Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ферментов лизосом в формировании иммунного ответа при различном характере питания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ферментов лизосом в формировании иммунного ответа при различном характере питания"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи УДК: 577.156—576.8.097.3—612.39

КОНОВАЛОВА Любовь Сергеевна

РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ ЛИЗОСОМ В ФОРМИРОВАНИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ РАЗЛИЧНОМ ХАРАКТЕРЕ ПИТАНИЯ

(03.00.04 — Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1988

Работа выполнена в лаборатории энзииологии шггания клститута питания АМН СССР

Научный руководитель -профессор, доктор медицинских наук - В.А.Тутельян

Официальные оппоненты: профессор,доктор медицинских наук Е.А.Строев профессор, доктор биологических наук В.А.Березин

Ведущее учреждение - Институт биологической с медицинской химии АМН СССР

Защита диссертации состоится ■ 1989 г.

в " часов на заседании специализированного Совета Д.001.02.01 щи Институте питания АМН СССР (Москва 109240, Устьинский проезд, 2/14)

С диссертацией иагно оз пак смяться в библиотеке Института питания АМН СССР

Автореферат разослан шШ :.ЩуУ- 1989 г

Ученый секретарь о Совета

специализированного Совета

Л-137-Ю Подл, к печати 23/ц' 198<5 г. Ф.П.Л. 1,5 Тираж /¿>0

Типография ХОЗУ Мнннефтепроы». -Зок. 3*07

.. . .. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Различные видц пищевых дисбалансов (белковая и белново-энергетическая недостаточность, аминокислотный дисбаланс, дефицит витаминов и др.) изменяют устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды, воздействуя на различные звенья иммунной защиты (Р.В.Петров, 1Ъ&$№СЬопсЬа, РР&С/юпска, 1986).Поскольку образование антител и их деградация может рассматриваться как частный случай синтеза и катаболизма белка, следует учитывать,что начальные этапы деградации биополимеров эндогенного и экзогенного происхождения и, в частности, белковой природы обеспечиваются ли-зосомальным аппаратом клетки, причем скорость деградации белка в значительной степени определяется как характером питания, так и функциональным состоянием комплекса лизосомалышх протеиназ (А.А.По кровский, В.А.Тутелъян 1976; В.А.Тутельян и др. 1980\JhtxnwbJЫрС. 1984; М.Н.Волгарев 1984; Л.Е.Панин, Н.Н.Маянская 1987). Таким образом, есть все основания полагать, что структурно-функциональные изменения лизосом могут в существенной степени влиять на процесс иммуногенеза в организме животных и человека 1984;

(п7е&еп1аС. 1984).

Однако детальное изучение особенностей функционирования специализированных ферментных систем лизосом в отдельных органах и типах клеток в ответ на изменение качествешюго и количественного состава пищи, а также изучение взаимосвязи реакции этих сЕериентных * систем с реакцией иммушюй системы носит весьма ограниченный характер, тогда как расшифровка этих механизмов необходима для формирования представлений об основных биохимических процессах, лежащих в реакциях иммуногенеза, закономерностей биологической адаптации организма к характеру питания, разработке научного обоснования

алиментарной коррекции иммунологических нарушений.

1-ЗИ0 7

Целъ и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение функционального состояния протеолити-ческой системы лизг"ом и скорости обновления белка в различных органах крцс с.интенсивностью иммунного ответа при изменении характера питания.

8 связи с этим в настоящей работе были определены следующие задачи:

- изучить активность лизосомальных протепназ (катепсинов А, В,С и 0 ) и интенсивность обновления белка в печени и иммунокомпе-тентных органах крыс при антигенной стимуляции (АС); .

- изучить влияние АС на особенности структурно-функционального состояния лнзосомалыгого аппарата на фоне голодания и белковой недостаточности;

- изучить структурно-функциональное состояние лизосомального аппарата при иммунодепрессивном состоянии, вызванном дефицитом витамина В6 (пиридоксина);

- изучить структурно-функциональное состояние лизосомального аппарата на фоне лммуномодулирувдего действия витамина А.

Новизна п научно-практическая значимость работы. Выявлено избирательное увеличение активности тиоловых протеиназ - катепсинов В к С в селезенке крыс при антигенной стимуляции эритроцитами барана, что свидетельствует об участии лизосомальных протеиназ этой группы в реализация иммунного ответа.

Получены доказательства участия лизосомальных протеиназ в регуляции скорости обновления белка, вираяшждаеся в существовании прямой коррелятивной зависимости мезду временем полужизни белка (Т-^.сут.) и изменением активности ферментов во всех исследованных органах при голодании, белковой недостаточности и дефиците пиридоксина.

-з-

Показано, что иммуностимулирующее действие избыточных доз витамина А на фоне антигенной стимуляции вызывает увеличение активности всего комплекса исследованных лизосомалышх протеиназ в им-цунокомлетентных органах а дестабилизацию мембран лизосом.

Установлено, что один из путей регулирующего действия алиментарного фактора на иммунный ответ организма реализуется через механизм лизосомального протеолиза.

