Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль окиси азота (NO) в процессах пролиферации и дифференцировки клеток кроветворной ткани
ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Роль окиси азота (NO) в процессах пролиферации и дифференцировки клеток кроветворной ткани"

Московский Государственный Университет I пПИ им. М.В. Ломоносова

1 1\ Д'г-Л ъио

БИОЛОГИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Радконова Юлия Викторовна

РОЛЬ ОКИСИ АЗОТА (N0) В ПРОЦЕССАХ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ.

03.00.11 эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1998

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биологическог факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель академик РАН, профессор

Н.Г. Хрущов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук

А.В.Зеленин А.А. Иванов

Ведущая организация

Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится « »_1998 г., в__часов на заседани!

диссертационного совета по адресу

119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет,

\

ауд._

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологическсп факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « »_1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из наиболее ярких открытий последних лет вляется установление синтеза N0 в клетках млекопитающих (Palmer et al., 1987). иогенный N0 оказался универсальным регулятором разнообразных метаболичес-их и физиологических процессов в организме животных и человека. В частности оказано его участие в регуляции кровотока и иммунитета, в нейротрансмиссии и вдите организма от бактериального поражения (Lowenstein et al., 1994; Madan, .ao, 1996). В 1992 году журналом Science N0 объявлен молекулой года (Koshland, 992). Ряд данных позволяет предположить, что оксид азота N0 участвует также в егуляции пролиферации и дифференцировки клеток разного типа (Peunova, inikolopov, 1993; Kuzin, Enikolopov, 1996; Holliday et al., 1997), однако до сих пор онкие механизмы регуляции остаются неясными. Кроветворная ткань представляет добный объект исследования в этом направлении, так как относится к системам с остоянным интенсивным клеточным обновлением. Ингибирование фермента N0-интазы и использование различных экспериментальных моделей (радиационных [ышиных химер, модели Seki (Seki, 1973; Мичурина и др., 1991)) позволяет сследовать влияние NO на дифференцировку и пролиферацию клеток роветворной ткани, начиная с самых ранних сроков кроветворения. Изучение роли Ю в пролиферации и дифференцировке клеток кроветворной и других тканей вляется одним из важных аспектов, необходимых для понимания )ундаментальных основ регуляции процессов детерминации и дифференцировки леток.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы на моделях регенерирующей роветворной ткани изучить участие окиси азота — N0 в регуляции процессов [ролиферации и дифференцировки кроветворных клеток.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи: ) исследовать распределение фермента NO-синтазы в клетках кроветворной кани (костный мозг, селезенка, тимус) и в других тканях и органах (лимфоузлы, 1ечень, почка, сердце, кожа, поджелудочная и подчелюстная железы, тонкий

3

кишечник, подкожная соединительная ткань, перитонеальный экссудат и др.) мыши при помощи цитохимического (NADPH-диафоразная реакция) и иммуногистохими-ческого (непрямая иммунофлуоресцентная реакция с применением антител к нейральной, макрофагальной и эндотелиалыюй изоформам NO-синтазы) методов;

2) на клетках костного мозга радиационных мышиных химер, регенерировавшего в условиях ингибирования NO-синтазы, изучить экспрессию рецепторов к факторам роста IL-3, SCF (c-kit - лиганд) и Еро с помощью непрямой иммунофлуоресцентной реакции;

3) изучить соотношение разных типов кроветворных колоний, образовавшихся на АЦ-мембранах (модель Seki) в условиях ингибирования фермента NO-синтазы.

Научная новизна работы. Цитохимическим и иммуногистохимическим методами было исследовано распределение фермента NO-синтазы (NOS) в клетках костного мозга, селезенки, тимуса, лимфоузлов, печени, почки, сердца, кожи, подкожной соединительной ткани, поджелудочной и подчелюстной желез, тонкого кишечника и перитонеального экссудата мыши. Показано, что фермент NO-синтаза, как правило, выявляется в дифференцированных закончивших активную пролиферацию клетках (зрелые кроветворные клетки, эпителий кишечных ворсинок, нейроны и др.) и отсутствует в интенсивно размножающихся малодифференцированных клетках (базальный слой эпидермиса, клетки крипт тонкого кишечника, бластные кроветворные формы и др.). В работе показано, что N0 участвует в процессах пролиферации и дифференцировки клеток кроветворной ткани. А именно, тормозит клеточную пролиферацию и совпадает с началом терминальной дифференцировки клеток.

Практическое значение работы. Работа вносит значительный вклад в изучение одной из фундаментальной проблем биологии — проблему клеточной дифференцировки, в частности, роль биогенного N0 в пролиферации и дифферен-цировке клеток кроветворной ткани. Полученные данные важны для дальнейшей разработки актуальных медико-биологических направлений, связанных с

«действием на кроветворный процесс (трансплантация тканей, лечение эдиационных поражений, заживление ран и др).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на онференции молодых ученых «Биохимические, цитологические и физиологи-еские механизмы развития» (Москва, 1997) и на заседании кафедры цитологии и 1СТОЛОГИН Биологического факультета МГУ (Москва, 1997). Результаты были редставлены также на Европейском конгрессе Биологии Развития (Тулуза, 1995) и а Международном симпозиуме «Хирургические проблемы и экология» (Черновцы, 995).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 4 печатных аботы.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, >бзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения ■езультатов, их обсуждения, выводов, приложения с иллюстрациями, приложения о статистическими расчетами и списка цитируемой литературы. Работа изложена

ta_страницах машинописного текста, содержит_рисунков и _таблиц.

Список цитируемой литературы включает_ наименований, _из них — на

шостранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самок мышей (Mus muskulus) гибридов (СВА х С57В1) весом 22 - 24 г.

Распределение фермента NO-синтазы исследовали при помощи NADPH-шафоразной реакции и иммуногистохимическим методом.

NADPH-диафоразную реакцию (позволяющую одновременно определять все гри изоформы фермента NO-синтазы) (Peunova, Enikolopov, 1993) проводили на гистологических срезах, полученных на замораживающем микротоме, а также на пленочных препаратах соединительной ткани, мазках костного мозга и перитонеального экссудата мыши. В качестве фиксатора использовали 1,25%-ный раствор глутарового альдегида. Препараты инкубировали во влажных камерах в

5

течение часа при 37°С в реакционной смеси следующего состава: 0.1 M раствор PBS, 0.3% TritonX-100, 0.1% NADPH, 0.02% нитро синего тетразолия. Посл< инкубации препараты отмывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,2 - 7,4) докрашивали метиловым зеленым и заключали в канадский бальзам. В качеств« первого контроля использовали препараты, обработанные реакционной смесью, н< содержащей NADPH. В качестве второго контроля, для подтвержден!« специфичности реакции по отношению к NOS, использовали препараты из тканей \ органов мыши, которой предварительно был введен ингибитор всех трех изофорк NOS—L-метиларгинин (L-NAME) в концентрации 1 мг/г веса (2 раза в сутки).

