Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рестрикционный полиморфизм ДНК в области "гена муковисцидоза", ассоциации его вариантов с заболеванием и мутациями гена в Республике Молдова

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Рестрикционный полиморфизм ДНК в области "гена муковисцидоза", ассоциации его вариантов с заболеванием и мутациями гена в Республике Молдова"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

т—ö7i-

■ ч '''(П у-1'''"-1

L J I'W'I На правах рукописи

УД к 575: 577.2 :616—056.7

ГИМБОВСКАЯ Светлана Дмитриевна

РЕСТРИКЦИОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ДНК В ОБЛАСТИ «ГЕНА МУКОВИСЦИДОЗА», АССОЦИАЦИИ ЕГО ВАРИАНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЕМ И МУТАЦИЯМИ ГЕНА В РЕСПУБЛИКЕ МОЛДОВА

03.00.15 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1993

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной генетики Медико-генетического научного центра РАМН и лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней Института акушерства и гинекологии им. Отта РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук В. Н. Калинин; доктор медицинских наук, профессор В. С. Баранов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О. В. Евграфов; кандидат биологических наук Г. Я. Соловьев.

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится « 45 » 1993 г.

в часов на заседании Специализированного совета

Д.001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра.

Автореферат разослан « > нО<-% 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

. • . - г -

Общая характеристика работы.

, Актуальность проблемы. Анализ структурно-функциональной организации генома человека - одно из магистральных и быстро развивающихся направлений современной молекулярной генетики. Решающие успехи последних лет в этой области стали возможными благодаря появлению высокоэффективных и достаточно экономичных биотехнологических приемов и методов, широкое применение которых ознаменовало начало качественно нового этапа исследований в генетике эукариот. сделало вполне реальным картирование генов человека и выяснение нуклеотидной'последовательности его генома. Эти исследования являются методической и теоретической основой молекулярной диагностики моногенных наследственных заболеваний и их рациональной профилактики, т. е. представляют большую социальную значимость, и создают реальные предпосылки для поиска возможных путей генноинженерной коррекции наследственных болезней. Таким образом, исследования подобного рода весьма актуальны как в плане Программы "Геном человека", так и для решения проблем медицинской генетики.

. Муковисцидоз (MB), или кисгозный фиброз поджелудочной железы- - одно из. наиболее распространенных моногенных заболеваний, наследуемое по аутооомно-рециссивному типу, часто ведущее к ранней детской смертности. Согласно обобщенным данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 1990). частота MB среди белого населения земного шара составляет 1:200-2500 новорожденных. и в среднем каждый двадцатый житель Европы и Северной Америки является гетерозиготным носителем мутантного гена, а каждая четырехсотая супружеская пара имеет примерно 25% риск рождения больного ребенка (European Working Group on CF Genetics [EWGCFG]. 1990). Высокая частота MB, гетерогенность клинических проявлений, а также отсутствие эффективного лечения обусловили необходимость изучения молекулярной природы. этого тяжелого наследственного заболевания,

Молекулярно-генетическими методами ген MB картирован на длинном плече хромосомы 7 (7q31.1) в 1985 году. В конце 1989 года усилиями ученых США и Канады был идентифицирован и охарактеризован ген MB. выявлена наиболее частая мутация, приводящая к заболеванию (трехнуклеотидная делеция в Ю-м экзоне гена), названная DF508, т.к.она приводит к утрате фенилаланина в 508-м

положении предполагаемого белка, получившего название трансмембранный регуляторный белок муковисдадоза (ТРЕМ) или Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) (Rlordan et. al. ,1989, Rommens et. al. .1989, Her em et.al., 1989). Дальнейшие исследования показали, что во многих странах мира DF508 является наиболее распространенной причиной развития заболевания, однако частота ее существенно варьирует в разных популяциях стран мира (Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium, 1990). На сегодняшний день известно около .250 различных мутаций гена ТРБМ. но остаются пока до конца не выясненными пути реализации структурных нарушений ДНК в патологические фенотипы. Существенный вклад в изучение этого вопроса вносят структурно-функциональные исследования ТРБМ. попытки выделения и .очистки данного белка (Gregory et.al.. 1990, 1991). а также анализ характера мутаций гена ТРБМ у больных разными клиническими формами (Cutting et.al..1990). Большое значение в этом плане имеют также исследования по идентификации широкого спектра мутаций гена ТРБМ и их распространения у больных из разных регионов мира. Немаловажную роль в этих исследованиях играет анализ внегенного и внутригенного полиморфизма ДНК, поскольку данные о неравновесии по сцеплению полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с геном ТРБМ или с .какими-либо мутациями данного гена, важны при поиске новых мутаций гена и для решения вопроса о времени происхождения и распространении мутаций в популяциях разных стран (Tsui et.al.. 1989). Подобные исследования важны также в практическом плане для использования ПДРФ как молеку-лярно-генетических маркеров в пренатальной диагностике MB.

Цель работа." .•• -

1. Выявление и анализ комбинации внегенных и внутригенных ' полиморфных маркеров гена ТРБМ в норме и в ассоциации с различными случаями MB: .

2. Характеристика частот встречаемости некоторых известных мутаций, а также поиск новых мутаций данного гена;

3. Выработка рекомендаций по выявлению носительства и пренатальной диагностике MB в семьях высокого риска.

Основные задачи работы:

1. Проанализировать особенности полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) некоторых ДНК маркеров гена ТРБМ (внегенных и внутригенных) в популяции и у больных MB в Мол-

дове в сравнении с другими регионами мира.

2. Изучить частоту мутаций гена ТРЕМ,- наиболее распространенных В ранее изученных популяциях: БГ508 (10 экзон). 65510 и ¡?553Х (11 экзон). Й347Р и 1Ш4И (7 экзон), а также их ассоциацию с определенными полиморфными сайтами у больных МВ.

3. Провести поиск новых мутаций у больных МВ в наиболее "мутабельных" областях гена ТРБМ.

4. Используя метод ПДРФ анализа и прямую идентификацию некоторых мутаций гена ТРБМ с помощью ПЦР, провести анализ информативности семей высокого риска МВ для ДНК-диагностики, а также пренатальную диагностику МВ на ранних сроках развития плода/ '

Основные положения, выносимые-на защиту: .1. Различные популяции мира, в том числе и популяция Республики Молдова, характеризуются своими особенностями частот аллельного полиморфизма ДНК локусов, сцепленных с геном ТРБМ . которые необходимо учитывать при проведении молекулярной диагностики МВ.,

2. Выраженное неравновесие по сцеплению определенных аллелей полиморфных сайтов локусов 1ЛР. 078399. 07323 может быть рекомендовано в качестве дополнительного молекулярного теста как в пренатальной, так и в постнатальной диагностике МВ.

3. Изучение ТТП 6В интрона гена ТРБМ. показало полное сцепление аллеля 6ТТП с мутацией ЕР508 (100%). Частота встречаемости данного аллеля на "не-БГ508" и нормальных хромосомах примерно'одинакова (22Я и 1955 соответственно). Диагностическая ценность этого теста в данном регионе невелика.

4. Частота мутации БР508 у больных из Молдовы составила 25%. что достоверно ниже, чем у пациентов из многих других регионов мира. Сравнительно низкая частота (БГ508. ¡Ш7Р. 1Ш4И). либо полное отсутствие (55510, 1?553Х) известных часто встречающихся в ранее изученных популяциях мутаций гена ТРБМ. а также преобладание в клинической картине форм, протекающих с поражением поджелудочной железы, показывает достаточно низкую диагностическую ценность данных мутаций, и что в Молдове основное число МВ связано с мутациями, отличными от вышеперечисленных, и ведущими к тяжелому течению болезни.

5. Анализ сцепления различных гаплотипов с "не-ПР508"мутациями позволил предположить наличие среди больных из Респуб-

- 5 - ;

лики Молдова, по крайней мере семи мутаций, отличных от DF508 (общая частота составила 70%). среда которых, возможно, имеются еще неописанные мутации. В данном регионе очевидна целесообразность направленного поиска., как уже описанных, так и новых. еще не описанных мутаций гена ТРБМ.

6. Молекулярный анализ семей высокого риска по MB из Республики Молдова, перспективных для пренатальной диагностики. ; выявил информативность в S3% .случаев. На данном этапе исследование должно включать пряму» идентификацию мутации DF508. В . .. случае неинформативности семьи по данному признаку возможна непрямая диагностика методом ПДРФ-анализа.. Комплексное исполь-\ зование биохимических и молекулярных методов позволяет существенно повысить достоверность пренатальной диагностики MB в Молдове в случае неоднозначности одного из методов.,

Научная новизна. ■ ■• : .

1. Впервые получены данные ГЩРФ-анализа ДНК маркеров, сцепленных с геном ТРИ в популяции я у больных МБ . из Респуолики -Молдова.. ■ ■ . , : , ' . , ,

2. Впервые показано неравновесие по сцеплению некоторых вне-генных ДНК-маркеров области 7q31.1 с ТРБМ геном в Молдове..

3. Впервые обнаружен ранее неописанный полиморфизм 1716+12 (A or G) /10 интрон/ гена ТРБМ.. ■"''„".'

4. Впервые проведен анализ частот тандемных тетрамерных GATT повторов 6В интрона гена ТРБМ в популяции и у больных из Молдовы.

5. Впервые проанализирована распространенность мутации DF508 и некоторых других частых мутаций гена ТРБМ у больных из Молдовы; установлена сравнительно низкая частота встречаемости '.мутаций DF508. R347P и R334W, и отсутствие мутаций G551D и R553X.

6. Впервые при помощи ПДРФ-анализа и методом прямой идентификации мутаций гена ТРБМ оценена информативность семей с высоким риском по MB из Республики Молдова, и в.некоторых из них осуществлена пренатальная диагностика. "

Практическая значимость'работы.

Полученные в работе данные по ПДРФ-анализу ДНК локусов, сцепленных с геном ТРБМ, а тагае"результаты, исследования ; внутригенного полиморфизма ТТП 6В интрона. в совокупности с показателями частот встречаемости мутации DF508 и некоторых других мутаций в популяции и у больных MB из Республики Молдова, имеют существенное значение для своевременного выявления мута-

ций MB в семьях высокого риска, для молекулярной пренатальной диагностики MB в 1-м и II-м триместрах беременности, а так же для верификации диагноза MB после рождения и. следовательно, являются научной основой для организации рациональной профилактики этого грозного заболевания в данном регионе СНГ.

Апробация работы .

Основные положения диссертации доложены на научном семинаре НИИ генетики человека МГНЦ РАМН. .

Публикации.

По теме,диссертации опубликовано 6 работ, 4 статьи находятся в печати.• -.:-'.

" : • ' ' Структура и обьём диссертации.

; -; Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы. Диссертация.изложена.на 120 страницах машинописного текста, содержит 25.таблиц и 17 рисунков.

. Материалы и методы исследования.

В качестве материала использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови и пятен крови, нанесенных на фильтровальную бумагу. В работе использован материал от.больных , MB, находящихся на лечении и обследовании ,в кликике НИИ ОЗМиР МЗ Республики Молдова, и их родителей, здоровых доноров, проживающих на территории* республики, а.также образцы ДНК из клеток биоптата хориона и амниовдтов плодов женщин группы высокого риска, направленных на пренатальную диагностику MB. Выделение ДНК из!лейкоцитов периферической крови, биоптатов хориона и ам-ниоцитов. а также анализ расщепления фрагментов ДНК посредством эндонуклеаз. ДНК-полимеразную цепную реакцию (ПЦР). мечение ПЦР- . продуктов проводили согласно.общепринятым методам (Маниатис Т. и др.. 1983, 1987). Поиск точковых мутаций осуществлялся при помощи гетеродуллексного и SSCP анализов (White М. в, et. al.. 1990. Orlta М. et.ail.. 1989). Визуализация ДНК в гелях осуществлялась при помощи окраски бромистым этидаем.и серебром (Маниатис Т. и др. 1983, Lleberman et. al., 1990). Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сангера (Sanger et.al.,1977) с некоторыми модификациями (Gyllensten et.al. ,1988). Олигонуклео-тидные праймеры, использованные эндонуклеазы рестрикции, а также термостабильная ДНК-полимераза синтезированы в НПО иБиотех"и"Би-он". Часть исследований проводилась в сотрудничестве и на базе лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РАМН (г.С.Петербург).

- 7 - .. Результаты и обсуждение. 1. Исследование аллельного полиморфизма ДНК локусов области 7q31.

После выделения в 1985 году геномных клонов ДНК локусов НЕТ и D7S8 (ДНК зонды МетН и J3.11), фланкирующих ген MB, из фрагмента хромосомы, ограниченного указанными локусами. были получены многочисленные ДНК зонда: CS7, Кш19 (локус IRP). Mp6D9 (локус D7S399). XV-2c {локус D7S23) и другие, находящиеся в непосредственной близости к гену MB. Наличие в выявляемых ими локусах полиморфных сайтов, доступных для ПДРФ-анализа, а так же их тесное сцепление с геном MB, позволило использовать их в качестве удобных молекулярных маркеров данного гена.

Учитывая значительные расовые различия аллельного полиморфизма локусов МЕТ. и D7S8, выявленные в Северной Америке . (Martin R.K. et.al.. 1988). а также в ряде отечественных попу-, лядай (Иващенко Т.Э., 1992, Лившиц Л.А.. 1991), представлялся важным более детальный ПДРФ анализ этих локусов и в популяции Молдовы (табл.i).

..Таблица 1.

Частота встречаемости аллелей локусов МЕТ и D7S8 в различных

популяциях .

Зонды!Ал- ! Молдова ! Сев.-Зап.! Северная! Италия 1Сев. Америка 1лель! 1 России [Европа 1 !(европеоиды)

-----j----1„----—_|----———!--------1---------!—----------

Met HI 1 1 0.57 ! 0,56; I 0.56 ! 0.57 I 0,56 /Mspl! 2! 0,43 i 0,44 I 0,44 ! 0,43 I 0.44 , ! I n-70 I П-66 I I n-104 !

-----1----j ---------j----------1 --------1----—j-----——— ,.

J3.ll! 1 ! 0,34 ! 0.41 I 0.41 ! 0.38 ! . ' - . ' .' /Pstl! 2 ! 0,66 I 0.59 ! 0,59 ! 0.62 ! ! ! n-147 ' 1 n-92 11 n-148 ! :

Примечание: индекс 1 - аллель без сайта рестрикции. .

индекс 2 - аллель с наличием сайта рестрикции. Полученные результаты достоверно показали практически полное соответствие частот аллельных полиморфизмов локусов МЕТ и D7S8 в популяции Молдовы с таковыми северо-западной части России, стран Северной Европы, . Италии, а также Северной Америки (европеоиды). Определенные нами частоты полиморфных

аллелей локусов МЕТ и 07Б8 свидетельствовали о том. что в самой популяции Молдовы имеются статистически достоверные отличия между частотами встречаемости аллелей системы J3.ll/Mspl (Х2-30. V. Р<0,001). и данные отличия отсутствуют в системе иегн/Мзр!.

Особый интерес представляют исследования ПДРФ локусов. расположенных значительно ближе к гену МВ. чем локусы МЕТ и V7Б8. таких как 07523 (ХУ-2с). ШР. (СБ7 и Кш19) и 073399 (МрбОЭ). Полученные нами данные по частотам встречаемости аллелей этих локусов приведены в таблице 2. В популяции Молдовы

Таблица 2.

Частота встречаемости аллелей локусов Б7323. ШР и 073399 в различных популяциях.

!Ал- ! Молдова! Сев.-Зап.1 Северная! Италия!Сев.Америка Зондн!лель! I России ! Европа ! ((европеоиды)

-----1——!--------!----------1---------1—-----!-------------

ХУ-2СI 1 ! 0.38 1 0,54 1 0.46 ! 0.49 ! 0.58 ЛЗДИ 2 I 0.62 ! 0,46 ! 0.54 ! 0.51 ! 0,42 ( ! П-82 I П-66 I п-110 ! П-366 !

----------—|----------1---------1-------!-------------

С57/ ! 1 ! 0,72 ! 0.68 I - ! 0,68 ! НШ611 2 ! 0,28 ! 0.32 ! - ! 0,32 ! 1 ! П-136 ! П-112 ! - I П-98 I

——|----------¡—-------1---------1-------1-------------

Нт19/! 1 I 0,68 ! 0.79 1 0,68 ! 0,74 ! 0.72 РэН I 2 I 0,32 ! 0.21 ! 0.32 ! 0,26 ! 0.28 ! I П-141 1 П-186 «11-110. I П-261 !

-----1----1-----_„|_:--------1—------;|-------1-------------

Мр6Г>9! 1 ! 0.61 ! 0,55 ! 0.65 ! - ! /МэрП 2 ! 0.39 ! 0.45 ! 0.35 ! - ! 1 I П-41 ! 11-80 1 П-134 ! - !

аллель 2 системы ХУ-2с/Тад1 встречается более чем в 1.5 раза чаще, чем аллель: 1 (6255 и 3836 соответственно. Х2-9.8;Р<0.01). При исследовании аллелей локуса 1ЯР обнаружено явное преобладание аллеля 1 над аллелем 2 - С57/НШ6.1 в 2,5 раза (72% и 28% соответственно, Х2-52,9;Р<0.001) и ШЭ/РэИ - в 2 раза (68% и 32% соответственно, Х2-36,9;Р<0,001). Наблюдалась также большая

-9т'. '.' ": ■■'-'•.-' . ';

в 1.5 раза частота встречаемости аллеля 1 по сравнению с аллелем . 2 Мр609/Мзр1 (локус 073399) (61% и 39% , соответственно,. Х2-4.95;Р<0,05). . ;"Л'л;"/ : ... : '

При сравнении частот встречаемости аллелей данных локусов с таковыми в ранее исследованных популяциях (табл.2), выявлено отсутствие достоверных отличий частот аллелей №-2с/1щ1в Молдове и у жителей стран Северной Европы, Италии и Северной Америки (за исключением северо-западных районов России, Х2-4,14;Р<0,05). ; Кроме этого, частоты аллелей С37/Н1п6Л, ЮШЭ/РаИ и Мр6В9/Мэр1 в популяций Молдовы также оказались сходными с:таковыми во всех сравниваемых популяциях, (кроме. северо-западных районов России, где существуют отличия в распределении частот аллелей. системы КпИЭ/РаИ. Х2»5.03;Р<0,05) (табл.2). ■

Таким образом, проведенный нами среди, жителей Молдовы ПДРФ анализ локусов МЕТ, Б7Б8, ИР, Ю7523,и Б75399, выявил, статистически достоверные отличия в частотах встречаемости по-диморфных сайтов J3.ll/PstI. CS7/Hln6.I, Кш19/РзЧ, ХУ-2с/Тая1 и Мр6В9/мзр1, и отсутствие таковых для системы Ме№/Мзр1.' В то же время, межпопуляционный ПДРФ анализ вышеперечисленных локусов показал, в основном, отсутствие каких-либо достоверных отличий в распределении частот встречаемости аллелей в Молдове и в ранее исследованных европеоидных популяциях.(за исключением северо-западных районов России системы ХУ-гслад и-КпИЭ/РзИ).

Учитывая эти результаты, а также тесное сцепление данных ДНК-локусов с геном МБ. наш рассмотрена распределение аллель- ' ного полиморфизма у больных МВ из Республики Молдова в сравнении с таковыми в других регионах мира. :

Анализ частот встречаемости полиморфных аллелей локусов. МЕТ и В7Б8, фланкирующих "ген МВ" у больных из Молдовы (табл.3).' показал статистически достоверные отличия мезду этими показателями. Так, аллель 2 системы Меед/Мзр1 встречался в 4035 случаев. . а частота этого же аллеля в системе J3. il/Pstl была равна 6855 (Х2=8,1;Р<0,01 и Х2-23,9;Р<0.001 соответственно). Изучение ал-лельного полиморфизма локусов ПР и 073399, установило, что в каждой из трех исследованных систем: С57/Н1П6.1, Кш19/РзИ и Мр6В9/Мзр1 преимущественно встречается аллель 2 и частота его достоверно отличается от таковой аллеля 1 (Х2= 21,2;Р<0.001; Х2=6.75:Р<0.01 и Х2=12,1:Р<0.001 соответственно). Исследование локуса 07Э23 (ХУ-2с/Тад1) показало, что аллель 2 встречается

Частота встречаемости полиморфных аллелей у больных МВ в различных регионах.

Зонды 1 АЛ— Молдова ! Сев. -зап.! Северная Италия Северная

!лель !России ! Европа Америка

Ме1 Н ! 1 0,60 I 0.76 ! 0.62 0.59 0.71

/Мэр1 ! 2 0,40 1 0.24 ! 0.38 0.41 0. 29

1 П=89 ! П=46 1 - П=98 п=69

1\-гс ! 1 0,66 ! 0.78 ! 0,90 0.82 0.83

/Тач1 ! 2 0.34 1 0.22 ! 0.10 0,18 ! 0.17

! 11=87 ! П-36 ! п=110 П=326 ! 11=64

СБ7/ ! 1 0. 30 ! 0,15 ! - 0,11 Г -

Н1п6.I! 2 0, 70 ! 0.85 ! - 0.89 !

! П=74 ! 11=62 ! - П=98 |

Кт19 1 1 0,40 ! 0,11! 0.12 0.17 ! 0,13

/РэИ ! 2 0,60 ! 0,89 ! 0.88 0.83 ! 0.87

! 11=96 ! П=47 ! П-110 п=326 ! П=80

МрбБЭ ! 1 0,36 ! 0. 16 ! 0,13 - 1 0.11

/Мзр1 ! 2 0.64 ! 0.84 ! 0,87 - ! 0.89

! 11=73 1 П=90 ! 11=134 - I 11=72

J3.ll I 1 0,32 ! 0.63 ! 0.54 0,36 1 0.51

/Рз« ! 2 0,68 ! 0.37 ! 0,46 0. 64 ! 0.49

! П>91 ! П=38 ! - П=150 ! 11=74

почти в 2 раза реже, чем аллель 1 (34% и 66% соответственно). Эти отличия также являются статистически достоверными (Х2-16.8: Р<0,001).

В таблице 3 приведены также данные по частотам встречаемости полиморфных аллелей у больных МВ в различных регионах мира. Полное совпадение частот аллелей имеются лишь в системе МеШ/Мзр1 и частично - в J3.ll/Pstl. где отличия в распределении частот аллелей наблюдаются в северо-западных районах России и в Северной

Америке (Х2=10.8;Р<0.001 и Х2=6,4;Р<0.05 соответственно). Результаты ПДРФ анализа локусов D7S23. IRP и D7S399 достоверно отличаются в каждой из исследованных систем. Так, частота аллеля 1 (XV-2c/TaqI) в Молдове составила 66%. что существенно меньше, чем у пациентов из других регионов: в северо-западных районах России она равна 78%. в странах Северной Европы - 90%, в Италии - 82%. а в Северной Америке - 83% (Х2= 8.3; 17.7; 11,4: Р<0.001 и Х2=5.6; Р<0,05 соответственно). В то же время в системах Kml9/Pstl, CS7/Hln6.1 и Mp6D9/MspI, наоборот, отмечается явное преобладание данного аллеля у молдавских больных, по сравнению с пациентами из других стран. Так, например, в системе Kml9/Pstl частота аллеля 1 составила 40%, что почти в 4 раза больше, чем у пациентов северо-западной части России - 1155 (Х2=13.3;Р<0.001), в 3 раза больше, чем в странах Северной Европы и Северной Америки - 12% (Х2=22,5 и 17,2;Р<0,001 соответственно) и более, чем в 2 раза выше, чем у итальянских больных - 17% (Х2=23,4). Вариации частот встречаемости данного аллеля в системе CS7/Hln6.I распределились следующим образом: в Молдове она равна 3055. в северо-западных районах России - 15% (Х2=5,1;Р<0,05), в Италии - 11% (Х2=10.5;Р<0,01). Этот же показатель в системе Mp6D9/Mspl равен: у молдавских пациентов -36%, у больных из северо-западных районов России - 16% (Х2=8,8; Р<0, 01), в североевропейских странах - 13% (Х2-15.1;Р<0.001) и в Северной Америке - 11% (Х2=12.1; Р<0, 001).

Таким образом, в группе больных из Молдовы преобладают пациенты с аллелем 1 (без сайта рестрикции) в системах MetH/MspI и XV-2c/TaqI, и с аллелем 2 (с сайтом рестрикции) в системах CS7/Hln6.I, Kml9/Pstl, Mp6D9/MspI и J3.ll/Pstl. В то же время, сравнительный анализ аллельного полиморфизма локусов MET, D7S8, IRP, D7S23 и D7S399 у больных из Молдовы и у пациентов из других регионов выявил статистически достоверные отличия в частотах встречаемости полиморфных сайтов J3.ll/Pstl, CS7/Hln6.I, Kml9/Pstl. XV-2c/TaqI и MpSD9/MspI и отсутствие таковых в системе MetH/MspI.

Частоты встречаемости полиморфных аллелей на хромосомах, Hecy^ix мутацию MB, и на здоровых хромосомах существенно отличаются (табл.4). Так, частота аллеля 1 (XV-2c/TaqI) на мутантых хромосомах почти в 2 раза больше, чем на здоровых (66% против тогда как в системах CS7/Hln6.1, Kml9/Pstl и Mp6D9/MspI .."готы этого аллеля на мутантных хромосомах в 1,5 - 2,5 раза

Частота встречаемости полиморфных аллелей локусов. тесно сцепленных с геном ТРБМ, на мутантных и нормальных хромосомах в Молдове.

Зонды 1Мутантные хромосомыШормальные хромосомы! Х2 ! с^

1 — 1 1 ----------! 2 ! 1 2 -! Р< ! 10,0011

ХУ-2с/Тад1 ! 57 30 ! 31 51 113.0 ! 0.280

СБ7/Н1п6.I ! 23 51 ! 98 38 ! 33. 0 10.420

КпИЭ/РэИ ! 39 57 ! 96 45 117,6 ¡0,282

Мр6Д9/Мзр1 ! 26 47 ! 25 16 16,83 10,250

МеШ/МБр1 ! 54 35 ! 40 30 ! 0.2 !0.031

J3.ll/Pstl ! 29 62 ! 50 97. !0.12 !0,022

меньше, чем на здоровых. И лишь в системах МеШМэр! и J3.ll/Pstl эти показатели почти не отличаются.

Сопоставление гаплотипов хромосом, несущих и лишенных мутаций МВ, показало, что большинство (64Ж) мутантных хромосом несет аллели С2К2М2, причем гаплотип С2К2 характерен для примерно 70% "больных" хромосом. Эти данные отличаются от таковых по Северо-западной части России, где частота гаплотипа С2К2 составила более 9035 (7). В системе ХУ-2с/Тад1, в отличие от аллелей С37, Кт19 и Мр6Б9, где на мутантных хромосомах отмечается преобладание аллеля 2, полиморфные аллели распределяются с явным преобладанием аллеля 1. Наблюдаемые отличия в распределении аллелей на нормальных и мутантных хромосомах являются статистически высокодостоверными.

Степень ассоциации исследованных аллелей с геном МВ наглядно отражает стандартный коэффициент неравновесия (с^). Его анализ четко показывает, что наиболее тесно сцеплен с геном МВ аллель С2 (СБ7/Н1п6.1). в меньшей степени аллель К2 (КМЭ/РэШ и аллель XI (Х\/-2сЛ^1) ,и минимально, но вполне достоверно аллель М2 (Мр6Б9/Мзр1). По степени сцепления с геном МВ аллели данных локусов. по нашим результатам, в порядке убывания от 5' к 3' концу гена П?Р располагаются следующим образом: СБ7 -Кт19 -XV-2с.

Таким образом, в отличие от доноров, у больных МВ из Молдовы аллели С2, К2, М2 и XI явно преобладают и их частота составляет

65Ж. Наши данные несколько отличаются от таковых показателей Северо-западных районов России, где по степени сцепления с геном МВ доминирует аллель К2 (КпЦЭ/РбШ. а частота пациентов с аллелями С2, К2. М2 и XI составила 70% (Иващенко Т.Э., 1992).

Учитывая эти данные в совокупности с результатами исследований по частотам встречаемости полиморфных аллелей ДНК локусов области 7q.31 среди больных МВ и в популяции Республики Молдова, в сравнении с аналогичными данными в ранее обследованных регионах, можно думать о специфическом, не характерном для других стран и регионов распределении частот различных мутаций гена ТРЕМ.

2. Анализ мутации ОГ508 у больных МВ.

Еще до открытия самого гена МВ и идентификации мажорной мутации БГ508 выраженное неравновесное сцепление определенных аллелей локуса Ю7523 с геном МВ позволило предположить наличие доминирующей мутации МВ в ряде популяций мира - ЮР508 (КегетЬ В.Б. е1.а1.,1989с). Затем было показано, что частота встречаемости данной мутации среди больных МВ в разных регионах весьма различна (табл.5). По нашим данным, частота встречаемости данной мутации у больных МВ в Молдове составила 25%, т.е. из обследованных 122 хромосом лишь 31 несут мутацию БР508. Эти результаты хорошо согласуются с обобщенными европейскими данными, указывающими на прогрессивное ; снижение распространенности д?508 в Европе в направлении с северо-запада на юго-восток (ШССГв, 1990).

Таблица 5.

Частота встречаемости БГ508 у больных МВ из разных регионов.

Мутант.! хромое.! Молдова! ! Сев.-Зап! России ! Сев.-Зап! Европы ! Италия! Северная!Турцция ! Америка !

Всего ! БГ508 ! Частота! 122 ! 31 ! 0.25 ! 183 ! 97 ! •0.53 ! 600 ! 479 ! 0.80 ! 284 156 0,55 466 ! 30 330 ! 8 0.71 ! 0.27

Анализ распределения мутации ЮР508 в генотипах больных с различными клиническими формами МВ приведен в таблице 6. Пациентов МВ/П1 (с поражением поджелудочной железы) оказалось 49, или (8055 от общего числа больных МВ). При этом гомозиготами по БР508 было 7 человек (11%). а гетерозиготами - 12 пациентов (20Х).' Подгруппа больных МВ/П2 (без поражения поджелудочной

Таблица 6.

Корреляция между клиническими проявлениями МВ и генотипами.

Генотип ! Молдова ! Северная Америка

• (Всего) МВ/П1 МВ/П2 1 МВ/П1 1 МВ/П2 ! Х2

ОГ508Л)Г5С8 ! 9 П=7 П=2 ! П-149 ! п=2 ! 15,2

I 0. И 0. 033! 0.51 ! 0, 007!Р<0.001

0г508/не-0г508 ( 13 п-12 П-1 1 П-84 1 п=33 2, 6.

I 0, 20 0,017! 0.29 I 0. ИЗ! Р>0,1

не-0р508/не-0р508! 39 П-30 п-9 1 П-9 ! п-16- ! 10,7

1 .0,49 0,15 ! 0.03 1 ' 0, 05 ! Р<0, 01

Итого ! 61 49 12 1 242 ! 51 !

Частоа ( 0,80 0,20 ! 0.83 ! 0,17 !

железы) составила 12 человек, или 20% от общего числа больных. Гомозиготами по Ш50В оказались 2 больных (3,3%), а гетерозиго-тами 1 (1,1%). В обеих подгруппах достаточно высока доля пациентов, у которых обе мутации пока остались неидентифицированны-Ш; 30 (49%)-в подгруппе МВ/П1. И 9 (15%) - в подгруппе МВ/П2.

Наши результаты хорошо согласуются с результатами подобных исследований северо-американских авторов, где доля больных МВ/ш значительно выше, чем МВ/П2. и составила 83% и 17% соответственно. . Но в отличие от нашей выборки, у больных из Северной Америки основное число пациентов - как МВ/П1, так и МВ/П2 - оказалось гомозиготами (52%), или гетерозиготами (40%) по мутации В?508.

Принимая во внимание многочисленные данные литературы об ассоциации мутации 0Г508 с определенным гаплотипом в системах ХЧ-2с/Тац1 и Кт19/Рз11. а именно с гаплотипом В, .частота которого в странах Северной Европы достигает 90%, и представляющим собой сочетание аллелей с отсутствием сайта рестрикции для полиморфного сайта ХУ-2сЛ^1 (аллель 1) и с наличием сайта рестрикции (аллель 2) в системе Кт19/РзП. мы рассмотрели распространенность гаплотапов данных систем на мутантных хромосомах с 0Г503 и с "не-ВР508"мутациями, а также на нормальных хромосомах в Молдове (табл, 7). Гаплотип В на СГ508-хромосомах встречается в подавляющем большинстве случаев - 26 (96%), и

Таблица 7.

Распространенность гаплотипов XV-2c(TaqI) / Kral9(PstI) на мугантных и нормальных хромосомах в Молдове.

Гапло-! Аллели ! Мутантные хромосомы ¡Нормальные хромосомы типы !XV-2c!Kml9 !----------------------!

!/Taql!/PstII DF508 !"He-DF508"

I-----¡-----1----------1-----------

А ! 1 i ! - ¡16 (0,33) ! 9 (0,20)

В ! 1 2 ! 26 (0,96)! 11 (0,23) ! 2 (0,05)

С ! 2 1 ! ! 9 (0, 19) ! 23 (0.52)

D ! 2. 2 ! 1 (0,04)! 12 (0,25) ! 10 (0.23)

------|----------w_|----------|-----------1-------------

Всего ! " ¡27 (1.0) ! 48 (1,0) I 44 (1.0)

лишь в одном случае у пациента, являющегося гетерозиготой по DF508, встречается гаплотип D. Наши данные об ассоциации мутации DF508 с гаплотипами XV-2c/TaqI и Kml9/Pstl полностью согласуются с гипотезой, ряда зарубежных авторов (Devoto М. et.al., 1989, Kerem B.S. et.al., 1989c) о единой природе возникновения DF508, а именно на хромосоме с гаплотипом В.

Особый интерес представляют ассоциации "He-DF508"- хромосом с этими же гаплотипами (табл.7). Так "He-DF508"-хромосомы. чаще всего ассоциированы с гаплотипом А (33%), D (25%) и В (23%), и в меньшей степени с гаплотипом С (19%); тогда как для нормальных хромосом' наиболее характерен именно гаплотип С (52%), и найме-' нее - гаплотип В (5%). Частота встречаемости гаплотипа А на "ne-DF508"-xpoMocoMax более чем в 1,5 раза выше частоты встречаемости данного гаплотипа на нормальных хромосомах (33% и 20% соответственно). Гаплотип D встречается примерно с одинаковой частотой в обеих подгруппах хромосом.

Таким образом, спектр и частоты встречаемости мутации DF508 у больных КВ в Республике Молдова существенно отличаются от обследованных ранее европеоидных популяций. Значительное число случаев МВ в данном регионе ассоциировано с тяжелой формой заболевания, протекающей • с поражением поджелудочной железы, и должно быть связано с мутациями, отличными от DF508, в том числе, возможно, с еще неописанными мутациями. Для хромосом, несущих эти "He-DF508" "мутации, наиболее характерны гаплотипы А,

В и D (XV-2c/TaqI и Kml9/Ps'tl). а также преобладание аллеля 2 в системе CS7/Hln6.I и J3.ll/Pstl и. в меньшей степени, аллеля 1 в системах MetH/MspI и Kml9/Pstl.

3. Анализ аллелей ТТП интрона 6В в популяции и у больных MB. Повторы GATT 6В интрона гена ТРБМ обнаруживаются в виде • гепта (7-копийный - 7ТТП) или гекса (6-кспийный - 6ТТП) повторов. В таблице 8 представлены результаты серии исследований, в которой проанализировано распределение ТТЛ аллелей на нормальных■-84- и мутантных -122- хромосомах, причем последняя группа состояла как из хромосом с мутацией DF508, так и из хромосом, несущих неид?н-тифицированные мутации этого гена - "He-DF508". Наши результаты

Таблица 8.

Частота встречаемости аллелей 7ТТП и 6ТТП 6B интрона на мутантных и нормальных хромосомах.

ХРОМОСОМЫ

Регион DF508 гллель 7ТТП He-DF508 ! норма ! DF508 1ллель 6ТТП He-DF508 ! норма

Молдова 0, 78 П=71 0.81 ! 1.0 п=68 ! п-31 0.22 ! 0.19 П=20 ! п=16

Сев-зап.! России ! 0. 62 п=38 0.81 ! 1.0 ! 0,38 ! 0.19 п=50 ! п=41 ! п=23 ! п=12

Сев.Амер! ! 0,75 П-15 0,75 ! 1,0 ! 0,25' ! 0.25 П=83 ! П=76 ! П=5 ! П=28

подтвердили данные ряда авторов • (№е1:аЬ еЬ.а1. .1991. Агбангла К.'. 1993) о том. что все '^508"-хромосомы имеют аллель 6ТТП. и ни в одном случае эта мутация не сцеплена с аллелем 7ТТП. Кроме этого, наши данные показали, что на "не-0Г508"-хромосомах частота аллеля 7ТТП в 4 раза превышает таковую аллеля 6ТТП. причем частоты встречаемости указанных аллелей на "не-0Г508" и нормальных хромосомах примерно одинаковы. Результаты наших исследований находятся в хорошем соответствии с данными других авторов (табл.8).

Анализ сцепления ХУ-2с/Кш19 гаплотипов с аллеллями 7ТТП и 6ТТП на нормальных и мутантных хромосомах приведен в таблице 9.

Сцепление гаплотипов ХУ-2с/Кт19/7ТТП/6ТТП с DF508 и "He-DF508" мутациями на мутантных и нормальных хромосомах.

Гап- 1 Молдова ! Северная Америка

лотип! норма ! DF508 ! не -DF508 ! норма ! DF508 -! He-DF50

А7 ! 6 (0.29) ! 0 ! 9 (0.24) »25(0,23)! 0 1 0

А6 ! 2 (0.10) ! 0 ! 4 (0.11) !13(0,12)! 0 ! 0

В7 ! 0 ! 0 ! 4 (0.11) ! 8(0,07)! 0 . ! 9(0.45)

В6 1 0 ! 30(0, 97)! 2 (0.05) ! 7(0, 06)! 74 (0,97)! 5(0.25)

С7 ! 10 (0.48) ! 0 ! 8 (0.21) !36(0. 32)! 0 1 2(0.10)

С6 ! 0 ! 0 ! 1 (0.03) ! 6(0.05)! 0 ! 0

D7 ! 2 (0.10) ! 0 ! 10 (0.26) !14(0,13)! 0 I 4(0.20)

D6 ! 1 (0.05) ! 1(0. 03)! 0 1 2(0.02)1 2(0,03)! 0

В 30 случаях из 31. т.е. в подавляющем большинстве, мутантным хромосомам с DF508 соответствует галотип 1-2-6, т.е. В6 (97%), и лишь в одном случае 2-2-6. т.е. гаплотип D6.

Эти данные дополняются результатами анализа сцепления указанных гаплотипов на мутантных хромосомах больных с мутациями "He-DF508\ При изучении гаплотипов у 6 больных гетерозигот по DF508 в трех случаях хромосомам c"He-DF508" соответствовал гапп.о-' тип 2-2-*1 или D7. Оставшимся 3-м хромосомам из этой группы соответствовали следующие гаплотипы: 1-1-7 (А7) .1-2-7 (В7),2-1-6 (С6).

По нашим данным, приведенным в таблице 9, основное количество "He-DF508" хромосом имеют гаплотип D7 (26%). По данным американских авторов (Chehab et.al..1991), большинству "He-DF508"~ хромосомам соответствуют гаплотипы В7 и В6 (45% и 2555 соответственно); тогда как в нашей выборке эти частоты равкы 11% - для гапло-типа В7 и 5% - для гаплотипа В6. В то же время гаплотип С7, частота встречаемости которого в нашей выборке достаточно велика - 21% случаев, в исследованиях американских авторов встречался довольно редко - в 10% случаев.

Особый интерес представляет подгруппа "He-DF508" хромосом

с гаплотипами А7 {24%). Аб ^Ш) и €6(3%). Перечисленные гапло-типы на хромосомах с "не-0Г503" мутациями до настоящего времени не были описаны. Поэтому можно предположить, что именно с этими ■ гаплотипами могут быть связаны неизвестные мутации гена ТРБМ, вызывающие заболевание в популяции Молдовы.

Таким образом, исходя из вышеизложенного, можно с высокой вероятностью предположить наличие в Молдове . по крайней мере, семи мутаций, отличных от 0Г508. с преоблдающими гаплотипами Б7. А7, А6, С7 и Сб (общая частота составляет более 7035). Некоторые из этих мутаций, возможно, еще не описаны.

4. Частота некоторых распространенных мутаций гена ТРБМ.

В настоящее время в гене ТРБМ уже идентифицировано более 250 различных мутаций, из которых наиболее распространенной является БР508. Другие, мутации этого гена встречаются значительно реже, а подавляющее их число представлено единичными спорадическими случаями. Тем не менее, известно, что некоторые мутации 7-го и 11-го экзонов являются достаточно частыми (по данным литературы 5-10Ж) и могут иметь диагностическое значение. В связи с этим в работе предпринята попытка направленного поиска 4 мутаций - 05510 и И553Х (11 экзон), а также 1*334И и 11347Р (7 экзон): Всего проанализировано 122 мутантные хромосомы.

Замены оснований при возникновении мутаций С55Ю, К553Х. 1?3341» й И347Р, приводят к разрушению природных сайтов рестрикции. существующих в норме. Так в случае мутаций С551Б и 1*553Х исчезает, сайт для эндонуклеазы Н1пс II, для 1Ш4Ш - сайт Мер!, а для Н347Р - сайт Н1п6.I. что позволяет их легко идентифицировать (рис. 1 и 2). При тестировании 11334У( и 1Ш7Р использовали ■ методику одновременной обработки амплификата двумя ферментами рестрикции Мэр1 и Н1п6.I (7). В изученных нами образцах ДНК выявлен 1 случай мутации 1*3344 и 1 случай мутации И347Р (рис.1). Мутация 1{334И найдена у больного, который является гетерозиготой по СР508. Кроме этого, хромосомы, несущие данные мутации, имеют одинаковый гаплотип - С7. являющийся одним из наиболее распространенных среди' мутантных "не-0Г508"-хромосом (см. табл. 9). Мутации И553Х и С55Ю в исследованных нами образцах не найдены, (рис.2).

Обобщенные результаты данной серии исследований изображены на рисунке 3. из которого видно, что мутация 0Г508 у больных из

- 19 -

Рисунок 1. Определение мутаций И347Р и 1?334И (7 экзон):

1 J

6 5 '2

11 ■ ".....Л

Ч "-»«л

1-ЭК30Н 7/Мзр1 (И347Р)

2-экзон 7/Н1П6. ШЗШ)

3-б - экзон 7/Мзр1/Н1п6.I (отсутствие Й347Р И R334W).

Рисунок 2. Определение мутаций Й55Ю и Й553Х (И экзон).

рЦЦИ'-т"»1*. . * "1 I

1 - экзон И;

2-6 - экзон 11/Н1псИ -

отсутствие С55Ю и И553Х.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 3. 'Частоте» встречаемости нутаций гена ТРЕМ у больных МВ в Республике Молдова. •

Й334И

-"неЧ)Г508"

ш

- 25Х

IX

73Х

1

4

Молдовы пока является доминирующей (2535). а частоты мутаций R347P и R334W достаточно низки, и их диагностическая ценность невелика. Большинство же. так называемые "не-0Г508"мутации. вызывающие.заболевание в данном регионе (-73Я), остаются пока неизвестными. Эти результаты подтверждают предположение о региональной спе- ■ цифичности распространенности мутаций гена ТРБМ в Молдове.

5. Поиск мутаций ТРБМ гена.

Учитывая достаточно высокую заболеваемость MB и низкую частоту встречаемости мутаций "гена муковисцидоза", наиболее распространенных в ранее исследованных европеоидных популяциях, нами был предпринят поиск мутаций гена ТРБМ, вызывающих заболевание в Республике Молдова. Исследовались известные наиболее мутабельные области;ТРБМ гена:10,И и 20 экзоны. Йоиск-мутаций проводился на 30 образцах ДНК пациентов со смешанной и легочной формами MB. гетерозиготами по DF508 и тяжелым течением заболевания. Применялись методы гетеродуплекского и SSCP анализов, поз-воляквде определить замену одного нуклеотида в амплифицированном фрагменте ДНК (White M.B, et.al.,1990. Orlta М. et.al. .1989).

В результате проведенной работы, в области 10 экзона было идентифицировано два варианта измененной электрофоретической подвижности однонитевой ДНК (рис.4). Один вариант составила группа из 16 образцов ДНК (рис. 4. а: 3,4). а другой - выявлен лишь в одном случае (рис.4,а: 5). Прямое секвенирование образцов ДНК из первой группы показало, что они несут однотипное изменение - это описанный ранее полиморфизм 1540 (A or G) - замена аденина на гуанин в 1540 позиции гена, - в результате чего происходит изменение метионина на валин в позиции 47Ó белка ТРБМ (рис.5,а). Частота данного полиморфизма в нашей выборке составила 30%. Прямое секвенирование "необычного" образца 5 (см. рис. 4.а) установило намчие в области 10 интрона ранее нео- ' писанного полиморфизма 1716*-12 (A or G) (рис.5.б). Данный полиморфизм зарегистрирован Международным Консорциумом по MB. В нашем случае указанный полиморфизм присутствовал в гетерозиготном состоянии у больного MB. являющегося гетерозиготой по DF508.

При работе с 20-м экзоном выявлен только один тип измененной подвижности однонитевой ДНК, отличный от нормы, и обнаруженный в 4-х случаях (рис.4, в). Проведенное секвенирование показало, что этот вариант - известный полиморфизм 4002 (A or G) (рис.5.в). Данный полиморфизм во всех случаях встречался в ге-

- 21 - ; Рисунок 4. БЗСР анализ экзонов гена ТРЕМ с использованием Р*32.

1

5

1 3.

а) экзон 10: 1- 4/+; 2- +/ТЖ508;. б) экзон 20: 1.2 - +/+; 3.4 - ?/+ 3.4- ?/0Г508; 5- ??ЛЖ508

Рисунок 5. Определение нуклеотидной последовательности точечных замен ТРЕМ гена методом секвенирования по Сангеру.

А С в Т

_Т в С А

1-3

А! А 6

Т!Т

^ . АМ?

• ■ •., -.а Т1Т

Т " ♦ «м-**»

* " Г А!А

г ' ли

Т!Т

а) 1540 (А о!- в) /10 экзон/

А!А ' Т1Т А-в ГШУ С 1С

л"

■«мм» А1А

ас ■■-'

Г!Т V

А С

А!А

С!С "

С! С

б) 1716+12 (А ОГ о /10 экзон/

А-С ШШ^

• С!С Г4*' ■

ею

в) 4002 (А ог й) /20 ЭКЗОН/

- 22 -

терозиготном состоянии, и е^о частота составила 1%.

Исследование области 11 экзона принесло лишь отрицательные результаты, что может с большой вероятностью указывать на отсутствие в данной выборке больных пациентов с "измененной" ДНК последовательностью в этом экзоне, либо о том, что используемые методики для 11 экзона требуют усовершенствования.

Таким образом, проведенное прямое секвестрование области 10 и 20 экзонов в нашей отобранной при гетеродуплексном и ББСР анализах группе больных МВ выявило наличие в 10 патроне ранее неописанного полиморфизма (1716+12 к ог О. Каких-либо других изменений в ДНК последовательностях данных областей, отличных от мутации 0Р508 и вышеперечисленных.известных полиморфизмов, обнаружено не было. "

6. Преяатальная диагностика МВ в семьях высокого риска.

V Для проведения пренатальной диагностики (ПД) большое значение имеет установление информативности семьи, т.е. ее пригодности для молекулярно-генетического анализа. Для определения ДНК информативности семьи проводят исследования на наличие мутаций гена ТРЕМ, (прямой метод), либо ПДРО анализ ДНК ло-кусов, сцепленных с мутантным геном ( непрямой метод). Исследования мутаций позволяет судить об информативности семьи как при наличии больного ребенка, так и при его отсутствии; определение информативности семьи методом ПДРФ анализа возможно только в полных семьях, т.е. при наличии ДНК больного ребенка.

В работе изучена информативность 45 полных семей с высоким риском МВ. • перспективных для последующей пренатальной диагностики; по 10 молекулярным маркерам гена ТБРМ. Суммирование полученных результатов, а точнее, сочетанный молекулярный анализ по всем изученным маркерам, показал, что 31 семья, или 6955 от общего числа обследованных семей, являются полностью информативными для ПД по тому или иному молекулярному маркеру: 10 . семей,, или. 245Е; являются частично ■ информативными и лишь 4 семьи, или 7% - неинформативными. Таким образом, данный алгоритм молекулярного исследования семей, нуждающихся в ПД МВ, обеспечивает информативность в 93% случаев.

Согласно схеме "Принципиальная стратегия пренатальной диагностики МВ". разработанной в лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РАМН (йващенко, 1992), полностью информативная семья может быть обследована практически на любом сроке бере-

менности, когда доступен для анализа плодный материал. Оптимальным для этого является 1-й триместр беременности (обычно 10-12 недели). При частичной информативности, по желанию женщины, диагностика может быть предпринята также в 1-м триместре. В этом случае при отсутсвии мутантной хромосомы у плода- со 100Х вероятностью снимается диагноз MB у плода, а при ее наличии имеется 50% вероятность рождения больного ребенка. Поэтому целесообразно проведение повторной диагностики уже во 2-м триместре (оптимально 18-19 неделя), дополнив молекулярные исследования биохимическим анализом белков амниотической жидкости.

Рисунок 6. Примеры пренатальной 2-х семьях:

диагностики муковисцидоза в

+/DF508 +/DF508

л-г-О

-¿Г -6

Г-":" -i

í . i 3

а) прймой метод (DF508)

С1С2

С*~

С1С2

-о

а ♦

С2С2 ■ С2С2

'-..i- ' • Y,„.f

б) непрямой метод (CS7/HW6.I) 1-отец. 2-магь. 3-плод, 4-пробанд, + - отсутствие DF508, С1 - нормальный аллель, С2 - мутантный аллель.

Исходя из этого, на базе лаборатории пренатальной диагностики ИАГ РАМН, г. (¡-Петербург, нами щюведена ПД МВ в 9 семьях группы высокого риска по МВ из Молдовы. В 3-х случаях ПД ограничилась изучением молекулярных маркеров гена ТРБМ, а в 6-и -ПД была дополнена биохимическим анализом ферментов амниотической жидкости. В 3-х случаях из 9, оба родителя являлись гете-розиготами по мутации БР508, и ПД проводилась прямым методом.. В 3-х семьях лишь один из родителей являлся гетерозиготным но-

сителем ОРбОЗ. а в остальных 3-х - данной мутации не было обнаружено, вообще. и ДД проводилась на основании ПДРФ внегенных маркеров (непрямым методом) в совокупности с результатами биохимического анализа ферментов амниотической жидкости. Примеры прямой и непрямой ПД изображены на рис.б. Во всех случаях ПД МВ диагнозы подтвердились.

Выводы:

1. Частоты встречаемости полиморфных сайтов ДНЯ локусов МЕТ, 07Б8.1ЕР. С7Б23 и 073399. сцепленных с геном ТРЕМ, у жи-. телей Республики Молдова, в основном, не обнаруживают статистически достоверных отличий от ранее исследованных европеоидных популяций. 4

2. У больных МВ из Молдовы имеются достоверные отличия частот встречаемости полиморфных сайтов С57/Н1п6.1. Кт19/Рз«, ХУ-2с/Тач1, Мр6М/№р1 и J3.ll/Pstl по сравнению с пациентами из других регионов и здоровыми донорами.

3. В семьях высокого риска по МВ имеется достоверное неравновесие по сцеплению полиморфных сайтов С57/Н1п6.1. КпИЭ/РзИ. ХУ-2сЛЗД, МрбЭЭ/Мзр! и отсутствие неравновесия по сцеплению полиморфных сайтов МеШ/МБр1 и I3.ll/Pstl с мутант-ным геном ТРБМ.

4. Обнаружен ранее неописанный полиморфизм 1716 + 12 (А ог О в 10 интроне гена ТРБМ.

5. Частоты встречаемости аллелей 7ТТП и 6ТТП 6В интрона . гена ТРБМ в популяции Молдовы сходны с таковыми в ранее исследованных регионах. Аллель 6ТТП сцеплен с мутацией 0Р508. Частоты встречаемости данного аллеля на "не-БР508" и нормальных хромосомах одинаковы. Диагностическая ' ценность этого теста в данном регионе невелика.

6. Частота встречаемости делеции Е508 у больных МВ в Республике Молдова составляет 25%. мутации Й334И и !Ш7Р встречаются в единичных случаях, мутации С551р и К553Х не обнаружены.

7. Результаты анализа природы мутаций и сцепления различных гаплотипов с "не-БГ5С8"-мутациями позволяет предположить наличие в Молдове мутаций, отличных от д?508. С5510. Й553Х. Й347Р и R334W. Основное число МВ в данном регионе обусловлено мутациями,- отличными ОТ 0К503. С55Ш, Й553Х. К347Р. R334W и ведущими к развитию тяжелых клинических форм с поражением под-

желудочной железы.

8. Полученные данные по ПДРФ анализу и природе мутаций в семьях высокого риска по МВ в Молдове, обеспечивают информативность в 93% случаев. В 9 семьях проведена пренатальная диагностика МВ; диагноз во всех случаях подтвердился. - „

Список опубликованных работ по теме диссертации: .

1. Гимбовская С.Д., Баранов В.С*, Трубникова И.С.. Ива-щенкоТ.Э., Амоаший Д.С., Капранов Н.И.. Калинин В.Н. Рестрик-ционный полиморфизм в области "гена муковисцидоза" в Молдове и московской популяции.//II Всесоюзная конференция "Геном чело-века-91". октябрь 1991г., г. Переславль-Залесский, И.. 1991г., стр.107-108. ■

2. Гимбовская С.Д., Калинин В.Н., Баранов B.C., Трубникова И. С.. Иващенко Т. Э., Амоаший Д. С. Частота делеции F508 и' рестрикционный полиморфизм в области "гена муковисцидоза": по Молдове и в московской популяции.// VI сьезд ВОГиС им.Н.И.Вавилова. Минск, ноябрь 1992г., тезисы докладов.

3. Амоаший Д.С., Гимбовская С.Д., Горбунова Г.Д.. Калинин В.Н., Баранов B.C., Кирилова В.В. Распространение клинических форм муковисцидоза и частота делеции F508 в Республике Молдова. //I Республиканская конференция НИИ ОЗМиР, Кишинев, октябрь 1992, тезисы докладов.

4. Иващенко Т.Э., Лившиц Л.А.. Гимбовская С.Д.. Амоаший Д.С., Веножинскис М.Т.. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Сравнительный анализ частот делеции F508 у больных муковисцидозом.// Биополимеры и клетка, 1991,-т. 7. КЗ. стр. 49-54. •

"5. Baranov V.S.Ivashenco Т.Е., Gorburiova V.N., Llvshltz L.А., Venozlnskis М.Т., Glnibovskaya S.D.. Kalinin V.N.. Romanenco 0.P., ■ Gembltskaya Т. E.. Orlov A. V.. Shved N.V. Frequency of the F508 deletion. In cestlc fibrosis patients from the European part of the USSR.// Hum. Gen., 1991, V.87. p. 61-64. -. . . . .

6. Baranov V.S., Ivashenco Т.Е., Gorbunova V.N.; Osynovskaya N.S., Glmbovskaya S. D. Five years experience In molecular analysis of cystic fibrosis In the USSR. //Pedlatr. Pulmonology. 1991, Suhhl. 6. p. 244.

Подписано в печать /О 19эЗг.

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»

Зак. 60Ц"[щ. {00