Полученные результаты могут служить научным обоснованием для разработки путей коррекции иммунных нарушешй за счет направленного использования алиментарных факторов, а также при помощи соответствующих ингибиторов или активаторов ферментных систем, ответственных за регуляцию иммунного ответа.

Апробация работы проведена па совместной конференции Отдела биохимии и физиологии питания с лабораторией энзимологии питания Института питания АМН СССР. Результаты исследования были доложены на международном симпозиуме "Лизосомы в биологии, патологии и биотехнологии" в Софии (1986г.), на конференции молодых ученых Карагандинского Государственного медицинского института (1986г.), на Республиканской конференции молодых ученых Грузинской ССР (1986г.) и на конференции молодых ученых Инстиута питания АМН СССР (1988г.).

Публикации. Материалы исследования изложены в 7 печатных работах.

Структура и объем диссертации.Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, обоснования цели и методов исследования, экспериментальной части, включающей изложение материала и методов исследования,результатов исследования и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего источников. Работа изложена на /^страницах и включает таблиц и рису!шов.

МАТЕЕШЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар. Всего в работе било использовано около 500 животных.

Гомогенаты органов готовили по стандартной методике, с предварительным измельчением ткани и продавливанием через перфорированную пластину с диаметром отверстий I mi, используя в качестве суспендирующей среды 0,25 М раствор сахарозы рН 7,4, содержащей I мМ ЭДГА, в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма (1200 об/мин, 90 сек) с тефлоновым пестиком (зазор 0,21). Выделение субклеточных фракций из гомогенатов проводили с помощью дифференциального центрифугирования по методу Де Дюва и сотрЛС. Je Dure- »fot., 1955).Получали 5 фракций: ядерную (600^-мин), митохондриальную (3 300 д-тн), ли-зосшальную (10 ООО ^ • мин), микросомальную (100 ООО j - мин) и цито-зол. Все процедуры проводили при 0-2°С.

При постановке метода локального гемолиза селезенке гомогенизировали на холоду в 5 мл однократного раствора Хенкса(рН 7,4) с помощью стеклянного гомогенизатора Поттера-Эльвейма и фильтровали через дедероновую сеточку.

В гомогенатах тканей определяли активность 4 лизосомальных протеиназ - катепсина А (КФ 3.4.12АЛ), В (КФ 3.4.22.1), С (КФ 3. 4.14.I) с использованием спектрофлюориметрпческого метода (А.В.Васильев и др.1983) и катепсина D (КФ 3.4.23.5) с помощью модифицированного спектрофотометрического метода (А.Д.Баррет А.Д.,М.Ф.Хит 1980; А.В.Васильев и др.1983). Кроме этого, в гомогенатах определяли активность арилсульфатаз А и В (КФ 3.I.6.I) спектрофотометричес-кпм микрометодом (А.А.Покровский,1969). Активность ферментов выражали в мкмолях продуктов гидролизата соответствующих субстратов, освобожденных за I мик I г белка.

С целью характеристики иммунологического статуса животных про-

всдали определение компломентарной активности сыворотки крови по 5055 гемолизу (Е.Кэбот, М.Мейер 1968), определение количества анти-телообразующих клеток в селезенке модифицированным методом (ЯЛ^м* пе- tf ai, 1963) и определение уровня сывороточных антител к эритроцитам барана с помощью реакции пассивной гемагглтинации.

Все полученные результаты были подвергнуты статистической обработке и выражались как Ш + т). Степень достоверности выявленных различий между анализируемыми показателями оценивались с использованием i-критерия Стьвдента (Л.С.Каминский 1964).

Определение периода полужизни суммарных белков проводили путем внутрибршинного введения крысам за 24 часа, четыре и шесть дней до забоя раствора I-Í^JOL.-лейцина в 0,9% УоС£з дозе 20 мкКи на 100 г масси тела. К образцу исследуемого материала добавляли 5% ТХУ и переносили полученный осадок на мембранный фильтр"Сынпор #2". Радиоактивность белков на мембранных фильтрах определяли в сцинтилляторе, приготовленном на основе толуола, на зшдкосцинтил-ляциотюм счетчике "МСК-ВЕТ/1-1215" (LKB,Швеция). Расчет периода полужизни белков проводили на основании константы деградации, которую определяй! при построении зависимости In удельной радиоактивное ти в исследуемом образце от времени прошедшего с момента введения I-(I4C)0L-лейцина до забоя (R Zak et al , 1979). Статистическую обработку результатов и расчет параметров обновления проводили с использованием стандартных статистических программ "Curve fitting " на микроЭВМ "Hewlett Packard".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I.Изучение активности лиз ос шальных гидролаз в печет и иммуно-коилетентных органах крыс на фоне антигенной стимуляции.

Анализ результатов исследований, проведенных на крнсах,получавших патноцешп^ иощевипарийный рпцион свидетельствует, что АС жя-г-3401

ьотных эритроцитами барана приводит к умеренному снижению активности катепсинов А и 0 в печени (на 21 и 23% соответственно) и активации тиоловых протеигаз лизосом - катепсинов В и С в селезенке (на 23 и 36$). Активность лизосомальных протеиназ в тимусе при АС практически не изменялась(табдЛ).

