Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль биологически активных факторов в регенерации структур глаза и конечностей у амфибий

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Роль биологически активных факторов в регенерации структур глаза и конечностей у амфибий"

¡-.•...'¿О

\ ^ 4 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 591.596/599

ЗК0ЙК0 Сергей Леонидович

РОЛЬ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ФАКТОРОВ В РЕГЕНЕРАЦИИ СТРУКТУР ГЛАЗА И КОНЕЧНОСТИ У АМФИБИЙ

03.01.00 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1996

Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Института биологии развития им. Н.К.Кольцова Директор Института Академик Н.Г. Хрущов

Научный руководитель:

Доктор биологических наук В.И.Миташов

г

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук А.Г.Бабаева Доктор биологических наук В.Я.Бродский

Ведущее учрездение: Биологический факультет

Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 27 ноября 1996 года в 11 часов на заседании специализированного совета Д 002.85.01 по защите диссертаций при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им Н.К.Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова. 26)

Автореферат разослан 25 октября 1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е. В. Волина

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ обусловлена следующими обстоятельствами: 1. Способность к эпиморфной регенерации тканей глаза и конечности свойственна только представителям низших позвоночных животных (хвостатые амфибии). У безхвостых амфибий эта способность теряется на определенных стадиях онтогенеза, взрослые особи обладают гипоморфной, регенерационной способностью (вос-тановление утраченной части происходит не полностью) или совсем ею не обладают; 2. По мере утраты регенерационной способности показатели пролиферативной активности клеток также снижаются. Уменьшается доля клеток участвующих в пролиферации, меняются параметры клеточного цикла, уменьшается продолжительность периода активной пролиферации; 3. Восстановление регенерационной способности, там где это было возможно, сопровождается воста-новлением основных параметров пролиферации клеток. 4. Развитие техники культивирования органов и тканей in vitro позволило выявить вещества усиливающие пролиферативную активность клеток. Таким образом, появилась возможность для экспериментального изучения роли пролиферации клеток (на стадиях накопления клеток, морфогенеза и роста регенерата) у животных со сниженной способностью к таковой.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы - изучить роль биологически активных факторов в регенерации структур глаза и конечности. В связи с этим, осуществляя данные исследования. мы руководствовались следующими задачами: 1. Изучить содержание пептидного фактора роста гидры в тканях обыкновенных тритонов; 2. Исследовать влияние фактора роста гидры и деларги-на (структурного анализа бетта-эндорфина, - нейропептида) на ход регенерации конечности у шпорцевых лягушек; 3. Разработать теоретическую модель морфогенеза регенерирующей конечности; 4. Сравнить влияние ретинола на регенерацию конечности и хрусталика in vivo; 5. Разработать систему длительной доставки ростовых факторов в ткани экспериментального животного; 6. Изучить возможность стимуляции ростовыми факторами регенерации хрусталика из вентральной радужки тритона in vivo; 7. Исследовать влияние ростовых факторов на регенерацию сетчатки у лягушек Xenopus La-evis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые на модели регенерации тканей глаза in vivo использована система доставки биологически активных факторов на основе полимерного носителя. Наши данные впервые демонстрируют возможность восста-

новления с помощью ростовых факторов способности к регенерации хрусталика у взрослых особей Xenopus laevts. Впервые получены данные о влиянии витамина А на процесс регенерации хрусталика у низших позвоночных животных, а также о влиянии фактора роста гидры и деларгина на восстановление регенерационной способности конечности у взрослых шпорцевых лягушек. Использованный метод доставки биологически активных факторов может быть применен в различных областях экспериментальной биологии и медицины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации докладывались на следующих Международных конференциях: Советско-Финский Симпозиум по биологии развития. 26 сен.-1 окт., 1988, Ташкент; 11 Международный Конгресс Международного Общества биологов развития. 20-25 авг., 1989, Утрехт; Рабочее совещание по проблемам развития конечности, 24-27 сен., 1990 г. Сантандер; Европейская конференция по тканевой и посттравматической регенерации. 3-7 сентября 1990 г, Женева.

ПУБЛИКАЦИИ. Результаты работы изложены в 9 публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением материала и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована ^ таблицами и рисунками. Список

литературы содержит источника, в том числе :Ё^Гна русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе представлены методические подходы для анализа выхода биологически активных факторов из инертного носителя. Обнаружено наличие пептида ФРГ в тканях амфибий, выявлена стимуляция регенерации конечности у шпорцевых лягушек под действием фактора роста гидры и деларгина. Под влиянием фактора роста фибробластов стимулировали прохождение ранних стадий регенерации хрусталика (III ст.) клетками вентральной области радужки. Под влиянием фактора роста фибробластов удалось стимулировать раннюю стадию регенерации сетчатки из клеток пигментного эпителия и хрусталика - из клеток внутреннего листка роговицы у альбиносов шпорцевых лягушек. Показано, что ретиноевая кислота не оказывает морфогенетического эффекта на регенерацию хрусталика

- з -

у тритонов в противоположность регенерации конечности. Все результаты получены впервые и существенны для понимания механизмов регенерации органов и тканей. Выявленные эффекты действия биологически активных факторов на регенерацию конечности находятся в хорошем соответствии, с предложенной нами "упаковочной" моделью регенерации конечности.

