Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC)

Илатовская, Дарья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC)
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC)"

На правах рукописи

ИЛАТОВСКАЯ Дарья Викторовна

РОЛЬ АКТИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА КОРТАКТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (ЕХаС)

03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2012

005055827

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук и Медицинском колледже Висконсина, Милуоки, США

Научные руководители: доктор биологических наук

Юрий Алексеевич Негуляев

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

доктор биологических наук

Александр Викторович Старущенко

Медицинский колледж Висконсина, Милуоки, США

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зоя Иринарховна Крутецкая

Санкт-Петербургски й государственный университет

доктор биологических наук

Ирина Ильинична Марахова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П.Павлова

РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «14» декабря 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: ceIlbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан « » ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Лктуальпость исследования

Центральным фактором, регулирующим объем и давление крови, является реабсорбция ионов натрия в почке. Заключительная стадия этого процесса происходит в дистальном отделе нефрона и управляется различными эндокринными стимулами. Транспорт ионов натрия из мочи в кровь в данном сегменте нефрона опосредуется эпителиальными натриевыми каналами (ЕЫаС), которые служат важнейшим конечным эффектором ренин-ангиотензии-альдостероповой системы [1]. Исследование функционирования этих каналов напрямую связано с изучением регуляции давлепия крови и, как следствие, с пониманием причин патологических состояний, опосредованных нарушением водно-осмотического гомеостаза [12, 13, 27, 28]. Физиологическое значение ЕКаС на уровне организма подчеркивается тем, что мутации в субъединицах канала вызывают наследуемые заболевания, связанные с нарушениями водно-солевого баланса организма, такие, как болезнь Лиддла или псевдогипольдостеронизм I типа [20, 21].

Ранее было показано, что активность НЫаС может регулироваться элементами актинового цитоскелета [8, 9]. Кроме того, существуют данные о том, что Р-актин и а-субъединица ЕЫаС колокализуются в субапикальной области цитоплазмы эпителиальных клеток и взаимодействуют за счет сайта связывания на этой субъединице [23, 24]. Однако, несмотря на то, что регуляция ЕЫаС, обусловленная динамическими изменениями цитоскелета, показана ранее, механизм этого явления остается неизвестным.

Ассоциированный с кортикальным актином белок кортактин за счет связывания с комплексом Агр2/3 является одним из основных регуляторов полимеризации в-актина [38]. Недавно было показано, что кортактин также участвует в регуляции эпителиальных ионных каналов - Ку1.2 и кальций-активируемого калиевого канала В К. [33, 37]. Таким образом, представлялось крайне важным изучение внутриклеточных механизмов цитоскелет-зависимой регуляции ЕЫаС и роли кортактина в этом процессе. Регуляция ЕЫаС, обусловленная перестройками актинового цитоскелета, представляет собой сложный процесс, который модулируется многими факторами. В работе получены результаты, позволяющие охарактеризовать некоторые пути регуляции ЕЫаС при деструкии Р-актина и определить, как в этот процесс вовлечен комплекс актин-связывающих белков кортактина и комплекса Агр2/3. Данная работа создает основу для дальнейших исследований в этой области и более глубокого понимания многоуровневого пути цитоскелет-зависимой регуляции ЕЫаС и других ионных каналов.

Цели и задачи исследования Цель работы заключалась в определении механизмов регуляции эпителиальных натриевых каналов (ЕЫаС) актип-связывающим белком кортактином. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Наладить регистрацию активности ЕЫаС, трансфицированных в клетки млекопитающих, а также нативных каналов в иммортапизованпых и свежевыделенных клетках эпителия почки.

2. Исследовать влияние состояния актинового цитоскелета на вероятность открытого состояния ПЫаС и количество каналов на плазматической мембране в клетках млекопитающих.

3. Определить функциональное влияние актин-связывающего белка кортактина на активность ЕИаС.

4. Изучить механизм регуляции ЕИаС кортактином.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эпителиальные натриевые каналы, восстановленные в клетках млекопитающих методом трансфекции, а также нативно экспрессирующиеся в клетках эпителия собирательных трубочек почки, активируются при разрушении актинового цитоскелета за счет увеличения вероятности пребывания канала в открытом состоянии.

2. Цитоскелет-связывакмций белок кортактин снижает активность эпителиальных натриевых каналов.

3. Модулирование активности ЕЫаС кортактином происходит вследствие уменьшения вероятности нахождения канала в открытом состоянии.

4. В кортактин-опосредованный механизм регуляции эпителиальных натриевых каналов вовлечен белковый комплекс Агр2/3.

Научная новизна работы. В данной работе получены новые данные о механизмах регуляции Е№С с участием актинового цитоскелета и цитоскелет-связывающих белков. В ходе исследования разработан метод, позволяющий регистрировать активность Е№С в плазматической мембране клеток собирательных трубочек, изолированных из почек крыс. Следует отметить, что до настоящего исследования непосредственно в свежеизолированных клетках почки не производилось изучения регуляции ЕЫаС в зависимости от состояния актинового цитоскелета. Впервые получены данные об активации Е№С при деструкции Р-актина в свежевыделенных клетках собирательных трубочек почки. Особый интерес представляют результаты, показывающие, что модуляция активности ЕИаС при разрушении актинового цитоскелета происходит за счет изменения вероятности пребывания канала в открытом состоянии. Приоритетными являются данные, показавшие, что цитоскелет-связывающий белок кортактин участвует в актин-зависимой регуляции ЕЫаС. Впервые показано, что в этот сигнальный механизм вовлечен комплекс Агр2/3. Установлено, что кортактин участвует в модуляции воротных свойств канала, снижая вероятность его открытого состояния, и не вовлечен в изменение числа функциональных каналов в плазматической мембране.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Теоретическое и практическое значение работы. В проведенном исследовании впервые получены данные о вовлечении кортактина в регуляцию эпителиальных натриевых капалов; в частности, показано, что кортактин-опосредованное снижение активности ЕИаС происходит при участии белкового комплекса Агр2/3. Результаты также демонстрируют, что вероятность нахождения канала в открытом состоянии может контролироваться перестройками актинового цитоскелета; получены данные о существовании взаимодействия между кортактином и ЕЫаС. Таким образом, результаты работы имеют значение для понимания роли цитоскелет-связывающих белков в регуляции ЕЫаС, а также роли данпых каналов в поддержании необходимой концентрации ионов натрия в норме и при патологии. Представленные данные позволяют расширить представления об эпителиальных патриевых каналах и механизмах их регуляции. Результаты работы содействуют пониманию важности регуляции транспорта в дисталыюм пефроне; выяспение полного механизма действия кортактина и актинового цитоскелета на ЕЫаС позволит найти новые способы предотвращения Е№С-оиосредоваш1ых заболеваний. Результаты работы могут быть также использованы в курсах лекций по клеточной биологии, физиологии и биофизике.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в качестве устных докладов на ежегодной Конференции по изучению эпителиального транспорта (Вашингтон, США, 2011), 1 -й общероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, Россия, 2011), 2-й конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2010), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Анахайм, США, 2010), на семинарах кафедры физиологии и Центра по изучению сердечно-сосудистых заболеваний Медицинского колледжа Висконсина (Милуоки, США, 2010), а также на научных семинарах в Институте цитологии РАН. В форме стендовых докладов работа была доложена на 7-м международном симпозиуме по альдостерону и эпителиальным натриевым каналам (Асиломар, США, 2011), 15-й международной конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2011), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии (Анахайм, США, 2010), 3-м конгрессе «вЮ/КЕСТ: тенденции и проблемы изучения ионных каналов» (Тенерифе, Испания, 2011), ежегодной конференции Федерации Американских обществ по экспериментальной биологии «Гемодинака почки: механизмы понимания заболеваний» (Сакстонс Ривер, США, 2010).

По материалам диссертации опубликовало 15 работ, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена па ^ ^ ^ страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение и выводы. Материал иллюстрирован рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель содержит источников.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 05-04-48209-а, 08-04-00574-а, 10-04-00995-а), программы Молекулярная и клеточная биология Президиума РАН, Комитета по науке и высшей школе Правительства Санкт-Петербурга (грант 2.6.04 - 06/057), Американской ассоциации диабета (грант 1-10-BS-168) и Национальных институтов здоровья США (грант R01HL108880).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клеточные культуры. Клеточная линия яичника китайского хомячка СНО была получена из Американской коллекции клеточных культур (АТСС). Линия mpkCCDCi4 была предоставлена лабораторией проф. Вандевалле из Парижского университета (Франция). Клетки СНО культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина, при 37 °С в 5 % СОг. Культуральная среда для клеточной линии mpkCCDci4 состояла из смеси сред DMEM и F-12 (1:1) и содержала 60 нМ селената натрия, 5 мкг/мл трансферрина, 50 нМ дексаметазона, 1 нМ трийодтиронина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 5 мкг/мл инсулина, 2 % эмбриональной телячьей сыворотки и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина.

Выделение собирательных трубочек почки крысы. Собирательные трубочки были изолированы из почек самцов крысы (возраст 6-8 недель) линии Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, США). Выделенные почки помещали в охлажденный раствор Кребса-Рингера и затем при помощи бритвенного лезвия делали поперечные срезы толщиной 0.51 мм. Собирательные трубочки коркового слоя изолировали из полученных срезов при помощи пинцетов под бинокулярным микроскопом и помещали на покровные стекла, покрытые поли-Р-лизином. Для обеспечения свободного доступа к апикальной мембране клеток трубочки вскрывали при помощи двух остро заточенных стеклянных капилляров, управляемых микроманипуляторами (Sutter, США или Narishige, Япония). Эксперименты проводили в течение 2-4 ч после забора органа.

Метод патч-кламп. Для регистрации трансмембранных ионных токов был использован усилитель Axopatch 200В (Molecular Devices, США), соединенный с персональным компьютером через аналого-цифровой преобразователь Digidata 1322А (Molecular Devices, США). Регистрацию и первичную обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения pClamp 10.2 (Molecular Devices, США). Микропипетки для патч-кламп экспериментов вытягивали из филамент-содержащих капилляров (World Precision Inst., США) с использованием горизонтальной вытяжки для микроэлектродов Р-87 (Sutter Instruments, США). Визуальные наблюдения осуществляли с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti (Nikon Instruments, Япония), установленного на антивибрационном столе.

Измерение трапсэпителиальиого потенциала. Клетки линии mpkCCDci4 выращивали на проницаемых подложках (диаметр 24 мм, поры 0.4 мкм), в которых имеется доступ к апикальной и базолатералыюй мембранам клетки (Costar Transwells, США). Для

формирования монослоя с высоким электрическим сопротивлением и интенсивным Na+-транспортом среду меняли каждые 48 ч в течение 7-10 дней. За 18 ч до экспериментов клетки перепосили в среду, не содержащую сыворотки и ростовых факторов. Для регистрации реабсорбции Na+ использовали двухэлекгродную Ag/AgCl систему измерения электрического сопротивления Millicel (Millipore Corp., США). Трансэпителиальный ток Na+ вычисляли согласно закону Ома как отношение трансэпителиалыюго электрического напряжения к сопротивлению монослоя клеток [19].

Растворы, исполыованпые в электрофизиологическях экспериментах. В электрофизиологических экспериментах при отведении от целой клетки (конфигурация whole-cell метода патч-кламп) пипеточный раствор содержал (мМ): 120CsCl, 5 NaCl, 2 MgCh, 5ЭГТА, 10HEPES/Tris, 0.1 GTP. Раствор в экспериментальной камере содержал (мМ): 150 NaCl, 1 СаС12, 2 MgCl2, 10 Hepes/Tris; для блокирования ENaC-опосредовшшых токов внеклеточно добавляли 10 мкМ амилорида из маточного раствора (10 мМ; раствор в воде). рН растворов поддерживали на уровне 7.3-7.4. В условиях cell-attached растворы в экспериментальной камере и в регистрирующей пипетке содержали (мМ): 160 NaCl, 1 СаС12, 2 MgClj, 10 HEPES/Tris и 140 LiCl, 2 MgCl2, 10 HEPESATris, соответственно.

Выделение белков. Для приготовления клеточных лизатов клетки различных линий растили в течение 24^18 ч на чашках Петри до образования монослоя. Клетки дважды промывали фосфатным буфером (4 °С) и в чашку добавляли 400 мкл лизирующего буфера (0.5 % NP-40, 50 мМ Tris-HCl рН 7.6, 150 мМ NaCl с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (Roche, США)). После инкубации на льду в течение 10 мин клетки собирали пластиковой лопаткой и подвергали гомогенизации при помощи шприца. После центрифугирования в течение 15 мин при 10000 g и 4 °С к отобранному супернатанту добавляли буфер Лэммли. Образцы прогревали в течение 5 мин при 95 "С. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Брэдфорд [6].

Для экспериментов по мечению белков плазматической мембраны биотипом клетки промывали холодным фосфатным буфером и инкубировали с 0.5 мг/мл сульфо-NHS-LC-биотина (Pierce, USA) в течение 30 мин в темноте при 4 °С. Реакцию биотинилирования останавливали добавлением 100 мМ глицина в фосфатном буфере. Далее проводили лизирование клеток, образец обрабатывали ультразвуком в течение 10 с, центрифугировали 10 мин при 10000 g, 4 °С и затем проводили измерение концентрации белка в супернатанте. Равное количество белка для каждой пробы инкубировали в течение часа при 4 "С с предварительно уравновешенной в лизирующем буфере стрептавидин-агарозой (Roche, США). Агарозу со связавшимися иммунокомплексами осаждали центрифугированием и промывали холодным фосфатным буфером. Элюцию комплексов осуществляли, добавляя к осадкам равный объем 2-кратного буфера Лэммли, прогревали 5 мин при 95 °С, после чего образцы анализировали методом иммуноблотинга.

