Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль минисателлитного повтора UPS29 в модуляции экспрессии гена ACAP3 при эпилепсии и болезни Паркинсона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль минисателлитного повтора UPS29 в модуляции экспрессии гена ACAP3 при эпилепсии и болезни Паркинсона"

На правах рукописи

БЕЛОЦЕРКОВСКАЯ Екатерина Васильевна

РОЛЬ МИНИСАТЕЛЛИТНОГО ПОВТОРА иРв29 В МОДУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АСАРЗ ПРИ ЭПИЛЕПСИИ И БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

03.00.04-биохимия

9 ОКТ 2014

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2014

005553072

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного

отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Паткин Евгении Львович

Официальные оппоненты: Смирнов Александр Федорович

доктор биологических наук, профессор,Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», заведующий Лабораторией генетики животных

Гужова Ирина Владимировна

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, заведующий Лабораторией защитных механизмов клетки

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита состоится <С С » ^ 2014 г. в ^ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских науки на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov03.htm

Автореферат диссертации разослан «& ШоТМ,^ 2014 г. Ученый секретарь ___-

Диссертационного совета Л.К. Хныченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время скорость накопления новых данных о нуклеотидных последовательностях геномов возрастает с каждым годом. Несмотря на достигнутый прогресс в этой области, структурная организация геномов, а также функциональная значимость многих элементов генома до сих пор остаются малоизученными. В частности, является актуальным изучение роли сателлитных ДНК, которые представляют собой кластеры тандемио повторяющихся последовательностей ДНК различного размера (Хемлебен и др., 2003). Среди сателлитных ДНК выделяют микросателлиты, минисателлиты и макросателлиты, также называемые собственно сателлитной ДНК. Минисателлиты — это повторяющиеся последовательности ДНК, состоящие из тандемных повторов от 5 п.н. (пар нуклеотидов) до 100 п.н., при общем размере кластера от 500 п.н. до 100 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) (Buard, Jefireys, 1997). Большой интерес к изучению минисателлитных последовательностей ДНК в основном связан с ролью этих повторов в развитии заболеваний человека. В настоящее время для многих минисателлитов установлены ассоциации с онкологическими (Kiaris et al., 1995; Santos-Silva et al., 2005; Yoon et al., 2011), неврологическими (Lalioti et al., 1997a; Сучкова и др., 2009), нейродегенеративными (Kelada et al., 2006), психическими (Haddley et al., 2008; Hranilovic et al., 2000; Reif et al., 2012), сердечно-сосудистыми (Iwai et al., 1999; Lievers et al., 2001) и другими заболеваниями человека. Роль минисателлитных локусов в развитии заболеваний связывают с участием этих последовательностей ДНК в модуляции экспрессии генов посредством взаимодействия минисателлитных последовательностей с транскрипционными факторами, регуляции альтернативного сплайсинга, изменения уровня метилирования CpG-динуклеотидов (Vergnaud, Denoeud, 2000; van IJzendoorn et al., 2010). Кроме эго, за последние годы стала очевидной взаимосвязь между статусом метилирования сателлитной |НК, нестабильностью повторов и возникновением патологических изменений в организме (Robertson, Wolffe, 2000).

Несмотря на полученные данные о регуляторных свойствах минисателлитных оследовательностей, вопрос о функциях этих элементов генома, и в частности механизмах участия развитии различных патологий, до сих пор остается открытым. В связи с этим поиск и изучение ювых минисателлитных последовательностей в геноме человека крайне актуальны. Одним из таких инисателлитных локусов является UPS29 (University París South), локализованный в интроне 14-15 гна АСАРЗ (АгКЗАР, Coiled coil, Ankyrin repeat, PH domain) (CENTB5, KIAA1716) (GeneID: 116983). í Лаборатории молекулярной цитогенетики развития млекопитающих Отдела молекулярной енетики Института экспериментальной медицины на протяжении многих лет ведется изучение инисателлитного повтора UPS29. Ранее было выявлено 7 аллелей минисателлита UPS29, одержащих 6, 8, 9, 10, 14, 17 и 24 повторов (Сучкова и др., 2007). При этом установлено, что ороткие аллели минисателлита UPS29 ассоциированы с ранним и поздним дебютом болезни

Паркинсона у женщин (Сучкова и др., 2009). Несмотря на то, что механизм выявленной ассоциации не ясен, данные анализа in silico нуклеотидной последовательности UPS29, указывающие на возможность участия минисателлита UPS29 в альтернативном сплайсинге транскриптов гена АСАРЗ, а также взаимодействие с рядом транскрипционных факторов (Шубина и др., 2009), позволяют предполагать возможное модулирующее влияние этого минисателлитного повтора на экспрессию гена АСАРЗ и/или близлежащих генов. Следует отметить, что ген АСАРЗ, кодирующий белок центаурин бета 5, локализован в субтеломерной области короткого плеча первой хромосомы (1р36.33) и входит в одну группу сцепления с генами, вовлеченными в развитие неврологических заболеваний и синдромов, в том числе различных форм болезни Паркинсона и эпилепсии (Сучкова и др., 2009). Кроме того, известно, что центауриновые белки в наибольшей степени экспрессируются в мозге (Nagase et al., 2000) и связаны с развитием нейродегенеративных и психических заболеваний (Reiser, Bernstein, 2004; Wassink et al., 2005). Несмотря на эти данные, вопрос о возможном участии минисателлита UPS29 в патогенезе различных форм эпилепсии до сих пор не разрешен.

Эпилепсия и болезнь Паркинсона — широко распространенные заболевания неврологического профиля. По оценке Всемирной организации здравоохранения во всем мире эпилепсией страдают около 50 миллионов человек. На сегодняшний день в развитых странах доля людей, страдающих эпилепсией в активной форме, составляет от 4 до 10 человек на 1000 человек. Частота встречаемости болезни Паркинсона среди лиц старше 65 лет составляет 0,1 — 0,2%, в то время как среди лиц старше 85 лет этот показатель достигает 4%, при этом ожидается, что к 2030 году заболеваемость болезнью Паркинсона возрастет вдвое (Karlsson et al., 2013).

Эпилепсия и болезнь Паркинсона относятся к группе мультифакториальных заболеваний, развитие которых определяется сложным комплексом механизмов, контролируемых различными генетическими факторами (Engel, 2001; Иллариошкин и др., 2006). На сегодняшний день получены важные сведения лишь о некоторых механизмах этих заболеваний. Так, в отношении болезни Паркинсона выявлено 18 локусов PARK (Bekris et al., 2010), а в случае эпилепсии описаны гены белков ионных каналов и нейромедиаторов, связанные с развитием этой патологии (Иллариошкин и др., 2002).

