Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих

Томилин, Алексей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих"

томилин

Алексей Николаевич

РОЛЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА ОСТ4 В ПОДДЕРЖАНИИ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003481462

Работа выполнена в Европейской молекулярно -биологической лаборатории

(Гейдельберг, Германия), Пеннсильванском университете (Филадельфия, США), Институте иммунобиологии им. Макса Планка (Фрайбург, Германия) и в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Воробьёв Владимир Иосифович

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор

Киселёв Олег Иванович

Институт гриппа РАМН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук, Институт

биологии развития РАН, Москва

Защита состоится 20 ноября 2009 г. в ^¿у часов на заседании диссертационного

совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194964 Санкт

Петербург, Тихорецкий пр., 4, Факс (812) 297-03-41

Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан < У9 » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н.

af. Е.В.Каминская

Посвящается светлой памяти моего отца

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, впервые полученные в 80-е годы из ранних эмбрионов мыши, уже на протяжении более чем двух десятилетий остаются важным инструментом для изучения функции генов методом нокаута. Важность открытия ЭС клеток нашла свое отражение в Нобелевской премии за 2007 г., присуждённой Эвансу, Капеккн и Смитису. Изолированные из внутренней клеточной массы бластоцисты, ЭС клетки способны неограниченно долго делиться в культуре, а также подвергаться генетическому манипулированию, сохраняя свои свойства. Путём изменения условий культивирования можно добиваться дифференцировки ЭС клеток ш уИго практически во все клеточные типы тканей взрослой мыши (за исключением двух внезародышевых клеточных типов - трофэктодермы (ТЭ) и первичной эндодермы). После подсадки в доимплантационные эмбрионы ЭС клетки способны встраиваться в ткани, происходящие из всех трех зародышевых листков, и, что существенно для успешного проведения генного нокаута, в линию половых клеток, обеспечивая тем самым передачу введенных генных мутаций в следующие поколения. Описанные свойства обозначаются термином клеточная плюрипотентность. Неотъемлемым компонентом регулярного аппарата ядра, обеспечивающим поддержание плюрипотентности, является РОи-доменный транскрипционный фактор Ос(4.

Принятые сокращения: ВКМ - внутренняя клеточная масса, иПС клетки - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, КСК - кроветворные стволовые клетки, МСК - мезенхимные стволовые клетки, МЭФ - мышиные эмбриональные фибробласты, ППК - первичные половые клетки, Г1ЦР - полимеразная цепная реакция, СЭПГ - сдвиг электрофоретической подвижности в геле; ТЭ - трофэтодерма, дпо - дней после оплодотворения, ЦНС - центральная нервная система, ЭС клетки - эмбриональные стволовые клетки, bFGF - basic fibroblast growth factor, Cre - causing recombination, ER - estrogen receptor, jlox - flanking loxP. hCG - human chorionic gonadotropin, LIF -leukemia inhibitory factor, MORE - More of PORE, OPN - остеопонтип, PIAS - protein inhibitor of activated STAT, PMS - pregnant mares' serum, PORE - palindromic Oct-recognition element, PR -progesterone receptor, shRNA - small hairpin RNA, SUMO - small ubiquitin-related modifier, TNAP -tissue nonspecific alkaline phosphatase, TUNEL - terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling

В 1998 г. Томсоном были впервые получены ЭС клетки человека [1], что открыло путь для использования этих клеток в заместительной терапии и дало следующий мощный стимул исследованиям в области биологии стволовых клеток. На сегодняшний день получены уже несколько десятков линий ЭС клеток человека, стали известны некоторые молекулярные и генетические аспекты механизма регуляции самообновления и плюрипотентности ЭС клеток мыши и человека, проведены широкомасштабные работы по оптимизации способов их дифференцировки в различные клеточные типы. Однако очевидны и серьёзные ограничения, заметно отдаляющие перспективу применения ЭС клеток в клинической практике, какими являются (а) туморогенность и (б) отсутствие этих клеток во взрослом организме с возникающей вследствие этого проблемой иммунной несовместимости при аллогенной трансплантации дифференцированных производных от уже полученных человеческих ЭС линий. Первая трудность пока еще ждет своего решения, тогда как для решения второй уже предложены несколько подходов. Во-первых, создание банков человеческих ЭС клеток, охватывающих все НЬА типы, поможет решить эту проблему, но это, по-видимому, будет (если будет) реализовано только в отдаленной перспективе. Во-вторых, терапевтическое клонирование было предложено как альтернативный метод получения аутологичных (пациент-совместимых) ЭС клеток. При таком подходе ядра соматических клеток пациента подсаживают в безъядерные ооциты. ЭС клетки затем получают в культуре из развившихся клонированных бластоцист. Это весьма дорогостоящий и малоэффективный метод, который к тому же предполагает уничтожение доимплантационных человеческих эмбрионов, что запрещено в некоторых странах по этическим соображениям. Поэтому получение аутологичных ЭС или подобных клеток непосредственно из соматических клеток пациента, не прибегающее к терапевтическому клонированию, представлялось крайне актульным. Подобная идея доказала свою состоятельность, когда одна группа из Киотского университета путем простого перебора различных комбинаций и з 24 генов, экспрессия которых ассоциирована с ЭС фенотипом, показала возможность индукции плюрииотентного состояния соматических клеток (МЭФ) при помощи форсированной генной

экспрессии [2]. Как оказалось, экспрессии 4 транскрипционных факторов Oct4, Sox2, сМус и Klf4, доставленных в фибробласты при помощи ретровирусных векторов, на протяжении нескольких дней было достаточно для получения иПС клеток. Полученные иПС клетки обладали всеми свойствами, присущими ЭС клеткам мыши, т.е. способностью самообновляться и дифференцироваться т vivo и ш vilro во все эмбриональные типы клеток, включая половые клетки. За последующие 3 года вышло большое количество работ по данной тематике, описавших альтернативные комбинации транскрипционных факторов, улучшающие эффективность получения иПС клеток у разных видов (включая человека), предложивших различные способы доставки (вирусный, плазмидный, транспозонный, белковый), использовавших различные исходные соматические клеточные типы для получения иПС клеток и т. д. [3,4]. Стало совершенно понятно, что клеточная терапия, основанная в первую очередь на иПС клетках, уже в ближайшие годы сулит здоровью человечества огромные выгоды.

Цель н задачи исследования

Цель работы состояла в изучении биологической роли Oct4 и молекулярных механизмов действия этого белка как ключевого для клеточной плюрипотентности. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач:

1. Выяснить, выполняет ли Oct4 в ППК функцию, сходную с той, какую он несет в раннем эпибласте и ЭС клетках, а именно поддержание плюрипотентного недифференцированного статуса клеток.

2. Опровергнуть или подтвердить большое число противоречивых литературных данных, которые показывают экспрессию Oct4 в соматических стволовых клетках взрослой мыши, а также указывают на возможную функцию Oct4 в этих клетках.

3. Изучить возможность существования новых типов связывания ДНК димерами POU-доменных транскрипционных факторов Oct-подсемейства (Oct 1, Oct2, Oct4 и Oct6), провести структурно-функциональные исследования новых типов димеров.

4. Провести поиск новых транскрипционных партнеров белка Oct4, изучить их роль в модуляции активности Oct4.

5. Исследовать способность лентивирусов селективно заражать первые ТЭ и и также и проходить через этот эпителий первый тип эпителия; исследовать возможность использования этих вирусов для селективного генного манипулирования в плаценте.

Основные положения, выносимые па защиту

1. В отличие от трофобластной дифференцировки плюрипотетных клеток ранних зародышей мышей, их непосредственные потомки - ППК - при генетическом нокаутировании гена Ос/4 подвергаются апоптотической гибели, что указывает на плейотропные функции в развитии клеток «полового пути».

2. Ген Oct4 не экспрессируется и не нужен для самообновления и дифференцировки взрослых соматических стволовых клеток, таких как нейрональные стволовые клетки, КСК и МСК костного мозга, а также стволовые клетки крипты эпителия кишечника, печени, и волосяного фолликула.

3. Существует новый класс cis-элементов в ДНК (MORE), опосредующих связывание гомо- и гетеродимеров Oct-факторов в ранее не описанной конфигурации, что было подтверждено после определения молекулярной структуры MORE и ранее описанного PORE типа POU димеров. Фосфорилирование серинов и треонинов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях внутри PORE и MORE типов POU димеров, играет важную биологическую роль в селективной регуляции димеризации по двум описанным типам.

4. Димерный комплекс Octl, образованный на PORE, способен рекрутировать изветный лимфоидный коактиватор ОсаВ и, тем самым, стимулировать транскрипцию, в то время как конфигурация POU димера, образованного на MORE ДНК, является непермиссивной для взаимодействия с ОсаВ. Природные MORE

сайты, выявленные в промоторах генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (Vu) также непермисивны для ОсаВ.

5. ОсаВ может выступать в роли мощного стабилизатора димера Octl на PORE ДНК, а также в роли коактиватора, ослабляющего требования к специфичности в последовательности PORE. Полученные нами данные предполагают альтернативное соединение POUs и POUH суб-доменов в димерном Octl/PORE комплексе в присутствии ОсаВ.

6. PIASy, один из известных членов семейства SUMO лигаз, является впервые описанным негативным транскрипционным ко-регулятором Oct4, способным взаимодействовать с POU доменом Oct4 через свой SAP домен и репрессировать (независимо от его SUMO-лигазной активности) Ос14-опосредованную транскрипционную активацию посредством релокализации Oct4 на периферию ядра.

7. Лентивирусы способны заражать ТЭ бластоцисты, однако, ввиду эпителиальной природы последней, не способны проникать через ТЭ и заражать клетки ВКМ. Данное свойство лентивирусов может быть использовано в функциональной генетике мыши для тканеспецифических генных манипуляций.

Научная новизна работы

Данная работа представляет собой первое генетическое исследование функции гена Oct4 в первичных половых клетках (ППК). Впервые показано, что утеря функции одного гена в различных клеточных контекстах может проявляться в совершенно различных фенотипах. С другой же стороны, показано отсутствие функции Oct4 в соматических стволовых клетках, что должно положить конец многочисленным основанным на недостоверных данных спекуляциям, предполагающим обратное. В работе охарактеризована новая димерная конфигурация Oct-белков, возникающая при связывании нового класса ДНК элементов. Сформулирована концепция, основанная на структурно-функциональных данных и постулирующая, что альтернативные конформация POU димеров могут по-разному взаимодействовать с транскрипционными кофакторами, оказывая тем самым различное влияние на

транскрипцию. Такой механизм может обеспечивать регуляцию многообразных биологических процессов сравнительно небольшим числом белков POU семейства. В работе выявлен первый негативный транскрипционный регулятор функции Oct4 -белок PIASy. Наконец, впервые показана способность первого эпителиального типа, возникающего при развитии млекопитающих - ТЭ - служить непроницаемым барьером для вирусов, что имеет важные приложения в функциональной генетике мыши и, возможно, в лечении плацентарных заболеваний.

Теоретическое и практическое значение работы

Работа имеет как фундаментальную, так и практическую направленность. Ее результаты важны, в первую очередь, для понимания механизмов регуляции самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток, создают научно-теоретический базис и открывают перспективы их дальнейшего исследования в контексте клинического применения этих клеток в ткане-заместительной терапии у человека. В представленной работе были продемонстрированы среди прочих (а) плодотворность условного генного нокаута при изучении функции гена, имеющего ранний летальный фенотип, и (б) успешность мультидисциплинарного подхода при изучении структурно-функциональных аспектов действия димеров POU-доменных транскрипционных факторов. Данные подходы могут быть рекомендованы для углубленного изучения ряда проблем эмбриогенеза и регуляции транскрипции.

