Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Радченко Элина Александровна

РОЛЬ ГЕНА В КОНТРОЛЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ НОНСЕНС-СУПРЕССИИ У ДРОЖЖЕЙ БассНатотусез ссгсч'шас

специальность 03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 НОЯ 2014

Санкт-Петербург 2014

005556039

005556039

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет».

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Людмила Николаевна Миронова, Кафедра генетики и биотехнологии, Санкт-Петербургский государственный университет.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Владимир Геннадьевич Королев, руководитель отделения молекулярной и радиационной биофизики ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова», НИЦ «Курчатовский институт» (Гатчина).

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Владимир Александрович Жуков, и.о. заведующего лабораторией генетики растительно-микробных взаимодействий, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург).

Ведущее учреждение: Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится ■»ЗиЛеж/г? 2015 г. в ^ часов на заседании совета Д.212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета и на сайте Санкт-Петербургского государственного университета (http://spbu.ru/).

Автореферат разослан «/^» 2014 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12 доктор биологических наук

Людмила Андреевна Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Трансляция — это один из базовых процессов, происходящих в клетках живых организмов. Этот сложноорганизованный матричный процесс требует участия большого числа молекул и макромолекулярных комплексов различной природы. Нарушения в работе компонентов аппарата трансляции могут приводить к снижению или, наоборот, повышению ее точности. Одна из моделей для изучения генетического контроля точности трансляции - изучение супрессии нонсенс-мутаций, в результате которой стоп-кодоны, возникшие мутационным путем в рамке считывания, могут быть прочитаны как значащие.

Следует отметить, что значительное число наследственных заболеваний человека обусловлено присутствием стоп-кодона в кодирующих последовательностях. В связи с этим исследование уже известных факторов как генетической, так и эпигенетической природы, а также поиск и характеристика новых факторов, влияющих на эффективность нонсенс-супрессии, на модельном объекте, дрожжах Saccharomyces cerevisiae, представляет собой актуальную задачу.

К числу активно изучаемых генов, мутации которых приводят к считыванию стоп-кодонов, относятся гены SUP35 и SUP45, кодирующие факторы терминации трансляции eRF3 и eRFl соответственно. Штаммы, маркированные мутациями в этих генах, можно использовать для выявления новых генетических и эпигенетических факторов, снижающих или повышающих эффективность считывания стоп-кодонов. К числу эпигенетических факторов, влияющих на считывание стоп-кодонов у дрожжей, относятся наследственные детерминанты белковой природы - прионы. Так, в присутствии хорошо изученного фактора [.Р5/"], прионной формы белка Sup35 (eRF3), эффективность считывания стоп-кодонов повышается. Другой прион, [/£У>+], обнаруженный ранее в лаборатории физиологической генетики СПбГУ, напротив, снижает эффективность нонсенс-супрессии. [7£Р+] представляет собой продукт прионизации транскрипционного фактора Sfpl. Таким образом, белок Sfpl представляет собой неизвестный ранее компонент системы, контролирующей точность трансляции у дрожжей.

Степень разработанности проблемы. Транскрипционный фактор Sfpl регулирует экспрессию большого количества генов, контролирующих биогенез рибосом, клеточный цикл, размер клеток, ответ клеток на стресс (Xu and Norris, 1998; Jorgensen et al., 2002; Fingerman et al., 2003; Jorgensen et al., 2004; Cipollina et al., 2008a; 2008b). Сверхэкспрессия гена SFP1 приводит к индукции [/£Р+], а делеция — к потере этого детерминанта (Rogoza et al., 2010). Помимо этого, в нашей лаборатории отмечено, что сверхэкспрессия SFP1 проявляет также собственный антисупрессорный эффект, не связанный с возникновением [/5Р+], а делеция приводит к повышению эффективности нонсенс-супрессии. Механизм, посредством которого изменение статуса Sfplp влияет на эффективность нонсенс-супрессии неясен.

В связи с этим цель работы состояла в выяснении роли гена SFP1 в контроле эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проанализировать влияние прионной формы белка Sfpl, детерминанта

[ISP+], на экспрессию генов SUP35 и SUP45;

2. Исследовать влияние сверхэкспрессии гена SFPI на проявление

нонсенс-супрессорных мутаций sup35 и sup45;

3. Изучить влияние сверхэкспрессии и делеции гена SFP1 на экспрессию

генов SUP35 и SUP45.

Научная новизна диссертационной работы. Впервые на молекулярном уровне охарактеризованы последствия сверхпродукции и прионизации транскрипционного фактора Sfplp, а также делеции кодирующего его гена SFP1. Выявлено позитивное влияние прионизации и сверхпродукции белка Sfpl на экспрессию гена SUP35. Это объясняет природу антисупрессии, наблюдаемой в штаммах [ISP*]. Впервые охарактеризовано влияние сверхэкспрессии SFP1 на проявление мутаций в генах SUP35 и SUP45. Впервые показано, что увеличение количества белка Sup35, синтезируемого под контролем аллели SUP35, несущей миссенс-мутацию, может компенсировать нарушение терминации трансляции. Полученные данные позволяют утверждать, что ген SFP1 вовлечен в контроль считывания стоп-кодонов путем регуляции синтеза фактора терминации трансляции Sup35p (eRF3).

Теоретическая и практическая значимость. Работа посвящена исследованию точности трансляции, одного из фундаментальных процессов на пути реализации генетической информации. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов, обеспечивающих считывание стоп-кодонов как значащих, поскольку выявлен новый компонент этой системы. Эти данные могут быть использованы в исследованиях других факторов, влияющих на точность трансляции. В перспективе они могут быть использованы при разработке способов диагностики и терапии заболеваний, вызываемых нарушениями в работе компонентов аппарата трансляции.

