Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль марк- и PI3K-зависимых сигнальных каскадов в регуляции пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль марк- и PI3K-зависимых сигнальных каскадов в регуляции пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши"

На правах рукописи

□03058387

ЛЯ11ГУЗОВЛ М^^^ Мария Сергеевна

РОЛЬ МАРК- И Р13К-ЗАВИСИМЫХ СИГНАЛЬНЫХ

КАСКАДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ

03 00 25

гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой С1енени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003058387

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель доктор биологических наук

профессор Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Корнилова Елена Сергеевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук Паткин Евгений Львович

ГУ ПИИ экспериментальной медицины РАМП

Ведущая организация Санкт-Петербургскии государственный университет, биолого-почвенный факультет

Защита состоится "25" мая 2007 года в 13 час на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , д. 4 www cytspb rssi ru email cellbio@mail cytspb rssi ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан " и " апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертционнош совет, кандидат биологических наук ' / Каминская Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одно из уникальных свойств эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши - способность к автономной пролиферации В отличие от соматических клеток организма млекопитающего, например, фибробластов, ЭСК могут пролиферировать в отсугсгвие внешних mhioi енных cm налов (Schratt et al, 2001) Эхо свойс1во делает их схожими со злокачественно трансформированными клетками Однако дерегуляция пролиферации опухолевых клеток вызвана мутациями в протоонкогенах и опухолевых супрессорах, в то время как ЭСК являются нормальными клетками, не несущими мутаций, в которых контроль за целостностью тенома осуществляется очень ciporo, так как они происходят из клеюк внутренней клеточной массы бластоцисты, дающей начало всем клеткам зародыша и впоследствии взрослому организму Очевидно, неспособность ЭСК останавливаться в клеточном цикле обусловлена функционированием в них особой программы пролиферации

Скорее всего, автономное гь деления ЭСК от внешних сигналов тесно связана с тем, что л и клетки пролнферируюг очень быстро, так же как и их аналог in vivo - клетки внутренней клеточной массы бластоцисты. При развитии зародыша мыши в период с 4 5 по 7 0 dpc (days post coitum) размер внутренней клеточной массы бластоцисты увеличивается о г 20-25 клеток до примерно 4000 клеюк Таким образом, в бластоцисте на доиплантационной стадии происходит вспышка пролиферативной активности, молекулярные основы которой во многом еще не ясны. Детальное изучение регуляции пролиферации ЭСК способствует пониманию событий раннего эмбрионального развития млеконн г ающих

Предыдущие исследования молекул-регуляторов пролиферации в ЭСК мыши показали, что в этих клетках белок Rb гиперфосфорилирован, а транскрипционный фактор E2F1 и комплексы cdk2/mi^hh Е, cdk2/mikhhh А активны постоянно, независимо от стадии клеточного цикла (Stead et al, 2002, Savatier et al, 1994) В клетках других типов, например, в фибробласшч, эти регуляторы клеточного цикла акгпвирукнея только перед началом фазы синтеза ДНК в результате митогенной стимуляции клеток ростовыми факторами на ранней стадии фазы Gl В ЭСК

мыши фаза Gl очень коротка, и период чувствительноеш к митогенным сигналам из вне в ней, по-видимому, редуцирован. Вероятно, пролиферацию ЭСК мыши стимулирует независимая от внешних сигналов митогенная активность, которая постоянно поддерживает циклин-зависимые киназы и транскрипционный фактор E2F1 в активном состоянии Какие сигнальные молекулы и каскады обеспечивают эту активность пока еще неизвестно На клегках других iiuiob показано, что митогенный сигнал от ростовых факторов к регуляторам клеточного цикла передают MAP-Erk киназный каскад и Р13К-зависимый каскад (Jones, Kazlauskas, 2001) В связи с этим данные сигнальные пути представляются вероятными кандидатами на роль источников внутренней мшогешюн активности в ЭСК мыши

ТТели и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение вклада активностей МАРК и Р13К-зависимых каскадов в регуляцию перехода G1/S в митотическом цикле эмбриональных стволовых клеток мыши

В соответствии с этим были сформулированы следующие

задачи

1) выяснить, зависит ли активность Erk- и Р13К-зависимых каскадов в эмбриональных стволовых клеток мыши от сыворотки,

2) с помощью фармакологических ингибиторов выяснить в какой степени активность МАРК и Р13К-зависимых каскадов является необходимой для пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши;

3) исследовать, как удаление ростовых факторов и ингибирование Р13-киназы влияет на активность регуляторов клеточного цикла в эмбриональных стволовых клетках мыши,

4) изучить выживаемость и рост популяции эмбриональных стволовых клеток мыши при сывороточном голодании и ингибировании активности Р13К-зависимого сигнального пути

Основные положения, выносимые на защиту

Эмбриональные стволовые клетки мыши способны пролиферировать при пониженной активности мигоген-активируемых сигнальных каскадов, которая достигается сывороточным голоданием или обработкой клеток

фармакологическими ингибиторами киназ В отсутствие росювых факюров позитивные регуляторы пролиферации - киназа сс1к2 и транскрипционный фактор Е2Ё1 - в эмбриональных стволовых клетках мыши остаются активны

Фармакологический ингибитор Р13К ЬУ294002 вызывает накопление эмбриональных стволовых клеток мыши в фазе 01 кле1 очного цикла, которое сопровождается р27кф-независнмым снижением уровня акшвиости киназы сс!к2 и транскрипционного фактора Е2Й1 Присутствие ростовых факторов ослабляет эффект ЁУ294002 на распределение ЭСК мыши по фазам клеточного цикла

Научная новизна работы

Впервые было показано, что фармакологические ингибиторы МАРК каскадов (Егк, ЖК, р38) не препятствуют пролиферации ЭСК мыши

Впервые было показано, что сывороточное голодание не вызывает снижения активности циклин/киназных комплексов в ЭСК мыши

Впервые было показано, что в ЭСК мыши обработка ингибитором РТЗК ЕУ294002 приводит к существнному снижению активности комплексов циклин Е/сс1к2 и транскрипционного фактора Е2Р1 по р27кф-независимому механизму.

Впервые для ЭСК мыши описана зависимость ан1ипролнфера1Ивного эффекта ингибиторов киназ Р13К (ЬУ294002) и сс1к2 (росковитина) от присутствия сыворотки в среде культивирования

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные в иасюящем исследовании данные вносят вклад в понимание механизмов пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши Выяснено, что регуляция перехода в Е/Э в ЭСК мыши осуществляется как автономными сигналами, независимыми от сыворотки, так и ростовыми факторами сыворотки Полученная в данной работе сублиния ЭСК мыши, несущая ген люциферазы иод Е2Р1-чувтвтельным промоюром может быть использована в дальнейших исследованиях пролиферации ЭСК мыши

Материалы диссертации могут быть использованы в

1<ачес1ве иллюстративных материалов в учебных лекционных курсах но клеточной биологии

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 3 статьи и сделано 4 сообщения на международных конференциях Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах И петиту га цитологии РАН.