Результаты работы используются при чтении курса лекций по трансгенезу для аспирантов Института иммунобиологии Макса Планка (Фрайбург, Германия). Они могут быть использованы в курсах лекций по частным разделам биологии развития, клеточной биологии,генетики, структурной биологии, при подготовке специалистов в других высших учебных заведениях медико-биологического профиля и включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на конференциях по регуляции транскрипции (Колд Спринг Харбор, США, 2000), по развитию половых клеток (Колд Спринг Харбор, США, 2002, доклад), конференции научного сообщества Макса Планка по стволовым клеткам (Рингберг, Германия, 2005, доклад), конференции "Функциональная геномика эмбриональных стволовых клеток" (EMBL, Гейдельберг, Германия, 2007), Юбилейной конференции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007, д оклад), Р оссийско-немецком двустороннем симпозиуме «Молекулярная биомедицина» (Санкт-Петербург, 2008, доклад). Финансовая поддержка работы осуществлялась грантами ЕМВО short-term fellowship, EMBL postdoctoral allowance, Marion Dilley and David George Jones Funds, Commonwealth and General Assembly of Pennsylvania, Max-Planck Gesselschaft, Alexander-von-Humboldt Stiftung, РФФИ (07-04-01154-a), РФФИ-Гельмгольц 07-04-9228 l-CHr_a/HRJRG-024), программы МКБ «Новые группы», Гос. контракта 02.512.11.2253 с Мин. науки по программе «Живые системы».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 статей в международных и отечественных рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярной биологии стволовых клеток и механизмам регуляции транскрипции, описания материалов и методов исследования, главы «Результаты и обсуждение», объединяющей 5 подглав, в которых приводится изложение экспериментальных данных с их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (90 наименований). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит 26 иллюстраций.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

+ (п>0

Для проведения условного нокаута по гену Oct4 создавали плазмидную конструкцию, включающую ген устойчивости к неомицину (Neo), три сайта 1охР и плечи гомологии к Oct4 локусу, как это изображено (Рис. 1). Данную конструкцию вводили в ЭС клетки линии El4 129/Ola элекгропорацией, 0418-резистентные колонии отбирались и анализировались методами ПЦР и Саузерна для идентификации тех из них, в которых произошло встраивание в Oct4 локус всех 3 !охР сайтов и Neo кассеты [5]. Для выщепления Neo гена в floxNeo локусе проводили второй раунд электропорации Сге-экспрессирующей плазмидой. Клоны с типом делении (З-у (аллель Oct4l,m, flox

означает flanked loxP) отбирались, ,.......... ютг.птжпгюе^икшвюжгт

подтверждались ПЦР и Саузерн блот- ......................-.........................................;

гибридизацией геномной ДНК и использовались для инъекций в бластоцисты мышей линии С57В16 (Рис. 1). Полученные химеры обратно скрещивали с С57В16 мышами с целью передачи flox мутации потомству. Ocl4,lm мышей переводили в гомозиготное состояние, а затем скрещивали с TNAPC"' мышами, экспрессирующими Сге рекомбиназу под контролем гена ткане-неспецифической щелочной

l»J..............Им..........1

2'й шаг: экспрессия Cm

fía

Лох

И i i 11 8 И

J ft

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая получение

От"* аллеля в ЭС клетках для дальнейшего проведения условного нокаута на мышах, фосфатазы. Сге рекомбиназа в данной Условные обозначения: овал - промотор, черные

прямоугольники - экзоны, треугольники — ЬхР сайты, стрелки - места отжига праймеров для генотипипования алелей.

линии экспрессируется в ППК, а после 10.5 дпо - дополнительно в некоторых соматических тканях [6]. Поскольку экспрессия Ой4 после 7.5 дпо ограничена исключительно половыми клетками, его выщепление под действием Сге в этих

соматических клетках себя никак не проявляет, а фенотип, который наблюдается в ППК, является к леточно-автономным. При проведении нокаута в соматических тканях [7] Ос14^ах мыши скрещивали с мышами различных линий, экспрессирующими Сге индуцибельным и(или) ткане-специфическим способом. Основные методики, использованные нами при проведении нокаутов, изложены в известных руководствах по генетике мыши [8-10].

Основным методом, используемым при изучении комплексов POU-доменных белков с ДНК, был метод СЭПГ, в котором меченные изотопом 32Р двухцепочечные олигонуклеотиды (длина 20-50 пн), содержащие исследуемые сайты, инкубировали с экспрессированными в бактериях белками или клеточными экстрактами; комплексы затем разделяли электрофоретически в неденатурирущих 4-6%-ных полиакриламидных гелях [11-13].

Способность изучаемых ДНК сайтов опосредовать транскрипционную активацию исследовали методом временной трансфекции, для чего олигонуклеотиды, содержащие эти сайты, сначала мультимеризовали, а затем клонировали перед минимальным tk промотором, направляющим базальную экспрессию люциферазного гена (lue). Эти репортерные плазмиды затем ко-трансфецировали, отдельно или вместе с Oct-экспрессирующими векторами, в клетки млекопитающих с использованием липофектаминовых реагентов.

Сайт-направленный мутагенез POU-белков проводили при помощи ПЦР. При определении структуры ДНК-белковых комплексов экспрессированные в бактериях POU домены денатурировали, постепенно ренатурировали в присутствии PORE- и MORE-содержащих олигонуклеотидов, затем кристаллизовали. Рентгено-структурные исследования выращенных кристаллов проводили на ускорителе DESY (EMBL, Гамбург).

Для изолирования новых Ос14-взаимодействующих факторов, библиотеку кДНК, созданную на основе мРНК из 11-дневных эмбрионов мыши, клонированную в рАСТ2 векторе и пре-трансформированнуя в дрожжевой штамм Y187, подвергали двугибридному скринингу путём скрещивания с дрожжевым штаммом АН 109,

несущим вектор-наживку pBD-GAL4-POU4. кДНК из прошедших два раунда селекции клонов была секвенирована и подвергнута дальнейшему анализу.

В опытах по иммунопреципитации клетки 293Т трансфецировали кальций-фосфатным методом комбинациями плазмид, экспрессирующих таггированые МТ, Т7 и FLAG пептидами PIAS и Oct4 белки, а также их мутанты. Лизаты транфецированных клеток затем инкубировали с соответствующими антителами на таг-пептиды, иммобилизованными на агарозе. Элюированные после промывок матрицы белки анализировали на иммуноблотах с использованием конъюгированных с пероксидазой антител против вышеупомянутых пептидных тагов.

Иммунофлуоресцентную окраску трансфецированных клеток линий HeLa, С2С12 и 293 проводили после их фиксации в 1 %-ном параформальдегиде, приготовленном на буфере ТФС (10 мМ Tris-HCl рН8.0, 13.5 мМ KCl, 20 мМ NaCl, 0.5мМ EDTA, 0.1% Triton Х-100), что являлось абсолютным условием сохранения морфологии ядерных органелл [14].

Использованные в работе лентивирусы упаковывали в клетках 293Т с использованием упаковочной системы второго поколения (pMD2G и psPax2), концентрировали ультрацентрифугированием и титровали по известным методикам [15].

Суперовуляцию у 4-6-недельных самок мышей линии С57В16 или FVB индуцировали с использованием PMS и hCG [9]. За 0 дпо принимали полночь суток начала спаривания. 4-клеточные эмбрионы (1.5 дпо) вымывали из яйцевода, а бластоцисты (3.5 дпо) - из матки, следуя известной процедуре [9]. Перед вирусным заражением zona pellucida удаляли, затем эмбрионы инкубировали с лентивирусами, разведенными до конечной концентрации (0.1-1)«107 трансформирующих единиц/мл. После инфекции эмбрионы культивировали (37°С, 5% С02) до 4.5 дпо, а затем фиксировали и анализировали при помощи конфокальной микроскопии. Для анализа экспрессии лентивирусов после имплантации зараженные эмбрионы подсаживали в матки псевдобеременным реципиентным самкам линии NMRI. Эмбрионы, внезародышевые мембраны и плаценту анализировали на стадии 10.5 или 18.5 дпо.

Более подробная характеристика использованных в работе методов

молекулярного клонирования, биохимии, эмбриологии, генетики, микроскопии, а также ссылки на первоисточники приведены в статьях из списка работ, опубликованных по теме диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение функцни Oct4 в первичных половых клетках

Поскольку гомозиготные по Oct4 эмбрионы, получаемые при помощи классического нокаута, гибнут на стадии бластоцисты из-за отсутствия плюрипотентного эпибласта [16], для изучения функции этого гена в ППК, потомках клеток эпибласта, нами был применён метод условного нокаута, использующий CrdloxP технологию [17]. В ходе выполнения поставленной задачи нами была создана линия мышей Ос14^'х, в которой в Oct4 локус были введены два loxP сайта, фланкирующие промотор и 1-й экзон гена. Предварительные тест-скрещивания подтвердили полную функциональность flox аллеля и полное отсутствие продуктов А аллеля, получающегося при Сге-опосредованном выщеплении участка гена между двумя loxP сайтами. Для биаллельной flox-*A конверсии в ППК (получаемые мыши нами названы для простоты А/А) мы провели многоступенчатое скрещивание Oct4^ох и TNAPCre линий мышей. А/А мыши обоих полов не показывали каких-либо физиологических, поведенческих или анатомических отклонений, кроме того, что их фертильность была либо частично, либо полностью нарушена, что напрямую коррелировало со степенью обедненности гонад половыми клетками при гистологическом анализе. В сравнении с яичниками пред-эстральных (возраст 3 недели) контрольных (+/А) самок, яичники А/А самок содержали примерно вдвое меньше растущих фолликулов. Более выраженной была разница в содержании примордальных фолликулов. Так, А/А самки содержали таковых в 25-100 раз меньше, чем А/+ самки. У 6-недельных А/А самок первичные фолликулы уже практически не выявлялись, хотя небольшое число растущих фолликулов иногда обнаруживалось (Рис. 2а), в то время как у контрольных А/+ самок такого же возраста выявлялось большое количество и тех, и других (Рис. 26). По достижении половозрелое™ (6 недель) яичники А/А самок

состояли из стромальной ткани, тогда как фолликулы практически отсутствовали, что, очевидно, и служило причиной стерильности этих самок.

В отличие от полной стерильности Л/Л самок, фертильность половозрелых Л/Л самцов заметно варьировала от частичной до полной, даже среди животных из одного помета. В согласии с этим оказались данные гистологического анализа, показавшего частичное или полное отсутствие сперматогенных клеток в семенниках Л/Л самцов. Доля семенных канальцев, в которых отсутствовал половой

компонент, находилась в пределах 30 и 100% (п=7), что напрямую

коррелировало с частично или полностью нарушенной фертильностью этих

о Рис. 2. Морфология яичников 6-недельных А/А (а) и

самцов. В отличие от ,

контрольных А/+ (б) самок мыши. Примордиальные и растущие

самок, пенетрантность фолликулы отмечены черными и белыми стрелками,

соответственно. Морфология семенников половозрелых с

такого фенотипа у Л/Л полной пенетрантностью фенотипа А/А самцов (в) и

контрольных 4/+ (г) самцов. Показаны окрашенные

самцов в целом не зависела гематоксилином/ эозином парафиновые срезы гонад, (д) 10.5-

ОТ возраста Кроме того дп0 ^ и контРольнь1е А/+(е) эмбрионы, окрашенные на

щелочную фосфатазу - маркер ППК (показаны стрелками).

можно отметить

уменьшенный диаметр семенных канальцев без полового компонента и гиперпролиферацию окружающих их клеток Лейдига - типичная картина, наблюдаемая при подавлении сперматогенеза генетическими, химическими или иными способами (Рис. 2в). Как будет показано ниже, взрослые половые клетки, обнаруживаемые у Л/Л особей являются потомками ППК, в которых Сге-опосредованная рекомбинация в локусе не произошла. Рекомбинация эта

должна происходить между 7.25 и 15.5 дпо, т.е. в период экспрессии ТЫАРСге локуса в

ППК [18,19]. Следовательно, утеря взрослых половых клеток должна являться следствием утери ППК примерно в этот же период эмбрионального развития. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели окрашивание ППК на щелочную фосфатазу и показали, что в то время как в 9.5-дпо А/А эмбрионах число ППК остается в пределах нормы, к 10.5 дпо, т.е. к моменту максимальной миграторной активности ППК, число этих клеток резко падает (Рис. 2д). После 10.5 дпо число обнаруживаемых половых клеток в А/А эмбрионах всегда оказывалось крайне низким. Таким образом, утеря гамет у взрослых А/А мышей является прямым следствием утери ППК в эмбриональный период. Присутствие же нормальных гамет в препубертатных самках и самцах может быть объяснено ограниченной эффективностью Сге-опосредованной делеции в Ocl4flox локусе. Действительно, предыдущие тест-скрещивания линии TNAPCre с мышами-репортерами Z/AP линии показали в среднем 60 %-ную эффективность делеций в ППК [6]. Более сильным аргументом, однако, являются (а) экспрессия Oct4 белка в растущих ооцитах препубертатных А/А самок и (б) наличие во всех тестированных сперматозоидах А/А самцов нерекомбинированного flox локуса (данные не приведены).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что нормальное

развитие ППК в отсутствие Oct4

невозможно.

Чтобы ответить на вопрос о судьбе ППК при нокаутировании по Oct4, мы рассматривали по крайней мере 4 возможных сценария: (г) утрата способности к миграции или восприятию сигнала хемотаксиса от презумптивных гонад, (//) дифференцировка в трофобластные клетки (по аналогии с эпибластными и ЭС клетками [16,20]), (ш) вхождение в профазу мейоза I (по

а В^ЙНИ 1

> ч

jf пб

• да

Рис. 3. Двойная окраска участков парафиновых срезов А/А (а и вставка) и А/+ (б) 10.5-дпо эмбрионов на поверхностный маркер ППК SSEA1 (красный флюорохром) и методом TUNEL (зеленый флюорохром). Показаны участки поперечных срезов в районе половых бугорков (пб) и дорсальной аорты (да).