*

ВВЕДЕНИЕ

Около двухсот лет прошло с тех пор, как было открыто явление эпиморфной регенерации, то есть процесса полного восстановления целого органа или его части. Наиболее изученной моделью органной регенерации является регенерация конечности у хвостатых амфибий. Тогда как для изучения восстановления частей органа более популярна модель регенерации структур глаза: хрусталика и сетчатки. Обе эти модели были использованы в наших исследованиях.

Процесс регенерации можно условно разделить на две фазы. Первая фаза - регрессивная - или стадия дедифференцировки на тканевом и клеточном уровнях, приводит к образованию популяций клеток регенерата. Вторая фаза - прогрессивная - или стадия размножения клеток источника регенерации с последующим морфогенезом и ростом.

Исследования по эпиморфной регенерации всегда велись в тесной связи с исследованиями по развитию аналогичных органов и тканей. Для этого были следующие основания. Во-первых, прогрессивная фаза эпиморфной регенерации в большой степени сходна с процессом развития. Во вторых, процесс регенерации, запущенный на разных этапах онтогенеза, приводит к различным результатам. В связи с этим на подготовительном этапе нами была разработана модель морфогенеза развивающейся и регенерирующей конечности.

"Упаковочная" модель морфогенеза конечности.

Свободные конечности позвоночных животных развиваются I! регенерируют в проксимо-дистальной и передне-задней последовательности.

Скелетные элементы конечности организованы в ряды. В прок-симльной части конечности количество костных рядов меньше, чем в дистальной. Процесс новообразования рядов (ветвление) инициируется на определенных этапах морфогенеза. В момент ветвления, в проспективной области нового скелетного ряда повышается про-лиферативная активность клеток мезодермы, что приводит к опережающему росту данной области (Рис. 1, 2).

В основе предлагаемой нами модели лежит гипотеза о раннем пространственном разделении хондрогенной (ХСК) и нехондрогенной (НСК) субпопуляций клеток. К нехондрогенной субпопуляции клеток относятся полипотентные клетки, расположенные поверхностно под эктодермой. К хондрогенной субпопуляции относятся клетки, ком-митированные к хондрогенной дифференцировке.

Согласно модели, пространственное разделение субпопуляций клеток происходит на основании различий в их адгезионных свойствах. по правилам, предложенным Стейнбергом (Steinberg, 1963). В соответствии с этими правилами хондрогенные клетки перемещаются в центральную а нехондрогенные в переферическую области конечности.

Мы считаем, что относительная скорость пролиферации и относительное перемещение хондрогенных и нехондрогенных субпопуляций клеток внутри бластемы (почки конечности) определяет размеры и форму каждого элемента скелета.

На Рис.1 представлена схема морфогенеза конечности. В ходе формирования одного ряда скелетных элементов происходит "упаковка" центрально расположенной ХСК в НСК. Процесс ветвления происходит в результате образования дополнительного направления роста.

Рост мезодермы в ходе морфогенеза конечности поддерживается непрерывным поступлением ростовых факторов в дистальные области конечности. Источником указанных факторов является апикальный эктодермальный гребень (АЭГ). Индукция и последующая функциональная активность которого контролируется специализированной группой клеток из НСК. получившей название зоны поляризующей активности.

Таким образом, в ходе морфогенеза конечности имеет место широко распространенное в развитии явление - взаимодействие мезодермы и эктодермы.

Сопоставление предложеной модели с современными данными по экспрессии некоторых генов дает следующие результаты.

В клетках зоны поляризующей активности обнаружена экспрессия гена Sonic hedgehog (shh). С экспрессией данного гена клетки зоны приобретают способность к индукции АЭГ из клеток эктодермы.

Обнаружена дифференциальная экспрессия генов семейства Нох и их гомологов. Наибольшее число этих генов активно в клетках с высокой пролиферативной активностью (дистальная область зад-не-дорсального края конечности). Показано, что для эспрессии вышеуказаных гомеобокс содержащих генев Shh и Нох необходимо наличие факторов роста фибробластов.

В клетках АЭГ был обнаружен синтез факторов роста фибробластов. Максимальное количество ростовых факторов этого семейства экспрессируется в задней половине АЭГ. Гены кодирующие рецепторы к FGF (Р-1 и Р-2) дифференциально экспрессируются в клетках мезодермы. Р-1 обнаружен во всех клетках мезодермы а Р-2 только в ХСК и в клетках АЭГ.

Анализируя приведенную информацию можно заключить, что ключевую роль в реализации программы развития конечности играет семейство факторов FGF и их рецепторов.

Обнадеживающие результаты были получены при культивировании развивающейся и регенерирующей конечности в присутствии факторов роста фибробластов (FGF) и эпидермального ростового фактора (EGF). Эти и другие исследования подготовили базу для изучения роли ростовых факторов in vivo.