Финансовая поллержка работы

Работа выполнена при содействии Российского Фонда Фундаментальных исследований (проекты 03-04-49377 и 06-0449058), iipoipaMMbi Президиума PAII "Молекулярная и клеточная биожиия", гран i a NATO 979190

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописно1 о ieKcia и иллюстрированы 34 рисунками

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клеточные линии, их культивирование и обработка В работе использовались ЭСК мыши линий 10UD2 и Е 14 1 Линия IOUD2 была любезно предоставлена П Саватьером (Лион, Франция), линия Е 14 1 - А Нордхаймом (Тюбинген, Германия). Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco BRL, США) с добавлением 10 % FCS (РАА, Австрия) и фактора LIF (Sigma, США) в концентрации 25 ед/мл на пластиковых чашках Heipn (Coming, США), покрытых 0 2 %-ным раствором желатина Сывороточное голодание проводили, культивируя клетки в среде, содержащей 0 1 % FCS без фактора L1F Использовали ингибиторы киназ PD98059 (50 мкМ), SB203580 (20 мкМ), SP600125 (ЮмкМ), росковитин (ЮмкМ), LY294002 (40 мкМ) (Calbiochem, Германия)

Для индукции дифференцировки клетки рассевали в среде, не содержащей LIF, на следующий день добавляли 1 мкМ ретиноевой кислоты (All-trans retinoic acid, Sigma, США), и культивировали 2 сут После этого клетки культивировали еще 1

сут в чисюи (без реишоевой кислоты) среде Подсчет клеток. Клетки высевали в количес1ве 50 тыс трехсантиметровые чашки, каждую точку - в трех повториостях На следующий день условия культивирвоания меняли в соответствии с экпериментом Через сутки проводили подсчет клеток в камере Горяева

Оценка жизнеспособности популяций (МТТ-тест). Оценку жизнесиособносш популяции производили колориме1рическим методом с использованием метилтиазолилдифенилтетразолиума бромида (МТТ) (Sigma, США) Метод основан на том, что митохондриальные оксидоредуктазы (преимущественно дегидрогеназы) способны восстанавливать желтый МТТ до пурпурного формазана, количество коюрого за1ем измеряют сиек1рофотометрически. Поскольку эта реакция происходит холько в живых клетках с активными митохондриальпыми ферментами, количество формазана коррелирует с числом живых клеток в популяции В наших опытах клетки рассевали на 96-луночную плату, на следующий день меняли среду и добавляли LY294002 на 1 суг После этого среду удаляли, к клеткам добавляли 0 5 мг/мл МТТ, растворенною в PBS, и инкубировали в хечение 1 ч при 37°С в атмосфере 7 5 % С02. Образовавшийся осадок формазана растворяли, добавляя в лунку равный объем 0 04 M HCl в изопропаноле и тщательно пипетируя Затем измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 570 им относительно чистого раствора МТТ с добавленным в xieio 0 04 M11С1 в изопропаноле Проточная цитофлуорнметрия ДНК Растущую в монослое культуру клеток снимали с чашек раствором Версена, центрифугировали 5 мин при 1000 g, ресуспендировали в буфере, содержащем 0 25М сахарозы и 40 тМ цитрата натрия После этого к пробам добавляли лизирующий буфер (0 5 % NP-40, 0 5 тМ ЭДТА, PBS), содержащий 200 мкг/мл РНКазы и 20 мкг/мл иодистого пропидия, и инкубировали 10 минут. Пробы подвергали анализу на содержание ДНК на проточном питометре (Beckman Coulter, США)

Электрофорез и иммуноблоттинг. Клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), захем лизировали в буфере PBS, содержащем 1 % NP-40, 0 5 % дезоксихолата натрия, 0 1 % SDS, ингибиторы протеаз и фосфатаз с последующим центрифугированием Количество белка в пробах измеряли по

меюду Брэдфорд, па форез наносили равное количество белка в каждой пробе После диск-элекгрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях проводили полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану (Amersham, Великобритания) Для окрашивания антителами мембрану инкубировали сначала в буфере PBS, содержащем 0 05 % Tvveen-20, 5 % обезжиренного молока, а затем в PBS, содержащем 0 05 % Tween-20, 1 % BSA, и соотвехствующие первые антитела В качестве первых антител использовали антитела к фосфорилированному по Ser-473 белку PKB/Akt (кат № 9271), к расщепленной форме каспазы 3 (кат № 9661) (Cell Signaling, США), к фосфорилированной (sc-7383) и тотальной (sc-94) форме киназы Erk, циклину Dl (sc-717), циклинуA(sc-751) ициклнну Е(sc-418), к cdk2 (sc-163), к шпибиюру циклнн-киназных комплексов р27кф (sc-1641) (Santa Cruz Biotechnologies, США), белку GAPDII (5G4, HyTest, Финляндия) В качестве вторых антител использовали антитела козла против иммуноглобулинов кролика или антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена Белки выявляли меюдом усиленной хемилюминисценции (ECL, Amersham, Великобритания) Люциферазная активность Для изучения динамики транскрипционной активности факторов E2F1 клетки линии IUOD2 были котрансфецированы плазмпдамп E2Fl-luc, несущей ген люциферазы под E2F1-чувствительным промотором, и pBabe-puro, кодирующей ген устойчивости к пуромицину Трансфекцию проводили с помощью реагента Липофектамин-2000 в соответствии с рекомендациями производителя (Gibco, BRL) Полученные в результате селекции в присутствии пуромицина клоны были собраны в популяцию и использовались для анализа Трансактивацию E2Fl-luc оценивали по степени расщепления субстрата люциферина с помощью люминометра TD-20/20 Turner Design Результаты нормированы по количеству белка In vitro анализ активности киназ проводили, используя в качестве субстрата для фосфорилирования гистон H1 Клеточные лизаты получали, инкубируя клетки 45 мин на льду в лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCl pH 7.4, 150 мМ NaCl, 0.5 % NP-40, 1 % Тритона Х-100, ингибиторы протеаз и фосфатаз) с последующим центрифугированием Для иммунопреципитации инкубировали 500 - 1000 мкг белка с 5 мкл антител к циклину Е (sc-418) или cdk2

(sc-163) (Santa Cruz) в течение 2-4 ч при 4°С, затем полученные комплексы осаждали, инкубируя с прогепн А-сефарозой 30-60 мин при 4°С с последующим цсшрифугированием Осадок использовали в киназной реакции, проводимой в буфере содержащем 20 мМ HEPES pH 7 9, 20 мМ MgCl2, 2 мМ МпС12, 1 мМ дитиотреитола, 25 мкМ немеченого АТФ, 74 кБк [г-12Г']АТФ и 1 мкг гистона 111 Реакцию проводили 20 мин при 30°С и останавливали добавлением буфера Лэмли для нанесения проб. Пробы кипя 1 или 5 мин, после электрофореза i ель сушили и экспонировали перед рентгеновской пленкой Оценка ассоциированной со старением активности бета-галактозидазы Клетки промывали буфером PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содедржащем 0 5% глухаральдегнда и 2 % формальдегида в течение 5 мин, затем промывали PBS, pH = 7 2, содержащем 1 0 мМ MgCl,, и инкубировали в окрашивающем расiворе на 37°С в течение ночи Окрашивающий раствор включает в себя 1 мг/мл X-gal, 0 12 мМ К Fe(CN) 0 12 мМ K4Fe(CN)6,1.0 мМ MgCL, растворенных в PB S pH-6 0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Анализ распределения ЭСК мыши по фазам клеточного никла в условиях инактивации сигнальных каскадов, зависимых от МАР-кнназ и Р13-киназы.

ЭСК мыши пролиферируют с высокой скоростью (время удвоения популяции составляет 10-12 часов), очень быстро проходят фазу Gl и, в отличие от фибробластов. не выходят из клеточного цикла в фазу покоя G0 при удалении ростовых факторов из среды культивирования (Schratt et al , 2001) Молекулярные механизмы, обусловливающие автономность пролиферации ЭСК мыши or росговых факюров, пока еще мало изучены Вероятно, этих клетках сигнальные каскады, необходимые для перехода Gl/ S, не нуждаются в стимуляции экзогенными факторами, в результате чего ЭСК постоянно коммитированы к пролиферации

Из исследований на фибробластах известно, что для инициации продвижения по фазе Gl и перехода в фазу синтеза ДНК клетке необходима последовательная активация ростовыми факторами сигнальных каскадов, опосредованных киназами Erk и PI3K (Jones et al, 1999, Jones, Kazlauskas, 2001) В связи с этим

Рис. 1. Влияние сыворотки иа уровень фосфорилирования кип аз Егк и РКВ/Ак1 в ЭСК мыши. 5 0 % РС8 - нормальные условия культивирования, О, I % РСБ -сывороточное голодание в течение суток, 0.1 % +РС5 - стимуляция 15 % сыворотки в Течение 15 мин после сыворотчного голодания.

10% 0.1% 0.1% +res

GAPDH■

интересно было выяснить, чувствительны ли данные каскады к содержанию сыворотки в среде культивирования в ЭСК мыши.