аналогии со снижением экспрессии Oct4 при вхождении в мейоз женских ппк на 13.5 дпо) и , наконец, (í'v) апоптотическая гибель. Ни эктопические ппк, ни позитивные на трофобластные маркеры клетки, ни мейотические фигуры в Л/Л эмбрионах не были обнаружены (данные не показаны), в то время как в области половых бугорков наблюдались группы клеток с фрагментированными ядрами (данные не приведены) - типичный признак апоптотических клеток. Эти кластеры клеток оказались двойными позитивными при tunel окраске и при иммуноокраске на известный поверхностный маркер миграторных ппк, белок ssea1 (Рис. 3), что говорило о том, что они представляют собой скопления подвергающихся апоптотической гибели ппк. Это заключение было подтверждено методом проточной цитофлуорометрии (данные не приведены).

TNAPCre локус ко-экспрессируется с Oct4 начиная с 7.25 дпо, в то время как ППК фенотип у Л/А зародышей проявляется только к 10.5 дпо. Такая задержка может быть из-за того, что Oct4 не нужен в пре-миграторных (7.5-8.5 дпо) и раннемиграторных ППК (8.5 дпо), а становится необходимым только к 10.5 дпо, когда пролиферативная активность ППК наивысшая. Однако более правдоподобным объяснением этой задержки является необходимость достижения экспрессией Сге белка некоторого порогового уровня, выше которого она начинает эффективно выщеплять flox аллель. Действительно, при тест-скрещиваниях TNAPCre мышей с репортерными мышами, рекомбиназная активность Сге обнаруживалась только к 9.5 дпо [6]. В нашем же случае, дальнейшая задержка в проявлении фенотипа до 10.5 дпо могла быть обусловлена временем, необходимым для деградации белка и мРНК Oct4, а также для запуска каскада, ведущего к апоптозу ППК.

Как отмечалось выше, пенетрантность фенотипа у Л/Л самок прогрессирует, в то время как у Л/А самцов она с возрастом не меняется. Популяция покоящихся ооцитов, уже заметно о бедненная у Л/Л самок в препубертатном периоде, продолжает и дальше истощаться через овуляторные циклы и(или) атрезию. Наблюдаемая между полами разница, очевидно, отражает тот факт, что сперматогенез полагается на самообновляющиеся в течение взрослой жизни недифференцированные клетки (известные как сперматогониальные стволовые клетки), в то время как оогенез

полагается на фиксированное число ооцитов, заложенных в процессе эмбрионального развития.

Нокаут по одному и тому же гену в различных клеточных типах, хотя и принадлежащих к одному, так называемому половому пути (от англ. germI¡ne), приводит к различным фенотипическим проявлениям. Так, нокаут по Ос14 в ЭС клетках и эпибласте приводит к дифференцировке, а нокаут по Ос14 в ППК ведет к апоптозу. Ответ на вопрос о том, какие регуляторные механизмы задействованы при проявлении Ос14 своей плейотропной функции в ходе развития клеток полового пути, - задача будущих исследований. Знания эти, однако, важны для понимания природы полового пути.

Изучение роли Ос14 в соматических стволовых клетках

За последнее десятилетие были представлены не менее 70 статей, в которых авторы обнаруживали продукты гена Ой4 в соматических компартментах и предполагали роль Ой4 в поддержании не только плюрипотентных, но и соматических стволовых клеток [7,21]. В согласии с такой возможностью находились результаты экспериментов по форсированной экспрессии Ос/4 у взрослой мыши, показавших дефект дифференцировки и гиперпролиферацию прогениторного компартмента эпителия кишечника [22]. Таким образом, Ой4 мог выступать в роли протоонкогена, что также наводило на мысль об его причастности к неоплазиям, имеющим соматическое происхождение. Однако анализ более чем 3600 первичных опухолей, представляющих более чем 100 видов рака, выявил присутствие продукта Оа4 только лишь в 3 случаях [23], причем во всех трех экспрессия Ой4 вызвана не реактивацией эндогенного Ой4, а геномными перестройками, в ходе которых Ос14 локус оказывался вблизи от чужеродного активного промотора [24]. С другой стороны, виды рака, происходящие из половых клеток, практически всегда показывают высокий уровень экспрессии Ос14 [23].

В здоровых организмах экспрессию Ой4 чаще всего обнаруживали в костном мозге, а именно в МСК и КСК, а также в различных субпопуляциях мультипотентных прогениторных клеток. Помимо костного мозга, Ой4 обнаруживали в прогениторных

клетках поджелудочной железы, в почках, эпителии молочной железы, эндометрии матки, щитовидной железе, легких, кожном эпителии, волосяных фолликулах, амниотической жидкости, пуповинной крови, плаценте (см. обзор [7]). Хотя для нас было по-прежнему ясно, что роль Оа4 действительно ограничена исключительно клетками полового пути, внушительный объем данных по экспрессии этого гена в соме не мог быть проигнорирован и требовал дополнительного изучения.

Мы задались целью внести ясность в достаточно актуальный вопрос о том, действительно ли Ой4 экспрессируется и выполняет какую-либо функцию, по крайней мере, в некоторых и з описанных соматических стволовых типов. С этой целью были проведены опыты по условному нокауту гена, для чего описанные в

а >< о | + >< +

Нох +— я

— гг тт

А — —. —

л/+ л/л эс

л/+

С045.2

.-4щ

\ 50-50/ \/

у-облучённые реципиенты

J|щ

Анализ конкурирующего {С045.1 против С045 2} восстановления геыатопоэза л/л

8 недель

Рис. 4. Условный нокаут по Ос14 гену в МСК и КСК костного мозга, (а) Пример ПЦР-генотипирования потомства, получаемого при скрещивании Ос^"^"" и Сге-экспрессирущих мышей, (б) Сравнительный анализ уровня экспрессии Ой4 мРНК в костном мозге мышей указанных генотипов и ЭС клетках м етодом количественного 11Т-ПЦР. (е) Сравнение клоногенных свойств МСК, выделенных из костного мозга указанных генотипов, (г) Сравнение способности восстанавления гематопоэза КСК костного мозга А/А и А/+ генотипов.

предыдущей главе Ос!^"* мыши скрещивали с мышами, экспрессирующими Сге рекомбииазу на тканеспецифический и(или) индуцибельный манер.

Для проведения нокаута по Ос14 в эпителии кишечника использовали тамоксифен-контролируемый гибрид между Сге рекомбиназой и лиганд-связывающим доменом эстрогенового рецептора (ЕЯ), помещенный под контроль мШт гена [25]. Генерирование Л/Л генотипа в эпителии кишечника при инъецировании индуцирующего СгеЕЯ активность тамоксифена потомству, полученному при ОсX УННп-СгеЕЯ скрещивании, было подтверждено ПЦР геномной ДНК (Рис. 4а). Затем это и контрольное (имеющее по крайней мере один функциональный аллель Ос14) потомство подвергали у-облучению, а затем сравнивали регенеративную способность эпителия кишечника у этих двух генотипов. Оказалось, что отсутствие функциональных Ос14 аллелей (+ или Аох) не сказывается на с пособности стволовых клеток крипты регенерировать этот эпителий после облучения. Кроме того, анализ мРНК 0^4 в нормальном эпителии показал уровень этой экспрессии на 5 порядков ниже, чем в ЭС клетках.

Для проведения нокаута в МСК и КСК костного мозга использовали трансгенную линию мышей, в которой Сге экспрессия находится под контролем интерферон-индуцирумого промотора (Мх1-Сге) [26]. Высокая эффективность/1ох-*А конверсии была подтверждена, как и раньше, при помощи ПЦР (Рис. 4а). Известно, что МСК дают начало хондроцитарному, адипоцитарному, миоцитарному и остеогенному клеточным типам. Все эти клетки наиболее часто упоминаются в связи с Ой4 экспрессией, однако во всех проведенных нами экспериментах, анализирующих клоногенные (Рис. 4е), дифференцировочные, пролиферативные свойства этих клеток не выявили какой-либо зависимости от функциональности Ос/4 локуса (данные не приведены). Сравнительный анализ КСК из костного мозга Л/Л и контрольных мышей показал неотличимые показатели по содержанию в крови красных и белых кровяных телец, а также тромбоцитов. Долговременный регенеративный потенциал КСК обоих генотипов был также неотличим (Рис. 4г).

С целью выяснения роли Ой4 в печени мы опять использовали Мх1-Сге линию мышей. После индукции /1ох—*Л конверсии интерфероном печень подвергали 60-75

%-ной гепатэктомии. Два месяца спустя было обнаружено, что печень как у нокаутной, так и у контрольной группы животных полностью восстановилась. Как и в других соматических клетках, экспрессия Ос14 в печени практически не выявлялась.

Вопрос о возможной функции Осг4 в центральной нервной системе (ЦНС), в частности в нейрональных прогениторных клетках, неоднократно поднимался [7]. Для ответа н а него Ос/Уог мыши скрещивали с трансгенными мышами, в которых экспрессия Сге в нейрональных прогениторных клетках обеспечивается промотором гена Ые5Цп (линия Ыезйп-Сгё). Мыши, гомозиготные по А аллелю в ЦНС, не показывали каких-либо очевидных отклонений в поведении и в морфологии мозга. Кроме того, экспрессия РНК и белка Оа4 не обнаруживалась ни в одном из отделов мозга (данные не приведены).

Наконец, функцию Ос14 в волосяных фолликулах анализировали путем скрещивания Ос^ох мышей с трансгенными, экспрессирующими гибрид Сге и лиганд-связывающего домена прогестеронового рецептора (СгеРШ) под контролем промотора гена КегаИп15, который активен исключительно в стволовых клетках волосяного фолликула [27]. Эти клетки могут дифференцироваться во все типы клеток волосяного фолликула и дермы в процссе заживления кожного эпителия. После индукции/1ох-*А конверсии мифепристоном, антагонистом прогестерона, у 8-недельных гибридов Ос14п"х X К15-СгеРЯ1 морфология волосяных фолликулов не менялась, как не менялась у таких мышей и способность к заживления повреждений кожного покрова.

Таким образом, представленные данные позволяют утверждать, что Ос14 не экспрессируется и не нужен для нормального функционирования соматических стволовых клеток кишечного эпителия, костного мозга, печени, ЦНС и волосяных фолликулов.

Регуляция транскрипции димерами РСШ-факторов

Ос14 принадлежит к семейству РОи-доменных транскрипционных факторов, которым присуще большое разнообразие в способах связывания с ДНК-элементами в промоторах и энхансерах важных для развития генов. Гибкость такого узнавания

обеспечивается за счет уникальной двухчастной ДНК-связывающей белковой единицы, POU домена, состоящего из двух структурно и функционально независимых суб-доменов, POU-специфического (POUs) и POU-гомео (POUh) доменов. Исходно POU белки были описаны как транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК в виде мономеров [28,29]. Более поздние исследования показали способность POU белков кооперировать при связывании со специфическими последовательностями в ДНК, что было впервые продемонстрировано на примере OctI и Oct2, которые могли связываться с промоторами семейства иммуноглобулиновых генов (VH) в виде димеров. Консервативный ДНК мотив, опосредующий такое связывание, был идентифицирован как «гептамер-октамер» (CTCATGAATATGCAAAT), тогда как конфигурация POU димера на нем оставалась неизвестной [30-32]. Настоящее исследование проливает свет на природу этой конфигурации (см. ниже).

Другим примером явился гипофизарный POU-доменный белок Pit 1, который способен связываться с ДНК либо как гомодимер, либо как гетеродимер с Octl [33]. Позднее были проведены кристаллографические исследования гомодимсра Pit 1 на синтетическом мотиве PitD (ATGTATATACAT), производном от Pit 1-связывающего природного элемента АТАТАТАТТСАТ из промотора пролактинового гена [34]. Структура POUs и POUH субдоменов Pit 1 в комплексе с ДНК оказалась очень схожей со структурой таковых в комплексе мономера POU домена Octl с октамерным сайтом (ATGCAAAT, [35]). В последнем POUs Octl узнавал подпоследовательность ATGC, а в Pit 1-содержащем комплексе POUs узнавал мотив АТАС, причем в противоположной цепи ДНК, что обуславливало инвертированную относительно РОин ориентацию POUs [34].

Наконец, третий случай кооперативного связывания с ДНК был выявлен в ходе поиска генов-мишеней белка Oct4 методом иммунопреципитации хроматина [13]. ДНК мотив PORE (Palindromic Oct Recognition Element), ATTTGAAATGCAAAT (15 нт), обнаруженный в интроне остеопонтина (OPN), мог связывать димер Oct4, тем самым опосредуя активацию гена в доимплантационных эмбрионах мыши. Компьютерное моделирование, основанное на кристаллографических данных

исследований комплекса Oct] мономера с октамерным мотивом [35], позволило предсказать структуру этого димера. Помимо Oct4, возможность гомо- и гетеро-димеризации белков Octl и Oct6 на мотиве PORE были также продемонстрированы [13].