Кроме указанных факторов представлял интерес пептид, получивший название "морфоген, ускоряющий регенерацию головного отдела гидры" или "фактор роста гидры". Данный пептид, молекулярной массой 1125 Да был обнаружен во многих тканях млекопитающих, что может свидетельствовать о высоком консерватизме его структуры и о возможности существования нескольких функций ФРГ в организме.

Еще один пептидный фактор - деларгин - оказался в фокусе нашего внимания. Этот структурый аналог бетта-эндорфина с молекулярной массой 660 Да мог претендовать на роль нейротрофичес-кого фактора, доставляемого к месту регенерации по нервным волокнам. Используя вышеперечисленные ростовые факторы мы расчи-

Рис. 1. А. Стадии морфогенеза скелетных элементов в пределах одного ряда. Обозначения: ХСК - хондрогеяная субпопуляция клеток. НСК - нехондрогенная субпопуляция клеток. Б. Стадии образования нового ряда костных элементов (ветвления).

НСК

ХСК

ЗПА

АЭГ

Рис. 2. Схема распределения различных типов клеток в ходе морфогенеза конечности. Обозначения: темные клетки - ХСК. светлые клетки ИСК. точки - зона поляризующей активности (ЗПА). АЭГ - апикальный эктодермальный гребень.

тывали повлиять на скорость деления клеток, потенциально способных к участию в регенерации.

Кроме стимулирующих пролиферацию факторов мы изучали витамин А. ретинол (Р). и его активную форму - ретиноевую кислоту. Это вещество оказывало необычный эффект на регенерацию конечности. Гипервитаминоз витамина А в период дедифференцировки менял объем восстановливающихся структур в сторону увеличения. Регенерат содержал двойной набор костных элементов как вдоль проксимо-дистальной. так и вдоль передне-задней оси конечности. Таким образом витамин А являлся агентом, удлинняющим регрессивную фазу регенерации и увеличивающим обьем регенерации. Представлялось интересным проверить чувствительность к этому фактору других регенерационных систем. Это стало возможным при изучении регенерации конечности и хрусталика параллельно на одном животном.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнялась на следующих видах животных: тритоны обыкновенные, тритоны испанские, лягушки шпорцевые. Все операции на животных проводились под уретановым наркозом. Операции по удалению конечности проводились на уровне 1/2 предплечья. Операции по удалению хрусталика, сетчатки и дорсальной радужки производились через операционные отверстия выполненные по дуге 180' в дорсальной области роговицы.

Для изучения пролиферативной активности проводились радиоавтографические исследования на гистологических срезах с применением 'Н-тимидина. Данные подсчета меченых и немеченных ядер обрабатывались статистически.

Для исследования морфогенеза кости целые препараты конечности окрашивали Alelan Blue 8GX, просветляли и хранили в глицерине.

Фактор роста гидры (ФРГ) и деларгин (Д) были получены из ВКНЦ. Фактор роста фибробластов основная (bFGF) и кислая (aFGF) формы, а также эпидермальный фактор роста (EGF) были предоставлены в лиофилизированном виде Институтом ВНИИ Биотехнологии и хранились при -20'С до использования.

Активную Форму витамина А - ретиноевую кислоту (Serva) -

растворяли в ДМСО (Sigma) из расчета 0.25 мг в 2 мкл. инъекционного раствора.

Адаптация метода доставки биологически активных веществ с помощью полимерного носителя к условиям экспериментов на

тканях глаза.

Для решения поставленных перед нами задач по изучению воздействия биологически активных веществ на процесс регенерации структур глаза и конечности у амфибий, мы столкнулись с необходимостью разработать механизм доставки факторов в изучаемую систему.

Взяв за основу метод, разработанный Райном с соавторами, (Rhine et al., 1980) мы приготовили полимерные блоки с конечными размерами 1.5*1.2*0.8 мм (для ретинола) и 0,4*0,4*0.2 мм (для ФРГ). Для приготовления полимерных блоков (ЭВА) этиленви-нилацетат смешивали с этилендихлоридом в соотношении 1/10 (вес/объем). К полученному раствору добавляли сывороточный альбумин (СА) человека и 'Н-меченые ретинол (Р) или ФРГ (Таблица 1. 2). По скорости перехода радиоактивной метки из носителя в раствор судили о кинетике диффузии из ЭВА и бумаги меченых факторов. Полученные данные представляли графически (Рис. 3. 4).

Таблица 1. Исходный состав полимерных блоков с Р.

Шифр Компоненты

серии

НЗ-Р-0Л СА ЭВА ЭДХ

(МГ) (мг) (МГ) (мг)

А-1 11.1 40 100 1.0

А-2 0.33 40 100 1.0

А-3 0.11 40 100 1.0

Б-1 0.33 60 100 1.0

Б-2 0.33 20 100 1.0

Б-3 0,33 0 100 1.0

Таблица 2. Исходный состав полимерных блоков с ФРГ.

Шифр Компоненты

серии ЗН-ФРГ СА ЭВА ЭДХ

(мг) (ИГ) (МГ) (мл)

Г-1 1,44*10\-9М _____ 100 1.0

Г-2 1,44*10\-9М 70 100 1.0

- а -

Рис. 3. Количественная характеристика выхода ретинола из ЭВА в зависимости от содержания СА в носителе. Содержание Р в носителе - 4 мкг. содержание СА: В-3 (0%); В-2 (14,2%); А-2 (28Я); В-1 (42%). По оси абсцисс - время (в днях). По оси ординат - количество вышедшего ретинола (в % от общего количества).