Табл.1

Активность ферментов в лизосомах печени и иммунокомпетентных органах крыс при антигенной стимуляции (мкмоль/мин/г белка)

Условия Катепсин А Катепсин В Катепсин С Катепсин 0

эксперимента

Контроль 7,38+0,39 1,48+0,08 17,64+1,04 .12,59+0,72

Контроль+АС 5,82+0,33' 1,54+0,10 18,86+0,98 9,63+0,60*

Контроль 5,81+0,31 1,17+0,04 6,12+0,32 15,30+0,36

Контроль+АС 6,21+0,32 1,44+0,07*. 8,34+0,33* 15,23+0,68

Контроль 6,06+0,28 1,16+0,06 4,83+0,26 14,00+0,67

Контроль+АС 6,32+0,31 1,30+0,08 5,85+1,34 15,59+0,76

Примечание. Представлены средние (1.1+т) данные от 24 животных.

*) - р*-0,01

Следует отметить, что обобщенные данные по изменению периода полужизни белка в селезенке свидетельствуют об отсутствии значительных изменений в скорости их обновления при АС. Это позволяет расценивать выявленную активацию катепсинов В и С в этом органе как отражение их специфического участия в формировании иммунного ответа (в частности в реакциях ограниченного протеолиза).

2. Изучение активности лизосомальных гидролаз в печени, селезенке и тимусе крыс при АС на фоне голодания.

Исследование проводили на крысах-си,■щах лиши Вистар с исходной массой тела 250-280г. Крыс опытной группы помещали в индивидуальные клетки с решетчатым дном,' исключающим возможность копрофе-гии, и лишали пищи. Еивотных контрольных групп содерг^али на полно-

ценном общевиварийном рационе (ОР).Воду животные получали Ы ¿/ЫЫтт; причем животные опытных групп вместе с водой получали комплекс водорастворимых витаминов, аналогичный ОР.Крыс забивали декапитацией через 4, С и 8 суток после начала эксперимента. т бл 2

Влияние голодания на продукцию АОК и общую активность комплемента сыворотки

Иммунсд огиче см е показатели Контроль + Срок голодания (дни)+АС

АС 4 6 8

Число АОК на Ю6

спленоцитов 32,3+2,90 15,01+1,45* 4,80+р,41* 21,2+1,9СГ

Активность компле-

мента (СНэд) 38,3+3,70 106,1+10,5" 98,4+10,2* 66,9+3,50*

Примечание.Представлены средние данные (М+m) от 6-8 животных. * ) - р А. 0,001

Как видно из тайл.2, голодание животных приводило к выраженному подавлению иммунного ответа, о чем судили по снижению интенсивности АОК на 54, 85 и 34$ соответственно, что согласуется с имеющимися данными о развитии иммунодепрессии при голодании (CMHohi do£.J985). Наряду с этим было выявлено резкое увеличение общей комплементарной активности сыворотки на 277, 256 и 175$ по отношению к контролю. Учитывая, что голод является стрессовым фактором для организма, вызывающим стимуляцию функциональной активности макрофагов, можно объяснить возрастание комплементарной активности сыворотки, выявлетюе в данном эксперименте - активацией синтеза компонентов комплемента возросшей функциональной активностью макрофагов.

Результаты энзимсдогических исследований представлены на рис.1. В печени крыс, лииенных пищ, обнаружено реципрокное изменение активности катепсиаов A,D и В,С. Причем наибольшее увеличение ак-

АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛШК 1ОДР0ЛАЗ ПРИ АС И ГОЛОДАНИИ ( в % от контроля )

тивности катепсинов А и С отмечено к 8-му дню голодания. При исследовании активности лизосоиалышх протеиназ в селезенке крыс, лишенных пищи обнаружена генерализованная активация всех исследованных лизосоиалышх гвдролаз, прогрессивно возрастающая по мере увеличения срока голодания и составившая к 8-му дню для катепсинов А,В,С и/)- 222, 245, 248 и 146$ соответственно по отношению к контролю. Аналогичная картина наблкдалась в тимусе. АС в печени практически полностью снимала выявленную при голодании активацию катепсинов А • и1>, а в,селезенке уменьшение активности наблюдалось для всех исследованных ферментов.В тимусе иммунизированных животных на фоне краткосрочного голодания выявлена резко выраженная дальнейшая активация всех исследованных ферментов, за исключением катепсина 0 . Увеличение периода голодания снимало эффект активации лизосскальных протеиназ в тимусе.