Настоящее исследование имело целью выявить новые типы связывания ДНК гомо- и гетеро-димеров POU-доменных транскрипционных факторов Oct-подсемейства (Octl, Oct2, Oct4 и

Oct6) и провести структурно-функциональные исследования этих новых типов Oct димеров. В ходе выполнения поставленной задачи нами был синтезирован и охарактеризован новый ДНК элемент, названный нами MORE (more of PORE. ATGCATATGCAT), который был способен обеспечивать кооперативное связывание гомо- и гетородимерами всех известных Oct-факторов (Octl, Oct2, Oct4, Oct6), a также опосредовать

транскрипционную активацию

люциферазных репортеров в опытах по временной трансфекции (данные не приведены).

Расположение POU суб-доменов в димерах, образованных на MORE сайтах, принципиально отличается от

MORE димер

ATGCATATGCAT ТАCOTATАССТА

PORE димер

»СГГТАСвТТТА

iïïii

MORE MORE '1 MORE' г

ATGCAÏA&TGCAT ТАСОТЛ^ГАСОТА

АТОСАДАТАТОСАТ TACGTJ^TATACGTA

MORE'3 ATGCATAAT»TGCAT " TACGTATTAff ACGTA

MORE4'

ATGCAiATATiATGCAT TACGTSlATAfTACOTA

Рис. 5. (а) Схема, иллюстрирующая принципиальное различние в расположении POU-спецнфичеких (S) и POU-гомео (Н) доменов при связывании ДНК в MORE и PORE димерных конформациях, (б) Производные от MORE олигонуклотидные зонды, использованные для СЭПГ (в). Д - димер Oct4, М - мономер Oct4.

такового на PORE, что было показано при анализе производных от MORE спейсерных вариантов +1 - +4. Так, способность к связыванию Octl димера сохранялась при увеличении дистанции между POUs связывающими подсайтами

ATGC в каждой цепи ДНК, в то время как подобная манипуляция с PORE привела бы к немедленной утрате способности опосредовать связывание димера. Описанное различие обусловлено различным расположением двух POU доменов. О ни расположены поперек оси ДНК в PORE димере так, что белок-белковая поверхность

взаимодействия двух POU субъединиц димера (интерфейс) расположена в плоскости,

перпендикулярной оси ДНК (Рис. 5а). Этот интерфейс был бы неизбежно нарушен у спейсерных вариантов сайта PORE, тогда как у MORE этого не происходит ввиду того, что взаимодействие субъединиц POU димера на этом элементе происходит в плоскости, параллельной оси ДНК, при этом только длина линкера, соединяющего POUs и POUH субдомены в каждой из субъединиц димера, накладывает ограничение на допустимое «растягивание» мотива MORE (Рис. 5). Эти выводы были полностью подтверждены в результатах кристаллографических исследований PORE и MORE димеров (Рис. 6).

Несет ли какой-либо биологический смысл выявленная способность POU-доменных факторов связываться с ДНК в различных димерных конформациях? Полученные нами результаты позволяют ответить на вопрос положительно и показывают, что реализовываться это различие может через селективное взаимодействия POU димеров с транскрипционными коактиваторами. Так, в настоящей работе показано, что известный лимфоидный коактиватор ОсаВ (OBF1,

MORE димер PORE димер

Рис. 6. Выявленная в процессе кристаллографических исследований структура димерных комплексов POU домена Oct 1, сформированных на MORE и PORE ДНК сайтах. POU-специфичекие (S) и POU-гомео (Н) домены и соединяющие их неструктурированные линкерные последовательности (пунктирные линии), принадлежащие одной молекуле, выделены оттенками одного цвета. Интерфейсы димеризации обведеные красными кругами.

ВоЫ), известный своей способностью синергетически активировать транскрипцию в тандеме с мономерами белков Octi и Oct2 [36,37], может взаимодействовать и ко активировать транскрипцию р епортерного гена через взаимодействие с димером Oct), образованным на PORE, но не MORE (Рис. 7а). Наблюдаемая селективность, очевидно, обусловлена различиями в конформациях двух типов Octl димеров. Полученные нами результаты кристаллографических исследований Octl димеров типа MORE и PORE [11,12] вкупе с опубликованными ранее данными по структуре

Рис. 7. (а) Опыт СЭПГ, показывающий селективное образование комплекса коактиватора ОсаВ с димером POU домена Octl (POU-1), сформированном на PORE сайте (отмечен звёздочкой), (б) Известная структура комплекса мономера РОШ с ОсаВ (розовый) на октамерном сайте (слева) и структура POU-I димера на MORE сайте (справа, показана только половина коплекса). (в) Одна и та же белковая поверхность в POUs субдомене (выделена желтым цветом) принимает участие и в связывании ОсаВ (слева), и в димеризации по типу MORE (справа).

Octl/OcaB комплекса на октамерном сайте [38] позволили объяснить эту селективность на структурном уровне. Четыре а-спирали в POUs суб-домене из каждого мономера образуют белковую поверхность, имеющую гидрофобную полость (выделена жёлтым цветом на Рис. le), которая взаимодействует с ОсаВ (розовый цвет) в OcaB/Octl комплексе, образованном на октамерном сайте (Рис. 76, слева), а также, вероятно, в OcaB/Octl /Octl комплексе, образованном на сайте PORE.

Надо отметить, что PORE димер (в отличие от MORE) представляет собой двукратно повторенный классический мономер, лежащий в плоскости, пересекающей ось ДНК (Рис. 6). Описанная гидрофобная полость в димере, образованном на MORE, участвует уже во взаимодействии с С-концевым участком спирали 4 Р01!ц домена второй молекулы Octl, т.е. играет роль уже интерфейса димеризации. Сходная ситуация имеет место на уровне ДНК-белковых взаимодействий: спираль 4 в MORE конфигурации взаимодействует с той же парой А:Т оснований (позиция 5 в MORE), которая принимает участие во взаимодействии с ОсаВ в мономерной и PORE конфигурациях (данные не показаны). Таким образом, димеризация по типу MORE и взаимодействие с ОсаВ являются для Octl двумя взаимоисключающими событиями.

Наши результаты показывают, каким образом разные димерные конформации POU-доменных факторов могут селективно рекрутировать транскрипционные коактиваторы, тем самым оказывая разное влияние на транскрипцию.

Одним из интересных приложений полученных нами данных явилось объяснение известного VH-OcaB парадокса. Поскольку консенсусный MORE (ATGCATATGCAT) является всего лишь синтетическим ДНК элементом, последовательность которого была нами выведена с учетом предпочтений в связывании определенных последовательностей ДНК Oct-факторами, мы задались целью выявить природные элементы, связывающие эти факторы в MORE-конфигурации. Компьютерные поиск в нуклеотидной базе данных NCBI при помощи программы BLAST выявил среди прочих несколько десятков гомологий консенсусной MORE последовательности в промоторах суперсемейства генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH). Выявленные последовательности отличались от синтетического MORE в одной или двух позициях, но, тем не менее, были способны связывать димеры Octl в MORE конформации (данные не приведены). Дальнейший анализ VH MORE показал, что они представляют собой не что иное, как «гептамер/октамер» элементы, охарактеризованные еще в конце 80-х годов как связывающие Octl и Oct2 в неизвестной димерной конфигурации [30-32]. Более удивительным оказалось то, что эти «гептамер/октамеры» были использованы для

изолирования и клонирования ОсаВ [36,37], в то время как, согласно нашим данным, они имеют MORE природу и, тем самым, непермиссивны для рекрутирования ОсаВ. Кроме того, проведенные генетические исследования показали, что нокаут по ОсаВ не приводит к нарушениям в транскрипции VH генов [39,40], что находится в согласии с нашими результатами, но противоречило исходным данным [36,37]. Как выяснилось, для изолирования ОсаВ последовательность «гептамер/октамер» (MORE) была мутирована, за счет делетирования «гептамерной» части, в классический октамерный (ATGCAAAT) сайт [36,37], который действительно был способен рекрутировать ОсаВ, но через Octl мономер. Такая стратегия помогла авторам открыть ОсаВ, однако в конечном итоге привела к описанному Ун-ОсаВ парадоксу, который нам удалось разрешить, используя наши новые знания о MORE димерах.

В следующей части работы нами были более детально исследованы структурно-

фунциональные аспекты взаимодействия ОсаВ с POU димером Octl, образованным на PORE [11,41]. Во-первых, мы

показали что PORE из ">ис' ^ Структура POU1/PORE комплекса и интерфейс

димеризации в увеличенном виде; показаны аминокислотные регуляторной области остатки, подвергавшиеся сайт-специфическому мутагенезу, (б)

Список мутантов POU1, использованных в дальнейшем анализе, гена OPN опосредует (в) Опыт СЭПГ, демонстрирующий ослабленные требования к

интактности интерфейса при PORE димеризации в присутствии транскрипционную 0саВ

активацию этого гена в

лимфоидных клетках через взаимодействие с коактиватором ОсаВ. Во-вторых, мы определили, что состав комплекса на PORE сайте включает две Octl и одну ОсаВ

ml: QIHA. I2IA. KIMS. KI09A

тЗ: 121Y

m4: 12 Ю. К22А

mil: S107 А

ml2: SI07D

ml): SI07I-:

POU-1 «'I n)3 m4 m I ] m J 2 ml3

ОсаВ • + + + - * +

- •

m •

молекулу. Вопрос о том, почему в этом симметричном по структуре комплексе присутствует лишь одна ОсаВ молекула, предстоит выяснить.

Далее мы установили, что ОсаВ может выполнять совершенно необычные

функции, действуя в р оли своеобразной молекулярной прищепки (англ. clump),

способной (/') увеличивать

стабильность димерного комплекса

Octl/PORE на порядки, (//)

обеспечивать PORE димеризацию

даже при мутировании белковой

поверхности, необходимой для такой

димеризации в отсутствие ОсаВ (Рис.

8) и (iii) обеспечивать димеризацию

Octl на PORE последовательностях,

мутированных до такой степени, что

они не могут вообще связывать Oct!

без ОсаВ (Рис. 9а). Тот факт, что

присутствие ОсаВ существенно

ослабляет требования к ДНК

специфичности при формировании Модель альтернативного соединения POU субдоменов в присутствии ОсаВ (справа). Принятые димеров по типу PORE, существенно обозначения как на Рис. 5.

расширяет список потенциальных

генов-кандидатов, регулируемых таким комплексом. Кроме того, ввиду полученных результатов нами было выдвинуто предположение об альтернативном способе соединения POU-субдоменов в Octl димере, образованном на PORE в присутствии ОсаВ (Рис. 96).

В заключительной части этой части работы нами была изучена возможность селективной регуляции димеризации по двум описанным типам за счет фосфорилирования. Нам удалось показать, что фосфо-мимикрирующая мутация S107E Octl, находящаяся в PORE димер-образующем белковом интерфейсе, выражается в заметном ослаблении димеризации на PORE, но не затрагивает ни

Д Д+ОсаВ

PORE ATTTGAAATGCAAAT + + +

PORE° --------G------ ++ + +

pore" —G------------ - -

AIC -------С------- - + +

A6G ------------G— - + +

A5T -----------T___ + +

A7C -------------c- - ++

pore+1 ATTTGAA@ATGCAAAT - ++

Рис. 9. (а) Результат опытов СЭПГ, в которых исследовалась способность PORE мутантов опосредовать димеризацию в присутствии ОсаВ. (б)

мономерное связывание на классическом октамерном сайте, ни димеризацию на MORE сайте. Аминокислота 107 у всех Oct-белков представляет собой либо серии, либо треонин, что косвенно подтверждает биологическую роль этой модификации. В MORE димер-образующем интерфейсе Oct4 и Oct2 находится S159, фосфо-мимикрирующая мутация по которому ведет к подавлению димеризации на MORE, но не на PORE или октамерном сайтах (данные не приведены). S/T107 и S159 располагаются внутри KR(T/S)SIE мотива, являющегося консенсусным сайтом фосфорилирования для ц АМФ- и цГТФ-зависимых протеинкиназ. Таким образом, фософорилирование по альтернативным серинам в Oct-белках может играть существенную роль в селективной регуляции димеризации по тому или иному типу.

