Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов в клетках НЕК293

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов в клетках НЕК293"

На правах рукописи

НИКОЛАЕВ Антон Владимирович

РОЛЬ АДАПТЕРНЫХ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА HOMER В РЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОР-УПРАВЛЯЕМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ В КЛЕТКАХ НЕК293

03.00.25

Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сан кт-Петербург 2004

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук

Казначеева Елена Валентиновна

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Медведева Наталья Дмитриевна

Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Антонов Сергей Михайлович

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН

Ведущая организация: Санкт-Петербургский

государственный университет

Защита состоится 4 февраля 2005 года в 15 ч. на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан 29 декабря 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук ^ ИИ- Марахова

17Ш

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Временное повышение концентрации кальция в цитоплазме (кальциевый сигнал) играет значительную роль в таких важных клеточных процессах, как деление, дифференцировка и синтез нуклеиновых кислот В электроневозбудимых клетках кальциевый сигнал, активируемый при стимуляции рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С (PLC), опосредуется выбросом кальция из внутриклеточных депо и его входом через рецептор-управляемые каналы [1] Механизм выброса кальция из депо достаточно хорошо изучен. Основной вклад в этот выброс вносится рецептором инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3R), активируемым при взаимодействии с инозитол-1,4,5-трисфосфатом (IP3). В то же время рецептор-управляемый вход кальция остается менее исследованным Существует достаточно большое количество рецептор-управляемых каналов в электроневозбудимых и нейрональных клетках. Большинство из них активируется при увеличении концентрации IP3 в цитоплазме [1]. Как правило, эти каналы также активируются при пассивном опустошении кальциевых депо [2]. В этом случае принято говорить о депо-управляемом входе кальция в клетки через депо-управляемые каналы (SOC).

Механизм активации рецептор-управляемых каналов остается не выясненным Доступные данные обсуждаются в рамках двух основных гипотез Гипотеза водорастворимого посредника предполагает существование особого посредника - фактора входа кальция, высвобождающегося при опустошении кальциевых депо, диффундирующего к плазматической мембране и активирующего кальциевые каналы [3,4]. Гипотеза конформационного взаимодействия предполагает, что каналы активируются при их взаимодействии с рецептором IР3 [5] В последнее время накапливаются данные о существовании обоих механизмов и об их синергичном действии в невозбудимых клетках [6].

Фармакологические характеристики многих рецептор-управляемых каналов не отличаются друг от друга. В связи с этим разделять различные рецептор-управляемые каналы можно только по их электрофизиологическим свойствам. Поэтому для изучения механизмов регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов требуется их регистрация на одиночном уровне. Ранее было показано, что в клетках А431 стимуляция рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С, или приложение IP3 к внутренней стороне плазматической мембраны активирует низкопроводящие кальциевые каналы в плазматической мембране Данные каналы были названы Imin каналами и охарактеризованы в нескольких типах электроневозбудимых клеток [7] Данные каналы также активировались при пассивном опустошении кальциевых депо. Мы показали, что в их активационном механизме важную роль играет рецептор IP3 эндоплазматического ретикулума (Zubov, Kaznacheyeva, Nikolaev et al., 1999). Кроме того, мы также показали, что мембранный липид фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (PIP2) ингибирует активность Imin каналов (Kaznacheyeva, Zubov, Nikolaev et al., 2000).

Эти данные ставят вопрос о механизмах локализации элементов системы

рецептор-управляемого входа кальция в э ках. Логично

предположить, что должны существовать белки, связывающие в единый молекулярный комплекс фосфолипазу С, рецептор 1Рз и Imin канал в плазматической мембране. В постсинаптической плотности нейрональных клеток существует целый ряд скэффолд белков, сязывающих в единый макромолекулярный комплекс рецепторы, сопряженные с фосфолипазой С на постсинаптической мембране, рецептор IP3 в мембране эндоплазматического ретикулума и другие функционально-значимые белки постсинапса [8]. Среди этих белков важную роль играют белки семейства Homer. Данные белки связывают рецептор 1Р3 и глутаматный рецептор (mGluR) друг с другом и с другими белками [9] Как правило, мишени Homer белков имеют последовательность PPXXF или PPXF Белки семейства Homer экспрессируются и в электроневозбудимых клетках, в частности в клетках НЕК293. Однако их функция в этих клетках неясна Можно предположить, что эти белки могут связываться с рецептором 1Рз в мембране эндоплазматического ретикулума и кальциевым каналом в плазматической мембране и собирать их в единый макромолекулярный комплекс.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование роли белков семейства Homer в регуляции активности каналов Imin. Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать каналы рецептор-управляемого входа кальция в клетках нек?93 на одиночном уровне.

2. Выяснить как меняется активность каналов Imin в клетках НЕК293 при нарушении связи белков семейства Homer с белками мишенями.

3. Выяснить как меняется активность каналов Imin при нарушении олигомерной структуры белков семейства Homer.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рецептор-управляемый вход кальция в клетках НЕК293 опосредован как минимум тремя типами кальциевых каналов, одним из которых является Imin канал.

2. Белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию Imin каналов.

3. Для блокирования спонтанной активации Imin каналов требуются олигомерные комплексы белков семейства Homer.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые показано, что UTP-индуцированный вход кальция в клетках НЕК293 опосредуется тремя типами кальциевых каналов. Один из них - это ранее изученный в клетках А431 миниатюрный кальциевый канал Imin. Он имеет проводимость 1.2 пСм и потенциал реверсии +50 мВ. Данный канал активируется в клетках НЕК293 приложением IP3 к внутренней стороне плазматической мембраны, но, в отличие от Imin каналов в клетках А431, не чувствителен к состоянию кальциевых депо Два других рецептор-управляемых канала активируются пассивным опустошением кальциевых депо и имеют проводимости 5 и 17 пСм. Кроме того, с помощью молекулярно-биологических и электрофизиологических методик было показано, что адаптерные белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию каналов Imin. В работе также было показано, что для такого действия Homer белков требуется их олигомерная организация^ s ,

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции рецептор-управляемого входа кальция в электроневозбудимых и нейрональных клетках Результаты, свидетельствующие о роли белков семейства Homer в регуляции Imin каналов, безусловно расширяют представления о механизмах активации ионных каналов. Полученные данные о рецептор-улравляемом входе Са2+ в невозбудимые клетки создают основу для структурно-функционального анализа рецептор-управляемых кальциевых каналов и могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических препаратов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на симпозиуме «Кальциевая сигнализация» (Италия, 2000), Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001), IV конференции Чешского общества нейробиологов (Прага, 2001), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004) и семинарах лаборатории ионных каналов клеточных мембран Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, содержащего 157 публикаций. Работа изложена на 98 страницах текста и иллюстрирована 19 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки эпидермоидной карциномы человека А431 и клетки эмбрионального эпителия почки человека НЕК293 (из коллекции клеточных культур Института цитологии, РАН) культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина). За 2-4 суток до начала эксперимента клетки высевали на фрагменты покровных стёкол (3x3 мм).

Электрофизиология. В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурацях: cell-attached - микропипетка образует плотный контакт с мембраной клетки, не нарушая её целостности, что позволяет регистрировать токи, протекающие через ограниченный пипеткой фрагмент мембраны клетки; inside-out - фрагмент мембраны, ограниченный плотным контактом с микропипеткой, изолируется от клеточной поверхности, что открывает доступ к внутриклеточной поверхности плазматической мембраны; whole-cell -после образования плотного контакта фрагмент мембраны, ограниченный микропипеткой, разрушается, что позволяет регистрировать интегральные токи через плазматическую мембрану всей клетки.

Потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой. Микропипетки изготавливали из мягкого молибденового стекла и покрывали силиконовой резиной Sylgard (Dow Corning, США). Электрическое сопротивление заполненных раствором пипеток составляло 3-8 МОм (для whole-cell) и 8-20 МОм (в остальных случаях).

Регистрацию токов проводили с помощью усилителя РС501-А (Warner Instruments, США) с сопротивлением в цепи обратной связи 10 ГОм. Усиленный и

предварительно отфильтрованный встроенным в усилитель двухполюсным фильтром Бесселя (частота среза 500 Гц) сигнал оцифровывали на частоте 2500 Гц с помощью платы АЦП L-305 (L-Card, Москва).

В опытах, выполненных в конфигурации whole-cell, раствор регистрирующей пипетки содержал (в мМ)- 145 NMDG-аспартата, 10 EGTA/CsOH, 10 HEPES/CsOH, рН 7 3, 1.5 MgCI2 и либо 4.5 CaCI2 (рСа 7), либо 0 CaCI2 (рСа > 9). Внеклеточный раствор содержал (в мМ)' 140 NMDG-Asp, 10 BaCI2, 10 HEPES/CsOH, рН 7 3 В конфигурации inside-out внутриклеточный раствор (камера) содержал (в мМ)' 140 К-глутамата, 5 NaCI, 1 MgCI2, 10 HEPES/KOH, рН 7.4, 2 EGTA/KOH и 1 13 CaCI2 (рСа 7) В конфигурации cell-attached внеклеточный раствор (камера) содержал (в мМ): 140 KCI, 5 NaCI, 10 HEPES/KOH, 1 MgCI2 и 2 CaCI2. Раствор пипетки содержал (в мМ) 105 BaCI2,10 Tris/HCI (рН 7.3).