Табл.3

Период полужизни белка (Т^2>СУТ-5 в печени,селезенке и тимусе крыс при антигенной стимуляции и голодании

Условия эксперимента ' Печень Селезенка Тимус

Контроль 5, ОМ), 28 3,55+0,14 3,91+0,30

Контроль + АС 9,46^0,24* 3,14+0,35 3,94+0,22

4 дня голода 6,72+0,35* .8,97+1,31* 5,44+0;II*

6 дней голода 5,98+0,11* 7,63+0,17* 4,16+0,16

8 дней голода 7,46+1,20 13,35+1,19* В.бО+О.бЗ1*

4 дня голода + ■ АС 4,45+0,28 4,70+0,12* 6,71+0,22*

6 дней голода +■ АС 5,00+0,14 5,63+0,13* 4,76^3,12

8 дней голода + АС 10,99+0,46* 5,55+0,40* 5,58^0,32*

Примечание.Представлены средние данные (М+т) от 6-8 животных,

* ) - р/. 0,01-0,001

Определение Тт/.> суммарных белков в органах (табл.3) показа»1

3^01

-ГО-

ли, что голодание у интактных глвотных вызывало умеренное увеличение Т-^2 ® печени (на 19-49$, р*. 0,05) и весьма существенное в селезенке - в 2,1-3,8 раза В тимусе наиболее значительное увеличение Чу 2 (до 220%) вштлено к 8-му%го голодания. Иммунизация животных, получавших 0Р, не вызывала изменений в интенсивности обновления белков селезенки и тимуса, однако в печени величина возрастала на 88$ (р/-0,01). Привлекает внимание тот факт, что и в печени, и в селезенке АС животных, лишенных пищи, сопровождалась возрастанием скорости обновления белков, о чем свидетельствует достоверное снижение величины 1-Ц2 в ЭТ1ПС органах на 16-34 и 26-48$ соответственно, тогда как в тимусе напротив, к 4-му и к 6-му дню голодания белков несколько возрастал, но к 8-му дат голодания составлял только 65$ от ^1/2 7 неиммунизированных яивотных.

Вероятно, сокращение Тбелков печени и селезенки при голодании и АС, отражает возрастание активности макрофагов ( Е. е.1о1. 1983), а учитывая их участие в синтезе компонентов комплемента и обнаруженное падение активности лизосоыальных протеиназ, выявленное резкое увеличение общей комплементарной активности моано расценить как результат сочетанного усиления биосинтеза и снижения скорости деградации его отдельных компонентов. Еместе с тем, возрастание при АС интенсивности обновления белков в спленоцитах на поздних (8 дней) сроках голодания лежит, по-видимому, в основе относительного увеличения продукции АОК. В свою очередь, выраженная активация протешштичеокой системы лиэосом тимоцитсв мскет быть обусловлена их контактом с антигенным материалом и его последующей модификацией. В тоже время АС снимала индукцию прогесдагтяческой системы лизосом, вызванную длительным голоданием, что можно расценить как комденса-торную реакцию иимунокоипетентша «легок, калраЕлеюдгю на сохранение иммунологического гомеостаза и, ь частпоотя, ка регуляцию меж-

клеточных взаимодействий между макрофагами, Т- и В-димфоцитами, . синтеза антител.

3. Изучение активности лизосомальних протеиназ в печени, селезенке и тимусе крыс при АС и дефиците белка

Исследование проводили на растущих крысах-самцах лиши Вистар с исходной массой тела 190-220г., которые содержались на изокало-рийных рационах, содержащих различ1ше количества белка(18$ белка -контрольная группа и 5% белка - опытная) в течение 45 дней. Рационы включали необходимое количество минеральных веществ и витаминов.

Как показали иммунологические исследования (табл.4), дефицит белка в рационе приводил к резкому - в 3,5 раза - снижению активности комплемента и уменьшению числа АОК более чем в 2 раза. В то

же время титр антител снижался в значительно меньшей степени.

Табл.4

Показатели иммунного ответа у крыс на эритроциты барана на фоне белковой недостаточности

Иммунологические показатели АС АС на фоне белковой недостаточности

Активность комплемен- 71,30 + 7,00*

та (СН^) 240,0 + 18,00

Число АОК на 10 сплено-

цитов 187,1 16,30 72,40 ± 7,20*

Титр антител 3,6 0,22 2,50 + 0,22*

Примечание. Представлены средние данные (М+т) от 8-10 животных. « ) - р 0,001

Результаты знзииалогического анализа представлены на рис. 2, Как видно из рисунка дефицит белка вызывал в печени характерное увеличение активности катепсинов А и й на 27 и 39$ (р*-0,001) с одновременным снижением активности тиолових протеиназ на 22-49$. В селезенке крыс на фоне белковой недостаточности отмочено умеренное

АКТИВНОСТЬ ЛИ30СШ1АЛБНЫХ ГИДРОЛАЗ ПРИ АС НА ФОНЕ.

БЕЛКОВОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ( в % от контроля )

Печень

Селезенка

--- Тимус

; -ТУ - катепсины А,В,С и 0 соответственно; У-арилсульфатазы А и

1 г- котроль + АС; 2 - опыт; 3 - опыт+ АС Представлены средние данные (М + т) от 6-8 животных.