Коиммуиопреципитацня. Сформированные на чашках Петри монослои клеток mpkCCDci4 и СНО дважды промывали фосфатным буфером и лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl (рН 7.5), 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton Х-

100 и коктейль ингибиторов протеаз (Roche, США). Измеряли концентрацию белка в образце и к 500 мкг общего клеточного белка добавляли антитела (1 мкг); образцы инкубировали в течение 2 ч при температуре 4 °С с постоянным перемешиванием; впоследствии добавляли A/G-агарозу (Roche, США) 1:20 и инкубировали в течение часа при тех же условиях. После центрифугирования (1 мин при 1000 g, 4 °С), преципитированные осадки иммунокомплексов промывали три раза 1 мл фосфатного буфера для удаления несвязавшихся белков. К осадкам добавляли равный объем 2-кратного буфера Лэммли, прогревали 5 мин при 95 °С и анализировали с помощью иммуноблотинга.

Электрофорез и иммуноблотинг. Белки разделяли методом диск-электрофореза в 7% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, затем проводили электроперенос на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) в течение 1 ч при 300 мА. Мембрану блокировали в течение 1 ч 5% обезжиренным сухим молоком, разведенным в буфере TTBS (20 мМ Tris-HCl (рН7.4), 150 мМ NaCl, 0.1% Tween-20), затем инкубировали в течение 8 ч при 4 °С с антителами к исследуемым белкам, разведенными в TTBS с 2% молоком. После 3-кратной отмывки TTBS мембрану инкубировали 1 ч с вторичными антителами в буфере TTBS с 2% молоком. Затем проводили две отмывки по 10 мин с TTBS и одну отмывку в течение 10 мин в TBS. Визуализацию блотов проводили путем усиленной хемилюминесценции (ECL, Amersham, США).

Временная трансфекция моиослойной культуры. Клетки СНО трансфицировали за 24 - 72 ч до эксперимента, используя реагент Polyfect (Qiagen, США) согласно протоколу производителя. 2-3 мкг плазмидной ДНК растворяли в 150 мкл среды, не содержащей сыворотки и антибиотиков, добавляли 10 мкл реагента Polyfect, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 5-10 мин. Далее добавляли 600 мкл среды, содержащей сыворотку и антибиотик, и раскапывали смесь в чашку с подготовленными для трансфекции клетками.

Создание постоянной клеточной линии с пониженной экспрессией целевого белка методом лентивирусной трансфекции. Для постоянного ингибирования экспрессии кортактина в клетках линии mpkCCDcn были использованы нереиликационноспособные лентивирусные частицы (Santa Cruz, США) представляющие собой концентрированные, готовые к трансдукции конструкции, содержащие три специфичные к мРНК кортактина shRNA-последовательности длиной от 19 до 25 нуклеотидов (плюс т.н. «шпилька»). Для подтверждения эффективности трансдукции использовали лентивирусные частицы, содержащие некодирующую последовательность. После трансдукции проводили селекцию зараженных лентивирусными частицами клеток при помощи пуромицина (100 мкг/мл), и отдельные клетки переносили в новые чашки Петри для формирования колоний. Колонии, в которых произошло снижение экспрессии целевого белка, идентифицировали методом иммуноблотинга, отбирали и культивировали для последующих экспериментов.

Статистические расчеты. Амплитуды ионных токов одиночных каналов оценивали с помощью функций статистической обработки программного комплекса pClamp (Mol. Devices, США). Уровень активности одиночного канала оценивали по значению вероятности

открытого состояния (УД рассчитываемого по формуле P„=I/(Nxi), где I - средний ток для заданного временного интервала, N — число каналов в исследуемом патче, / - амплитуда тока, протекающего через одиночный канал. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакетов программ pClamp 10.2, OriginLab Origin 7.0 и Microsoft Excel 2007. Результаты представлены в виде средпих значений и их стандартных ошибок. Парные и непарные эксперименты сравнивали, используя соответствующие /-тесты Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Роль разрушения F-актипа в регуляции эпителиальных патрисвых каналов

Влияние разрушепия актинового цитоскелста на активность эпителиальных натриевых каналов, экспрессированпых в клетках СНО и НЕК293-Т. Стимулирующее влияние разрушения актинового цитоскелета на активность ENaC показано ранее в клетках линии Аб эпителия почки шпорцевой лягушки и в экспрессионной системе ооцитов [17, 23. 24]. Кроме того, показано влияние разборки цитоскелета на активацию натриевых каналов, имеющих сходные характеристики с ENaC, в клетках различной специализации [31, 32]. Однако вопрос о существовании подобных механизмов регуляции нативных каналов в клетках эпителия почек млекопитающих оставался актуальным. Была поставлена задача определить механизм активации ENaC, опосредованный разрушением F-актина в клетках, трансфицированных субъединицами ENaC мыши, а также иммортапизованных и свежевыделенных клетках эпителия почки, экспрессирующих нативные каналы.

В первых экспериментах клетки СНО яичников китайского хомячка были трансфицированы плазмидами, несущими гены а, ß и у субъединиц ENaC мыши (далее mENaC). Через 24-72 ч после трансфекции в конфигурации отведения от целой клетки (whole-cell) метода патч-кламп измеряли интегральный амилорид-чувствительный ток через мембрану необработанных (контрольных) трансфицированных клеток. Для изучения влияния разборки актинового цитоскелета на ENaC-опосредованный ток трансфицированные клетки перед электрофизиологическими экспериментами обрабатывали актин-разрушающим реагентом цитохалазином Д (ЦитД; 10 мкг/мл) в течение 20 мин до электрофизиологических экспериментов. На рис. 1, А приведены примеры типичных записей интегральных токов через мембрану контрольных и обработанных ЦитД клеток до и после подачи амилорида. Токи регистрировали в ответ на напряжение, линейно изменяющееся в течение 300 мс от +60 до -100 мВ при его поддерживаемом значении, равном 40 мВ {рис. 1, Б; поддерживаемым называют потенциал, прилагаемый между тестовыми импульсами пилообразно меняющегося напряжения). Согласно полученным данным, обработка Цит Д в течение 20 мин значительно увеличивала амилорид-чувствительный ток в трансфицированных клетках (рис. I, А,В).

Рис. 1 Влияние разрушения актиновых микрофиламентов цигохалазином Д на ENaC-опосредованный ток. А, примеры записей трансмембранных Na+ токов через каналы ENaC в трансфицированных клетках СНО в конфигурации whole-cell. Приведенные записи иллюстрируют интегральные токи до (верхний рисунок) и после 20 мин обработки 10 мг/мл цитохалазина Д (ЦитД). Стрелкой показан ток до подачи 10 мкМ амилорида. Б, схематическое представление протокола подачи потенциала, использованного в экспериментах whole-cell. В, гистограммы плотности амилорид-чувствительного тока до и после обработки цитохалазином Д р < 0.05.

Средняя плотность амилорид-чувствительного тока в контрольных экспериментах (клетки, не обработанные ЦитД) составляла 342 ±57 пА/пФ (п=14). Разрушение актиновых микрофиламентов ЦитД в течение 20 мин значительно увеличивало плотность тока (до 671 ±82 пА/пФ, п=11). Таким образом, наши результаты подтверждают ранее опубликованные данные, полученные в экспериментах на клетках амфибий Кроме этого, мы исследовали свойства ENaC на уровне регистрации одиночных каналов. Субъединицы ENaC мыши трансфицировали в клетки НЕК-293Т; затем трансфицированные клетки анализировали методом патч-кламп в конфигурации отведения от фрагмента мембраны неповрежденной клетки (cell-attached). Согласно полученным данным, NP0 увеличивалась в среднем в 2.7 раза после 10 мин обработки ЦитД (от 0.29 ±0.03 до 0.79 ± 0.08). В проведенных экспериментах был также получен ответ на вопрос о том, влияет ли разрушение актинового цитоскелета на биофизические характеристики унитарных токов через ENaC: проводимость и потенциал реверсии Так, проводимость одиночных каналов составляла 14.7 ±0.5 и 14.8 ± 0.4 пСм до и после обработки ЦитД, соответственно. Потенциал реверсии также не менялся и составил 35.2 ± 0.1 и 35.9 ± 0.2 мВ [18].

Активация эндогенных эпителиальных натриевых каналов в клетках собирательных трубочек почки в ответ на разрушение актиновых микрофиламентов.

Как видно из полученных нами данных см рис 1, [18]) и ранее опубликованных работ [31, 32], разборка актинового цитоскелета влияет на активность натриевых каналов, экспрессирующихся в клетках амфибий и клетках крови, а также в трансфицированных клетках различных линий. Однако проведенные ранее исследования были сделаны в различных модельных системах, и вопрос о существовании подобной регуляции в клетках почки, экспрессирующих нативный ENaC, оставался открытым В данной работе в качестве клеточной линии, стабильно экспрессирующей ENaC, были выбраны клетки собирательных трубочек почки мыши линии mpkCCDcw. Активность одиночных каналов ENaC регистрировали в парных экспериментах в конфигурации cell-attached метода патч-кламп до и после обработки ЦитД В течение 10 мин наблюдали значительное увеличение NP0 (с 0.47 ± 0.20 до 1.37 ± 0.54, соответственно) [18].

ENaC

2 иА 1100 mi '

U »WMB

«40 ма

„ 750

| И.УЙ.1 3

I 600

| 450

| 300 И £ | 150

B»t+

'ЦшД (211 мин)

Аналогичные эксперименты были проведены на свежеизолированных собирательных трубочках почки крысы линии 5рга§ис Оа\у1еу, в условиях, наиболее приближенных к физиологическим. Выделенные из кортекса почки крысы трубочки вскрывали с помощью микропипеток, чтобы обеспечить доступ к апикальной плазматической мембране. Активность ионных каналов регистрировали при поддерживаемом потенциале -60 мВ Типичный пример, иллюстрирующий увеличение активности одиночных каналов ЕЫаС в ответ на разрушение актиновых микрофиламентов ЦитД, показан на рис 2, А Приведена полная запись, демонстрирующая увеличение активности ЕЫаС в ответ на приложение цитохалазина Д в концентрации 10 мкг/мл, ниже показаны фрагменты записи при большем временном масштабе. Согласно полученным данным (рис. 2, Б), наблюдалось увеличение №„ с 0 5 ± 0.1 до обработки ЦитД до 1.3 ± 0.4 после обработки, соответственно (/?< 0.05)

, цит Д

т-п

1 пА |4 мин / 8 с

контроль (цитД

Рис. 2 Разрушение Р-актнна приводит к увеличению активности ЕЫаС в апикальной мембране клеток свежевыделениых собирательных трубочек почки крысы. А, типичные записи активности одиночных каналов, полученные в отведении от участка апикальной мембраны клетки свежевыделениых собирательных трубочек почки крысы Под полными записями активности одиночных каналов приведены в увеличенном масштабе участки данных записей до (I) и после (II) аппликации цитохалазина Д. В течение эксперимента поддерживали потенциал -60 мВ. Обозначениями "з" и "о" показаны закрытое и открытые состояния канала, соответственно. Б, график, суммирующий активность (№„) каналов, зарегистрированных в мембране свежевыделениых клеток собирательных трубочек почки крысы Звездочкой показано различие в ИРо до и после обработки реагентом (р< 0.05).

Результаты, показанные на рис 2, демонстрируют, что активность нативных каналов ЕЫаС, зарегистрированных в апикальной мембране клеток собирательных трубочек почки, изменяется при обработке ЦитД Таким образом, эндогенно экспрессирующийся ЕЫаС, так же, как и восстановленный методом трансфекции, активируется при деструкции актиновых филаментов

Изучение изменении количества эпителиальных натриевых каналов в мембране при разрушении актинового цитоскелета. В настоящее время в литературе рассматривают два основных механизма изменения активности ионных каналов: увеличение или уменьшение вероятности открытого состояния канала и изменение количества каналов в мембране клетки [7, 22, 27]. Кроме этого, дополнительным параметром, который влияет на

изменение общего тока через канал, является уменьшение или увеличение проводимости отдельных каналов В дальнейших экспериментах была поставлена задача выяснить, какой из вышеперечисленных механизмов отвечает за активацию ЕКаС при разрушении Р-актина. Для данных экспериментов мембранную фракцию ЕЫаС изолировали при помощи стрептавидиновой преципитации общего лизата клеток, белки плазматической мембраны которых были предварительно помечены сульфо-№ 18-ЬС-биотином. Данный подход надежным образом позволяет отделить поверхностные и интегральные белки плазматической мембраны от белков цитоплазмы.

На рис. 3, А приведены результаты иммуноблотинга антителами против последовательности Мус. Для данных экспериментов клетки СНО трансфицировали плазмидами, кодирующими все три субъединицы тНЫаС, каждая из которых несет последовательность Мус на С-конце Трансфицированные клетки обрабатывали 10мг/мл ЦитД, либо его растворителем (ДМСО, контроль) в течение 20 мин. На рис 3, Б показан уровень мембранной фракции ЕЫаС до и после обработки цитохалазином Д. Усредненные результаты приведены на суммирующем графике (рис. 3, Б). Согласно полученным данным, доля Е№С в плазматической мембране необработанных клеток составлял 23.3 ± 5.4% от общего содержания ЕЫаС в клетке и существенно не изменялся при обработке цитохалазином Д (19 4 ± 3.9%).