17 14 21 23

Рис. 4. Количественная характеристика выхода ФРГ из ЭВА в зависимости от содержания СА в носителе. Обозначения осей те же. что на Рис. 3.

Как видно из Рис. 3 и 4 в первый день из полимерных блоков высвобождается в 5-10 раз больше Р. чем в последующие. Из бумажного носителя, в отличие от ЭВА. за этот период диффундирует больше половины Р.

Во второй фазе (со 2 по 14 день) выход Р из ЭВА замедляется. и почти прекращается в третьей фазе. ФРГ практически не выходит из ЭВА в отсутствие СА. Это. очевидно, свидетельствует о недостаточности внесенного количества 'Н-ФРГ для формирования пор и каналов в полимере, и о его неспособности проникать через чистый ЭВА. Это свойство ФРГ согласуется с данными литературы об отсутствии диффузии из ЭВА веществ, молекулярная масса которых больше чем 300 Да.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о различных механизмах диффузии из ЭВА веществ, имеющих разную молекулярную массу. Р диффундирует через ЭВА и через поры и каналы в нем, а ФРГ только через поры и каналы в ЭВА.

Таким образом, меняя соотношение ЭВА к СА (то есть количество пор и каналов на единицу площади поверхности) можно добиться желаемой скорости выхода для веществ с молекулярной массой больше 324 Да.

Простота изготовления носителя, его стерильность, минимальная травматичность процедуры имплантации, а также возможность управления скоростью диффузии веществ, позволяют предпочесть этот метод многократным инъекциям биологически активных растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание пептидного фактора роста гидры в тканях тритонов Т. vulgaris.

С помощью иммуноферментного метода (Engvall. 1980) изучалось содержание фактора роста гидры (ФРГ) в гомогенатах различных тканей тритонов (Т. vulgaris). Полученные данные представлены в таблице (Таблица 3)

Таблица 3. Содержание ФРГ в некоторых тканях обыкновенных тритонов.

Органы Кол-во ФРГ

в пг на ед. изм.

Поджелудочная железа 1250

Желудок 600

Кишечник 120

ЦНС 60

Мышцы 30

Кожа 20

Регенераты 35

Из Таблицы видно, что пищеварительный тракт и ЦНС обыкновенного тритона содержит ФРГ в большем количестве, чем остальные изученные органы. Учитывая высокий консерватизм ФРГ (от гидры до человека), можно предположить его участие в регуляции деятельности указанных органов и/илн систем органов тритона. Это предположение послужило основанием для проведения экспериментов по изучению влияния ФРГ и деларгина на регенерацию конечности у шпорцевых лягушек.

Влияние ФРГ и деларгина на регенерацию конечности у шпорцевых лягушек.

Регенерация полноценной конечности у шпорцевых лягушек возможна на ранней стадии развития указанного органа: Способность к регенерации конечности у лягушек X. 1аеи1з угасает в ходе развития. У взрослых особей возможна только несовершенная регенерация - образование хрящевого выроста, называемого спику-лой.

Целью настоящего исследования было изучить возможности восстановления совершенной регенерации конечности у взрослых особей шпорцевых лягушек.

Конечности взрослых шпорцевых лягушек ампутировали на уровне 1/2 предплечья. Растворы деларгина и ФРГ инъецировали в основание регенерата в период с 4 по 14 или с 14 по 28 дни после операции. На 14. 28 и 40 сутки после инъекции регенераты исследовали на гистологических срезах с использованием радиоавтографии. Меченые клетки подсчитывались в центральной и периферической областях регенерата.

В опытных группах, в которых инъекции были начаты с 4-го дня. на 120 день регенерации помимо обычных спикулоподобных регенератов. были обнаружены раздвоенные регенераты (Рис. 5) в 20% случаев после инъецирования ФРГ и в 12.5% случаев после инъецирования Д. В случае начала действия факторов с 14 дня. регенераты не отличались от контрольных. Внутреннее строение регенератов было сходным: центрально-расположенный хрящ повторял внешние контуры регенерата, между ним и раневым эпителием располагалась соединительная ткань.

Изучение пролиферативной активности в центральной и пери-

Рис. 5. Внешний вид регенератов конечности лягушек Хепориэ ¿аеигэ после применения фактора роста гидры (ФРГ), деларгина (Л) и контрольного (К).

ферической областях регенерата не выявило достоверных различий между экспериментальными и контрольной группами.

Таким образом, изучая влияние ФРГ и деларгина на процесс регенерации конечности у взрослых шпорцевых лягушек, мы обнаружили небольшие изменения в морфогенезе регенератов, которые мы расценили как проявление более совершенной регенерации. Во всех изученных группах имеется тенденция в превышении пролифератив-ной активности клеток центральной области регенерата по отношению к периферическим областям, хотя достоверных различий не выявлено. и тенденцию к возрастанию пролиферативной активности клеток центральной и периферической зон регенерата.

Стимуляция регенерации хрусталика из вентральной радужки с помощью ростовых факторов у взрослых тритонов Р. mltlii i л vivo.

Источником регенерации хрусталика у тритона является дорсальная область радужки. В этой области, преимущественно во внутреннем листке, клетки пигментного эпителия депигментируют-ся, - в них наблюдается повышенная пролиферативная активность. В результате этих процессов на свободном крае дорсальной радужки накапливаются слабопигментированные клетки зачатка хрусталика. В дальнейшем наблюдается рост зачатка и одновременная диф-ференцировка клеток в направлений клеток хрусталикового эпителия и хрусталиковых волокон. В экспериментальных условиях было установлено, что линзобразующая способность радужки полярна с максимумом в дорсальной и минимумом в вентральной области.

Мы изучали влияние полипептидных ростовых факторов на регенерацию хрусталика взрослых тритонов Р. mltlii в условиях отсутствия основного источника регенерации хрусталика - дорсальной области радужки.

У каждого животного из обоих глаз удаляли хрусталик и дорсальную область радужки. На 12 сутки после операции в глаза тритонов имплантировали полимерные блоки, содержащие ростовые факторы (Таблица 4).

В левый глаз имплантировали блок с меньшим, а в правый - с большим содержанием ростового фактора. На 30 и 70 дни после операции проводилось гистологическое исследование глаз (по 6

глаз на точку) с применением радиоавтографии. Подсчет меченых клеток вели раздельно в зрачковой и цилиарной зоне наружного и внугренноего листка дорсальной и вентральной радужек.

К 30 дню регенерации в контрольных группах происходил процесс регенерации дорсальной радужки и хрусталика (до П-1У стадии). В экспериментальных группах дорсальная радужка и хрусталик регенерировали в 1 и. частично, 2 группе. В остальных случаях наблюдалась задержка регенерации. Пролиферативная активность клеток дорсальной радужки'опытных групп к 30 дню регенерации не отличалась от контрольных. В вентральной радужке к этому сроку в 3 и 2 группах отмечалось в 4055 случаев расхождение листков в зрачковой области. Превышение значения индекса меченых ядер (ИМЯ) в опытных группах над контрольными было выявлено в следующих зонах вентральной радужки: в зрачковой области (в наружном и внутреннем листках), в цилиарной области (во внутреннем листке) (Рис. 6).

Таблица 4. Состав медленно-высвобождающей ростовые факторы системы на основе этиленвинилацетата кополимера в экспериментальных и контрольной группах.

Тип опыта Ростовые факторы Состав полимерной пластины Количество РФ в блоке (мкг)

II контроль ---- 70 мг ЧСА 1.0 мл 10% р-ра полимера 0. ООО

1-ая эксп. группа bFGF 3.9 мкг + то же 30,9 мкг + то же -"- 0.017 0.108

2-ая эксп. группа aFGF 5.3 мкг + то же 247.8 мкг + то же -"- 0.018 0.848

3-я эксп. группа EGF 2.0 мкг + то же 69. 0 мкг + то же -"- 0.008 0.268

Рис. .6 . Изменения ИМЯ п клетках внутреннего листка центральной радужки под влиянием РФ-ов на 30-й день регенерации

' зрачковая зона

15

10

в - высокое содержание рв в блоке Н-низкое Р® w опоке

□ Контроль ■ЭРФ еэФГФС к) ШФГФ(о) 1High/Low

К 70 дню в контрольной группе регенерировала дорсальная радужка и хрусталик (IV—VII стадии). Пролиферативная активность клеток дорсальной радужки снижалась к исходному уровню. Отличия от контроля были обнаружены в 1 эксп группе, где в 40% случаев из дорсальной радужки формировался дополнительный хрусталик меньшего размера. То же явление было обнаружено во второй экспериментальной группе в 20 - 25% случаев. Пролиферативная активность клеток дорсальной радужки опытных групп не отличалась от контрольных за исключением 2-ой группы (Рис. 7). В этой группе пролиферация клеток дорсальной радужки в 2 раза превысила контрольные значения. К 70 суткам регенерации в вентральной области радужки была обнаружена депигментация зрачковой зоны радужки и расхождение ее листков (III стадия регенерации) в 25-60 % случаев всех экспериментальных групп, чего не наблюдалось в контрольных группах. В зрачковой зоне пролиферативная активность клеток в экспериментальных группах достоверно выше, чем в контрольных (Рис. 7).

Как видно из диаграммы в контроле пролиферация клеток практически завершена /ИМЯ не превышает 2 %/. а в экспериментальных группах еще продолжается /ИМЯ 3-15%/

Таким образом, после проведенной операции инициируется процесс регенерации дорсальной радужки и хрусталика. Клетки регенерата дорсальной радужки пролиферируют с максимально возможной для них скоростью, что, вероятно, маскирует эффект ростовых факторов на пролиферативную активность (30 день регенерации). Однако к 70 дню регенерации aFGF удерживает пролиферативную активность клеток дорсальной радужки на прежнем уровне, тогда как в остальных группах значение ИМЯ снижается, поскольку процесс регенерации дорсальной радужки и хрусталика в основном завершается. Напротив, пролиферативная активность клеток вентральной радужки (не являющейся источником регенерации хрусталика) превышала контрольные значения на всех изученных сроках, а сопутствующие этому морфологические изменения были расценены как III стадия регенерации хрусталика. В отличие от контролей в 1 и 2 экспериментальных группах к 70 дню сформировались дополнительные хрусталики в 40 и 20Я случаев, соответственно.

Влияние ростовых факторов на регенерацию сетчатки и хрусталика у шпорцевых лягушек

Регенерация хрусталика у лягушек Xenopus laevls происходит из клеток внутреннего слоя роговицы. Образовавшийся регенерат хрусталика увеличивается в размере, приобретая морфологию дефинитивного хрусталика. Способность к регенерации хрусталика у шпорцевых лягушек сохраняется до момента слияния наружной и внутренней части роговицы в ходе развития (до метаморфоза).

Клеточным источником регенерации сетчатки у шпорцевых лягушек является циллиарная область радужки /ростовая область глаза/. Низкодиффернцированные клетки этой области размножаются, образуя зачаток сетчатки. Регенерат продолжает расти но не достигает дна глаза. Кроме этого, у шпорцевых лягушек обнаружены отдельные островки образования- сетчаточной дифференцировки из клеток пигментного эпителия. Однако, таких клеток явно недостаточно. чтобы образовать сколь-нибудь протяженный участок сетчатки.

Таким образом, единственным источником регенерации сетчатки у лягушек Xenopus laevis является цилиарная область радужки. По мере развития животного потенции ростовой области к воссоз-

Рис. Та.. Изменения ИМЯ в клетках наружного листка дорсальной радужки пол влиянием РФ-ов на 70-й день регенерации'

Рис. :7б. Изменения ИМЯ в клетках внутреннего листка вентральной радужки под влиянием РФ-ов на 70-й день регенерации

25

20

15

10

%

тг

В-высо«ов «адргжяим« 1-э в блок» Н-нюков содержании Рв в Олоке

Ш,

шра

□Контроль ■ЭРФ ИФГФ(к) ■ ФГФ(о) I Н1дЬ/1_сп»

I- мнмрояи ?-*л*Н{*ш«.

данию сетчатки уменьшаются, что приводит к неполной регенерации.

Для исследования использовали взрослых (6 месячных) шпорцевых лягушек альбиносов. Для стимуляции регенерации использовали эпидермальный фактор роста (ЕСП. и фактор роста фиброб-ластов (ГСГ)- кислую (аГСП и основную (ЬГСП формы. Животным удаляли хрусталик, радужку (включая ростовую зону) и сетчатку. Оперировали оба глаза каждого животного. На 14 сутки после операции в глаза лягушек имплантировали полимерные блоки, содержащие ростовые факторы. В левый глаз имплантировали блок с меньшим. а в правый - с большим содержанием того же ростового фактора.

Для краткости в Таблице 5 группа животных с имплантацией ЬГйЕ обозначена как 1-ая экспериментальная группа, с имплантацией аРБГ - 2-ая экспериментальная группа, с имплантацией ЕйГ -3-я экспериментальная группа. Контролями служили оперированные глаза, в которые имплантировали полимерные блоки, содержащие альбумин (П-ой контроль), либо ничего не имплантировали (1-ый контроль).

Глаза оперированных животных фиксировали (по 4-5 штук на точку) в различные сроки после операции: проводили радиоавтографическое исследование на срезах; данные подсчета меченых и не меченных ядер обрабатывали статистически.

Таблица 5. Содержание РФ в медленно-высвобождающей ростовые факторы системы на основе этиленвинилацетата сополимера в экспериментальных и контрольной группах.

Тип опыта Ростовые факторы Состав полимерной пластины Количество РФ в блоке (мкг)

П-контроль ---- 70 МГ ЧСА 1.0 мл 10% р-р полимера 0. ООО

1-я экспер. группа bFGF 0.2 мкг + то же 24.0 мкг + то же 0.0051 0.447

2-я зкспер. группа aFGF 2,4 мкг + то же 240.0 мкг + то же 0, 0547 5.907

3-я экспер.• группа EGF 0.4 мкг + то же 48.0 мкг + то же 0. 0058 0.938

- 19 -

Таблица 6. Результаты наблюдения за формированием регенератов сетчатки и хрусталика под влиянием ростовых факторов у лягушек Хепорив 1аеи1з.