Положения, выносимые на защиту. Прионизация и сверхпродукция белка Sfpl снижают эффективность нонсенс-супрессии за счет изменения уровня экспрессии гена SUP35. Сверхпродукция мутантного белка Sup35 может компенсировать дефект терминации трансляции. Сверхэкспрессия гена SFP1 влияет на проявление мутаций sup35 и sup45, что является следствием увеличения количества белка Sup35 в этих штаммах. Делеция гена SFP1 приводит к нонсенс-супрессии и снижению уровня экспрессии генов SUP35 и SUP45.

Апробация работы. Результаты работы опубликованы в виде пяти статей (три из них в отечественных изданиях, рекомендованных ВАК, две - в международных научных рецензируемых журналах). Материалы диссертации были представлены на международных и российских конференциях, в том числе: на 12-ом международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина, 2008

г.), на 25-ой международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Олыптын, Польша, 2011 г.), на 1-ом Международном Симпозиуме «Non-conventional Yeasts in Postgenomic Era» (Львов, Украина, 2011 г.), lia V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, Россия, 2012 г.), на 16-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2012 г.), на 26-ой международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Франкфурт-на-Майне, Германия, 2013 г.), на 38-ом конгрессе FEBS (Санкт-Петербург, Россия, 2013 г.), на конференции CNRS им. Жака Моно «Protein misfolding in disease: molecular processes and translational research toward therapy» (Роскоф, Франция, 2013 г.), на конференции ЕМВО «Gene transcription in yeast: From regulatory networks to mechanisms» (Жирона, Испания, 2014 г.), на VI съезде ВОГиС (Ростов-на-Дону, Россия, 2014 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (284 источника). Работа содержит 6 таблиц и 31 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей Saccharotnyces cerevisiae, использованных в работе, приведены в таблице 1.

Таблица I. Штаммы Saccharomyces cerevisiae, использованные в работе.

Название штамма Генотип Происхождение

1А-Д1628 MATa adel-14 his3 lys2 ura3-52 trp1-289 1еи2-3,112 SUP45::HIS3 [pRS316-SUP45] Moskalenko et al., 2003

21-Д863 MATa adel-14 his7-l lys2-90 vra3-52 trpl-289 Ieu2-3,112 SUP35::TRP1 [pYCHU2] Задорский и др., 2003

1Б-Д1606 MATa adel-14 his7-l tys9-A21 trpl-289 ura3-52 Ieu2-3,112 Moskalenko et al., 2003

sfpl Д-1Б-Д1606 MATa adel-14 his7-l Iys9-A21 trpl-289 ura3-52 leu2-3,112 sfpl A А.Б. Данилова (не опубликовано)

25-25-2В-П3982* MATa adel-14 his7-l lys2-87 игаЗА leu2-l thr4-B15 sup35-2S sup45-400 и [¿у/] Volkov et al., 2002

sfpl Д-25-25-2В-П3982** MATa adel-14 his7-l lys2-87 игаЗА leu2-l thr4-BI5 sup35-25 sup45-400 sfpl A [isp] Rogoza et al., 2010

Плазмиды. В работе использовали центромерные плазмиды серии pRSUl (Volkov et al., 2002) и pRS315 (Sikorski and Hieter, 1989), различающиеся аллелями гена SUP35 (Chabelskaya et al., 2004, Volkov et al., 2002) и SUP45 (Le Goff et al., 2002; Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004) соответственно (Табл. 2). Плазмида pRS426-SFPl получена С. А. Родионовой, плазмида pRSU3-25 - К.В. Волковым (Volkov et al., 2002). В работе также

использованы плазмиды pRS425 и pRS426 (Christianson et al., 1992).

Таблица 2. Характеристика плазмид серий pRSUl и pRS315.

Плазмида Аллель гена Нуклеотидная замена Аминокислотная замена, тип мутации

pRSUl SUP 35 - -

pRSUl-10 sup35-10 G1087А 363Asp —* Asn (миссенс)

pRSUl-25 sup35-25 С1133Т 378Thr —» Ile (миссенс)

pRSU 1-228 sup35-228 G1115A 372Arg—>Lys (миссенс)

pRSU 1-240 sup35-240 С166Т 56Gln—»UAA (стоп)

pRS315-SUP45 SUP45 - -

PRS315-101 sup4 5-101 G796T 266Glu—>UAA (стоп)

pRS315-102 sup45-102 Т159А 53Tyr—»UAA (стоп)

pRS315-103 sup45-103 Т62С 21 Leu—»Ser (миссенс)

pRS315-104 sup45-104 Т848А 283Leu—>UAA (стоп)

pRS315-105 sup45-105 G1153T 385Glu—»UAA (стоп)

pRS315-107 sup45-107 T950G 317Leu—» UGA (стоп)

pRS315-l 16 sup45-116 G185C 62Arg—>Thr (миссенс)

Методы. В работе использовали стандартные методы и культуральные среды, применяемые при работе с дрожжами и бактериями (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986; Sambrook et al, 1989; Kaiser et al., 1994), a также стандартные молекулярные и биохимические методы (Sambrook et al, 1989; Inoue et al., 1990, Gietz et al., 1992, Kaiser et al, 1994, Gietz and Woods, 2006). Для элиминации плазмид, несущих маркерный ген URA3, использовали среду SC, содержащую 5-фтороротовую кислоту (FOA, Angus) в концентрации 1мг/мл (Kaiser et al, 1994). Для детекции ауксотрофности по аденину применяли среду Ул YEPD (Eaglestone et al., 2000). Для сравнения эффективности нонсенс-супрессии применяли упорядоченный посев штаммов дрожжей на селективные среды с использованием серий последовательных разведений суспензии клеток.

Для выделения РНК использовали PureZol (Bio-Rad), для реакции обратной транскрипции - набор RevertAid Reverse Transcriptase (ThermoScientifîc), для ПЦР в режиме реального времени - набор реагентов EVA Green (Синтол) и ПЦР-амплификатор CFX96 (Bio-Rad). Для каждого эксперимента выделяли не менее трех независимых проб тотальной мРНК. Нормализованное соотношение экспрессии анализируемого гена (SUP35 или SUP45) к экспрессии контрольного гена (ADH1 или АСТ1) оценивали по методу Ливак (Livak and Schmittgen, 2001).

Выделение и электрофорез белков осуществляли по методике (Kushnirov et al., 2006) с модификациями. Для иммунодетекции белков Sup35 и Sup45 использовали набор реагентов ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham, Швеция) и первичные поликлональные антитела SE90 и SE45-2. Антитела SE90 предоставлены C.B. Шабельской, SE45-2 - С.Е. Москаленко. Полученные с помощью прибора GeneGnome (Syngene) изображения сканировали и обрабатывали в программе ImageJ 1.44р

(http://rsbweb.nih.gov/ij7). Выравненность концентраций белков оценивали с помощью окрашивания мембраны в растворе Кумасси R-250 согласно протоколу (Welinder and Ekblad, 2011).

Секвенирование осуществляли в фирме "АТГ Сервис-ген", в компании «Бигль» и на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Статистическую обработку результатов производили с помощью программ RConsole (R Development Core Team, 2012; www.r-project.org) и OpenOffice.org Cale. Для попарных сравнений применяли критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Sokal and Rohlf, 1995; Шипунов и др., 2012).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние детерминанта [ЛУЯ+] на экспрессию генов SUP35 и SUP45

Прионная форма белка Sfpl, детерминант [ISP*], снижает эффективность считывания стоп-кодонов как значащих в штаммах, несущих нонсенс-супрессорные мутации sup35-10 и sup35-25 и криптические мутации sup45-400 и sup45-75 (Volkov et al., 2002, Аксенова и др., 2006). Однако прямые данные, связывающие изменение эффективности нонсенс-супрессии с функцией белка Sfplp в его нормальной и прионной форме, отсутствовали. Вместе с тем логично предположить, что антисупрессия, то есть усиление эффективности терминации трансляции, может быть связана с увеличением количества белков, обеспечивающих этот процесс. В связи с этим мы сравнили характер экспрессии генов SUP35 и SUP45 в [/573+] и [к/;"] вариантах штамма 25-25-2В-П3982, а также в производном этого штамма, несущем делецию гена SFP1 (в дальнейшем они обозначаются как [/5Р+], [¿sp"] и .^/¿/-штаммы).

На первом этапе мы сравнили количество мРНК этих генов в исследуемых штаммах с помощью ПЦР в режиме реального времени и обнаружили, что эффективность транскрипции гена SUP35 в штамме [/£Р+] примерно в 4 раза выше, чем в штамме [юр"]. Однако уровень экспрессии гена SUP45 изменяется в противоположную сторону: в штамме [/£Р+] количество мРНК SUP45 снижено в 1,25 раза. Наименьший уровень экспрессии обоих генов наблюдали в штамме sfplA. Таким образом, транскрипция по крайней мере одного из двух генов, кодирующих факторы терминации трансляции, гена SUP35, в штамме [ISP *"] усилена по сравнению с двумя другими штаммами, использованными в этом эксперименте.

Известно, что изменения в уровне транскрипции генов не всегда прямо коррелируют с изменениями в количестве соответствующих белков. Поэтому на следующем этапе работы мы оценили количество белков Sup35 и Sup45 в этих же штаммах с помощью вестерн-блот анализа и показали, что различия в количестве белков Sup35 и Sup45 между штаммами [/5Р+], [isp~\ и sfplA коррелируют с различиями в уровне мРНК (Рис. 1А, 1Б).

А

Sup35p —У i

тотальный белок

Sup45p ■

- ..

Л*

/

тотальный белок

Рисунок 1. Количество белков Sup35 (А) и Sup45 (Б) различается в штаммах [/5'Р+], [¿sp"] и sfplA. Цифрами

представлено отношение интегральной оптической плотности полос на пленке, характеризующей штаммы [ISP+] и sfplA, к контролю, штамму [мр~].

2.0

0,8

0,8 : 1 : 0,1

Таким образом, можно предположить, что изменение фенотипа штамма с супрессорного (Sup+) на несупрессорный (Sup), наблюдаемое при возникновении [/5Р+], связано с увеличением количества белка Sup35 (eRF3).

2. Сверхэкспрессия мутантной аллели гена SUP35 приводит к антисупрессии

Понятно, что увеличение количества фактора терминации трансляции может повысить эффективность этого процесса. Вместе с тем, необходимо подчеркнуть, что функция белка Sup35 в использованных штаммах частично нарушена, поскольку он синтезируется под контролем мутантной аллели sap35-25. Ранее показано, что эта мутация снижает эффективность считывания стоп-кодонов всех трех типов (Volkov et al., 2002). Чтобы проверить, может ли увеличение количества мутантного белка Sup35 компенсировать дефект нарушения терминации трансляции, мы трансформировали штамм 25-25-2В-П3982 [isp~] мультикопийной плазмидой pRSU3-25, несущей аллель sup35-25.

Фенотипический анализ трансформантов показал, что экспрессия аллели sup35-25 с мультикопийной плазмиды приводит к изменению фенотипа штамма с Sup" на Sup" (Рис. 2А). Вестерн-гибридизация с использованием антител SE90, опознающих Sup35p, показал, что количество Sup35p у этих трансформантов действительно увеличено (Рис. 2Б).

Sup35-25p

pRSU3-25 pRS425

Рисунок 2. Экспрессия мутантной аллели хир35-25 с мультикопийной плазмиды рК8Ш-25 приводит к антисупрессии (А) и к значительному увеличению количества белка Эир35 (Б). Плазмида рЯ5425 использована в качестве контроля.

Таким образом, хотя замена ТЬг378—»Не в белке Бир35 приводит к снижению эффективности терминации, увеличение количества мутантного белка 8ир35 компенсирует это снижение. Следовательно, антисупрессия, наблюдаемая при возникновении [75Р ], также может быть следствием увеличения количества белка, синтезируемого под контролем аллели зир35-25.

3. Влияние сверхэкспрессии гена 5'FP^ на проявление мутаций sup35 и$ир45

В соответствии с критериями прионного наследования, сверхэкспрессия гена 5/7Р/, являющегося структурным геном приона [/£Р+], в штаммах [/.у/У] приводит к индукции этого приона. Однако ранее в работах нашей группы показано, что антисупрессорный эффект, связанный со сверхэкспрессией ЪРР1, не всегда обусловлен возникновением [1БР ], поскольку примерно у четверти трансформантов элиминация плазмиды, несущей БРРР приводит к восстановлению исходного супрессорного фенотипа (И^ога е( а1., 2008). Снижение эффективности нонсенс-супрессии в результате повышения продукции белка 8ф1 может рассматриваться как указание на прямое или косвенное участие этого белка в регуляции терминации трансляции. Штамм, на котором было показано, что сверхэкспрессия приводит к возникновению

приона [1БР ], содержит нонсенс-супрессорную мутацию $ир35-25 и криптическую мутацию зир45-400. Ранее прион [75Р+] был обнаружен также в штамме, несущем нонсенс-супрессорную мутацию зир35-10 и криптическую мутацию зир45-75 (Уо1коу е/ д/., 2002; Аксенова и др., 2006). Для расширения представления о влиянии гена на терминацию трансляции необходимо

проанализировать эффекты сверхэкспрессии гена БРР1 в штаммах, несущих другие комбинации аллелей 5С/Р55 и БиР45.

Для этого мы использовали штамм 21-Д863, содержащий дизрупцию хромосомной копии гена 5С/Р35 и компенсирующую эффект дизрупции центромерную плазмиду рУСТ-Ш2, несущую аллель БиР35 дикого типа. Отличие этого штамма от использованных ранее заключается также в том, что он несет аллель дикого типа гена БиР45, что было специально подтверждено секвенированием. Этот штамм мы трансформировали плазмидами серии pR.SU!, несущими мутантные аллели 811Р35\ $ир35-10, 8ир35-25, зир35-228 и зир35-240 (см. табл. 2) После этого проводили элиминацию плазмиды рУСНи2, пассируя клетки на полной среде УЕРБ. Полученные штаммы, несущие мутации Бир35 на плазмиде рЯБШ, трансформировали мультикопийными плазмидами рЯ8426-8РР1 и рЯ8426 (в качестве контроля). Далее трансформантов оценивали по эффективности супрессии. Мы обнаружили, что у всех трансформантов происходит снижение эффективности нонсенс-супрессии при сверхэкспрессии ЯРР1 (Рис. 3). Правда, все исследованные штаммы в той или иной степени демонстрировали снижение скорости роста при сверхэкспрессии БРР1, поэтому в некоторых комбинациях нонсенс-мутаций и мутаций $ир35 ослабление роста было обусловлено, по-видимому, обеими причинами. Тем не менее, в некоторых комбинациях

супрессорной и супрессируемой мутаций, как, например, Бир35-240 и ас1е1-14, снижение эффективности нонсенс-супрессии было очевидно и само по себе. Таким образом, сверхэкспрессия БРР1 приводит к снижению эффективности супрессии, вызванной различными по своей природе (нонсенс- и миссенс-) мутациями Бир35.

SC-Ura SC-Ura-Ade SCHLTra-His SC-Ura-Lys

Рисунок 3. Наличие мультикопийной плазмиды рК8426-8РР1 приводит к снижению эффективности супрессии мутаций ас1е1-14, А«7-/, /у^2-90 в штаммах, несущих различные аллели 5С1Р35. Штамм, несущий плазмиду с геном $£/Р35 дикого типа, обозначен как «д.т.»; штаммы, несущие плазмиды с мутантными аллелями ь-ир35-10, яир35-25, л-ир35-228, ¿-ир35-240, обозначены цифрами 10, 25, 228 и 240, соответственно. Здесь и далее представлены пять последовательных пятикратных разведений (концентрация клеток уменьшается слева направо). Знаком «0» здесь и далее обозначена контрольная плазмида рЯБ426; плазмида р115426-8РР1 обозначена как «^РУ».

Для того чтобы выяснить, обусловлено изменение фенотипа трансформантов увеличением копийности гена SFP1, или оно является следствием возникновения в таких клетках прионной формы Sfplp, мы элиминировали плазмиду pRS426-SFPl, пассируя клетки на полной среде YEPD. Дальнейший анализ клонов, потерявших плазмиду с геном SFP1, показал, что супрессорный фенотип восстановился у всех отобранных клонов, несущих мутации sup35-240, sup35-25, sup35-228 (в каждом случае было проанализировано не менее 60 клонов). Следовательно, сверхэкспрессия гена SFP1 в этих штаммах приводит к снижению эффективности нонсенс-супрессии, не связанному с возникновением прионного детерминанта [ISP1].

Вместе с тем, в случае штамма, несущего мутацию sup35-10, 4 клона из 100 проанализированных сохранили несупрессорный фенотип после потери плазмиды. На рисунке 4 представлено по одному клону обоих типов (восстановивших фенотип Sup+ и сохранивших фенотип Sup" после элиминации плазмиды).

1 '^fifCl

2 {35ЖГ

Рисунок 4. Фенотип Sup' сохраняется у некоторых клонов, несущих мутацию sup35-10, после потери плазмиды с геном SFP1. Здесь и далее элиминация плазмид, которые содержались в клетках исследованных штаммов, отражена путем перечеркивания их названий. (1) — клон, утративший плазмиду pRS426 (контроль), (2) - клон, утративший плазмиду pRS426-SFPl и восстановивший фенотип Sup+, (3) - клон, утративший плазмиду pRS426 и сохранивший фенотип Sup .

Одной из функций гена 5РР1 является контроль размера клеток. Показано, что размер клеток штамма, несущего делецию гена £№7, на 40% меньше, чем размер клеток штамма, несущего нормальную аллель ЖР7 (7огдешсп е/ а1, 2002). В работах нашей группы показано, что клетки штамма [7ХР"1 несколько превышают по размеру клетки штамма [1чр] (И^ога в? а1., 2010). В связи с этим, мы решили проверить, отличаются ли по размеру клеток клоны, предположительно содержащие [75Р+], от клонов, прошедших через процедуру пассирования на среде с универсальным антиприонным агентом -хлоридом гуанидина (СиНС1). Мы обнаружили, что размер клеток до и после пассирования на среде с ОиНС1 статистически значимо различается (Рис. 5).

*** ***

!----------! г

Рисунок 5. Средняя площадь клеток исходного штамма, несущего sup35-10 (1), клона, сохранившего фенотип Sup" после элиминации плазмиды pRS426-SFPl (2) и восстановившего фенотип Sup+ после пассирования на среде с GuHCl (3). Приведены ошибки средних. *** - р<0.001.

Эти данные также подтверждают вывод о том, что в штамме, несущем мутацию sup35-10, временное повышение экспрессии гена SFPI привело к возникновению наследственного детерминанта, схожего по своему проявлению с прионом [AS"P+]. Анализ последовательности гена SUP45 из двух клонов, сохранивших фенотип Sup" после потери мультикопийной плазмиды, показал отсутствие отличий от опубликованной последовательности гена SUP45 дикого типа штаммов Петергофских генетических линий (Mironova et al., 1995). Это означает, что возникновение [7£Р+] возможно и в отсутствие криптических мутаций в гене SUP45, однако эффективность образования приона в этом случае, по-видимому, ниже, чем в случае комбинации мутаций sup35-25 и sup45-400, либо sup35-10 и sitp45-75.

Таким образом, проявление мутаций вир35 модифицируется при сверхэкспрессии SFP1, причем эта модификация может быть обусловлена как прионизацией белка БТр1, так и сверхпродукцией его нормальной изоформы. В обоих случаях эта модификация проявляется на фенотипическом уровне как снижение эффективности нонсенс-супрессии.

Ранее мы показали, что в присутствии детерминанта [75Р+] уровень транскрипции гена 811Р35 и продукции белка 8ир35 выше, чем в штамме [кр~]. Сходство фенотипических эффектов ' ] и повышенной продукции белка Sfpl позволяет предположить, что в штаммах [игр"], сверхпродуцирующих Э1р1р, экспрессия гена 5'1/Р35 также повышена. Для проверки этого предположения мы трансформировали штамм 21-Д863, несущий аллель гена 511Р35 дикого типа, мультикопийными плазмидами р118426-8РР1 и рЯ8426 для контроля. Оценка количества мРНК гена 5ЬР35, проведенная с помощью ПЦР в режиме реального времени, показала, что ее количество в клетках, сверхэкспрессирующих БРР1, увеличено по сравнению с контролем. Этот результат воспроизводился в каждой из трех повторностей, однако из-за большого разброса значений порогового цикла в случае различных биологических повторностей, подтвердить эти данные статистически не удалось. Очевидно, в этом случае требуется большее, чем обычно, количество повторностей. Тем не менее, вывод об усиленной экспрессии гена ШР35 в клетках штамма [/&°+] был подтвержден в эксперименте по оценке количества белка Бир35 с помощью вестерн-блот-гибридизации (Рис. 6). Таким образом, сверхэкспрессия гена БРР1 повышает количество белка 8ир35, а на фенотипическом уровне снижает эффективность супрессии, обусловленной мутациями зир35.

0 т жга»г

Рисунок 6. Количество ЭирЗбр увеличено при сверхэкспрессии ,!>№/ в штамме 21-Д863, несущем аллель 817Р35 дикого типа. Использовалась мультикопийная плазмида рК8426-8РР1 ("Г^РУ) и рКЭ426(0) ^ (контроль). Цифрами представлено отношение интегральной оптической плотности полос, характеризующей штамм со сверхэкспрессией к тому же показателю в контроле.

1 : 2,1

После этого мы проанализировали влияние сверхэкспрессии SFP1 на проявление мутаций в гене SUP45. Для этого был использован штамм 1А-Д1628, несущий нонсенс-мутации adel-14 и trp1-289. В этом штамме мы провели замену плазмиды pRS316, несущей аллель дикого типа гена SUP45, на серию плазмид pRS315, несущих мутантные аллели sup45. Среди этих аллелей было пять аллелей с нонсенс-мутациями (sup45-101, -102, -104, -105, -107) и две аллели с миссенс-мутациями (sup45-103 и -116) (см. табл. 2). Последующий

Sup35 —

тотальный балок

анализ фенотипа отобранных клонов показал, что все мутации зир45, проклонированные в составе плазмиды рЯ8315, проявляют супрессорный эффект по отношению к нонсенс-мутациям ас1е1-14 и ¡гр 1-289.

Полученные штаммы трансформировали плазмидами р Я 8426-5 К Р 1 и рК5426. Мы обнаружили, что повышенная экспрессия гена 8РР1 по-разному влияет на проявление мутаций Бир45. В случае штаммов, несущих нонсенс-мутации зир45, отмечалось ослабление эффективности нонсенс-супрессии практически во всех комбинациях мутаций эир45 и супрессируемых мутаций. В случае штаммов, несущих миссенс-мутации зир45, наблюдался разный эффект по отношению к мутациям ас1е1-14 и &р1~289 (Рис. 7).

Следует отметить, что штаммы, несущие плазмиду р118426-8РР1, практически во всех случаях демонстрировали более слабый рост на полной среде по сравнению с контролем. Таким образом, как и в случае мутантов зир35, регистрируемый на селективных средах фенотип является отражением двух эффектов: снижения жизнеспособности и изменения эффективности

Рисунок 7. Сверхэкспрессия ЗРР1 0 приводит к разным фенотипическим \SFPi эффектам на фоне различных аллелей 31/Р45. Представлены результаты Ф фенотипического анализа штаммов, - <;рр] несущих: (А) БиР45 дикого типа; (Б) нонсенс-мутантные аллели ь-ир45; (В)

® миссенс-мутантные аллели яир45.

Т 5РР1

0 *

0

\SFPi 0

0

ТЛ№/ 0

После потери плазмиды, несущей 8РР1, у всех клонов восстанавливался первоначальный супрессорный фенотип. Таким образом, наблюдаемая при трансформации мультикопийной плазмидой рЯ8426-8РР1 антисупрессия обусловлена повышением количества белка БТр 1 и не связана с возникновением приона |75Р+].

нонсенс-супрессии.

ВС-Хл-а 8С-Ига-А<1е ЙС-Вта-Тф

А

На следующем этапе мы оценили влияние повышенной экспрессии гена SFP1 на уровень белка Sup45 в производных штамма 1А-Д1628, несущих аллель SUP45 дикого типа, а также мутантные аллели sup45-104 (несет стоп-кодон UAA) и sup45-116 (несет миссенс-мутацию). Вестерн-блот анализ показал, что сверхэкспрессия SFP1 не влияет на количество белка Sup45 в штаммах, несущих аллель дикого типа SUP45 и миссенс-мутацию sup45-116. В штамме с нонсенс-мутацией sup45-104 сверхэкспрессия SFP1 приводит к увеличению количества фрагмента белка Sup45, образующегося при терминации трансляции на стоп-кодоне, возникшем вследствие мутации. Количество полноразмерного Sup45p в этом штамме такое же, как в контроле, при нормальном уровне экспрессии SFP1 (Рис. 8А). Увеличение количества фрагмента Sup45p, синтезируемого под контролем аллели sup45-104, говорит о повышении эффективности терминации трансляции при сверхэкспрессии SFP1. Об этом же свидетельствует снижение эффективности супрессии, зарегистрированное у этого мутанта при сверхэкспрессии SFP1. Вместе с тем, образующийся в результате преждевременной терминации трансляции фрагмент белка Sup45 не может обеспечить нормальную терминацию, поскольку у него отсутствуют 155 С-концевых аминокислотных остатков и, соответственно, сайт связывания со вторым фактором терминации - Sup35p (eRF3) (Eurwilaichitr et al., 1999). Поскольку количество полноразмерного белка Sup45 в этом штамме не увеличивается, мы предположили, что повышение эффективности терминации обусловлено повышением уровня Sup35p в этих штаммах. Проверка этого предположения показала, что при сверхэкспрессии SFP1 количество Sup35p во всех трех проанализированных штаммах действительно увеличено (Рис. 8Б).

А

Sup45p -

титальнын белок

Д.т. 116 104

д.г. 116 104

0 тSFP1 0 гSFP1 0 tiTO JLJSZI. S,.......тжр/ 0 tsm

- Sup45p (фрагмент)

§||f «||Ш|

ЩШ JltiP

11 ¡¡¡Il......|§ х- - -

Sup35p —> МММ тттк

тотальный ¡¡H ...........Йй......i

белокi ■1

¡¡¡H! аИИНв

Рисунок 8. Уровень белков Эир45 (А) и 8ир35 (Б) при сверхэкспрессии 5ГР1 в штаммах, несущих различные аллели гена 51/Р45. Знаком «*» отмечена зона неспецифической гибридизации с антителами.

Таким образом, сверхэкспрессия БРР1 не изменяет количество белка 8ир45, а ее влияние на проявление нонсенс-мутаций яир45 обусловлено изменением количества белка 8ир35.

В то же время в случае штаммов, несущих миссенс-мутантные аллели

БиР45, повышенная продукция белка 8ир35р не приводит к снижению эффективности супрессии, то есть к увеличению эффективности терминации трансляции. Можно предположить, что мутантный белок 8ир45 в этом случае характеризуется сниженным сродством к стоп-кодону, поэтому увеличение количества Бир35р не приводит к повышению эффективности терминации.

4. Анализ продукции белков 8ир35 и 8ир45 в штамме, несущем делецию гена БРР1 или нормальную аллель этого гена

При исследовании роли гена в поддержании детерминанта [7£Р+]

обнаружено, что помимо необратимой элиминации [7£Р+], делеция БРР1 сама по себе приводит к слабой нонсенс-супрессии (И^ога ег а1., 2008). Кроме того, как показано в данной работе, количество белков Бир35 и Бир45 в штамме 25-25-2В-П3982, несущем делецию БРР1, снижено (см. п. 1). Вероятно, это является причиной повышения эффективности считывания стоп-кодонов, что проявляется на фенотипическом уровне как нонсенс-супрессия.

Необходимо отметить, однако, что в упомянутых выше экспериментах использовался штамм, несущий нонсенс-супрессорную мутацию $ир35-25. Поэтому наблюдаемые эффекты отражают модификацию фенотипического проявления мутантной аллели, нарушающей терминацию трансляции. Для более полной характеристики эффектов делеции гена 5РР7, было интересно посмотреть, как делеция БРР1 влияет на экспрессию генов ЗЬР35 и 5ЬР45 в отсутствие мутаций в этих генах. С этой целью был использован штамм 1Б-Д1606, несущий делецию гена БРР1 и нонсенс-мутации ас1е1-14 (ЦХЗА), (ЦАА), 1уз9-А21 (иДО) и ¡гр 1-289 ШЛО). После этого сравнили фенотипы исходного штамма и штамма с делецией гена БРР1. Эффективность супрессии оценивали методом посева с разведениями. Мы обнаружили, что делеция 8РР1 приводит к нонсенс-супрессии по отношению ко всем четырем нонсенс-мутациям (Рис. 9).

Рисунок 9. Делеция гена (здесь и далее

обозначено как Д») приводит к повышению 5РР1 эффективности супрессии мутаций ас1е1-14, Л/я7-2, ф!А 1уз9-Л21 и /гр1-289 по сравнению со штаммом, несущим нормальную аллель гена ^Р/ (здесь и далее обозначено как «бТ-РУ»),

УЕРО У.\

БС

5!7Р1

ЗС-Ас1е

ЭС-Тгр

БС-Луз

ф1А ЬТР] ф!А

5РР1 з/р1А

ф1А

Затем мы показали, что нонсенс-супрессорный эффект делеции гена 577Р1 связан со снижением уровня экспрессии генов 5иР35 и 511Р45. Это было показано как в отношении мРНК, транскрибируемой с этих генов (Рис. 10), так и в отношении белков Эир35 и 5ир45 (Рис. 11). Следует отметить, что при оценке количества мРНК гена ЯиР45 из-за большого разброса значений порогового цикла в независимых биологических повторностях, подтвердить эти данные статистически не удалось. Тем не менее, во всех повторностях зарегистрировано уменьшенное количество мРНК генов 5С/Р35 и 5С/Р45 в клетках с делецией БРР1 по сравнению с контролем.

АСЧ

отношение медиан

зирзз

ЯРР1 ф!Л

0,13

ДСд-<

ЯиР45 ЯРР1 ¡¡ЫА

0,5

Рисунок 10. В штамме 1Б-Д1606, несущем делецию БРР1, количество мРНК генов 5?7Р35 (А) и 31/Р45 (Б) снижено по сравнению со штаммом, несущем нормальную аллель ЭРРР На оси ординат (АСц) отложена разница между значениями критического цикла для исследуемого гена и референсного (АОШ) в логарифмическом масштабе, а каждая точка обозначает одну биологическую повторность. Цифрами представлено соотношение медиан выборок. * - различия статистически значимы (р < 0,05, критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

вир35р-

тотальный белок

Б ^

ДЬ-

- 8ир45р рисунок ц Делеция гена 57'Р1 приводит к снижению количества белков 3ир35 и 5ир45 по сравнению со штаммом, несущим нормальную аллель гена.

2,0

1,8

Заключение

Характеристика

эффектов сверхпродукции и прионизации

транскрипционного фактора 8ф1, а также делециии кодирующего его гена БРР1, позволила установить, что белок является позитивным регулятором

экспрессии гена ,!>1/Р35. Увеличение количества белка 5ир35 в штамме [75Р+] и в штаммах со сверхэкспрессией £/*Р/ объясняет природу антисупрессии, регистрируемой в этих штаммах. Роль белка 8ф1 в регуляции экспрессии гена менее очевидна и, по всей видимости, опосредована белком БирЗб. В качестве иллюстрации, подводящей итоги исследования зависимости экспрессии генов 511Р35 и 811Р45 от уровня экспрессии гена БРР1 и прионизации белка можно предложить схему, представленную на

рисунке 12.

Рисунок 12. Уровень экспрессии генов 5ОТ55 и 5иР45 зависит от статуса белка ЗГр1. Черными сплошными соединительными линиями показано негативное влияние на экспрессию, а черными пунктирными линиями со стрелкой — позитивное. Серая линия показывает, что достоверного влияния на

'ЪиР45

уровень экспрессии 51/Р45 зарегистрировано не было.

Полученные в работе данные дополняют существующие представления о генетическом и эпигенетическом (прионном) контроле точности трансляции у дрожжей.

ВЫВОДЫ

1. В штамме, содержащем прионную форму белка 8ф1, детерминант [/£Р+], повышен уровень экспрессии гена 811Р35 и снижен уровень экспрессии гена 5'иР45, что проявляется как на уровне мРНК этих генов, так и на уровне соответствующих белков.

2. Увеличение количества мутантного белка 8ир35, синтезируемого под контролем аллели БиР35, несущей миссенс-мутацию, может приводить к снижению эффективности нонсенс-супрессии, что свидетельствует о компенсации нарушения терминации трансляции.

3. Снижение эффективности нонсенс-супрессии в присутствии прионного детерминанта \1БР ] обусловлено увеличением количества фактора терминации трансляции 8ир35р (е!1РЗ).

4. Экспрессия гена ЯРР1 с мультикопийной плазмиды снижает эффективность нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями вир35. В отношении мутаций это влияние носит аллеспецифичный характер.

5. Снижение эффективности нонсенс-супрессии при повышении экспрессии гена 57<Р/ сопровождается увеличением количества белка Бир35 при сохранении количества белка Бир45.

6. Делеция гена БРР1 приводит к нонсенс-супрессии и сопровождается значительным снижением уровня экспрессии генов БиР35 и 5(7Р45 и, соответственно, уменьшением количества белков 8ир35 и 8ир45.

7. Полученные данные позволяют утверждать, что ген ЗРР1 вовлечен в контроль терминации трансляции путем регуляции синтеза фактора терминации 8ир35 (е!1РЗ).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Drozdova P., Rogoza Т., Radchenko Е., Lipaeva P., Mironova L. Transcriptional response to the [757>+] prion of Saccharomyces cerevisiae differs from that induced by the deletion of its structural gene, SFP1 // FEMS Yeast Research. 2014. doi: 10.1111/1567-1364.12211.

2. Дроздова П.Б., Радченко Э.А., Рогоза T.M., Хохрина М.А., Миронова JI.H. Ген SFP1 контролирует терминацию трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae путем регуляции количества белка Sup35 (eRF3). // Молекулярная биология. 2013. Т. 47. №2. С. 275-281.

3. Radchenko Е., Rogoza Т., Khokhrina М., Drozdova P., Mironova L. SUP35 expression is enhanced in yeast containing [7£P+], a prion form of the transcriptional regulator Sfpl // Prion. 2011. V. 5 №4. P. 317-322.

4. Иванов M.C., Радченко Э., Миронова Л.Н. Белковый комплекс Ppzlp/Hal3p и эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae И Молекулярная биология. 2010. Т. 44. №6. С. 1018-1026.

5. Иванов М.С., Аксенова А.Ю., Бурдаева Я.В., Радченко Э.А., Миронова Л.Н. Сверхэкспрессия гена PPZ1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет на эффективность нонсенс-супрессии // Генетика. 2008. Т. 44. №2. С. 177-184. Тезисы:

1. Polina Drozdova, Tatiana Rogoza, Elina Radchenko, Polina Lipaeva, Ludmila Mironova. How does [75P+], the prion form of Sfplp, control gene expression? // EMBO Conference «Gene transcription in yeast: From regulatory networks to mechanisms» (SantFeliu de Guixols, Spain). 2014. P. 81.

2. Дроздова П.Б., Липаева П.В., Рогоза T.M., Радченко Э.А., Миронова Л.Н. Прионизация белка Sfpl регулирует экспрессию гена SUP45 у дрожжей // VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону). 2014. С. 56.

3. Radchenko Е.А., Drozdova Р.В., Rogoza Т.М., Mironova L.N. Identification of prion domain in Sfpl protein in Saccharomyces cerevisiae // 26th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology (Frankfurt/Main, Germany). 2013. V. 30. P. SI 17.

4. P. Drozdova, E. Radchenko, T. Rogoza, P. Lipaeva, L. Mironova. Sfpl prion conversion is not equal to the absence of this yeast protein // 38th FEBS Congress (Saint-Petersburg, Russia). 2013. P. 76.

5. Polina Drozdova, Elina Radchenko, Tatyana Rogoza, Polina Lipaeva, Ludmila Mironova. Prion switch of the Sfpl protein dramatically changes transcription profile in yeast // Conference «Protein misfolding in disease: molecular processes and translational research toward therapy» (Roscoff, France). 2013. P. 48.

6. Радченко Э.А., Дроздова П.Б., Рогоза T.M., Хохрина М.А., Миронова Л.Н. Идентификация прионного домена в белке Sfpl у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // V международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород). 2012. С. 3.

7. Дроздова П.Б., Радченко Э.А., Рогоза Т.М., Хохрина М.А., Миронова J1.H. Прионизация белка Sfpl у дрожжей Saccharomyces cerevisiae зависит от генотипического фона штамма // 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино). 2012. Р. 102-103.

8. Radchcnko Е., Rogoza Т., Drozdova P., Khokhrina М., Mironova L. Antisuppression caused by [/5Р+] prion is determined by the increased amount of Sup35p (eRF3) // 25lh International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology (Olsztyn, Poland). 2011. P. S133.

9. Drozdova P., Radchenko E., Khokhrina M., Rogoza Т., Mironova L. Effects of SFP1 overexpression in Saccharomyces cerevisiae strains containing sup35 and sup45 nonsense suppressor mutations // Conference «Non-Conventional Yeast in the Postgenomic Era» (Lviv, Ukraine). 2011. P. 12.

10. Ivanov M.S., Radchenko E.A., Mironova L.N. Phosphatase Ppzlp influences the efficiency of nonsense suppression by pathways distinct from the dephosphorylation of the elongation factor EFlBu in yeast Saccharomyces cerevisiae II 12th International Congress on Yeast (Kyiv, Ukraine). 2008. P. 145.

Подписано в печать 31.10.2014 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 2,25 Тираж 100 экз. Заказ 486

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А