При регистрации интегральных токов в конфигурации whole-cell потенциал на мембране поддерживали на уровне 0 мВ Периодически (каждые 10 с) потенциал на мембране изменяли до -100 мВ (на 30 мс), а затем постепенно (со скоростью 1 мВ/мс) его величину изменяли до +70 мВ. Для сравнения величины токов через плазматическую мембрану разных клеток, амплитуду токов относили к емкости клетки (16-28 пФ). Записи, полученные до активации исследуемых токов, использовали для вычитания тока утечки и тока через другие каналы Измерение внутриклеточной концентрации кальция проводили с помощью флуоресцентного зонда Fura-2 (Molecular Probes, США). Перед опытом клетки инкубировали 1 ч в растворе Хенкса, содержащем 5 мкМ Fura-2AM и 0 025% детергента Pluronic (Molecular Probes, США) при 37°С Затем клетки выдерживали 30 мин в растворе Хенкса при 37°С для снятия ацетометильного блока с молекул зонда Внеклеточный бескальциевый раствор содержал в мМ: 140 KCI, 10 HEPES/KOH (рН 7.3), 0.1 EGTA, кальциевый раствор содержал в мМ 140 KCI, 10 HEPES/KOH (рН 7 3), 2 СаСЬ Изменение концентрации кальция в цитозоле определяли по изменению флуоресценции Fura-2 при возбуждении УФ излучением с длиной волны 340 и 380 нм. Отношение интенсивностей флуоресценции зонда при двух длинах волн возбуждения F340/F380 прямо пропорционально концентрации свободного кальция внутри клетки. Приведенные в тексте данные представлены средними арифметическими значениями и их среднеквадратичными отклонениями. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков Homer 1а и Homer 1с. Белки экспрессировали в клетках E.coli штамма BL21 в среде LB при 37°С Индукцию проводили 1 мМ IPTG в течении 2-3 ч. Клеточную суспензию охлаждали на льду, центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин (Beckman JA-10), осадок ресуспендировали в 5 мл PBS с добавлением лизоцима, 1% Triton Х-100 (при выделении белка GST-Homer 1с) и ингибиторов протеаз. При выделении белка Homer 1с клетки дополнительно разрушали одним циклом замораживания/оттаивания Суспензию клеток разрушали ультразвуком. Лизат клеток пропускали через колонку с 2 мл глутатион-сефарозы. Колонку промывали 20 мл PBS с 1% Triton Х-100. Белок элюировапи 2 мл буфера для элюции (50 мМ Tris, 100 мкМ глутатиона, рН 8.0). Качество очистки белка проверяли с помощью электрофореза и иммуноблоттинга с использованием поликпональных антител к

GST Для проверки того, что Homer белки взаимодействуют со своими мишенями, были поставлены контрольные пулдаун-эксперименты с рецептором 1Рз Для этой цели к 25 мкл сефарозы со связанными на ней Homer белками добавляли лизат мозжечка крысы и инкубировали при +4°С в течении 2 ч После этого сефарозу промывали 3 раза 1 мл PBS с тритоном и варили с 50 мкл буфера для нанесения на SDS электрофорез. Наличие IP3R в пробах проверяли методом иммуноблоттинга с использованием поликпональных антител к IP3R (Kaznacheyeva et al„ 1998). Использованные в экспериментах белки взаимодействовали с рецептором IP3 (данные не показаны).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Уридинтрифосфат и пассивное опустошение депо активируют вход кальция через плазматическую мембрану. Для того чтобы убедиться, что в клетках НЕК293, используемых нами, существует рецептор-индуцированный и депо-управляемый вход кальция, мы провели несколько серий экспериментов по измерению внутриклеточной концентрации кальция. В первой серии экспериментов мы исследовали рецептор-управляемый вход кальция в клетках НЕК293. Результаты данной серии представлены на рис. 1. Стимуляция рецепторов P2Y2, сопряженных с фосфолипазой С, приложением 100 мкМ уридинтрифосфата (UTP) в бескальциевом растворе вызывала выброс кальция из кальциевых депо. Повышение концентрации кальция в цитоплазме было временным, и концентрация кальция снижалась до нормального уровня за 2-3 минуты. Дальнейшее приложение 2 мМ кальция с внешней стороны мембраны вызывало его вход через рецептор-индуцируемые кальциевые каналы (рис. 1А).

I 1 I 1 I 1 I 1 1 1 I 1 I 3 4 5 G 7 8 9 время (мин)

I Ч 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 2 3 4 5 6 7 время (мин)

I Ч 1 I 8 9 10

Рис. 1. Активация рецептор-индуцированного и депо-управляемого входа кальция уридинтрифосфатом и TPEN в клетках НЕК293. А - Подача 100 мкМ 1ГГР активирует как выброс кальция из внутриклеточных депо, так и его вход через плазматическую мембрану. Б - Пассивное опустошение депо с использованием 1 мМ TPEN вызывает активацию депо-управляемого входа кальция.

Из полученных данных следует, что активация рецепторов, сопряженных с PLC, вызывает как выброс кальция из внутриклеточных депо, так и его вход через кальциевые каналы плазматической мембраны Однако такой протокол

эксперимента не может дать однозначный ответ, существуют ли депо-управляемые каналы в клетках НЕК293, или же рецептор-индуцированный вход кальция опосредуется кальциевыми каналами, не чувствительными к состоянию внутриклеточных кальциевых депо. Для того, чтобы ответить на этот вопрос, были проведены эксперименты с использованием мембран-проницаемого агента TPEN, который проникает в кальциевые депо и афинно связывает свободные ионы кальция, понижая тем самым их концентрацию Подача 1 мМ TPEN в бескальциевом растворе не вызывала увеличения концентрации внутриклеточного кальция (рис 1Б) Дальнейшее приложение 2 мМ кальция к внешней стороне плазматической мембраны приводило к повышению концентрации кальция в цитоплазме за счет его входа через плазматическую мембрану В контрольных экспериментах подача 100 мкМ UTP после приложения TPEN в бескальциевой среде не вызывала выброса кальция из внтуриклеточных депо, что говорит о том, что концентрация свободного кальция в депо является низкой Таким образом, из полученных данных следует, что в клетках НЕК293 существует депо-управляемый вход кальция через плазматическую мембрану.

2. Изучение депо-управляемых и рецептор-индуцируемых кальциевых каналов на одиночном уровне.

Во многих типах невозбудимых клеток существуют различные типы депо-управляемых каналов, практически не отличающихся по своим фармакологическим характеристикам. В связи с этим, данные каналы возможно разделить по их проводимости и селективности, измеренных на одиночном уровне Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение того, какие конкретно кальциевые каналы отвечают за рецептор-индуцируемый и депо-управляемый вход кальция в клетках НЕК293 С этой целью мы провели несколько серий экспериментов с использованием метода patch-clamp с измерением токов на уровне одиночных каналов Для активации рецептор-индуцированных токов использовали эксперименты в конфигурации cell-attached и inside-out с добавлением 100 мкМ UTP или 2.5 мкМ IP3 в качестве активатора. При этом потенциал на мембране фиксировали на уровне -70 мВ. В качестве проникающего иона использовали барий в концентрации 105 мМ.

2.1 UTP активирует низкопроводящие кальций-селективные депо-независимые каналы Imin. На рис. 2А представлены результаты экспериментов в конфигурации cell-attached с использованием 100 мкМ UTP в качестве активатора. Подача 100 мкМ UTP к внешней стороне плазматической мембраны приводила к активации токов входящего направления (рис 2А, п=48/118) Амплитуда одиночных каналов составляла -0.18 пА при потенциале на мембране, равном -70 мВ. Изоляция фрагмента мембраны в искусственный внутриклеточный раствор приводила к полному исчезновению активности. Этот факт говорит о том, что в активации данных каналов участвует водорастворимый посредник. Приложение 2 5 мкМ IP3 приводило к активации токов входящего направления (рис 2 Б, п=19/84). Средняя вероятность открытого состояния каналов NPo в контроле составляла 0.010Ю.001, а после добавления IP3 - 0.10±0.02 (п=13). Амплитуда тока через

одиночный канал при потенциале на мембране, равном -70 мВ, составляла -0 18 пА (рис, 2 Б, нижняя часть) (Николаев и др , 2004а)

На рисунке 2Б представлены примеры записей токов при различных потенциалах Видно, что токи имеют постоянные амплитуды одиночных каналов Кроме того, чаще всего мы наблюдали активность нескольких (3-4) одиночных каналов в каждом фрагменте мембраны На наш взгляд, это говорит о высокой кластеризации ионных каналов, активируемых в ответ на приложение 1Р3

Cell-attached

юоцм utp

-70 мВ

30 сек

ШЯПРЬ

1 сек

Inside-out

2.5цМ IP,

-70 мВ

10 сек j 0.5 пА

Контроль -70 мВ

0.5 ПА

2.5 цМ 1Р3

-110 мВ

-70 мВ1

-30 мВ

-О 22 пА

-0 17 пА

1 с®« 0.5 ПА

пА

Рис. 2. UTP и IP3 активируют кальциевые каналы в плазматической мембране клеток линии НЕК293. А - Запись токов, активированных приложением UTP, в сжатом и расширенном масштабах времени Б - Запись токов, активированных приложением IP3, в сжатом и расширенном масштабах времени. Указаны примеры токов при различных потенциалах.

Вольт-амперные характеристики UTP- и IP3- активируемых каналов совпадали (рис. ЗА). На рисунке видно, что в условиях, когда в качестве проникающего иона использовалось 105 мМ бария, каналы имеют проводимость, равную 1.2 пСм, и потенциал реверсии выше +50 мВ. Среднее время открытого состояния каналов составляет 9 мсек (рис. ЗБ). Кроме того, активность каналов зависела от потенциала на мембране (данные не показаны). Такие же свойства характерны для Imin каналов в клетках А431 (Zubov, Kaznacheyeva, Nikolaev et al.,1999; Kaznacheyeva, Zubov, Nikolaev et al. 2000) Эти сравнения позволяют заключить, что в клетках НЕК293 приложение UTP к внешней стороне мембраны и IP3 к внутренней стороне мембраны вызывает активацию каналов Imin (Николаев и др., 2004а).

Рис. 3.

Электрофизиологические свойства каналов, активируемых приложением 1Р3 и UTP. А - Вольт-амперные характеристики каналов,

активируемых приложением UTP (полые кружочки) и 1Р3 (заполненные кружочки) Б - Гистограмма распределения времени открытого состояния канала, активированного

приложением 1Р3 при потенциале -70 мВ.

Для того чтобы проверить, являются ли Tmin каналы в клетках НЕК293 депо-зависимыми, подавали TPEN к внешней стороне плазматической мембраны. Ни в одном из 84 экспериментов мы не наблюдали развития токов с электрофизиологическими характеристиками, сходными с характеристиками Imin (п=20, данные не показаны). Кроме two, подача других реагентов, вызывающих пассивное опустошение кальциевых депо (ВАРТА-АМ и тапсигаргин), также не вызывала активации Imin каналов. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что механизм активации Imin каналов в клетках НЕК293 является PLC-зависимым, с одной стороны, но при этом депо-независимым - с другой. При этом следует отметить, что в клетках А431 Imin каналы проявляют свойство депо-зависимости, поскольку они активировались тапсигаргином [10].

2.2. Imin каналы в клетках НЕК293 регулируются уровнем PIP2 плазматической мембраны.

В нашей предыдущей работе мы показали, что в клетках А431 Imin каналы активируются рецептором IP3 эндоплазматического ретикулума (Zubov, Kaznacheyeva, Nikolaev et at., 1999) Кроме того, PIP2, связывая и блокируя IP3R, блокирует также и Imin каналы (Kaznacheyeva, Zubov, Nikolaev et al., 2000; Казначеева, Зубов, Николаев и др. 2002). Мы предположили, что в клетках НЕК293 может быть сходный способ регуляции активности Imin каналов через уровень Р1Рг. Для проверки этого предположения была проведена следующая серия экспериментов. IP3 в концентрации 2.5 мкМ подавали к внутренней стороне изолированного фрагмента мембраны в конфигурации inside-out. В этом случае IP3 не всегда вызывал активацию каналов Imin Можно предположить, что это связано с тем, что Imin каналы заблокированы PIP2. Последующее добавление моноклональных антител к PIP2 активировало Imin каналы в 84% опытов (п=1б/19, рис 4А). В тех случаях, когда IP3 вызывал активацию каналов Imin, последующее добавление Р!РгАЬ вызывало дальнейшее увеличение активности Imin (рис 4Б) (Николаев и др. 2004а). В среднем, PIP2Ab в 3 раза увеличивали активность Imin. Полученные данные указывают на то, что Imin каналы в клетках НЕК293 блокируются PIP2. В клетках А431 это ингибирование осуществлялось через взаимодействие PIP2 с рецептором IP3 (Kaznacheyeva, Zubov,

д mslde-out -70 mV

2 5 цМ IP3

>ЧРК

20 сек 11 nA а a

17 pA

500 M0 0.5 nA

2 5 цМ IP,

PIP2Ab

iiUiiii

Рис. 4 Активность 1т1п в клетках НЕК293 регулируется уровнем Р1Рг в плазматической мембране.

А - Подача 1Рз не всегда вызывает активацию 1пгнп. Последующая подача Р1Р2АЬ вызывает появление активности Ып.

Б - Р1РгАЬ усиливают активность 1гшп, вызванную 1Рз.

Nikolaev et а!, 2000). Это позволяет предполагать, что в клетках НЕК293 IP3R сходным образом активирует и регулирует каналы Imin.

2.3. UTP активирует два типа депо-зависимых каналов в плазматической мембране клеток НЕК293. Из предыдущих экспериментов следует, что UTP и IP3 активируют каналы Imin При этом эксперименты с использованием TPEN указывают на то, что в клетках НЕК293 Imin каналы не являются депо-управляемыми. Однако эксперименты по измерению внутриклеточной концентрации кальция указывают на то, что в этих клетках пассивное опустошение депо активирует депо-управляемые каналы (рис 1Б) Часто, при приложении UTP одновременно с активацией Imin, мы наблюдали активацию двух других типов каналов с большей амплитудой. Мы подробнее изучили их свойства и проверили, активируются ли эти каналы при пассивном опустошении депо.

В 40% опытов (п=48/118) приложение UTP активировало каналы с характеристиками, отличающимися от характеристик Imin каналов (рис 5А). Они имели амплитуду одиночного канала, равную 1 7 пА, в том случае, когда потенциал на мембране составлял -70 мВ Проводимость этих каналов составляла 17 пСм, а потенциал реверсии составлял более +30 мВ (рис 5Г) Данные каналы активировались также приложением IP3 к внутренней стороне плазматической мембраны (п=14/80, рис. 5Б). В отличие от каналов Imin данные каналы активировались при пассивном опустошении кальциевых депо в экспериментах с использованием 1 мМ TPEN (п=18/84, рис. 5В).

А

-70мВ

20Г

100цм UTP

бОсек

5сек [ 1пА

В

-70мВ

1шм tpen

ЗОсек! 2пА

-70МВ

-ЮмВ

1О0К |1пА

-70мВ

2.5 цМ IP,

fWMT "S

2nA

ТП^Г

Зсек |1"A

Д

TfWV"

-150 -100 -50 0 50МВя25-,

17пСм

Т «2 1 мсек

о1

О 10 20 30 40 мсек

Рис. 5 UTP активирует кальций-селективные депо-управляемые каналы

А - активация каналов приложением 100 мкМ UTP в cell-attached экспериментах Б - активация каналов приложением 2.5 мкМ IP3 в inside-out экспериментах. В - активация каналов пассивным опустошением кальциевых депо при разных потенциалах. Г - Вольтамперная характеристика каналов. Д - Гистограмма распределения времени открытого состояния канала

Второй тип депо-управляемых каналов, зарегистрированный в клетках НЕК293, встречался гораздо реже. Они имели меньшую амплитуду одиночного канала (рис б) и активировались приложением 100 мкМ UTP (рис. 6А, п=11/118) Пассивное опустошение кальциевых депо с использованием 10 mM TPEN (рис. 6Б) или 100 мкМ ВАРТА-АМ активировало каналы в 14% опытов (п=11/84) Канал имел проводимость, равную 5 пСм, и был неселективен для двухвалентных катионов по отношению к моновалентным, поскольку потенциал реверсии данных каналов был близок к 0 мВ (рис. 6Г)- Данный канал не активировался приложением IP3 к внутренней стороне изолированного фрагмента мембраны (п=80; данные не показаны) Таким образом, в клетках НЕК293 UTP активирует депо-зависимые неселективные каналы через неизвестный посредник, не затрагивающий IP3 чувствительный путь.

Полученные нами данные указывают на то, что в клетках НЕК293 существует рецептор-индуцируемый и депо-управляемый вход кальция через плазматическую мембрану. Рецептор-управляемый вход кальция опосредуется как минимум тремя типами каналов. Один из них - Imin канал, описанный нами ранее в клетках А431 и перитонеальных макрофагах мыши. Два других типа каналов имеют большую

проводимость и также активируются пассивным опустошением кальциевых депо. Четвертый тип кальциевых каналов - CRAC канал, также опосредующий депо-управляемый вход кальция, наблюдался нами в whole-cell экспериментах (Николаев и др , 2004а, данные не показаны) Зарегистрировать активность CRAC каналов на одиночном уровне не представляется возможным из-за их крайне низкой проводимости [11] Полученные нами данные создают основу для структурно-функционального анализа рецептор-индуцированного и депо-управляемого входа кальция с применением молекулярно-биологических методик.

-1р° .. .-у. . :. вРиВ

1пА

5 пСшГ

У

-0.1 —0,2 -0,3 -0,4пА

Т =2 1 мсек

I 1 | 1 |

0 5 10 1S 20мсек

Рис. 6. UTP активирует неселективный депо-управляемый канал. Все эксперименты проведены в конфигурации cell-attached. А - активация каналов приложением 100 мкМ UTP. Б - активация каналов приложением 1 мМ TPEN. В - активация каналов 100 мкМ ВАРТА-АМ. Г - Вольтамперная характеристика каналов. Д - гистограмма распределения времени открытого состояния

3. Белки семейства Homer блокируют спонтанную активность Imin каналов. Скэффолд-белки семейства Homer были открыты в постсинаптической области нейронов, где они играют важную роль в связывании ряда постсииаптических белков. Было продемонстрировано, что Нотег-белки связываются с IP3R, mGluR и рядом других белков, участвующих в кальциевом ответе нейронов, и связывают их в единый макромолекулярный комплекс [9,11]

Homor-белки экспрессируются в клетках НЕК293 [12], однако их роль в этих клетках до сих пор не была выяснена. Проведенный нами анализ аминокислотной последовательности TRP каналов, вероятно входящих в субъединичный состав каналов рецептор-индуцированного и депо-управляемого входа кальция в клетках НЕК293 [13], показал, что они содержат последовательность, ответственную за связь с Homer белками. Кроме того, Imin каналы активируются рецептором 1Рз (Zubov, Kaznacheyeva, Nikolaev et al., 1999), который в свою очередь также способен связываться с Homer белками [9] Исходя из этого, мы предположили, что Homer-белки могут выступать в роли белков, связывающих в единый комплекс IP3R и Imin каналы, а также участвовать в регуляции рецептор-индуцированного входа кальция в клетках НЕК293. Для проверки этой гипотезы мы использовали синтетический пептид PPKKFR (FR), являющийся лигандом для Homer белков. Такой пептид должен нарушать взаимодействие Homer белков с IP3R, а также гипотетическую связь Homer белков и эндогенных TRP каналов в плазматической мембране клеток НЕК293. Данный пептид использовался в экспериментах с применением метода patch-clamp в конфигурации Inside-out.

В первой серии экспериментов мы активировали Imin каналы приложением 2.5 мкМ 1Р3 к внутренней стороне мембраны и после развития активности подавали пептид FR. При этом мы ожидали, что приложение FR будет ингибировать активность Imin каналов, поскольку должно нарушаться взаимодействие Homer белков с IP3R и Imin каналом, что в свою очередь должно приводить к нарушению функциональной связи между IP3R и Imin. Однако FR в концентрации 100 нМ не только не ингибировал активность Imin, но даже увеличивал ее (рис 7) Средняя вероятность открытого состояния Imin каналов после приложения IP3 составляла О 10 ±0 07, а после добавления FR-0.36 ±0 11 (л=17).

Таким образом, нарушение связи Homer белков со своими мишенями усиливает активность imin каналов. Однако такая постановка эксперимента не дает ответ на вопрос, требуется ли присутствие 1Рз для действия пептида FR В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние нарушения связи Homer белков со своими мишенями на активацию Imin в отсутствие агониста Для этого мы подавали раствор, содержащий FR в концентрации 100 нМ, к внутренней стороне изолированного фрагмента мембраны В 14 опытах из 26 наблюдалось развитие активности токов входящего направления (рис 8А) В среднем, активность достигала максимума через 2 5 мин и NPo составляла 0.40+0.11 (п=11) Сравнение вольтамперной характеристики зарегистрированных каналов (рис 8В) и вольтамперной характеристики Imin в клетках НЕК293 (рис ЗА) позволяет утверждать, что FR вызывает активацию каналов Imin в клетках НЕК293 (Николаев и др, 20046) Последующее приложение IP3 к внутренней стороне изолированного фрагмента мембраны не вызывало дальнейшего увеличения активности Imin (данные не показаны).

NPo

100PPKKFR

Рис. 7. Нарушение связи Homer белков со своими мишенями в inside-out экспериментах

усиливает активность Imln каналов. Показана вероятность открытого состояния канала NPo до и после приложения пептида FR.

40 80 120 160 200 240 280 сек

КОНТРОЛЬ

100PPKKFR

J 0 5nA

-50 мВ

-70 мВ

18 пА

-90 мВ

23 пА

-110 мВ

J0;

-0 24 пА

) 5 пА 250 мсек

-0 2 пА

Рис. 8. Нарушение связи Homer белков со своими мишенями активирует Imln каналы в отсутствие агониста. А - Запись токов в сжатом масштабе времени. Поддерживаемый потенциал на мембране -70 мВ

Б - Примеры записей токов через одиночные каналы в изолированном фрагменте мембраны при разных потенциалах в расширенном масштабе времени.

В - Вольтамперная характеристика тока через одиночные каналы,

активированные приложением пептида PPKKFR.