Следует подчеркнуть, что в настоящее время имеются данные, указывающие на сочетанность эпилепсии и болезни Паркинсона (Bodenmann et al., 2001; Gaitatzis et al., 2004; Feddersen et al., 2013). Однако общие патогенетические факторы этого явления до сих пор точно не установлены. Среди предполагаемых общих причин этих заболеваний рассматривают нарушение норадренергической системы, нейропатологические изменения гиппокампа и его иннервации от голубого пятна (Szot, 2012), подавление автофагии (Polajnar, Zerovnik, 2011; Mizushima, Komatsu, 2011; McMahon et al., 2012). Кроме того, известно, что при некоторых эпилептических синдромах

регистрируются изменения компонентов дофаминергической системы (Feddersen et al., 2013). В то же время при болезни Паркинсона некоторые антиэпилептические препараты оказывают нейропротективное воздействие на дофаминергические нейроны (Kidd, Schneider, 2011; Xiong et al., 2011). Одним из генов, изменение в котором связано с развитием эпилепсии, а также предполагаемым участием в процессе нейродегенерации, является ген цистатина В, CSTB (GenelD: 1476, 21q22.3), белковый продукт которого функционирует как ингибитор цистеиновых протеиназ (Turk et al., 2008). Особый интерес вызывает тот факт, что ген CSTB содержит минисателлит, экспансия которого приводит к снижению уровня мРНК цистатина В (Joensuu et al., 2007) и развитию миоклонус-эпилепсии Унферрихта-Лундборга (Lalioti et al., 1997а; Joensuu et al., 2007). Несмотря на имеющиеся данные о возможном участии белка цистатина В в развитии не только различных форм эпилепсии, но и ряда нейродегенеративных заболеваний, в литературе отсутствуют сведения об изучении изменения уровня мРНК этого гена при этих патологиях.

Следует отметить, что несмотря на достигнутый прогресс и большой интерес к молекулярно-генетической составляющей эпилепсии и болезни Паркинсона, полученные данные о патогенезе этих заболеваний до сих пор не позволяют сформировать полное представление о механизмах развития этих патологий. Очевидно, что некоторые участники патогенеза до сих пор не выявлены. В этой связи поиск новых молекулярных факторов, в том числе минисателлитных ДНК повторов, вовлеченных в развитие этих патологических состояний организма, является весьма актуальным. Цель работы — оценить влияние минисателлитного повтора UPS29 на экспрессию гена АСАРЗ при эпилепсии и болезни Паркинсона в сравнении с модельными экспериментами на культуре клеток. Задачи исследования включали:

1. сравнить аллельные и генотипические частоты минисателлита UPS29 у пациентов с эпилепсией, болезнью Паркинсона и у здоровых людей;

2. провести сравнительный анализ статуса метилирования ДНК UPS29 у пациентов с эпилепсией, болезнью Паркинсона и у здоровых людей;

. оценить уровень мРНК гена АСАРЗ в лейкоцитах периферической крови у пациентов с пилепсией, болезнью Паркинсона, здоровых людей;

. оценить уровень мРНК гена CSTB в лейкоцитах периферической крови у пациентов с эпилепсией, олезнью Паркинсона, здоровых людей;

. оценить влияние различных аллелей UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных кспериментах по временной трансфекции клеточных культур различного типа (HeLa, F9, строциты крысы);

. сравнить модулирующий эффект различных аллелей минисателлита UPS29 на уровень кспрессии репортерного гена EGFP в клетках мышиной эмбриональной тератокарциномы линии 9 в экспериментах по стабильной трансфекции.

Научная новизна диссертационной работы. В результате данного диссертационного исследования впервые было установлено повышение частоты коротких аллелей минисателлита иР829 среди женщин с симптоматической эпилепсией. Впервые выявлено снижение частоты метилированных форм 11Р829 в лейкоцитах периферической крови у женщин с эпилепсией и отсутствие связи между статусом метилирования \JPS29 и болезнью Паркинсона. Впервые показано, что при симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона наблюдается повышение уровня мРНК гена АСАРЗ в лейкоцитах периферической крови по сравнению с контролем. Впервые изучен уровень мРНК гена СБТВ при симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона и показано, что при этих заболеваниях уровень мРНК С5ТВ значительно снижается по сравнению с контролем. Впервые, в модельных экспериментах обнаружено, что короткий аллель минисателлита 11Р829 обладает супрессорными свойствами в отношении экспрессии репортерного гена ЕСРР в клеточной линии Р9.

Теоретическая и практическая значимость результатов. В данном диссертационном исследовании были выявлены новые молекулярно-генетические факторы патогенеза симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона. Полученные сведения вносят вклад в понимание механизмов патогенеза симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона и позволяют получить дополнительную информацию о возможных общих биохимических механизмах сочетанности этих заболеваний.

Помимо новых сведений для понимания молекулярных основ патогенеза эпилепсии и болезни Паркинсона, результаты данного исследования могут представлять интерес и для клинической практики. Молекулярно-генетический анализ минисателлита иР829 у пациентов с различными формами эпилепсии и болезни Паркинсона может быть использован как дополнительный прогностический критерий риска развития этих заболеваний, для определения которого используется доступный биологический материал, а именно лейкоциты периферической крови. Кроме того, полученные данные об изменении уровня экспрессии гена АСАРЗ в клетках периферической крови у пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона, могут быть полезными при создании тест-систем на основе комплексных биомаркеров для диагностики этих заболеваний, подборе персонализированного курса терапии, в том числе с учетом генотипа по минисателлиту ЦР829. Полученные данные об изменении уровня экспрессии гена АСАРЗ могут найти применение при поиске и проверке новых фармакологических препаратов, разрабатываемых для лечения эпилепсии и болезни Паркинсона. Кроме того, установленное различие в статусе метилирования иР829 у пациентов с эпилепсией может оказаться важным для предсказания эффекта антиэпилептических препаратов, обладающих влиянием на процесс метилирования ДНК.

Положения, выносимые на защиту.

• Короткие аллели минисателлита UPS29 у женщин являются фактором риска развития симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона с поздним дебютом заболевания. Наличие коротких аллелей UPS29 может служить дополнительным критерием риска развития этих заболеваний.

• Статус метилирования минисателлита UPS29 оказывает влияние на развитие симптоматической эпилепсии у женщин.

• Ген АСАРЗ вовлечен в патогенез симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона.

• Ген CSTB вовлечен в патогенез симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона.

• Минисателлит UPS29 обладает супрессорными свойствами в отношении экспрессии репортерного гена EGFP в клетках мышиной эмбриональной тератокарциномы линии F9.

Степень достоверности и апробация результатов.

Экспериментальные данные получены с применением современных биохимических и молекулярно-биологических методов, лично обработаны и проанализированы. Выносимые на защиту научные положения и вытекающие из них выводы подтверждены экспериментальными данными, полностью обоснованы и соответствуют представленным результатам. Достоверность выводов подтверждается большим фактическим материалом, корректной обработкой данных на основе методов статистического анализа.