0,05 - 0,001 ■ •

снижение активности всех исследованных ферментов на 15-30$. В тимусе животных этой группы изменения активности ферментов отмечено не было. При АС крыс, находившихся в условиях белковой недостаточности активация катепсинов А и 0 стала более выраженной и составила 47 и 70$ от контроля, а уровень активности тиоловых протеиназ стал близок к контрольным значениям. В селезенке крыс при АС на фоне белковой недостаточности наблюдалась резкая активация тиоловых протеиназ. Как в иммунокомпетентных органах, так и в печени, АС на фоне белковой недостаточности вызывала возрастание активности всех исследуемых ферментов по отношению к группе неиммунизированных животных. ■ •

Анализ изменений относительной удельной активности в субклеточных фракциях печени свидетельствует о типичном характере распределения по фракциям при белковой недостаточности. Так, во фракции лизосом отмечено возрастание ОУА катепсинов А и Р. с одновременным снижением ОУА тиоловых протеиназ. Во фгподиях митохондрий уровень ОУА возрастал, что.является по-видимому отражением усиления процессов аутофагоцитоза. При АС на фоне белковой недостаточности отмечено значительное увеличение ОУА катепсипаР во фракции лизосом, что в определенной степени коррелирует с выявленным наш сокращением суммарных белков в гомогенате печени и во фракции лизоссм. Исследование периода полужизни суммарных белков в гомогенатах печени, селезенки и тимуса крыс показало, что при дефиците белка величина Ту^ возрастала в этих органах на 46-79$ (табл.5). АС животных на фоне нормальной обеспеченности белком приводила к увеличению Т^ -в селезенке на 19$ и в тимусе на 69$, тогда как в печега изменеий не выявлено. В противоположность этому, АС крыс на ионе дефицита белка вонзала сокращение Т^о сушаршгх белков в пет;е:ш

на 22$ и в селезенке на 26$ (ра 0,05) по сравнению с группой животных, содержавшихся на рационе, дефицитном по белку.

Табл.5

Период полужизни белка в печени, селезенке и тимусе крыс при антигенной стимуляции на фоне белковой недостаточности

Условия Период полужизни белка (Т^.сут.)

Печень Селезенка Тимус

Контроль 4,33 + 0,54 2,77 + 0,22 2,57 + 0,19

Контроль + АС 4,62 + 0,62 3,30 ± 0,31 4,33 + 0,27м*

Опыт 6,33 ± 0,57* 4,95 + 0,35*" 3,85 + 0,43*

Опыт + АС 4,95 + 0,35 3,65 + 0,38 3,64 + 0,19**

Примечание. Представлены средние данные (М +т) от 6-6 животных. * )-р 0,05-0,02; •» )- рД0,017 *** )-р 0,001

Заслуживает внимания характер изменения Т^у2 белка в субклеточных фракциях при АС (табл.6). Так, в печени крыс, получавших полноценный рацион, АС сопровождалась увеличением Т^ белков во фракциях митохондрий и лизосом в 2-2,5 раза. В то же время в селезенке животных этой группы снижение скорости обновления белка отмечено прежде всего во фракции митохондрий и макросом (316 и 226$ от контроля) в во фракции лизосом и цитозоля (130 и 148$). АС на фона белковой недостаточности приводила в печени к сокращению Т-да белков лизосом и цитозола с одновременны!.! возрастанием белков митохондрий и макросом. Примечательно, что в селезенке наиболее отчетливые изменения обнаружены во фракциях лизосом, где период полужизни белков возрастал в 3,8 раза.

Вероятно, увеличение активности тиоловых прстеиназ в селезенке при АС на фоне белковой недостаточности обусловлено изменением интенсивности их биосинтеза, свидетельством чего в определенной мере является снижение скорости обновления белков во Фракции лизосом

Табл.6

Лоряод ¡¡счтухизни бгллч о^т.) в субклеточных фракциям печени и селезенки при АС на фоне

* белковой недостаточности ■ • - -

5 Г Еочень Селезенка

Контроль Кснтродь + ли Опыт Опыт + АС Контроль Контроль + АС Опыт Опыт + АС

Ядра 0„56~ 0,25 0,30 " 5,02 + 0,27 5,06 + 0,26 " 3,59 + 0,26 ~ - 7,88 0,73 + -

Йзтехошци® 3,92„+ 9,2о"" 8,65 0,81 " 4,44 + 0,2В " 6,08 + 0,66 ~ 4,99 + 0,26 15,75+ 1,44™ 5,33 0,39 + 3,30 + 0,27 ~

¿¿•„"ч-^сш 0,23 8,69 4 0,71 " 4,15 + 0,14 ~ 3,09 + 0,28 4,71 + 0,26 ~ 6,13 + 0,66 " 4,78 0,40 + 18,24 + 1,85 "

'-Мчрсосш 4,01 + 0,31 у.СЗ + 0( 53 0-26 5,1С 0,31 " 2,31 + 0,21 " 5,21 + 0,44 ~ 3,85 0,28 + 5,29 + 0,46 ~

Штсзах 4>19~± 0,31 3,23 + 0,28 ~ г, йй . С,о4 3.&2 * 2..Ц + 0,24 ~ 3,75 + 0,33 " 4,78 0,30 ± 4,18 + 0,35 ~

данкого органа, йлесте с тем, выраженная реакция кислых тиоловых протеиназ селезенки при иммунодепрессивном состоянии отражает, по-видимому, их превалирующее участие в процессе иммуногенеза по сравнению с другими лизосональными гидролазами.

4. Изучении активности лизосомалышх гидролаз в печени, селезенке и тимусе крыс при АС и дефиците витамина Вд

Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар с массой тела 230-280 г. Животных опытных групп в течете 30 дней содержали на рационе, лишенном пиридоксина. Контрольные животные в течение этого периода времени получали полноценный полусинтетический рацион. Через 30 дней половину животных из контрольных и опытных групп иммунизировали путем однократного внутрибршинного введения 2 мл 20$ суспензии отмытых эритроцитов барана на 100 г массы тела и через 4 дня животных забивали.

Табл.7

Показатели иммушого ответа у крыс на эритроциты барана на фоне дефицита пиридоксина

Иммунологические АС АС на фоне дефицита

показатели пиридоксина

Активность комллемен-

та (Cllgo) 83,40 + 4,80 ' 39,30 + 3,50*

с Число АОК на 10 сплено-

цитов 73,00 + 2,20 8,28 + 3,60*

Титр антител, 3,70 + 0,21 2,30 + 0,11"

Примечание.Представлены средние дшпше (М+m) от 8-10 животных.

* ) - р^ 0,001

Как видно из результатов иммунологических исследований, представленных на табл.7, дефицит пиридоксина приводил к резкому ослаблению иммунного ответа, о чем судили по уменьшении титра антител на 38$ и продукции АОК более чем в 8 раз, а также по снижении компле-

АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛШЫХ ГИДРОЛАЗ ПРИ АС НА «СНЕ ДЕФИЦИТА ШТАМИНА Bg ( в 55 от контроля )

III

U

100

50 О

_ _ U___ Печень

123

123

123

123

123

Ж

123

г

123

123

123

123

123

Селезенка

Тимус

1-1У - катепснны А, В, С в ¡> соответственно,^ - арилсулъЯатаэн

А и В

I - контроль + АС; 2 - опыт; 3 - опыт + АС . Представлены средние (М+m) данные от 6-8 животных. * ) - pi-0.CS - 0,COI

мектаркой активности сыворотки на 53$. Полученные данные полностью согласуются со сведениями о развитии депрессивных состояний при В^-авитаминозе (ЛЕ АяЫ, 1981).

Результаты энзимологического анализа представлены на рис. 3. При В6-авитаминозе в печени обнаружена активация всех исследованных (за исключением катепсина С) лизосомальных гидролаз на 21-43$, тог-га как в селезенке, напротив, обнаружено снижение активности катепсинов А и С на 15 и 23$ соответственно. В тимусе животных этой группы отмечено некоторое увеличение активности катепсина С и арилсуль-фатаз А и В. АС на фоне дефицита пиридоксина в значительной степени изменяла характер реакции лизосомальных гидролаз в ответ на введение антигена. Так, в печени активность всех исследованных ферментов (за исключением катеписна А) была ниже по сравнению с неиммунизирован-ными животными с В6-авитаминозом, а активность тиоловых протеиназ стала даже ниже контрольных значений. В селезенке крыс, при АС на фоне дефицита пиридоксина отмечено лить достоверное увеличение активности катепсина В на 35$, тогда как в тимусе иммунизация Т-зави-симым антигеном вызывала достоверное увеличение активности тиоловых протеиназ и арилсулъфатаз А и В на 15-35$ ( р^-0,01).

Как видно из результатов определения суммарных белков, представленных в табл.8, иммунизация животных, получавших контроль- • ный рацион, вызывала незначительное увеличение "х/2су,'и'гаРнш: йелков в печени и селезенке и более интенсивное обновление белков тимуса. Вместе с тем, Т-^ белков в тимусе крыс с В£-авитаминозом практичесн ки не отличался от контрольных значений. АС животных этой группы . приводила к увеличению белка в печени на ЗЭ$(р^-0,01) и сокращению Гу2 белка в тимусе на 36$ (р*- 0,01).

Табл.8

Период полужизни белка в печени, селезенке и тимусе крыс при АС на фоне дефицита пиридоксина

Условия эксперимента Период полужизни белка (Т-^.сут.) -

Печень Селезнка Тимус

Контроль 5,33 + 0,10 3,30 + 0,09 4,48 + 0,08

АС 6,20 + 0,27** 3,80 + 0,06"Ю 3,67 + О.ОЭ*"'

Дефицит пиридоксина 4,52 + 0,01*** 2,77 + 0,09е" 4,27 + 0,07

АС на фоне дефицита пиридоксина 6,30 + О.О!""' 3,27 + 0,09" 2,75 + 0,03й"

Примечание.Предсташ. нн средние данные (М ±т) от 6-8 животных.