Модуляция транс-активирующего потенциала Oct4 белком PIASy

Известно, что транскрипционный фактор Oct4 взаимодействует с различными клеточными белками, модулирущими его транс-активирующую активность [42-49]. С целью лучшего понимания механизма функционирования Oct4 мы провели поиск дополнительных Оа4-ассоциирующих белков с применением дрожжевой двугибридной системы, используя в качестве «наживки» (от англ. bait) POU домен белка Oct4 (POU4), ковалентно соединённый с ДНК-связываюшим участком белка GAL4. POU домен был выбран по причине того, что он опосредует все известные на сегодняшний день взаимодействия Oct4 с ДНК и другими белками. Среди нескольких подтверждённых после двух раундов двугибридного скрининга клонов два кодировали известную SUMO лигазу - PIASy. Помимо двугибридной системы, PIASy и Oct4 взаимодействуют в опытах ко-иммунопреципитации (Рис. 10). Поскольку PIASy является членом

IP: аМТ WB: аТ7

1 2 3

MT-Oct4 + +

T7-PIASy +

T7-PIAS -

kDa

— 75

МТ-ОсМ input МТ-ОС14 -(WB: аМТ)

— 75

— 50

T7-PÍASy input (WB: аТ7)

• 75

Рис. 10. Ко-иммунопреципитация из лизатов 293Т клеток, трансфециро-ванных указанными вверху плазмвда-ми. 1Р - иммуноперципитация с антителами на МТ пептид (осМТ); в вестерн блотах (\УВ) использовали антитела на Т7 пептид (аТ7). Справа указаны маркеры молекулярного веса.

SxMORE-luc SxPOREO-luc бхОСМис 6xFgf4-tuc

Oct4 Sox2 PIASy mutPIASy

20000 isooo 16000 14000 Й 12000 Л 10000

u 8000 6000 4000 2000

белкового семейства, дополнительно включающего PIAS 1, PIAS3 и PIASxa/|3, мы проверили их способность взаимодействовать с Oct4 in vivo. Опыты по коиммунопреципитации показали, что PIAS 1 и PIAS3, но не PIASxa/(3, способны связываться с Oct4 (данные не приведены).

PIASy был исходно описан как ЕЗ SUMO лигаза для ряда белков, поэтому мы проверили, может ли он выступать в этом качестве по отношению к Oct4. В белке Oct4 три потенциальных сайта сумоилирования: К.118, К215 и К244 (внутри консенсусного мотива ФКХЕ). Замена этих аминокислот в Oct4 на аргинины не влияла ни на активность, ни на его способность связывать PIASy. Более того, эффективность получения иПС клеток с использованием этих лизиновых мутантов Oct4 была не ниже, чем при использовании белка дикого типа (данные не приведены). Таким образом, полученные данные говорят о том, что PIASy не является SUMO лигазой для Oct4 и что Oct4/PIASy взаимодействие не зависит от

JjU

Рис. 11. Временная трансфекция клеток 293. В верхней половине таблицы указаны репортерные люциферазные (lue) конструкции под управлением тандемов из шести MORE, PORED, ОСТ или Fgf4 сайтов. Нижняя половина таблицы - эффекторные плазмиды, экспрессирующие указанные белки. Стимуляция транскрипции выражена в условных единицах как отношение активности люциферазы к активности ß-галактозидазы (bgal), использованной для нормализации эффективности трансфекции.

сумоилирования Oct4. Более того, нам удалось показать, что Oct4 может быть сумоилирован по К118, но только SUMO конъюгирующим белком Ubc9, который, кстати говоря, нами был также изолирован в ходе двугибридного скрининга в дрожжах как партнер Oct4. PIASy же выступает в роли ингибитора этой Ubc9-опоерредованной модификации Oct4. Механизм такого ингибирования, возможно, вовлекает конкуренцию PIASy и Ubc9 за связывание с Oct4.

Далее мы показали, что PIASy может выступать в роли мощного ингибитора транскрипционной активации, опосредованной мономером (сайт ОСТ) и димерами Oct4 (сайты PORE и MORE), а также Oct4/Sox2 гетеродимером (сайт Fgf4), выступая

aOct4 Hoechst наложение

Рис. 12. (а-г) Иммунофлюоресцентная окраска ядер клеток HeLa, трансфецированных указанными слева плазмвдами и меченых антителами на (a) Oct4 и SC35 (интерхроматиновые гранулы), (б) Oct4 и коэлин (тельца Кахала), (в, г) Oct4 и PIASy. {д, е) Иммунофлюоресцентная окраска (д) ранних и (е) поздних бластоцист антителами на Oct4 (красный флюорохром) и PIASy (зеленый флюорохром); ядра, ко-экспрессирущие оба белка, выглядят желтыми.

тем самым в роли универсального стереонеспецифического негативного транскрипционного ко-регулятора транскрипции (Рис. 11). Обнаруженная активность PIASy не зависела ни от его сумоилирующей активности (mutPIASy, мутация в RING домене) (Рис. 11), ни от присутствия интактного К118 в Oct4 (данные не показаны). Выяснилось также, что PIAS1 и PIAS3 не способны оказывать аналогичное действие.

Далее мы изучили, как распределен Oct4 внутри клеточного ядра и как меняется это распределение в присутствии PIAS белков, известных своей способностью релокализовывать белки-партнёры. Известно, например, что PIAS1 способен перемещать гомеобоксный транскрипционный фактор Msxl на периферию ядра, где

последний начинает репрессировать промоторы MyoD и Myf5 [50]. При иммунофлуоресцентной окраске трансфецированных HeLa клеток Oct4 показал неравномерное распределение внутри ядра, локализуясь на периферии телец Кахала и интерхроматиновых гранул (Рис. 12а, б). PIASy эффективно перемещает Oct4 на периферию ядра, где оба белка ко-локализуются (Рис. 12в). Опять же, эта PIASy активность не зависела ни от его сумоилирующей активности, ни от присутствия интактного К118 в Oct4 (Рис. 12г). Что касается других членов PIAS семейства, интересным представляется то, что несмотря на неспособность PIAS1 и P1AS3 репрессировать Ос14-опосредованную транскрипцию, оба эти PIAS белка также могут перемещать Oct4 на периферию клеточного ядра.

Полученные данные говорят о том, что способность связывать и релокализовывать Oct4 ещё не является достаточным условием для членов семейства PIAS1 и PIAS3, чтобы выступать в роли ингибитора Oct4, и что при реализации этой функции белком PIASy включаются какие-то дополнительные механизмы.

Поиск клеточного типа и стадии развития, на которых PIAS-опосредованное ингибирование Oct4 может играть роль, привел нас к доимплантационному развитию. Oct4, как известно, экспрессируется во всех клетках до стадии ранней бластоцисты (3.5 дпо), а к 4.5 дпо его экспрессия поддерживается в ВКМ, но затухает в ТЭ. Подобные сведения по экспрессии PIAS белков в литературе отсутствуют, поэтому мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание ранних эмбрионов мыши на PIASy и Oct4. Оба белка показывают равномерное распределение во всех клетках 8- и 16-клеточной морулы (2.5 дпо). В поздней моруле и ранней бластоцисте PIASy экспрессия по-прежнему обнаруживается во всех клетках, однако заметно снижена в ВКМ (Рис. \2д). К стадии поздней бластоцисты (4.5 дпо) PIASy обнаруживается, главным образом, в ТЭ (Рис. 12е). Таким образом, в ходе доимплантационного развития домены экспрессии Oct4 и PIASy полностью перекрываются на стации морулы, но сегрегируют к моменту формирования зрелой бластоцисты. Такое реципрокное разграничение доменов экспрессии согласуется с гипотезой, что PIASy может выполнять ингибирующую функцию по отношению к Oct4, постепенно ограничивая его активность в созревающей бластоцисте клетками ВКМ.

Лентивирусные технологии и их применение для ткане-специфических генных

манипуляций

В последней, методологической части работы приведены результаты исследований возможного приложения лентивирусных технологий для ткане-специфических генных манипуляции у плацентарных млекопитающих. Лентивирусные векторы в последнее время приобретают все большую популярность для решения фундаментальных и клинических задач ввиду того, что они обладают несколькими важными свойствами: (а)

стабильно поддерживать экспрессию при

интегрировании в геном, (б) трансдуцировать как

делящиеся, так и неделящиеся клетки, (в) трансдуцировать клетки разных видов

(политропийность). Кроме того, имеются

эффективные, лёгкие и

( 1 •

безопасные упаковки капсидов [51].

ТЭ является эпителиальной

системы вирусных

бластоцисты первой тканью,

Рис. 13. Экспрессия вРР в 4.5-дпо бластоцистах при заражении СРР-экспрессирующим лентивирусом на стадии 3.5-дпо бластоцисты (а) и ранней морулы (б), (в) Контрольная группа незараженных вирусом эмбрионов. Экспрессия СЯР в 10.5-дпо плодах при заражении СРР-экспрессирующим лентивирусом на стадии 3.5-дпо бластоцисты (г) и ранней морулы (<)). рТЕ и шТЕ - полярная и муральная ТЭ, РЕ — первичная эндодерма, Ое - десвдуа, Ер - эпибласт, Ет -эмбрион, Р1 - плацента, УБ - желточный мешок.

возникающей при развитии млекопитающих, и выполняет сигнальную и питательную функции в доимплантационный период. Кроме того, ТЭ обеспечивает имплантацию эмбриона в стенку матки и дает начало внеэмбриональным тканям, необходимым для закладки осей и роста эмбриона после имплантации. Поскольку ТЭ представляет собой эпителий, мы предположили, что она может служить

естественным барьером для лентивирусных частиц. Действительно, серия проведенных на стадии ранней бластоцисты (3.5 дпо) заражений GFP-экспрессирующим лентивирусом (LVTHM) показала, что только клетки ТЭ оказываются трансдуцированы лентивирусом, тогда как окружённая этим эпителиальным барьером ВКМ - нет (Рис. 13а-в). Экспрессия интегрированного LVTHM затем стабильно поддерживается у потомков ТЭ - гигантских клеток трофобласта, внеэмбриональной эктодермы, эктоплацентарного конуса, клеток губчатого и лабиринтного отделов плаценты (данные не приведены). При инфицировании ранних эмбрионов до формирования трофэктодермы (1.5-2.5 дпо) трансдуцированными оказывались ВКМ и ТЭ и, соответственно, их потомки - сам эмбрион и плацента (Рис. 13г, d).

Наши данные о непроницаемости трофэктодермы для ряда вирусов являются многообещающими в свете возможной тканеспецифичной генетической манипуляции на модели лабораторной мыши, а возможно, в перспективе и на человеке при генной терапии плацентарной недостаточности. Так, например, предлагаемый нами подход может являться значительно менее трудоемкой альтернативой тетраплоидной агрегации - методу, широко используемому для генетического разделения функций генов в эмбрионе и плаценте [52,53]. Как показано в настоящей работе и проиллюстрировано на Рис. 14, путём заражения эмбрионов на стадии бластоцисты вирусом, экспрессирующим интересующую кДНК или интерферирующую РНК (как, например, small hairpin RNA, shRNA), можно добиваться селективной экспрессии (кДНК) или, наоборот, подавления экспрессии РНК-мишени (shRNA) в трофобластных тканях плаценты. С другой стороны, метод может быть адаптирован для избирательного

• -О

Рис. 14. (а) Доставка модуляторов генной экспрессии (кДНК или зЫША) селективно в ТЭ и плаценту (зеленые) через инфицирование лентивирусом (ЬУ) на стадии бластоцисты. (б) Модуляция генной экспрессии в ВКМ и самом эмбрионе (розовые),

осуществляемая за счет поэтапного инфицирования двумя лентивирусами (ЬУ1 и ЬУ2, аттенюирущим эффект ЬУ1 в ТЭ и плаценте).

манипулирования экспрессией генов в ВКМ и е ё производных с применением двушагового инфицирования (Рис. 14). Например, при получении трансгенных мышей эмбрионы могут быть сначала и нфицированы на стадии 4-8 клеток для доставки кДНК во все клетки зародыша. Затем, когда эмбрионы достигнут стадии бластоцисты, они заражаются уже вЫША-экспрессирущим вирусом, подавляющим экспрессию этой кДНК исключительно в плаценте. Соответственно, для Р НК интерференции в производных ВКМ в первом раунде проводится заражение зЬЮЧА-кодирующим вирусом, а во втором - кДНК-кодирующим вирусом, который будет удалять эффект первого вируса в ТЭ. Естественно, что при обоих сценариях вЬЯНА будет интерферировать не т олько с РНК-продуктом трансгена, но и с мРНК, кодируемой хозяйским геномом. Этого эффекта при желании можно избегать за счёт сайт-направленного мутагенеза по 3-м позициям в триплетных кодонах в участке кДНК, к омплементарном вЫУЧА, т.е. путём введения нонсенс-мутаций. Таким образом, можно добиться того, что зЬЯЫА будет узнавать только экзогенную мРНК. Дальнейшую гибкость рассматриваемой системы тканеспецифической модуляции генной экспрессии может обеспечить дополнительное использование ТеЬ индуцибельной системы. Для лентивирусных векторов такая возможность была ранее описана [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Утеря функции гена ОсН в различных клеточных контекстах может проявляться либо в виде трофобластной дифференцировки (ранний эпибласт и ЭС клетки), либо в виде апоптотоза (ППК). Нокаутирование по гену Nanog в раннем эпибласте и ЭС клетках ведет к дифференцировке в эндодерму [54,55], а в ППК - к апоптотической гибели (Т.Тас1а, сообщение). Поскольку известно, что Nanog позитивно регулируется Ой4/8ох2 гетеродимером в ЭС клетках [56-58], представляется в озможным, что функция Ой4 в ППК осуществляется именно через позитивную регуляцию гена Nanog. Будущие исследования должны установить, посредством каких регуляторных связей Nanog контролирует жизнеспособность ППК.