А мембр общ ри£ з Типичный результат иммуноблотинга

антителами против последовательности Мус, показывающий цитоплазматическую и мембранную долю Е№С в клетках, обработанных ЦитД, по сравнению с контролем Белки плазматической мембраны были помечены сульфо-ЫН5-ЬС-биотином и изолированы методом стрептавидиновой преципитации. Показаны уровни ЕЫаС в общем лизате и мембранной фракции контрольных клеток и клеток, обработаных 10 мг/мл ЦитД (А). Б, суммирующий график, демонстрирующий процент ЕЫаС в плазматической мембране клеток в присутствии и отсутствие обработки ЦитД.

2. Определение влияния актин-связывающего белка кортакгина на акгнвность эпителиальных натриевых каналов

Исследование влияния кортакгина на ток, опосредованный эпителиальными натриевыми каналами, в модели трансфицированных клеток. Активность ЕК'аС контролируется различными регуляторными механизмами и сигнальными молекулами [4, 26, 29, 35]. Наряду с другими факторами активность канала регулируется актиновым цитоскелетом Однако конкретные сигнальные механизмы и белки, вовлеченные в поддержание активности канала и взаимодействие с актиновым цитоскелетом, не выявлены Одним из кандидатов на роль связующего звена между цитоскелетом и субъединицами

канала является кортактин - белок, напрямую связывающийся с актиновыми микрофиламентами Ранее было показано, что кортактин вовлечен в координирование пространственной организации различных трансмембранных белков [11, 33, 37].

Для того, чтобы выяснить, существует ли функциональное воздействие кортактина на ENaC, субъединицы канала экспрессировали в клетках ОНО методом временной трансфекции и затем в конфигурации отведения от целой клетки метода патч-кламп (whole-cell) регистрировали плотность амилорид-чувствительной компоненты интегрального трансмембранного тока В данных экспериментах субъединицы ENaC экспрессировали либо отдельно, либо совместно с рекомбинантным кортактином дикого типа. На рис 4, А показаны типичные амилорид-чувствительные токи через каналы mENaC, трансфицированные в клетки СНО, до и после (указано стрелкой) приложения 10 мкМ раствора амилорида. Показанные записи иллюстрируют значительное снижение амилорид-чувствительного интегрального Na+ тока в клетках, где помимо субъединиц ENaC был экспрессирован кортактин (нижняя запись), по сравнению с клетками, где экспрессировали только субъединицы канала (верхняя запись) Согласно полученным данным, суммарные результаты по которым приведены в виде гистограмм на рис 4, Б, совместная экспрессия ENaC и кортактина в клетках СНО приводит к значительному снижению ENaC-опосредованной плотности тока с 171 ± 10 до 55 ± 9 пА/пФ.

Рис. 4. Совместная экспрессия ENaC и кортактина снижает амилорид-чувствительный ток в

трансфицированных клетках СНО А,

типичные записи интегральных токов через мембрану клеток СНО, трансфицированных субъединицами mENaC отдельно или совместно с кортактином дикого типа. Б, гистограмма, суммирующая плотность амилорид-чувствительного тока в клетках СНО, трансфицированных субъединицами mENaC отдельно или совместно с кортактином дикого типа (+кортактин). р < 0.001.

Экспрессия и локализация кортактина в почке крысы и иммортализованных клеточных линиях собирательных трубочек почки. Двойное окрашивание антителами против кортактина и аквапорина-2 продемонстрировало, что кортактин локализован в собирательных трубочках почки [16] Можно также отметить, что окраска, соответствующая антителам против кортактина, наблюдалась и в других фрагментах нефрона, например, в дистальных извитых канальцах Однако наиболее сильная экспрессия кортактина обнаружена в сегментах почки, в которых экспрессируются также и субъединицы ENaC. В дополнительных экспериментах методом иммуноблотинга показано, что кортактин экспрессируется в кортексе почки крысы, а также в иммортализованных клетках собирательных трубочек почки млекопитающих, включая культивируемые клетки

mENaC

- кортактин

0.5 нА L

-J

собирательных трубочек мыши (линии тркССОС14 и М-1) и клетки Мадин-Дарби почки собаки (МЭСК-С7) [16]

Роль кортактина в реабсорбции натрия в клетках собирательных трубочек почки.

В ходе исследования был поставлен вопрос о том, насколько кортактин вовлечен в физиологически обусловленные процессы, затрагивающие активность эпителиальных натриевых каналов в почке Так же, как и в предыдущих экспериментах, в качестве модели почечного эпителия была использована линия иммортализованных клеток собирательных трубочек почки тркССПсм

Рис. 5. Снижение уровня экспрессии кортактина в клетках тркССОС14. А, типичный результат иммуноблотинга антителами против кортактина, проведенный на лизатах клеток почки мыши шркССПс|4, инфицированных лентивирусными частицами, несущими некодирующую

последовательность эИИ^А (контроль зНЯЫА), а также вЫУ^А, содержащую последовательность для подавления экспрессии кортактина (кортактин КО). Уровень загрузки геля контролировали при помощи антител против Р-актина (нижняя панель). Б, денситометрический анализ относительной экспрессии кортактина в контроле и клетках с подавленной экспрессией кортактина.

При помощи метода лентивирусной инфекции бЫ^ЫА в клетках линии тркССОсм был снижен уровень мРНК, кодирующей ген кортактина. Были использованы лентивирусные частицы, несущие эНКЫА против последовательностей мРНК кортактина мыши; в качестве контрольных частиц применяли соответствующие коммерчески доступные лентивирусные векторы, не несущие кодирующих последовательностей вЫ^ЫА. После селекции антибиотиком пуромицином из зараженных лентивирусными частицами клеток формировали отдельные колонии, в которых методом иммуноблотинга проверяли уровень экспрессии кортактина. Из ряда колоний клеток, в которых лентивирусная трансфекция была успешной, выбрали колонию с самым низким уровнем экспрессии кортактина, получившую название «клон 13», и вывели стабильную линию с пониженной экспрессией кортактина Результат типичного иммуноблотинга антителами против кортактина мыши, показывающий значительное снижение экспрессии кортактина в клетках тркССГ)С|4 клона 13 в сравнении с контрольными клетками, а также денситометрический анализ; было проведено усреднение по трем экспериментам, приведен на рис. 5 А, Б.

Созданная клеточная линия со стабильно сниженной экспрессией кортактина была охарактеризована двумя независимыми электрофизиологическими методами. Во-первых, для регистрации активности ЕЫаС был использован метод патч-кламп. Во-вторых, были проведены измерения трансэпителиального ЕЫаС-опосредованного тока через монослой

1.0

1 0.8

0.6

§ 0.4

0.2

0.0

** т

п = 3

кортактин КО

клеток. Для экспериментов по измерению трансэпителиального тока контрольные клетки линии тркССОсИ, а также клетки клона 13 высевали на проницаемые подложки одновременно в одинаковой концентрации и культивировали в одинаковых условиях, замеряя трансэпителиальное сопротивление и потенциал ежедневно с начала токообразования. Как показано на графике на рис. б, токообразование в клетках клона 13 с пониженной экспрессией кортактина протекало более интенсивно и через 7 суток ежедневных измерений наблюдались большие значения тока, чем в контрольных клетках. В конце эксперимента со стороны апикальной мембраны к клеткам добавляли 10 мкМ амилорида для того чтобы подтвердить, что измеренные токи опосредованы НЫаС

Действие кортактина на вероятность открытого состояния эпителиальных натриевых каналов (Р„). Проведенные нами опыты по изучению влияния разборки актинового цитоскелета на активность ENaC показали, что, по всей вероятности, данный эффект опосредован изменениями в воротных свойствах канала Так как кортактин может быть вовлечен в регуляцию канала F-актином, было исследовано предположение, что механизм действия кортактина также обусловлен изменениями в вероятности открытого состояния канала (Р0), а не количества каналов в апикальной мембране клеток (N).

В электрофизиологических экспериментах с клоном 13 клеточной линии mpkCCDc|4 было показано, что снижение экспрессии кортактина влияет на вероятность пребывания канала в открытом состоянии, однако при этом количество каналов в плазматической мембране не изменяется. На рис. 7, А приведены типичные записи активности одиночных каналов в апикальной мембране контрольных клеток линии mpkCCDci4, а также клона 13 (конфигурация cell-attached). Снижение экспрессии кортактина привело к заметному увеличению вероятности открытого состояния канала до 0.78 ± 0.08 по сравнению с контролем (0.47 ± 0.07) (рис. 7, Б) Как видно из усредненных данных, количество каналов в изолированном фрагменте мембраны постоянно при снижении экспрессии кортактина (рис. 7, Б). Таким образом, можно сделать вывод о том, что кортактин участвует в подавлении активности ENaC за счет влияния на вероятность открытого состояния канала. Для подтверждения этой гипотезы были проведены эксперименты по биотиниляции мембранных белков, а также электрофизиологические измерения активности одиночных каналов в системе трансфицированных клеток

Рис. 6. Снижение экспрессии кортактина вызывает увеличение амилорид-чувствительного тока через монослой клеток линии тркССОс14. График показывает развитие трансэпителиального тока в контрольных клетках тркССОс|4 и «клоне 13» со сниженной экспрессией кортактина. Данные усреднены по минимум 9 независимым экспериментам. *р<0.01

0 12 3 4 5 6 7

Время, суг

Контроль shRNA Г"?4'^*'^......f1"""1'

Рис. 7. Снижение экспрессии кортактина

J.....f"' приводит к повышению вероятности открытого

..... состояния ENaC в клетках mpkCCDci4. А,

примеры типичных записей активности одиночных Кортактнн KD каналов, зарегистрированных в отведении cell-

■' 1 attached метода патч-кпамп на апикальной

оГпЦиШЬ

1 ПА I

4т

ф*

5 с

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0'

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ENaC кортактнн KD

ENaC

корта шн KD

мембране контрольных клеток (верхняя запись, контроль зНЮ^А) и клеток со сниженной экспрессией кортактина (нижняя запись, кортактин АТ£>); поддерживаемый потенциал -60 мВ «з» и «о» обозначают закрытое и открытое состояние канала, соответственно. Б, график, суммирующий эффект снижения экспрессии кортактина на вероятность открытого состояния ЕЫаС (Р„) и среднее количество активных каналов (АО- Звездочкой показано статистически значимое отличие между группами (р < 0.05).

На рис. 8, А показаны типичные записи одиночных каналов, зарегистрированных в отведении от фрагмента клеточной мембраны (конфигурация cell-attached метода патч-кламп). Для этих экспериментов субъединицы ENaC были функционально встроены в клетки СНО отдельно и совместно с кортактином дикого типа Как видно из представленных записей, а также суммирующих гистограмм {рис. 8, Б), вероятность открытого состояния канала (Р0) значительно ниже при котрансфекции ENaC совместно с кортактином. В свою очередь, среднее количество активных каналов в изолированном фрагменте мембраны (N) было постоянным. Полученные данные подтверждают также, что кортактин вовлечен в регуляцию ENaC посредством влияния на воротную кинетику канала и не участвует в изменении количества каналов в мембране.

A ENaC

iViLiTiftY-

ENaC + кортактин

0.5 »А ГПГ

0.4 0.3 " 0.2 0.1 0.0

n-9

Рис. 8. Совместная экспрессия кортактина и ENaC приводит к снижению вероятности открытого состояния канала (Р„). А, типичные записи токов через одиночные каналы, полученные в конфигурации cell-attached метода патч-кламп в клетках, трансфицированных субъединицами mENaC отдельно (верхняя запись) или совместно с кортактином дикого типа (нижняя запись). Поддерживаемый потенциал составлял —60 мВ. «з» и «о» обозначают закрытое и открытое состояние канала, соответственно. Б, график, суммирующий влияние снижения экспрессии кортактина на вероятность открытого состояния ENaC (Р0) и среднее количество активных каналов (N) в отведенном фрагменте мембраны. Звездочками показано статистически значимое отличие между группами (р < 0.01).

В дополнение к электрофизиологическому методу был применен количественный биохимический подход по биотиниляции мембранной фракции ENaC. На рис. 9 показан

п»Т

-1.6

f 1.2 О

¡0.8-} и

z 0.4 0.0

п <з

п~7

пример иммуноблотинга, иллюстрирующий количество белка ЕМаС в мембранной фракции и общем клеточном лизате клеток СНО, трансфицированных ЕЫаС отдельно и совместно с кортактином. Для детекции ЕЫаС были использованы антитела против последовательности Мус, которую включает в себя экспрессирующийся при трансфекции белок Денситометрический анализ серии аналогичных экспериментов показал, что экспрессия кортактина совместно с ЕЫаС не изменяет долю ЕЫаС в плазматической мембране по сравнению с субъединицами ЕИаС, трансфицированными отдельно [16]

Кортактин ассоциирован с субъединицами Е>аС. Возможным вариантом реализации этого механизма влияния кортактина на воротные свойства канала является прямое взаимодействие актин-связывающего и канального белков Для проверки этой гипотезы был применен коиммунопреципитационный анализ, который позволяет показать наличие прямой либо опосредованной связи между двумя белками.