Непрямую иммунофлуоресцентную реакцию проводили на мазках костногс мозга и селезенки мышей, а также на парафиновых срезах тех же органов Использовали кроличьи моноклональные антитела к индуцибелыюй, эндотели-альной и нейральной изоформам фермента NO-синтазы («Transductior Laboratories») и козьи поликлональные антитела против иммуноглобулинов кролика, коньюгированные с изотиоцианатом флуоресцеина («Amersham»). Препараты просматривали в флуоресцентном микроскопе «MJI-2E» с фазово-контрастной приставкой. Специфичность свечения оценивали по сравнению с контролями: 1) контроль качества очистки меченых антител, 2) контроль аутофлуоресценции.

Экспериментальная модель Seki (Seki, 1973; Мичурина и др., 1991). МышеГ реципиентов (с вживленными в перитонеальную полость АЦ-мембранами) на 7-е сутки подвергали рентгеновскому облучению на установке РУМ-17. Доз;: облучения — 750 р при следующих условиях: 210 кВ, 15 мА, фильтры: 0,5 мм Си -t 1,0 мм А1, расстояние до источника 47 см. Через 3 ч. после облучения животным интраперитонеально инъецировали суспензию клеток донорского костного мозга от сингенных животных (1х106 ядерных клеток на одну мышь). Затем, через 12 ч. вводили внутрибрюшинно ингибитор трех изоформ NO-синтазы (нейральной. макрофагальной, эндотелиальн'ой) — L-NAME в концентрации 1 мг/г веса (2 раза в сутки, с разницей 6 часов). Группе контрольных мышей вместо L-NAME вводили

[еактивный энантиомер О-ЫАМЕ (в такой же концентрации). На 7-ые или 9-ые утки животных забивали и извлекали селезенки, подложки АЦ-мембраны, а также остный мозг из малой и большой берцовой костей (Рисунок 1).

САМ (перитонсальная полость)

в/б сингенный костный мозг (1*10' яд. кл.)

7 суток (2 раза в сутки)

7 суток

3 часа

Ь^АМЕ (в/б)

(1 мг/1г веса) В.ММЕ (в/б)

О^АМЕ (1 мг/1г веса) (в/б)

VI

I □ 'V | СП »V

I

контроль

9 суток (2 раза в сутки)

(в/б)

"I

костный мозг, САМ

Рисунок 1. Схема эксперимента.

Мазки костного мозга радиационных мышиных химер, регенерировавшего в юрме и в условиях ингибирования МО-синтазы, тестировали при помощи непрямой иммунофлуоресцентной реакции. Использовали кроличьи поликлональные антитела

7

к рецепторам интерлейкина 3 (IL-3-Ra), эритропоэтина (Epo-R) и фактору роста стволовых кроветворных клеток (c-kit) (Santa Cruz Biotechnology, Inc) и козьи поликлональные антитела против иммуноглобулинов кролика, коньюгированные с изотиоцианатом флуоресцеина (ин-т Гамалеи).

Для исследования соотношения разных типов кроветворных колоний, образовавшихся на АЦ-мембранах (модель Seki) в норме и в условиях ингиби-рования фермента NO-синтазы, использовали миелопероксидазную реакцию (Bonati, Franchi, 1948; Van Duijn, 1955; Пирс, 1962).

Весь числовой материал, приведенный в работе, обрабатывался статистически по двухвыборочному t-критерию Стьюдента или U-критерию Уилкоксона (Манна-Уитни). Для расчетов использовали компьютерные программы Excel, Origin и Statistica.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ИССЛЕДОВАНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТА NO-СИНТАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЯХ И ОРГАНАХ МЫШИ.

1. При проведении NADPH-диафоразной реакции для выявления NO-синтазы мы опирались на данные многих исследователей, определявших NO-синтазу с помощью соответствующих антител в клетках с NADPH-диафоразной активностью (Shimosegava et al., 1992; Afework et al., 1992; Dippel et al.,1994; Worl et al., 1994) и использовали методику, описанную в статье Пеуновой и Ениколопова (Peunova, Enikolopov, 1993). Ниже приведены данные о локализации NO-синтазы, полученные при проведении NADPH-диафоразной реакции.

Костный мозг. NADPH-диафоразная активность (NO-синтаза) обнаружена в дифференцированных клетках разной степени зрелости всех рядов кроветворения. В малодифференцированных (бластных) клетках содержание фермента было незначительным или фермент отсутствовал вовсе.

Селезенка. В белой пульпе лимфоциты практически не содержали NO-синтазу. Реакцию обнаруживали лишь единичные клетки. В красной пульпе NO-синтазу

1ЫЯВЛЯЛИ в подавляющем большинстве клеток. Фермент всегда присутствовал в макрофагах и клетках стромы органа.

Гимус. Большая часть тимоцитов коркового вещества не содержала фермента, тогда сак тимоциты мозгового вещества обнаруживали отчетливую реакцию. Высокую 1ктивность NO-cинтaзы наблюдали в тельцах Гассаля. Фермент присутствовал также в клетках соединительно-тканных септ и капсулы тимуса. Пимфоузел. ЫО-синтазу выявили в отросчатых клетках стромы и макрофагах. В шмфоцитах фолликулов и мякотных шнуров фермент, как правило, не наблюдали. Кожа. ЫО-синтаза присутствовала в клетках всех слоев эпидермиса, за исключением клеток базального (росткового) слоя. Отчетливую реакцию обнаруживали в фибробластах и макрофагах подкожной рыхлой соединительной ткани. Гонкая кишка. ЫАОРН-диафоразную активность наблюдали в клетках ворсинок, причем, отметили, что по мере приближения клеток к верхней части ворсинки их окрашивание усиливалось. В то же время, в клетках средней зоны крипт окрашивание отсутствовало. Бокаловидные клетки также не содержали фермент. Печень. Фермент обнаруживали практически во всех гепатоцитах, причем, интенсивность реакции в них уменьшалась по мере удаления от центральной вены к периферии печеночной дольки. Наличие ЫАОРН-диафоразной активности наблюдали в Купферовых и эндотелиальных клетках органа.

Сердце. Присутствие фермента обнаруживалось в клетках мышц средней части предсердия. В клетках центральной и периферической зон предсердия, а также клетках желудочков фермент не выявлялся.