Материалы диссертации были представлены на: IV Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической Конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010" (Москва, 2010); 22-ой Европейской студенческой конференции «Perspectives and Challenges in Regenerative Medicine» (Берлин, 2011); Международном молодежном научном форуме «Ломоносов — 2011» (Москва, 2011); VIII Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2013); XX Международном Конгрессе по болезни Паркинсона и сопутствующим заболеваниям «Integration by Translation» (Женева, 2013); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); VI съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону, 2014). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе статья в отечественном журнале, статья в международном рецензируемом журнале, 10 тезисов отечественных и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 17 таблицами; состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, и списка цитируемой литературы (277 источников, в том числе 256 на иностранных языках).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови пациентов с симптоматической эпилепсией с полиморфными приступами (табл. 1), пациентов с идиопатической формой болезни Паркинсона с дебютом после 50 лет (табл. 2). Подбор пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона из Санкт-Петербурга осуществлялся сотрудниками Клиники неврологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.

В качестве контроля использовали образцы ДНК добровольцев из Санкт-Петербурга, которые не являлись кровными родственниками и не страдали эпилепсией и болезнью Паркинсона того же пола, возраста и этнической принадлежности, что и соответствующие группы пациентов (табл. 1,2).

Табл. 1. Характеристика исследованных групп пациентов с эпилепсией и здоровых людей

Выборка Эпилепсия Контрольная группа

п Возраст, лет (М ± ЙО) п Возраст, лет (М ± ЯО)

Мужчины 78 36,5 ±16,6 54 34,1 ±14,1

Женщины 110 37,1 ± 14,3 98 30,3 ±10,1

Табл. 2. Характеристика исследованных групп пациентов с болезнью Паркинсона и здоровых людей____ _

Выборка Болезнь Паркинсона Контрольная группа

п Возраст, лет (М ± ЭЭ) п Возраст, лет (М ± Бй)

Мужчины 33 67,5 ± 6,5 67 63,4 ± 18,2

Женщины 33 61,7 ±9,7 101 58,6 ± 18,6

Клеточные линии. Линии клеток эмбриональной тератокарциномы мыши Р9 и НеЬа человека, соответствующие Американской коллекции типовых культур (АТСС), были любезно предоставлены Российской коллекцией клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клеточные культуры первичных астроцитов крысы были получены согласно методу, описанному СаяБта с соавторами (СаяБша е( а1., 2002).

Плазмндные конструкции рМб-ЕвРР и рК26-ЕСРР-иР829. Эукариотический экспрессионный плазмидный вектор рК26-ЕСРР (5,5 тыс. п.н.), содержащий ген усиленного зелёного флуоресцирующего белка ЕСРР под контролем промотора Я08А26 мыши (ЮБвеЬегИг й а1., 1999) (рис. 1, А), был любезно предоставлен проф. Н.В. Томилиным (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Между промоторами СМУ 1Е и Я08А26 по сайтам НтсЛП и ЕсоЫ были встроены различные аллели 1)Р829, получены три типа плазмидных конструкций, содержащих длинный аллель №829 (рЯ26-ЕСРР-иР8900), короткий аллель (рЯ26-ЕСРР-и[>8400), длинный аллель с фланкирующими участками интрона (рЯ26-НОРР-иРБ 1500) (рис. 1, Б).

Рис. 1. Схематическое изображение плазмидной конструкции р]<26-Е01;Р (А), с указанием сайта встраивания аллелей Ш'829 (Б).

Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови человека, а также клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии Б9 методом хлороформ-изоамиловой экстракции.

Определение аллельных вариантов минисателлита 11Р829. Аллельные варианты 1Л>829 выявляли с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров сШРЗ (5'-tcataagcttcacatgggcagatggtacctgc-3') и сШР4 (5'-gtcagaattccgcgagagccctgacagttg-3,), а также праймеров ехиР5 (5'-tcataagcttaggctgactccgagaagctg-Зl) и ех№6 (5l-gtcagaattcgagcactcaatgcagagcag-3') (Сучкова и др., 2007). Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мМ Тле-НС! (рН 8.5), 25 мМ КС1, ЮмМ 2-меркаптоэтанола, 0.1% Тритона Х-100, 3 мМ *^С12, по 320 мкМоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1.25 ед. Тац-полимеразы («Медиген», Новосибирск), по 0.4 мкМоль каждого праймера и 10 - 15 нг геномной ДНК. Режим амплификации включал предварительную денатурацию при 97°С, 7 мин; 30 циклов, состоящих из денатурации при 96°С, 1 мин; отжига с праймерами при 57°С, 1 мин; элонгации при 72°С, 3 мин; заключительный цикл: 57°С, 1 мин и 72°С, 8 мин. Продукты амплификации разделяли с помощью нейтрального электрофореза в 6%ПААГ и окрашивали в 0.1% AgNOз.

Ферментативный гидролиз геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами. Для

анализа метилирования иР829 проводили ферментативный гидролиз геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами Мзр1 и Нра11 («СибЭнзим», Новосибирск) с последующей ПЦР. Рестрикционная смесь объемом 30 мкл содержала 10 мМ Тп8-НС1, рН 7.6; 10 мМ К^СЬ; 1 мМ дитиотрейтол, 20 ед. Мэр1 или 20 ед. Нра11, 50 нг геномной ДНК. Рестрикционную смесь инкубировали при 37°С в течение ночи. После рестрикции 7,5 мкл рестрикционной смеси вносили в ПЦР-смесь с праймерами сШРЗ и сШР4, но без добавления Продукты амплификации

разделяли с помощью нейтрального электрофореза в 6% ПААГ и окрашивали в 0.1% AgNOз. Временная и стабильная трансфекция клеток. Временную трансфекцию клеток линии НеЬа, И9 и первичных астроцитов крысы плазмидами рК26-ЕС1*'Р, рК26-ЕСЕР-иР81500, рЯ26-ЕС5ЕР-иР8900, рК26-ЕСГР-иР8400 проводили с помощью реагента «8ирегЕесЬ> («Qiagen», Германия)

согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для каждого варианта плазмидных конструкций эксперименты по трансфекции повторяли не менее пяти раз.

В экспериментах по стабильной трансфекции недифференцированных клеток линии F9 для отбора трансфектных клеток проводили их культивирование на селективной среде с гентамицином (G-418) в концентрации 400 г/мл. Культуры трансфицированных клеток проверяли на наличие вышеописанных конструкций с помощью ПЦР с использованием праймеров, специфичных к гену EGFP (EGFP1: 5'-cagccgctaccccgaccaca-3', EGFP2: 5'-cgctgccgtcctcgatgttg-3') (Greco et al., 2004) и минисателлиту UPS29.

Оценка флуоресценции белка EGFP в культуре трансфицированных клеток. Клетки HeLa, эмбриональной тератокарциномы мыши F9 и первичных астроцитов крысы, трансфицированных плазмидами, содержащими ген зеленого флуоресцентного белка EGFP, анализировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss LSM 510 МЕТА («Carl Zeiss», Германия), используя лазер длиной волны 488 нм, объектив Plan Achromat 63х (NA 1.4).

Оценка нормализованного уровня экспрессии генов АСАРЗ и CSTB в лейкоцитах периферической крови. Тотальную РНК из лейкоцитов периферической крови выделяли с помощью реагента "Trizol" («Life Technologies», США), согласно рекомендациям производителя. После ДНКазной обработки экстрагированной РНК, проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора ¡Script™ cDNA Synthesis Kit («Bio-Rad», США), следуя рекомендациям фирмы-производителя.

Уровень экспрессии генов АСАРЗ и CSTB определяли методом ПЦР «в реальном времени». В качестве эндогенных контролей были выбраны ß-актин {АСТВ) и р2-микроглобулин (В2М) как одни из наиболее стабильно экспрессирующихся генов в лейкоцитах (Vandesompele et al., 2002). Праймеры к генам АСАРЗ и CSTB были подобраны с помощью программы Primer express 3.0. Опубликованные ранее последовательности праймеров использовали при амплификации фрагментов генов АСТВ (Metaye et al., 2002), В2М(Kadi et al., 2002) (табл.3). Все использованные в работе праймеры были синтезированы компанией «Синтол», Россия.

Амплификацию проводили на приборе CFX96 Thermal cycler («Bio-Rad», США) с использованием коммерческой смеси iQ™ SYBR® Green Supermix («Bio-Rad», США), с добавлением 0,88 мкМоль каждого из праймеров и кДНК. Режим амплификации включал: начальную денатурацию при 95°С — 5 мин; 40 циклов, состоящих из денатурации при 95°С, 20 сек; отжига при 57°С - 61°С в зависимости от амплифицируемой последовательности, 20 сек; элонгации при 72 С, 30 сек. Все исследуемые и контрольные образцы амплифицировали в трехкратной повторности.

Ген Амплифицируемый участок Нуклеотидная последовательность Температура отжига, С

АСТВ Экзон 4 forward: 5'-tccctggagaagagctacg-3' 61

Экзон 5 reverse: 5'-gtagtttcgtggatgccaca-3'

В2М Экзон 2 forward: 5 '-gatgagtatgcctgccgtgt-3' 57

Экзон 4 reverse: 5'-caatccaaatgcggcatct-3'

АСАРЗ Экзон 17 forward: 5'-tgcaggcagcaggaaacc-3' 57

Экзон 18 reverse: 5'-ccaegtatttgtccttgatcca-3'

CSTB Экзон 1 forward: 5'-atcgccgaccaggtgagg-3' 59

Экзон 2 reverse: 5'-ctcgcaggtgtacgaagtcc-3'

Статистическая обработка данных. Расчёт соответствия распределения генотипов в популяционной выборке закону Харди-Вайнберга проводили с использованием программы Hardy-Weinberg equilibrium calculator (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml).

Оценку достоверности различий между исследуемыми выборками по частоте коротких аллелей UPS29 и индивидов, носителей коротких аллелей UPS29, а также частоте индивидов с метилированным UPS29 проводили с помощью программного обеспечения «VassarStats: Website for Statistical Computation» (http://vassarstats.net). Для анализа был использован точный критерий Фишера (двусторонний) для таблиц сопряженности 2x2. Различия между сравниваемыми выборками считали статистически значимыми при р < 0,05. В случаях достоверных отличий между контролем и исследуемыми группами пациентов были вычислены показатели относительного риска (RR), отношение шансов (OR) и коэффициент ассоциации (Phi). Значения этих показателей указаны с 95% доверительным интервалом.

Оценку достоверности различий нормализованной экспрессии генов АСАРЗ и CSTB между исследуемыми группами проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (Гланц, 1998).

Достоверность различий показателей интенсивности флуоресценции белка EGFP в клетках F9, несущих плазмидные конструкции pR26-EGFP, pR26-EGFP-UPS400, pR26-EGFP-UPS900, pR26-EGFP-UPS1500, определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ ассоциаций минисателлита UPS29 с эпилепсией и болезнью Паркинсоиа

В исследованных выборках пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсоиа, как и в контроле, были выявлены длинный аллель (из 17 повторяющихся единиц) и короткие аллели (менее 17 повторов) минисателлита UPS29.

Закон распределения генотипов Харди-Вайнберга соблюдался в контрольной выборке для эпилепсии (X2 =1,33; р=0,51); контрольной выборке для болезни Паркинсоиа (X2 = 1,39; р =0,50);

выборке пациентов с эпилепсией (А-2 =0,77; р =0,68) и пациентов с болезнью Паркинсона (Л"2 = 0.07; Р =0,97).

Были обнаружены статистически значимые различия по частоте коротких аллелей иРБ29 (р = 0,001) (табл. 4) и частоте индивидов (р = 0,002), носителей коротких аллелей, только для женщин с эпилепсией (табл. 5). У женщин с эпилепсией наблюдалось повышение частоты коротких аллелей иР829 (р = 0,001). Наличие в генотипе у женщин хотя бы одного короткого аллеля иР829 повышает риск развития эпилепсии (ЯК. = 2,40, 95% С1: 1,35 - 4,26; 011=3,05, 95% С1: 1,50 - 6,20; РЫ=0,22; р = 0,002). Для мужчин не выявлены достоверные различия по аллельным (р = 0,161) и генотипическим частотам (р = 0,046) между пациентами с эпилепсией и здоровыми людьми.

Табл. 4. Частота коротких аллелей минисателлита иР829 среди пациентов с эпилепсией и здоровых людей

Выборка контроль эпилепсия

N Частота, % ± тр, (п) N Частота, % ± тр, (п)

Мужчины, с? 108 7,4 ±2,5 (8) 156 13,5 ±2,7 (21)

Женщины, 5 196 6,6 ±2,8 (13) 220 16,8 ±2,5 (37)*

Примечание: * - статистически значимые различия при р = 0,001

Табл. 5. Частота индивидов, носителей коротких аллелей иРБ29 в гетеро- и гомозиготном состоянии среди пациентов с эпилепсией и здоровых людей

Выборка контроль эпилепсия

N Частота, % ± шр, (п) N Частота, % ± шр, (п)

Мужчины, с? 54 11,1 ±4,3 (6) 78 25,6 ±4,9 (20)

Женщины, $ 98 13,3 ±3,4 (13) 110 46,7 ± 4,8 (35) *

Примечание: * - статистически значимые различия при р = 0,002

Обнаружено повышение частоты (р=0,006) коротких аллелей ЦР829 (табл. 6) и частоты индивидов, носителей коротких аллелей (табл. 7) у женщин с поздним дебютом болезни Паркинсона (средний возраст начала заболевания составил 61,7 ± 9,7 лет). Наличие в генотипе у женщин хотя бы одного короткого аллеля ЦР829 повышает риск развития болезни Паркинсона у женщин после 60 лет (Ш1=2,78; 95% С1: 1,30 - 5,95; 011=3,56; 95% С1: 1,35 - 9,40; РЫ= 0,23; р=0,013). Для мужчин не выявлены достоверные различия по аллельным (р = 1,000) и генотипическим частотам (р = 1,000) по сравнению с контролем. Эти результаты согласуются с ранее полученными в нашей лаборатории данными (Сучкова и др., 2009), где было показано статистически значимое повышение частоты коротких аллелей 11Р829 только для женщин с болезнью Паркинсона с ранним дебютом между 30 - 50 годами (ОЯ = 6,90; 95 % С1: 1,96 - 24,27; р = 0,003) и поздним дебютом после 60 лет (ОЯ = 3,33; 95 % С1: 1,09 - 10,22; р = 0,035).