Проведенный Вестерн-блот анализ содержания фосфорилированных (то есть, активных) форм киназ Егк и РКВ/ Akt (которые являются ключевыми звеньями Егк- и PI3K-зависимых каскадов соответственно) показал, что при низком содержании сыворотки (0.1 %) количество фосфорилированных киназ Егк и PKB/Akt снижается, а последующая сывороточная стимуляция значительно активирует как lirk-, так и Р13 «.-зависимые каскады в ЭСК мыши. Следует отметить, что при сывороточном голодании фосфорилированные формы киназ не исчезают полностью (рис. I).

Для того чтобы выяснить участие Р13К-зависимого и МАР-киназных каскадов в регуляции пролиферации ЭСК, клетки культивировали в течение суток с ингибиторами ключевых киназ этих каскадов, а затем методом проточной цито ф л уори м етр и и проводили анализ клеточного цикла. Были использованы ингибиторы киназ РБК (LY294002), MEKl/Erk (PD98059), р38 (SB203580) и JNK (SP600125). На рисунке 2 видно, что, в то время как ингибиторы МАР-кииаз и сывороточное голодание не влияли на распределение ЭСК по фазам клеточного цикла, ингибитор Р13-

Рис. 2. Распределение ЭСК по фазам клеточного цикла после 24 ч инкубации с ингибиторами MAP киназ MEKl/Erk (PD98059), рЗН (SB 203580), JNK (SP600125), PI3K (LY294002) и

сывороT очного голодания.

G! S G2 qi/s соотношение

Контроль 21% 69% 10% 0.3

PD98059 21% 65 % 14% 0.3

SB203580 20% 6К% 12% 0.J

SP600125 19% 62% 19 % 0.3

LV294002 22% 5J % 14% U.6

Голодание 19% 67% 14% 0.3

киназы LY294002 вызвал заметное снижение содержания клеток в фазе S и накопление в фазе G1, увеличивая соотношение фаз G1/ S с 0 3 до 0 6

В митотическом цикле ЭСК мыши фаза 01 значительно короче, чем у фибробластов Вероятно, у них редуцирована первая часть фазы G1 и, соответственно, отсутствует зависимость пролиферации ог росювых факюров сыворотки и активности MEK/Erk каскада 11еобходимос1ь же ак1Ивнос1н PI3K-зависимого каскада для G1/S перехода в ЭСК, возможно, сохраняется Это предположение подкрепляется данными о существовании ЭСК-специфичного конститутивно-активного белка Eras, который из всех возможных мишеней активирует преимущественно именно PI3K и положительно регулирует скорость пролиферации, а также данными о юм, чю ЭСК, в которых активность Р13К-зависимого каскада усилена в результате делеции гена фосфатазы PTEN растут гораздо быстрее, чем ЭСК дикого типа (Takahashi et al, 2003, Sun et al, 1999)

2. Анализ распределения ЭСК мыши по фазам клеточного цикла при сочетании сывороточного голодания и инактивации Р13К-зависимого сигнального каскада.

Было обнаружено, что при обработке ЭСК мыши ингибитором PI3-киназы LY294002 в условиях сывороточного голодания антипролиферативный эффект ингиби гора значительно усиливается более половины популяции накапливается в фазе G1, содержание клеток в фазе S снижается до 27 % (рис. ЗА)

Киназа PKB/Akt - ключевой участник Р13К-зависимого каскада, по уровню фосфорилирования PKB/Akt можно судить об активности данного сигнального пути На рисунке ЗБ видно, что как в нормальных условиях, гак и при сывороточном голодании обработка ЭСК LY294002 приводит к значительной инактивации в них сигнального пути PI3K-PKB/Akt То есть, наблюдаемое на рис ЗА различие антипролиферативного эффекта LY294002 в нормальных и бессывороточных условиях обусловлено не разницей в степени инактивации Р13-киназы, а скорее наличием или отсутствием дополнительных митогенных сигналов от компонентов сыворотки

Рис. 3. Влияние присутствия сыворотки в среде культивирования на действие LY294Ö02. А - Распределение по фазам клеточного цикла ЭСК, обработанных LY294002 в нормальных условиях И При с ы в о р о т о ч н о м голодайии,

Б - уровень ф о с ф ор л и р и р о в а и и я кииазы PK B/Akt в клетках, обработанных LY294002 в нормальных условиях и при

С Ы В О р о т очно м голодании.

3.Влияние сывороточного голодания и обработки LY294Ö02 на содержание и активность белков, регулирующих G1/S переход в ЭСК мыши.

Для перехода из фазы Gl в фазу S клеткам необходима активность транскрипционного фактора E2FI. В начале фазы ОI факторы E2F1 находятся и комплексах с белками семейства Rh, оставаясь неактивными. Во время фазы Gl происходит множественное (гипер-) фосфорилирование белков Rb комплексами циклим D/cdk4„6, циклин E/cdk2. В результате факторы E2FI высвобождаются, и становятся способны активировать траискрнпдию генов, необходимых для синтеза ДНК. При сывороточном голодании в фибробластах циклии-киназные комплексы и фактор E2F1 остаются неактивными, вследствие этою клетки выходят из циклирОвания в фазу покоя G0.

В ЭСК мыши сывороточное голодание не снижает активности cdk2- и циклин Е-содержащих комплексов, в то время как LY294002 приводит к существенному снижению их кнназной активности (рис, 4А). Очевидно, что снижение активности происходит из-за уменьшения общего числа комплексов cdk2/

контрил (

.,1 M * 1

Gl: 1

LY294U02

g2-m: 16%

s: f>k %

(it: 27 % G2-M: 14% S: 59 %

Gl; 19% G2-M; 14% S; 67 %

Gl: 58% G2-M: 15% S; 27 %

10 % FCS

0,1 % FCS

10% FCS 0.!% FCS

.. LY - I.YK0HTP

pPKB/Akl GAPDH

циклим Е в LY294002-обработанных клетках, i la рисунке 4i> видно, что количество белков-компонентов этих комплексов - циклинов Е, А, и cdk2 после обработки LY294002 уменьшается. Кроме того, в результате обработки LY294002 снижается содержание циклина DI, но количество киназы cdk4 не изменяется (рис. 4Б). Известно, что и фибробластах антипролиферативный эффект ингибиторов Р13-киназы опосредован белком p27kip - ингибитором циклин-киназных комплексов, количество которого возрастает при инактивации PI3K (Collado et at., 2000). В ЭСК, обработанных LY294002, падение активности циклин-киназных комплексов и остановка в фазе GI не сопровождаются накоплением р27к,р, и происходят, по-видимому, пор27кФ-независимому механизму (рис. 4Б).

Известно, что в ЭСК белок Rb находится постоянно в гннерфоефорилированной форме, и фактор E2F1 активен

FCS 10 % 0.1 %

LY — LY HHI т \P:cyli

Б FCS 10% 0.1%

шм mm lém. — IP: cdk2

FCS 10% 0.1%

lY Ly контр

шч? cyDI

WK "Ж суЕ -нм---GAPD11

p27

GAPDH

Рис, 4. Влияние LY294002 и сывороточного голоданий на экспрессию и активность молекул, регулирующих переход Gl/S. А - in vitro анализ активности ккназ,ассоциированных с-циклином Е и cdk2, Б -иммуноблотинг белков cdk4, cdk2, un клин А. циклин D1, ни клин Е, р27, в качестве контроля нагрузки - GAPDH.

-е-=

§

1 '—м

1

Ш: в|Вя

10%

0.1% 10%

0.1 % FCS

контроль

LY294002

Рис. 5 Активность т ране к р и п ц и о н и о г о фактора Е2Т1 в клетках, обработанных 1^294002 в нормальных условиях и при пониженном

содержании сыворотки.