Почка. Активность фермента определили в клетках корковой зоны. В клетках почечных клубочков и почечной лоханки фермент отсутствовал. Подчелюстная железа. ЫО-синтазу обнаруживали в клетках вставочных отделов железы.

Поджелудочная железа. Реакция выявлена в ацинарных клетках, а также в клетках островков Лангерганса.

Перитонеапьный экссудат мыши. Фермент присутствовал практически во всех клетках (макрофагах, лимфоцитах, тучных клетках).

Следует отметить, что ЫАОРН-диафоразная активность всегда отчетливо выявлялась в клетках эндотелия сосудов, а также в нервных окончаниях, нервных волокнах и интрамурапьных ганглиях всех исследованных нами органов. По нашему мнению, ЫАОРП-диафоразную реакцию можно использовать наряду с другими нейроморфологическими приемами.

2. Выявление МО-синтазы непрямым иммунофлуоресцентным методом с использованием моноклональных антител к трем различным изоформам фермента мы проводили только на препаратах костного мозга и селезенки мышей. Полученные данные сравнивали с результатами КАБРН-диафоразной реакции. Костный мозг. При использовании моноклональных антител к индуцибельной изо-форме фермента положительную иммунофлуоресцентную реакцию обнаружили в зрелых клетках всех рядов кроветворения. При использовании антител к эндотели-альной изоформе МО-синтазы отметили положительную иммунореактивность в клетках эндотелия сосудов. Применение антител к нейральной изоформе фермента не дало положительных результатов, флуоресцирующие клетки не были обнаружены.

Селезенка. Специфичное связывание антител к индуцибельной изоформе МО-синтазы наблюдали в макрофагах и большинстве клеток стромы органа. Небольшое число лимфоцитов обнаруживало слабое специфичное свечение. Клетки эндотелия сосудов давали положительную реакцию при использовании антител к эндотелиаль-ной изоформе ЫО-синтазы. При применении антител к нейральной изоформе наблюдали положительный результат в отростках нейронов, иннервирующих орган.

Результаты иммуногистохимического анализа подтвердили данные, полученные при проведении ЫАОРН-диафоразной реакции.

Таким образом, фермент ИО-синтазу был обнаружен в окончивших пролиферацию дифференцированных клетках (эпидермиса, кишечных ворсинок, эндотелия сосудов). При этом, мы отметили, что ИАОРН-диафоразная активность

увеличивалась по мере возрастания степени зрелости клеток (костного мозга, кишечных ворсинок). Напротив, в активно пролиферирующих клетках (базального слоя эпидермиса, средней зоны кишечных крипт и властных клетках костного мозга) фермент не был выявлен.

2. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ N0 В КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ НА ПРИМЕРЕ

КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ.

Анализ работ за последних лет позволяет достаточно обосновано предположить, что N0 является одним из регуляторов процессов клеточной пролиферации и дифференцировки (Peunova, Enikolopov, 1993; Kuzin, Enikolopov, 1996; Holliday et al., 1997)

Для выяснения роли N0 в созревании клеток кроветворного ряда, мы ингибировали NOS на экспериментальной модели Seki, позволяющей получать очаги пролиферации кроветворных клеток на искусственных подложках (Seki, 1973). В экспериментах был использован специфический ингибитор всех трех изоформ фермента NOS — L-NAME (Klatt et al., 1994; Marietta, 1994).

1. Иммуногистохимический анализ клеток регенерировавшего костного мозга сннгенных мышиных радиационных химер, в норме и при ингибированин фермента NOS.

По данным различных авторов полное заселение облученных реципиентов кроветворными клетками донора происходит к шестым - пятнадцатым суткам (Bell end Shand, 1972; Васильева и др., 1977).

Для того, чтобы сравнить степень зрелости клеток регенерировавшего костного мозга в опытной (получавших активный ингибитор NOS (L-NAME)) и контрольной (получавших неактивный ингибитор NOS (D-NAME)) группах облученных мышей, мы тестировали мазки регенерировавшего костного мозга этих животных (на 7-е и 9-е сутки после трансплантации донорского костного мозга) непрямым иммунофлуоресцентным методом с применением специфичных антител к рецепторам различных цитокинов. В частности, мы использовали антитела к

рецепторам эритропоэтина (EPO-R), интерлейкина 3 (1L-3-R) и фактору р. »ста стволовых кроветворных клеток (c-kit).

Появление каждого из этих рецепторов характеризует определенную степень зрелости клеток в гемопоэзе. Например, известно, что c-kit — рецептор к SCF (фактор роста стволовых кроветворных клеток) экспрессируется стволовыми и родоначальными кроветворными клетками (Welham, Schräder, 1990; Papayannopoulou et al., 1991), факторзависимыми линиями тучных клеток (Welham, Schräder, 1990), а также эндотелиальными клетками (Ayu et al., 1992). Рецептор к интерлейкину 3 (мульти-колониестимулирующему фактору) широко представлен на поверхности пролиферирующих клеток различных типов, включая кроветворные предшественники (Yang et al., 1986). Появление рецептора к эритропоэтину совпадает с вступлением кроветворных клеток в стадию терминальной дифференцировки (Чертков, Фриденштейн, 1979; Jacobs et al., 1985). Максимальная экспрессия этого рецептора наблюдалась на стадии проэритробласта (Akahane et al., 1989). По мере созревания клеток экспрессия этого рецептора снижается и на поздних стадиях дифференцировки эритроидных клеток не выявляется (Frazer et al., 1988).

а) Результаты непрямой иммунофлуоресцентной реакции (с использованием антител к рецепторам эритропоэтина (EPO-R), интерлейкина-3 (IL-3-R) и фактора роста стволовых кроветворных клеток (c-kit)) на клетках регенерировавшего костного мозга, облученных мышей опытной (получавшей активный ингибитор NOS (L-NAMEY) и контрольной (получавшей неактивный ингибитор NOS (D-NAME)) групп животных (7-е сутки после трансплантации сингенного костного мозга).

Таблица 1. (7-е сутки). Средине относительные кол-па клеток (%) регенерировавшего остного мозга, дающих положительную реакцию с антителами к Еро-К, 11,-3-11, с-кН, для пытной и контрольной групп животных.

7 суток Среднее кол-во кл., %

Еро-(Ч -«+», (опыт) 19,7

Еро-Р? -«+» (контроль) 26,5

И-З-Р} -«+» (опыт) 23,6

11_-3-И -«+»(контроль) 13,1

С-кй - «+» (опыт) 14,7

С-кй -«+» (контроль) 6,8

О

H 15 О

7 сутки

V.iVk-?

:-.г.