Табл. 6. Частота коротких аллелей минисателлита №829 среди пациентов с болезнью Паркинсона и здоровых людей

Выборка Контроль Болезнь Паркинсона

N Частота, % ± шр, (п) N Частота, % ± шр, (п)

Мужчины, с? 134 11,2 ±2,7 (15) 66 10,6 ±3,8 (7)

Женщины, $ 202 5,4 ±1,6 (11) 66 16,6 ±4,6 (11)*

Примечание: * - статистически значимые различия при р=0,006

Табл. 7. Частота индивидов, носителей коротких аллелей иРБ29 в гетеро- и гомозиготном состоянии среди пациентов с болезнью Паркинсона и здоровых людей

Выборка Контроль Болезнь Паркинсона

N Частота, % ± тр, (п) N Частота, % ± шр, (п)

Мужчины, с? 67 17,9 ±4,7 (12) 33 18,2 ±6,7 (6)

Женщины, $ 101 10,9 ±3,1 (11) 33 30,3 ± 8,0 (10) *

Примечание: * - статистически значимые различия при р=0,013

Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что короткие аллели минисателлитного повтора иР829 у женщин являются фактором риска развития как симптоматической эпилепсии, так и болезни Паркинсона с поздним дебютом заболевания. В настоящее время молекулярный механизм выявленной ассоциации не ясен. Предполагается, что иР829 может принимать участие в модуляции активности гена АСАРЗ, в котором он локализован через модуляцию транскрипции, альтернативного сплайсинга, либо оказывать транс-действие на соседние гены. Кроме того, т яШсо анализ нуклеотидной последовательности иР829 показал обогащенность данного минисателлита СрО-динуклеотидами. В каждой повторяющейся единице иР829 имеются сайты, гомологичные сайтам связывания таких факторов, как ШИ и УВ-1, которые вовлечены в эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, в том числе в геномный импринтинг (Шубина и др., 2009).

Исходя из этих данных был проведен анализ метилирования минисателлитной последовательности ЦР829, а также оценка уровня мРНК гена АСАРЗ у пациентов и здоровых людей, несущих различные аллели иРБ29.

Анализ метилирования ДНК минисателлитного повтора иРв29 при эпилепсии и болезни Паркинсона

По результатам метил-чувствительной ПЦР в выборке здоровых людей и у пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона были выявлены индивиды с гипометилированными и метилированными формами иР829. При сравнении частоты встречаемости индивидов с метилированными формами иР829 (без учета полиморфизма по длине аллелей иР829) было обнаружено статистически значимое понижение частоты индивидов с метилированным вариантом

13

ЦР829 по сравнению с контролем только у женщин с эпилепсией [р=0,048; 1111=1,65 (95% С1: 1,02 -2,66); 011=2,32 (95%С1: 1,05 — 5,14); РЫ=0,2] (табл. 8). Для мужчин с эпилепсией, а также для пациентов с болезнью Паркинсона (как мужчин, так и женщин) достоверных различий по частоте встречаемости индивидов с метилированными формами 11Р829 не установлено (табл. 9). Табл. 8. Частота индивидов с метилированными формами иРБ29 у пациентов с эпилепсией и здоровых людей

Выборка Контроль Эпилепсия

N Частота, % ± шр, (п) N Частота, % ± тр, (п)

Мужчины, с? 49 67,3 ± 6,7 (33) 45 55,6 ± 7,4 (25)

Женщины, $ 55 69,1± 6,2 (38) 51 49,0 ± 7,0 (25)*

Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р = 0,048).

Табл. 9. Частота индивидов с метилированными формами иРБ29 у пациентов болезнью Паркинсона

и здоровых людей

Выборка Контроль Болезнь Паркинсона

N Частота, %± тр, (п) N Частота, % ± тр, (п)

Мужчины, с? 34 47,8 ± 8,6 (23) 61 54,1 ±6,4 (33)

Женщины, $ 42 68,0± 7,2 (25) 50 58,0 ± 7,0 (29)

Таким образом, впервые обнаружено понижение частоты встречаемости индивидов с метилированным иР829 у женщин с симптоматической эпилепсией. Эти результаты указывают на возможное участие метилирования иР829 в патогенезе эпилепсии, в частности посредством модуляции экспрессии гена АСАРЗ.

Оценка уровня мРНК генов АСАРЗ, С5ТВ при эпилепсии и болезни Паркинсона

Методом ПЦР «в реальном времени» был проанализирован уровень мРНК генов АСАРЗ и СЗТВ в лейкоцитах периферической крови 19 человек (9 мужчин и 10 женщин) с болезнью Паркинсона, 22 человек (11 мужчин и 11 женщин) с эпилепсий. Контрольная группа была представлена 32 добровольцами (21 женщин и 11 мужчин).

Оценка уровня мРНК гена АСАРЗ при эпилепсии и болезни Паркинсона

Согласно полученным результатам, при эпилепсии было установлено повышение уровня экспрессии АСАРЗ почти в 2 раза как у женщин (р=0,01), так и у мужчин (р=0,01). При болезни Паркинсона выявлено статистически значимое повышение уровня мРНК АСАРЗ только для женщин (р=0,01) (рис. 2).

2,5

% 2,0

9 1,5 я

1,0

1

jg женщины □ мужчины

0,5

о.

mm

1,57

1,47

Ж

0,96

1,69

0,99

Рис. 2. Уровень мРНК гена АСАРЗ среди пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона, а также здоровых людей. Примечание. * - статистически значимые различия при р=0,05 ** - статистически значимые различия при р=0,01. БП - болезнь Паркинсона, о.е. - относительные единицы

Поскольку уровень экспрессии может зависеть от числа копий гена, то в данном исследовании было определено число копий гена АСАРЗ в геноме изучаемых групп пациентов и здоровых людей методом ПЦР «в реальном времени». Как в контроле, так и у пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона, ген АСАРЗ представлен в 2 копиях на диплоидный геном, т.е. повышение уровня мРНК гена АСАРЗ в исследуемых группах пациентов не связано с изменением числа копий этого гена.