Лизат Мсмбр

Рис. 9. Совместная экспрессия ЕЫаС и кортактина в клетках СНО не изменяет количество канального белка в мембранной фракции. А, Пример иммуноблотинга антителами против последовательности Мус. Показаны дорожки, содержащие общий клеточный лизат клеток СНО, экспрессирующих Мус-конъюгированные субъединицы шЕЫаС в присутствии или отсутствие кортактина. Белки плазматической мембраны метили сулы|ю-ЫН$-88-биотином и далее изолировали стрептавидиновой преципитацией. Загрузку дорожек геля в случае общего клеточного лизата контролировали по уровню Р-актина.

В первых экспериментах в качестве модели использовали трансфицированные клетки СНО, временно экспрессирующие субъединицы ENaC и кортактин дикого типа Гены, кодирующие альфа-субъединицу ENaC мыши, несли также последовательность Мус, однако бета- и гамма-субъединицы ENaC, трансфицированные в СНО, данной последовательности не содержали. Плазмида, несущая ген кортактина дикого типа, содержала последовательность FLAG На рис 10, А (верхнее изображение) приведены результаты ко-иммунопреципитационного эксперимента, в котором преципитация проводилась антителами против последовательности FLAG. Был также проведен обратный эксперимент, в котором преципитация проводилась антителами против последовательности Мус (нижнее изображение на рис. 10, А). Кортактин был выявлен в лизатах, проанализированных при помощи антител к Мус-последовательности на альфа-субъединице ENaC, и наоборот

100

Мус

A aENaC + + + кортактин + + +

+ +

aENaC кортактин

ИП FLAG; WB Мус ИП Мус; WB FLAG

ОКЛ ИП ИП ОКЛ ИП ОКЛ ИП ОКЛ ИП Без AT'

Б В

тркССР.м Кортикальная область почки

3 2 1 1 2 3 1 2 3

-a-ENaC 100 •

p-ENaC 100 "

-y-ENaC

ИП

лизат"

ИП

Рис. 10. Кортактин коиммунопреципигирует с субъединицами ENaC. А, показан типичный результат коиммунопреципитационного эксперимента, для которого клетки СНО были трансфицированы плазмидами, несущими гены, кодирующие конъюгированную с последовательностью Мус а-субъединицу mENaC и не содержащие маркирующих последовательностей р~ и y-mENaC, а также конъюгированный с последовательностью FLAG ген кортактина. Общие клеточные лизаты (ОКЛ) трансфицированных клеток либо сразу анализировали в ПААГ с последующим иммуноблотингом антителами против последовательностей FLAG либо Мус, либо подвергали ко-иммунопреципитации (ИП) антителами против FLAG или Мус (верхний и нижний рисунки, соответственно). Б, В, общие клеточные лизаты клеток линии mpkCCDci4 (Б), а также лизаты гомогенизированной ткани кортекса почки крысы (В) анализировали электрофорезом в ПААГ с последующим иммуноблотингом антителами против соответствующих субъединиц ENaC (I) или подвергали иммунопреципитации антителами против кортактина (3). Сигнала ко-иммунопреципитации кортактина и субъединиц ENaC не было обнаружено в случае, когда процедура преципитации проводилась без антител (2).

Далее был поставлен вопрос о существовании комплекса Е№С-кортактин в клетках, экспрессирующих эндогенные белки Как показано на рис 10, Б, эндогенный кортактин ко-иммунопреципитирует с а-ЕЫаС в клетках эпителия собирательных трубочек почки мыши тркССОсм Более того, р- и у-Е№С были обнаружены в преципитатах, полученных из клеток кортикальной области почки крысы линии Sprague Оа\у1еу при помощи антител к кортактину (изображение в правой части нижнего ряда на рис 10, В). Лизаты клеток в данных экспериментах сначала подвергали преципитации антителами против кортактина, или напрямую анализировали в ПААГ с последующим иммуноблотингом антителами против соответствующих субъединиц канала

В целом, результаты, показанные на рис. 10, согласуются с гипотезой о том, что кортактин и ЕИаС находятся в непосредственной близости друг от друга и это взаимодействие, вероятнее всего, происходит напрямую или через адаптерный белок.

Изучение механизма кортактин-зависимой регуляции эпителиальных натриевых каналов

Белковый комплекс Агр2/3 необходим для регуляции эпителиальных натриевых каналов кортактином. На уровне клетки кортактин может быть участником множества сигнальных каскадов, конкретный механизм каждого из которых зависит от функциональных доменов кортактина, вовлеченных во взаимодействие с другими белками. В данной работе была поставлена задача определения доменов кортактина, участвующих в регуляции ENaC, и, соответственно, соответствующего сигнального механизма Для решения этой задачи были использованы различные формы кортактина, в которых мутации критических аминокислот делали определенные домены кортактина не функциональными

Известно, что второй домен с N-конца кортактина, состоящий из семи 37-аминокислотных тандемных повторов, отвечает за связывание с актиновым цитоскелетом и высоко консервативен среди кортактинов различных видов [11]. В исследованном мутантном кортактине, получившем название «кортактин Д4», отсутствует четвертый из актин-связывающих повторов; данный мутант не способен взаимодействовать с F-актином [36]. Кодоны 421, 466 и 482 в гене кортактина мыши кодируют остатки тирозина, которые могут подвергаться фосфорилированию киназой c-Src, при этом тирозин 421 является первичным сайтом Src-опосредованного фосфорилирования кортактина in vivo [14, 15]. Мутант кортактина, названный «кортактин-ЗУ», содержит замену тирозина на фенилаланин во всех трех сайтах и не обладает присущей кортакгану фосфотирозиновой активностью. Мутантный кортактин W22A не способен связываться с комплексом Агр2/3 и, таким образом, не может участвовать в активации сборки актинового цитоскелета (показано in vitro и in vivo [30, 34]).

375

3 300

С §

о н

G 150

1 75

—

Л?

г<ЪГ

* &

4Г

í 15 п

I а = * e-fr И SI I S

Рис. 11. Действие мутантных форм кортактина на Е№С-опосредоваш1ый ток. А,

гистограммы плотности интегрального амилорид-чувствительного тока через мембрану клеток СНО, трансфицированных плазмидами субъединиц щЕИаС отдельно или совместно с различными мутантными вариантами кортактина Плотность тока рассчитывали для потенциала -80 мВ. Показано количество опытов в каждой группе (п) Звездочка обозначает статистически достоверное отличие между группами (р < 0.05) Б, типичный результат иммуноблотинга, показывающий уровень экспрессии кортактина в нетрансфицированных клетках СНО, а также клетках, трансфицированных кортактином дикого типа или его мутантными формами.

В наших исследованиях различные мутантные формы кортактина были использованы в электрофизиологических экспериментах по измерению ENaC-опосредованного тока в отведении от целой клетки (конфигурация whole-cell метода патч-кламп). Мы протестировали кортактин Д4, кортактин-ЗУ и кортактин W22A в системе клеток СНО, трансфицированных плазмидами, несущими гены различных мутантов кортактина и субъединицы канала. Согласно полученным результатам (рис. 11, А), только совместная трансфекция субъединиц ENaC и кортактина W22A не повлияла на регистрируемые интегральные токи, тогда как остальные мутаптные формы кортактина снижали амилорид-чувствительный ток так же, как и кортактин дикого типа. В качестве дополнительного контроля был проверен уровень экспрессии различных мутантов кортактина в клетках СНО (рис. II, Б). Иммуноблотинг показал, что уровень экспрессии мутантных белков сравним с контролем (кортактин дикого типа), и, соответственно, полученные эффекты не обусловлены различным уровнем эффективности трансфекции.

N-концевая часть кортактина содержит так называемый NTA (N-terminal acidic) -домен, внутри которого расположен мотив DDW, являющийся сайтом связывания для АгрЗ-компоненты комплекса Агр2/3, за которым следуют тандемные повторы из 37 аминокислот, отвечающие за взаимодействие с F-актином [10, 38]. В контрольных экспериментах мы проверили, будет ли NTA-домен, экспрессированный в клетках СНО отдельно от комплекса Агр2/3, влиять на ENaC-опосредованный амилорид-чувствительный ток. Согласно опубликованным данным [16], совместная трансфекция субъединиц ENaC и домена NTA не ингибирует амилорид-чувствительный ток по сравнению с током через мембрану клеток, трансфицированных только субъединицами канала (308.2 ± 50.2 и 286.2 ± 57.5 пА/пФ, соответственно, различие недостоверно (р > 0.05)) [16].

Электрофизиологические данные о вовлечении комплекса Агр2/3 в регуляцию ENaC посредством кортактина были подтверждены при помощи фармакологического подхода. Для этого был использован химический ингибитор комплекса Arp2/3 СК-0944666 (далее СК-666) [5, 25]. СК-666 связывается с сайтом на границе субъединиц Агр2 и АгрЗ комплекса Агр2/3, блокируя переход Агр2 и АгрЗ в их активное состояние [25]. В рамках задачи изучения роли комплекса Агр2/3 в механизме взаимодействия ENaC и кортактина клетки СНО, временно трансфицированные субъединицами ENaC отдельно и совместно с кортактином, были обработаны реагентом СК-666 (1 ч, 100 мкМ). Затем в конфигурации отведения от целой клетки метода патч-кламп был измерен амилорид-чувствительный ток через мембрану трансфицированных клеток. Как показано на рис. 12, обработка СК-666 предотвратила снижение ENaC-опосредованного интегрального тока, которое наблюдается при совместной трансфекции субъединиц ENaC и кортактина (значение плотности тока при экспрессии только субъединиц ENaC составило 328.1 ± 40.7 пА/пФ, при совместной экспрессии с кортактином - 138.1 ±3.7 и 343.3 ± 17.3 пА/пФ до и после обработки СК-666, соответственно). Полученные данные подтверждают выдвинутую гипотезу и позволяют с большей уверенностью заключить, что комплекс Агр2/3 необходим для кортактин-зависимого снижения активности ENaC.

5 зоо g —з

* ///

Рис. 12. Блокирование комплекса Агр2/3 при помощи 100 мкМ СК-666 предотвращает действие кортактина на Е\аС-оиосредованпый ток. Показана гистограмма, суммирующая интегральный амилорид-чувствительный ток через мембрану клеток СНО, трансфицированных субъединицами тЕЫаС отдельно и совместно с кортактином дикого типа Обработка клеток, трансфицированных Е1ЧаС совместно с кортактином 100 мкМ СК-666 вызывала возвращение плотности тока на контрольный уровень Звездочками обозначено статистически значимое различие между группами (**р < 0.01, ***р < 0.001).

Влияние разборки актиновых микрофиламентов и ингибирования комплекса Агр2/3 на взаимодействие между субъединицами эпителиального натриевого канала н кортактином Среди белков, посредством которых может осуществляться взаимодействие кортактин-ENaC, наиболее вероятными кандидатами являются актин и комплекс Агр2/3 Для проверки вовлечения этих белков в исследуемое взаимодействие были проведены дополнительные ко-иммунопреципитационные эксперименты. Клетки СНО трансфицировали субъединицами ENaC и кортактином дикого типа и затем обрабатывали либо актин-разрушающим реагентом цитохалазином Д (30 мин, 10 мкг/мл), либо ингибитором комплекса Агр2/3 СК-666 (1 ч, 100 мкМ) В данных экспериментах клетки СНО трансфицировали плазмидами, содержащими гены субъединиц ENaC, несущих последовательность Мус, и ген кортактина, несущий последовательность FLAG. Лизаты клеток затем подвергали иммунопреципитации антителами против FLAG либо Мус.

А контроль

+ цигохалачнп Д

шртакчип (FLAG)

Рис. 13. Деполимеризация актиновых микрофиламентов и ингибирование комплекса Агр2/3 не вызывают потери ассоциации между субъедииицамн ENaC и кортактином.

Клетки СНО были трансфицированы плазмидами, кодирующими гены субъединиц mENaC, несущих последовательности Мус, и кортактина дикого типа, конъюгированного с последовательностью FLAG. Через 24 ч после трансфекции клетки обрабатывали контрольным раствором (А, контроль), цитоскелет-деполимеризующим реагентом цитохалазином Д (10 мкМ; 30 мин) (Я) или ингибитором комплекса Arp2/3 СК-0944666 (СК666; 100 мкМ; 1 ч) (В). Общие клеточные лизаты затем либо анализировали электрофорезом в ПААГ с последующим иммуноблотингом (1), либо подвергали иммунопреципитации антителами против Мус или FLAG

(3).

Преципитированные ENaC и кортактин затем выявляли в иммуноблотах антителами против последовательностей Мус или FLAG, соответственно. На рис. 13 (А, Б, В) приведены результаты подобного эксперимента, показывающие, что ни разрушение актиновых микрофиламентов цитохалазином Д, ни ингибирование активности комплекса Агр2/3 не повлияли на ассоциацию между ENaC и кортактином. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что ENaC напрямую взаимодействует с кортактином, и последний таким образом модулирует изменения активности канала.

ВЫВОДЫ

1. Активность ENaC, нативно экспрессирующихся в иммортализованных и свежевыделенных клетках эпителия собирательных трубочек почки, а также восстановленных в клетках млекопитающих методом трансфекции, повышается при разборке актинового цитоскелета.

