Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ретиноевой кислоты в процессах пролиферации и дифференцировки клеток линии К562

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль ретиноевой кислоты в процессах пролиферации и дифференцировки клеток линии К562"

?Г8

') "I ^^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ цитологии

На правах рукописи

ЧИСТОХИНА Анна Валерьевна

РОЛЬ РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ В ПРОЦЕССАХ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК ЛИНИИ К562

03.00.25 — клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

19 !)3

Работа выполнена в Институте цитологии РАН.

Научный руководитель — кандидат биологических наук А. В. Медведев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. К. Дондуа; кандидат биологических наук О. А. Петухова.

Ведущее учреждение — Институт экспериментальной медицины РАМН.

на заседании Специали_ , . _ , уте ци-

тологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологи" ран

Защита состоится

часов

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

©Институт цитологии РАН

общ хпттшстш РАБОТЫ

В настоящее время быстро развивавшимся направлением биологической падки стало изучение особенностей дифференцировки клеток разного тканевого происхо1дония, связанных с различиями в их спо-' собности отвечать изменение* программы развития на внешние сигналы. Изучение этих процессов вато для понимание закономерностей

С

сламснного фцннционирогтиия специализированных клеток в организме и причин, приводящих к возникновении злокачественных новообразований.

В каз&ой клетке сучестпугт »«сколько оЬновинх путей передачи сигнала от поверхностной иеибранн в ядро, где разворачивается основные события регуляции генетической программа развития и функционирования клетки. Во внутриклеточной трансформации сигнала принимает участие ограниченное число вторичных мессендмеров. Вероятно. чго сочетание активности разных сигнальных систем обеспечивает разнообразив и специфики клеточных реакций на воспринимаемые стимулы.

Находясь о обычной среде обитания внутри организма камдая клетка постоянно становится нияеньв действия различных опсяних агентов. Одни из них является индукторами пролиферации или дифференцирован данного типа клеток, другие ме не проявляют фенотипи-ческого эффекта. 'Каким образов осуществляется такой яеетний контроль, не позволявший клетке адекватно реагировать на "чужие" стимула, до сих пор достаточно плохо изучено. ЧаЧе всего, убедиввись, что агент не вызывает изменения пролиферативннх характеристик данных клеток, автора переходят к работе с адекватными индукторами, не анализируя причину блокирования проведения сигнала ( Ооиег е1 а]., 1982: КоеГПег, 1983 ). ,

Для изучения взпросоз. связанных с кндякцией пролиферации или

дифференцировки, удобными моделями являются постияшшс .^иличииь линии. Одна из них, человеческая эрнтролсйкеничесиаа jü;i¡ks К5В2 ( Lozzío, Lozzío, 1975 ), била использована в навей забито. Клеточная линия К562 происходит из клетки раннего геиатопо.-.тичшмго предвественника к потока способна дифференцироваться а ¡.азии: направлениях в ответ на воздействие соотьстстицацих индукторов ( Loízíо. Lozzío, 19?9; fïndcrson et ah, 1073; îetteroo et al., 1884: Papayaimopoulou et al., 1387 ). Тан 12-0-тетрадекшшмФор-боя-13-ацетат ( tOÛ 5 ншшцирдет появление карцеров мегакариоци-гарйой йКФФерсняг;ровии в sn« клоках ( Tettcroo et al., 1904; Papayannoppulou et al., 1907 ). Необходимо подчеркни!ь, что вопрос о кещюзце Т'ТЙ-яз f&u цнр о pätiin о Я диелсренцлроики иле тон яниак К582 до сия пор является првдыетои дискуссии ( Hurray et al.. 1933; Yen et al., 1333 J, Дрцгйй ваагшД ыорфоген п индцитор дйф-Фереицировня клеток как ir, vivo, так и In vitro - рвтшюевая кислоте С Sporn, Roberts, 1983; ilolf, 1504: Durstor. Ы al., 1302 ) jig сказывает ао цатши ¡шотоци* sarapes $е«<тшачесвого эффекта «а клетки линии К562 (Douer et al., 1902; Kgeífler, Í903 ). Предполагай. что это иокет бить связано с перестройкой гена рецепто-• ра ретшюевой кислоты ( Robcrtsson et al., 1S31 ), ародцкт которого о иорив является транскршцкошша Факторои С Green, Chaabon, 1388; llahlí, Martines. 1S31 ,). Однако не всегда сдцсствованне перестройки гена ведет к нарушив индукции фснотппнческих .вффзктов. Так перестройка гена ЯЯЙа в клетках острой яровивлоцитаряоЯ.лейке-ииа не блокириет .РК-иидуцировашшв дкфферреицировки, на чем к основа!! iiqbuA помой к яечезтп атого заболевания ( iluang et al., íSOS; Castalgne el al.. 1930; Blondi et al.. 1991; Lo Coco et al.. -Í89L). • '