Выявленные различия в экспрессии центаурина бета 5 между здоровыми людьми и пациентами с эпилепсией указывают на возможную роль белкового продукта гена АСАРЗ в патогенезе неврологических заболеваний. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о связи центауриновых белков с болезнью Альцгеймера и аутизмом (Rademakers et al., 2005; Hayashi et al., 2006). Необходимо подчеркнуть, что ген АСАРЗ локализован в одном хромосомном районе с генами, нарушение функционирования которых связано с развитием различных неврологических заболеваний и синдромов, в том числе с эпилепсией и болезнью Паркинсона. Поэтому, не исключено, что «кластер» этих генов вместе с АСАРЗ может находиться под влиянием одних и тех же регуляторных элементов, среди которых может быть и минисателлит UPS29. Кроме того, в пользу выявленного участия центаурина бета 5 в патогенезе эпилепсии и болезни Паркинсона говорит тот факт, что многие предполагаемые функции белка АСАРЗ совпадают с таковыми для белковых продуктов генов, экспрессия которых в клетках крови изменяется при эпилепсии и болезни Паркинсона (Greiner et al., 2013; Scherzer et al., 2007; Karlsson et al., 2013).

Оценка уровня мРНК гена СУГВ при эпилепсии и болезни Паркинсона

В результате анализа уровня мРНК гена С8ТН было установлено снижение уровня мРНК как при эпилепсии, так и при болезни Паркинсона. Для женщин с эпилепсией было выявлено понижение экспрессии почти в 3 раза (р=0,05), тогда как у мужчин с эпилепсией эта разница достигала 2 раз (р=0,05). При болезни Паркинсона у женщин уровень экспрессии цистатина В снижен практически в 2,4 раза (р=0,01), тогда как у мужчин с болезнью Паркинсона - в 3 раза (р=0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Уровень мРНК гена СБТВ среди пациентов с эпилепсией и болезни Паркинсона, а также здоровых людей. Примечание. * - статистически значимые различия при р=0,05. ** - статистически значимые различия при р=0,01 БП - болезнь Паркинсона, о.е. — относительные единицы.

Полученные результаты впервые указывают на изменение уровня мРНК С5ТВ при симптоматической эпилепсии. Ввиду того, что мутации в гене цистатина В являются основными причинами возникновения прогрессивной миоклонус-эпилепсии Унферрихта-Лундборга (ЬаПои с1 а1., 1997а), изучение экспрессии этого гена проводилось только у пациентов с данным заболеванием. Было показано, что при миоклонус-эпилепсии в зависимости от генотипа по минисателлиту СБТВ-УЫТК экспрессия гена цистатина В снижается от 5 - 10% до 60% в лимфобластах ^оепвии е1 а1., 2007). Полученные данные об участии белкового продукта гена СЗТВ в развитии симптоматической эпилепсии представляют интерес в связи с тем, что симптоматическая эпилепсия, как считалось ранее, не детерминирована генетически, в то время как миоклонические эпилепсии представляют класс наследуемых синдромов (Иллариошкин и др., 2002). Участие цистатина В в патогенезе миоклонус-эпилепсии и симптоматической эпилепсии, по-

видимому, указывает на общность молекулярно-генетических механизмов этих эпилепсий. Не исключено, что обнаруженное нами изменение экспрессии гена цистатина В при симптоматической эпилепсии может быть связано, как и в случае миоклонус-эпилепсии, с экспансией минисателлитного повтора CSTB-VNTR.

Следует отметить, что в литературе отсутствуют прямые доказательства участия цистатина В в патогенезе болезни Паркинсона, хотя имеется ряд косвенных данных о связи этого белка с процессом нейродегенерации (Polajnar, Zerovnik, 2011; Ii et al., 1993; Ceru et al., 2010; Skerget et al., 2009; Korja et al., 2007).

Полученные результаты об одновременном изменении уровня мРНК генов АСАРЗ и CSTB как при эпилепсии, так и при болезни Паркинсона говорят в пользу участия белковых продуктов обоих этих генов в патогенезе изучаемых патологий, и могут иметь значение для понимания молекулярных основ сочетанности данных заболеваний.

Выявленные нами тендерные различия в экспрессии АСАРЗ и CSTB при эпилепсии и болезни Паркинсона могут быть связаны с влиянием половых гормонов, в частности эстрогена (Kompoliti, 1999; Kompoliti, 2003; Dziedziejko et al., 2009; Reddy et al., 2013). Механизм, лежащий в основе такого полового диморфизма, не ясен. Однако известно, что многие биологические процессы, индуцируемые стероидными гормонами, происходят с участием клеточных рецепторов. Предполагаемое участие АСАРЗ в регуляции Arf ГТФ-азной активности G-белков, которые активируются при взаимодействии со специфическими рецепторами как различных i нейромедиаторов, так и гормонов (Gilman, 1987), указывает на возможную гормональную зависимость экспрессии гена АСАРЗ при эпилепсии и болезни Паркинсона.

Изучение влияния различных аллелей UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по временной трансфекции клеточных культур HeLa, F9 и астроцитов крысы

Регуляторные свойства минисателлита UPS29 в отношении экспрессии репортерного гена ( EGFP были изучены в экспериментах по трансфекции клеточных культур. Известно, что регуляторные свойства минисателлитов могут по-разному проявляться в зависимости от типа тканей. В случае минисателлита UPS29 предполагаемое модулирующее влияние могло оказаться специфичным по отношению к клеткам нейронального происхождения, т.к. наибольший уровень экспрессии гена АСАРЗ наблюдается в мозге. В связи с этим эксперименты по временной трансфекции были проведены на культуре эукариотических клеток, относящихся к разным типам тканей: HeLa — эпителиального происхождения, первичная культура астроцитов крысы — глиального происхождения и плюрипотентные клетки эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 (недифференцированные, частично и полностью дифференцированные по нейрональному типу).

На первом этапе были получены клетки эмбриональной тератокарциномы мыши линии Р9, частично и полностью дифференцированные по нейронапьному типу. Затем в условиях временной трансфекции получены трансфектные клетки линии НеЬа (рис.4), эмбриональной тератокарциномы мыши Р9 (недифференцированные, частично и полностью дифференцированные по нейронапьному типу) (рис. 5) и первичных астроцитов крысы (рис. 6).

Рис. 4. Клетки НеЬа, трансфицированные конструкциями рЯ26-ЕОРР (а), рЯ26-ЕОРР-иР829 (б). Масштабные отрезки - 10 мкм. Флуоресценция ЕОРР при длине волны 488 нм

Рис. 5. Клетки Р9, трансфицированные конструкцией рЯ26-ЕОРР-иР8900: недифференцированные (а), частично дифференцированные (б), дифференцированные по нейронапьному типу (в). Масштабные отрезки - 10 мкм. Флуоресценция ЕОРР при длине волны 488 нм

Масштабные отрезки - 10 мкм. Флуоресценция ЕОРР при длине волны 488 нм

Учет ЕОРР-положительных клеток был проведен для всех изучаемых культур через 24 и 48 ч после трансфекции (табл.8).