*) -р£ 0,05; **) -р/. 0,01; *»* ) -р 0,001 Результаты иммунологических и энзиматических исследований позволяет сделать вывод о преимущественном участии тестовых протекназ лизооом в формировании иммунного ответа. Так, если выявленная при дефиците витамина Вц активация катепс£г»ов А,В в печени может являться причиной интенсивной деградации ряда низкомолекулярных компонентов комплемента, в следствии чего имеет место снижение общей комплементарной активности сыворотки,то АС на этом фоне приводит к уменьшению активности катепсинов В и С в печени и их активации в тимусе, что находится в прямой зависимости с изменением интенсивности обновления белков в этих органах, о чем можно судить по величине ^1/2* ®сть основания считать, что подавление иммуногенеза и реакция лизасомальных протеиназ находятся в тесной связи с возпикаициш при дефиците пиридоксина нарушениям в синтезе нуклеиновых кислот и белка(Н.РапМ е/ а( ,1971; ¿С ТгаШМ^Мгг/ги/^ЭбЗ). Данное обстоятельство позволяет предполагать,что тиоловые протеиназы лизосом играют существенную рать в иммуногенезе, поскольку тленно с этим типом фердентов связывавт регуляцию однонаправленных биологических процессов, обновления белков,пострансляционного процесспнга (Л.А.Лок-ппна, Э.А.Дилакян 19С6).

5.Изучение активности лизосомалъных гидролаз в печени,селезенке и тимусе крыс при АС на фоне введения избыточного количества витамина А

Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар с массой тела 200-250г. Животным опытных г^упп в течение 3 дней при помощи зонда вводили масляный раствор витамина А(ретинола ацетата) в дозе 30 ООО МЕ на 100г массы тела, контрольным - только масло в равном объеме. Через сутки после заключительного введения витамина А ила масла животных иммунизировали однократно внутрпбрпшнно 2мл 20$ взвеси отмытых эритроцитов барана на 100г массы тела. Через 4 дня после иммунизации проводили забой животных.

Как видно из результатов иммунологических исследований (табл.9) АС >и фоне введения дополнительных доз витамина А вызывала достоверное усиление продукции АОК, приводила к увеличению титра антител я активности комплемента на 37,39 и 43$ соответственно. Следует отметить, что сходные результаты бшш получены и на животных других видов (К.Д.Плецитый.М.А.Аскеров 1982). Табл.9

Показатели иммунного ответа у крыс на эритроциты барана на фоне введения избыточных доз витамина А

Иммунологические показатели AC АС + витамин А

Активность комплемента 68,00 + 5,30**

Число АОК на 10 сплено-цитов 47,30 + 4,10

36,30 ± 2,80 49,80 х s.°°*

Титр антител, tog , 3,75 ± 0,21 5,21 ¿0,32**

Примечание.Представлены средние данные (М+m) от 8-10 животных. * ) - pi-0,05; «» )-р /. 0,01 ~

Экзимологические исследования позволяют сделать вывод(рис.4),

что введение крысам дополнительных доз витамина А сопровождается

в печени незначительны:.! увеличением активности тиэлотгх протеиназ

АКгаШОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ГИДРОЛАЗ ПРИ АС НА ФОНЕ

в % от контроля )

ВВЕДЕНИЯ ВИТАМИНА А

1-1У - катепсинн A,Bl,C и О соответственно; У -арилсулыТятязы А и В I - контроль + АС; 2 - опыт; 3 - опыт + АС Представлены средние (М+ m) дашше от 6-8 животных; «}.pt 0,05 - О,TOI

и уменьшением активности катепсинов A hD на 19 и 17$ соответственно. В селезенке и тимусе активность всех исследованных ферментов была выше контрольных значений, но достоверное увеличение активности в селезенке отмечено лишь для катепсинов А и С(на 21 и 31$). При АС на фоне введения витамина А характер реакции исследованных ферментов существенно менялся в печени и селезенке по сравнению с неиммунизиро-вашшми животными.Так, в печени происходила дальнейшая активация ти-оловых протеиназ на 27-32$ (pi-Q ,01-0,001) ,а уровень активности катепсинов А иD приблизился к контрольным значениям. Аналогичная картина наблвдалась в селезенке. В то же время в тимусе изменений в активности лиз ос шальных ферлентов обнаружить не удалось.

Таким образом,в результате исследований удалось установить, что иммуностимулирующее действие избыточных доз витамина А сопровождается выраженным возрастанием функциональной активности лизосомального аппарата печени и избирательной активацией отдельных лизосомалышх гидролаз в селезенке. Поскольку имеются основания рассматривать витамин А как стимулятор гуморального иммунного ответа к Т-зависимым антигенам и в реализацию его иммуностимулирующего действия вовлечена система Т-хелперов (К.Д.Пяецитый 1985) .имеются основания,с одной стороны, расценивать реакцию лизосомального аппарата печени как один из биохимических этапов формирования гуморального иммушого ответа, а с другой - нельзя исключать возможность участия протеиназ лизосом в процессе сохранения динамического равновесия между синтезом и катаболизмом имглуноглобулинов.В этом аспекте заслуживает внимание и точка зрения о рати прэтеолитического комплекса лизосом в деструкции белкового репрессора митозов (Maub^t оС,1970),что подтверждается сведении ш об увеличении числа клеток,находящихся в состоянии митоза при действии витамина А (Э.Аллисон 19С9),что макет лежать в основе тупоголсзп.

- 23 -

ВЫВОДЫ

I.Установлено, что антигенная стимуляция крыс эритроцитами барана приводит к избирательному увеличению активности тиоловых протеиназ - катепсинов В и С в селезенке, что свидетельствует об участии лизосомальных протеиназ в реализации иммунного ответа.

. 2.При голодании, в печени крыс наблюдается выраженная активация катепсинов А и 0 на фоне значительного снижения активности тиоловых протеиназ, а в иммунокомпетентных органах выявлен прогрессивно возрастающий уровень активности всех исследованных ферментов лизосом (на 21-36% к 4 дню и на 46-179$ к 8 дню голодания). Антигенная стимуляция на ранни: сроках голодания вызывает еще большую активацию лизосомальных протеиназ в селезенке и тимусе (на 26-140$ к 4 дню). При длительном периоде голодания и антигенной стимуляции увеличения активности комплекса лизосомальных протеиназ в этих органах не выявлено.

3.Прз белковой недостаточности, т- :гасе как и при голодании, в печени крыс обнаружены рецяпрокные изменения активности катепсинов А,

О и В,С и незначительное снижение активности всех исследовашпк ферментов в селезенке. Антигенная стимуляция на фоне белковой недостаточности приводит к увеличению общей активности и относительной удельной активности во фракции лизосом всех исследованных протеиназ в печени и иммунокомпетентных органах (на 86-170$) с одновременным сокращением периода полужизни суммарных белков во фракциях лизосом п цитозола (на 14-16$).

4.Дефицит пирпдоксипа в рационе приводит к увеличению активности всех исследованных лизосомальных гидролаз в печени и к уменьшению активности катепсинов А и С в селезенке. Антигенная стимуляция на на фоне дефицита пирпдоксипа вызывает сниаение активности тиоловых протеиназ в печени и их активации в селезенке, что находится в

прямой зависимости с изменением суммарных белков этих органов.

5.Иммуностимулирующее действие избыточных доз витамина А сопровождается возрастанием активности тиоловых протеиназ и снижением активности катепсинов А и Р в печени, тогда как в иммунокомпетент-ных органах наблвдается незначительное увеличение активности всех исследованных ферментов. Антигенная стимуляция на фоне дополнительных доз витамина А вызывает дальнейшее увеличение активности лизо сомалышх протеиназ и дестабилизации мембран лизосом, что выражается в увеличении относительной удельной активности лизосом в цитозо-ле.

6.Установлено, что один из путей регулирующего дейотвия алиментарного фактора на иммунный ответ организма реализуется через механизм ливосомального протеолиза.

Основное ссдегагаотэ диссертации яалаяено в следуютх публикациях

1.Коновалова 1.С.-Обновлешге белка в активность протеиназ лзгаоесм в некоторкг органах крнс прв голодании. Тезисы докладов на областной научно! конференция, Караганда, 1985, стр.206

2.Коновалова I.C.-Протеолятяческая система лизоссм печени,селезенки в тимуса крыс при голодании и антигенной стимуляции. Тезисы докладов на республиканское слете молодых медиков, Тбилиси,1986,стр.20

3.Васильев A.B. .Коновалова -5.С. Дя 1ва Рен - Дизосомя и обновление белка пря изменении характера питания. В кн. -.Материалы меадународ-ного симпозиума -"Лжзосош в биологии, патологи» и биотехнологии", Софи, 1986, стр.

4.Васильев A.B..Коновалова I.C. .Плецятнй К.Д..Пономарева 1.Г.,Ту-тельян В.А.— Активность лизоссиальных протеиназ в печени,селезенке я тимусе ори антигенной стимуляция я введении витамина А. Вопр. ме.химии, 1987,JS5, стр. 81-83

5.Васильев A.B. .Коновалова Д.С.,Плецитый К.Д..Давыдова Т.В. .Тутель-ш В.А.- Протенназы лизосш я обновление белка в печени, селезенке я тимусе крнс при антигенной стимуляции я голадании.Еол.эксп.биол. и мед..1988,S2.стр.I8I-I84

6.Васильев A.B..Коновалова I.C..Пледятый К.Д..Пономарева i.V., Ту-телыш В.А. - Активность лизостальных гидролаз в печени, селезенке я тимусе крыс ирг антигенной стимуляция в дефиците витамина Bg. Вопр.аед.химии. 1988.52. стр. 97-99

7.Васильев A.B. .Коновалова I.C. .Шгепятый К,Д. .Пономарева Z.V. ,Ту-тельян В.А. - Активность лизос смальных гидролаз я обновление белка в печени, селезенке я тимусе крыс пря антигенной стимуляции я дефиците белка. Вопр.мед.химия, 1989,51, стр.