2. Актин-связывающий белок кортактин участвует в регуляции функциональной активности ENaC: подавление экспрессии кортактина повышает активность каналов.

3. Кортактин снижает вероятность нахождения эпителиальных натриевых каналов в открытом состоянии; содержание субъединиц канала в плазматической мембране клетки при этом остается неизменным.

4. Белковый комплекс Агр2/3 вовлечен в регуляцию ENaC и, вероятно, опосредует ингибирующее действие кортактина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Ilatovskaya D.V., Levchenko V., Pavlov T.S., Negulyaev Yu.A., and Staruschenko A. Cortical actin binding protein cortactin regulates ENaC activity via Arp2/3 complex. FASEB J. 25(8):2688-2699, 2011.

2. Karpushev A.V., Levchenko A., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Staruschenko A. Novel role of Racl/WAVE signaling mechanism in regulation of the Epithelial Na+ channel. Hypertension. 57:996-1002, 2011

3. Платовская Д.В., Павлов T.C., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. Механизмы регуляции эпителиальных натриевых каналов кортактином: вовлечение динамина. Цитология. 53(11):903-910, 2011.

4. Karpushev A.V., Ilatovskaya D.V., Staruschenko A. The actin cytoskeleton and small G protein RhoA are not involved in flow-dependent activation of ENaC. BMC Res Notes. 3(1):210, 2010.

5. Karpushev A.V., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Negulyaev Yu.A., Staruschenko A. Intact cytoskeleton is required for small G protein dependent activation of the epithelial Na+ channel. PLoSOne. 5(l):e8827, 2010.

6. Вачугова (Платовская) Д.В. и Морачевская Е.А. Механочувствительность натриевых каналов суперсемейства DEG/ENaC. Цитология. 51(10):806-814, 2009.

Тезисы копферепций

1. Илатовская Д.В., Павлов Т.С., Левченко В.В., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. Актин-связывающий белок кортактин регулирует эпителиальные натриевые каналы

при участии комплекса Лгр2/3. 15-я международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущине, Сборник тезисов, с. 129-130, 2011.

2. Платовская Д.В., Павлов Т.С., Левченко ВВ., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. Комплекс Агр2/3 участвует в регуляции эпителиальных натриевых каналов. Цитология. 53(9): 704-705, 2011.

3. Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Levchenko V., Negulyaev Yu.A., Staruschenko A. Key role for the cortical actin binding protein cortactin in the regulation of ENaC by actin cytoskeleton. 7"1 International Symposium on Aldosterone and the ENaC/Degenerin Family of Ion Channels: Molecular Mechanisms and Pathophysiology abstract book, pp. 22, 2011.

4. Staruschenko A., Karpushev A.V., Levchenko V., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S. Novel role of RaclAVAVE signaling mcchanism in regulation of the epithelial Na+ channel (ENaC). FASEBJ. 25:1039.1, 2011.

5. Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Levchenko V., Negulyaev Yu.A., Staruschenko A. Cortactin regulates ENaC via Arp2/3 complex. SICI/RECI III: Trends and challenges in ion channel research meeting. Tenerife, Spain, OS. 5, p. 56, 2011.

6. Ilatovskaya D.V., Karpushev A.V., Pavlov T.S., Levchenko V., Negulyaev Yu.A., Staruschenko A. Role of the cortical actin and cortactin in regulation of ENaC activity. J Am Soc Nephron, 21: PO 638, 2010

7. Staruschenko A.V., Ilatovskaya D.V., Karpushev A.V., Pavlov T.S., Levchenko V., Negulyaev Yu.A. Role of cortical actin and cortactin in regulation of ENaC activity. FASEB conference: Renal Hemodynamics: Mechanisms to Understand Disease, abstract 8, 2011.

8. Ilatovskaya D.V., Vinnakota K.C., Pavlov T.S., Staruschenko A.V. An essential role of cortactin in the regulation of ENaC. Experimental Biology'2010, Anaheim, USA. FASEB J. 24:606.2, 2010.

9. Вачугова (Платовская) Д.В. Разработка экспериментальной модели для исследования свойств натриевых каналов (ENaC). Молодые ученые — промышленности СевероЗападного региона. Политехнический симпозиум. Сборник тезисов. Санкт-Петербург, Россия. С. 53, 155, 2007.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ashkroft F.M, 2000. Academic Press. 1-502. 2. Berdiev B.K. et al. 1996. J.Biol.Chem. 271:1770417710. 3. Berdiev B.K. et al., 2001. Biophys.J. 80:2176-2186. 4. Bhalla V. and Hallows K.R. 2008. J.Am.Soc.NephroI. 19:1845-1854. 5. Blanchoin L. and Boujemaa-Paterski R. 2009. Chem.Biol. 16:1125-1126. 6. Bradford M M., 1976. Anal.Biochem. 72:248-254. 7. Butterworth MB. et al, 2009. Am.J.Physiol.Renal Physiol. 296:F10-F24. 8. Cantiello H.F., 1995. Kidney Int. 48:970-984. 9. Cantiello H.F. et al., ¡991. Am.J.Physiol. 261:C882-C888. 10. Cosen-Binker L.I. and Kapus A., 2006. Physiology (Bethesda ). 21:352-361. 11. Daly R.J., 2004. Biochcm.J. 382:13-25. 12. Hansson J.H. et al., 1995a. Nat.Genet. 11:76-S2. 13. Hansson J.H. et al, 1995b. Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A. 92:11495-11499. 14. Head J.A. et al., 2003. Mol.Biol.CcIl. 14:3216-3229. 15. Huang C. et al, 1997. J.Biol.Chem. 272:13911-13915. 16. Ilatovskaya D. V. et al, 2011. FASEB J. 25:2688-99. 17. Jovov B. et al, 1999. J.Biol.Chem. 274:37845-37854. 18. Karpushev A.V. et al, 2010. PLoS One, 5, e8827. 19. Levchenko V. et al, 2010. J.Cell.Physiol. 223:252-259. 20 Lifton RP., 1995. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92:8545-8551. 21. Lifton RP. et al., 2001. Cell. 104:545-556. 22. Malik B. etal, 2006. Am.J.Physiol.Renal Physiol. 290:F1285-F1294. 23. MazzochiC. etal, 2006a. 291:FU13-F1122. 24. MazzochiC. etal., 2006b. J.Biol.Chem. 281:6528-6538. 25. Nolen B.J. etal., 2009. Nature. 460:1031-1034. 26. PochynyukO. etal., 2008. Curr.Opin.Nephrol.Hypertens. 17:533-540. 27. Rossier B.C., 2002. J Gen.Physiol. 120:67-70. 28. Rossier B.C. andSchild L„ 2008. Hypertension. 52:595-600. 29. Rotin D. et al., 1994. EMBO J. 13:4440-4450. 30. Schafer DA.. 2002. Curr.Opin.Cell Biol. 14:7681. 31. Shumilina E.V. et al., Mol.Biol.Cell. 14:1709-1716. 32. Staruschenko A. et al, 2005. J.Biol.Chem. 280:39161-39167. 33. TianL. etal, 2008. J.Biol.Chem. 283:3067-3076. 34. Uruno T. et al., 2001. Nat.Cell Biol. 3:259-266. 35. Verrey F. et al.. 2008. Kidney Int. 73:691-696. 36. WeedSA., 2000. J.Cell Biol. 151:29-40. 37. Williams MR etal., 2007. Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A. 104:1741217417. 38. WuH. and Parsons J.T., 1993. J.Cell Biol. 120:1417-1426.

Подписано в печать 06.11.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 574

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Илатовская, Дарья Викторовна

1 ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность исследования.

1.2 Цели и задачи исследования.

1.3 Основные положения, выносимые на защиту.

1.4 Научная новизна.

1.5 Теоретическое и практическое значение работы.

1.6 Апробация работы.

1.7 Публикации и личный вклад автора.

1.8 Объем и структура диссертации.

1.9 Финансовая поддержка.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Транспорт натрия в собирательных трубочках почки.

2.1.1 Общая структура нефрона. Собирательные трубочки почки.

2.1.2 Транспорт натрия в собирательных трубочках почки.

2.2 Эпителиальные натриевые каналы: молекулярная организация, биофизические характеристики и физиологическая роль.

2.2.1 Суперсемейство дегенерины/эпителиальные натриевые каналы.

2.2.2 Физиологическая значимость ЕЫаС и болезни, опосредованные патологиями в структуре/регуляции канала.

2.2.3 Молекулярная организация эпителиальных натриевых каналов

2.2.4 Стехиометрия эпителиальных натриевых каналов.

2.2.5 Биофизические характеристики эпителиальных натриевых каналов: селективность, кинетика, фармакология, взаимодействие с блокирующими агентами.

2.3 Некоторые механизмы регуляции эпителиальных натриевых каналов.

2.3.1 Альдостерон-зависимая регуляция эпителиальных натриевых каналов.

2.3.2 Модуляция активности эпителиальных натриевых каналов посредством убиквитинирования и деубиквитинирования.

2.3.3 Роль протеолитического расщепления в регуляции эпителиальных натриевых каналов.

2.3.4 Механочувствительность эпителиальных натриевых каналов.

2.4 Регуляция натриевых каналов посредством актинового цитоскелета.

2.4.1 Роль кортикального актина в регуляции натриевых каналов в клетках миелоидной лейкемии К562.

2.4.2 Роль актинового цитоскелета в регуляции эпителиальных натриевых каналов.

2.5 Актин-связывающий белок кортактин и комплекс Агр2/3.

2.5.1 Участие кортактина в регуляции ионных каналов.

2.5.2 Белковый комплекс Агр2/3 и его химические ингибиторы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Клеточные культуры.

3.2 Реагенты и антитела.

3.2.1 Антитела.

3.2.2 Реагенты и плазмиды.

3.3 Выделение собирательных трубочек почки крысы.

3.4 Электрофизиологические методы.

3.4.1 Метод патч-кламп.

3.4.2 Измерение трансэпителиального потенциала.

3.4.3 Растворы, использованные в электрофизиологических экспериментах.

3.5 Молекулярно-биохимические методы.

3.5.1 Измерение цитотоксичности.

3.5.2 Выделение белков.

3.5.3 Коиммунопреципитация.

3.5.4 Выделение белков плазматической мембраны.

3.5.5 Электрофорез и иммуноблотинг.

3.5.6 Иммуногистохимическое окрашивание ткани почки крысы.

3.5.7 Окрашивание актинового цитоскелета.

3.6 Работа с бактериями, временная и постоянная трансфекции.

3.6.1 Приготовление компетентных бактериальных клеток.

3.6.2 Трансформация бактерий, выделение и очистка плазмид.

3.6.3 Временная трансфекция монослойной культуры.

3.6.4 Создание постоянных клеточных линий с пониженной экспрессией целевого белка методом лентивирусной трансфекции.

3.7 Микроскопия.

3.7.1 Флуоресцентная микроскопия фиксированных препаратов и обработка изображений.

3.7.2 Электронная микроскопия.

3.7.3 Статистические расчеты.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Исследование роли разборки Б-актина в регуляции эпителиальных натриевых каналов.

4.1.1 Влияние разрушения актинового цитоскелета на активность эпителиальных натриевых каналов, экспрессированных в клетках СНО и НЕК293-Т.

4.1.2 Активация эндогенных эпителиальных натриевых каналов в клетках собирательных трубочек почки в ответ на разрушение актиновых микрофилам ентов.

4.1.3 Изучение изменения доли эпителиальных натриевых каналов в мембране при разборке актинового цитоскелета.

4.2 Определение влияния актин-связывающего белка кортактина на активность эпителиальных натриевых каналов.

4.2.1 Исследование влияния кортактина на ток, опосредованный эпителиальными натриевыми каналами, в модели трансфицированных клеток.

4.2.2 Экспрессия и локализация кортактина в почке крысы и иммортализованных клеточных линиях собирательных трубочек почки

4.2.3 Роль кортактина в реабсорбции натрия в клетках собирательных трубочек почки.

4.2.4 Действие кортактина на вероятность открытого состояния эпителиальных натриевых каналов (Р0).

4.2.5 Кортактин ассоциирован с субъединицами ЕШС.

4.3 Изучение механизма кортактин-зависимой регуляции эпителиальных натриевых каналов.

4.3.1 Роль белкового комплекса Агр2/3 в регуляции эпителиальных натриевых каналов кортактином.

4.3.2 Влияние разборки актиновых микрофиламентов и ингибирования комплекса Агр2/3 на ассоциацию между субъединицами эпителиального натриевого канала и кортактином.

5 ОБСУЖДЕНИЕ.

6 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC)"

1.1 Актуальность исследования

В современном мире одной из основных причин смертности являются патологии сердечно-сосудистой системы, в основе которых лежит гипертония — заболевание, при котором наблюдается хроническое повышение давления крови (соотношение более 140/90 мм. рт. ст. считается повышенным и представляет опасность для развития хронических сердечно сосудистых заболеваний). Вероятность развития заболевания возрастает у пожилых людей. По данным ВОЗ 63% населения в мире старше 45 лет имеет повышенное давление.