Табл. 8. Процент ЕОРР-положительных клеток в экспериментах по временной трансфекции клеток НеЬа, Р9, астроцитов крысы

Тип клеток ЕйРР-положительные клетки, %

через 24 ч через 48 ч

рЯ26-ЕОРР Л26-ЕвРР-иРв1500 рК26-НОРР-иРБЭОО рЯ26-ЕвРР-иР8400 рЯ26-ЕСРР рК26-ЕОРР-иР31500 рЯ26-ЕОРР-иРЭ900 р!*26-ЕОРР-ЦР8400

НеЬа 1Д 0,9 1,0 0,9 1,1 1,0 1,0 0,8

Р9 недифференцированные 1,3 1,3 1,2 1,0 1,2 1,4 1Д 1,2

Начало дифференцировки поНТ 3,0 3,5 8,0 6,2 2,3 4,5 8,9 8,2

Дифференцированные по НТ 1,2 38,1 26,6 18,3 2,4 43,3 25,5 22,4

Астроциты крысы 0 81,0 78,0 82,0 2,0 81,0 82,0 79,0

Примечание НТ- нейрональный тип

Представленные результаты качественной оценки флуоресценции белка БОБР в клетках Не! а, Р9, астроцитах крысы указывают на то, что экспрессия репортерного гена ПОР!' зависела от типа клеток, в которые была произведена трансфекция плазмидных конструкций, а также от наличия вставки минисателлита \JPS29. Таким образом, было установлено тканеспецифичиое влияние минисателлитной последовательности №829 на экспрессию репортерного гена ЕОРР, в частности энхансерный эффект минисателлита 11Р829 в клетках нейронального (Р9, дифференцирующихся по нейрональному типу) и глиального (первичных астроцитов крысы) происхождения.

В отношении минисателлита иР829 известно, что он содержит сайты, гомологичные сайтам связывания с транскрипционными факторами, обнаруженными в центральной и периферической нервной системе, такими как СКЕВ, ВТЕВ, п-Мус, Мах-1 (Шубина и др., 2009). Не исключено, что благодаря таким сайтам связывания в трансфектных клетках нейронального (Р9, дифференцированные по НТ) и глиального происхождения (астроциты крысы), несущих конструкции со вставкой 11Р829, происходит взаимодействие транскрипционных факторов, специфично экспрессирующихся в этом типе ткани, с последовательностью иРЭ29. В таком случае это взаимодействие обуславливает экспрессию репортерного гена £'GF^, в клетках нейронального происхождения. Важно отметить, что в минисателлитной последовательности иРв29 есть сайты узнавания для таких факторов как и8Р1, иЭР2 и АР-2. Именно АР-2 оказывает влияние на дифференцировку и развитие нервной системы (Бе Ооиапп е1 а!., 1993). Если принять во внимание, что он экспрессируется под действием ретиноевой кислоты, использовавшейся и в наших опытах, можно понять причину увеличения количества ЕОРР-положительных клеток Р9 после их дифференцировки по нейрональному пути.

Изучение влияния мииисателлитного повтора 1!Р829 на экспрессию репортерного гена ЕСРР в модельных экспериментах по стабильной трансфекции клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии Б"9

Несмотря на широкое использование временной трансфекции для различных типов клеточных культур и конструкций, быстроту получения результатов, следует отметить, что при таком подходе не происходит встраивания плазмидной конструкции в геном клеток, и экспрессия репортерного гена происходит вне геномного окружения. В связи с этим были проведены эксперименты по стабильной трансфекции описанными выше плазмидными конструкциями недифференцированных клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии Р9.

В модельных экспериментах по стабильной трансфекции было обнаружено статистически значимое снижение уровня интенсивности флуоресценции белка ЕСРР в клетках, содержащих вставку иР829 (рЯ26-Е01'Р-иР8) (р = 0,01) по сравнению с клетками, несущими конструкцию рЯ26-Е01'Р. При этом клетки со вставкой «иР8900» и клетки с «иР81500» практически не различались по изучаемому показателю, а для клеток со вставкой короткого аллеля «1Л'8400» наблюдалось значительное снижение интенсивности флуоресценции (рис. 7).

Рис. 7. Интенсивность флуоресценции репортерного белка EGFP в экспериментах по стабильной трансфекции клеток F9 конструкциями, содержащими различные аллели минисателлита UPS29. Примечание, o.e. - относительные единицы * - статистически значимые различия при р=0,03.

Супрессорный эффект UPS29 при стабильной трансфекции мог быть связан с интеграцией в транскрипционно неактивную область (район гетерохроматина, около границы ядра) и/или с изменением статуса метилирования конструкции. Для объяснения наблюдаемого явления требуется проведение дополнительных исследований.

Таким образом, модельные эксперименты по трансфекции клеточных культур плазмидными конструкциями, содержащими иРБ29, подтверждают наше предположение о модулирующих экспрессию свойствах этого минисателлита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование посвящено изучению роли минисателлитного повтора ИРй29 в модуляции экспрессии гена АСАРЗ при эпилепсии и болезни Паркинсона. В результате проведенного молекулярно-генетического анализа минисателлита 1ЛР829 было обнаружено повышение частоты коротких аллелей ЦР829 у женщин с эпилепсией и женщин с поздним дебютом болезни Паркинсона, а также пониженная частота встречаемости индивидов с метилированными формами иРБ29 среди женщин с эпилепсией. Эти данные позволили предположить, что выявленные особенности минисателлита ЦР829 при эпилепсии и болезни Паркинсона могут отражаться на патогенезе этих заболеваний посредством изменения характера экспрессии гена АСАРЗ, в котором локализован 11Р829. Было обнаружено, что уровень мРНК гена АСАРЗ изменяется при эпилепсии и болезни Паркинсона. В частности, было показано достоверное повышение уровня мРНК АСАРЗ для мужчин и женщин с эпилепсией и для женщин с болезнью Паркинсона. Регуляторные свойства минисателлита иР829 были подтверждены результатами экспериментов по временной и стабильной трансфекции клеточных культур плазмидными конструкциями, содержащими различные аллели ЦР829.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что короткие аллели минисателлита иР829 являются фактором риска развития симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона. Представляется вероятным, что в условиях патологических процессов повышение уровня мРНК гена АСАРЗ происходит с участием коротких аллелей №529.

Полученные данные вносят новые представления о молекулярно-генетических факторах патогенеза эпилепсии и болезни Паркинсона, а также расширяют знания о сочетанности этих патологий. В частности, в результате данного исследования впервые доказано участие в патогенезе болезни Паркинсона и симптоматической эпилепсии белковых продуктов генов АСАРЗ и С5Т5.

Необходимо отметить, что результаты молекулярно-генетического тестирования на наличие коротких аллелей минисателлита 11Р829 могут быть использованы в качестве прогностического критерия риска развития эпилепсии и болезни Паркинсона. На сегодняшний день выявление групп риска развития болезни Паркинсона крайне актуально и связано с возможностью проведения ранней терапии, позволяющей отсрочить наступление инвалидизации. Помимо этого, полученные данные об изменении уровня экспрессии гена АСАРЗ в клетках периферической крови у пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона, могут быть полезными при создании тест-систем на основе комплексных биомаркеров для диагностики этих заболеваний, поиске и проверке новых

фармакологических препаратов, подборе индивидуализированного курса терапии, в том числе с учетом генотипа по минисателлиту UPS29. Несмотря на то, что основные нарушения различных процессов при развитии эпилепсии и болезни Паркинсона протекают в головном мозге, для многих генов, активно экспрессирующихся в головном мозге, доказано изменение уровня их мРНК в лейкоцитах периферической крови. В связи с этим большие надежды в диагностике неврологических заболеваний связывают с использованием лейкоцитов периферической крови для оценки биомаркеров заболеваний центральной нервной системы. Не исключено, что изменения структуры и статуса метилирования минисателлита UPS29, а также уровня мРНК АСАРЗ могут быть использованы в качестве таких биомаркеров.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с симптоматической эпилепсией и женщин с поздним дебютом болезни Паркинсона обнаружено повышение частоты коротких аллелей UPS29.

2. У женщин с эпилепсией установлено снижение частоты метилированных форм UPS29. Различия по статусу метилирования UPS29 между пациентами с болезнью Паркинсона и здоровыми людьми не обнаружены.

3. При симптоматической эпилепсии установлено повышение уровня мРНК гена АСАРЗ в лейкоцитах периферической крови как у мужчин, так и у женщин, а при болезни Паркинсона только у женщин.

4. При симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона выявлено снижение уровня мРНК гена CSTB в лейкоцитах периферической крови как у мужчин, так и у женщин.

5. В модельном эксперименте по временной трансфекции обнаружено, что минисателлит UPS29 обладает энхансерными свойствами в отношении экспрессии репортерного гена EGFP вне зависимости от длины аллеля только в клетках нейронального и глиального происхождения.

6. При стабильной трансфекции установлено, что UPS29 оказывает супрессорное влияние на экспрессию репортерного гена EGFP. Наибольшим супрессорным эффектом обладает короткий аллель данного минисателлита.

Список работ, опубликованных по теме диссертационного исследования

Статьи:

1. Сасина, J1. К. Внутриинтронный минисателлит человека UPS29, ассоциированный с неврологическими заболеваниями, регулирует экспрессию репортерного гена EGFP в зависимости от типа клеток / Л. К. Сасина, Н. А. Сломинская, И. О. Сучкова, Е. В. Пицнк и др. // Цитология. -2010.-№52 (9).-С. 715-723.

2. Sasina, L. К. Modulation of reporter EGFP gene expression by a disease-associated human intra-intronic minisatellite upon transient and stable transfection / L. K. Sasina, E. M. Fedorova., N. A.

Grudinina, E. V. Belotserkovskaya et al. // International Journal of Biological Engineering. - 2013. - Vol. 3(1).-P. 1-10.

Тезисы конференций:

3. Минисателлит UPS29 гена CENTB5 человека как возможный генетический маркер некоторых форм эпилепсии / Е.В. Пицик, И.О. Сучкова, Е.В. Борисова [и др.] // Медицинская генетика. -Материалы IV Съезда Российского общества медицинских генетиков (15 — 18 мая 2010 года, г. Ростов-на-Дону).- 2010.-С. 140- 141.

4. Эпигенетическая регуляторная функция некодирующих белки тандемных повторов ДНК / И.О. Сучкова, Л.К. Сасина, Е.В. Пицик [и др.] // Цитология. - 2010. - №52. (8). - 685 с.

5. Интронный минисателлит UPS29 гена CENTB5 человека ассоциирован с симптоматической и криптогенной эпилепсией у женщин / И.О. Сучкова, Е.В. Пицик, Е.В. Борисова [и др.] // Сборник трудов: VII Всероссийская научно-практическая Конференция с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010" (24 - 26 ноября 2010 года, г. Москва). - 2010. - Т. 3. - С. 140 -142.

6. Использование ПЦР в режиме реального времени для оценки экспрессии генов CENTB5 и АСОТ7 при моделировании геморрагического инсульта у крыс / Е.В. Пицик, И.О. Сучкова И Медицинский академический журнал. Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (21-22 декабря 2010 года, г. Санкт-Петербург). - 2010. - Т. 10, № 5. - 61 с.

7. CENTB5 как возможный ген, ассоциированный с криптогенной и симптоматической эпилепсией / Е.В. Пицик // Материалы Международного молодежного научного форума "Ломоносов - 2011" (11 — 15 апреля 2011 года, г. Москва). - 2011. - 95 с.

8. Association of minisatellite UPS29 with symptomatic and cryptogenic epilepsy in women / E.V. Pitcik, I.O. Suchkova, I.V. Milyukhina, et al. // European Journal of Medical Research. Abstract Book. 22nd European Students' Conference (21 - 24th September, 2011, Berlin). - 2011. - 33 p.

9. Экспрессия гена АСАРЗ в лейкоцитах периферической крови у пациентов с эпилепсией / Е.В. Белоцерковская, Н.К. Боровкова, A.A. Молчанова // Материалы VIII Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (3—6 декабря 2013 года, г. Харьков). -2013.-57 с.

10. Анализ метилирования ДНК минисателлитного повтора UPS29 у пациентов с эпилепсией / Е.В. Белоцерковская, И.О. Сучкова, Е.В. Борисова [и др.] // Сборник трудов VIII всероссийской научно-практической конференции с международным участием: «Молекулярная диагностика-2014» (18 - 20 марта 2014 года, г. Москва). - 2014. - Т. II. - С. 176- 177.

11. Analysis of the association of minisatellite UPS29 of ACAP3 gene with Parkinson's Disease / N. Borovkova, I. Suchkova, E. Borisova, E. Belotcerkovskaya, et al. // Abstract Book. XX World Congress on Parkinson's disease and related disorders (8 — 11th December, 2013, Geneva). - 2013. - 63 p.

12. Экспрессия гена CSTB в лейкоцитах периферической крови у пациентов с симптоматической эпилепсией и болезнью Паркинсона / Е.В. Белоцерковская, И.О. Сучкова, Е.В. Борисова [и др.] // Тезисы докладов VI съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (15 - 20 июня 2014 года, г. Ростов-на-Дону). - 2014. - С. 123.

Подписано в печать 30.07.2014 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 120 экз. Заказ 343

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А