Известно, что PK и T<ífl когцт вастцпать «ак антагонисты в ре-гцляции.-транскрипции лскоюрих гонов ( Schule et al., 1391; Desbots

а'. а1., 431 ), одипгп кхевтся донные и о позитивном влиянии РК на т;спрсс:; ч ОД-записиямс гонов ( йс СгооЬ е1 а1.. 1990 ).

Целя ; задачи исс.-.'^опания. Целью настояцей работы являлось выявление параметров нозмояиого влияния реТиноевой кислоты на клетки линии К56<!. 15 снязи с этин бнли поставлена следующие задачи:

1. Провести анализ пролиферативпой активности клеток линии К562 при воздействии на них рстипоевой кислоты. Провести анализ сочеташ: то воздействия фарболового эфира и ретииосвой кислоты на пролисеративпуи активность данных клеток.

?.. И-следовать регуляции экспрессии генов ядерных рецепторов ретиноеп'Я кислоты в натизннх и обработанных РК или/и ТФЙ клетках линии КЕ::г. . • .

3. Провести анализ /йК-свяоывавчой активности транскрипционных факторов Р.(Ша, !ЩЬ н АР-Г в нативних и-обработанных РК или 7ФА клетках линии К562.

Научная новизна работы.

Работа содерхит ряд новых данных об особенностях пролифератнв-пчй активности клеток линии К562 при сочсташша воздействии на них 'ПА и РК, а так гс об особенностях экспрессии генов рецепторов ретииосвой кислотн в клетках данной линии.

Комплексное применение методов анализа пролиферативной активности клеток, анализа экспрессии генов и анализа /¡НК-связывапщей активности транскрипционных факторов позволило.определить пара-астры влияния РК на некоторые процессы, протекающий в клетках К502.

Проведенные.исследования показали, что р^тиноеная кислота усиливает антипролиосративиое действие форболового эфира на клетки линии К562.

Впервые показано, что вренелная динамика экспрессии рецепторов ретииосвой кислоты в клетках данной линии имела существенные осо-

бенности по сравнении с клеточными моделями, диффсренцирцичииися в ответ иа индцкцив РК.

Обработка клеток форболовым офиром влияла на экспрессии рецепторов ретиноевой кислоты, если его добавляли совместно с ретиноевой кислотой. Так сочетанное воздействие на клетки К5в2 ТФЛ и РК приводило к снижение экспрессии гена Ша, но к повышению уровня экспрессии (ШКЬ.

Полученные дашшс позволит судить о возможных механизмах воздействия используемых агентов на клетки линии К582. Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались иа Всероссийском совещании по биологии клетки в культуре ( Санкт-Петербург, октябрь 1992 г. ) и иа XI Симпозиуме "Стриктура и функции клеточного ядра'Ч Санкт-Петербург, октябрь 1993 г. ), на семинарах в Институте цитологии Р1Ш. Публикации.

По гене диссертации опубликовано 3 работы. Обгеи работа.

Диссертация нзлояена иа страница;; каашюписного текста,

состоит из введения, обзора литературы, описании иатериалов и

1 ' ■

истодов исследования, излонения результатов и обсуждения их, вн-водов, списка литературы, состоацего из наименований. Материалы диссертации иллвстрированы рисунка»» и 2 таблицами.