Название эксперимента 1-к. И-к. 1-опыт 2-ОПЫТ 3-опыт

Кол-во РФ в блоке в мкг 0 0 0, 0051 0,447 0.0547 5.9 0. 0058 0.938

15 сутки регенерации

Регенерат хруст, стадия ^наблюдений 0 0 ___ _ _ _ _____ ___ _ ____

Реген. сетч. % наблюдений (ИМЯ)* 20% (0, 55) 0 — --- --- --- --- ---

20 сутки регенерации

Регенерат хруст.стадия ^наблюдений 0 0 0 III (20%) 0 0 0 0

Реген. сетч. % наблюдений (ИМЯ) 0 20% (0.45) 20% (0.67) 20% (0.55) 0 25% (0.52) 20% (0.45) 20% (0.55)

45 сутки регенерации

Регенерат хруст.стадия ^наблюдений 0 0 0 III (20%) 0 0 0

Реген. сетч. % наблюдений (ИМЯ) 0 20% (0.4) 25% (0.6) 40% (0.55) 50% (0.5) 30% (0.4) 20% (0.45) 20% (0. 35)

75 сутки регенерации

Регенерат хруст.стадия ^наблюдений 0 III (20%) 0 IV (40%) ** 20% 0 0 II-VI (40%) **40% IV (20%) *»20%

Реген. сетч. % наблюдений (ИМЯ) 0 20% (0.4) 25% (0.6) 30% (0. 55) 25% (0.5) 25% (0.4) 20% (0.45) 20% (0.35)

* ИМЯ-индекс меченных ядер

** -указан процент формирования дополнительных хрусталиков.

Стадии регенерации хрусталика по G.Freeman (J.Exp.Zool. 1963. v. 154. N1-3, рр 39-65.

В результате проведенного эксперимента (Таблица 6) к 15 суткам после операции, в 1-контроле. в 20% случаев сформировался регенерат сетчатки, что может свидетельствовать о неполном удалении ростовой области.

К 20 суткам почти во всех опытных и II-контрольной группе обнаружен регенерат сетчатки (в 20-25% случаев). В 1-ой опытной группе, кроме того, обнаружен регенерат хрусталика III стадии регенерации.

К 45 суткам во всех группах, кроме I-контроля, сформировались регенераты сетчатки. Регенераты встречались более часто в 1 и 2 группах (40-50%) в сравнении с (20-25%) остальными группами. В 20% случаев в 1 группе регенерировал хрусталик (до III стадии.) К 75 сут. во всех группах кроме I-контроля наблюдались регенераты сетчатки (в 20-25% случаев). Во Ii-контроле, также как в 1 и 3 группах, обнаружены регенераты хрусталиков (II-VI стадий). Однако, в опытных группах наблюдалось образование дополнительных хрусталиков (в 20-40% случаев).

Таким образом, количество регенератов сетчатки нарастает от первого контроля (20% в 1 сроке) ко Ii-контролю (20% в Зх сроках) и достигает максимума в опытных группах (20-50% случаев во всех сроках).

Регенерат хрусталика появляется во Ii-контроле (на 75 сутки). В экспериментальных группах, кроме 2-ой, помимо первого регенерата хрусталика появляется дополнительный хрусталик в 20-40% случаев.

Полученные результаты позволяют предположить, что как влияние ростовых факторов (aFGF, bFGF. EGF), так и механическое воздействие имплантированного блока, по отдельности, способны вызывать учащение случаев трансдифференцировки клеток пигментного эпителия в зачаток сетчатки. При сочетании этих воздействий наблюдается существенное увеличение количества регенератов сетчатки и появление дополнительных хрусталиков у взрослых шпорцевых лягушек.

Наши данные впервые демонстрируют возможность восстановления способности к регенерации хрусталика у взрослых особей X. laevts.

Сравнительная характеристика влияния ретиноевой кислоты на регенерацию конечности и хрусталика у взрослых

тритонов

В литературе описан эффект витамина А (ретинола) на регенерацию конечности хвостатых амфибий. Этот эффект заключается в появлении в регенерате структур, расположенных проксимальнее уровня ампутации, т.е. объем регенерации превышает объем удаленных структур. Целью нашего исследования было изучить влияние ретинола на регенерацию хрусталика у тритона.

У обыкновенных тритонов (Trtturus vulgaris) удалялись как хрусталики, так и передние конечности на уровне предплечья. Спустя 7 суток после операции тритонам однократно иньецировали ретиноевую кислоту (РК). растворенную в ДМСО (Crawford and Sto-cum. 1988). Одновременно было поставлено два контроля. Для контроля неспецифического воздействия растворителя (ДМСО) нескольким тритонам вводили такой же объем (2мкл) ДМСО без РК. Для получения гистологического контроля регенерации другой группе контрольных тритонов не вводили ни РК ни ДМСО.

Под влиянием витамина А изменялась пролиферативная активность клеток регенерационной бластемы конечности.

Таблица 7. Изменение индекса меченных ЗН-тимидином ядер (ИМЯ) в передней (1) и задней (II) зонах регенерационной бластемы конечности (М + ш, %)

Время после операц./ инъек. РК (сут) Опытная группа (РК) Контроль (ДМСО) Контроль ЗН-тимидин

I II I II I II

15/8 20/13 30/23 36.6=2.9 35.4=9.5 33,2=1,8 34.2=4,7 30,5=3, 1 35.6=5,3 19.1=3,9 31,3=4.7 35.6=3,7 22,6=4,6 32,4=1,6 26.2=1.8 21,1=8,1 30.5=3.1 25.4=2.2 32.5=1.9

Примечание: "-" - нет данных (бластема не сформирована).