постоянно, независимо от фазы клеточног о цикла (Savatier et al., 1994; Stead et a]., 2002). Это, по-видимому, является основой автономности пролиферации ЗСК от внешних сигналов. Для анализа E2F [ -зависямои транскрипции в клетках, культивированных в условиях сывороточного голодания или в присутствии LY294002. нами была роздана сублиния ЭСК, трансфецированная репортеры ой плаз милой, кодирующей ген люциферазы под Е21-' 1 -регулируемым промотором. На рисунке 5 видно, что в результате обработки клеток LY294002 транскрипционная активность фактора E2FI существенно снижается, особенно в условиях сывороточного голодания. Это согласуется с данными проточной цатометрии, свидетельсвующими о максимальном подавлении пролиферации в случае сочетания обработки клеток LY294002 с сывороточным голоданием (рис. ЗА) Сывороточное голодание само по себе также приводит к некоторому снижению активности E2F1, которое, вероятно, недостаточно для предотвращения перехода G1/S перехода, так как в бессывороточной среде ЭСК продолжают пролиферирОвать па высоком уровне (рис. 2, 3).

В

10% i:trS 0-1% FCS

Расщеплгтнгая кас к 3

10% FCS 0,1 % res

Рис. 6. Влияние LY294002 на рост популяции и гибель ЭСК. А - М7Т-тест, отражающий численность популяций ЭСК, культивируемых в условиях ¡сывороточного голодания [г в присутствии 40 мкМ LY294002. Б - иммуноблот на активную форму каспаты 3.

4. Анализ влияния ингибитора PI3K LY 294002 на численность популяции ЭСК, выживание и старение клеток.

Роль РГЗК-зависимого каскада как необходимого для выживания известна для клеток разных типов (Downward, 2004). Для оценки жизнеспособности ЭСК, обработанных ингибитором Р13-киназы, был применен МТТ-тест, выявляющий живые клетки по активности митохондриааъных ферментов. Полученные данные представлены на рисунке 6А. Обработка ЭСК LY294Ü02 сокращает число живых клеток более чем в два раза по сравнению с контрольной, необработанной ингибитором популяцией. Таким образом, жизнеспособность популяции ЭСК в результате обработки LY294002 снижается, причем негативный эффект проявляется как в нормальных, так и в бессывороточных условиях культивирования, но в присутствии сыворотки эффект ингибитора выражен слабее. Следует отметить, что сывороточное голодание само по себе приводит к Сокращению численности популяции ЭСК (рие.бА),

Наблюдаемое сокращение численности популяции вызвано скорее всего двумя причинами: затруднением перехода G1/S (рис. 2 и ЗА) и индукцией апоптотической гибели клеток {рис. 6Б). Об индукции апоптоза в ЭСК судили по накоплению в клетках расщеплённой (активной) формы каспазы 3.

Замедление и остановка пролиферации - один из признаков старения клеток (Campisi, 2001). В связи с этим мы проверили, не

11) % РС8 III % Ш> Дифференцирован.....с

Контроль + 1Л'294ВД2 клетки

Рис. 7. Выявление ассоциированной со старением клеток активности бега-галакгозидазы. Контроль - недифференцированные ЭСК, культивированные в нормальных условиях, 0,1 РСБн--1Л'294002 - ЭСК, обработанные ЬУ294002 в условиях сывороточного голодания. Дифференцированные в течение 1 месяца клетки использованы в качестве положительного контроля.

0(6 Рис. 8. Влияние

01 в 02 СООП!. ро^ковитина на

! 0% 18% 70 % 12% 0.3 распределение

10% »Искс 26 % 6-1 % 10% 0.4 ЭСК по фазам

0,1% 22% 63 Г. 15% 0.3 клеточного цикла

(А) и активность

0.1% +-ЩЙ 39% 38 % 23 % 1.0

0,1% 1 Ио5С+10Р1 транскрипционного

35% •15% 18% 0.8 фактора Е2Р1 (1>),

_

■-- —— —

7 контроль рОСКОВ. контроль [НЧ'КОВ.

10% 0.1 % РС8

вызывает ли старения обработка клеток ЬУ294002 в условиях сывороточного голодания. Выл проведен анализ ассоциированной со старением активности бета-галактозидазы (яепексепсе-а8кое!-а1сч! 5А^е^а-Оа1), Результаты

представлены на рисунке 7. Видно, что в ЭСК, обработанных ЬУ294002 в условиях низкой сыворотки, демонстрирующих существенное накопление в фазе СИ, цито плазматической активности бета-галактозидазы пе наблюдается. Кроме того, видно, что эти клетки выглядят апоптотиругощими. В качестве положительного контроля для ЗА-Ье1а-(За1 были использованы ЭСК, дифференцированный с помощью ретиноевой кислоты в течение месяца.

5. Инактивация с(1к2 в условиях сывороточного голодания вызывает накопление ЭСК мыши в фазе С1

Поскольку и ЭСК, обработанных ЬУ294002, накопление клеток в фазе СП коррелирует со снижением количества и активности кипазы с(.1к2 (рис. 4). было проверено, является ли инактивация сс!к2 причиной остановки клеток в фазе С1. Для этого было проанализировано распределение по фазам клеточного цикла ЭСК, обработанных специфическим ингибитором киназ сс!к2 и с<.!с2 росковитином (рис. 8А). Оказалось, что в присутствий сыворотки росковитнн вызывает небольшие изменения в

«•fl 20 40

□

|§

- 1 в

<F rf?

FGF Fors kotin IGF UF EGF

10%

10%+ly 0.1%

0.1%-iLY 0,1% +LY+-LIF ai%+LV+(GF

Gl 19%

43% 21 % 51 % 49% 511 %

S

70% 45% 72% IS % Л 5 % 34 %

0,1 % FCS +LY

<32

11%

12% 7% 14% 16% 16%

Gl/S C<>OI ношение

0.3

0.9

0.3

14

1.4

1.5

Рис. 9. Влияние отдельных факторов на эффект LY 294002. А — численность популяций ЭСК, обработанных 20 мкМ LY294002 24 Ч в присутствии различных факторов.

К - распределение ЭСК по фазам клеточного цикла при обработке LY294002 в присутствии IGF и LIF.

распределении ЭСК по фазам цикла; однако в условиях сывороточного голодания он снижает содержание клеток в фазе S до % но сравнению с 70 % в контроле, а содержание клеток в фазах GI и G2 возрастает до 39 % и 23 % соответственно.

Изменения транскрипционной активности E2F1 при обработке роековитином соответствуют изменениям в распределении клеток по фазам клеточного цикла: значительное снижение активности наблюдается в клетках, обработанных роековитином в условиях сывороточного голодания (рис. 8Б). Вероятно, в ЭСК мыши переход G1/S регулируется как к и паю и cdk2, так и cdk2-независимыми механизмами, которые могут быть активированы ростовыми факторами сыворотки. Поэтому заметного снижения количества клеток в фазе S можно добиться только одновременным удалением сыворотки и инактивацией cdk2 с помощью: росковитина.

Ростовой фактор IGF1, как известно, активирует PI3K-зависимый каскад. IGF- i несколько сглаживает негативное влияние росковитина на G1/S переход ЭСК мыши, но всё-таки не гак эффективно, как сыворотка (рис. 8А). Это позволяет предположить, что стимулирующее GI/S переход ЭСК мыши действие PI3K каскада опосредована е0к2-содержащими комплексами.

6. Ростовые факторы ослабляют негативный эффект LY294002 на численность популяции ЭСК мыши.