В работе охарактеризована новая димсрная конфигурация Oct-белков, возникающая при связывании нового класса ДНК элементов, MORE. Сформулирована концепция, основанная на структурно-функциональных данных и постулирующая, что альтернативные конформацин POU димеров могут по-разному взаимодействовать с транскрипционными кофакторами, такими как ОсаВ, оказывая тем самым различное влияние на транскрипцию. Такой механизм может обеспечивать регуляцию многообразных биологических процессов сравнительно небольшим числом белков POU семейства.

В работе показано, что ОсаВ может выполнять совершенно уникальные функции, действуя в роли молекулярной прищепки, способной на порядки увеличивать стабильность димера Octl на консенсусном PORE и обеспечивать димеризацию при мутировании (/) интерфейса димеризации и (//) последовательности в PORE. Объяснить первое наблюдение возможно, если постулировать альтернативный способ соединения POU (см. выше). Для объяснения второго наблюдения потребуются специальные исследования, однако уже ясно, что присутствие ОсаВ может обеспечивать транскрипционную активацию, за счет Octl (Oct2) димеров, лимфоид-специфических генов, содержащих в своих промоторах и энхансерах мотивы с очень ограниченной гомологией с консенсусным PORE, но, тем не менее, способных связывать Octl в PORE конфигурации.

Вопрос о с уществовании коактиваторов, аналогичных ОсаВ, модулирующих действие Oct4 димеров на PORE последовательностях в плюрипотентных и половых клетках, а также вопрос о стереоспецифических коактиваторах, взаимодействующие селективно с MORE, но не PORE димерами POU факторов - все это также крайне интересные темы для будущих исследований.

Показанная способность первого эпителиального типа, возникающего при развитии млекопитающих - ТЭ - служить естественным барьером для вирусов может имеет важные приложения в функциональной генетике мыши и, возможно, в лечении плацентарных заболеваний человека.

Полученные в работе результаты важны для понимания механизмов работы POU доменных транскрипционных факторов и, в частности, белка Oct4 как одного из

центральных регуляторов фенотипа половых и плюрипотентных клеток. Знание механизмов функционирования Oct4 позволит глубже понять природу клеток «полового пути», а также позволит более эффективно индуцировать и управлять клеточной плюрипотентноетыо, приближая тем самым перспективу эффективного и безопасного использования этих клеток в тканезаместительной терапии у человека.

ВЫВОДЫ

1. В отличие от трофобластной дифференцировки плюрипотетных клеток ранних зародышей мышей, их непосредственные потомки - ППК - при генетическом нокаутировании гена Oct4 подвергаются апоптотической гибели, что указывает на плейотропные функции в развитии клеток «полового пути».

3. Существует новый класс cw-элементов в ДНК (MORE), опосредующих связывание гомо- и гетеродимеров Oct-факторов в ранее не описанной конфигурации, что было подтверждено после определения молекулярной структуры MORE и ранее описанного PORE типа POU димеров. Фосфорилирование серинов и треонинов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях внутри PORE и MORE типов POU димеров, играет важную биологическую роль в селективной регуляции димеризации по двум описанным типам.

5. Описанные ранее как «гептамерные/октамерные» сайты из семейства промоторов генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (VH) представляют собой природные MORE элементы, которые также непермисивны для ОсаВ.

6. ОсаВ может выступать в роли мощного стабилизатора димера Octl на PORE ДНК, а также в роли коактиватора, существенно ослабляющего требования к специфичности в последовательности PORE. Полученные нами данные предполагают альтернативное соединение POUs и РОии суб-доменов в димерном Octl/PORE комплексе в присутствии ОсаВ.

7. PIASy, один из известных членов семейства SUMO лигаз, является впервые описанным негативным транскрипционным ко-регулятором Oct4, способным взаимодействовать с POU доменом Oct4 через свой SAP домен и репрессировать (независимо от его SUMO-лигазной активности) Ос14-опосредованную транскрипционную активацию посредством релокализации Oct4 на периферию ядра.

8. Лентивирусы способны заражать ТЭ бластоцисты, однако, ввиду эпителиальной природы последней, не способны проникать через нее и заражать клетки ВКМ. Данное свойство лентивирусов может быть использовано в функциональной генетике мыши для тканеспецифических генных манипуляций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. "Tomilin A., "Remenyi A., Lins К., Bak Н„ Leidel S., Vriend G., Wilmanns M., Scholer H.R. 2000. Synergism with the coactivator OBF-1 (OCA-B, BOB-1) is mediated by a specific POU dimer configuration. Cell. 103: 853-864.

2. "Remenyi A., "Tomilin A., Polil E„ Lins K., Philippsen A., Reinbold R., Scholer H.R., and Wilmanns M. 2001. Differential transcriptional activity of dimeric Oct-1 by DNA-motif induced domain swapping. Mol. Cell. 8: 569-580.

3. Remenyi A., Tomilin A, Scholer HR, Wilmanns M. 2002. Differential activity by DNA-induced quarteniary structures of POU transcription factors. Biochem. Pharmacol. 64: 979-984.

4. Lins K., Remenyi A., Tomilin A., Massa S., Wilmanns M., Matthias P. and Scholer H.R. 2003. OBF1 enhances transcriptional potential of Octl. EMBO J. 22: 2188-2198.

# равнозначный вклад

5. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz В., Pesce M., Gentile L., Boiani M., Lomeli H., Nagy A., McLaughlin K.J., Scholer H.R., Tomilin A. 2004. Oct4 is required for primordial germ cell survival. EMBO Rep. 5: 1078-1083.

6. Tolkunova E., Cavaleri F., Eckardt S., Reinbold R., Christenson L.K., Scholer H.R. , Tomilin A. 2006. The caudal-related protein Cdx2 promotes trophoblast differentiation of mouse ES cells. Stem Cells. 24: 139-144.

7. Malashicheva A., Kanzler В., Tolkunova E., Trono D., Tomilin A. 2007. Lentivirus as a tool for lineage-specific gene manipulations. Genesis. 45: 456-459.

8. Lengner C.J., Camargo F.D., Hochedlinger K., Welstead G.G., Zaidi S., Gokhale S., Scholer H.R., Tomilin A., Jaenisch R. 2007. Oct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 1: 403-415.

9. Tolkunova A., Malashicheva A., Parfenov V.N., SustmannC., Grosschedl R., Tomilin A. 2007. PIAS proteins as repressors of Oct4 function. J. Mol. Biol. 374: 1200-1212.

10. Малашичева А.Б., Канцлер Б., Толкунова Е.Н., Троно Д., Томилин А.Н. 2008. Применение лентивирусов для тканеспецифичных генетических манипуляций. Цитология. Т.50, No. 4, С 370-375.

11. Толкунова Е.Н., Малашичева А.Б., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И., Жен В., Jlyo Ж., Добрински И., Хирхольцер А., Кемлер Р., Томилии А.Н. 2008. Е-кадхерин как новый поверхностный маркер сперматогониальных стволовых клеток. Цитология. Т.51, No.3, С 212-218.

12. Saxe J., Tomilin A., Scholer H.R., Plath К., Huang J. 2009. Post-translational regulation of Oct4 transcriptional activity. PLoS One. 4: 1-9.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Thomson etal (1998) Science 282: 1145-1147.

2. Takahashi etal (2006) Cell 126: 663-676.

3. Maherali el at. (2008) Cell Stem Cell 3: 595-605.

4. Ellis el al. (2009) Celt Stem Cell 4: 198-199; author reply 202.

5. Kehler el al. (2004) EMBO Rep 5: 1078-1083.

6. Lomeli el ill. (2000) Genesis 26: 116-117.

7. Lengner el al. (2007) Cell Stem Cell 1: 403-415.

8. Nagy (2003). Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, 3rd edn (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

9. Hogan (1994). Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, 2nd cdn (Plainvievv, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

10.Wassarman el al. (1993). Guide to techniques in mouse development (San Diego, Academic Press).

11 .Remenyi el al. (2001) Mot Cell 8: 569-580.

12.Tomilin el al. (2000) Cell 103: 853-864.

13.Botquin el al. (1998) Genes Dev 12: 2073-2090.

14.Tolkunova el al. (2007) J Mo! Biol 374: 12001212.

15.Wiznerowicz el al. (2003) J Virol 77: 8957-8961.

16.Nichols et al. (1998) Cell 95: 379-391.

17.Gu et al. (1994) Science 265: 103-106.

18.Ginsburg el al. (1990) Development 110: 521528.

19.Anderson el al. (2000) Mech Dev 91: 61-68.

20.Niwa et al. (2000) Nat Genet 24: 372-376.

21.Lengner el at. (2008) Cell Cycle 7: 725-728.

22.Hoched!inger et al. (2005) Cell 121: 465-477.

23.Looijenga et al. (2003) Cancer Res 63: 22442250.

24.Yamaguchi el al. (2005) Genes Chromosomes Cancer 43: 217-222.

25.el Marjou et al. (2004) Genesis 39: 186-193.

26. Kuhn et al. (1995) Science 269: 1427-1429.

27.Morris et al. (2004) Nat Bioteclmol 22: 411-417.

28.Staudt elal. (1986) Nature 323: 640-643. 29.Scholer et al. (1990) Nature 344: 435-439.

30.KemlerW al. (1989) EMBOJS: 2001-2008.

31.LeBowitz el al. (1989) Genes Dev 3: 1625-1638.

32.Poellinger el al. (1989) Nature 337: 573-576.

33.Voss et al. (1991) Genes Dev 5: 1309-1320.

34.Jacobson et al (1997) Genes Dev 11:198-212.

35.Klemm et al. (1994) Cell 77: 21 -32.

36.Luo et al. (1995) Mol Cell Biol 15: 4115-4124.

37.Luo el al (1992) Cell 71: 231 -241.

38.Chasman et al (1999) Genes Dev 13: 2650-2657.

39.Kim et al. (1996) Nature 383: 542-547. 40.Schubart et al. (1996) Nature 383: 538-542. 41 .Litis et al. (2003) EMBO J 22: 2188-2198.

42. Yuan et al. (1995) Genes Dev 9: 2635-2645.

43.Remenyi etal (2003) Genes Dev 17: 2048-2059.

44.Boyer et al. (2005) Cell 122: 947-956. 45,Okumura-Nakanishi et al. (2005) J Biol Chem

280: 5307-5317.

46.Tomioka el al. (2002) Nucleic Acids Res 30: 3202-3213.

47.Brehm el al. (1999) Mol Cell Biol 19: 2635-2643. 48.Scholer et al (1991) Cell 66: 291 -304.

49.Guo el al. (2002) Proc Nail Acad Sci U S A 99: 3663-3667.

50.Lee el al. (2006) Genes Dev 20: 784-794.

51.Trono (2002). Lentiviral vectors (Berlin ; New York, Springer).

52.Nagy et al. (1990) Development 110: 815-821.

53.Tanaka et al (2001) Methods Mol Biol 158: 135154.

54.Chambers et al. (2003) Cell 113: 643-655.

55.Mitsui etal. (2003) Cell 113: 631-642.

56.Boyer et al. (2002) Genesis 34: 236-243.

57.Rodda et al (2005) J Biol Chem 280: 2473124737.

58.Kuroda et al (2005) Mol Cell Biol 25: 24752485.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 16.10.2009. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,0. Уч.-изд. л. 2,0. Тираж 100. Заказ 5015Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812)297-57-76

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Томилин, Алексей Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Oct4 и его роль в онтогенезе мыши.

2.2. Предполагаемая роль Oct4 в соматических клетках.

2.3. POU-доменные димеры.

2.4. Взаимодействие POU домена с гетерогенными белками.

2.5. PIAS белки.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Плазмидные вектора.

3.2. Работа с ЭС клетками.

3.3. Генотипирование.

3.4. Работа с мышами.

3.5. СЭПГ.

3.6. Двугибридный скрининг.

3.7. Коиммунопреципитация.

3.8. Временная трансфекция.

3.9. Иммунологическая окраска.

3.10. Работа с лентивирусами.

3.11. Другие методы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Изучение роли Oct4 в первичных половых клетках.

4.1.1. Создание Oct4flox аллеля.

4.1.2. Подготовительные скрещивания.

4.1.3. Oct4 фенотип у взрослых самок.

4.1.4. Oct4 фенотип у взрослых самцов.

4.1.5. Oct4 фенотип у зародышей.

4.1.6. Судьба ППК без Oct4.

4.1.7. Обсужден ие.

4.2. (Изучение роли Oct4 в соматических стволовых клетках.

4.2.1. Нокаут Oct4 в эпителии кишечника.

4.2.2. Нокаут Oct4 в костном мозге.

4.2.3. Нокаут Oct4 в печени.

4.2.4. Нокаут Oct4 в ЦНС.

4.2.5. Нокаут Oct4 в волосяных фолликулах.

4.2.6. Обсуждение.

4.3. Регуляция транскрипции димерами POU-доменными белками.

4.3.1. Новая димерная конформация на мотиве MORE.

4.3.2. Селективное рекрутирование OBF1 PORE-димером.

4.3.3. Vn-OBFl парадокс.

4.3.4. OBF1 как мощный стабилизатор PORE-димеров.

4.3.5. Фосфорилирование селективно регулирует димеризацию.

4.3.6. Обсужден ие.

4.4. Модуляция активности Oct4 белками семейства PIAS.

4.4.1. Oct4 и PIASy взаимодействуют in vivo.

4.4.2. PIASy не является SUMO-лигазой для Oct4.

4.4.3. PIASy суппресирут активность Oct4.

4.4.4. PIAS белки релокализуют Oct4.

4.4.5. PIASy и Oct4 в предимплантационномразвитии.

4.4.6. Обсуждение.

4.5. Леитиврусы для ткаие-специфических генных манипуляций.

4.5.1. Лентивирусы не проходят через барьер ТЭ.

4.5.2. Обсуждение.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих"

Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, впервые полученные в 80-е годы из ранних эмбрионов мыши, уже на протяжении более чем двух десятилетий остаются важным инструментом для изучения функции генов методом нокаута. Признание важности этого открытия нашло свое отражение в Нобелевской премии за 2007 г., присуждённой Эвансу, Капекки и Смитису. Изолированные из внутренней клеточной массы бластоцисты, ЭС клетки способны неограниченно долго делиться в культуре, а также подвергаться генетическому манипулированию (мутагенезу через гомологичную рекомбинацию или введение трансгенов), сохраняя свои свойства. Путём изменения условий культивирования можно добиваться дифференцировки ЭС клеток in vitro практически во все клеточные типы тканей взрослой мыши (за исключением двух внезародышевых клеточных типов — трофэктодермы и первичной эндодермы). После подсадки в доимплантационные эмбрионы, ЭС клетки способны встраиваться в ткани, происходящие из всех трех зародышевых листков и, что существенно для успешного проведения генного нокаута, в линию половых клеток, обеспечивая, таким образом, передачу введенных генных мутаций следующему поколению. Описанные свойства обозначаются словом "плюрипотентность". Неотъемлемым компонентом регулярного аппарата ядра, обеспечивающим поддержание плюрипотентности, является POU домен-содержащий транскрипционный фактор Oct4.

В 1998 г. Томсоном были впервые получены ЭС клетки человека (Thomson et al., 1998), что открыло путь для использования этих клеток в заместительной терапии и дало следующий мощный стимул исследованиям в области биологии стволовых клеток. Вопрос о том, являются эти клетки действительно ЭС клетками в полном смысле этого слова, остается до сих пор отрытым, а получение доказательства их плюрипотентности через способность дифференцироваться во все зародышевые листки in vivo после подсадки в ранние эмбрионы по известным причинам на человеке невозможно. Однако некоторые признаки, такие как независимость от LIF и зависимость от bFGF при культивировании позволяет скорее отнести их к эпибластным стволовым клеткам (ЭпиС, от англ. EpiSC), недавно описанным для мыши и крысы (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007). Ha сегодняшний день получены уже несколько десятков линий ЭС клеток человека, стали известны некоторые молекулярные и генетические аспекты механизма регуляции самообновления и плюрипотентности ЭС клеток мыши и человека, идут широкомасштабные работы по оптимизации методов их дифференцировки в различные клеточные типы. Однако очевидны и серьёзные ограничения, заметно отдаляющие перспективу применения ЭС клеток в клинической практике, какими являются (а) туморогенность и (б) отсутствие этих клеток во взрослом организме с возникающей вследствие этого проблемой иммунной несовместимости при аллогенной трансплантации дифференцированных производных от уже полученных человеческих ЭС линий.

Первая трудность пока еще ждет своего решения, тогда как для решения второй уже предложены несколько подходов. Во-первых, создание банков человеческих ЭС клеток, охватывающих все HLA типы, поможет решить эту проблему, но это, по-видимому, будет (если будет) реализовано только в отдаленной перспективе. Во-вторых, терапевтическое клонирование было предложено как альтернативный метод получения аутологичных (пациент-совместимых) ЭС клеток. При гаком подходе ядра соматических клеток пациента подсаживают в безъядерные ооциты. ЭС клетки затем получают в культуре из развившихся клонированных бластоцист. Это весьма дорогостоящий и малоэффективный метод, который к тому же предполагает уничтожение доимплантационных человеческих эмбрионов, что запрещено в некоторых странах по этическим соображениям. Поэтому получение аутологичных ЭС или подобных клеток непосредственно из соматических клеток пациента, не прибегающее к терапевтическому клонированию, представлялось крайне актуальным. Подобная идея доказала свою состоятельность, когда одна группа из Киотского университета путём простого перебора различных комбинаций из 24 генов, экспрессия которых ассоциирована с ЭС фенотипом, показала возможность индукции плюрипотентного состояния соматических клеток (МЭФ) при помощи форсированной генной экспрессии (Takahashi and Yamanaka, 2006). Как оказалось, экспрессии 4 транскрипционных факторов Oct4, Sox2, сМус и Klf4, доставленных в фибробласты при помощи ретровирусных векторов, на протяжении нескольких дней было достаточно для получения иПС клеток. Полученные иПС клетки обладали всеми свойствами, присущими ЭС клеткам мыши, т.е. способностью самообновляться и дифференцироваться in vivo и in vitro во все эмбриональные типы клеток, включая половые клетки. За последующие 3 года вышло большое количество работ по данной тематике, описавших альтернативные комбинации транскрипционных факторов, улучшающие эффективность получения иПС клеток у разных видов (включая человека), предложивших различные способы доставки (вирусный, плазмидный, транспозонпый, белковый), использовавших различные исходные соматические клеточные типы для получения иПС клеток и т. д. (Ellis et al., 2009; Maherali and Hochedlinger, 2008). Стало совершенно понятно, что клеточная терапия, основанная в первую очередь на иПС клетках, уже в ближайшие годы сулит здоровью человечества огромные выгоды.

Примечательно, что во всех используемых комбинациях транскрипционных факторов и при всех условиях культивирования для успешной индукции плюрипотентности в соматических клетках было абсолютно необходимо введение POU-доменного транскрипционного фактора Oct4, тогда как введение остальных факторов не было обязательным. Диссертация посвящена изучению молекулярных механизмов действия этого ключевого для плюрипотентности белка и его партнеров, его роли в онтогенезе мыши.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Томилин, Алексей Николаевич

5. ВЫВОДЫ

1. В отличие от трофоблаетной дифференцировки плюрипотетных клеток ранних зародышей мышей, их непосредственные потомки - ППК - при генетическом нокаутировании гена Oct4 подвергаются апоптотической гибели, что указывает на плейотропные функции в развитии клеток «полового пути».

2. Ген Oct4 не экспрессируется и не нужен для самообновления и дифференцировки взрослых соматических стволовых клеток, таких как нейрональиые стволовые клетки, КСК и МСК костного мозга, а также стволовые клетки крипты эпителия кишечника, печени, и волосяного фолликула.

3. Существует новый класс с «--элементов в ДНК (MORE), опосредующих связывание гомо- и гетеродимеров Oct-факторов в ранее не описанной конфигурации, что было подтверждено после определения молекулярной структуры MORE и ранее описанного PORE типа POU димеров. Фосфорилирование серинов и треонинов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях внутри PORE и MORE типов POU димеров, играет важную биологическую роль в селективной регуляции димеризации по двум описанным типам.

6. ОсаВ может выступать в роли мощного стабилизатора димера Octl на PORE ДНК, а также в роли коактиватора, существенно ослабляющего требования к специфичности в последовательности PORE. Полученные нами данные предполагают альтернативное соединение POUs и POUH суб-доменов в димерном Octl/PORE комплексе в присутствии ОсаВ.

7. PIASy, один из известных членов семейства SUMO лигаз, является впервые описанным негативным транскрипционным ко-регулятором Oct4, способным взаимодействовать с POU доменом Oct4 через свой SAP домен и репрессировать (независимо от его SUMO-лигазной активности) Oct4-опосредованную транскрипционную активацию посредством релокализации Oct4 на периферию ядра.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Томилин, Алексей Николаевич, Санкт-Петербург

1. Anderson, R., Copeland, Т.К., Scholer, H., Heasman, J., and Wylie, C. (2000). The onset of germ cell migration in the mouse embryo. Mech Dev 91, 61-68.

2. Boiani, M., Eckardt, S., Scholer, H.R., and McLaughlin, K.J. (2002). Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev 16, 12091219.

3. Botquin, V., Hess, H., Fuhrmann, G., Anastassiadis, C., Gross, M.K., Vriend, G., and Scholer, H.R. (1998). New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev 12, 2073-2090.

4. Boyer, L.A., Lee, T.I., Cole, M.F., Johnstone, S.E., Levine, S.S., Zucker, J.P., Guenther, M.G., Kumar, R.M., Murray, H.L., Jenncr, R.G., et al. (2005). Coretranscriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 122, 947-956.

5. Brehm, A., Ohbo, K., Zwerschke, W., Botquin, V., Jansen-Durr, P., and Scholer, H.R. (1999a). Synergism with germ line transcription factor Oct-4: viral oncoproteins share the ability to mimic a stem cell-specific activity. Mol Cell Biol 19, 2635-2643.

6. Brehm, A., Ohbo, K., Zwerschke, W., Botquin, V., Jansen-Durr, P., and Scholer, H.R. (1999b). Synergism with germ line transcription factor Oct-4: viral oncoproteins share the ability to mimic a stem cell-specific activity. Mol Cell Biol 19, 2635-2643.

7. Butteroni, C., De Felici, M., Scholer, H.R., and Pesce, M. (2000). Phage displayscreening reveals an association between germline-specific transcription factor Oct-4 and multiple ccllular proteins. J Mol Biol 304, 529-540.

8. Casellas, R., Jankovic, M., Meyer, G., Gazumyan, A., Luo, Y., Roeder, R., and

9. Nussenzweig, M. (2002). OcaB is required for normal transcription and V(D)J recombination of a subset of immunoglobulin kappa genes. Cell 110, 575-585.

10. Chasman, D., Cepek, K., Sharp, P.A., and Pabo, C.O. (1999). Crystal structure of an OCA-B peptide bound to an Oct-1 POU domain/octamer DNA complex: specific recognition of a protein-DNA interface. Genes Dev 13, 2650-2657.

11. Chen, X., Fang, F., Liou, Y.C., and Ng, H.H. (2008). Zfpl43 regulates Nanog through modulation of Oct4 binding. Stem Cells 26, 2759-2767.

12. Cook, A.L., and Sturm, R.A. (2008). POU domain transcription factors: BRN2 as aregulator of melanocytic growth and tumourigenesis. Pigment Cell Melanoma Res 27,611-626.

13. De Miguel, M.P., Cheng, L., Holland, E.C., Federspiel, M.J., and Donovan, P.J. (2002). Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retro viral-mediated gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 10458-10463.

14. Donohoe, M.E., Silva, S.S., Pinter, S.F., Xu, N., and Lee, J.T. (2009). The pluripotency factor Oct4 interacts with Ctcf and also controls X-chromosome pairing and counting. Nature 460, 128-132.

15. Donovan, P.J., and de Miguel, M.P. (2003). Turning germ cells into stem cells. Сип-Орт Genet Dev 13, 463-471.el Marjou, F., Janssen, K.P., Chang, B.H., Li, M., Hindie, V., Chan, L., Louvard, D.,

16. Chambon, P., Metzger, D., and Robine, S. (2004). Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis 39, 186-193.

17. Feldman, N., Gerson, A., Fang, J., Li, E., Zhang, Y., Shinkai, Y., Cedar, H., and

18. Bergman, Y. (2006). G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. Nat Cell Biol 8, 188-194.

19. Ginsburg, M., Snow, M.H., and McLaren, A. (1990). Primordial germ cells in the mouse embiyo during gastrulation. Development 110, 521-528.

20. Gu, H., Marth, J.D., Orban, P.C., Mossmann, H., and Rajewsky, K. (1994). Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science 265, 103-106.