В контрольных экспериментах мы использовали синтетический пептид PPKKRR (RR) В данном пептиде Phe-5 заменен на Arg-5, что отменяет связывание с белками семейства Homer [9] Такой пептид не должен нарушать взаимодействие Нотег-белков со своими мишенями Типичный эксперимент из этой серии представлен на рис 9. Приложение пептида RR к внутренней стороне плазматической мембраны не вызвало активацию Imin ни в одном из 11

экспериментов. Последующее добавление Р13 активировало 1ггнп в 8 из 11 попыток Эти данные свидетельствуют в пользу того, что действие пептида РЯ было специфичным.

Из полученных данных следует, что Нотег-белки, связанные с 1Р3Р, ТРР и, возможно, рядом других белков, имеющих последовательность РРХХР, блокируют спонтанную активацию каналов 1т1п Нарушение связи Нотег-белков с этими лигандами вызывает активацию 1гтш в отсутствие 1Рз.

контроль_

PPKKRR PPKKFR

О 5 пА

60 сек

PPKKRR

Рис. 9. Действие пептида РРККРР специфично - контрольный пептид РРККЯЯ не активирует 1т1п. А - Запись токов в сжатом масштабе времени. Поддерживаемый потенциал на мембране -70 мВ Б - Примеры записей токов через одиночные каналы на изолированном фрагменте мембраны при потенциале, равном -70 ¡иВ

PPKKFR

-0 18 пА

_0 5 пА

500 мсек

4. Для регуляции активности Imln каналов требуются олигомерные комплексы Homer белков. В постсинаптической области нейрональных клеток Homer белки регулируют активность глутаматного рецептора [14]. Нарушение связи mGluR и Homer вызывает спонтанную активацию mGluR в отсутствие агониста Также было показано, что для предотвращения спонтанной активации mGluR требуются олигомерные комплексы, состоящие из длинных изоформ Homer белков, содержащих СС-домены Поскольку нарушение связи Homer белков со своими мишенями вызывает спонтанную активацию Imin, мы предположили, что для блокирования конститутивной активности Imin каналов также требуются длинные Нотег-белки, образующие олигомерные комплексы. Для проверки этой гипотезы мы использовали рекомбинантный белок GST-H1a, экспрессированный в клетках E.coli BL21 (DE3) Согласно нашему предположению, короткий мономерный Homer белок Н1а, поданный к внутренней стороне мембраны, должен вытеснять эндогенные олигомерные комплексы Нотег-белков, конкурируя с последними за места

связывания на молекулах-лигандах, и активировать Imin каналы в отсутствие агониста

Рекомбинантные белки GST-Homer 1а (Н1а) и GST-Homer 1с (Н1с) очищали на колонке с глутатион-сефарозой как описано в разделе материалы и методы Для контроля качества очистки полученные белки разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и анализировали Кумасси G-250 (рис 10А), а также иммуноблоттингом с поликлональными антителами к GST Как видно из рисунка, Н1а мигрирует в электрофорезе единой полосой, в то время как Н1с выделяется с небольшими примесями продуктов протеолиза На электрофорезе видна минорная линия с молекулярной массой, равной 60 кДа Как целый Н1с, так и продукт его протеолиза, окрашиваются антителами к GST и присутствуют в неочищенных лизатах бактериальных клеток, что говорит о том, что белок деградирует в бактериальных клетках до начала очистки (рис 10Б). Кроме того, белки проверяли взаимодействием с рецептором IP3 в пулдаун-экспериментах (см Материалы и методы).

205 I - -

не

97 84 вв

- 84 -вв

56 M

« wr

36 Mflk

Рис. 10. Выделение рекомбинантных белков Н1а и Н1с. А - SDS гель с образцами используемых белков в patch-clamp экспериментах (1-Молекулярный стандарт; 2- Н1а; 3-Н1с). Б - Иммуноблот с поликлональными антителами к GST с очищенным белком Н1с (1- клетки BL21 после индукции IPTG, 2- лизат клеток BL21, экспрессирующих Н1с; 3-очищенный белок Н1с).

Н1а подавали к внутренней стороне плазматической мембраны в конфигурации inside-out метода patch-clamp. На рис 11 представлен типичный эксперимент из этой серии Подача Н1а в концентрации 100 нМ приводила к активации каналов Imin Электрофизиологические характеристики каналов, вызванных приложением Н1а (рис. 11 Б, В), совпадали с таковыми у каналов, активированных приложением IP3 (рис ЗА) В среднем, активность развивалась за 2 5 мин и NPo составляла 0.5 ±0.1 (п=8) (Николаев и др., 20046).

В контрольных экспериментах подавали рекомбинантный белок GST-H1c, содержащий СС-домен на С-конце и способный олигомеризоватъся Приложение GST-H1c к внутренней стороне плазматической мембраны клеток линии НЕК293 не вызвало активации Imin ни в одном из 13 экспериментов Примерно в половине случаев (п=6/13) последующее приложение GST-H1a вызвало активацию Imin (данные не показаны). На наш взгляд, полученные данные подтверждают

предположение о том, что олигомерные комплексы Homer белков блокируют спонтанную активацию Imin каналов (Николаев и др.,20046)

Н1а

контроль

20 сек

JO 5 пА

-30 мВ -70 мВ -90 мВ

,oi9nA

-110 мВ

-0 22пА

-100

-50

50 мВ

J..:

-01

-0 2 пА

.5 пА 500 мсек

Рис. 11. Замена олигомерных комплексов Homer белков на мономерные активирует каналы Imin.

А - Запись токов в сжатом масштабе времени. Б - Примеры записей токов через одиночные каналы на изолированном фрагменте мембраны при разных потенциалах в расширенном масштабе времени. В - Вольт-амперная характеристика каналов,

активированных приложением Н1а к внутренней стороне мембраны

Таким образом, мы впервые показали, что рецептор-индуцированный вход кальция в клетках НЕК293 регулируется белками семейства Homer. Данные белки блокируют спонтанную активацию Imin каналов, причем для этого требуются олигомерные комплексы Homer белков. Изучение деталей взаимодействия Homer белков с Imin каналом на данный момент не представляется возможным, поскольку неизвестна молекулярная структура Imin каналов Тем не менее, недавно вышла работа, в которой было показано, что Homer белки связывают в единый комплекс IP3R и TRP каналы, трансфицированные в клетки НЕК293. Комплекс TRP/Homer/IP3R существует в неактивной клетке, а после опустошения кальциевых депо нарушается взаимодействие IP3R и Homer белков. При этом взаимодействие IP3R и TRP, вероятно, не нарушается, поскольку оно необходимо для активации TRP каналов. На основании этих и наших данных была выдвинута гипотеза о механизме действия Homer белков на активность Imin каналов (рис.12). Согласно этой гипотезе, в неактивированной клетке существует комплекс PLC/PIP2/lmin/Homer/IP3R Функция Homer белка заключается в стабилизации этого комплекса и препятствовании активационного взаимодействия IP3R и Imin каналов (рис 12А) В нормальных физиологических условиях взаимодействие агонистов с рецепторами сопряженными

с PLC, приводит к диссоциации Homer белков от белков-мишеней, что вызывает активацию Imin каналов (рис 12Б).

А Б

Рис. 12. Механизм регуляции Imin каналов белками семейства Homer. А- В неактивированных клетках Homer белок связан с Imin каналом и IP3R, что препятствует их активационному взаимодействию. Б- При активации клеток Homer-белок диссоциирует от IP3R и Imin и не препятствует их взаимодействию.

ВЫВОДЫ

1. Рецептор-индуцируемый вход кальция в клетках НЕК293, активируемый приложением 100 мкМ UTP, опосредуется тремя типами каналов - Imin и каналами с проводимостью 17 и 5 пСм Imin каналы с проводимостью 1 2 пСм активируются приложением IP3 к внутренней стороне мембраны, но не чувствительны к состоянию внутриклеточных кальциевых депо Каналы с проводимостью 17 пСм активируются приложением IP3 к внутренней стороне плазматической мембраны, а также пассивным опустошением внутриклеточных кальциевых депо. Неселективные каналы с проводимостью 5 пСм активируются опустошением внутриклеточных кальциевых депо, но не чувствительны к действию IP3.

2. Активность Imin каналов в клетках НЕК293 регулируется уровнем Р1Рг в плазматической мембране.

3. Адаптерные белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию Imin каналов. Разобщение связи Homer белков с белками-мишенями вызывает спонтанную активацию Imin каналов.

4. Для предотвращения спонтанной активации Imin каналов требуются олигомерные комплексы Homer белков Замена олигомерных комплексов Homer белков на мономерные вызывает активацию Imin каналов в отсутствие агониста.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Николаев А.В., Бугай В В., Зубов А.Н., Казначеева Е.В. (2004а). Каналы Imin в плазматической мембране клеток линии HEK293 Биологические мембраны. 21(3):225-232.

2. Николаев А.В., Скопин А Ю., Казначеева Е В (20046) Белки семейства Homer регулируют активность lmin-каналов в клетках НЕК293. 20046. Биологические мембраны. 21(6)451-457.

3. Nlkolaev A.V., Kaznacheyeva E.V., Mozhayeva G.N. (2001) 'Store-operated calcium channels in plasma membrane of HEK293 cells'. В материалах коференции "Fourth Conference in Czech Neuroscience Society", Prague, p.26-27

4. Николаев A.B., Казначеева Е.В , Можаева Г.Н. (2002) Депо-зависимые каналы в плазматической мембране клеток линии НЕК293. Биология - наука XXI века. 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых: Сборник тезисов, т. 1:24-25.

5. Николаев А.В, Казначеева Е В., Можаева Г.Н (2003) Нарушение взаимодействия белков семейства Homer с Homer-лигандами активирует депозависимые каналы в плазматической мембране клеток линии НЕК293. Цитология 45:906

6. Kaznacheyeva Е., Gusev К., Nikolaev A., Mozhayeva G. (2004). Store operated calcium channels in non-excitable cells. В материалах конференции Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps" p.20

Список цитируемой литературы

1. Parekh A.B., Penner R. (1997) Physiol. Rev. 77:901-930.

2. Hoth M„ Penner R (1992) Nature 355(6358):353-356.

3. Randriamampita C., Tsien R.Y. (1993) Nature. 364:806-814

4 Randriamampita C., Tsien R.Y.(1995) J. Biol. Chem. 270(1 ):29-32.

5. Kiselyov K.I. et al. (1998) Nature. 396:478-482.

6. Vaden Abeele F. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(29):30326-30337.

7. Kiselyov K.I. et al. (1999) Pflugers Arch. 437(2):305-314.

8 de Bartolomeis A., lasevoii F. (2003) Psychopharmacol Bull. 37(3).51-83.

9. Tu J.C. et al. (1998) Neuron. 21 (4):717-726.

10.Kaznacheyeva E. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA. 98(1):148-153. 11 Xiao B. et al. (1998) Neuron. 21(4):707-716.

12.Soloviev M.M. et al. (2000) J Mol. Biol. 295(5):1185-1200.

13. Wu X. et al. (2000) Am J Physiol Cell Physiol. 278(3):C526-536.

14. Ango F. et al (2001) Nature. 411 (6840):962-965.

15. Zubov A., Kaznacheeva E., Nikolaev A. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(37):25983-25985

16. Kaznacheyeva E, Zubov A, Nikolaev A. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(7)- 4561-4564

17. Казначеева ЕВ, Зубов АН., Николаев А.В. и др. (2002) Биологические мембраны. 19 (1):5-13.

18. Николаев А.В. и др. (2004а). Биологические мембраны. 21(3) 225-232.

19. Николаев А.В., и др (20046) Биологические мембраны. 21(6):451-457

I t I

11

*

Подписано в печать 24.12.2004. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/2412. П. л. 1.125. Уч.-изд. 1.125. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис», 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16

тел.: (812) 234 4333

f

» !

w— 9 02

РНБ Русский фонд

2005-4 48917

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николаев, Антон Владимирович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Общие данные о депо-управляемых каналах.

1. Первая регистрация SOC каналов.

2. Агонисты SOC каналов.

3. Проводящие свойства SOC каналов.

4. Механизмы регуляции SOC каналов.

5. Инактивационные механизмы SOC-каналов.

6. Физиологическая значимость SOC каналов.

7. Imin каналы в клетках А431 и мышиных макрофагах.

Глава П. TRP каналы и структура рецептор-управляемых каналов.

1 .Номенклатура TRP каналов.

2. Доменная организация.

3. Способы активации.

4. Роль TRP в формировании субъединичного состава молекулы S ОС канала.

5. Олигомерная организация TRP каналов.

Глава Ш. Механизмы локализации элементов кальциевого сигнала в нейрональных и невозбудимых клетках. Homer белки.

1. Механизмы локализации молекул каскада фототрансдукции в фоторецепторах D.melanogaster.

2. Локализация SOC каналов в клетках млекопитающих.

3. Homer белки как основные скэффолд белки в постсинапсе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клетки.

Электрофизиология.

Измерение внутриклеточной концентрации кальция.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков Homer la и Homer le.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1.UTP и пассивное опустошение депо активируют вход кальция через плазматическую мембрану.

2.Изучение интегральных токов через рецептор-индуцируемые и депо-управляемые ионные каналы.

3 .Изучение депо-управляемых и рецептор-индуцируемых кальциевых каналов на одиночном уровне.

3.1. UTP активирует низкопроводящие кальций-селективные депо-независимые каналы Imin.

3.2. Imin каналы в клетках НЕК293 регулируются уровнем PIP2 плазматической мембраны.

3.3. Активность Imin каналов в клетках НЕК293 в среднем ниже, чем в клетках А431.

3.4. UTP активирует два типа депо-зависимых каналов в плазматической мембране клеток НЕК293.

4. Белки семейства Homer блокируют спонтанную активность

Imin каналов.

5. Для регуляции активности Imin каналов требуются олигомерные комплексы Homer белков.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов в клетках НЕК293"

Актуальность проблемы. Временное повышение концентрации кальция в цитоплазме (кальциевый сигнал) играет значительную роль в таких важных клеточных процессах, как деление, дифференцировка и синтез нуклеиновых кислот. В электроневозбудимых клетках кальциевый сигнал, активируемый при стимуляции рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С (PLC), опосредуется выбросом кальция из внутриклеточных депо и его входом через рецептор-управляемые каналы (Parekh, Penner, 1997, Putney, McKay, 1999). Механизм выброса кальция из депо достаточно хорошо изучен (Yoshida Y., Imai S. 1997). Основной вклад в этот выброс вносится рецептором инозитол-1,4,5-трисфосфата (IP3R), активируемым при взаимодействии с инозитол-1,4,5-трисфосфатом (IP3). В то же время рецептор-управляемый вход кальция остается менее исследованным. Существует достаточно большое количество рецептор-управляемых каналов в электроневозбудимых и нейрональных клетках. Большинство из них активируется при увеличении концентрации 1Р3 в цитоплазме (Parekh, Penner, 1997). Как правило, эти каналы также активируются при пассивном опустошении кальциевых депо (Hoth, Penner, 1992). В этом случае принято говорить о депо-управляемом входе кальция в клетки через депо-управляемые каналы (SOC).

Механизм активации рецептор-управляемых каналов остается не выясненным. Доступные данные обсуждаются в рамках двух основных гипотез. Гипотеза водорастворимого посредника предполагает существование особого посредника — фактора входа кальция, высвобождающегося при опустошении кальциевых депо, диффундирующего к плазматической мембране и активирующего кальциевые каналы (Randriamamptia, Tsien, 1993, 1995). Гипотеза конформационного взаимодействия предполагает, что каналы активируются при их взаимодействии с рецептором IP3 (Kiselyov et al., 1998, Ma et al., 2000). В последнее время накапливаются данные о существовании обоих механизмов и об их синергичном действии в невозбудимых клетках (Vaden Abeele et al., 2004).

Фармакологические характеристики многих рецептор-управляемых каналов не отличаются друг от друга. В связи с этим разделять различные рецептор-управляемые каналы можно только по их электрофизиологическим свойствам. Поэтому для изучения механизмов регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов требуется их регистрация на одиночном уровне. Ранее было показано, что в клетках А431 стимуляция рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С, или приложение IP3 к внутренней стороне плазматической мембраны активирует низкопроводящие кальциевые каналы в плазматической мембране. Эти каналы были названы Imin каналами и охарактеризованы в нескольких типах электроневозбудимых клеток (Kiselyov et al., 1999). Данные каналы также активировались при пассивном опустошении кальциевых депо. Нами были получены данные, свидетельствующие о том, что в их активационном механизме важную роль играет рецептор 1Р3 эндоплазматического ретикулума (Zubov et al., 1999). Мы также показали, что мембранный липид фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (Р1Р2) ингибирует активность Imin каналов (Kaznacheyeva et al., 2000).

Эти данные ставят вопрос о механизмах локализации элементов системы рецептор-управляемого входа кальция в электроневозбудимых клетках. Логично предположить, что должны существовать белки, связывающие в единый молекулярный комплекс фосфолипазу С, рецептор 1Рз и Imin канал в плазматической мембране. В постсинаптической плотности нейрональных клеток существует целый ряд скэффолд белков, сязывающих в единый макромолекулярный комплекс рецепторы, сопряженные с фосфолипазой С на постсинаптической мембране, рецептор 1Рз в мембране эндоплазматического ретикулума и другие функционально-значимые белки постсинапса (de Bartolomeis, Iasefoli, 2003). Среди этих белков важную роль играют белки семейства Homer. Данные белки связывают рецептор 1Р3 и глутаматный рецептор (mGluR) друг с другом и с другими белками (Tu et al., 1998). Как правило, мишени Homer белков имеют последовательность PPXXF или PPXF. Белки семейства Homer экспрессируются и в электроневозбудимых клетках, в частности в клетках НЕК293. Однако их функция в этих клетках неясна. Можно предположить, что эти белки могут связываться рецептором IP3 в мембране эндоплазматического ретикулума и кальциевым каналом в плазматической мембране и собирать их в единый макромолекулярный комплекс.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование роли белков семейства Homer в регуляции активности каналов Imin. Исходя из этой цели, были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать каналы рецептор-управляемого входа кальция в клетках НЕК293 на одиночном уровне.

2. Выяснить как меняется активность каналов Imin в клетках НЕК293 при нарушении связи белков семейства Homer с белками мишенями.

3. Выяснить как меняется активность каналов Imin при нарушении олигомерной структуры белков семейства Homer.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рецептор-управляемый вход кальция в клетках НЕК293 опосредован как минимум тремя типами кальциевых каналов, одним из которых является Imin канал.

2. Белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию Imin каналов.

3. Для блокирования спонтанной активации Imin каналов требуются олигомерные комплексы белков семейства Homer.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые показано, что UTP-индуцированный вход кальция в клетках НЕК293 опосредуется тремя типами кальциевых каналов. Один из них - это ранее изученный в клетках А431 миниатюрный кальциевый канал Imin. Он имеет проводимость 1.2 пСм и потенциал реверсии +50 мВ. Данный канал активируется в клетках НЕК293 приложением 1Р3 к внутренней стороне плазматической мембраны, но, в отличие от Imin каналов в клетках А431, не чувствителен к состоянию кальциевых депо. Два других рецептор-управляемых канала активируются пассивным опустошением кальциевых депо и имеют проводимости 5 и 17 пСм. Кроме того, с помощью молекулярно-биологических и электрофизиологических методик было показано, что адаптерные белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию каналов Imin. В работе также было показано, что для такого действия Homer белков требуется их олигомерная организация.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции рецептор-управляемого входа кальция в электроневозбудимых и нейрональных клетках. Результаты, свидетельствующие о роли белков семейства Homer в регуляции Imin каналов, безусловно расширяют представления о механизмах активации ионных каналов. Полученные данные о рецептор-управляемом входе Са в невозбудимые клетки создают основу для структурно-функционального анализа рецептор-управляемых кальциевых каналов и могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Николаев, Антон Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Рецептор-индуцируемый вход кальция в клетках НЕК293, активируемый приложением 100 мкМ UTP, опосредуется тремя типами каналов - Imin и каналами с проводимостью 17 и 5 пСм. Imin каналы с проводимостью 1.2 пСм активируются приложением 1Р3 к внутренней стороне мембраны, но не чувствительны к состоянию внутриклеточных кальциевых депо. Каналы с проводимостью 17 пСм активируются приложением 1Р3 к внутренней стороне плазматической мембраны, а также пассивным опустошением внутриклеточных кальциевых депо. Неселективные каналы с проводимостью 5 пСм активируются опустошением внутриклеточных кальциевых депо, но не чувствительны к действию 1Рз.

2. Активность Imin каналов в клетках НЕК293 регулируется уровнем Р1Рг в плазматической мембране.

3. Адаптерные белки семейства Homer блокируют спонтанную активацию Imin каналов. Разобщение связи Homer белков с белками-мишенями вызывает спонтанную активацию Imin каналов.

4. Для предотвращения спонтанной активации Imin каналов требуются олигомерные комплексы Homer белков. Замена олигомерных комплексов Homer белков на мономерные вызывает активацию Imin каналов в отсутствие агониста.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Николаев А.В., Бугай В.В., Зубов А.Н., Казначеева Е.В. (2004а). Каналы Imin в плазматической мембране клеток линии НЕК293. Биологические мембраны. 21(3):225-232.

2. Николаев А.В., Скопин А.Ю., Казначеева Е.В. (20046) Белки семейства Homer регулируют активность Imin-каналов в клетках НЕК293. 20046. Биологические мембраны. 21(6):451-457.

3. Nikolaev А.У., Kaznacheyeva E.V., Mozhayeva G.N. (2001) 'Store-operated calcium channels in plasma membrane of HEK293 cells'. В материалах коференции "Fourth Conference in Czech Neuroscience Society", Prague, p.26-27.

4. Николаев A.B., Казначеева E.B., Можаева Г.Н. (2002) Депо-зависимые каналы в плазматической мембране клеток линии НЕК293. Биология - наука XXI века: 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых: Сборник тезисов, т.1:24-25.

5. Николаев А.В, Казначеева Е.В., Можаева Г.Н (2003) Нарушение взаимодействия белков семейства Homer с Homer-лигандами активирует депозависимые каналы в плазматической мембране клеток линии НЕК293. Цитология 45:906

6. Kaznacheyeva Е., Gusev К., Nikolaev A., Mozhayeva G. (2004). Store operated calcium channels in non-excitable cells. В материалах конференции "Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps" p.20.

90 ***

Выражаю благодарность моему научному руководителю Елене Валентиновне Казначеевой и руководителю нашей лаборатории Галине Николаевне Можаевой за помощь в работе.

Я искренне благодарен моим коллегам по лаборатории за их бескорыстную помощь, доброжелательность и терпение.

Выражаю крайнюю признательность моим первым Учителям - проф. М. Хубенову и проф. В.Николаеву за то, что они открыли мне биологию и привили интерес к этой замечательной науке.

Эта работа не была бы выполнена без моей любимой супруги Юлии, моих детей Даниила и Алексея, мамы Румяны, а также моих друзей Н. Попова, В.Бабакова, А.Капустиной, Ю.Соловьева, А.Батюка, Е.Подольской, П.Абушика, А.Власова и В.Тишкова.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николаев, Антон Владимирович, Санкт-Петербург

1. Aarts М, Iihara К, Wei WL, Xiong ZG, Arundine M, Cerwinski W,

2. MacDonald JF, Tymianski M. A key role for TRPM7 channels in anoxicneuronal death. Cell. 2003 Dec 26; 115(7):863-77.

3. Alvarez J, Montero M, Garcia-Sancho J. Cytochrome P-450 may linkintracellular Ca2+ stores with plasma membrane Ca2+ influx. Biochem J.1991 Feb 15;274 (Pt 1): 193-7.

4. Alvarez J, Montero M, Garcia-Sancho J. High affinity inhibition of Ca(2+)-dependent K+ channels by cytochrome P-450 inhibitors. J Biol Chem. 1992 Jun 15;267(17):11789-93.

5. Amiri H, Schultz G, Schaefer M. FRET-based analysis of TRPC subunitstoichiometry. Cell Calcium. 2003 May-Jun;33(5-6):463-70.

6. Ango F, Prezeau L, Muller T, Tu JC, Xiao B, Worley PF, Pin JP,

7. Bockaert J, Fagni L. Agonist-independent activation of metabotropicglutamate receptors by the intracellular protein Homer. Nature. 2001 Jun21;411(6840):962-5.

8. Berridge MJ. Capacitative calcium entiy. Biochem J. 1995 Nov 15;312 ( Pt 1):1-11.

9. Berven LA, Barritt GJ. A role for a pertussis toxin-sensitive trimeric G-protein in store-operated Ca2+ inflow in hepatocytes. FEBS Lett. 1994 Jun 13;346(2-3):235-40.

10. Bird GS, Bian X, Putney JW Jr. Calcium entry signal? Nature. 1995 Feb 9;373(6514):481-2.

11. Bottai D, Guzowski JF, Schwarz MK, Kang SH, Xiao B, Lanahan A, Worley PF, Seeburg PH. Synaptic activity-induced conversion of intronic to exonic sequence in Homer 1 immediate early gene expression. J Neurosci. 2002 Jan 1;22(1): 167-75.

12. Chevesich J, Kreuz AJ, Montell C. Requirement for the PDZ domain protein, INAD, for localization of the TRP store-operated channel to a signaling complex. Neuron. 1997 Jan;18(l):95-105.

13. Clapham DE, Runnels LW, Strubing C. The TRP ion channel family. Nat Rev Neurosci. 2001 Jun;2(6):387-96.

14. Cooper DM, Yoshimura M, Zhang Y, Chiono M, Mahey R. Capacitative Ca2+ entry regulates Ca(2+)-sensitive adenylyl cyclases. Biochem J. 1994 Feb 1;297 ( Pt 3):437-40.

15. Crabtree GR, Clipstone NA. Signal transmission between the plasma membrane and nucleus of T lymphocytes. Annu Rev Biochem. 1994;63:1045-83.

16. Danino D, Hinshaw JE. Dynamin family of mechanoenzymes. Curr Opin Cell Biol. 2001 Aug; 13(4):454-60.

17. Dohke Y, Oh YS, Ambudkar IS, Turner RJ. Biogenesis and topology of the transient receptor potential Ca2+ channel TRPC1. J Biol Chem. 2004 Mar 26;279(13): 12242-8. Epub 2004 Jan 05.

18. Dolmetsch RE, Lewis RS. Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates Ca2+.i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 1994 Mar;103(3):365-88.

19. Emptage NJ, Reid CA, Fine A. Calcium stores in hippocampal synaptic boutons mediate short-term plasticity, store-operated Ca2+ entry, and spontaneous transmitter release. Neuron. 2001 Jan;29(l): 197-208.

20. Fagan KA, Mahey R, Cooper DM. Functional co-localization of transfected Ca(2+)-stimulable adenylyl cyclases with capacitative Ca2+ entry sites. J Biol Chem. 1996 May 24;271(21):12438-44.

21. Fasolato C, Hoth M, Penner R. A GTP-dependent step in the activation mechanism of capacitative calcium influx. J Biol Chem. 1993 Oct 5;268(28):20737-40.

22. Fasolato C, Nilius B. Store depletion triggers the calcium release-activated calcium current (ICRAC) I n macrovascular endothelial cells: a comparison with Jurkat and embryonic kidney cell lines. Pflugers Arch. 1998 Jun;436(l):69-74.

23. Feng W, Tu J, Yang T, Vernon PS, Allen PD, Worley PF, Pessah IN. Homer regulates gain of ryanodine receptor type 1 channel complex. J Biol Chem. 2002 Nov 22;277(47):44722-30. Epub 2002 Sep 09.

24. Fernando KC, Barritt GJ. Evidence from studies with hepatocyte suspensions that store-operated Ca2+ inflow requires a pertussis toxin-sensitive trimeric G-protein. Biochem J. 1994 Oct 15;303 ( Pt 2):351-6.

25. Fierro L, Parekh AB. Fast calcium-dependent inactivation of calcium release-activated calcium current (CRAC) in RBL-1 cells. J Membr Biol. 1999 Mar 1;168(1):9-17.

26. Foa L, Raj an I, Haas K, Wu GY, Brakeman P, Worley P, Cline H. The scaffold protein, Homer lb/c, regulates axon pathfinding in the central nervous system in vivo. Nat Neurosci. 2001 May;4(5):499-506.

27. Gilon P, Bird GJ, Bian X, Yakel JL, Putney JW Jr. The Ca(2+> mobilizing actions of a Jurkat cell extract on mammalian cells and Xenopus laevis oocytes. J Biol Chem. 1995 Apr 7;270(14):8050-5.

28. Girard S, Clapham D. Acceleration of intracellular calcium waves in Xenopus oocytes by calcium influx. Science. 1993 Apr 9;260(5105):229-32.

29. Goel M, Sinkins WG, Schilling WP. Selective association of TRPC channel subunits in rat brain synaptosomes. J Biol Chem. 2002 Dec 13;277(50):48303-10. Epub 2002 Oct 10.

30. Goldenring JR, Tang LH, Modlin IM. Small GTP-binding proteins in parietal cells: candidate modulators of parietal cell membrane dynamics. Yale J Biol Med. 1992 Nov-Dec;65(6):597-605.

31. Gray NW, Fourgeaud L, Huang B, Chen J, Cao H, Oswald BJ, Hemar A, McNiven MA. Dynamin 3 is a component of the postsynapse, where it interacts with mGluR5 and Homer. Curr Biol. 2003 Mar 18;13(6):510-5.

32. Graier WF, Simecek S, Sturek M. Cytochrome P450 mono-oxygenase-regulated signalling of Ca2+ entry in human and bovine endothelial cells. J Physiol. 1995 Jan 15;482 ( Pt 2):259-74.

33. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 1985 Mar 25;260(6):3440-50.

34. Gusev K, Glouchankova L, Zubov A, Kaznacheyeva E, Wang Z, Bezprozvanny I, Mozhayeva GN. The store-operated calcium entry pathways in human carcinoma A431 cells: functional properties and activation mechanisms. J Gen Physiol. 2003 Jul;122(l):81-94.

35. Harris BZ, Lim WA. Mechanism and role of PDZ domains in signaling complex assembly. J Cell Sci. 2001 Sep;114(Pt 18):3219-31.

36. Harteneck C, Plant TD, Schultz G. From worm to man: three subfamilies of TRP channels. Trends Neurosci. 2000 Apr;23(4): 159-66.

37. Hofer AM, Fasolato C, Pozzan T. Capacitative Ca2+ entry is closely linked to the filling state of internal Ca2+stores: a study using simultaneous measurements of ICRAC and intraluminal Ca2+. J Cell Biol. 1998 Jan 26;140(2):325-34.

38. Hofmann T, Obukhov AG, Schaefer M, Harteneck C, Gudermann T, Schultz G. Direct activation of human TRPC6 and TRPC3 channels by diacylglycerol. Nature. 1999 Jan 21;397(6716):259-63.

39. Hofmann T, Schaefer M, Schultz G, Gudermann T. Subunit composition of mammalian transient receptor potential channels in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 May 28;99(11):7461-6.

40. Honda H, Kondo T, Zhao QL, Feril LB Jr, Kitagawa H. Role of intracellular calcium ions and reactive oxygen species in apoptosis induced by ultrasound. Ultrasound Med Biol. 2004 May;30(5):683-92.

41. Hoth M, Penner R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 1992 Jan 23;355(6358):353-6.

42. Hoth M. Calcium and barium permeation through calcium release-activated calcium (CRAC) channels. Pflugers Arch. 1995 Jul;430(3):315-22.

43. Hoth M, Penner R. Calcium release-activated calcium current in rat mast cells. J Physiol. 1993 Jun;465:359-86.

44. Hsu Sf, O'Connell PJ, Klyachko VA, Badminton MN, Thomson AW, Jackson MB, Clapham DE, Ahern GP. Fundamental Ca2+ signaling mechanisms in mouse dendritic cells: CRAC is the major Ca2+ entry pathway. J Immunol. 2001 May 15;166(10):6126-33.

45. Huber A, Sander P, Paulsen R. Phosphorylation of the InaD gene product, a photoreceptor membrane protein required for recovery of visual excitation. J Biol Chem. 1996 May 17;271(20):11710-7.

46. Huber A, Sander P, Bahner M, Paulsen R. The TRP Ca2+ channel assembled in a signaling complex by the PDZ domain protein INAD is phosphorylated through the interaction with protein kinase C (ePKC). FEBS Lett. 1998 Mar 27;425(2):317-22.

47. Inamura K, Sano Y, Mochizuki S, Yokoi H, Miyake A, Nozawa K, Kitada C, Matsushime H, Furuichi K. Response to ADP-ribose by activation of TRPM2 in the CRI-G1 insulinoma cell line. J Membr Biol. 2003 Feb l;191(3):201-7.

48. Jacob R. Agonist-stimulated divalent cation entry into single cultured human umbilical vein endothelial cells. J Physiol. 1990 Feb;421:55-77.

49. Ishikawa J, Ohga K, Yoshino T, Takezawa R, Ichikawa A, Kubota H, Yamada T. A pyrazole derivative, YM-58483, potently inhibits store-operated sustained Ca2+ influx and IL-2 production in T lymphocytes. J Immunol. 2003 May l;170(9):4441-9.

50. Jayadev S, Petranka JG, Cheran SK, Biermann JA, Barrett JC, Murphy E. Reduced capacitative calcium entry correlates with vesicle accumulation and apoptosis. J Biol Chem. 1999 Mar 19;274(12):8261-8.

51. Jungnickel MK, Marrero H, Birnbaumer L, Lemos JR, Florman HM. Trp2 regulates entry of Ca2+ into mouse sperm triggered by egg ZP3. Nat Cell Biol. 2001 May;3(5):499-502.

52. Kato T, Ishiwata M, Mori K, Washizuka S, Tajima O, Akiyama T, Kato N. Mechanisms of altered Ca2+ signalling in transformed lymphoblastoid cells from patients with bipolar disorder. Int J Neuropsychopharmacol. 2003 Dec;6(4):379-89.

53. Kato A, Ozawa F, Saitoh Y, Fukazawa Y, Sugiyama H, Inokuchi K. Novel members of the Vesl/Homer family of PDZ proteins that bind metabotropic glutamate receptors. J Biol Chem. 1998 Sep 11;273(37):23969-75.

54. Khan AA, Steiner JP, Klein MG, Schneider MF, Snyder SH. IP3 receptor: localization to plasma membrane of T cells and cocapping with the T cell receptor. Science. 1992 Aug 7;257(5071):815-8.

55. Kiselyov KI, Mamin AG, Semyonova SB, Mozhayeva GN. Low-conductance high selective inositol (l,4,5)-trisphosphate activated Ca2+channels in plasma membrane of A431 carcinoma cells. FEBS Lett. 1997 May 5;407(3):309-12.

56. Kiselyov K, Xu X, Mozhayeva G, Kuo T, Pessah I, Mignery G, Zhu X, Birnbaumer L, Muallem S. Functional interaction between InsP3 receptors and store-operated Htrp3 channels. Nature. 1998 Dec 3 ;396(6710):478-82.

57. Kiselyov KI, Semyonova SB, Mamin AG, Mozhayeva GN. Miniature Ca2+ channels in excised plasma-membrane patches: activation by IP3. Pflugers Arch. 1999 Jan;437(2):305-14.

58. Kiselyov K, Mignery GA, Zhu MX, Muallem S. The N-terminal domain of the IP3 receptor gates store-operated hTrp3 channels. Mol Cell. 1999 Sep;4(3):423-9.

59. Kiselyov KI, Shin DM, Wang Y, Pessah IN, Allen PD, Muallem S. Gating of store-operated channels by conformational coupling to ryanodine receptors. Mol Cell. 2000 Aug;6(2):421-31.

60. Kwan HY, Huang Y, Yao X. Regulation of canonical transient receptor potential isoform 3 (TRPC3) channel by protein kinase G. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Feb 24;101(8):2625-30.

61. Kwiatkowski AV, Gertler FB, Loureiro JJ. Function and regulation of Ena/VASP proteins. Trends Cell Biol. 2003 Jul;13(7):386-92.

62. Lepple-Wienhues A, Cahalan MD. Conductance and permeation of monovalent cations through depletion-activated Ca2+ channels (ICRAC) in Jurkat T cells. Biophys J. 1996 Aug;71(2):787-94.

63. Li HS, Montell C. TRP and the PDZ protein, INAD, form the core complex required for retention of the signalplex in Drosophila photoreceptor cells. J Cell Biol. 2000 Sep 18;150(6):1411-22.

64. Liedtke W, Tobin DM, Bargmann CI, Friedman JM. Mammalian TRPV4 (VR-OAC) directs behavioral responses to osmotic and mechanical stimuli in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Nov 25;100 Suppl 2:14531-6. Epub 2003 Oct 27.

65. Liman ER, Corey DP, Dulac C. TRP2: a candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 May ll;96(10):5791-6.

66. Liu M, Simon MI. Regulation by cAMP-dependent protein kinease of a G-protein-mediated phospholipase C. Nature. 1996 Jul 4;382(6586):83-7.

67. Luckhoff A, Clapham DE. Calcium channels activated by depletion of internal calcium stores in A431 cells. Biophys J. 1994 Jul;67(l): 177-82.

68. Lupu VD, Kaznacheyeva E, Krishna UM, Falck JR, Bezprozvanny I. Functional coupling of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J Biol Chem. 1998 Jun 5;273(23): 14067-70.

69. Ma R, Sansom SC. Epidermal growth factor activates store-operated calcium channels in human glomerular mesangial cells. J Am Soc Nephrol. 2001 Jan;12(l):47-53.

70. Ma H-T, Patterson RL, van Rossum DB, Birnbaumer L, Mikoshiba K, Gill DL. Requirement of the inositol trisphosphate receptor for activation of store-operated Ca2+ channels. Science. 2000 287: 1647-1651.

71. Martin SC, Shuttleworth TJ. Ca2+ influx drives agonist-activated Ca2+.i oscillations in an exocrine cell. FEBS Lett. 1994 Sep 19;352(l):32-6.

72. Martinez MC, Freyssinet JM. Deciphering the plasma membrane hallmarks of apoptotic cells: phosphatidylserine transverse redistribution and calcium entry. BMC Cell Biol. 2001;2(1):20. Epub 2001 Oct 17.

73. Mery L, Strauss B, Dufour JF, Krause KH, Hoth M. The PDZ-interacting domain of TRPC4 controls its localization and surface expression in HEK293 cells. J Cell Sci. 2002 Sep l;115(Pt 17):3497-508.

74. Minami I, Kengaku M, Smitt PS, Shigemoto R, Hirano T. Long-term potentiation of mGluRl activity by depolarization-induced Homer la inmouse cerebellar Purkinje neurons. Eur J Neurosci. 2003 Mar; 17(5): 102332.

75. Minakami R, Kato A, Sugiyama H. Interaction of Vesl-IL/Homer lc with syntaxin 13. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Jun 7;272(2):466-71.

76. Missiaen L., Taylor C.W., Berridge M.J. Spontaneous calcium release from inositol trisphosphate-sensitive calcium stores. Nature. 1991. 352: 241-244.

77. Monteilh-Zoller MK, Hermosura MC, Nadler MJ, Scharenberg AM, Penner R, Fleig A. TRPM7 provides an ion channel mechanism for cellular entry of trace metal ions. J Gen Physiol. 2003 Jan;121(l):49-60.

78. Montell C, Birnbaumer L, Flockerzi V. The TRP channels, a remarkably functional family. Cell. 2002 Mar 8;108(5):595-8.

79. Montero M, Alvarez J, Garcia-Sancho J. Control of plasma-membrane Ca2+ entry by the intracellular Ca2+ stores. Kinetic evidence for a shortlived mediator. Biochem J. 1992 Dec 1;288 (Pt 2):519-25.

80. Mori Y, Takada N, Okada T, Wakamori M, Imoto K, Wanifuchi H, Oka H, Oba A, Ikenaka K, Kurosaki T. Differential distribution of TRP Ca2+ channel isoforms in mouse brain. Neuroreport. 1998 Feb 16;9(3):507-15.

81. Niemeyer BA, Suzuki E, Scott K, Jalink K, Zuker CS. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 1996 May 31;85(5):651-9.

82. Nilius B. From TRPs to SOCs, CCEs, and CRACs: consensus and controversies. Cell Calcium. 2003 May-Jun;33(5-6):293-8.

83. Partiseti M, Le Deist F, Hivroz C, Fischer A, Korn H, Choquet D. The calcium current activated by T cell receptor and store depletion in human lymphocytes is absent in a primary immunodeficiency. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32327-35.

84. Putney J.W.R, Biphasic modulation of potassium release in rat parotid gland by carbachol and phenylephrine. J Pharmacol Exp Ther. 1976 Aug; 198(2):375-84.

85. Putney J.W.R, Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 1987 Feb;252(2 Pt 1):G149-57.

86. Parekh AB, Terlau H, Stuhmer W. Depletion of InsP3 stores activates a Ca2+ and K+ current by means of aphosphatase and a diffusible messenger. Nature. 1993 Aug 26;364(6440):814-8.

87. Parekh AB, Fleig A, Penner R. The store-operated calcium current Icrac: Nonlinear activation by InsP3 and dissociation from calcium release. Cell. 1997. 89: 973-980.

88. Parekh AB, Foguet M, Lubbert H, Stuhmer W. Ca2+ oscillations and Ca2+ influx in Xenopus oocytes expressing a novel 5-hydroxytryptamine receptor. J Physiol. 1993 Sep;469:653-71.

89. Parekh AB, Penner R. Depletion-activated calcium current is inhibited by protein kinase in RBL-2H3 cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug 15;92(17):7907-11.

90. Parekh AB, Penner R. Store depletion and calcium influx. Physiol Rev. 1997 0ct;77(4):901-30.

91. Patterson R.L., van RossumN.B., Gill D.L. Store-operated Ca2+ entry: evidence for a secretion-like coupling model. 1999 Cell. 98: 487-499.

92. Pessah IN, Stambuk RA, Casida JE. Ca2+-activated ryanodine binding: mechanisms of sensitivity and intensity modulation by Mg2+, caffeine, and adenine nucleotides. Mol Pharmacol. 1987 Mar;31(3):232-8.

93. Prakriya M, Lewis RS. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 2002 May;l 19(5):487-507.

94. Putney JW, Jr., McKay RR. Capacitative calcium entry channels. BioEssays, 1999 21(1): 38-46.

95. Randriamampita C, Tsien RY. Emptying of intracellular Ca2+ stores releases a novel small messenger that stimulates Ca2+ influx. Nature. 1993 Aug 26;364(6440):809-14.

96. Randriamampita C, Tsien RY. Degradation of a calcium influx factor (CIF) can be blocked by phosphatase inhibitors or chelation of Ca2+. J Biol Chem. 1995 Jan 6;270(l):29-32.

97. Rivera AA, White CR, Guest LL, Elton TS, Marchase RB. Hyperglycemia alters cytoplasmic Ca2+ responses to capacitative Ca2+ influx in rat aortic smooth muscle cells. Am J Physiol. 1995 Dec;269(6 Pt l):C1482-8.

98. Ryazanova LV, Dorovkov MV, Ansari A, Ryazanov AG. Characterization of the protein kinase activity of TRPM7/ChaKl, a protein kinase fused to the transient receptor potential ion channel. J Biol Chem. 2004 Jan 30;279(5):3708-16. Epub 2003 Oct 30.

99. Sala C, Piech V, Wilson NR, Passafaro M, Liu G, Sheng M. Regulation of dendritic spine morphology and synaptic function by Shank and Homer. Neuron. 2001 Jul 19;31(1):115-30.

100. Sheng M, Kim E. The Shank family of scaffold proteins. J Cell Sci. 2000 Jun;113(Ptll):1851-6.

101. Shieh BH, Zhu MY. Regulation of the TRP Ca2+ channel by INAD in Drosophila photoreceptors. Neuron. 1996 May;16(5):991-8.

102. Schnitzer JE, Oh F, Jacobson BS, Dvorak AM. Caveolae from luminal plasmalemma of rat lung endothelium-.microdomains enriched in caveolin,

103. Ca2+-ATPase, and inositol triphosphate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995 92: 1759-1763.

104. Shuttleworth TJ, Thompson JL. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry during Ca2+. oscillations. Biochem J. 1996 Jun 15;316 ( Pt 3):819-24.

105. Soboloff J, Zhang Y, Minden M, Berger SA. Sensitivity of myeloid leukemia cells to calcium influx blockade: application to bone marrow purging. Exp Hematol. 2002 0ct;30(10): 1219-26.

106. Soloviev MM, Ciruela F, Chan WY, Mcllhinney RA. Molecular characterisation of two structurally distinct groups of human homers, generated by extensive alternative splicing. J Mol Biol. 2000 Feb 4;295(5): 1185-200.

107. Somasundaram B, Norman JC, Mahaut-Smith MP. Primaquine, an inhibitor of vesicular transport, blocks the calcium-release-activated current in rat megakaryocytes. Biochem J. 1995 Aug 1;309 ( Pt 3):725-9.

108. Strubing C, Krapivinsky G, Krapivinsky L, Clapham DE. Formation of novel TRPC channels by complex subunit interactions in embryonic brain. J Biol Chem. 2003 Oct 3;278(40):39014-9. Epub 2003 Jul 11.

109. Sugawara H, Kurosaki M, Takata M, Kurosaki T. Genetic evidence for involvement of type 1, type 2 and type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors in signal transduction through the B-cell antigen receptor. EMBOJ. 1997 Jun 2;16(ll):3078-88.

110. Takezawa R, Schmitz C, Demeuse P, Scharenberg AM, Penner R, Fleig A. Receptor-mediated regulation of the TRPM7 channel through its endogenous protein kinase domain. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Apr 20;101(16):6009-14. Epub 2004 Apr 06.

111. Takuwa N, Iwamoto A, Kumada M, Yamashita K, Takuwa Y. Role of Ca2+ influx in bombesin-induced mitogenesis in Swiss 3T3 fibroblasts. J Biol Chem. 1991 Jan 25;266(3): 1403-9.

112. Tang Y, Tang J, Chen Z, Trost C, Flockerzi V, Li M, Ramesh V, Zhu MX. Association of mammalian trp4 and phospholipase C isozymes with a PDZ domain-containing protein, NHERF. J Biol Chem. 2000 Dec 1 ;275(48):37559-64.

113. Thastrup O, Dawson AP, Scharff O, Foder B, Cullen PJ, Drobak BK, Bjerrum PJ, Christensen SB, Hanley MR. Thapsigargin, a novel molecular probe for studying intracellular calcium release and storage. Agents Actions. 1989 Apr;27(1-2): 17-23.

114. Thomas U. Modulation of synaptic signalling complexes by Homer proteins. J Neurochem. 2002 May;81(3):407-13.

115. Thorn P. Ca2+ influx during agonist and Ins(2,4,5)P3-evoked Ca2+ oscillations in HeLa epithelial cells. J Physiol. 1995 Jan 15;482 ( Pt 2):275-81.

116. Takemura H, Putney JW Jr. Capacitative calcium entry in parotid acinar cells. Biochem J. 1989 Mar 1;258(2):409-12.

117. Toescu EC, Moller T, Kettenmann H, Verkhratsky A. Long-term activation of capacitative Ca2+ entry in mouse microglial cells. Neuroscience. 1998 Oct;86(3):925-35.

118. Tsunoda S, Sierralta J, Sun Y, Bodner R, Suzuki E, Becker A, Socolich M, Zuker CS. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 1997 Jul 17;3 88(6639):243-9.

119. Tsunoda S, Sun Y, Suzuki E, Zuker C. Independent anchoring and assembly mechanisms of INAD signaling complexes in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 2001 Jan 1;21(1): 150-8.

120. Tu JC, Xiao B, Yuan JP, Lanahan AA, Leoffert K, Li M, Linden DJ, Worley PF. Homer binds a novel proline-rich motif and links group 1 metabotropic glutamate receptors with IP3 receptors. Neuron. 1998 Oct;21(4):717-26.

121. Vaca L, Kunze DL. Depletion of intracellular Ca2+ stores activates a Ca(2+)-selective channel in vascular endothelium. Depletion of intracellular Ca2+ stores activates a Ca(2+)-selective channel in vascular endothelium.

122. Vaca L, Sinkins WG, Hu Y, Kunze DL, Schilling WP. Activation of recombinant trp by thapsigargin in Sf9 insect cells. Am J Physiol. 1994 Nov;267(5 Pt l):C1501-5.

123. Vaca L, Kunze DL. IP3-activated Ca2+ channels in the plasma membrane of cultured vascular endothelial cells. Am J Physiol. 1995 Sep;269(3 Pt l):C733-8.

124. Venkatachalam K, Zheng F, Gill DL. Regulation of canonical transient receptor potential (TRPC) channel function by diacylglycerol and protein kinase C. J Biol Chem. 2003 Aug l;278(31):29031-40. Epub 2003 Apr 29.

125. Venkatachalam K, van Rossum DB, Patterson RL, Ma H-T, Gill DL. The cellular and molecular basis of store-operated calcium entry. Nature Cell Biol .2004 4: E263-E272.

126. Verkhratsky A, Toescu EC. Endoplasmic reticulum Ca(2+) homeostasis and neuronal death. J Cell Mol Med. 2003 Oct-Dec;7(4):351-61.

127. Wes PD, Xu XZ, Li HS, Chien F, Doberstein SK, Montell C. Termination „ of phototransduction requires binding of the NINAC myosin III and the

128. PDZ protein INAD. Nat Neurosci. 1999 May;2(5):447-53.

129. Westhoff JH, Hwang SY, Scott Duncan R, Ozawa F, Volpe P, Inokuchi K, Koulen P. Vesl/Homer proteins regulate ryanodine receptor type 2 function and intracellular calcium signaling. Cell Calcium. 2003 Sep;34(3):261-9.

130. Wu X, Babnigg G, Zagranichnaya T, Villereal ML. The role of endogenous human Trp4 in regulating carbachol-induced calcium oscillations in HEK-293 cells. J Biol Chem. 2002 Apr 19;277(16): 13597608. Epub 2002 Feb 05.

131. Xu X, Star RA, Tortorici G, Muallem S. Depletion of intracellular Ca2+ t stores activates nitric-oxide synthase to generate cGMP and regulate Ca2+influx. J Biol Chem. 1994 Apr 29;269(17): 12645-53.

132. Xu XZ, Li HS, Guggino WB, Montell C. Coassembly of TRP and TRPL produces a distinct store-operated conductance. Cell. 1997 Jun 27;89(7): 1155-64.

133. Xu XZ, Choudhury A, Li X, Montell C. Coordination of an array oftsignaling proteins through homo- and heteromeric interactions between , PDZ domains and target proteins. J Cell Biol. 1998 Jul 27; 142(2):545-55.

134. Yuan JP, Kiselyov K, Shin DM, Chen J, Shcheynikov N, Kang SH, Dehoff MH, Schwarz MK, Seeburg PH, Muallem S, Worley PF. Homer binds TRPC family channels and is required for gating of TRPC1 by IP3 receptors. Cell. 2003 Sep 19;114(6):777-89.

135. Zhang L, McCloskey MA. Immunoglobulin E receptor-activated calcium conductance in rat mast cells. J Physiol. 1995 Feb 15;483 (Pt l):59-66.

136. Zhu X., Birnbaumer L. Calcium channels formed by mammalian Trp homologues. News Physiol. Sci. 1998 13: 211-217.

137. Zhu X, Jiang M, Birnbaumer L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. J Biol Chem. 1998 Jan 2;273(1): 133-42.

138. Zitt C, Obukhov AG, Strubing C, Zobel A, Kalkbrenner F, Luckhoff A, Schultz G. Expression of TRPC3 in Chinese hamster ovary cells results in calcium-activated cation currents not related to store depletion. J Cell Biol. 1997 Sep 22; 138(6): 1333-41.

139. Zubov AI, Kaznacheeva EV, Nikolaev AV, Alexeenko VA, Kiselyov K, Muallem S, Mozhayeva GN. Regulation of the miniature plasma membrane Ca(2+) channel I(min) by inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. J Biol Chem. 1999 Sep 10;274(37):25983-5.

140. Zweifach A, Lewis RS. Mitogen-regulated Ca2+ current of Tlymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores. Proci

141. Natl Acad Sci USA. 1993 Jul l;90(13):6295-9.

142. Zweifach A., Lewis R.S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (/crac) due to local calcium feedback. J. Gen. Physiol. 1995 105: 209-226.

143. Zweifach A, Lewis RS. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 1995 Jun 16;270(24): 14445-51.