Как видно из таблицы, в опытной группе наблюдается задержка формирования бластемы (15 сутки). Увеличение пролиферативной активности на 20 сутки в опытной группе по сравнению с контрольными, связано с преобладанием более ранних стадий регенерации в эти сроки. Анализ просветленных препаратов, окрашенных на хрящ показал высокую частоту структурных аномалий конечности. В 72% появление дополнительных структур конечности, в 11% - формировались гипоморфные регенераты (2 пальца) и в 16% случаев регенерация отсутствовала. Удвовния структур конечности были обнаружены вдоль проксимо-дистальной оси и содержали дополнительную плечевую кость.

Нами обнаружено снижение пролиферативной активности в ци-лиарной области дорсальной и вентральной радужки на 8 день после инъекции витамина А. Мы предполагаем, что локальное подавление пролиферации, так же как и в регенерате конечности, может быть объяснено токсическим эффектом витамина А. Избирательная чавствительность циллиарной области радужки, вероятно, связана с наличием в ней кровеносных сосудов, что создает максимум концентрации транспортируемых кровью веществ.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено наличие пептида ФРГ (фактора роста головного отдела гидры) в тканях тритона. Максимальные количества ФРГ обнаружены в поджелудочной железе, желудке и кишечнике. В центральной нервной системе, коже, мышцах и регенератах конечности тритона пептид оказался менее представленным.

2. Изучение регенерации конечности у шпорцевых лягушек под влиянием пептидов (ФРГ и деларгина) показало, что пролиферативная активность клеток регенерата имеет тенденцию к возрастанию. Этот эффект приводит к небольшим изменениям в морфогенезе регенерата, расцененным как проявление более совершенной регенерации.

3. Используя отработанную методику доставки биологически активных веществ с помощью инертного носителя, стимулировали у взрослых тритонов In vivo регенерацию хрусталика из вентральной области радужки до III стадии. Показано, что использование кислой и основной форм фактора роста фибробластов в данной системе

вызывает образование дополнительных хрусталиков из дорсальной радужки. Под влиянием ростовых факторов достоверно возрастает пролиферативная активность клеток вентральной радужки на 30-е и 70-е сутки регенерации.

4. Наши данные демонстрируют возможность восстановления способности к регенерации хрусталика у взрослых шпорцевых лягушек ln vivo. Имеющиеся потенции альбинотического пигментного эпителия шпорцевых лягушек к трансдифференцировке в сетчатку, могут быть усилены как дополнительной травмой, так и ростовыми факторами.

5. Исследовано воздействие ретиноевой кислоты на процессы регенерации конечности и хрусталика у взрослых тритонов. Обнаружено, что в начальный период экспериментального гипервитами-нозоза А пролиферация клеток регенератов конечности и циллиар-ной области радужки у обыкновенных тритонов подавляется. Обнаружены описанные ранее изменения в строении регенерата конечности, тогда как никаких нарушений процесса морфогенеза хрусталика (за исключением 1 случая дополнительного хрусталика) не обнаружено.

6. Предложенная теоретическая модель морфогенеза развивающейся и регенерирующей конечности хорошо согласуется с экспериментальными данными, получаемыми как гистологическими, так и молекулярно-биологическими методами.

- 24 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Знойно С.Л., Милосердое Ю. В., Поздняков С.П. Изучение скорости и продолжительности выхода меченых биологически активных факторов из этилен винил ацетата кополимера // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1990. N 1. С. 22-29.

2. Григорян Э.Н., Знойно С.Л.. Мальчевская И.Е., Миташов В. И. Сравнительная характеристика влияния ретиноевой кислоты на регенерацию у взрослых тритонов // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. N 5. С. 726-734.

3. Znolko S.L. A "packaging" model of limb development // Plenum Press. New York. 1991. P. 261-263.

4. Знойко С.Jl.. Чагай А.Э., Миташов В.И.. Жуков В.И., Грин М. А., Кизюн С.М., Афанасенко Г.А. Стимуляция регенерации хрусталика у врослых тритонов // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1992.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ТЕЗИСОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Znolko S.L.. Mlloserdov U.V..Pozdnyakov S. P. Release kinetics of trlthlated retlnol and Hydra head activator peptide from ethylen vinyl acetate polymer. Cell Differ.and Develop.. 1989. V. 27 Suppl.. p 24.

2. Zaralsky A.G.. Lukyanov S.A.. Nefedova 0.V., Znolko S.L.. Mltashov V.I. Spatial and temporal pattern of nicks In nucleus DNA studied on tissue sections of adult newt. Pleurode-les waltlli. In the process of limb regeneration. In: "1st European conference on tissue and post-traumatic regeneration". Geneva, 1990, p. 81.

3. Znoiko S.L. The morphogenesis of the regenerating limb (RL) (The packing model). In "1st European conference on tissue and post-traumatic regeneration", Geneva. 1990, p.37.

4. Znoiko S.L.. Malchevskaya I.E. Influence of bioactive factors (BAFs) on the regenerating limb and eye tissues in the vertebrates. In: "1st European conference on tissue and post-traumatic regeneration". Geneva, 1990. p.31.

5. Znoiko S.L.. Malchevskaya I.E. Influence of bioactive factors (BAFs) on the regenerating eye tissues In the lower vertebrates. In: "International Congress of Eye Research" Helsinki. Finland. 1990.