21. Herr, W., and Cleaiy, M.A. (1995). The POU domain: versatility in transcriptionalregulation by a flexible two-in-one DNA-binding domain. Genes Dev 9, 16791693.

22. Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., and Jaenisch, R. (2005). Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell 121, 465-477.

23. Hogan, B. (1994). Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, 2nd edn (Plainview, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

24. Jacobson, E.M., Li, P., Leon-del-Rio, A., Rosenfeld, M.G., and Aggarwal, A.K. (1997). Structure of Pit-1 POU domain bound to DNA as a dimer: unexpected arrangement and flexibility. Genes Dev 11, 198-212.

25. Kang, J., Gemberling, M., Nakamura, M., Whitby, F.G., Handa, H., Fairbrother, W.G., and Tantin, D. (2009a). A general mechanism for transcription regulation by Octl and Oct4 in response to genotoxic and oxidative stress. Genes Dev 23, 208-222.

26. Kang, J., Shaky a, A., and Tantin, D. (2009b). Stem cells, stress, metabolism and cancer: a drama in two Octs. Trends Biochem Sci 34, 491-499.

27. Kemler, I., Schreiber, E., Muller, M.M., Matthias, P., and Schaffner, W. (1989).

28. Octamer transcription factors bind to two different sequence motifs of the immunoglobulin heavy chain promoter. EMBO J 8, 2001-2008.

29. Kim, U., Qin, X.F., Gong, S., Stevens, S., Luo, Y., Nussenzweig, M., and Roeder, R.G. (1996). The B-cell-specific transcription coactivator OCA-B/OBF-l/Bob-1 is essential for normal production of immunoglobulin isotypes. Nature 383, 542547.

30. Klemm, J.D., Rould, M.A., Aurora, R., Herr, W., and Pabo, C.O. (1994). Crystalstructure of the Oct-1 POU domain bound to an octamer site: DNA recognition with tethered DNA-binding modules. Cell 77, 21-32.

31. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., andRajewsky, K. (1995). Inducible gene targeting in mice. Science 269, 1427-1429.

32. Maherali, N., and Hochedlinger, K. (2008). Guidelines and techniques for thegeneration of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 3, 595-605.

33. Mangelsdorf, D.J., and Evans, R.M. (1995). The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell 83, 841-850.

34. McLaren, A. (2000). Germ and somatic cell lineages in the developing gonad. Mol Cell Endocrinol 163, 3-9.

35. Morris, R.J., Liu, Y., Maries, L., Yang, Z., Trempus, C., Li, S., Lin, J.S., Sawicki, J.A., and Cotsarelis, G. (2004). Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol 22, 411-417.

36. Nagy, A. (2003). Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual, 3rd edn (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

37. Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E.M., Prideaux, V.R., Ivanyi, E., Markkula, M., and Rossant, J. (1990). Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development 110, 815-821.

38. Nichols, J., Zevnik, В., Anastassiadis, K., Niwa, H., Klewe-Nebenius, D., Chambers, I., Scholer, H., and Smith, A. (1998). Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 95, 379-391.

39. Niwa, FI., Miyazaki, J., and Smith, A.G. (2000). Quantitative expression of Oct-3/4defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet 24, 372-376.

40. Niwa, H., Toyooka, Y., Shimosato, D., Strumpf, D., Takahashi, K., Yagi, R., and Rossant, J. (2005). Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectoderm differentiation. Cell 123, 917-929.

41. Okumura-Nakanishi, S., Saito, M., Niwa, H., and Ishikawa, F. (2005). Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J Biol Chem 280, 5307-5317.

42. Palmieri, S.L., Peter, W., Hess, FI., and Scholer, H.R. (1994). Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the firsttwo extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol 166, 259267.

43. Pesce, M., Gross, M.K., and Scholer, H.R. (1998a). In line with our ancestors: Oct-4 and the mammalian germ. Bioessays 20, 722-732.

44. Pesce, M., Wang, X., Wolgemuth, D.J., and Scholer, H. (1998b). Differential expression of the Oct-4 transcription factor during mouse germ cell differentiation. Mech Dev 71, 89-98.

45. Poellinger, L., Yoza, B.K., and Roeder, R.G. (1989). Functional cooperativity between protein molecules bound at two distinct sequence elements of the immunoglobulin heavy-chain promoter. Nature 337, 573-576.

46. Remenyi, A., Lins, K., Nissen, L.J., Reinbold, R., Scholer, H.R., and Wilmanns, M. (2003). Crystal structure of a POU/HMG/DNA ternary complex suggests differential assembly of Oct4 and Sox2 on two enhancers. Genes Dev 17, 20482059.

47. Remenyi, A., Pohl, E., Scholer, H.R., and Wilmanns, M. (2001a). Crystallization of redox-insensitive Octl POU domain with different DNA-response elements. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57, 1634-1638.

48. Remenyi, A., Tomilin, A., Pohl, E., Lins, K., Philippsen, A., Reinbold, R., Scholer, H.R., and Wilmanns, M. (2001b). Differential dimer activities of the transcription factor Oct-1 by DNA-induced interface swapping. Mol Cell 8, 569-580.

49. Rodda, D.J., Chew, J.L., Lim, L.H., Loh, Y.H., Wang, В., Ng, H.H., and Robson, P.2005). Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J Biol Chem 280, 24731-24737.

50. Rodriguez, M.S., Dargemont, C., and Hay, R.T. (2001). SUMO-1 conjugation in vivo requires both a consensus modification motif and nuclear targeting. J Biol Chem 276, 12654-12659.

51. Rosner, M.H., Vigano, M.A., Ozato, K., Timmons, P.M., Poirier, F., Rigby, P.W., and Staudt, L.M. (1990). A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature 345, 686-692.

52. Roth, W., Sustmann, C., Kieslinger, M., Gilmozzi, A., Irmer, D., Kremmer, E., Turck, C., and Grosschedl, R. (2004). PIASy-deficient mice display modest dcfects in IFN and Wnt signaling. J Immunol 173, 6189-6199.

53. Ryan, A.K., and Rosenfcld, M.G. (1997). POU domain family values: flexibility, partnerships, and developmental codes. Genes Dev 11, 1207-1225.

54. Sachdev, S., Bruhn, L., Sieber, H., Pichler, A., Melchior, F., and Grosschedl, R. (2001). PIASy, a nuclear matrix-associated SUMO E3 ligase, represses LEF1 activity by sequestration into nuclear bodies. Genes Dev 15, 3088-3103.

55. Scholer, H.R. (1991). Octamania: the POU factors in murine development. Trends Genet 7, 323-329.

56. Scholer, H.R., Ciesiolka, Т., and Gruss, P. (1991a). A nexus between Oct-4 and El A: implications for gene regulation in embryonic stem cells. Cell 66, 291-304.

57. Scholer, H.R., Ciesiolka, Т., and Gruss, P. (1991b). A nexus between Oct-4 and El A: implications for gene regulation in embryonic stem cells. Cell 66, 291-304.

58. Scholer, H.R., Dressier, G.R., Balling, R., Rohdewohld, H., and Gruss, P. (1990a). Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. EMBO J 9, 2185-2195.

59. Scholer, H.R., Hatzopoulos, A.K., Balling, R., Suzuki, N., and Gruss, P. (1989). A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J 8, 25432550.

60. Scholer, H.R., Ruppert, S., Suzuki, N., Chowdhury, K., and Gruss, P. (1990b). Newtype of POU domain in germ line-specific protein Oct-4. Nature 344, 435-439.

61. Schubart, D.B., Rolink, A., Kosco-Vilbois, M.H., Botteri, F., and Matthias, P. (1996).

62. B-cell-specific coactivator OBF-1/OCA-B/Bobl required for immune response and germinal centre formation. Nature 383, 538-542.

63. Stallock, J., Molyneaux, K., Schaible, K., Knudson, C.M., and Wylie, C. (2003). The pro-apoptotic gene Bax is required for the death of ectopic primordial germ cells during their migration in the mouse embryo. Development 130, 65896597.

64. Staudt, L.M., Singh, H., Sen, R., Wirth, Т., Sharp, P.A., and Baltimore, D. (1986). A lymphoid-speeific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes. Nature 323, 640-643.

65. Surani, M.A. (2001). Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. Nature 414, 122-128.

66. Surani, M.A., and McLaren, A. (2006). Stem cells: a new route to rejuvenation. Nature 443, 284-285.

67. Tadokoro, Y., Yomogida, K., Ohta, H., Tohda, A., and Nishimune, Y. (2002).

68. Homeostatic regulation of germinal stem cell proliferation by the GDNF/FSH pathway. Mech Dev 113, 29-39.

69. Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676.

70. Tanaka, M., Hadjantonakis, A.K., and Nagy, A. (2001). Aggregation chimeras.

71. Combining ES cells, diploid and tetraploid embryos. Methods Mol Biol 158, 135-154.

72. Tesar, P.J., Chenoweth, J.G., Brook, F.A., Davies, T.J., Evans, E.P., Mack, D.L.,

73. Gardner, R.L., and McKay, R.D. (2007). New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature 448, 196-199.

74. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J.,

75. Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147.

76. Tokuda, M., Kadokawa, Y., Kurahashi, H., and Marunouchi, T. (2007). CDH1 is a specific marker for undifferentiated spermatogonia in mouse testes. Biol Reprod 76, 130-141.

77. Tolkunova, E., Cavaleri, F., Eckardt, S., Reinbold, R., Christenson, L.K., Scholer, H.R., and Tomilin, A. (2006). The caudal-related protein cdx2 promotes trophoblast differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells 24, 139-144.

78. Tolkunova, E., Malashicheva, A., Parfenov, V.N., Sustmann, C., Grosschedl, R., and Tomilin, A. (2007). PIAS proteins as repressors of Oct4 function. J Mol Biol 374, 1200-1212.

79. Tomilin, A., Remenyi, A., Lins, К., Bak, H., Leidel, S., Vriend, G., Wilmanns, M., and Scholer, H.R. (2000). Synergism with the coactivator OBF-1 (OCA-B, BOB-1) is mediated by a specific POU dimer configuration. Cell 103, 853-864.

80. Tomioka, M., Nishimoto, M., Miyagi, S., Katayanagi, Т., Fukui, N., Niwa, H.,

81. Muramatsu, M., and Okuda, A. (2002). Identification of Sox-2 regulatory region which is under the control of Oct-3/4-Sox-2 complex. Nucleic Acids Res 30, 3202-3213.

82. Torres, R.M., and Kiihn, R. (1997). Laboratory protocols for conditional gene targeting (Oxford ; New York, Oxford Uninversity Press).

83. Trono, D. (2002). Lentiviral vectors (Berlin ; New York, Springer).

84. Venter, J.C., Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., Sutton, G.G., Smith, H.O., Yandell, M., Evans, C.A., Holt, R.A., et al. (2001). The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351.

85. Verrijzer, C.P., and Van der Vliet, P.C. (1993). POU domain transcription factors. Biochim Biophys Acta 1173, 1-21.

86. Voss, J.W., Wilson, L., and Rosenfeld, M.G. (1991). POU-domain proteins Pit-1 and Oct-1 interact to form a heteromeric complex and can cooperate to induce expression of the prolactin promoter. Genes Dev 5, 1309-1320.

87. Wang, J., Rao, S., Chu, J., Shen, X., Levasseur, D.N., Theunissen, T.W., and Orkin,

88. S.H. (2006). A protein interaction network for pluripotency of embryonic stem cells. Nature 444, 364-368.

89. Wassarman, P.M., and DePamphilis, M.L. (1993). Guide to techniques in mouse development (San Diego, Academic Press).

90. Wei, F., Scholer, H.R., and Atchison, M.L. (2007). Sumoylation of Oct4 enhances its stability, DNA binding, and transactivation. J Biol Chem 282, 21551-21560.

91. Wiznerowicz, M., and Trono, D. (2003). Conditional suppression of cellular genes:lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol 77, 89578961.

92. Yamaguchi, S., Yamazaki, Y., Ishikawa, Y., Kawaguchi, N., Mukai, H., andNakamura, T. (2005). EWSR1 is fused to POU5F1 in a bone tumor with translocation t(6;22)(p21;ql2). Genes Chromosomes Cancer 43, 217-222.

93. Yeom, Y.I., Fuhrmann, G., Ovitt, C.E., Brehm, A., Ohbo, K., Gross, M., Hubner, K.,and Scholer, H.R. (1996). Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells. Development 122, 881-894.

94. Yuan, H., Corbi, N., Basilico, C., and Dailey, L. (1995). Developmental-specificactivity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3. Genes Dev 9, 2635-2645.

95. Zhao, G.Q., and Garbers, D.L. (2002). Male germ cell specification and differentiation. Dev Cell 2, 537-547.

Информация о работе

Томилин, Алексей Николаевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Роль и механизм действия транскрипционного фактора Оct4 в поддержании плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы