиня кл1Тинно1 стшки цибул! за рахунок В1дкладення калози. Тому необхщио 5уло пШбрати оптимальш умови для шдукцп синтезу калози в суспензШнШ культур1 клтш цнбул!.

1ндукшя та флуориметричне визначення вм!сту калози в суспензштй культур! КЛ1ТИН ш;бул1

Обробка суспензШно! культури кл1тин цибул! ел!ситором х!тозаном приводила до зб1льшеш1я вм!сту калози.

Дослужено дйнамжу в!дкладеиня калози в кл!тинах, оброблених елкитором. Виявилося, що збшьшення вм!сту калози в оброблених х!тозаном кл!тинах пор1вняно э контролем в)дбупаеться вже через 20 хв п!сля обробки елкитором.' Вм1ст калози в культур!, оброблешй ел!сйтором, зб!льшуеться майже прямо пропорцШно часов! 1 цосягае максимума через 7 год. Проведен! експернменти дозволили шд^брати оптимальн! умови для ¡ндукцИ синтезу калози в суспенз^йшй культур! клтш А. сера. В подальших досл!джепнях вм!ст калози в клтшах визначали через 4.5 год п!сля обробки ел!ситором х1тоэаном (0.2 мг/мл).

Проведений пошук оптимальних умов для ¡ндукцН обох захисних реакшй — синтезу ФА та пакопичення калози — в суспензшнш культур'! клтш А. сера дозволяе використовувати цю культуру як модельну систему для вивчення мехашзм1в ¡ндукци захисних реакц!й, зокрема, визначення вторинних месенджср!в при

трансдукцн сигналу всередит рослннних кллгш.

3. Вплив зовшшньоклтшного Саг+ на ¡ндукцш захисних реакций

Значення зовнннньокл ¡тинного Са2* для ¡ндукш! захисних реакшй Спочатку треба було перев1рити, чи е потреба в Са2+ для ¡ндукованого елкиторами синтезу ФА 1 калози. Вияиилось, що наивность у поживному середовищ! Са2+ е необхщною умовою ¡ндукци захисних реакцШ в клтшах А. сера. При зв'язуваиш вшьного Са2+ в середовищ! за допомогою 5 мМ ЕГТА синтез ФА, шдуковашш обробкою КФ, блокувався новшстю, а ¡вдукованнй хггозаном синтез калози зменшувався втрич! (табл.).

Осмльки наявшсть Са2+ в зовншньоклтшиому середовищ! виявилась необхщною для ¡ндукцп елкиторамн обох реакщй — синтезу ФА та накопичення калози, було висунуто прнпущення, що в пронес! ¡ндукцП захисних реакцШ ¡они Са2+ надходять всередину клнини через кальщев! капали плазматнчно! ме^брани. Тому в подальших експериментах аналЬували ефекти речовин, ям впливають на концен-тращю внутр1шньокл1тинного калъщю.

Таблиця

Вллив антагошстш Са2+ на !ндукований елкиторами (Е) синтез ФА та. калози в суслензШшй культур! кл!тин цибулК

Реагент Концеитращя ФА* Калоза*

-Е +Е -Е +Е

ЕГТА 5 мМ <1 39 31 52

Всрапам1Л 0.1 мМ 7 33 36 84

ЬаС13 0.1 мМ 13 26 - -

СоС12 0.1 мМ И 67 - -

ТМВ-8 0.2 мМ 8 43 39 89

Верапам!л + ТМВ-8 0.1 мМ+0.2 мМ 7 <1 37 <1

"— "-не тестували

* Дан1 наведен! Як вщсоток к!лькост| щдпшплнкх речовин, ик! накопичуються в коктролънШ суспен.т, обробленШ лише елкиторамн

Впдмв aroiiicTiB та антагон1ст1в Са2+ на ¡нпукшю захисних резки»!

Досл1джували д!ю 6локатор!в Са2+ канал1в на ¡ндукцш синтезу ФА та калози. Верапами е блокатором потешиал-залежних Са2+ калал!В в клтшах тварин (Erdreich , Rahamimoff, 1987). Нещодавно показана його ¡нпб!торна д'ш на ряд Са2+-залежннх npouecie у рослин (Магте, 1989).

Внявилось, що обробка верапаинлом (100 мкМ) cycnensifiitoi культури клшш Л. сера шпбуе ¡ндукований елкиторами синтез ФА в 6 раз1в, а калози — в 1.5 рази nopiBiiHiio з контролем (культурою, обробленою лише ел1ситорами) (див. табл.). Тобто, в результат! зв'язування елкитора з г1потетичним рецептором плазматично! мембрани в клтшах цибул! можуть активуватися потенц!ал-залежш Са2+ капали.

Для з'ясування того, чи потрапляе Са2+ до цитоплазми лише через потенщал-залежн! капали, досл!джували д1ю imuiix блокатор1В Ca2t канал'|в. Вщомо, що ¡они La3+ та Со21" в клтшах тварин, завдяки конкурентному зв'язуваншо, блокують pisiii види Са2+ канал1в: потенщал- та хемо-чутлив1 — в кл1Тинах тварин (Крышталь, 1985). 1они La3*' взаемод!ють з багатьма функц1ями Са2+ в кл!тинах рослин (Hep)er , Wayne, 1985). Обробка к л ¡тан ¡онами La31" показала, що вони бмын ефективцо ¡нпбуютъ синтез ФА в кл!тинах А. сера, н1ж верапам!л, якнй е блокатором лише потеншал-залежних Са2+ канал!в (див. табл.). Таким чином, внаслщок "розшзнавания" ел1Ситора рослиниою клтшою, вфопдно, активуються pi3Hi типи кальщевнх канал ¡в, по яких Са2+ може потрапляти всередину клшши.

Для перевфки цього припущення дослщжували вплии Са2+ ¡онофору А23187 на шдукованнн ел1ситорами синтез ФА та накопичення калози в клтшах цибуль Вщомо, що ¡онофор д\е як переносчик, полегшуе надходження ¡она через плазмалему i внасл!док цього приводить до збиьшення KOimeHTpanii ¡ошв Са2+ в цитоплазм!

кл!тшш (АНа1е]о,Оагс!а-

ЗапсЬо, 1988).

Додавання кшофору Са3+ А23187 в !нкубац!йне середоишце виклнкало пом!тний стимулюючий ефект на 1ндукц!ю синтезу ФА та калозн (рис. 2). Стимулюючий ефект А23187 по в!дношенню до обох эахисних реакцШ зростав ¡э збиыпенням концентрацИ (онофора в середовищ!.

Обробка кл!тин цибул! ¡омофором А23187 стимулювала синтез ФА та иакопичення калозн нав!ть у в!дсутност1 елкитор!в. В концентрацИ 15 мкМ А23187 викликав накопичення ФА, яке перевищувало 1хшй вм1ст в контрол! в 3.5 рази, а калози — в 3 рази. Юльюсть ФА та калози, ¡ндукованих обрйбкою ¡онофором, мала такий же порядок велнчшш, що 1 у кл!тин, оброблеиих ел!ситорами захисннх реакц!й. Тобто сам ¡онофор виступае в рол1 активного 1ндуктору эахисних реакцш. Це дае п1дстави виажати, вдо эб1льшешш копцентрацН Са2+ в цитоплазм! е своерщннм тр1гером каскаду захисннх реакцш.

Дослщжували динам!ку ¡ндукованого ел!ситорами потоку Са2+ всередину ттт А. сера. Виявилось, що шг!буючий ефект верапам!ла на шдукщю обох эахисних реакцш залежить вщ часу його додавання. Так, пригн!чення синтезу ФА та

!5

*ю 4

8 в

А

ь.

й к

N

1

1

з

4

\

Рис. 2. Синтез ФА та калози суспенз1ею кл!тин оброблеиих Са2+ 1онофором А23187:

1 — контроль;

2 — обробка елкиторами;

3 — ^онофор (15 мкМ) + ел1снтори;

4 — кшофор (15 мкМ) у в|дсутност1 ел|си?ор1в.

Б — синтез ФА В — накопичення калозн

б

А. сера.

6

«

калози вщбуваеться лише в тому вниадку, коли верапам^л додавали до клтш за 20 хв перед обробкою елкиторами (рис. 3). Якщо верапам!л додавали через 10 хв п!сля обробки ел1снторами, в!н, навпакн, стимулював синтез ФА та калози.

Оск1льки

>20

§

« 15

а з

110 е 5

а

ы

8 £

\

в

1

вепапамЦ Рис-3. Д'я вералам1лу(100 мкМ) на ¡вдукованнй синтез ФА та калози а суспензн кл1тин Л. сере в залежкост! в!д часу його додавання: 1нг1буе синтез ФА та калози 1 _ контроль;

2 — об ройка ел1ситорами; ■ т!льки при додаваии! його до 3 — додавання верапам1ла ад 20 хв перед ел1ст>рами;

4 — додавання верапам1лу одночасно э ел!ситорамн; культура до обробки ®— додавання верапам1лу через 10 хв п!еля ел)снтор1в.

0 — Синтез ФА,

, _ В — Накопичення калози.

елюитором, можна вважати, шо

Са2+ бере участь на початкових етапах 1ндукц11 эахисних реакцШ.

• Ррдь рпуто1мньо- та зов1иш1Чюкл1тинних пул!в Са2+ в 1ндукш1 захненнх реакшй

(8-Ы,Ы-д!етнлам!но)-октил-3,4,5-триметокс!бензоат (ТМВ-8) е блокатором внутр!шш>0кл1тннних депо Са2+ (Ко^та й ai., 1986). Додавання ТМВ-8 (0.2 мМ) до культури кл1тнн цибул! перед обробкою елкиторами викликало зменшення синтезу ФА в 6 раз1в, а калози в 2 рази пор&вняно з культурою, обробленою лише елкнторами (див. табл.). Одержан! дан! про ¡нг1бування ТМВ-8 1вдукц11 захисних реакц1Й в кл1тинах суспензШно! культури А. сера св)дчать, що внутр!шнь0кл1тиина

концентрация Са2+ [Са2+11 в процес! трансдукцП сигнала може зб1льшуватись не т1лькн эавдяки надходженню його зовш, эле й в результат! виходу в цитоплазму ¡з внутр!шяьокштштих депо, наприклад, з вакуол!. .

Все це ставило нас перед пеобхщшстю визначити, який ¡э пулш Са2+ вЩграе бшьш важливу роль в 1идукци захислих реакщй у Л. сера.

Було досл1джено ефект сп!льно? дп блокатор!в зовшшньо- та внутршньо-клггинних пулш Са2+ пор!вняно з окремою д1ею кожного з 6локатор1в. Виявилось, що шдуковашш ел1ситорами синтез ФА та калозн внаслщок обробки суспензЦ клгшн цибул1 0.1 мМ верапамиа та 0.2 мМ ТМВ-8 повшстю пригшчуеться (див. табл.).

Оск>льки шпбуючий ефект В1Д обробкн верапам1лом та ТМВ-8 е с1нерпчним, можиа припустит», що у вппадку блокування одного з Са2+ депо п!двищений ршеиь [Са2+]| теля обробки ел!ситором може тдтримуватися за рахунок надходження Са2+ з шшого, доступного депо.

Проте внутршшьо- та зовшшньоклтшний пули Са2+ вшграють, мабуть, р1зну роль в ¡ндукцН захисних реакцШ росли'шшх шнтин. Про що свщчить 1нг1буваиня синтезу ФА та калози в 6езкальц1евому середовииЦ (в присутност1 5 мМ ЕГГА). За цих умов внутрииньоклтшний пул Са2+ эалишаеться доступним, проте внасл!док видалення зовнкшнього кальшю захисш реакцП не ¡ндукуються.

Тому можна вважати, що первишшм етапом в трансдукцП елкнторного сигналу для ¡ндукшТ синтезу ФА та калози в суспензШШй культур! к л ¡тин Л. сера е зб1льшешш вмкту цнтоплазматичного Са2+ за рахунок надходжсиия його зовш через капали плазматичио! мембрани. В процеЫ подальше! трансдукцП сигналу, можливо, мае мкце внвьльнсшш Са2* в цитоплазму \ э виутр'шшьпкл'пшшчх депо.

Важливим було з'ясувати, ЯК1 мехатэми регулюють надходження Са2+ всередину клтши через капали плазматично! мсибрани шсля зв'язування елкитора з гшотетичиим рецептором плазматично! мембрани рослинно! клггини. Тому дал1 була досл1джена

4. Участь нАМФ в шдукци захисних реакций

Обробка суспензШно! культури клтш А. сера эгоистом цАМФ теофшном викликала ¡ндукщю синтезу ФА 1 калози (рис. 4). 1нтенсившсть цих захисних реакцШ в!др1знялась в залежмосп в1д концентрацН теофШна: для шдукш! синтезу ФА оптимальною була концентрац!я теофШна 0.05 мМ, для ¡ндукци накопичення калози оптимальною виявилась концентрашя тео(^1л1Па 0.5 мМ. 7 Одержан 1 дат св'щчать, що

6

шдвищепня р1вня цАМФ в кл!тит ^

ч

може стнмулювати синтез ФА та ° 5

.В

калози. "

е

2 -

Для перешрки цього

припущення дослщжувалл вплив

дибутирил цАМФ (дБцАМФ) на

пвдукщю синтезу ФА та калози в

суспенэШшй Культур! клтш

И 0 1 2 3 4 5

цибул!. ДБцАМФ, як шдомо, е Концентрашя теофШна, мМ

Рис. 4 Ефект теоф|Лша ка ¡ндукшю синтезу ФА » калози

в суспензи клтш А. сера. проникним через плазматичну , _ СИ1Пез фА. г

2 — накопичення калози

мембрану аналогом цАМФ, стШким до дП окислювач1в, 1 оброблеш ним клтши мають Шдвищений bmjct цАМФ в цитоплазм! (Kurosaki et al., 1989). Виявилось, що додавання дБцАМФ (0.01 мМ) до суспенэЯ юнтин, оброблено! ел!ситорами, приводить до эб!льшення синтезу ФА в 4 рази, а калози в 1.7 рази пор'1Вняно з контролем, обробленим лише елнаиорамн. Стимулююча активн!сть зростала !э зб1льшеш1Ям концентраца дБцАМФ, який стннулював синтез ФА в суспеизН кл!тнн А. сера i без ел1снтор1в. В концентрацП 0.1 мМ дБцАМФ мав приблизив такий же ФА^ндукуючий ефект в суспенз!йн!й культур!, як i бюгешшн елкнтор з В. cinerea (КФ).

Одержан) експериментальн! дан) дають можливють зробити внсновок про те, що пцдвшцення внупйшньоклтшно! концентрацй цАМФ приводить до (ндукш! двох эахнсннх peaKUifi - синтеза ФА 1 калози - в культур! кл!тин А. сера. Тобто, цАМФ також бере участь у трансдукца сигналу.

Дал! щкаво було з'ясувати, чн пов'язана Д1Я цАМФ на ¡ндукшю захисних реакшй в клггинах цнбул! з регулюванням внутршиьоклНтшного р1вня Ca2* , чн це е два неэалежних вторинних месенджери.

Досл!джували вплив верапам!лу, блокатора иотенц\ал-залежних Са2+-каналш, на ¡ндукований aroilicTOM цАМФ теоф!л!ном синтез ФА та калози в культур! кл!тин цибуль Як видно з рис. 5, в^суспензП юнтин, прешкубованих 30 хв з верапам!лом (100 мкМ), при обробц! теофЫном (0.05 мМ) накопичувалась майже вдв!ч1 менша к!льк!сть ФА, «¡ж у юитин, оброблених лише теофЬнном. 1ндукований теофшном (0.5 мМ) синтез калози пригн!чувався в 1.3 рази внаыНдок npeiiiKyöauii суспензи кл1тин э верапашлом.

Таким чином, можна стверджувати, що саме цАМФ-залежна активащя Са2+-

струму всередину клтши лежить в основ! ¡ндукш! захисних реакшй в клтшах А. сера.

5. Змпш внутр1ганьокл1Тншюго Са1+ в процес! ¡ндукца захисинх реакций у А. сера

Для шдтверджения одержаних нами даних про участь цАМФ-залежного короткочасного кальциевого струму в шдукци захйсних реакцш, необхшно було до-сл)днти вплив ел!ситор1в захисних реакц№ на [Са2+](. Для цього ми дослщили змшн [Са2+]| при шдукщ! захисних реакшй за допомогою Са2+-чутливого флуоресцентного

зонду ¡ндо-1.

7 6

и.

Ч

I5 14

д

Я 4

о >1

X о

5, 82

е

1

X

ч

ч

ч

ч

ч

ч >

I

$

\

I

\ \

N

Рис. 5 Вплив вералам(ла на ¡ндукований теофМном синтез . ФА та халози в суспензц к л ¡тин Л. сера:

1 — контроль;

2 — обробка оптимальною копцентраШею теофМну;

3 — додаваиня 100 мкМ верапам!ла за 30 хв перед об робкою тсоф1лшом;

4 — додаваиня верапам^ла через 10 хв п1сля обробки теофШном.

О — синтез ФА 9 — накопичення калози

Вплив ел1снтора КФ на коннентрашю питоплазматич-ного Са2*

Шсля обробки суспеиэИ протопласНв ел1ситором КФ спостер1галось шдиищеиия -флуоресцентного сшввщио-шення ' ¡ндо-1 (рис. 6), що св!дчить про збшыиення концентраца цитоплазматичного Са2+. Концентрашя Са2+| через

Л. сера, кавантажеких !ндо-1: I — спектр флуоресцеш! !нтактних протопласт!«;

2,3,4,5—спектри флуоресценцЦ протопласт! в шсля иосл!довного додаваияя до 1нку6ац1йного середовнща

10 мкл/мл ел!ситора КФ (2), 10 мкМ диг1тон!на (3), 3 мМ ЕГГА (4) та 20 мМ МлС1г (5). Концентрац!я Са2+ в ЫкубацШному середовищ! I мМ.

5 ХВ

Рис. 7 Диназшха зм!н флуоресцентного сшвылношеиня ¡идо-1 (К) в протопластах А. сера, оброблекнх сл!снтором КФ (10 мкл/мл). Строкою позиачене додаваний елкитора.

Я А»

г.»

и-

»И

Рис. 8 Вплив верапам!ла на ¡идукован! ел!ситором КФ змпш флуоресцентного сп1вВ1дношення ¡ндо-1 (К) в протопластах А. сера.

Строками позначено доливания 50 мкМ верапам!ла (В), 10 мкл/мл слЮитора (КФ) та 10 мкМ диг!тон!на (Д).

10-15 сек п1сля додавання КФ зростала в1д 220 нМ до 370 нМ.

Пщвищення [Са21"]] мало короткочасний характер (рис. 7). Флуоресцентне сшпвдаюшення ¡ндо-1 досягало максимального значения через 5-7 хв шсля додавання КФ I поступово спадало. Через 30 хв теля об робки КФ флуоресцентне сЫввщношення встановлювалось на стащонарному р)вн1, який в!дпов1дав на 20-30 нМ ВИЩ1Й концеитрацП цитоплазматичного Са2+, н1ж перед додаванням КФ. Такий стацюнарний р1вень [Са2+]| збер!гався В суспензи протопласпв протягом як мш!мум 1.5 год. Для э'ясуйання того, зовшшньо- чи внутр1шньоклтшний пул в кл1тинах цйбул! е джерелом шдвищення [Са2+]| шсля "обробки ел!ситором, ми досл!джували

Вплив верапамша на ¡ндукований ел!ситором кальи1евнй транз!ентний сигнал

Шсля 30 хв 1нкубащ1 з верапам1лом (100 мкМ), до суспензН Протопластов додавали КФ. При цьому. спостерц-ався сплеск концелграцп цитоплазматичного Са2+, але за ампл1тудого на 70% менший, тж в контрольнШ суспензП, необробленш всрапам1Лом (рис. 8). Оскмьки тимчасове пщвищеиня концелграцп цитоплазматичного Са2+ у в!дповщь на обробку ел1ситором 1иг!буеться верапакплом, можна прнпустити, що концентрац!я виутр1шньокл1тинного Са2+ в процеа 1ндуюш захиспих реакцш зростае за рахунок проникнення Са2+ зови! кл1тини через потенщал-залежгп кальшев! канали плазматично! мембрани. Це добре узгоджуеться з одержаними нами рашше даними про ¡нпбувадня верапамшом ¡ндукованого синтезу ФА в суспензшшй культур1 к л ¡тин А. сера.

Таким чином, результата експеримент>в по безпосередньому вим^рюванню концентраци вшьного цитоплазматичного Са2+ дають можлив!сть стверджувати, що:

1) в результат! обробки грнбним елкитором концентращя Са2+ в рослншшх кл!тияах п!двищуеться; 2) шдвищення [Са2+]| носить короткочасний характер; 3) р!вень Са2+ в цитоэол! зростае внасл!Док проникнення його зови! через кальщев! капали плазматично1 мембрани.

На баз! проведено! роботи ми визнали за можливе запропонувати такий меха-шзм шдукцп захисних реакцШ (рис. 9). Зв'язування елюитора з г1лотетичним рецептором на плазматичнШ мембран! приводить до активацй в клтпп фермент!в синтезу цАМФ. Пщвищения концентрацП цАМФ активуе Са2+-канали пЛазмалеми, через як! Са2+ поступав всередину кл1тини. 1ншим джерелом шдвищення концентрат! цито-плазматичного Са2+ можуть бути внутр1ШньокЛ1тинн1 депо Са2+, зокрема, вакуоль.

1они Са2+ можуть безпосередиьо активува-ти фермента синтезу захисних речовин

(наприклад, калозо-синтетазу), або, утворю-ючи комплекси з кальмодул!нами, активу вати протешкшази, як! в свою чергу активують ферменти, в!дпов!дальш за синтез ФА.

Рис. 9. Ппотетнчнз схема трансдукцИ елгаггорних сигнал!в в шптинах Allium сера

висновки

1. Одержано калусну та суспензШну культури кл1тин Allium сера. Шд!бран1 опгимальн! умови для досл1дже!шя ¡ндукцП захисннх реакшй в суспенэЦ кл1тин цибул1.

2. Встановлено, що Са2+ виконуе роль вторинного месенджера в 1ндукш! захисних реакцШ в к л ¡типах Allium сера.

3. Показано, що ряд речовин, як! модиф1кують концентрацпо цитоплазматичного Са2+, зм1нюють [нтенсивтсть синтезу ФА та калози ь суспензйнШ культур! клгтин Allium сера.

4. За допомогою кальцШчутливого флуоресцентного зонду ¡ндо-1 продемонстровано, що внасл1док обробки ел!ситорами захисних реакцШ в клтшах цибул1 тймчасово п|двищуеться концентращя цитоплазматичного Са2+ в основному завдякн проникненню його зови! через капали плаэматнчно! мембрани, та в меншШ Mipi — за рахунок виходу Са2 з ш1утр1шньокл1тинш1х депо.

5. Встановлено, що цАМФ бере участь в ¡ндукцн захисних реакцШ, можливо,

%

регулюючи надходження Са2+ в клгпши через канали плазматично! мембрани.

6. На 6a3i проведено! роботи зацропонований механ!зм шлукци захисних peaKUifi в клштах А. сера.

Список ро(ит, опублшованих по Teiii дисертаци

1. Dmitriev А.Р., Perkovskaya G.Y., DyachokJ.V. Activation of defence -related genes in onion //3 Intern. Congr. Mol. Biology. Abstracts. USA, Tucson.

Allium сера как объект исследования иммунных реакций растений //II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Тезисы. Пущина. 1993 г. С.137.

3. ДячокЮ.В., Гуща Н.И., Ковтун А.В., Дмитриев А.П. Синтез фитоалексинов лука культурой клеток Allium сера in vitro // Физиол. биохим. культ, растений. 1994. N4. С.399-405.

4. J.V.Dyachok, А.Р. Dmitriev. Pathogen - elicited phytoalexin synthesis in Allium сера cell culture depends from calcium. // Vlllth International Congress of Plant Tissue and Cell Culture. Abstracts. Italy, Firenze. 1994. P.222.

5. DyachokJ.V., Dmitiev A.P. Calcium involvment in elicitation of phytoalexin synthesis in Allium сера cell culture // Cell Biol. Intern. 1994. V.18, N5, P.405.

6. Dmitriev A. P., DyachokJ.V. Defence reactions and signal transduction in onion (.Allium сера) cells // International Symposium "Plant Biotechnology and Genetic Engineering". Abstracts. Kiev. 1994.

7. ДячокЮ.В., Дмитриев А.П. Регуляция синтеза фитоалексинов в культуре клеток Allium сера in vitro // III Международный симпозиум "Новые методы биотехнологии растений". Тезисы. Пущино. 1995 г.

8. Дячок Ю.В., Дмитр>ев О.П., Гродзинський Д.М. Трансдукщя сигналу для синтезу ф^оалсксишв в культур! клшш Allium сера in vitro. / / Доповад HAH Украшц. 1995. N4. С.101-103.

1991. Р.1314

2. Дячок Ю.В., Гуща II.И., Ковтун A.B., Дмитриев А.П. Культура клеток

Дячок Ю.В. Роль Са2+ как вторичного мессенджера в индукции защитных реакций в культуре клеток Allium сера L.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25 - клеточная биология, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1995.

Защищается 8 научных работ, которые содержат исследования роли Са2+ в индукции защитных реакций в суспензионной культуре клеток Allium сера L. Установлено, что Са2+ выполняет функции вторичного мессенджера в индукции синтеза фнтоалексинов и накопления каллозы. С помощью Са2+ - чувствительного флуоресцентного зонда индо-1 показано, что в обработанных биогенным элнситором из фитопатогенного гриба Botrytis cinerea протопластах Allium сера происходит кратковременное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме за счет проникновения его извне через каналы плазматической мембраны.

Dyachok J.V. Role of Са2+ as a second messenger in elicitation of defence reactions in Allium сера suspension cell culture.

Thesis for obtaining scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.25 - Cell Biology, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1995.

8 published papers to be defended contain investigation on role of Ca2+ in induction of defence reactions in Allium сера suspension cell culture. Ca2+ has been established to be a second messenger in elicitation of phytoalexin synthesis and callosc accumulation. Measurements of intracellular calcium concentration with fluorescent probe indo-1 shown that apparent transient calcium signal occurs in onion protoplasts treated with biotic elicitor derived from Botrytis cinerea.