г,

ИЙТЕРИШ И МЕТОДЫ

Кцльтивнрованав клеток

Клегкн человеческой эритролейкеыичеашй линии К5В2 культивировал» в среде ЙРШ с 10 % аибриональиой сыворотки коров. Пересевали клетки каадие 2-З сцтон.

Все эксперименты проводились с использованием клеток, иаходив-«ихся в экспоненциальной Фазе роста. При этом клетки рассевали в плотности 200000 кл/мл, давали им прикрепиться к поверхности ча-«ек Петри ( 10 - 12 ч ) и затем добавляли ТФй и/или PK, в зависимости от задач эксперимента.

Анализ пролиферативной активности клеток

Принцип метода заключается в том, что скорость вклвчения ЗН-тимидина в синтезирувхувся ДНК прямо пропорциональна интенсивности пролиферации клеток ( Адаме, 1983 ). °

Отбирали аликвоту клеточной суспензии для подсчета количества клеток в 1 миллилитре культуральной среды. Подсчет клеток произво-.дили в камере Горяева. Параллельно производили импульсное мечение синтезйрувчейся JHK. Для этого трихды отбирали по 100 мкл клеточной суспензии и добавляли по 10 мкл раствора ЗН-тимидина ( по 1 икКп ). После инкубации в С02-инкубаторе при 37'С в течение 2 часов по 70 мкл суспензии накосили на стеклянный фильтр ( "Serva" ). который промывали 1 мл 7,6 X раствора ТХУ дважды и один раз 1. мл 98 X этанола. После этого высушенные фильтре помещали во флаконы с сцинтилляциоиной мидкостьв 1С-8.И на анализаторе бета-излучения определяли количество импульсов в минуту.

Полученное среднее значение для трех повторностей соотносили со средним значением количества клеток в 70 мкл, определяя таким образом удельное поглощение ЗН-тимидина клеткой.

Анализ экспрессии индикаторныхплазмид

Для временных трансакций брали 5-10 ккг индикаторной плазки-ды на 60 мм чайку Петри, используя метод кальций-фосфатного преця-

.6

питата] Анализ активности хлораыфениколацстилтрши^е^азы ( CÍÍT ) проводили по методу Горман ( Goman. 1SGU ) через 45 ч поело :ракс-Фекции. Для этого клетки снимали и ресуспендиропали и 100 ккл 0.25 Н Трис-HCl рН 8.0. Затем проводили три цикла замораанвания-оттак-Вания, центрифугировали и определяли Ш-активиость в супернатаи-Те. Апеллирование 14-С-хлорамфеникола ( Aaershan ) определяли восходящей тонкослойной хроматографией в смеси хлороформ/метанол ( 20:1 ). После хроматографии пластинку экспонировали с рентгеновской пленкой.

Анализ количества специфической мРНК исследуемых генов

Тотальнуа клеточную РНК выделяли по методу Бирнбойиа ( Blrn-Ьо1в, 1988 ), денатурировали и наносили 10 мкг в лунки дот-аппарата для переноса РНК, используя метод последовательного разведения. Перенос осуцествляли в 25 нМ фосфатной буфере рН 0,5 на нейлоно-вув мембрану ( "Gene Screen". КЕН ) и гкбридизовали с 32-Р-меченц-ми последовательностями ДНК срответствцщих генов.

После гибридизации мембраны авторадиографировали с пленкой PU-1 или РЫ-В при - 70'С, используя усиливающий экран ( "Curlx KR600", "flofa"

Анализ ДШ-связываюцей активности транскр-лцкошшх факторов

Ядерные белковые экстракты выделали по иетоду, описанному Диг-иакоы ( Dignas et al., 1983 ). в модификации для кнни-экстрактов £ Schrelber, 1903 ) из клеток К502.

■ Реакции связывания белковых экстрактов с 32-Р-иечинами синтетическими олитщклеотидани TRE/AP-I. Ш£-а или RílRE-b проводили в отсутствии или присутствии 10-кратного или 100-кратного избытка

немеченых ( холодных ) конкурентов.

Анализ ДНК-белкового связывания проводили методом "задержки в геле", который основан на меньжей эяектрофоретической подвижности связанного с белком олигонуклеотида по сравнения со свободнмм ( Shneider et al., 1986 ). Электрофорез проводили в 4Z полиакрил-амидном геле ( 30 частей акрилакида: 1 часть бнсакриламида ). После фиксации гель сумили на холоду и авторадиографировали с

с'

рентгеновской пленкой РМ-В при -?0'С используя усиливаний экран ("Curlx KR800". "flyfa").

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ 0БС91ДЁНИЕ

1. Пролиферативная активность клеток линии К562 при их раэ-. -дельной обработке форболовмм эфиром или ретиноевой кислотой

Для изучения взаимного влияния ТФА и РК на пролифератизнув активность клеток линии К5В2 необходимо было проанализировать влияние на пролиферации каждого из используемых агбнтов по отдельности..

На рис.1 представлены результата анализа пролнферативной активности клеток К5В2. определяемые по вклвченио ЗН-тижидина в ДНК. синтезируемую в клетках dc novo.

Пролиферативная активность клеток линии К5В2 сильно изменялась в ответ на добавление в кцльтуральнув среду форболового эфира ( 100 нг/мл ). Яже через 8 ч после добавления Т0Д вклвченйе ЗН-тимиднна в ДНК клеток снижалось более чей в 2 раза ( рчс.1 ) и через 1 сут составляло уже не более 1.2 X от такового, измеренного до индукции.

Снижение пролиферативной активности клеток линии К582 при обработке их форболовым эфиром связано с индукцией мегакариоцитарной днфференцировки ( Tetteroo et al.. 1984: Papayannopoulou et al..

I

Рис. 1. -Динамика поглощения 311-тмидаша клетками линии К562, 7. 1 - нормально пролиферирупиив клетки;'2 - клетки, обработанные РК ( 10 икМ ); 3 - клетки, обработанные Ш'( 100 иг/мл )

по оси х - время, ч; но оси у - включение 311-тиыидина, У. от контроля С 0 ч )

х4<1,

воо-

200-

т 1

1

ш

I

!

I

" ^ о. ю > 0.1 „гумл терд

Рис. 2. Прирост клеток при обработке их разными концентрация-ип ТФй, кл/мл х 1000

1987 ). Причем показано, что ТФА индуцирует при этом задержу прохождения клетками линии K5S2 клеточного цикла ( Yen et al., 1993 ).

Известно, что длительное присутствие больших доз ТФА приводят к инактивации протеинкиназн С ( Закеп, 1990 ). что может также приводить к неспецивичсскому угнетения пролиферации клеток. Чтоб« убедиться в специфичности действия ТФА. мы рассмотрели действие разных доз последнего на клетки К562 ( см. таблицу ). Для этого в культуральнуя среду добавляли ТФА о различных концентрациях (10. 1 и 0.1 нг/мл ). Через I сцт регистрировали вклхчение ЗН-тимидинй и численность клеток и сравнивали полученные показатели с исходными значениями ( полученными до добавления агента ). Влияний ТФА на пролиферативнуи аг.тязность клеток зависело от дозн. 10 и 1 нг/мл ТФА сильнее снижали вклгачекие ЗН-тимидина в клетки. Кроме того, численность клеток практически не изменилась при использовании концентраций 10 и 1 нг/мл ТОЙ и незначительно возросла при добавлении последнего в концентрации 0.1 нг/мл ( р/с.2 ).

Подавление пролиферации клеток К502 при дейстпии ТФА имело необратимый характер. Так мы обнаружили, что для подавления пролиферации достаточно обработать клетки ТФА в концентрации 10 иг/ мл в течение 13 мин, а затеи заменить кцльтуральнуп среду ка та-новую без индуктора ( рис. 3 ). Увеличение времени инкубации с ТФА до 180 мин приводило даме к меньшему антипролиферативному эффекту агента по сравнение с обработкой в течение 15 шш ( рис. 3 ). Это означает, что остановка пролиферации клеток линии К5В2 под действием ТФА не связана со снижением активности протеинкиназн С. Однако, обработка клеток ТФА в течение 1 сут приводила к больжему снижении включения ЗН-тинидина ( рис. 3 ). *

Вклвчение ЗН-тимйдина в клетки, культивированные в течение 4 сут в присутствии ретиноевой кислоты, но отличалось от включения его в контроле ( клетки, культивкропанние в средо без индукторов

Рис. 3. Поглощении ЗН-тииидина клетками после обработки их . ТФИ ( 10 нг/ил ). г 1 - контроль С без обработки ТФП, принят за 100 У. ); ?. - обработка ТФА » течение 15 кип: 3 - обработки ТФП б течение 60 ыин; 4 - обработка ТФА и течение 100 шш; 5 - обработка ТФА и течение 24 ч

юоо-900 8оа-

700600 ■ 500 400 300 200

Рис.-4. Динамика численности клеток, кл/мл

I - иативная культура: 2 - клетки, обработанные РК ( 10 мкМ >

пи оси х - ррсмя, ч; по оси у - ил/им х 1000

в течение 4 cur ). В обоих случаях ни наблюдали равное по скорости постепенное снижение поглощения ЗИ-тимидина, которое иомет бить связано с истощением культуральной среды делящимися клетками. Подсчет количества клеток показал, что и в нативной культуре, и при обработке клеток ретииоевой кислотой прирост их численности происходил с равной интенсивность« ( рис. 4 ).

Полученные результаты укладывавтся в существующие представления о взаимодействии PK с клетками линии К562. Таи, Робертсон с соавт. ( Robertson et al., 1991 ) отмечает, что клетки линия K5Ö2, вероятно, япляптся устойчивыми к действия PK. Обработка их указанный индуктороа не приводит, по данным других авторов, к изменение пролиферативной активности и не вызывает появление маркеров дифференцирован ( Douer et al., 1902; Koeff 1er.Î9B3 ).

2. Пролиферлтивная активность клеток линии К562 при сочетаи-нои воздействии на них ©орболового эфира и. ретиноевой кислоты

Ориентируясь на одествувций интерес к вопросам детерминации клеток кы реаили проверить реагирование клеток К562 на сочетанное воздействие адекватного и неадекватного агентов ( ТФА и PK соответственно ).

Вэатшое влияние ТФА и PK на пролифератнвнув активность клеток исследовали при добавлении ТФЙ ( 100 иг/ил ) в культуральнув среду клеткак. растукна в течение 11 ч в присутствии PK ( 10 ыкМ ). Этот срок выбран кскодя из анализа временной динашши включения ЗН-тн-видина клеткаии, нормально пролиферирцпщиым в среде без добавления индукторов, и клеткааи, обработанными PK. В дайной точке наблвдали иакбольаее совпадение удельного вклшчениз ЗН-тиыидина и численности клеток ( рис. 1 и 4 ). Вклвчение ЗН-тииидина регистрировали чо-

-м. , *ял

. Е2 К' ЕЭ+п'*

Рис. 5. Влияние РК иа поглощение ЗН-ткмидтга клетками, обработанными ТФО ( 100 нг/мл )

Таблица

Включение тимидина в клетки К582 при действии ретиноевой кислоты и разных доз ТРП

Интенсивность вклпчения тимидина.

Вариант опыта

имг1/мин/кл, x 10, x td

решюевая кислота

, + рстиносвая кислота

Контроль ч ТРЙ, 10 нг/мл . ТРЙ. 1 нг/мл ТРП. 0.1 нг/мл

2550.lt 6?.Б 19.3 1 0.2 26.2 ¿ 2.1 . 1052.5 ¿41.7

2203.С 174.4 10.2 1 0.6 15.1 ^ 0.6 797.2 1 9.4

а-значения достоверно различавтея меядн собой ( Р < 0.05 )

рез 8 ч после добавления ТФА, поскольку при исследовании временной динамики пролиферативноА активности при обработке клеток одним ТФЙ уме к атому времени после индукции било отмечено существенное сии-■ение включения ЗН-тимидина клетками ( рис. 1 ).

РК не только но препятствовала действии ТФА. но на Фоне ее действия подавление пролиферации было более выраженным. Так вклпченкв ЗН-тимидина клетками, не обработанными предварительно РК, снималось через 8 ч после добавления ТФА в 3 раза, а при предварительной обработке клеток РК - в 3.8 раза ( рис. 5 ).

Характер взаимодействия ТФА и РК не зависел от длительности предварительной обработки РК клеток липни К582. Так РК усиливала действие ТФА в каждом варианте опыта и при менее длительной обработке клеток ( 1 сут ) до индукции форболовим эфиром в концентрациях 10. 1, 0.1 нг/мл ( см. таблицу ).

3. Регуляция экспрессии генов рецепторов ретиноевой кислоты в клетках линии К562

Таким образом РК, добавленная в кцльтуральнуп среду отдельно, не вызывает фенотйпических эффектов при действии на клетки линии 11582. Неханнзм поддержания в дайной клеточной системе такой ситуации не исследован. Причиной может служить как случайное наруме-ике в системе передачи информации, зависимой от РК, так и блокирование передачи этого сигнала для поддержания детерминированного состояния клеток данной линии. Чтобы приблизиться к понимании этого механизма, необходимо было проанализировать экспрессии генов рецепторов ретиноевой кислоты - первых звеньев данного сигнального каскада - о нативнах и индуцированных клетках.

Одним из эффективных инструментов изучения особенностей регуляции транскрипции генов слуиат индикаторные плазкиды, содержащие

кодирувщуп область бактериального гена хлорамфениколацетилтрансфе-раэм ( CAT ) под контролен регуляторной области изучаемого гена ( Согмап. 1985 ).

В нами* исследованиях ж использовали плазииду phRflRb-CftT, содер«а*ей 5'-регцляторнув область гена hRARb.

Уровень экспрессии плазмиды phRfiRb-CflT в клетках линии К5В2 в экспериментах по временной трансфекции плазмидной ДНК в кальций-фосфатном преципитате незначительно повивался при обработке клеток РК ( 10 мк11 ) в течение 1 су т. Кроме того было проверено действие форболового эфира на экспрессия данной плазмиды. поскольку индукция дифференцировки клеток К5В2 с помомьв ТфА сопровождается значительными изменениями в экспрессии многих генов, вровень экспрессии phRflRb-СЛТ не изменялся при воздействии Ш ( 10 нг/мл ) в течение.1 сут.

Эти результата в целом совпадавт с характером экспрессии эндогенного гена RfiRb. К незначительному повнвенив уровня мРНК последнего приводила обработка клеток РК ( 10 mkií ) лимь в течение 1 сут. 6 ч индукции РК не меняло количества мРНК RARb, однако, последующая обработка этих клеток ТФЙ .в течение 1 ч приводила к резкому усиленно экспрессии исследуемого гена, хотя сам ТФП в течение 1 ч не изменял количество мРНК ШЬ.

Тот факт, что в данных клетках транскрипция эндогенного гена RflRb не активируется обработкой РК в течение б ч отличает их от клеток тератокарциномы мыви F9. Клетки тсратокарциномы является адекватной модель« для изучения ГК-индуцированной дкфференцировки. С Strickland, Háchdavl. 1978 ). В клетках линии F9 экспрессия RfiRb не детектируется до индукции РК, одиачо ysc через 3 ч после добавления РК в культуралыщп среду экспрессия данного гена су-вественно возрастает и достигает максимума через 6 ч С Kartin ct al., 1330; На, Sudas, 1330 ). Экспрессия, гена RñRa в тех se клет-

как носит конститцтйпннй неиндуцибелышй характер ( Martin et al.. 1990 ). Uoariio отметить, что в этой клеточной системе продукт гена Rflka принимает сигнал, спяз1шая молекулу рипшоевой кислотц. и передает его слодуачеиу участнику этого каскада, активируя его транскрипцию. Таковыи является ген RrtRb. Запуск каскада, зависимого от РК, приводит и конечном счете к терминальной ди<з®еренциров-ке клеток ¡;9 в направлении париетальной эндодермы ( Strickland, Machdavl, 19?8 ).

Необходимо отметить, что регуляция экспрессии эндогенного гена RARa в клетках K5S2 отличалась от описанного в литературе механиз- . на, свойственного клеткам гератокарциномы пит FS. Транскрипция RARa по резцльтатаи дог-гибридизации существенно возрастала чврез S ч обработки плеток РК ( 10 икК ) и снова снигалась при увеличении времени обработки РК до 1 сут. Сиихение количества мРНК RARa отмечалось такме и в результате обработки в течение 1 ч ТФА клеток, культивированных предварительно с РК в течение 5 ч.

Одной из возиомностей об'яспения неспособности клеток линии И562 дифференцироваться или изменять пролиферагивнуы активность в ответ на обработку РК, Еероятно, могут слуаить особенности регуляции экспрессии генов рецепторов РК в этих клетках.

4. ДНК-сваэывавчая активность транскрипционных факторов в клетках линии К502

В связи с изменениями в экспрессии генов RARa и RARb при обработке клеток линии К562.ТФА и РК, проведен анализ ДНК-связывап-t\ea активности транскрипционных Факторов RARa, RARb, а такае ftp—1 как одного из транскрипционных фаиторов-миаеней ТФЙ.

Обработка клеток РК усиливала ДНК-связиваикуш активность факторов, образуют« комплекс с 32-Р-наченнм RARE-alfa й 32-Р-

меченым RARE-beta. Причем наблвдаемое усиление ДНК-связывавщсй активности факторов било пропорционально длительности обработки клеток индуктором. Обработка клеток РК также модулировала связывание белков с ТФА-зависимым элементом ( рис. 6 ).

Кратковременная обработка клеток К582 ТОЛ ( 100 нг/мл; 1 ч ) незначительно увеличивала ДНК-связнаавццв активность Факторов, об-разугаих комплекс с 32-Р-мечсннм RAREa. Аналогично изменялось в этих условиях связывание белковых факторов с 32-Р-меченым RAREb.

Методом задержки в геле комплексов 32-Р-меченых олигонуклеоти-дов RAREa и RAREb с ядерными белками было показано изменение их алектрофоретической подвижности в результате обработки клеток ТФА ( 100 нг/мл ) в течение 2 сут. Наблпдались изменения и при образовании комплекса с 32-Р-меченым олигонуклеотидом. содержащим ТФА-эависимый элемент. ДНК-связываюдая активность транскрипционного . фактора АР-1 резко снижалась. Это может быть связано со снижением активности протеинкинаэы С в результате длительного присутствия в культуралышА среде ее непосредственного активатора - ТФА ( Jaken, 1930 ) и соответствующим уменьжением в клетках доли белковых продуктов, фосфорялированнвх данным ферментом. Либо эти изменения момо связать с возможной принципиальной сменой белкового состава регистрируемого комплекса ДНК-белок.

Клетки линии К562. как жы уже отмечали, является полипотентны-ми я могут дифференцироваться в нескольких направлениях под действием соответствующих индукторов. Так ТФА индуцирует мегакариоци-тарнуп диффереицировку клеток линии KSS2 С Tctteroo et al., 1984; Papayannopouloo et al.. 198? ). a обработка этих клеток гемином приводит к появлении маркеров зритроидной дифференцировки ( Anders-son et al.. 1979; flbach et al., 1ЭВ7; Fraser et al.. 1988 ). Интересно, что обработка клеток К5В2 гемином блокирует влияние ТФА

СО ь

ЕЗьЗ ЕЕЭ сг-гз

ста

ВК^ЧИ ¥5333 (Е?Э вВВ£1 Н2Э

еаа езза кга» шзт ■ ет «зга

с<г

1 2 3 4 5 .6 ■ 7 Рис. 8. Схематическое нзабракние задервки в геле комплексов транскрипционных факторов с 32-Р-иечсшнш олигонцкле-отидаым:А - ШЕ-а1Га: Б - ШЖ-Ье1а; В - ТНЕ/6Р-1. 1 - контроль С натквные клетки ); 2 - ТФ(1 13. айн; 3 -ТФА 30 мин; 4 - ТФИ 00 нин; 5 - ТФА 2 сит; 6 - РК б ч; 7 - РК 2 сит

Стрелка оказывает специфические ДНК-белковие коиплексн СФ - Свободный фрагнеит

на экспрессии генов, содеряачих в проиоторо ТФА-злвип'иИ ar. и пргдотпраиает ТФЛ-зависикцю дифференциропку этих kístcí; ( ¡Y-.-«-;! et al., 1991 Вероятно таков пб^ий принцип изаиуоотчоггикЛ аде кватных агентов, индуцирующих дуфференцировку одного тина клеток в разннх направлениях.

Нельзя обойти виииавкеи другой тип взакиоутиожепий разных агентов - когда один из них в норне не оказниаст влияния на пролиферативные характеристики клеток данного типа и на экспрессии своих генов-мияеней. Так для клеток линии PIS киаииой тсрато-карциномы показано, что ТФЙ не способен активировать экспрессию генов, содервацих в промоторе ТФА-зависимый элемент, таких как с-fos, c-lun и ]unB. Но если эти клетки в течение 5 сут инкубировать в присутствии РК. то экспрессия указанных генов начинает индуцироваться ТФЙ ( de Groot et al., 1990 ). При этом стоит отметить, что форболопий эфир не влияет па пролиферации клеток эмбриональной тератокарцинокн и не является индуктором их диФФерецциров-ки, тогда как РК, напротив, индуцирует дифференцировку этих клеток ( Strickland, Hachdavl, 1S?8 ). Вероятно запуск программы диффе-ренцировки, индуцируемый РК, полчостьв меняет картину регуляции транскрипции генов е клетках тератокарциноми. в результате чего становится возможным индуцировать ТФЙ-зависимые гены, транскрипция которых блокирована в стволовых клетках.

Таких образом можно предположить, что все особенности Функционирования РК-зависимой сигнальной систем« и ее взаимодействия с другими сигнальными системами в клетках К562, являртся прямым отражением жесткой детерминации программы развития клеток данного типа, в результате чего они приобретают способность дифференцироваться линь в определенных направлениях под действием ограниченного числа индукторов, и могут рассматриваться как доступная модель для изучения этих вопросов.

выводи

1. Ретииоевая кислота, добавленная з культуральнуи среду отдельно, не влияла на пролиферация клеток линии '¡'.502, тогда как при сочетанием воздействии на зти клетки форболорого эфира и ре-тнноевоЛ кислоты последняя всегда усиливала аитипролифаратхвнна

. зффект Т<5А.

2. Обработка клеток линии К562 ретшшевой кислотой активировала экспрессия генов ядерник рецепторов РК и увеличивала их ДНК-связываяццп активность. Такиа образец отсутствие фенотипкчееккк эффектов одной РК на клетки линии-К502 не означает неспособности РК взаимодействовать со езояии рецепторе;»« н активировать их экспрессии,

3. ФсрболозаЯ эфир модулировал окспрвссип генов адерних рецепторов РК на фоне обработка метен РК я изменял ПЛЙЕ-связнваз-эдз активность при длнтельннх сроках обработки клеток, что даот возиошюсть да работ по иссаедовашш пересечения двух путей передачи информации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ!!Е ДИССЕРТАЦИИ

Чис1гохгша А.В., Игдведев А.В. Ретииоевая кислота усиливает действие форболового эфира на клетки лшпш К552'// Цитология. 1993. Т. 32. С. 52-50.

Чистохинз А.В., Медведев А.В. Влияние реткпоевой кислота на клетки эритролейкеначеской линии К582 // Цитология. 1393.- Т. 35. С. 101-102.

Медведев Й.В,, Чистохина А.В. Особенности регуляция транскрипции генов рецепторов ретиноевой кислота п меткая линии К5В2 // Цитология. 1993. Т. 35. С. 84-05.