Поскольку при обработке ЭСК LY294002 наиболее сильное сокращение численности популяции (рис 6А) и снижение доли фазы S (рис ЗА) поисходит в условиях сывороточного голодания, можно предположить, что сыворотка снабжает ЭСК митогенными или антианоитотическнми сигналами, устойчивыми к действию данною aienia

Чтобы выяснить, какие именно факторы сыворотки способствуют выживанию популяции ЭСК в присутствии LY294002, мы сравнили число клеток в контрольных популяциях (LY294002 в среде с 0 1 % FCS или с 10% FCS) и в популяциях, обработанных LY294002 в условиях сывороточного голодания с добавлением одного из следующих факторов EGF, IGF-1, FGF, LIF, форсколин (рис 9А). Число клеток было выше в том случае, когда вместе с LY294002 в среду добавляли ростовые факторы. Самый сильный "спасающий" эффект продемонстрировали факторы L1F и 1GF-1 Тем не менее, присутствие 10 % сыворотки более эффективно спасало клетки от действия LY294002, чем отдельные ростовые факгоры Анализ клеточного цикла показал, что распределение клеток, обработанных LY294002 в присутствии и в отсутствии LIF и IGF-1 не отличаются (рис 9Б) Следовательно, данные факторы снабжают клетку скорее не митогенными стимулами, а сигналами к выживанию

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные приводят нас к заключению, что пролиферация ЭСК мыши может быть стимулирована несколькими независимыми друг от друга сигнальными путями Во-первых, ЭСК мыши способны пролиферирова1ь в отсутствие ростовых факторов в среде культивирования, что свидетельствует о существовании эндогенной митогенной активности Наши исследования показали, что эту митогенную активность можно подавить ингибитором Р13К LY294002 или ингибитором cdk2 росковитином Следует отметить, что подавление пролиферации LY294002 сопровождается снижением активности транскрипционных факторов E2F1 и сс1к2-содержащих копмлексов Во-вторых, несмотря на способность ЭСК к пролиферирации в отстутствие ростовых факторов, сыворотка, тем не менее, может

стимулировать пролиферацию ЭСК, о чем свидетельствует увеличение доли клеюк в фазе Б при добавлении сыворотки клегкам, обработанным ЬУ294002 или росковишном.

Поскольку полученные данные свидетельствуют о том, что при сывороточном голодании в ЭСК мыши содержание и активность белков, положительно регулирующих пролиферацию (циклин 01, сс!к2, Е2Е1), остаются на высоком уровне, а нетативный ретулягор пролиферации, р27кф, наоборот, не накапливается, можно заключить, чго в ЭСК не функционирует ставшая классической для клеток других типов цепь передачи сигнала "ростовые факторы - регуляторы клеточного цикла". Интересно, что активность сигнальных каскадов Егк и РОК в ЭСК мыши зависит от присутствия сыворотки в среде культивирования, а значит, упомяну гая цепь разомкнута "ниже но течению" сигнала Па каком звене цепи возникает автономность митотического сигнала в ЭСК, и как происходит восстанавление зависимости пролиферации от ростовых факторов в результате дифференцировки клеток - вопрос, который должен сать предметом исследований в ближайшее время

Как отсутствие ростовых факюров, гак и ингибитор РОК ЬУ294002 вызывают апоптоз ЭСК мыши По-видимому, сыворотка снабжает ЭСК сигналами к выживанию, которые опосредованы в частности, РОК-зависимым каскадом Это предположение также требует более детального изучения

ВЫВОДЫ

1 Удаление ростовых факторов из среды культивирования снижает активность Егк- и Р13К-зависимых каскадов в эмбриональных стволовых клетках мыши, но не вызывает остановки пролиферации, при этом в клетках не происходит снижения активности комплексов циклин Е/с(1к2

2 Ингибирование активностей МАРК-каскадов (Егк, ЛЧК, р38) не приводит к изменению распределения эмбриональных стволовых клеток мыши по фазам клеточного цикла, в то время как ингибитор Р13-киназы ЕУ294002 вызывает накопление клеток в фазе С1 и снижение доли клеток в фазе синтеза ДНК Аншпролиферашвный эффект инт ибигора усиливается в условиях сывороточного голодания

3 Ингибитор Р13-киназы ЬУ294002 вызывает в

эмбриональных стволовых клетках мыши снижение активности транскрипционного фактора E2F1, а также активности комплексов циклин E/cdk2, что, однако, не сопровождается накоплением ингибитора циютин-киназных комплексов р27к'р

4 Как сывороточное голодание, так и обработка ингибитором Р13-киназы LY294002 вызывают аношэтическую гибель и негативно влияют на рост популяции эмбриональных стволовых клетках мыши.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ляш узова М С , Чуйкин И А , Поспелов В А 2004 Необходимость активации Р13-киназы для пролиферации клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9 Цитология 46(1) 2634

2. Лянгузова М С . Чуйкин И А , Нордхайм А , Поспелов В А

2006 Фармакологические ингибиторы Р13-киназы вортманнин и LY294002 оказывают различное действие на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши Цитология 48 (7) 560568.

3 Lianguzova М S . Chuykin 1 А , Nordhcim А , Pospelov V А.

2007 Phosphoinositide 3-Kinase inhibitor LY294002 but not serum withdrawal suppresses proliferation of murine embryonic stem cells Cell Biol Int 31 330-337

4. Liangouzova M S . Tchuikin I A , Pospelov V A Proliferation of early embryonic cells depends on PI3 kinase activity but not MAP kinases activity 14th European Student Conference at Cliarite (Берлин, Германия, 4-9 ноября 2003 г). Abstract book 405.

5 Поспелов В А , Лянгузова М С , Чуйкин И А . Малашичева А Б Механизмы автономной пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 25- 27 октября 2004 г).

6 Лянгузова М С , Чуйкин И А , Поспелов В.А Влияние ингибитора PI3 Киназы LY294002 на регуляцию перехода G1/S в эмбриональных стволовых клетках мыши VI Международная конференция "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Москва, 12-16 декабря 2005 г.) Сборник тезисов конференции, 98-99

7. Lianguzova М S , Nordheim А , Pospelov VA Influence of PI3-

kinase inhibitor LY294002 and serum deprivation on the proliferation of murine embryonic stem cells. FEBS/EMBO Workshop "Spatial and Temporal Regulation of Signaling" (Осло, Норвегия, 21-24 сентября 2006 г)

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Campisi J 2001 From cells to organisms' can we learn about aging from cells in culture"? Exp Gerontol. 36 607-618.

Collado M, Medema RH, Garcia-Cao I, Dubuisson ML, Barradas M, Glassford J, Rivas C, Burgering BM, Serrano M, Lam EW 2000 Inhibition of the phosphoinositide 3-kmase pathway induces a senescencelike arrest mediated by p27Kipl J Biol Chem 275 21960-21968

Downward J. 2004 PI 3-kinase, Akt and cell survival Seminars m Cell &Dev Biol 15 177-182

Jones SM, Klinghoffer R, Prestwich GD, Toker A, Kazlauskas A. 1999 PDGF induces an eatly and a late wave of PI 3-kinase activity, and only the late wave is required for progression through G1 Curr Biol 9 512-521

Jones SM, Kazlauskas A. 2001 Growth factor-dependent signaling and cell cycle progression FEBS Lett 490 110-116

Savatier P, Huang S, Szekely L, Wiman KG, Samarut J 1994 Contrasting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibioblasts Oncogene 9 809-818

Schratt G, Weinhold B, Lundberg AS, Schuck S, Berger J, Schwarz H, Weinberg RA, Ruther U, Nordheim A 2001 Serum response factor is required for immediate-early gene activation yet is dispensable for proliferation of embryonic stem cells MolCellBiol 2L2933-2943

Stead E, White J, Faast R, Conn S, Goldstone S, Rathjen J, Dhingra U, Rathjen P, Walker D, DaltonS 2002 Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cychn A/E and E2F activities Oncogene 21 8320-8333.

Sun H, Lesche R, Li DM, Liliental J, Zhang H, Gao J, Gavnlova N, Mueller B, Liu X, Wu H 1999 PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,-tnsphosphate and Akt/protem kinase В signaling pathway PNAS 96 6199-6204.

Takahashi K, Mitsui K, Yamanaka S 2003 Role of ERas in promoting tumour-like propeities in mouse embryonic stem cells Nature 423(6939)541-545

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 17 04 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 1524Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лянгузова, Мария Сергеевна

Оглавление

Введение

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Обзор литературы

Эмбриональные стволовые клетки

История получения эмбриональных стволовых клеток 8 Происхождение и основные свойства ЭСК мыши: плюрипотентность и самообновление

Молекулы, необходимые для поддержания недифференцированного состояния

LIF-Stat3 путь

Транскрипционный фактор Oct 3/

Транскрипционный фактор Nanog

Клеточный цикл

Структура клеточного цикла

Регуляция активности циклин-зависимых киназ

Регуляция перехода G1-.S ростовыми факторами

Особенности пролиферации ЭСК

Р13К-зависимый путь

Общее описание

Фосфатаза PTEN - негативный регулятор Р13К-зависимого пути

Семейство PI3K

PI3K I класса

PI3K II класса

PI3K III класса

Ингибиторы Р13-киназы

Вортманнин

Киназа PKB/Akt - ключевое звено в передаче сигнала от PI3K

Механизмы, которые обеспечивают антиапоптотическое действие киназы

PKB/Akt 39 Механизмы, с помощью которых киназа PKB/Akt стимулирует пролиферацию

Р13К-зависимый путь в ЭСК.

Роль PI3K в поддержании недифференцированного состояния ЭСК

Роль фосфатазы PTEN

ЭСК-специфичный белок Eras

Материалы и методы

Клеточные линии, их культивирование и дифференцировка

Построение кривых роста популяций.

Проточная цитофлуориметрия ДНК.

Оценка жизнеспособности популяций (МТТ тест)

Вестерн-блоттинг.

In vitro анализ киназной активности.

Обратная транскрипция и ПЦР.

Анализ экспрессии маркера старения $А ¡5-Gal

Люциферазная активность in vitro

Количественная ПЦР

Анализ активности каспазы

Реаультаты

Влияние сывороточного голодания на активность ERK- и Р13К-зависимых сигнальных каскадов и структуру клеточного цикла в ЭСК

Влияние ингибиторов сигнальных каскадов на распределение ЭСК мыши по клеточному циклу.

Анализ распределения ЭСК мыши по фазам клеточного цикла при сочетании сывороточного голодания и инактивации ERK и Р13К-зависимых сигнальных ка скадов.

Влияние сывороточного голодания и обработки LY294002 на содержание и активность белков, регулирующих G1—S переход в ЭСК мыши.

Анализ влияния инактивации cdk2 на G1->S переход ЭСК мыши

Негативное влияние LY2940Q2 на рост популяции ЭСК мыши

Индукция апоптотической гибели ЭСК мыши в результате сывороточного голодания и обработки LY

Сравнение эффектов двух ингибиторов PI3K LY294002 и вортманнина на ЭСК мыши

Дифференцировка ЭСК мыши

Старение ЭСК мыши

Обсуждение

Действие сывороточного голодания на ЭСК мыши

Действие ингибитора Р13К-зависимого каскада 1У294002 на ЭСК мыши

Сравнение действия ингибиторов Р13К ЬУ294002 и вортманнина на ЭСК мыши

Дифференцировка ЭСК мыши

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Лянгузова, Мария Сергеевна

Выводы

1. Удаление ростовых факторов из среды культивирования снижает активность Егк- и Р13К-зависимых каскадов в эмбриональных стволовых клетках мыши, но не вызывает остановки пролиферации; при этом в клетках не происходит снижения активности комплексов циклин Е/сс1к2.

2. Ингибирование активностей МАРК-каскадов (Егк, ЖК, р38) не приводит к изменению распределения эмбриональных стволовых клеток мыши по фазам клеточного цикла, в то время как ингибитор Р13-киназы ЬУ294002 вызывает накопление клеток в фазе и снижение доли клеток в фазе синтеза ДНК. Антипролиферативный эффект ингибитора усиливается в условиях сывороточного голодания.

3. Ингибитор Р13-киназы ЬУ294002 вызывает в эмбриональных стволовых клетках мыши снижение активности транскрипционного фактора Е2Р1, а также активности комплексов циклин Е/с<1к2, что, однако, не сопровождается накоплением ингибитора циклин-киназных комплексов р271ар.

4. Как сывороточное голодание, так и обработка ингибитором Р13-киназы ЬУ294002 вызывают апоптотическую гибель и негативно влияют на рост популяции эмбриональных стволовых клетках мыши. список работ. опубликованных по теме диссертации

1. Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Поспелов В.А. 2004. Необходимость активации Р13-киназы для пролиферации клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9. Цитология. 46 (1):26-34.

2. Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Нордхайм А., Поспелов В.А. 2006. Фармакологические ингибиторы Р13-киназы вортманнин и LY294002 оказывают различное действие на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши. Цитология. 48 (7):560-568.

3. Lianguzova M.S. Chuykin I.A., Nordheim A., Pospelov V.A. 2007. Phosphoinositide 3-Kinase inhibitor LY294002 but not serum withdrawal suppresses proliferation of murine embryonic stem cells. Cell Biol Int. 31:330-337.

4. Liangouzova M. S. Tchuikin I. A., Pospelov V. A. Proliferation of early embryonic cells depends on PI3 kinase activity but not MAP kinases activity. 14th European Student Conference at Charite (Берлин, Германия, 4-9 ноября 2003 г.). Abstract book. 405.

5. Поспелов B.A., Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Малашичева А.Б. Механизмы автономной пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши. Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 25- 27 октября 2004 г.).

6. Лянгузова М.С. Чуйкин И.А., Поспелов В.А. Влияние ингибитора PI3 Киназы LY294002 на регуляцию перехода G1/S в эмбриональных стволовых клетках мыши. VI Международная конференция "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Москва, 12-16 декабря 2005 г.). Сборник тезисов конференции, 98-99.

7. Lianeuzova M.S. Nordheim A., Pospelov V.A. Influence of PI3-kinase inhibitor LY294002 and serum deprivation on the proliferation of murine embryonic stem cells. FEBS/EMBO Workshop "Spatial and Temporal Regulation of Signaling" (Осло, Норвегия, 21-24 сентября 2006 г.).

Заключение

Полученные данные приводят нас к заключению, что пролиферация ЭСК мыши может быть стимулирована несколькими независимыми друг от друга сигнальными путями. Во-первых, ЭСК мыши способны пролиферировать в отсутствие ростовых факторов в среде культивирования, что свидетельствует о существовании эндогенной митогенной активности. Наши исследования показали, что эту митогенную активность можно подавить ингибитором Р13К ЬУ294002 или ингибитором С(1к2 росковитином. Следует отметить, что подавление пролиферации ЬУ294002 сопровождается снижением активности транскрипционных факторов Е2Р1 и сс1к2-содержащих комплексов. Во-вторых, несмотря на способность ЭСК к пролиферации в отсутствие ростовых факторов, сыворотка, тем не менее, может стимулировать пролиферацию ЭСК, о чем свидетельствует увеличение доли клеток в фазе в при добавлении сыворотки клеткам, обработанным ЬУ294002 или росковитином.

Поскольку полученные данные свидетельствуют о том, что при сывороточном голодании в ЭСК мыши содержание и активность белков, положительно регулирующих пролиферацию (циклин 01, с<Ис2, Е2Р1), остаются на высоком уровне, а негативный регулятор пролиферации, р27кФ, наоборот, не накапливается, можно заключить, что в ЭСК не функционирует ставшая классической для клеток других типов цепь передачи сигнала "ростовые факторы -регуляторы клеточного цикла". Интересно, что активность сигнальных каскадов Егк и Р13К в ЭСК мыши зависит от присутствия сыворотки в среде культивирования, а значит, упомянутая цепь разомкнута "ниже по течению" сигнала. На каком звене цепи возникает автономность митотического сигнала в

ЭСК, и как происходит восстановление зависимости пролиферации от ростовых факторов в результате дифференцировки клеток - вопрос, который должен стать предметом исследований в ближайшее время.

Как отсутствие ростовых факторов, так и ингибитор Р13К ЬУ294002 вызывают апоптоз ЭСК мыши. По-видимому, сыворотка снабжает ЭСК сигналами к выживанию, которые опосредованы в частности, Р13К-зависимым каскадом. Это предположение также требует более детального изучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лянгузова, Мария Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Малашичева А.Б., Кислякова Т.В., Саватьер П., Поспелов В.А. 2002. Эмбриональные стволовые клетки не вступают в арест клеточного цикла под воздействием ДНК-повреждающих факторов. Цитология. 44(7):643-8.

2. Досон Р., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. 1991. Москва, «Мир».

3. Розанов Ю.М. Проточная цитометрия. 1988. Методы культивирования клеток, с.221-231 Ленинград. Изд.Наука.

4. Alessi D. R., Caudwell F. В., Andjelkovic М., Hemmings В. A., Cohen, P. 1996. Molecular basis for the substrate specificity of protein kinase B: comparison with MAPKAP kinase-1 and p70 S6 kinase. FEBS Lett. 399:333-338.

5. Alt JR, Cleveland JL, Hannink M, Diehl JA. 2000. Phosphorylation-dependent regulation of cyclin D1 nuclear export and cyclin Dl-dependent cellular transformation. Genes Dev. 14:3102-3114.

6. Bellacosa A, Testa JR, Staal SP, Tsichlis PN: A retroviral oncogene, akt, encoding a serine-threonine kinase containing an SH2-like region. Science 1991; 254:274-277.

7. Brunet A., Bonni A., Zigmond M. J., Lin M. Z., Juo P., Hu L. S., Anderson M. J., Arden К. C., Blenis J. and Greenberg M. E. 1999 .Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell. 96: 857-868.

8. Buchou Т., Vernet M, Blond O, Jensen HH, Pointu H. 2003. Disruption of the Regulatory |3 Subunit of Protein Kinase CK2 inMice Leads to a Cell-Autonomous Defect and Early Embryonic Lethality. Mol Cell Biol. 908-915

9. Burdon T, Smith A, Savatier P. 2002. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol. 12:432-438.

10. Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A. 2003. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113:643-55.

11. Chen WS, Xu P, Gottlob K, Chen M, Sokol K, Shiyanova T, Roninson I, Weng W, Suzuki R, Tobe K, Kadowaki T, Hay N. 2001. Growth retardation and increased apoptosis in mice with homozygous disruption of the aktl gene. Genes Dev. 15:22032208.

12. Cheng A., Ross K.E., Kaldis P., Solomon M.J. 1999. Dephosphoiylation of cyclin-dependent kinases by type 2C protein phosphatases. Genes Dev. 13:29462957.

13. Cho H, Mu J, Kim JK, Thorvaldsen JL, ChuQ, Crenshaw EB III, Kaestner KH, Bartolomei MS, Shulman Gl, Birnbaum MJ. 2001. Insulin Resistance and a Diabetes Mellitus-Like Syndrome in Mice Lacking the Protein Kinase Akt2 (PKBß). Science. 292:1728-1731

14. Ciemerych MA, Sicinski P. 2005. Cell cycle in mouse development. Oncogene. 24:2877-2898.

15. Cross, D. A., Alessi, D. R., Cohen, P., Andjelkovich, M. and Hemmings, B. A. 1995. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. Nature. 378:785-789

16. Daheron L, Opitz SL, Zaehres H, Lensch WM, Andrews PW, Itskovitz-Eldor J, Daley GQ. 2004. LIF/STAT3 signaling fails to maintain self-renewal of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22:770-8.

17. Datta S.R., Dudek H., Tao X., Masters S., Fu H., Gotoh Y., Greenberg M.E. 1997. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery, Cell, 91:231-241.

18. Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. 2000. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 351:95-105.

19. Del Peso L., Gonzalez-Garcia M., Page C., Herrera R., Nunez G. 1997. Interleukin-3-induced phosphorylation of BAD through the protein kinase Akt, Science, 278:687-689

20. Dey, B. R.; Furlanetto, R. W.; Nissley, S. P. 1998. Cloning of human p55-gamma, a regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase, by a yeast two-hybrid library screen with the insulin-like growth factor-I receptor. Gene. 209: 175-183

21. Di Cristofano A., Pesce B., Cordon-Cardo C., Pandolfi P.P. 1998. Pten is essential for embryonic development and tumour suppression. Nat. Genet. 19:348-355

22. Diehl JA, Cheng M, Roussel MF, Sherr CJ. 1998. Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin Dl proteolysis and subcellular localization. Genes Dev. 12:3499-511.

23. Dimova DK, Dyson NJ. 2005. The E2F transcriptional network: old acquaintances with new faces. Oncogene. 24:2810-26.

24. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., Roskelley C., Medrano E.E., Linskens M., Rubelj I., Pereira-Smith O. 1995. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. PNAS. 92:9363-9367.

25. Domin J, Pages F, Volinia S, Rittenhouse SE, Zvelebil MJ, Stein RC, Waterfield MD. 1997. Cloning of a human phosphoinositide 3-kinase with a C2 domain that displays reduced sensitivity to the inhibitor wortmannin.Biochem J. 326:139-147.

26. Downward J. 2004. PI 3-kinase, Akt and cell survival. Seminars in Cell & Dev Biol. 15:177-182

27. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. 1981. Nature. 292(5819): 154-6.

28. Faast R, White J, Cartwright P, Crocker L, Sarcevic B, Dalton S. 2004. Cdk6-cyclin D3 activity in murine ES cells is resistant to inhibition by pl6(INK4a). Oncogene. 23:491-502.

29. Fluckiger A, Marcy G, Marchand M, Negre D, Cosset F, Mitalipov S. 2006. Cell cycle features of primate embiyonic stem cells. Stem Cells; 24: 547-56.

30. Fujii-Yamamoto H, Kim JM, Arai K, Masai H. 2005. Cell cycle and developmental regulations of replication factors in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 280:12976-12987.

31. Gearing DP, Gough NM, King JA, Hilton DJ, Nicola NA, Simpson RJ, Nice EC, KelsoA, Metcalf D. 1987. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF). EMBO J. 6:3995-4002

32. Gilbert S.F. Developmental biology, Sixth edition, 2000, Sinauer associates, inc., Publishers Sunderland, Massachusetts, CI1IA.

33. Gille H, Downward J. Multiple ras effector pathways contribute to G(l) cell cycle progression. 1999. J Biol Chem. 274:22033-22040.

34. Gilley J, Coffer PJ, Ham J. 2003. FOXO transcription factors directly activate bim gene expression and promote apoptosis in sympathetic neurons. J Cell Biol. 162:613-622

35. Gossler A, Doetschman T, Korn R, Serfling E, Kemler R. 1986. Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. PNAS. 83:9065-9069.

36. GrossVS, Hess M, Cooper GM. 2005. Mouse Embryonic Stem Cells and Preimplantation Embryos Require Signaling Through the Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway to Suppress Apoptosis. Mol Reprod and Dev. 70:324-332

37. Hay DC, Sutherland L, Clark J, Burdon T. 2004. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 22:225-235.

38. Jones SM, Kazlauskas A. 2001Growth factor-dependent signaling and cell cycle progression. FEBS Lett 490:110-116

39. Jones SM, Klinghoffer R, Prestwich GD, Toker A, Kazlauskas A. 1999. PDGF induces an early and a late wave of PI 3-kinase activity, and only the late wave is required for progression through Gl. Curr Biol. 9 :512-521.

40. Khwaja A, Rodriguez-Viciana P, Wennstrom S, Warne PH, Downward J. 1997. Matrix adhesion and Ras transformation both activate a phosphoinositide 3-OH kinase and protein kinase B/Akt cellular survival pathway. EMBO J. 16:2783-2793.

41. Malumbres M, Sotillo R, Santamaria D, Galan J, Cerezo A, Ortega S, Dubus P,Barbacid M. 2004. Mammalian cells cycle without the D-type cyclin-dependent kinases Cdk4 and Cdk6. Cell. 118:493-504.

42. Martin GR. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. PNAS. 78:7634-8.

43. Matsuda T, Nakamura T, Nakao K, Arai T, Katsuki M, Heike T, Yokota T. 1999 STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells. EMBO J. 18:4261-4269

44. Mazumder S, Gong B, Chen Q, Drazba J A., Buchsbaum JC., Almasan A. 2002. Proteolytic Cleavage of Cyclin E Leads to Inactivation of Associated Kinase Activity and Amplification of Apoptosis in Hematopoietic Cells. Mol and Cell Biol. 22: 23982409

45. Medema, R. H.; Kops, G. J. P. L.; Bos, J. L.; Burgering, B. M. T. 2000. AFX-like forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Ras and PKB through p27(kipl). Nature. 404:782-787.

46. Meikrantz W., Schle R. 1996. Suppression of Apoptosis by Dominant Negative Mutants of Cyclin-dependent Protein Kinases. JBC. 27:10205-10209

47. Metcalf D. The Unsolved Enigmas of Leukemia Inhibitory Factor. 2003. Stem Cells. 21:5-14

48. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S. 2003. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113:631-42.

49. Mueller PR, Coleman TR, Kumagai A, Dunphy WG. 1995. Mytl: a membrane-associated inhibitory kinase that phosphorylates Cdc2 on both threonine-14 and tyrosine-15. Science. 270:86-90.

50. Murakami M, Ichisaka T, Maeda M, Oshiro N, Hara K, Edenhofer F, Kiyama H, Yonezawa K, Yamanaka S. 2004. mTOR is essential for growth and proliferation in early mouse embryos and embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 24:6710-6718

51. Nichols J, Evans EP, Smith AG. 1990. Establishment of germ-line-competent embryonic stem (ES) cells using differentiation inhibiting activity. Development. 110:1341-1348.

52. Nilsson I, Hoffmann I. 2000. Cell cycle regulation by the Cdc25 phosphatase family. Prog Cell Cycle Res. 4:107-114

53. Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. 2000. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet. 24:372-376.

54. Niwa H. 2001. Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells. Cell structure and function. 26:137-148.

55. Ohtani, K.; DeGregori, J.; Nevins, J. R. 1995. Regulation of the cyclin E gene by transcription factor E2F1. PNAS. 92:12146-12150.

56. Ortega S, Prieto I, Odajima J, Martin A, Dubus P, Sotillo R, Barbero JL, Malumbres M, Barbacid M. 2003. Nat Genet. 35:25-31. Cyclin-dependent kinase 2 is essential for meiosis but not for mitotic cell division in mice.

57. Ozes О. N., Mayo L. D., Gustin J. A., Pfeffer S. R., Pfeffer L. M., Donner D. B. 1999. NF-kB activation by tumour necrosis factor requires the Aky serine-threonine kinase. Nature, 401(6748):82-85.

58. Paling N, Wheadon H, Bone H, Welham M. 2004. Regulation of Embryonic Stem Cell Self-renewal by Phosphoinositide 3-Kinase-dependent Signaling. J Biol Chem. 279:48063-48070.

59. Pardee AB. 1974. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. PNAS. 71:1286-1290.

60. Parker LL, Piwnica-Worms H. 1992. Inactivation of the p34cdc2-cyclin В complex by the human WEE1 tyrosine kinase. Science. 257:1955-1957.

61. Pesce M, Scholer HR. 2001. Oct-4: Gatekeeper in the Beginnings of Mammalian Development. Stem Cells; 19:271-278

62. Poon R.Y., Hunter T. 1995. Dephosphorylation of Cdk2 Thrl60 by the cyclin-dependent kinase-interacting phosphatase КАР in the absence of cyclin. Science. 270:90-93

63. Roach ML, McNeish JD, Metods for the isolation and Maintenance of murine Embryonic stem cells, c. 1-16 в кн. Embryonic Stem Cells. Metods and Protocols. Humana Press Inc., 2002.

64. Romashkova JA., Makarov SS. 1999. NF-kB is a target of AKT in antiapoptotic PDGF signalling. Nature. 401:86-90

65. Sarbassov DD, Guertin DA, Ali SM, Sabatini DM. 2005. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. Science. 307:1098-1101

66. Savatier P, Huang S, Szekely L, Wiman KG, Samarut J. 1994. Contrasting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibroblasts. Oncogene. 9:809-818.

67. Schulze M, Ungefroren H, Bader M, Fandrich F. 2006. Derivation, maintenance, and characterization of rat embryonic stem cells in vitro. Methods Mol Biol. 329:4558.

68. Sherr C.J., Roberts J.M. 1999. CDK inhibitors: positive and negative regulators of Gl-phase progression. Genes Dev. 13:1501-1512.

69. Smith AG, Hooper ML. 1987. Dev Biol. 121:1-9. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells.

70. Stambolic V., Suzuki A., de la PompaJ.L., Brothers G.M., Mirtsos C., Sasaki T., Ruland J., Perminger J.M., Siderovski D.P., Mak, T.W. 1998. Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN. Cell; 95:29-39

71. Stead E, White J, Faast R, Conn S, Goldstone S, Rathjen J, Dhingra U, Rathjen P, Walker D, Dalton S. 2002. Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities. Oncogene. 21:8320-8333.

72. Stein RC, Waterfield MD. 2000. PI3-kinase inhibition: a target for drug development? Mol Med Today. 6:347-57

73. Stephens L.R., Jackson T.R., Hawkins P.T. 1993. Agonist-stimulated synthesis of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate: a new intracellular signalling system? Biochim. Biophys. Acta. 1179:27-75

74. Stewart CL, Kaspar P, Brunet LJ. 1992. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. Nature. 359:76-79.

75. Takahashi K, Mitsui K, Yamanaka S. 2003. Role of ERas in promoting tumourlike properties in mouse embryonic stem cells. Nature. 423(6939):541-545.

76. Takahashi K, Murakami M, Yamanaka S. 2005. Role of the phosphoinositide 3-kinase pathway in mouse embryonic stem (ES) cells. Biochemical society transactions. 33:1522-1525.

77. Thomas KR, Capecchi MR. 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embiyo-derived stem cells. Cell. 51:503-512.

78. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science. 282:1145-7.

79. Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, Durning M, Harris CP, Becker RA, Hearn JP. 1995. Isolation of a primate embryonic stem cell line. PNAS. 92:7844-8

80. Tomida M, Yamamoto-Yamaguchi Y, Hozumi M. 1984. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic Ml cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259:10978-10982

81. Understanding Stem Cells: An Overview of the Science and Issues from the National Academies. 2007. National Academy of Sciences. Washington, D.C.

82. Vanhaesebroeck B, Alessi DR. 2000. The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB.Biochem J. 346:561-76.

83. Vanhaesebroeck B, Leevers S.J., Ahmadi K., Timms J., Katso R., Driscoll P.C., Woscholski R., Parker P.J., Waterfield M.D. 2001. Synthesis and function of 3-phosphorylated inositol lipids. Annu. Rev. Biochem. 70:535-602.

84. Virbasius JV, Guilherme A, Czech MP. 1996. Mouse pi70 is a novel phosphatidylinositol 3-kinase containing a C2 domain. J. Biol. Chem. 271:13304— 13307.

85. Vlach J, Hennecke S, Amati B. 1997. Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. EMBO J. 16:5334-5344.

86. Walker EH, Pacold ME, Perisic 0, Stephens L, Hawkins PT, Wymann MP, Williams RL. 2000. Structural Determinants of Phosphoinositide 3-Kinase Inhibition by Wortmannin, LY294002, Quercetin, Myricetin, and Staurosporine. Mol Cell. 6: 909-919.

87. Wang S, Tang X, Niu Y, Chen H, Li B, Li T, Zhang X, Hu Z, Ji W. 2007. Generation and Characterization of Rabbit Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 25:481-9.

88. Watcharasit P, Bijur GN, Zmijewski JW, Song L, Zmijewska A, Chen X, Johnson GV, Jope RS. 2002. Direct, activating interaction between glycogen synthase kinase-3beta and p53 after DNA damage.PNAS. 99:7951-7955

89. Williams RL, Hilton DJ, Pease S, Willson TA, Stewart CL, Gearing DP, Wagner EF, Metcalf D, Nicola NA, Gough NM. 1988. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336:684-687.

90. Zhou B. P., Liao, Y., Xia, W., Spohn B., Lee M. H., Hung M. C. 2001. Cytoplasmic localization of p21Cipl/WAFl by Akt-induced phosphorylation in HER-2/neu-overexpressing cells. Nat. Cell Biol. 3:245-252.1. Благодарности