СИ Опыт Im 4 Контроль

1 Epo-R-"+"

2 IL-3-R-"+"

3 C-kit-"+"

Рисунок 2. Сравнение средних значений количества клеток (%) регенерировавшего костного мозга, дающих положительную реакцию с антителами к Еро-И, 1Ь-3-Г{, с-кк, в опытной и в контрольной группах животных. (7-е сутки после трансплантации).

) Результаты непрямой иммунофлуоресцентной реакции (с использованием антител к рецепторам эритропоэтина (ЕРО-Ю. интерлейкина-З (IL-3-R) и фактора роста стволовых кроветворных клеток (c-kit)) на клетках регенерировавшего костного мозга, облученных мышей опытной (получавшей активный ингибитор NOS (L-NAMEY) и контрольной (получавшей неактивный ингибитор NOS (D-NAMEÏ) групп животных (7-е сутки после трансплантации

сингенного костного мозга").

Таблица 2. (9-е сутки). Средние относительные количества клеток (%) регенерпро вавшего костного мозга, дающих положительную реакцию с антителами к Еро-Я, 1Ь-3-К с-кИ, для опытной и контрольной групп животных.

9 суток Среднее кол-во кл., %

Еро-(Ч -«+», (опыт) 19,96

Еро-Р1 -«+» (контроль) 27,2

И-З-Р* -«+» (опыт) 20,1

И-З-К - «+» (контроль) 11,6

С-И- «+» (опыт) 11,3

С-кЛ- «+» (контроль) 5,6

9 сутки

Опыт Контроль

1 Еро-Я-"+"

2 1ЬЗ-Р-"+"

3 С-к11-"+"

Рисунок 3. Сравнение средних значений количества клеток (%) регенерировавшего костного мозга, дающих положительную реакцию с антителами к Еро-Я, с-кй, в опытной и в контрольной группах животных. (9-е

сутки после трансплантации).

2. Морфологический анализ колоний на АЦ-мембранах сингснных радиационных мышиных химер в норме и при иигибировании фермента РШ-синтазы.

На седьмые — девятые сутки после трансплантации костного мозга на АЦ-мембранах (САМ), предварительно имплантированных в перитонеальную полость

блученных мышей, образуются в основном гранулоцитарные колонии, [акрофагальные колонии составляют небольшой процент (Seki, 1973; Мичурина и р., 1980; 1985). Показано, что в костном мозге именно гранулоциты ответственны а продуцирование NO (Punjabi et al., 1992).

Для определения степени зрелости клеток в колониях, образовавшихся на АЦ-(ембранах, мы использовали миелопероксидазную реакцию, которая позволяет ¡пределять преимущественно зрелые гранулоциты. В бластных клетках и ранулоцитах на более ранних этапах дифференцировки активность пероксидазы [рактически отсутствует. Слабая по интенсивности реакция наблюдается в [ебольшон части моноцитов в виде немногочисленных рассеяных гранул (Bonati, rranchi, 1948; Van Duijn, 1955; Хейхоу, Кваглино, 1983), в связи с чем {акрофагальные колонии не учитывались нами.

.) Результаты миелопероксидазного тестирования колоний, образовавшихся на АЦ-мембранах (на 7-е сутки после введения костного мозга) животных опытной (получавшей активный ингибитор NOS (L-NAMë)) и контрольной (получавшей неактивный ингибитор NOS (D-NAME')') групп радиационных мышиных химер.

Таблица 3. Результаты миелопероксндазиой реакции. (7-е сутки). Колонии на АЦ-н'мбраиах опытных радиационных мышиных химер после инъекций активного (L-NAME) шгибнтора NOS. Обозначения: колонии, окрашенные миелопероксндазон мислопероксидаза - «+»), неокрашенные (миелопероксидаза - «-»).

Опыт (активный ингибитор NOS (L-NAME)), 7 суток

Колонии миелопероксидаза"-" Колонии миелопероксидаза"+"

■12 П.П. 50-100 100-500 500-1000 >1000 50-100 100-500 500-1000 >1000

ЯЫШИ клеток клеток клеток клеток клеток клеток клеток клеток

31 17 7 2 0 14 2 2 1

32 46 11 9 3 33 5 3 2

33 60 11 1 0 15 6 2 1

34 20 0 0 0 7 0 0 0

35 23 2 2 0 13 3 0 0

36 76 27 7 2 50 10 5 0

Зумма 242 58 21 5 132 26 12 4

Эбщее 326 174

_Общее кол-во колоний: 500_

Ü колоний миелопероксидаза "-"65,2 | |% колоний миелопероксидаза "+"34,8

Таблица 4. Результаты миелопероксидазной реакции. (7-е сутки). Колонии на АЦ-мембранах контрольной группы радиационных мышиных химер. Обозначения: колонии, окрашенные мнелонсроксидазои (миелопероксидаза - «+»), неокрашенные (миелопероксидаза - «-»).

Контроль (неактивный ингибитор NOS (D-NAME)), 7 суток

Колонии миелопероксидаза"-" Колонии миелопероксидаза"+"

№ п.п. мыши 50-100 клеток 100-500 клеток 500-1000 клеток >1000 клеток 50-100 клеток 100-500 клеток 500-1000 клеток >1000 клеток

К1 20 9 1 0 40 16 7 3

К2 16 8 1 0 36 10 2 0

КЗ 8 2 0 0 16 8 0 0

К4 33 12 5 5 64 16 8 3

К5 49 21 10 1 56 31 16 4

Сумма 126 52 17 6 212 81 33 10

Общее 201 336

Общее кол-во колоний: 537

% колоний миелопероксидаза "-" 37,4 | |% колоний миелопероксидаза "+" 62,6

Таблица 5. (7-е сутки). Сравнение количеств« колоний (%), окрашенных и неокрашенных миелопероксидазон (МП«+» и МП«-» соответственно), на АЦ-мембранах в опытной и контрольной группах радиационных мышиных химер.

/суток

опыт контроль

№ п/п мыши %МП "-" %МП "+" %МП "-" %МП "+"

1 58 42 31 69

2 60 40 34 66

3 75 25 30 70

4 74 26 38 62

5 62 38 43 57

6 63 37

среднее 65,3 34,7 35,2 64,8

7 суток

ЕЗ mi "-"

ГШ МП "+'' 10пыт 2 Контроль

Рисунок 4. Количество колоний (%), окрашенных (мнелопероксидаза - «+») и неокрашенных (мнелопероксидаза - «-») мнелопероксидазон, на АЦ-мембранах опытной и контрольной групп мышиных радиационных химер (7-е сутки).

) Результаты мнелопероксидазного тестирования колоний, образовавшихся на АЦ-мембранах (на 9-е сутки после введения костного мозга) животных опытной (получавшей активный ингибитор NOS (L-NAME)) и контрольной (получавшей неактивный ингибитор NOS (D-NAME)) групп радиационных мышиных химер.

Таблица 6. Результаты миелопероксидазной реакции. (9-е сутки). Колонии на АЦ-мембранах опытных радиационных мышиных химер после инъекций активного (L-NAME) ингибитора NOS. Обозначения: колонии, окрашенные миелопероксидазой (миелопероксидаза - «+»), неокрашенные (мнелопероксидаза - «-»).

Опыт (активный ингибитор NOS (L-NAME)), 9 суток

Колонии миелопероксидаза"-" Колонии миелопероксидаза "+"

№ n.n. 50 -100 100-500 500-1000 >1000 50-100 100-500 500-1000 >1000

мыши клеток клеток клеток клеток клеток клеток клеток клеток

Ol 36 9 3 1 27 6 1 0

02 91 54 12 8 24 11 5 - 1

ОЗ 48 15 0 0 28 11 0 0

04 67 30 6 3 35 15 5 2

Сумма 242 108 21 12 114 43 11 3

Общее 383 171

Общее кол-во колоний: 554

% колоний миелопероксидаза "-"69,1 | % колоний миелопероксидаза '+" 30,9

Таблица 7. Результаты миелопероксидазной реакции. (9-е сутки). Колонии на АЦ-мембранах контрольной группы радиационных мышиных химер. Обозначении: колонии, окрашенные миелопероксидазой (миелопероксидаза - «+»), неокрашенные (миелопероксидаза - «-»).

Контроль (неактивный ингибитор NOS (D-NAME)), 9 суток

Колонии миелопероксидаза"-" Колонии миелопероксидаза "+"

№ п.п. мыши 50-100 клеток 100-500 клеток 500-1000 клеток >1000 клеток 50-100 клеток 100-500 клеток 500-1000 клеток >1000 клеток

К1 46 23 7 2 27 23 2 2

К2 51 18 1 0 58 40 7 0

КЗ 91 43 2 0 76 18 1 1

К4 77 51 6 6 48 14 0 0

К5 61 45 11 5 46 28 1 1

Кб 31 13 4 0 40 20 2 0

Сумма 357 193 31 13 295 143 13 4

Общее 594 455

Общее кол-во колоний 1049

% колоний миелопероксидаза "-" 56,6 | |% колоний миелопероксидаза "+" 43,4

Таблица 8. (9-е сутки). Сравнение количества колоний (%), окрашенных и неокрашенных миелопероксидазой (МП «+» и МП «-» соответственно), на АЦ-мсмбранах в опытной и контрольной группах мышиных радиационных химер.

9 суток

опыт контроль

№ п/п мыши %МП "-" %МП "+" %МП "-" %МП "+"

1 59 41 59 41

2 80 20 40 60

3 62 38 59 41

4 65 35 69 31

5 62 38

6 44 56

среднее 66,5 33,5 55,5 44,5

Рисунок 5. Количество колоний (%), окрашенных (миелопероксидаза -«+») и неокрашенных (миелопероксидаза - «-») миелопероксидазой, на АЦ-мембраиах опытной к контрольной групп мышиных радиационных химер (9-е сутки).

3. ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании распределения фермента Ы0-синтазы в различных тканях органах мышей фермент ЫО-синтаза был обнаружен в окончивших ролиферацию дифференцированных клетках (эпидермиса, кишечных ворсинок, идотелия сосудов). ЫАОРН-диафоразная активность увеличивалась по мере воз-астания степени зрелости клеток костного мозга. Напротив, в активно ролиферирующих клетках (базального слоя эпидермиса, кишечных крипт и ластных клетках костного мозга) фермент не был выявлен. Эти данные позволили редположить, что активация экспрессии МО-синтазы связана с окончанием петочной пролиферации и переходом в стадию терминального созревания клеток.

Анализируя данные иммуногистохимического тестирования клеток регенери-овавшего костного мозга сингенных мышиных радиационных химер,

инъецированных активным (опытная группа) и неактивным (контрольная группа) ингибиторами NOS, мы отметили, что у контрольных групп животных количество костномозговых клеток с положительной иммунореактивностью с антителами к Epo-R (маркеру включения терминальной эритроидной дифференцировки), было в 1,35 (7-е сутки после трансплантации костного мозга) и в 1,36 (9-е сутки после трансплантации костного мозга) раза больше по сравнению с опытными животными. В то же время, в опытных группах животных пролиферирующих клеток, экспрессирующих рецептор к интерлейкину-3 (IL-3-R), было в 1,8 (7-е сутки) и в 1,73 (9-е сутки) больше, чем у контрольных мышей, а экспрессия рецептора к фактору роста стволовых кроветворных клеток (c-kit) была увеличена в 2 раза, как на 7-е, так и на 9-е сутки. Учитывая приведенную выше характеристику рецепторов, мы полагаем, что ингибирование фермента NOS в клетках костного мозга сингенных мышиных радиационных химер, во-первых, индуцирует пролиферацию клеток костного мозга, а, во-вторых, тормозит дифференцировку клеток эритроидного ряда.

Анализ колоний на ацетат-целлюлозных мембранах, извлеченных из перитонеальной полости мышиных радиационных химер контрольной группы (получавшей неактивный ингибитор NOS (D-NAME)) на 7-е сутки (после трансплантации сингенного костного мозга), показал, что большинство колоний являлись гранулоцитарными (62,5%). Значительно меньшая часть была представлена колониями, состоящими из малодифференцированных клеток (37,4%). Напротив, в опытной группе животных (получавшей активный ингибитор NOS (L-NAME)) большинство колоний на мембранах было представлено малодифференцированными элементами (65,2%), а зрелые гранулоцитарные колонии составляли меньшую часть (34,8%). На 9-е сутки у животных опытной группы по-прежнему преобладали колонии, содержащие малодифференцированные клетки (69%), а гранулоцитарных колоний было значительно меньше (31%). Следует отметить, что ингибирование фермента не повлияло в целом на среднее

пичество колоний, образовавшихся на АЦ-мембранах в опытной и в контрольной /ппах животных, как на 7-е, так и на 9-е сутки.

Следует отметить, что наше предположение об участии NO в процессах олиферации и дифференцировки клеток совпадает с мнением различных следователей. Так например, в ряде работ было убедительно одемонстрировано, что доноры NO тормозят клеточную пролиферацию (Gard et , 1992; Dubey, 1994; Yang et al., 1994; Maciejewski et al., 1995; Shami et al., 1995; laudri et al., 1996; Laskin et al., 1996; Shami, Weinberg, 1996), a ингибирование нтеза NO приводит к усилению пролиферативной активности и к замедлению оцесса терминальной дифференцировки клеток различных типов (Peunova, likolopov, 1993; Kuzin, Enikolopov, 1996; Hoffman et al., 1997; Holliday et al., 1997).

Экспериментальный материал, приведенный в данной работе, свидетель-вует о том, что N0 контролирует баланс между процессами пролиферации и фференцировки клеток кроветворной ткани. А именно, тормозит клеточную юлиферацию и индуцирует начало терминальной дифференцировки клеток.

ВЫВОДЫ

Цитохимическим и иммуногистохимическим методами исследовано распре-ление фермента NO-синтазы (NOS) в клетках костного мозга, селезенки, тимуса, [мфоузлов, печени, почки, сердца, кожи, подкожной соединительной ткани, «желудочной и подчелюстной желез, тонкого кишечника и перитонеального ссудата мыши. Показано, что фермент NO-синтаза, как правило, выявляется в [фференцированных закончивших активную пролиферацию клетках (зрелые юветворные клетки, эпителий кишечных ворсинок, нейроны и др.) и отсутствует в пепсивно размножающихся малодифференцированных клетках (базальный слой [идермиса, клетки крипт тонкого кишечника, бластные кроветворные формы и >.). Показано, что НАДФ-диафоразная активность отчетливо выявляется в :рвных клетках и их отростках, в связи с этим, предлагается использовать НАДФ-ифоразную реакцию, как один из нейроморфологических методов.

2. В костном мозге радиационных мышиных химер, регенерировавшем в условиях ингибирования фермента ЫО-синтазы, резко увеличивается число недифференцированных клеток, экспрессирующих рецепторы к интерлейкину-3 (1Ь-3-Я) и к фактору роста стволовых кроветворных клеток (c-k.it). В то же время количество клеток, экспрессирующих рецептор к эритропоэтину (маркер включения терминальной эритроидной дифференцировки), существенно снижается.

3. В условиях ингибирования ЫО-синтазы на АЦ-мембранах (метод БеИ) резко увеличивается число колоний, состоящих из недифференцированных властных клеток. Количество колоний гранулоцитарного типа, дающих положительную миелопероксидазную реакцию, существенно снижается.

4. Полученные данные указывают на существование зависимости между образованием N0 и процессами регуляции пролиферации и терминальной дифференцировки кроветворных клеток.

Michurina Т.V., Vasilieva T.V., Mikhailenko Ju.V., Bueverova E.I., Kuzin B.A.. Enikolopov G., Khrushchov N.G., Analysis of tissue specific expression of NO-sinthase, // Congress EDBC 95. Toulouse. (9-13 July 1995). P.142.

Михайленко Ю.В., Васильева T.B., Мичурина T.B., Изучение распределения фермента NO-синтазы в различных тканях и органах лабораторных грызунов. // Матерели симпозиуму з мгжнародною участю «XipyprinHi проблеми i еколопя». Чершвщ, YKpaiHa. (5-6 жовтня. 1995). с.89.

Васильева Т.В., Мичурина Т.В., Радионова Ю.В., Кузин Б.А., Ениколопое Г.Н., Хрущов Н.Г. Исследование N0- синтетазы в клетках различных тканей и органов мыши. // Онтогенез. 1997. том.28. № 6. с.458-462.

Радионова Ю.В., Васильева Т.В., Мичурина Т.В., Хрущов Н.Г. Использование NADPH-диафоразной реакции для выявления иннервации различных тканей и органов. // Онтогенез. 1998. том.29. №6. с.463-464.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Радионова, Юлия Викторовна, Москва

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

На правах рукописи

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

РАДИОНОВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА

РОЛЬ ОКИСИ АЗОТА (N0) В ПРОЦЕССАХ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ.

03.00.11 эмбриология, гистология и цитология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель академик РАН, профессор Н.Г. Хрущов

Москва - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................6

1.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ NO..............................................................................................................6

1.2.ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА N0....................................................................................8

1.3. ФЕРМЕНТ NO-СИНТАЗА.............................................................................................................10

1.4. NO-СИНТАЗНЫЙ МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ NO...............................................................13

1.5. ФУНКЦИИ NO В РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ОРГАНИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ..........................................................................................................................................20

1.6. ДАННЫЕ ОБ УЧАСТИИ N0 В ПРОЦЕССАХ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ........................................................................................................................................23

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................29

2. 1. Экспериментальные животные...............................................................................................29

2, 2. NADPH-диафоразная реакция...................................................................................................29

2. 3. Иммуногистохимия....................................................................................................................30

2. 4. Гистохимическая реакция выявления миелопероксидазы......................................................35

2. 5. Экспериментальная модель.......................................................................................................36

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................................38

3.1. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТА NO-СИНТАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЯХ И ОРГАНАХ МЫШЕЙ.............................................................................................................................................38

3. 1. 1. Распределение фермента NOS в тканях и органах млекопитающих...............................38

3. 1. 2. Способы выявления локализации фермента NOS................................................................39

3. 1. 3. NADPH-диафоразная реакция...............................................................................................40

3. 1.4. Непрямая иммунофлуоресцентная реакция.........................................................................42

3 .2. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ NO В КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ НА ПРИМЕРЕ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ...................................................................................................................................44

3. 2. 1. Экспериментальна я модель. Ингибирование фермента NOS на модели Seki.................44

3. 2. 2. Иммуногистохимический анализ клеток регенерировавшего костного мозга сингенных мышиных радиационных химер, инъецированных ингибитором фермента NOS......................................45

3.2.3. Морфологический анализ колоний на ацетат-целлюлозных мембранах сингенных радиационных мышиных химер в норме и при ингибировании фермента NO-синтазы............................64

3.2.4. Обсуждение полученных результатов...................................................................................77

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................81

ПРИЛОЖЕНИЕ № 1. ИЛЛЮСТРАЦИИ К РАБОТЕ.........................................................................83

ПРИЛОЖЕНИЕ №2. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ................................95

1. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО

ТЕСТИРОВАНИЯ КЛЕТОК РЕГЕНЕРИРОВАВШЕГО КОСТНОГО МОЗГА.............................................96

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ. 104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................113

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время известно, что различные клетки млекопитающих способны при участии фермента NO-синтазы (NOS) синтезировать из L-аргинина оксид азота — NO (Palmer et al., 1987; Rnowles, Moneada, 1994). Работами последних лет показано, что оксид азота N0 участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток разного типа (Peunova, Enikolopov, 1995; Kuzin, Roberts, 1996; Holliday et al., 1997). Однако до сих пор детальный механизм этих процессов остается неясным. Изучение роли N0 в пролиферации и дифференцировке клеток кроветворной и других тканей является одним из важных аспектов, необходимых для понимания фундаментальных основ регуляции процессов детерминации и дифференцировки клеток.

Для того чтобы изучить, каким образом N0 влияет на дифференцировку и пролиферацию клеток кроветворной ткани, начиная с самых ранних сроков кроветворения, мы тестировали восстановившийся костный мозг радиационных мышиных химер в норме и в условиях ингибирования фермента NO-синтазы. Кроме того, используя модель Seki (модель получения кроветворных колоний на ацетат-целлюлозных мембранах, имплантированных в перитонеальную полость мышей, у которых разрушенное облучением кроветворение было восстановлено за счет внутрибрюшинного введения клеток донорского костного мозга (Seki, 1973; Мичурина и др., 1991)) мы изучили влияние ингибирования NO-синтазы на процесс образования колоний на АЦ-мембранах и их клеточный состав.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы на модели регенерирующей кроветворной ткани изучить участие окиси азота — N0 в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток.

Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1) исследовать распределение фермента ЫО-синтазы в клетках кроветворной ткани (костный мозг, селезенка, тимус) и в других тканях и органах (лимфоузлы, печень, почка, сердце, кожа, поджелудочная и подчелюстная железы, тонкий кишечник, подкожная соединительная ткань, перитонеальный экссудат и др.) мыши при помощи цитохимического (МАЭРН-диафоразная реакция) и иммуногистохимического (непрямая иммунофлуоресцентная реакция с применением антител к нейральной, макрофагальной и эндотелиальной изоформам ИО-синтазы) методов;

2) на клетках костного мозга радиационных мышиных химер, регенерировавшего в условиях ингибирования ]\Ю-синтазы, изучить экспрессию рецепторов к факторам роста 1Ь-3, 8СР (с-кк — лиганд) и Еро с помощью непрямой иммунофлуоресцентной реакции;

3) изучить соотношение разных типов кроветворных колоний, образовавшихся на АЦ-мембранах (модель БеИ) в условиях ингибирования фермента N0-синтазы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ NO.

К началу восьмидесятых годов мировая наука в целом накопила более чем

достаточно фактов, указывающих на существование биогенного N0. Однако из-за того, что N0 долгое время рассматривался как опасное для здоровья вещество, предположения о возможности образования биогенного N0 представлялись слишком фантастичными и требовали от исследователей определенного мужества. Действительно, общеизвестная канцерогенность нитрозаминов, присутствие оксидов азота в выхлопных газах и в табачном дыме, пропагандируемый экологами жесткий контроль нитратов и нитритов во фруктах и в овощах создали N0 негативную репутацию.

Исследования, приведшие к открытию биосинтеза N0, велись по двум основным направлениям. Первое было более физиологическим по отбору методов исследования, и брало свое начало с попыток объяснить действие азотсодержащих вазодилаторов типа нитроглицерина. Второе имело химический уклон в методах решения задачи и началось с желания найти источник появления биогенных нитратов. Оба направления развивались независимо одно от другого. На важные результаты, получаемые случайно в ходе решения посторонних задач (например, обнаружение N0 в крови людей, обезьян и крыс (Freeman et al., 1978) или нитрозокомплексов в печени крыс (Ванин и др., 1978)), никто из представителей, как первого, так и второго направлений не обращал внимания.

Первой публикацией, неопровержимо доказавшей биогенное происхождение нитрата в моче млекопитающих, видимо, является статья Митчелла (Mitchell et al., 1916). В многодневных опытах на крысах и самих авторах было показано, что количество нитратов, выводимых с мочой, заведомо больше, чем поступает с пищей. Авторы не обсуждают вероятные пути окисления, ведущие к нитратам, указывая лишь, что это будет

темой дальнейших поисков. Как известно, эти поиски затянулись вплоть до 1987, когда Палмер с соавторами показал, что эндотелиальные клетки сосудов способны при участии фермента синтезировать N0 из L-аргинина (Palmer et al., 1987). Самое удивительное, что еще в 1977 году было опубликовано несколько очень интересных работ (Arnold et al., 1977; Deguchi, 1977), явно указывающих на существование биогенного NO. Арнольдом и соавторами была показана способность нитроглицерина, нитропруссида и N0 активировать гуанилат-циклазу. Более того, авторы пришли к выводу, что именно N0 является истинным активатором, остальные вещества были лишь его предшественниками. В свою очередь, Дегучи обнаружил в тканях мозга лабильный низкомолекулярный фактор, активирующий гуанилат-циклазу (GAF), неидентичный ни одному из испытанных им метаболитов, устойчивый к действию нескольких гидролаз, инактивируемый гидроксиламином, N-метилгидроксиламином и гемоглобином. Следует сказать, что еще в 1975 году было показано существование комплексов NO с гемоглобином NO-Hb (Oda et al., 1975). Через три года после публикаций Арнольда и Дегучи Фарчгот и Завадский (Furchgott, Zawadski, 1980) открыли секрецию эпителиальными клетками аорты низкомолекулярного вещества, способствовавшего релаксации гладких мышц артерий под действием ацетилхолина. Вещество назвали «эндотелиальным релаксирующим фактором» (endothelium-derived relaxing factor, EDRF). Структуру этого вещества не установили, тем не менее, определили, что оно не относится ни к одному из классов известных мессенджеров (пептиды, нуклеотиды, простагландины), требует для образования кислород и действует так же, как нитрит и «нитроглицерин». Однако только 11 июня 1987 года была опубликована статья Палмера, в которой было показано, что EDRF — это N0. Первоначально, это открытие многими исследователями воспринималось весьма скептически и термины «эндотелиальный релаксирующий

фактор» и «гуанилил-циклаза активирующий фактор» встречались, применительно к биогенному N0, в публикациях даже спустя пять лет (Schmidt et al., 1992). После осознания открытия количество публикаций, посвященных биогенному N0, резко возросло, и уже в 1992 году N0 был назван «молекулой года» (Koshland, 1992). За это время биосинтез NO был обнаружен у беспозвоночных (Elphick et al.,1993) и у некоторых бактерий (Chen, Rosazzo, 1994), однако, у растений биосинтез NO пока не найден.

1.2.ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА NO.

NO-является бесцветным, реакционно-способным газом, образующимся из азота и

кислорода воздуха при грозах и ядерных взрывах в атмосфере, а также искусственно синтезируемым в производстве азотной кислоты каталитическим окислением аммиака.

Молекула N0 — парамагнитна и содержит нечетное число электронов, один из которых имеет неспаренный спин:

:N::Ö:

Наличие одного электрона с неспаренным спином придает молекуле N0 высокую реакционную способность, позволяющую быстро и избирательно взаимодействовать с молекулой мишенью и быстро инактивироваться. Малые размеры и отсутствие заряда обеспечивают этой молекуле высокую проницаемость через мембраны клеток и субклеточных структур (Реутов, 1997). Коэффициент диффузии для N0 приблизительно в 1,4 раза выше, чем для кислорода при 37°С (Yoshimura et al., 1996). Кроме этого, молекула N0 — малополярная (хорошо растворимая не только в водных растворах, но и в гидрофобных липидных слоях) и электронейтральная (не взаимодействует с заряженными

группами электролитов). Благодаря этим свойствам N0 идеально подходит на роль всепроникающего переносчика информации.

Высокая скорость реакции N0 со свободными радикалами позволяет рассматривать его как «скавенджера» (поглотителя) радикалов in vivo. Таким образом, N0, первоначально рассматривавшийся как яд, может выступать в роли эффективного детоксикатора (Gorbunov et al., 1996).

Ко всему прочему, NO может взаимодействовать с белками и низкомолекулярными соединениями, содержащими в активном центре ионы переменных металлов (Ванин, Маленкова, 1996).

Поскольку обнаружили, что NO секретируется макрофагами для убийства других клеток (Stuehr et al., 1989; Nathan, Hibbs, 1991), многие исследователи недоумевали, каким образом такое высокотоксичное вещество может принимать участие в передаче внутри- и межклеточной информации. Однако оказалось, что цитотоксичность свободного N0 сильно преувеличивали, макрофаги же синтезируют и секретируют N0 для неферментативной генерации действительно супертоксичного пероксинитрита (Koppenol et al., 1992; Huie, Padmaja, 1993).

Распространено мнение, что основной формой транспорта N0 «на дальние дистанции» являются нитрозотиолы. В работе (Pietraforte et al., 1995) рассмотрена роль тиолов в транспорте N0 к эритроцитам, но главная роль в переносе N0 в крови отводится самим эритроцитам (Jia Li et al., 1996).

Все вышеперечисленные особенности молекулы N0 в полной мере используются клетками в механизмах внутри- и межклеточной сигнализации и для регуляции содержания этого соединения (Таблица 1) (Реутов, 1997).

Таблица 1

Физико-химические свойства оксида азота, клеточные эффекты и его физиологическая роль

Физико-химические характеристики Клеточные эффекты Физиологическая роль

Отсутствие заряда, малые размеры Высокая проницаемость через мембраны Участие в межклеточной сигнализации

Наличие неспаренного электрона Взаимодействие со свободными радикалами Взаимодействие с гемсо-держащими белками, а также с низкомолекулярными железосерными соединениями Регуляция содержания N0 Участие во внутриклеточной сигнализации и в аккумуляции N0

Способность участвовать в окислительно-восстано вительных реакциях Образование нитро- и нитрозосоединений Участие в цикле оксида азота и в аккумуляции N0

1.3. ФЕРМЕНТ NO-СИНТАЗА. В настоящее время известно, что синтазы, продуцирующие N0 из L-аргинина,

представляют собой не один фермент, а семейство ферментов (КФ1.14.13.39) (Schmidt et

al., 1988; Nathan, 1991; Abu-Soud, Stuehr, 1993; Nathan, 1995; Schmidt et al., 1995).

Различают три типа NO-синтаз (NOS), сходных по механизму катализа и, в

основных чертах, по организации генов, но отличающихся системой регуляции и

невысокой гомологией между представителями разных типов.

NO-синтаза I типа (нейрональная конститутивная) выделена первоначально из клеток мозга (мозжечка крысы) (Bredt, Snyder, 1990; Mayer et al.,1990; Bredt et al., 1991). Этот фермент представляет собой гомодимер (состоит из двух одинаковых субъединиц), с молекулярной массой одной субъединицы 160 кДа, и характеризуется обратимым связыванием с кальмодулином. Более 50% аминокислотной последовательности этого фермента гомологичны редуктазе цитохрома Р-450. Регуляция NOS-I осуществляется при участии ионов Са2+ (Bredt et al., 1991; Nakane et al., 1993; Schmidt et al., 1995). Помимо различных клеток центральной и периферической нервной системы, этот фермент был обнаружен в клетках почек (Mündel et al., 1992; Wilcox et al., 1992), бронхиального эпителия, желудочного эпителия (Реутов, 1997), скелетных мышц (Nakane et al., 1993), половых органов (Burnett et al., 1992), в ß-клетках поджелудочной железы (Shimosegava et al., 1992; Schmidt et al., 1992) и в надпочечниках (Dun et al., 1993; Afework et al., 1992).

NO-синтаза II типа (индуцибельная макрофагальная) впервые была выделена из макрофагов (Tayeh, Marietta, 1989; Stuehr et al., 1991). Она представляет собой гомодимер, молекулярная масса субъединицы равна 130 кДа. Этот фермент представлен двумя формами — растворимой и мембраносвязанной (Ringheim, Pan, 1995), различающимися строением N-концевого фрагмента. Этот фермент менее зависим от ионов Са2+ или кальмодулина и, по-видимому, это связано с тем, что кальмодулин прочно связан с этой изоформой NO-синтазы (Hibbs et al.,1987; Cho et al., 1992). Помимо макрофагов этот фермент был обнаружен в глиальных клетках микроглии мозга (Lowenstein et al., 1992), в нейтрофилах (McCall et al., 1989), эпителии дыхательных путей (Guo et al., 1995), кардиомиоцитах, кальмодулинзависимых гепатоцитах, мегакариоцитах, кератиноцитах (Xie et al., 1992; Schmidt et al., 1995;Реутов, 1997).

NO-синтаза III типа (конститутивная эндотелиальная) характерна для эндотелиальных клеток. Молекулярная масса этого фермента составляет 133 кДа (Nishida et al., 1992; Schmidt et al., 1995). Этот фермент может находиться как в растворимой, так и в мембранно-связанной форме. Он, как и NOS-I, характеризуется обратимым связыванием с кальмодулином, и его активность зависит от ионов Ca (Pollok et al., 1991; Lamas et al., 1992). Эта изоформа фермента была обнаружена также в гиппокамп (Реутов 1997).

Недавно Бейтс и соавторы (Bates et al., 1996) доказали наличие NOS (митохондриальной) в митохондриях. Для ее определения использовали антитела к NOS III типа, однако, идентичны ли эти ферменты, пока неизвестно.

Некоторые виды клеток могут экспрессировать NOS разных типов. Получены мутантные мыши, лишенные генов каждой из NOS, все они оказались жизнеспособными. Утрата гена NOS-I привела к повышению агрессивности и чрезмерной сексуальности, NOS-II-делетированные мыши были более чувствительны к инфекциям, а мыши, лишенные