Одной из основных причин гипертонии является нарушение солевого гомеостаза организма. Центральным фактором, регулирующим объем и давление крови, является реабсорбция ионов натрия в почке. Окончательная стадия реабсорбции натрия происходит в дистальном отделе нефрона, и управляется различными эндокринными стимулами. Транспорт ионов натрия из мочи в кровь в данном сегменте нефрона регулируется эпителиальными натриевыми каналами (ENaC) (Ashkroft, 2000). Таким образом, ENaC играет одну из определяющих ролей в гомеостазе соли на уровне всего организма (Alvarez de la Rosa D. et al., 2000). Исследование функционирования этих каналов напрямую относится к изучению регуляции давления крови и пониманию причин заболеваний, связанных с нарушением баланса жидкости в организме (Hansson et al., 1995b; Hansson et al., 1995a; Rossier et al., 2002; Rossier, Schild, 2008). Физиологическое значение ENaC на уровне организма подчеркивается тем, что мутации в субъединицах канала и его регуляторах вызывают тяжелые наследуемые формы сердечнососудистых заболеваний человека (Lifton, 1995; Lifton et al., 2001). Например, мутация, отвечающая за частичную потерю функции ENaC, приводит к псевдогипоальдостеронизму первого типа, характеризующемуся слабой реабсорбцией соли (Chang et al., 1996), а мутации, повышающие активность канала, напротив, - к синдрому Лиддла, тяжелой форме гипертонии (Hansson et al., 1995а; Lifton, 1995; Lifton et al., 2001).

Ранее было показано, что активность ENaC частично регулируется элементами актинового цитоскелета (Cantiello et al., 1991; Cantiello, 1995). Кроме того, существуют данные о том, что F-актин и альфа-субъединица ENaC колокализуются в субапикальной области цитоплазмы эпителиальных клеток и взаимодействуют за счет сайта связывания на альфа-субъединице ENaC (Mazzochi et al., 2006a; Mazzochi et al., 2006b). Эти данные подтвердили гипотезы о том, что цитоскелет играет важную роль в регуляции активности ENaC. Однако, несмотря на то, что регуляция ENaC вследствие изменений динамики цитоскелета была показана, механизм этого явления остается неизвестным. Кроме того, на данный момент не идентифицированы белки, вовлеченные в регуляцию ENaC актиновым цитоскелетом.

Ассоциированный с кортикальным актином белок кортактин был открыт в качестве основного субстрата тирозин-киназы v-Src (Wu, Parsons, 1993). Позже было показано, что он имеет широкий спектр действия - напрямую взаимодействует с актиновым цитоскелетом, фосфорилируется разнообразными киназами, активирует комплекс Агр2/3, который потенциирует ветвление актина и участвует в эндоцитозе, связываясь с динамином (Cosen-Binker, Kapus, 2006). Недавно было показано, что кортактин также участвует в регуляции эпителиальных ионных каналов - Kvl.2 и кальций-активируемого калиевого канала ВК (Tian et al., 2006; Williams et al., 2007). Таким образом, учитывая уже имеющиеся в научной литературе данные о вовлечении кортактина в регуляцию ионных каналов, представлялось необходимым изучение внутриклеточных механизмов цитоскелет-зависимой регуляции ENaC и роли кортактина в этом процессе.

Регуляция ENaC, обусловленная перестройками актинового цитоскелета, представляет собой сложный процесс, который модулируется многими факторами. Несмотря на интенсивные исследования, в том числе и с использованием метода патч-кламп, до представленной работы мало что было известно о детальных механизмах регуляции эпителиальных натриевых каналов при перестройках F-актина и цитоскелет-связывающих белках, вовлеченных в этот процесс. В работе получены обладающие научной новизной результаты, позволяющие охарактеризовать некоторые пути регуляции ENaC при разборке F-актина и определить вовлечение в этот процесс цитоскелет-связывающих белков кортактина и комплекса Агр2/3, что дает основания для дальнейших исследований в этой области и более глубокого изучения многоуровневого пути цитоскелет-зависимой регуляции Е№С и других ионных каналов.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Илатовская, Дарья Викторовна

6 выводы

1. Активность Е№С, нативно экспрессирующихся в иммортализованных и свежевыделенных клетках эпителия собирательных трубочек почки, а также восстановленных в клетках млекопитающих методом трансфекции, повышается при разборке актинового цитоскелета.

2. Актин-связывающий белок кортактин участвует в регуляции функциональной активности Е№С: подавление экспрессии кортактина повышает активность каналов.

4. Белковый комплекс Агр2/3 вовлечен в регуляцию ЕЫаС и, вероятно, опосредует ингибирующее действие кортактина.

7 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

3. Илатовская Д.В., Павлов T.C., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. Механизмы регуляции эпителиальных натриевых каналов кортактином: вовлечение динамина. Цитология. 53(11):903-910, 2011.

4. Karpushev A.V., Ilatovskaya D.V., Staruschenko A. The actin cytoskeleton and small G protein RhoA are not involved in flow-dependent activation of ENaC. BMC Res Notes. 3(1):210, 2010.

6. Вачугова (Илатовская) Д.В. и Морачевская Е.А. Механочувствительность натриевых каналов суперсемейства DEG/ENaC. Цитология. 51(10):806-814, 2009.

Тезисы конференций

1. Илатовская Д.В., Павлов Т.С., Левченко В.В., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. Актин-связывающий белок кортактин регулирует эпителиальные натриевые каналы при участии комплекса Агр2/3. 15-я международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, Сборник тезисов, с. 129—130, 2011.

2. Илатовская Д.В., Павлов Т.С., Левченко В.В., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. Комплекс Агр2/3 участвует в регуляции эпителиальных натриевых каналов. Цитология. 53(9):704-705, 2011.

3. Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Levchenko V., Negulyaev Yu.A., Staruschenko A. Key role for the cortical actin binding protein cortactin in the regulation of ENaC by actin cytoskeleton. 7th International Symposium on Aldosterone and the ENaC/Degenerin Family of Ion Channels: Molecular Mechanisms and Pathophysiology abstract book, pp. 22, 2011.

4. Staruschenko A., Karpushev A.V., Levchenko V., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S. Novel role of Racl/WAVE signaling mechanism in regulation of the epithelial Na+ channel (ENaC). FASEB J. 25:1039.1, 2011.

8. Ilatovskaya D.V., Vinnakota K.C., Pavlov T.S., Staruschenko A.V. An essential role of cortactin in the regulation of ENaC. Experimental Biology'2010, Anaheim, USA. FASEB J. 24:606.2, 2010.

9. Вачугова (Илатовская) Д.В. Разработка экспериментальной модели для исследования свойств натриевых каналов (ENaC). Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона. Политехнический симпозиум. Сборник тезисов. Санкт-Петербург, Россия. С. 53, 155, 2007.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Илатовская, Дарья Викторовна, Санкт-Петербург

1. Вачугова Д.В., Морачевская Е.А. 2009. Механочувствительность натриевых каналов суперсемейства DEG/ENaC. Цитология, 51(10): 806-814.

2. Илатовская Д.В., Павлов Т.С., Негуляев Ю.А., Старущенко А.В. 2011. Механизмы регуляции эпителиальных натриевых каналов кортактином: вовлечение динамина. Цитология, 53(11): 903-910.

3. Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. 2006. Структурно-функциональная организация транспорта в эпителиальных системах. I. Эпителиальные натриевые каналы. 48(10): 817-840.

4. Сударикова А.В., Васильева И.О., Морачевская Е.А., Негуляев Ю.А. 2012. Молекулярная и функциональная идентификация натриевых каналов в клетках К562. Цитология. 54 (7): 573-579

5. Aim Y.J., Brooker D.R., Kosari F., Harte B.J., Li J., Mackler S.A., and Kleyman T.R. 1999. Cloning and functional expression of the mouse epithelial sodium channel. Am.J.Physiol. 277: F121-F129

6. Alvarez de la Rosa D., Canessa C.M., Fyfe G.K., and Zhang P. 2000. Structure and regulation of amiloride-sensitive sodium channels. Annu.Rev.Physiol. 62: 573-594

7. Anantharam A. and Palmer L.G. 2007. Determination of epithelial Na+ channel subunit stoichiometry from single-channel conductances. J Gen.Physiol. 130: 55-70

8. Ash/croft F.M. 2000. Ion channels and Disease. San Diego, CA: Academic Press, pp. 1502.

9. Babilonia E., Li D., Wang Z., Sun P., Lin D.H., Jin Y, and Wang W.H. 2006. Mitogen-activated protein kinases inhibit the ROMK (Kir l.l)-like small conductance К channels in the cortical collecting duct. J.Am.Soc.Nephrol. 17: 2687-2696

10. Benos D.J. 1982. Amiloride: a molecular probe of sodium transport in tissues and cells. Am.J.Physiol. 242: C131-C145

11. Benos D.J., Awayda M.S., Ismailov I.I., and Johnson J.P. 1995. Structure and function of amiloride-sensitive Na+ channels. J.Membr.Biol. 143: 1-18

12. Benos D.J. and Stanton B.A. 1999. Functional domains within the degenerin/epithelial sodium channel (Deg/ENaC) superfamily of ion channels. J Physiol. 520 Pt 3: 631-644

13. Bens M., Chassin C., and Vandewalle A. 2006. Regulation of NaCl transport in the renal collecting duct: lessons from cultured cells. Pflugers Arch. 453: 133-146

14. Bens M. and Vandewalle A. 2008. Cell models for studying renal physiology. Pflugers Arch. 457: 1-15

15. Berdiev B.K., Latorre R., Benos D.J., and Ismailov II. 2001. Actin modifies Ca2+ block of epithelial Na+ channels in planar lipid bilayers. Biophys.J. 80: 2176-2186

16. Berdiev B.K., Prat A. G., Cantiello H.F., Ausiello D.A., Fuller C.M., Jovov B., Benos D.J., and Ismailov I.I. 1996. Regulation of epithelial sodium channels by short actin filaments. J Biol.Chem. 271: 17704-17710

17. Bhalla V. and Hallows K.R. 2008. Mechanisms of ENaC regulation and clinical implications. J Am Soc Nephrol. 19: 1845-1854

18. Blanchoin L. and Boujemaa-Paterski R. 2009. Inhibitors target actin nucleators. Chem.Biol. 16: 1125-1126

19. Botero-Velez M, Curtis J.J., and Warnock D.G. 1994. Brief report: Liddle's syndrome revisited—a disorder of sodium reabsorption in the distal tubule. N.Engl.J Med. 330: 178181

20. Bounoutas A. and Chalfie M. 2007. Touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Pflugers Arch. 454: 691-702

21. Bradford MM 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72: 248-254

22. Brown D., Hirsch S., and Gluck S. 1988. Localization of a proton-pumping ATPase in rat kidney. J Clin Invest. 82: 2114-2126

23. Brown D., Paunescu T.G., Breton S., and Marshansky V. 2009. Regulation of the V-ATPase in kidney epithelial cells: dual role in acid-base homeostasis and vesicle trafficking. J.Exp.Biol. 212: 1762-1772

24. Butterworth M.B., Edinger R.S., Frizzell R.A., and Johnson J.P. 2009. Regulation of the epithelial sodium channel by membrane trafficking. Am J Physiol Renal Physiol. 296: F10-F24

25. Butterworth M.B., Edinger R.S., Ovaa H., Burg D., Johnson J.P., and Frizzell R.A. 2007. The deubiquitinating enzyme UCH-L3 regulates the apical membrane recycling of the epithelial sodium channel. J Biol.Chem. 282: 37885-37893

26. Campbell D.H., Sutherland R.L., and Daly R.J. 1999. Signaling pathways and structural domains required for phosphorylation of EMSl/cortactin. Cancer Res. 59: 5376-5385

27. Canessa C.M., Horisberger J.D., and Rossier B.C. 1993. Epithelial sodium channel related to proteins involved in neurodegeneration. Nature. 361: 467-470

28. Canessa C.M., Merillat A.M., and Rossier B.C. 1994a. Membrane topology of the epithelial sodium channel in intact cells. Am J Physiol. 267: C1682-C1690

29. Canessa C.M., SchildL., Buell G., Thorens B., Gautschi I., Horisberger J.D., and Rossier

30. B.C. 1994b. Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel is made of three homologous subunits. Nature. 367: 463-467

31. Cantiello H.F. 1995. Role of the actin cytoskeleton on epithelial Na+ channel regulation. Kidney Int. 48: 970-984

32. Cantiello H.F., Stow J.L., Prat A.G., and Ausiello D.A. 1991. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Am.J.Physiol. 261: C882-C888

33. Cao H., Thompson H.M., Krueger E. W., and McNiven M.A. 2000. Disruption of Golgi structure and function in mammalian cells expressing a mutant dynamin. J Cell Sci. 113: 1993-2002

34. Carattino M.D., Sheng S., and Kleyman T.R. 2005. Mutations in the pore region modify epithelial sodium channel gating by shear stress. J Biol.Chem. 280: 4393-4401

35. Carattino M.D., Sheng S., and Kleyman T. R. 2004. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. J.Biol.Chem. 279: 4120-4126

36. Cheng C., Prince L. S., Snyder P.M., and Welsh M.J. 1998. Assembly of the epithelial Na+ channel evaluated using sucrose gradient sedimentation analysis. J Biol.Chem. 273: 22693-22700

37. Copeland S.J., Berdiev B.K., Ji H. L., Lockhart J., Parker S., Fuller C.M., and Benos D.J. 2001. Regions in the carboxy terminus of alpha-bENaC involved in gating and functional effects of actin. Am J Physiol Cell Physiol. 281: C231-C240

38. Coscoy S., Lingueglia E., Lazdunski M., and Barbry P. 1998. The Phe-Met-Arg-Phe-amide-activated sodium channel is a tetramer. J.Biol.Chem. 273: 8317-8322

39. Cosen-Binker L.I. and Kapus A. 2006. Cortactin: the gray eminence of the cytoskeleton. Physiology (Bethesda.). 21: 352-361

40. Daly R.J. 2004. Cortactin signalling and dynamic actin networks. Biochem.J. 382: 13-25

41. Debonneville C., Flores S.Y., Kamynina E., Plant P.J., Tauxe C., Thomas M.A., Munster

42. C., Chraibi A., Pratt J.H., Horisberger J.D., Pearce D., Loffing J., and Staub O. 2001. Phosphorylation of Nedd4-2 by Sgkl regulates epithelial Na(+) channel cell surface expression. EMBO J. 20: 7052-7059

43. DijkinkL., HartogA., van Os C.H., andBindels R.J. 2002. The epithelial sodium channel (ENaC) is intracellularly located as a tetramer. Pflugers Arch. 444: 549-555

44. Dinudom A., Fotia A.B., Lefkowitz R.J., Young J.A., Kumar S., and Cook D.I. 2004. The kinase Grk2 regulates Nedd4/Nedd4-2-dependent control of epithelial Na+ channels. Proc.Natl. Acad. Sci.U. S .A. 101: 11886-11890

45. Driscoll M. and Chalfie M. 1991. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349: 588-593

46. Drummond H.A., Grifoni S.C., and Jernigan N.L. 2008. A new trick for an old dogma: ENaC proteins as mechanotransducers in vascular smooth muscle. Physiology (Bethesda.). 23: 23-31

47. Drummond H.A., Welsh M.J., and Abboud F.M. 2001. ENaC subunits are molecular components of the arterial baroreceptor complex. Ann.N.Y.Acad.Sci. 940: 42-47

48. Duleh S.N. and Welch M.D. 2010. WASH and the Arp2/3 complex regulate endosome shape and trafficking. Cytoskeleton (Hoboken.). 67: 193-206

49. Edinger R.S., Lebowitz J., Li H., Alzamora R., Wang H., Johnson J.P., and Hallows K.R. 2009. Functional regulation of the epithelial Na+ channel by IkappaB kinase-beta occurs via phosphorylation of the ubiquitin ligase Nedd4-2. J Biol.Chem. 284: 150-157

50. Eladari D., Chambrey R., Frische S., Vallet M., and Edwards A. 2009. Pendrin as a regulator of ECF and blood pressure. Curr.Opin.Nephrol.Hypertens. 18: 356-362

51. Emtage L., Gu G., Hartwieg E., and Chalfie M. 2004. Extracellular proteins organize the mechanosensory channel complex in C. elegans touch receptor neurons. Neuron. 44: 795807

52. Eskandari S., Snyder P.M., Kreman M., Zampighi G.A., Welsh M.J., and Wright E.M. 1999. Number of subunits comprising the epithelial sodium channel. J Biol.Chem. 274: 27281-27286

53. Fejes-Toth G and Naray-Fejes-Toth A. 1993. Differentiation of intercalated cells in culture. Pediatric Nephrology. 7: 780-784

54. Firsov D., Gautschi I., Merillat A.M., Rossier B.C., and Schild L. 1998. The heterotetrameric architecture of the epithelial sodium channel (ENaC). EMBO J. 17: 344352

55. Garty H. 1994. Molecular properties of epithelial, amiloride-blockable Na+ channels. FASEB J. 8: 522-528

56. Garty H. and Palmer L.G. 1997. Epithelial sodium channels: function, structure, and regulation. Physiol Rev. 77: 359-396

57. Geller D S., Rodriguez-Soriano J., Vallo B. A., Schifter S., Bayer M., Chang S.S., and Lifton R. P. 1998. Mutations in the mineralocorticoid receptor gene cause autosomal dominant pseudohypoaldosteronism type I. Nat.Genet. 19: 279-281

58. Gumz M.L., Cheng K.Y., Lynch I.J., Stow L.R., Greenlee M.M., Cain B.D., and Wingo C.S. 2010. Regulation of alphaENaC expression by the circadian clock protein Period 1 in mpkCCD(cl4) cells. Biochim.Biophys.Acta. 1799: 622-629

59. Hallows K.R., Mount P.F., Pastor-Soler N.M., and Power D.A. 2010. Role of the energy sensor AMP-activated protein kinase in renal physiology and disease. Am.J Physiol Renal Physiol.

60. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B., and Sigworth F.J. 1981. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391: 85-100

61. Head J.A., Jiang D., Li M., Zorn L.J., Schaefer E.M., Parsons J.T., and Weed S.A. 2003. Cortactin tyrosine phosphorylation requires Racl activity and association with the cortical actin cytoskeleton. Mol.Biol.Cell. 14: 3216-3229

62. Hebert S.C., Desir G., Giebisch G., and Wang W.2005. Molecular diversity and regulation of renal potassium channels. Physiol Rev. 85: 319-371

63. Higgs H.N. and Pollard T.D. 2001. Regulation of actin filament network formation through ARP2/3 complex: activation by a diverse array of proteins. Annu.Rev.Biochem. 70: 649-676

64. Hoy W.E., Hughson M.D., Bertram J.F., Douglas-Denton R., and Amann K. 2005. Nephron number, hypertension, renal disease, and renal failure. J Am Soc Nephrol. 16: 2557-2564

65. Huang C., Liu J., Haudenschild C.C., and Zhan X. 1998. The role of tyrosine phosphorylation of cortactin in the locomotion of endothelial cells. J Biol.Chem. 273: 25770-25776

66. Huang C., Ni Y., Wang T., Gao Y., Haudenschild C.C., and Zhan X. 1997. Down-regulation of the filamentous actin cross-linking activity of cortactin by Src-mediated tyrosine phosphorylation. J.Biol.Chem. 272: 13911-13915

67. Hughey R.P., Carattino M.D., and Kleyman T.R. 2007. Role of proteolysis in the activation of epithelial sodium channels. Curr.Opin.Nephrol.Hypertens. 16: 444-450

68. Jasti J., Furukawa H., Gonzales E.B., and Gouaux E. 2007. Structure of acid-sensing ion channel 1 at 1.9 A resolution and low pH. Nature. 449: 316-323

69. Jovov B., Tousson A., Ji H.L., Keeton D., Shlyonsky V., Ripoll P.J., Fuller C.M., and Benos D.J. 1999. Regulation of Epithelial Na+ Channels by Actin in Planar Lipid Bilayers and in the Xenopus Oocyte Expression System. J.Biol.Chem. 274: 37845-37854

70. Kabra R., Knight K.K., Zhou R., and Snyder P.M. 2008. Nedd4-2 induces endocytosis and degradation of proteolytically cleaved epithelial Na+ channels. J Biol.Chem. 283: 6033-6039

71. Kaissling B. and Kriz W. (1992). In: Handbook of Physiology, Section 8: Renal Physiology. Morphology of the Loop of Henle, Distal Tubule, and Collecting Duct. (New York, NY: Oxford University Press).

72. Kanner S.B., Reynolds A.B., Vines R.R., and Parsons J.T. 1990. Monoclonal antibodies to individual tyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-encoded tyrosine kinases. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87: 3328-3332

73. Kapus A., Di C.C., Sun J., Zhan X., Kim L., Wong T.W., and Rotstein O.D. 2000. Cell volume-dependent phosphorylation of proteins of the cortical cytoskeleton and cell-cell contact sites. The role of Fyn and FER kinases. J.Biol.Chem. 275: 32289-32298

74. Kapus A., Szaszi K, Sun J., Rizoli S., and Rotstein O.D. 1999. Cell shrinkage regulates Src kinases and induces tyrosine phosphorylation of cortactin, independent of the osmotic regulation ofNa+/H+ exchangers. J.Biol.Chem. 274: 8093-8102

75. Karpushev A.V., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., Negulyaev Y.A., and Staruschenko A. 2010. Intact cytoskeleton is required for small G protein dependent activation of the epithelial Na channel. PLoS ONE. 5: e8827

76. Karpushev A. V., Ilatovskaya D.V., and Staruschenko A. 2010c. The actin cytoskeleton and small G protein RhoA are not involved in flow-dependent activation of ENaC. BMC.Res Notes. 3: 210

77. Karpushev A. V., Levchenko V., Ilatovskaya D.V., Pavlov T.S., and Staruschenko A. 2011. Novel role of Racl/WAVE signaling mechanism in regulation of the epithelial Na+ channel. Hypertension. 57: 996-1002

78. Kelleher J.F., Atkinson S.J., and Pollard T.D. 1995. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. J.Cell Biol. 131: 385-397

79. Kellenberger S. and Schild L. 2002. Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. Physiol Rev. 82: 735-767

80. Keller G., Zimmer G., Mall G., Ritz E., and Amann K. 2003. Nephron number in patients with primary hypertension. N.Engl.J Med. 348: 101-108

81. Kitamura K and Tomita K. 2010. Regulation of renal sodium handling through the interaction between serine proteases and serine protease inhibitors. Clinical and Experimental Nephrology. 14: 405-410

82. Kleyman T.R., Carattino M.D., and Hughey R.P. 2009. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. J Biol.Chem. 284: 20447-20451

83. Kleyman T.R.and Cragoe E.J., Jr. 1988. Amiloride and its analogs as tools in the study of ion transport. J.Membr.Biol. 105: 1-21

84. Koefoed-Johnsen V. and Ussing H.H. 1958. The nature of the frog skin potential. Acta Physiol Scand. 42: 298-308

85. Ma H.P. 2011. Hydrogen Peroxide Stimulates the Epithelial Sodium Channel through a Phosphatidylinositide 3-Kinase-dependent Pathway. J.Biol.Chem. 286: 32444-32453

86. Machesky L.M. and Insall R.H. 1998. Scarl and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex. Curr.Biol. 8: 1347-1356

87. Madsen KM., Verlander J. W., and Tisher C.C. 1988. Relationship between structure and function in distal tubule and collecting duct. J Electron Microsc.Tech. 9: 187-208

88. Malik B., Price S.R., Mitch W.E., Yue Q., and Eaton D.C. 2006. Regulation of epithelial sodium channels by the ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Am.J.Physiol Renal Physiol. 290: F1285-F1294

89. Mall M., Grubb B.R., Harkema J.R., O'Neal W.K., and Boucher R.C. 2004. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nat.Med. 10: 487-493

90. Martinez-Quiles N., Ho H.Y., Kirschner M. W., Ramesh N., and Geha R.S. 2004. Erk/Src phosphorylation of cortactin acts as a switch on-switch off mechanism that controls its ability to activate N-WASP. Mol.Cell Biol. 24: 5269-5280

91. Maximov A.V., Vedernikova E.A., Hinssen H., Khaitlina S.Y., and Negulyaev Y.A. 1997. Ca-dependent regulation of Na+-selective channels via actin cytoskeleton modification in leukemia cells. FEBS Lett. 412: 94-96

92. Mazzochi C., Benos D.J., and Smith P.R. 2006a. Interaction of epithelial ion channels with the actin-based cytoskeleton. Am.J.Physiol Renal Physiol. 291: F1113-F1122

93. Mazzochi C., Bubien J.K., Smith P.R., and Benos D.J. 2006b. The carboxyl terminus of the alpha-subunit of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel binds to F-actin. J.Biol.Chem. 281: 6528-6538

94. McCormick J.A., Bhalla V, Pao A.C., and Pearce D. 2005. SGK1: a rapid aldosterone-induced regulator of renal sodium reabsorption. Physiology (Bethesda.). 20: 134-139

95. McNicholas C.M. and Canessa C.M. 1997. Diversity of channels generated by different combinations of epithelial sodium channel subunits. J Gen.Physiol. 109: 681-692

96. Meneton P., Loffing J., and Warnock D.G. 2004. Sodium and potassium handling by the aldosterone-sensitive distal nephron: the pivotal role of the distal and connecting tubule. Am J Physiol Renal Physiol. 287: F593-F601

97. Mettlen M., Pucaduil T., Ramachandran R., and Schmid S.L. 2009. Dissecting dynamin's role in clathrin-mediated endocytosis. Biochemical Society Transactions. 37: 1022-1026

98. Mooren O.L., Kotova T.I., Moore A.J., and Schafer D.A. 2009. Dynamin2 GTPase and cortactin remodel actin filaments. J.Biol.Chem. 284: 23995-24005

99. Morimoto T., Liu W., Woda C., Carattino M.D., Wei Y, Hughey R.P., Apodaca G., Satlin L.M., and Kleyman T.R. 2006. Mechanism underlying flow stimulation of sodium absorption in the mammalian collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 291: F663-F669

100. Nakamura Y., Wood C.L., Patton A.P., Jaafari N., Henley J.M., Mellor JR., and Hanley J.G. 2011. PICK1 inhibition of the Arp2/3 complex controls dendritic spine size and synaptic plasticity. EMBO J. 30: 719-730

101. Negulyaev Y.A., Khaitlina S.Y., Hinssen H., Shumilina E.V., and Vedernikova E.A. 2000. Sodium channel activity in leukemia cells is directly controlled by actin polymerization. J.Biol.Chem. 275: 40933-40937

102. Nielsen S., DiGiovanni S.R., Christensen E.I., Knepper M.A., and Harris H.W. 1993. Cellular and subcellular immunolocalization of vasopressin-regulated water channel in rat kidney. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90: 11663-11667

103. Nolen B.J., Tomasevic N., Russell A., Pierce D. W., Jia Z., McCormick C.D., Hartman J., Sakowicz R., and Pollard T.D. 2009. Characterization of two classes of small molecule inhibitors of Arp2/3 complex. Nature. 460: 1031-1034

104. Palmer L.G. 1992. Epithelial Na channels: function and diversity. Annu.Rev.Physiol. 54: 51-66

105. Passero C.J., Hughey R.P., and Kleyman T.R. 2010. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr.Opin.Nephrol Hypertens. 19: 13-19

106. Pochynyuk O., Bugaj V., and Stockand J.D. 2008. Physiologic regulation of the epithelial sodium channel by phosphatidylinositides. Curr.Opin.Nephrol.Hypertens. 17: 533-540

107. Pochynyuk O., Medina J., Gamper N., Genth H., Stockand J.D., and Staruschenko A. 2006. Rapid translocation and insertion of the epithelial Na+ channel in response to RhoA signaling. J Biol.Chem. 281: 26520-26527

108. Praetorius H.A. and Spring K.R. 2005. A physiological view of the primary cilium. Annu.Rev Physiol. 67: 515-529

109. Prat A.G., Bertorello A.M., Ausiello D.A., and Cantiello H.F. 1993. Activation of epithelial Na+ channels by protein kinase A requires actin filaments. Am J Physiol. 265: C224-C233

110. Puelles V.G., Hoy W.E., Hughson M.D., Diouf B., Douglas-Denton R.N., and Bertram J.F. 2010. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Curr.Opin.Nephrol Hypertens.

111. Qualmann B. and Kessels M.M. 2009. New players in actin polymerization—WH2-domain-containing actin nucleators. Trends Cell Biol. 19: 276-285

112. Rohatgi R., Ma L., Miki H., Lopez M., Kirchhausen T., Takenawa T., and Kirschner M. W. 1999. The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-dependent signals to actin assembly. Cell. 97: 221-231

113. Rossier B.C. 2002. Hormonal regulation of the epithelial sodium channel ENaC: N or P(o)? J Gen.Physiol. 120: 67-70

114. Rossier B.C., Pradervand S., SchildL., andHummler E. 2002. Epithelial sodium channel and the control of sodium balance: interaction between genetic and environmental factors. Annu.Rev.Physiol. 64: 877-897

115. Rossier B.C. and Schild L. 2008. Epithelial sodium channel: mendelian versus essential hypertension. Hypertension. 52: 595-600

116. RotinD., Bar-Sagi D., O'Brodovich H., Merilainen J., Lehto V.P., Canessa C.M., Rossier B.C., and Downey G.P. 1994. An SH3 binding region in the epithelial Na+ channel (alpha rENaC) mediates its localization at the apical membrane. EMBO J. 13: 4440-4450

117. Rotin D. and Kumar S. 2009. Physiological functions of the HECT family of ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10: 398-409

118. Rotin D. and Schild L. 2008. ENaC and its regulatory proteins as drug targets for blood pressure control. Curr.Drug Targets. 9: 709-716

119. Rotin D. and Staub O. 2011. Role of the ubiquitin system in regulating ion transport. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 461: 1-21

120. Rouiller I., Xu X.P., Amann K.J., Egile C., Nickell S., Nicastro D., Li R., Pollard T.D., Volkmann N., and Hanein D. 2008. The structural basis of actin filament branching by the Arp2/3 complex. J.Cell Biol. 180: 887-895

121. Sanchez-Perez A., Kumar S., and Cook D.I. 2007. GRK2 interacts with and phosphorylates Nedd4 and Nedd4-2. Biochem.Biophys.Res.Commun. 359: 611-615

122. Schafer D.A. 2002. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Curr.Opin.Cell Biol. 14: 76-81

123. Schafer D.A., Weed S.A., Binns D., Karginov A. V., Parsons J.T., and Cooper J.A. 2002. Dynamin2 and cortactin regulate actin assembly and filament organization. Curr.Biol. 12: 1852-1857

124. Schild L. 2004. The epithelial sodium channel: from molecule to disease. Rev.Physiol Biochem.Pharmacol. 151: 93-107

125. Schild L., Schneeberger E., Gautschi I., and Firsov D. 1997. Identification of amino acid residues in the alpha, beta, and gamma subunits of the epithelial sodium channel (ENaC) involved in amiloride block and ion permeation. J.Gen.Physiol. 109: 15-26

126. Shimkets R.A., Lifton R.P., and Canessa C.M. 1997. The activity of the epithelial sodium channel is regulated by clathrin-mediated endocytosis. J.Biol.Chem. 272: 25537-25541

127. Shumilina E.V., Negulyaev Y.A., Morachevskaya E.A., Hinssen H., and Khaitlina S.Y. 2003. Regulation of sodium channel activity by capping of actin filaments. Mol.Biol.Cell. 14: 1709-1716

128. Snyder P.M. 2005. Regulation of epithelial Na+ channel trafficking. Endocrinology. 146: 5079-5085

129. Snyder P.M. 2002. The epithelial Na+ channel: cell surface insertion and retrieval in Na+ homeostasis and hypertension. Endocr.Rev. 23: 258-275

130. Snyder P.M., Cheng C., Prince L.S., Rogers J.C., and Welsh M.J. 1998. Electrophysiological and biochemical evidence that DEG/ENaC cation channels are composed of nine subunits. J Biol.Chem. 273: 681-684

131. Snyder P.M., Olson D.R., Kabra R., Zhou R., and Steines J.C. 2004. cAMP and serum and glucocorticoid-inducible kinase (SGK) regulate the epithelial Na(+) channel through convergent phosphorylation of Nedd4-2. J Biol.Chem. 279: 45753-45758

132. Snyder P.M., Price M.P., McDonald F.J., Adams C.M., Volk K.A., Zeiher B.G., Stokes J.B., and Welsh M.J. 1995. Mechanism by which Liddle's syndrome mutations increase activity of a human epithelial Na+ channel. Cell. 83: 969-978

133. Soderling S.H. 2009. Grab your partner with both hands: cytoskeletal remodeling by Arp2/3 signaling. Sci.Signal. 2: e5

134. Staruschenko A. 2012. Regulation of transport in the connecting tubule and cortical collecting duct. Compr.Physiol. 2: 1541-1584

135. Staruschenko A., Adams E., Booth R.E., and Stockand J.D. 2005a. Epithelial Na+ channel subunit stoichiometry. Biophys.J. 88: 3966-3975

136. Staruschenko A., Negulyaev Y.A., and Morachevskaya E.A. 2005b. Actin cytoskeleton disassembly affects conductive properties of stretch-activated cation channels in leukaemia cells. Biochim.Biophys.Acta. 1669: 53-60

137. Staruschenko A., Nichols A., Medina J.L., Camacho P., Zheleznova N.N., and Stockand J.D. 2004a. Rho small GTPases activate the epithelial Na(+) channel. J.Biol.Chem. 279: 49989-49994

138. Staruschenko A., Patel P., Tong Q., Medina J.L., and Stockand J.D. 2004b. Ras activates the epithelial Na(+) channel through phosphoinositide 3-OH kinase signaling. J.Biol.Chem. 279: 37771-37778

139. Staruschenko A., Pochynyuk O., and Stockand J.D. 2005d. Regulation of epithelial Na+ channel activity by conserved serine/threonine switches within sorting signals. J Biol.Chem. 280: 39161-39167

140. Staub O., Abriel H., Plant P., Ishikawa T., Kanelis V., Saleki R., Horisberger J.D., Schild L., and Rotin D. 2000. Regulation of the epithelial Na+ channel by Nedd4 and ubiquitination. Kidney Int. 57: 809-815

141. Staub O., Dho S., Henry P., Correa J., Ishikawa T., McGlade J., and Rotin D. 1996. WW domains of Nedd4 bind to the proline-rich PY motifs in the epithelial Na+ channel deleted in Liddle's syndrome. EMBO J. 15: 2371-2380

142. Staub O., Gautschi I, Ishikawa T., Breitschopf K, Ciechanover A., Schild L., and Rotin D. 1997. Regulation of stability and function of the epithelial Na+ channel (ENaC) by ubiquitination. EMBO J. 16: 6325-6336

143. Staub O. and Verrey F. 2005. Impact of Nedd4 proteins and serum and glucocorticoid-induced kinases on epithelial Na+ transport in the distal nephron. J.Am.Soc.Nephrol. 16: 3167-3174

144. Stockand J.D. 2010. Vasopressin regulation of renal sodium excretion. Kidney Int. 78: 849-856

145. Stockand J.D., Staruschenko A., Pochynyuk O., Booth R.E., and Silverthorn D.U. 2008. Insight toward epithelial Na+ channel mechanism revealed by the acid-sensing ion channel 1 structure. IUBMB.Life. 60: 620-628

146. Sun S.C., Wang Z.B., Xu Y.N., Lee S.E., Cui X.S., and Kim N.H. 2011. Arp2/3 complex regulates asymmetric division and cytokinesis in mouse oocytes. PLoS.One. 6: el8392

147. Svenningsen P., Friis U.G., Bistrup C., Buhl KB., Jensen B.L., and Skott O. 2011. Physiological regulation of epithelial sodium channel by proteolysis. Curr.Opin.Nephrol Hypertens.

148. Tian L., Chen L., McClafferty H., Sailer C.A., Ruth P., Knaus H.G., and Shipston M.J. 2006. A noncanonical SH3 domain binding motif links BK channels to the actin cytoskeleton via the SH3 adapter cortactin. FASEB J. 20: 2588-2590

149. Tian L., McClafferty H., Chen L., and Shipston M.J. 2008. Reversible tyrosine protein phosphorylation regulates large conductance voltage- and calcium-activated potassium channels via cortactin. J Biol.Chem. 283: 3067-3076

150. Uruno T., Liu J., Zhang P., Fan Y, Egile C., Li R., Mueller S.C., and Zhan X. 2001. Activation of Arp2/3 complex-mediated actin polymerization by cortactin. Nat.Cell Biol. 3: 259-266

151. Vallet V., Chraibi A., Gaeggeler H.P., Horisberger J.D., and Rossier B.C. 1997. An epithelial serine protease activates the amiloride-sensitive sodium channel. Nature. 389: 607-610

152. Vallet V., Pfister C., Loffing J., and Rossier B.C. 2002. Cell-surface expression of the channel activating protease xCAP-1 is required for activation of ENaC in the Xenopus oocyte. J Am Soc.Nephrol. 13: 588-594

153. Verrey F., Fakitsas P., Adam G., and Staub O. 2008. Early transcriptional control of ENaC (de)ubiquitylation by aldosterone. Kidney Int. 73: 691-696

154. Volkmann N., Amann K.J., Stoilova-McPhie S., Egile C., Winter D.C., Hazelwood L., Heuser J.E., Li R., Pollard T.D., and Hanein D. 2001. Structure of Arp2/3 complex in its activated state and in actin filament branch junctions. Science. 293: 2456-2459

155. Wade J.B., Stanton B.A., and Brown D. 1992. Structural Correlates of Transport in Distal Tubule and Collecting Duct Segments. New York, NY: Oxford University Press.

156. Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., Voilley N., and Lazdunski M. 1995. Molecular cloning and functional expression of a novel amiloride-sensitive Na+ channel. J Biol Chem. 270: 27411-27414

157. Warnock D.G. and Rossier B.C. 2005. Renal sodium handling: the role of the epithelial sodium channel. J Am Soc Nephrol. 16: 3151-3153

158. Weed S.A., Karginov A.V., Schafer D.A., Weaver A.M., Kinley A.W., Cooper J.A., and Parsons J.T. 2000. Cortactin localization to sites of actin assembly in lamellipodia requires interactions with F-actin and the Arp2/3 complex. J Cell Biol. 151: 29-40

159. Weed S.A. and Parsons J.T. 2001. Cortactin: coupling membrane dynamics to cortical actin assembly. Oncogene. 20: 6418-6434

160. Wiemuth D., Ke Y., Rohlfs M., and McDonald F.J. 2007. Epithelial sodium channel (ENaC) is multi-ubiquitinated at the cell surface. Biochem.J. 405: 147-155

161. Williams M.R., Markey J.C., Doczi M.A., and Morielli A.D. 2007. An essential role for cortactin in the modulation of the potassium channel Kvl.2. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 104: 17412-17417

162. Wu H. and Parsons J.T. 1993. Cortactin, an 80/85-kilodalton pp60src substrate, is a filamentous actin-binding protein enriched in the cell cortex. J.Cell Biol. 120: 1417-1426

163. Yang Q., Zhang X.F., Pollard T.D., and Forscher P. 2012. Arp2/3 complex-dependent actin networks constrain myosin II function in driving retrograde actin flow. J.Cell Biol. 197: 939-956

164. Zhou R. and Snyder P.M. 2005. Nedd4-2 phosphorylation induces serum and glucocorticoid-regulated kinase (SGK) ubiquitination and degradation. J.Biol.Chem. 280: 4518-4523

165. Zuckerman J.B., Chen X., Jacobs J.D., Hu B., Kleyman T.R., and Smith P.R. 1999. Association of the epithelial sodium channel with Apx and alpha-spectrin in A6 renal epithelial cells. J Biol.Chem. 274: 23286-23295

Информация о работе

Илатовская, Дарья Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Роль актин-связывающего белка кортактина в регуляции эпителиальных натриевых каналов (ENaC) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы