Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клетках

Харченко, Марианна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клетках
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клетках"

На правах рукописи

ХАРЧЕНКО Марианна Викторовна

ии3456024

РЕОРГАНИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК В ХОДЕ ЭНДОЦИТОЗА ЭФР-РЕЦЕПТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008

003456024

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Корнилова Елена Сергеевна, Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Пинаев Георгий Петрович, Институт цитологии РАН

Защита состоится 19 декабря 2008 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4. Сайт института: www.cvtspb.rssi.ru Электронный адрес: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан и ноября 2008 г.

Ученый секретарь Е.В. Каминская

кандидат биологических наук Сабанеева Елена Валентиновна,

Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ

диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эндоцитоз - один из видов везикулярного транспорта, присущего всем кариотам. В случае эндоцитоза, опосредованного рецептором, лиганд аимодействует со своим рецептором, находящимся на плазматической ембране, и образовавшийся лиганд-рецепторный комплекс поступает внутрь етки (интернализуется). Затем комплексы либо рециклируют на лазматическую мембрану, либо деградируют в лизосомах. Лиганд-ецепторные комплексы, направляемые на деградацию, переходят в поздние ультивезикулярные эндосомы (МВЭ), локализованные в околоядерной бласти. В этой части клетки зрелые МВЭ взаимодействуют с лизосомами. читается, что такие перемещения происходят с участием компонентов итоскелета, в том числе, микротрубочек (МТ). Это предположение получило дальнейшем множество подтверждений, был идентифицирован ряд белков, беспечивающих взаимодействие эндосом с плюс-концами МТ и движение езикул в сторону центра организации МТ (ЦОМТ), - таких как CLIP 170, инеин/динактиновый комплекс, Rab-белки и др. (Folker et al., 2005; Oda et al., 995; Valetti et al., 1999; Harrison et al., 2003). Перемещения эндосом с ериферии клетки в околоядерную область не происходит при обработке еток агентами, разрушающими МТ (van Deurs et al., 1985; Соколова и др., 998; Xie et al., 2004). Данные различных исследователей о роли МТ в ндоцитозе чрезвычайно противоречивы. Сообщается, например, о замедлении азных стадий эндоцитоза - от сортировки молекул из ранних эндосом в оздние до взаимодействия поздних эндосом с лизосомами после разрушения Т деполимеризующими агентами (Aniento et al., 1993; D'Arrigo et al., 1997; ie et al., 2004). В других работах эта точка зрения ставится под сомнение Diaz et al., 1991; van Deurs et al., 1995; Соколова и др., 1998).

Клетки, экспрессирующие рецепторы эпидермального фактора роста ЭФР), широко используются для изучения эндоцитоза, передачи нутриклеточного сигнала, а также взаимосвязи этих двух процессов. За юследние два десятилетия были идентифицированы многие белки (такие, как даптерный белок Epsl5, убиквитин-лигаза с-СЫ, малые ГТФазы Rab5 и Rab7, [юсфатидилинозитол-З-киназы и др.), участвующие в регуляции эндоцитоза на азных этапах, выяснены некоторые механизмы сортировки. Однако орфология тубулинового цитоскелета после стимуляции эндоцитоза до сих юр не изучалась. В ходе наших исследований роли фосфатидилинозитол-3-иназ 1-го класса в регуляции эндоцитоза было доказано, что они ссоциируются с некими внутриклеточными структурами, отличными от ндосом (Железнова и др., 2003). Эти структуры находятся в области ЦОМТ и овпадают с МТ. В дальнейшем мы впервые описали перестройки убулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза, связанные с нарушением радиального расположения МТ.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы — выявить основные закономерности перестрой тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР. Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. описать изменения системы МТ, происходящие после стимулящ эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, в культивируемых интерфазш. клетках;

2. выявить взаимосвязь характера реорганизации тубулинового цитоскелета ( скорости эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;

3. выяснить, различаются ли МТ на разных стадиях реорганизации I свойствам;

4. оценить участие других типов цитоскелета - актиновых и промежуточны филаментов - в реорганизации микротрубочек в ходе эндоцитоза;

5. выяснить специфичность изменения тубулинового цитоскелета п отношению к различным лигандам и клеточным линиям.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Радиальная система МТ после стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторны комплексов в клетках подвергается последовательным реорганизация IV включающим видимую «фрагментацию» и (или) деполимеризацию МТ последующее восстановление радиальности.

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапо реорганизации МТ коррелируют с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторны комплексов. Реорганизация МТ не наблюдается в клетках, в которых рецепто ЭФР не переходит в поздние эндосомы.

3. Радиальные МТ, присутствующие в клетке до начала эндоцитозг отличаются от «фрагментированых» и радиальных МТ, наблюдаемых на боле поздних этапах эндоцитоза, по чувствительности к обработке цитоскелетны буфером и по ацетилированности.

4. Реализация стадии «фрагментации» МТ нуждается в присутстви промежуточных (виментиновых) микрофиламентов, но не зависит о интактности актинового цитоскелета.

Научная новизна работы Впервые показано, что радиальная система МТ претерпевас последовательные изменения в ходе эндоцитоза. Описанный феномс! характерен для широкого ряда культивируемых клеточных линий эпителия фибробластов. Впервые выявлена связь между стадиями эндоцитоза I архитектурой тубулинового цитоскелета. Впервые продемонстрировано, чт радиально расположенные МТ на ранних и на поздних стадиях эндоцитоз отличаются по свойствам.

Теоретическое и практическое значение работы Работа имеет фундаментальную направленность. Наши данные позволяю выдвинуть гипотезу о координирующей и интегрирующей роли МТ в ход эндоцитоза, опосредованного рецепторами ЭФР. Эта гипотеза составляе

ьтернативу общепринятым представлениям о МТ как о пассивных «рельсах» я перемещения везикул. Теоретические результаты могут быть пользованы в курсах лекций по цитологии и молекулярной биологии.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликованы 8 печатных работ (в том числе, 3 атьи). Основные положения были доложены и обсуждались на на сероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 06), на II съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), на 3-й конференции FEBS (Афины, 2008) и на научных семинарах Отдела нутриклеточной сигнализации и транспорта Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и етодов исследования, результатов, обсуждения и списка цитируемой итературы, включающего 212 источников. Работа изложена на 100 страницах ашинописного текста и иллюстрирована 21 рисунком.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеточных линий. В работе использовали клетки пидермоидной карциномы человека линии А431 и линии HeLa, полученные из сероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-етербург) и Европейской коллекции клеточных культур, соответственно. Клетки пителия молочной железы линии SKBR3 любезно предоставлены проф. С.М. еевым (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова), етки эмбриональной почки человека НЕК 293 любезно предоставлены П.С. рудинкиным (Каролинский университет, Швеция). Клетки, экспрессирующие toрмальную или мутантные формы рецептора ЭФР человека (HER14, DC165, DC123, С63), независимо полученные на основе фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ, были побезно предоставлены Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский университет, США).

етки эндотелия аорты (РАЕ А II), трансфицированные плазмидой, кодирующей ецептор ЭФР, слитый с зеленым флуоресцирующим белком, получены от А.Д. Соркина Университет Колорадо, США).

Все клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 7-10 % етальной сыворотки (РАА, Австрия) при 37 °С в атмосфере с 5 % СС>2. Клетки ыращивали до 50-70 % монослоя. За 12 ч до опыта клетки переводили на среду, ■одержащую 0,25 % фетальной сыворотки.

Лиганды и их производные. В работе были использованы рекомбинантный ЭФР Sigma) и ЭФР, выделенный из подчелюстных желез мыши (Никольский и др., 1985), в онцентрации 50 нг/мл, рекомбинантный фактор роста тромбоцитов ВВ (PDGF) Oncogene, Германия) в концентрации 20 нг/мл. Иодирование ЭФР проводили по модифицированному методу Вайли и Каннингама (Wiley, Cunningham, 1982) с использованием иодогена (1,3,4,6-тетрахлор-3,6-дифенилглюкоурила) и Na125I. Специфическая активность полученного препарата составляла 200-400 тысяч имп./мин на 1 нг ЭФР.

Антитела. Для специфического выявления рецептора ЭФР использовали политональные антитела кролика, узнающие экстраклеточный домен рецептора ЭФР человека (любезно предоставлены Д.Б. Твороговым, Университет Вандербильда, США),

в разведении 1:500. Моноклональные мышиные антитела против а-тубулина (Sigm использовали в разведении 1:2000, а против ацетилированного тубулина (Sigma) -разведении 1:1000. В качестве вторых антител использовали конъюгаты GAR-Alexa Flu 568 и GAM-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Англия) в разведении 1:500. Антитс. разводили фосфатно-солевым буфером (PBS, рН 7,4), содержащим 1 % БСА.

Обработка клеток цитохалазином D. Клетки инкубировали в течение 60 мин н| 37 °С в рабочей среде, содержащей 10 мкМ цитохалазин D (Sigma). Все дальнейип инкубации проводили в постоянном присутствии цитохалазина в рабочей среде.

Обработка клеток буфером для экстракции растворимых цитоплазматическ! белков (цитоскелетным буфером). После завершения стимуляции эндоцитоза клет дважды промывали PBS и инкубировали 1 мин при комнатной температуре цитоскелетном буфере. Затем клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4 %-ны раствором формалина (Sigma) в PBS. Цитоскелетный буфер содержал 20 мМ HEPES (р 7,2) или 10 мМ PIPES (рН 6,8), 3 мМ MgCl, 50 мМ NaCl, 10 % глицерин, 0,1 % Triton-XIO 1 мМ Na3V04, 1 мМ NaF и коктейль протеазных ингибиторов (Invitrogen,CIHA).

Исследование динамики эндоцитоза проводили по схеме предварительно! связывания и по схеме импульсной загрузки лиганда.

Предварительное связывание. Для связывания лиганда с рецепторами клетк инкубировали в рабочей среде Игла, содержащей 0,1 % БСА и 20 мМ HEPES (рН 7,4) при °С в течение 60 мин в присутствии лиганда. После 5-кратной отмывки PBS i несвязавшегося лиганда эндоцитоз стимулировали переводом клеток в среду, н содержащую лиганд, нагретую до 37 °С, на указанное время.

Импульсная загрузка лиганда. Для связывания лиганда с рецепторами монослойны культуры клеток инкубировали в рабочей среде Игла, содержащей 0,1 % БСА и 20 м HEPES (рН 7,4) при 37 °С в течение 15 мин в присутствие лиганда. После 5-кратно отмывки теплой средой (20 °С), клетки переводили в рабочую среду, не содержашу! лиганда (при 37 °С), на указанное время с учетом 15-минутной инкубации.

Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17 %-ного Перколл позволяет разделить внутриклеточный пул везикул на три основные фракции - ранни эндосом (1,04 г/мл, 8-12-я фракция), поздних эндосом (1,05 г/мл, 3-6-я фракция) и лизосо (1,07 г/мл, 1-4-я фракция). Для изучения распределения эндоцитированного ЭФР внутр клеток мы собирали клетки в буфер ТЭС (10 мМ триэтаноламина, 250 мМ сахарозы, 1 м ЭДТА, рН 6,8) и после осаждения ядер и неразбитых клеток надосадок смешивали Перколлом, конечная концентрация которого составляла 17%. Градиент формировали 2 мин при 50000 g на центрифуге Spinko L2-65K с угловым ротором 65 (Beckman Фракционирование градиента на 17 фракций проводили со дна пробирки через игл Измерение радиоактивности проб осуществляли на гамма-счетчике Mini-Gamma (LKB Количественную оценку радиоактивности интернализованного и деградированной лигандов проводили по программе «Градиент». Результаты выражали в относительны единицах, полученных путем приведения радиоактивности каждой фракции к обще! радиоактивности, первоначально связанной клетками.

Определение степени деградации лиганда. Количество деградированной лиганда определяли методом осаждения высокомолекулярных пептидов раствором содержащим 5 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1 % фосфорновольфрамово! кислоты (ФВК). Для этого после окончания инкубационного периода среду сливали i смешивали с раствором ТХУ/ФВК в объемном соотношении 1:6. Через 2 ч инкубацш при 4 °С смесь подвергали центрифугированию при 6000 об./мин на центрифуге К23 осадок промывали аналогичным образом 2 раза, надосадочную жидкость собирали i

о содержащейся в нем радиоактивности оценивали количество деградированного иганда.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. После окончания инкубации етки дважды промывали PBS, а затем фиксировали 4 %-ным раствором формалина igma) на PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. После этого клетки ромывали 5 раз по 3 мин раствором PBS и обрабатывали 15 мин при комнатной емпературе раствором PBS, содержащим 0,5 % Triton-X 100 (Sigma). Неспецифическое крашивание блокировали инкубацией в растворе БСА (1 %), приготовленном на PBS, 0 мин при комнатной температуре. С первыми антителами клетки инкубировали 30 мин ри комнатной температуре. После этого промывали 3 раза по 5 мин раствором PBS, одержащим 0,1 % Tween 20 (BioRad). Инкубацию со вторыми антителами проводили 0 мин при комнатной температуре. Потом промывали, как описано выше. Для выявления ктина использовался 6,6 мкМ раствор родамин-фаллоидин (Invitrogen).

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Распределение луоресцентно-меченных белков в клетках изучали с помощью конфокального микроскопа eica TCS SL (Zeiss, Германия). Зеленую флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером 488 нм), красную - He-Ne лазером (543 нм). Флуоресценцию на разных длинах волн канировали раздельно с помощью программы Leica Confocal Software. Анализ зображений выполняли с помощью программы ImageJ 1.40g (National Institute of Health, aryland, USA). На черно-белых рисунках приведено инвертированное изображение.

Измерение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, в итоплазме клеток. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью программы mageJ 1.40g. Была использована методика, разработанная для оценки соотношения вободных и связанных с ЦОМТ МТ (Смурова и др., 2007). Исследуемую область клетки — т ЦОМТ до ее периферии — разделили на 10 равных отрезков, на каждом из которых пределяли среднюю интенсивность флуоресценции с 95 %-ным доверительным нтервалом. Измерения проведены для 5 клеток каждого типа.

Воспроизводимость экспериментов. Все эксперименты проводили не менее 3 раз. ш анализа выбирали клетки с максимальной степенью распластывания, на краю или вне стровков монослоя. Для каждой временной точки просматривалось по крайней мере по , и поля (около 20-30 клеток) на двух разных стеклах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФР-ецепторных комплексов (Жслсзиова и др., 2003; Харченко и др., 2007; Kharchenko et al., 2007; Kornilova et al., 2008). Для исследования эндоцитоза, опосредованного рецепторами, используют два подхода: импульсную загрузку и предварительное связывание лиганда. При импульсной загрузке лиганд добавляли к клеткам при температуре 37 °С и удаляли через определенное время. Такая постановка эксперимента приближена к физиологическим условиям, однако, процессы связывания лиганда с рецепторами, интернализация и переход в поздние эндосомы лиганд-рецепторных комплексов перекрываются во времени. Альтернативно используется схема предварительного связывания: при 4 °С лиганд связывается с рецептором на поверхности клетки, но лиганд-рецепторные комплексы не подвергаются интернализации. Дальнейшее нагревание клеток до 37 °С стимулирует

синхронную волну транспортных событий. Недостатком метода являете необходимость охлаждения клеток, приводящего к деполимеризации структу цитоскелета во многих типах клеток. Мы исследовали эндоцитоз ЭФ1 рецепторных комплексов и реорганизацию тубулинового цитоскелета клетках НеЬа с помощью методов двойной непрямой иммунофлуоресценции параллельного субклеточного фракционирования в градиенте плотност Перколла, используя обе схемы стимуляции клеток, для того чтобы установит их применимость и адекватность.

При использовании метода импульсной загрузки 1251-ЭФР выявлялся везикулах с большим разбросом по плавучей плотности, от очень низкого д максимального, характерного для лизосом (рис. 1 А). Наибольшее количеств радиоактивной метки приходилось на чуть более тяжелые везикулы, чем

Номер фракции

Рис. 1. Компартментализация (А) и деградация (Б) 1251-ЭФР в ходе эндоцитоза при использовании методик предварительного связывания и импульсной загрузки лиганда. Отмечены фракции лизосом (Лиз), поздних и ранних эндосом (ПЭ и РЭ).

учае предварительного связывания, для той же временной точки. Общее оличество интернализованного 1251-ЭФР также было выше при импульсной агрузке лиганда. В этом случае также наблюдался более быстрый выход адиоактивной метки во внеклеточную среду, что свидетельствует о более ысокой скорости деградации 1251-ЭФР в лизосомах, чем в случае редварительного связывания лиганда (рис. 1 Б). Мы объясняем эти различия инхронным, но относительно медленным из-за постепенного нагревания ротеканием стадий эндоцитоза в случае предварительного связывания иганда. Методом иммунофлуоресценции также было показано, что при мпульсной загрузке лиганда содержание рецептора ЭФР во внутриклеточных узырьках было больше, и перераспределение везикул в околоядерную бласть происходило быстрее, чем при предварительном связывании лиганда рис. 2, 3).

При анализе реорганизации тубулинового цитоскелета с использованием хемы импульсной загрузки (рис. 2) мы выявили следующие изменения. До обавления ЭФР сеть МТ была радиальной. Через 30 мин после стимуляции ндоцитоза, одновременно с перераспределением везикул, содержащих ецептор ЭФР, в область ЦОМТ, существенно увеличивалась интенсивность крашивания тубулина в околоядерной области, а на периферии клетки оявлялись спутанные МТ. Через 90 мин после стимуляции эндоцитоза /булиновый цитоскелет переходит в изначальное состояние (радиальная сеть Т максимально сконцентрирована вокруг ЦОМТ и занимает всю периферию . гетки). Это совпадало по времени с уменьшением интенсивности окрашивания околоядерных структур, содержащих рецептор ЭФР, что свидетельствует о начале деградации рецептора.

Более четкие изменения тубулинового цитоскелета наблюдались при стимуляции эндоцитоза рецептора ЭФР по схеме предварительного связывания (рис. 3). После инкубации клеток при 4 °С происходила разборка МТ. Через 15 мин после стимуляции эндоцитоза восстанавливалась радиальная сеть МТ. В это время мелкие везикулы, содержащие рецептор ЭФР, детектировались на периферии клеток. Затем параллельно с увеличением размера эндосом и перемещением их к центру клетки (30 и 60 мин) число длинных радиальных МТ уменьшалось, а интенсивность окрашивания тубулина вокруг ЦОМТ усиливалась. В целом система приобретала «губкоподобный» вид (спутанная сеть МТ), отдельные МТ укорачивались, возможно, фрагментировались и даже частично деполимеризовались. Разрешение метода иммунофлуоресценции не позволяет нам утверждать, что имеет место истинная фрагментация. Возможно, что наблюдаемая спутанная сеть вызвана изменением связывания специфических антител с тубулином из-за экранирования МТ какими-то белками. В результате этого длинная МТ может выглядеть как набор фрагментов. При этом очевидно, что сеть МТ утрачивает радиальность и что появляются отдельные сильно изогнутые МТ.

Рч

л о

<и Он

контроль

15 мин

30 мин

60 мин

90 мин

Рис. 2. Выявление рецептора ЭФР и тубулина методом иммунофлуоресценции

в клетках НеЬа. Эндоцитоз ЭФР стимулировали по схеме импульсной загрузки лиганда. "

£ е

I л

контроль

О мин

> ^ •

30 мин

60 мин

ШИШ

15 мин

■ии. иИШ/

• *

•43

90 мин

Рис. 3. Выявление рецептора ЭФР и тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках НеЬа. Эндоцитоз ЭФР стимулировали по схеме предварительного связывания лиганда.

Наибольшие изменения претерпевали МТ именно в той области, которой концентрировались эндосомы. Стадия дезорганизации радиально системы совпадала с переходом ЭФР-рецепторных комплексов в позднн эндосомы по данным субклеточного фракционирования. В дальнейшс радиальная система МТ восстанавливалась. Эта стадия совпадала по времени уменьшением окрашивания везикул антителами к рецептору ЭФР появлением продуктов деградации 1251-ЭФР в среде, то есть со стадис лизосомальной деградации ЭФР и рецептора ЭФР. Степень «фрагментации» деполимеризации различалась от эксперимента к эксперименту: внешний ви тубулинового цитоскелета варьировал от «губкоподобного» до почт деполимеризованного, с несколькими длинными и изогнутыми МТ.

Наши данные свидетельствуют о том, что методика предварительног связывания рецептора с ЭФР принципиально не изменяет путь лиганд рецепторных комплексов в клетке, но, в то же время, синхронизирует i несколько замедляет прохождение этих молекул через компартменты клетки по сравнению с импульсной загрузкой лиганда. Реорганизация тубулиново цитоскелета также происходит при использовании любой из методик, хотя i случае предварительного связывания она более выражена и при это\ замедлена. Также мы доказали, что изменения тубулинового цитоскелета н вызваны нагреванием клеток после охлаждения при предварительнол связывании лиганда: уже через 5 мин после перевода клеток в сред температурой 37 °С в отсутствие ЭФР система МТ восстанавливалась i сохраняла радиальность по крайней мере несколько часов (данные н представлены). Таким образом, методика предварительного связывания даст более четкую картину и физиологически значимые данные. Все дальнейши результаты получены с применением схемы предварительного связыванш лиганда.

Описанная нами реорганизация тубулинового цитоскелета в ход эндоцитоза наблюдалась не только в клетках HeLa, но и во многих други эпителиальных и фибробластоподобных клеточных линиях (А431, SKBR-3 РАЕ А II, НЕК 293, NIH ЗТЗ, Нег 14). Кроме того, схожие изменения тубулинового цитоскелета были обнаружены при стимуляции эндоцитоз фактором роста тромбоцитов (PDGF), хотя их скорость обычно была выше, чем в случае ЭФР (данные не представлены). Таким образом, наблюдаемый феномен в большей степени связан со стадиями эндоцитоза, чем с определенной линией клеток или определенным лиганд ом.

Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках с разной скоростью эндоцитоза (Kharchenko et al., 2007). Ранее было показано (Авров и др., 1996; Melikova et al., 2006), что в различных экспериментах клетки отличаются по скорости интернализации, сортировки лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы, рециклирования и деградации. Перечисленные параметры могут варьировать в широких пределах даже в

клетках одной и той же линии в зависимости от внешних условий. Можно выделить два крайних варианта эндоцитоза - «медленный» и «быстрый».

Выше были приведены данные для клеток с быстрым эндоцитозом, с эффективной лизосомной деградацией рецептора (рис. 3). Для быстрого эндоцитоза характерна смена стадии радиальности сети МТ на стадию дезорганизации или фрагментирования с последующим восстановлением радиальности. В клетках с медленным эндоцитозом, в которых сортировка рецептора в поздние эндосомы и его деградация оказывались неэффективными, транспорт эндосом в околоядерную область уменьшался вплоть до полного прекращения. При такой динамике эндоцитоза изначальные радиальные МТ в незначительной степени фрагментировались, а затем полностью деполимеризовались (рис. 4). Даже через 150 мин после начала стимуляции эндоцитоза радиальная сеть МТ не восстанавливалась. При этом эндосомы не увеличивались в размере, что свидетельствует о подавлении процесса их созревания.

Мы можем заключить, что при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов стадия перехода лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы сопровождается «спутыванием», «фрагментацией» и (или) деполимеризацией МТ, в то время как деградация ЭФР коррелирует с восстановлением радиальности. Эта корреляция со стадиями эндоцитозного пути справедлива для обоих методов стимуляции клеток и для обоих типов эндоцитоза, несмотря на различие временных параметров. Результаты свидетельствуют о том, что вся последовательность реорганизаций системы МТ не запрограммирована изначально на ранней стадии эндоцитоза. Мы предполагаем, что сигналы на реорганизацию сети МТ и на ее восстановление формируются на разных стадиях эндоцитоза, с различающихся по степени «зрелости» эндосом.

Чувствительность МТ к экстракции и степень ацетилированин тубулина изменяются в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов (КЬагсЬепко ^ а1., 2007). Соотношение свободных и ассоциированных с ЦОМТ МТ — одна из важных характеристик тубулинового цитоскелета. Существует подход для оценки этого параметра по скорости падения интенсивности флуоресценции тубулина от центра к периферии клетки — она выше для клеток с преобладанием МТ, связанных с ЦОМТ (Смурова и др., 2007). Применение этой модели к нашим данным показало, что клетки с радиальной организацией тубулинового цитоскелета различаются по соотношению свободных и связанных с ЦОМТ МТ, при этом преобладают МТ, связанные с ЦОМТ (рис. 5 А, Б). В клетках с деполимеризованным тубулином интенсивность флуоресценции слабо меняется от центра к периферии клетки (рис. 5 Г, Д). Наибольший интерес представляет описание «губкоподобной» организации тубулинового цитоскелета (рис. 5 В). В большинстве таких клеток хорошо выявляется ЦОМТ. Падение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, от ЦОМТ к периферии таких клеток, близкое к

ш.

»- II

•»-,, •> 1

у' * ✓Зй

о МКМ ■**■ | 'ФЩ

15 МИН

быстрый эндоцитоз

медденнъш эндошггоз

фрагментация

Сортировка в ПЭ

быстрая медленная р ^ . |

Реорганизация МТ

деполимеризация

Деградация

быстрая

медленная

Восстановление радиальной системы МТ

есть

Рис. 4. Совместное выявление рецептора ЭФР (отдельные везикулы указаны стрелкой) и тубулина в клетках НеЬа с разной скоростью эндоцитоза.

! [

! I

I I

I 1

I |

| 1

Расстояние от ЦОМТ до периферии клетки, усл. ед.

Рис. 5. Изменения интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, от ЦОМТ к периферии клеток с разной организацией МТ цитоскелета (А, Б - радиальная сеть МТ; В - губкоподобная сеть; Г, Д -деполимеризация тубулина, полная и частичная, соответственно).

1 ч

(О а)

& <и а 5 >>

о & И

•©< 3

г" ю

Ен4

«а н

линейному, соответствует предположению о преобладании «свободных» МТ разной длины. По причине большого разброса между отдельными клетками точно оценить параметры зависимостей между интенсивностью флуоресценции и расстоянием от ЦОМТ не представляется возможным.

Для оценки доли деполимеризованного тубулина и незакрепленных фрагментов МТ в клетках на разных стадиях эндоцитоза мы использовали раствор для экстракции растворимых цитоплазматических белков, далее

А Сортировка в ПЭ, реорганизация МТ_

шк

■ р

Контроль

15 мин

30 мин

60 мин

Контроль

Интернализация, ранние эндосомы. Радиальная система МТ

-►

/Г"

•м /

ж ' 1 *

Л\ 9 |

15 мин

30 мин

Сортировка в ПЭ,

реорганизация М^Г • • .............................

* ш

■ ч.

60 мин

Рис. 6 . Выявление тубулина методом иммунофлуоресценции в клетках НеЬа до и после обработки клеток цитоскелетным буфером (ЦБ) НЕРЕ8 (рН 7,2). А — клетки с быстрой сортировкой лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы. Б - клетки с медленной интернализацией

называемый цитоскелетным буфером. Такая методика позволяет удалить из клетки все молекулы, растворенные в цитоплазме, в том числе димеры тубулина. Мы ожидали разделить полимеризованный и деполимеризованный тубулин, однако использование цитоскелетного буфера (на основе HEPES рН 7.2) дало парадоксальные результаты. Радиальные МТ в контрольных клетках практически полностью вымывались, в них оставались единичные искривленные МТ разной длины (рис. 6). Когда же в необработанных буфером клетках МТ приобретали наиболее спутанный, фрагментированный вид («губкоподобная» организации тубулинового цитоскелета), обработка клеток цитоскелетным буфером практически не изменяла морфологию МТ цитоскелета. На рис. 6 А представлен случай эндоцитоза с быстрой сортировкой в поздние эндосомы. В клетках с медленной интернализацией максимальная дезорганизация МТ наблюдается через 60 мин после стимуляции эндоцитоза. Радиальные МТ, существовавшие в клетках до этой стадии, также чувствительны к действию буфера, тогда как фрагментированные дезорганизованные МТ - нет (рис. 6 Б). Таким образом, «фрагментированная», дезорганизованная сеть МТ отличается устойчивостью к действию цитоскелетного буфера вне зависимости от времени ее возникновения. Радиальная сеть МТ, восстановившаяся на стадии деградации рецептора ЭФР, оказалась устойчивой к экстракции цитоскелетным буфером. Эти данные позволяют предположить, что свойства МТ в ходе эндоцитоза изменяются. Применение цитоскелетного буфера на основе PIPES (рН 6.8) дало в целом схожие результаты.

Одной из возможных посттрансляционных модификаций МТ, влияющих на их стабильность, является ацетилирование тубулина (McKean et al., 2001). В контрольных клетках ацетилирование тубулина было выражено слабо - были видны только отдельные короткие ацетилированные участки МТ (рис. 7). После стимуляции эндоцитоза постепенно происходило ацетилирование участков МТ, приближенных к ЦОМТ. На стадии восстановления радиальной сети МТ их ацетилированнность значительно увеличивалось, и протяженные ацетилированные участки МТ оказывались распределенными по всей длине МТ. Таким образом, восстановленная радиальная структура тубулинового цитоскелета отличается от исходной устойчивостью к экстракции и усилением ацетилирования.

Зависимость реорганизации сети МТ от других типов цитоскелета (Kornilova et al., 2008). Наши данные позволяют предположить, что фрагменты МТ могут стабилизироваться в околоядерной зоне, возможно, за счет взаимодействия с другими элементами цитоскелета. Поэтому мы попытались выяснить, существенны ли микрофиламенты и промежуточные виментиновые филаменты для вышеописанной реорганизации МТ. В условиях коллапса актиновых структур под действием цитохалазина D реорганизация системы МТ в ходе эндоцитоза протекала без нарушений. Можно заключить,

Сортировка в ПЭ, реорганизация МТ Деградация

а контроль 15 мин 30 мин 120 мин

Рис. 7. Ацетилирование тубулина при реорганизации системы МТ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в клетках НеЬа.

что изменения тубулинового цитоскелета не связаны с реорганизацией актиновой сети.

Для проверки влияния промежуточных филаментов на перестройку сети МТ были использованы клетки мыши и МРТ-6, лишенные гена виментина, и клетки МРТ-16 с восстановленной экспрессией виментина. В клетках обеих линий до стимуляции эндоцитоза мы наблюдали спутанную сеть МТ (рис. 8). В клетках МРТ-16 эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов приводит к фрагментации МТ, в некоторых клетках наблюдается частичная деполимеризация (30-90 мин). Подобных изменений в клетках, лишенных виментина, не происходит. Таким образом, можно предположить непосредственное участие виментина в реорганизации системы МТ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

v£> i

О И К PI к 2 н

Ьй

Рис.

зависит

Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках, экспрессирующих мутантные формы рецептора ЭФР (Корнилова и др., 2005). Чтобы подойти к ответу на вопрос о том, какие сигналы инициируют преобразования, мы использовали клеточные линии, полученные на основе фибробластов мыши NIH ЗТЗ, экспрессирующие нормальную и мутантные формы рецептора ЭФР человека. Эти формы лишены С-терминальных доменов разной длины, несущих сайты связывания с сигнальными субстратами рецептора (CD165, CD123, CD63). Одной из особенностей этих клеток является разная динамика эндоцитоза (Корнилова и др., 2005). Так, лиганд-рецепторные комплексы в клетках CD 165 не попадают в поздние эндосомы, а в основном рециклируют из ранних. В клетках CD 123 комплексы сортируются в поздние эндосомы с низкой эффективностью, а CD63 — с эффективностью, присущей нормальному рецептору (HER 14) (рис. 9 Б). В клетках линий HER 14, CD63 и CD 123 эндоцитоз рецептора ЭФР приводит к описанной выше фрагментации МТ (15 мин), а потом и к деполимеризации тубулина (60 мин). В то же время, радиальная система МТ в клетках CD 165 сохраняется в ходе всего эксперимента и не подвергается никаким изменениям. Таким образом, способность рецептора ЭФР к переходу в поздние эндосомы может быть критичной для инициации перестроек тубулинового цитоскелета.

контроль 60 мин

8. Изменение организации тубулинового цитоскелета от промежуточных филаментов (виментина).

Рис. 9. Стимуляция эндоцитоза рецептора ЭФР в фибробластах мыши, экспрессирующих нормальную (HER 14) или мутантные формы рецептора ЭФР человека (DC63, DC123, и DC165). Выявление тубулина в клетках методом иммунофлуоресценции (А); компартментализация 1251-ЭФР ходе эндоцитоза (Б): по оси абсцисс - количество 1251-ЭФР во фракции, %; по оси ординат - номер фракции.

контроль 15 мин

60 мин

Н 15мин I I 60 мин

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные результаты позволяют предположить, что для начала реорганизации радиальной системы МТ необходимо достижение рецептор-содержащими эндосомами определенной стадии зрелости, по-видимому, соответствующей переходу в поздние эндосомы. Для созревания поздних эндосом необходимо участие определенных сортирующих комплексов, компоненты которых могут взаимодействовать с белками, дестабилизирующими МТ (Tsang et al., 2006). Например, есть сообщения о том, что компонент ESCRTI-комплекса, TSG101, способен взаимодействовать со статмином. Статмин привлекает наше внимание также и потому, что по крайней мере два сигнальных каскада способны изменять активность статмина - МАР-киназный каскад приводит к фосфорилированию статмина, a STAT3 образует комплексы со статмином в неактивированном состоянии. Кроме того, статмин не является единственным кандидатом, список белков, способных взаимодействовать как с эндосомами, так и с МТ, постоянно растет. Поэтому, хотя из общих соображений, а также из данных, полученных на мутантах, было бы разумно предположить, что такие модификации МТ должны стимулироваться при достижении эндосомами, нагруженными любым грузом, направляемым на лизосомную деградацию, определенной степени «зрелости», нельзя исключать вероятность того, что и передача сигнала с рецептора участвует в регуляции реорганизаций МТ. Аналогично, сигналом к восстановлению системы тубулинового цитоскелета может служить слияние поздних МВЭ с лизосомами или отсоединение вторичных МВЭ.

Характерно, что радиальная сеть МТ присутствует именно на тех стадиях эндоцитоза, которые нуждаются в радиальном перемещении везикул. Действительно, на ранних этапах эндоцитоза необходимо переместить ранние эндосомы в околоядерную область. Передвижение везикул на стадиях формирования МВЭ и существования гибридной эндо-лизосомы не нужно. Вторичные МВЭ после отделения от лизосом, по-видимому, выводятся из клеток экзоцитозом с участием МТ. Действительно, появление продуктов деградации ЭФР имеет место при восстановлении радиальных МТ. Косвенно это подтверждается тем, что количество ацетилированного тубулина, предпочтительно взаимодействующего с кинезинами (Reed et al., 2006), значительно возрастает, когда деградация ЭФР-рецепторных комплексов достигает максимальной скорости. Тем не менее, реальная картина может быть гораздо сложнее схем, рассматривающих только транспортную функцию МТ. Например, при фрагментации и деполимеризации МТ могут высвобождаться сигнальные молекулы, депонированные на МТ. Таким образом, МТ, как и цитоскелет в целом, могут играть роль интегратора транспортных и сигнальных процессов.

ВЫВОДЫ

1. Радиальная система МТ в культивируемых интерфазных клетках подвергается последовательным реорганизациям при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов. Стадия перехода лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы сопровождается видимой «фрагментацией» и (или) деполимеризацией МТ, в то время как выход продуктов деградации ЭФР во внеклеточную среду коррелирует с восстановлением радиальности сети МТ.

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапов реорганизации МТ связана с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

3. Радиальные МТ, поддерживающие перенос ранних эндосом в околоядерную область, отличаются от «фрагментированых» и радиальных МТ, наблюдаемых на более поздних этапах эндоцитоза, по чувствительности к обработке цитоскелетным буфером и по ацетилированности.

4. Реализация стадии «фрагментации» МТ нуждается в присутствии промежуточных (виментиновых) микрофиламентов, но не зависит от интактности актинового цитоскелета.

5. В клетках, экспрессирующих мутантную форму рецептора ЭФР, не способную к переходу в поздние эндосомы, перестроек тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза не наблюдается. Можно предполагать, что для начала изменений тубулинового цитоскелета необходимо достижение эндосомами определенной степени зрелости, т.е. их ассоциация с определенными белковыми комплексами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Железнова H.H., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский H.H., Корнилова Е.С. 2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/pl 10 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФР-рецепторных комплексов. Цитология. 45 (6): 574-581.

2. Харченко М.В., Корнилова Е.С., Меликова М.С. 2007. Изменение организации системы микротрубочек в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР. Цитология. 49 (3): 236-241.

3. Kharchenko M.V., Aksyonov A. A., Melikova М.М., Kornilova E.S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31: 349-359.

5. Корнилова E.C., Харченко M.B., Авров K.O. 2005. Роль эндоцитоза в регуляции сигналов, стимулируемых рецепторами эпидермального фактора роста. Тезисы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация": 12-13.

6. Харченко М.В., Аксенов A.A., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. 2006. Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в культивируемых клетках. Цитология. 48: 808.

7. Харченко М.В., Злобина М.В., Шрамко Б.В., Корнилова Е.С. 2007. Характер реорганизации радиальной системы микротрубочек в клетках HeLa с различной динамикой эндоцитоза. Цитология. 49 (9): 803.

8. Kornilova E.S., Zlobina M.S., Kharchenko M.V. 2008. Interphase microtubules undergo reorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. Abstracts of 33rd FEBS Congress: 253.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ вров К.О., Благовещенская А .Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1996. 1Висимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня ггивности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10): 184-1091.

!елезиова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С.

ЮЗ. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/pl 10 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФР-:цепторных комплексов . Цитология. 45: 574-581.

орнилова Е.С., Харченко М.В., Авров К.О. 2005. Роль эндоцитоза в регуляции [гналов, стимулируемых рецепторами эпидермального фактора роста. Тезисы еждународной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация": 12-13. мурова К.М., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2007. Свободные и связанные с центросомой икротрубочки: количественный анализ и моделирование двухкомпонентной системы, итология. 49: 270-279.

околова И.П., Арнаутов A.M., Благовещенская АД., Никольский Н.Н., Корнилова

.С. 1998. Влияние нокодазола на эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста, фитология. 40: 855-681.

niento F., Emails N., Griffiths GL, Gruenberg J. 1993. Cytoplasmic dynein-dependent esicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 123: 1373. 'Arrigo A., Bucci C., Toh B.H„ Stenmark H. 1997. Microtubules are involved in bafilomycin 1-induced tubulation and Rab5-dependent vacuolation of early endosomes. Eur J Cell Biol. 2(2): 95-103.

iaz E., Pfeffer S.R. 1998. TIP47: a cargo selection device for mannose 6-phosphate receptor ifficking. Cell. 93(3): 433-443.

olker E., Baker В., and Goodson H. 2005. Interaction of the Microtubule Cytoskeleton with ndocytic Vesicles and Cytoplasmic Dynein in Cultured Rat Hepatocytes. J. Biol. Chem. 270: 5242.

arrison R., Bucci C., Vieira O., Schroer Т., Grinstein S. 2003. Phagosomes Fuse with Late ndosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules'. Role f Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23: 6494-6506.

harchenko M.V., Aksyonov A. A., Melikova M.M., Kornilova E.S. 2007. Epidermal growth actor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in leLa cells. Cell Biol. Int. 31: 349-359.

ornilova E.S., Zlobina M.S., Kharchenko M.V. 2008. Interphase microtubules undergo eorganizations at late stages of EGF receptor degradative pathway. Abstracts of 33rd FEBS "ongress: 253.

cKean P.G., Vaughan S., and Gul K. 2001. The extended tubulin superfamily. J. Cell Sci. 14: 2723-2733.

elikova M.S., Kondratov K.A., and Kornilova E.S. 2006. Two different stages of epidermal rowth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by roteasome inhibitor MG132. Cell Biol. Int. 30(1): 31-43.

da H., Stockert R.J., Collins C., Wang H., Novikoff P.M., Satir P., Wolkoff A.W. 1995. nteraction of the Microtubule Cytoskeleton with Endocytic Vesicles and Cytoplasmic Dynein in ultured Rat Hepatocytes. J. Biol. Chem. 270:15242.

eed N.A., Cai D., Blasius T.L., Jih G.T., Meyhofer E., Gaertig J., Verhey K.J. 2006. icrotubule acetylation promotes kinesin-1 binding and transport. Curr Biol. 16(21): 2166-2172. sang H.T., Connell J.W., Brown S.E., Thompson A., Reid E., Sanderson C.M. 2006. A ystematic analysis of human CHMP protein interactions: additional MIT domain-containing roteins bind to multiple components of the human ESCRT III complex. Genomics. 88: 333-

346.Valetti C., Wetzel D.M„ Schrader M., Hasbani MJ., GDI S.R^ Kreis T.E., Schroer T.A.

1999. Role of Dynactin in Endocytic Traffic: Effects of Dynamitin Overexptession and Colocalization with CLIP-170. Mol. Cell. Biol. 23:6494-6506.

Van Dears B., Holm P.1C, Kayser L., Sandvig K. 1995. Delivery to lysosomes in the human carcinoma cell line Hep-2 involves an actin filament-facilitated fusion between mature endosomes and preexisting lysosomes. Eur. J. Cell Biol. 66:309-323.

Xie J., Quan L., Wang Y., Hamma-Alvares S.F., Mircheff A.K. 2004. Role of the microtubule cytoskeleton in traffic of EGF through the lacrimal acinar cell endomembrane network. Exp Eye Res. 78(6): 1093-1106.

Подписано в печать 16.11.2008. Формат 60x48/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ № 96.

Центр оперативной полиграфии «КОПИ-МЕДИА». Санкт - Петербург, 6-я линия В.О. д.29.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Харченко, Марианна Викторовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Внутриклеточный везикулярный транспорт

3.2. Типы эндоцитоза

3.3. Эндосомы

3.4. Эндоцитоз, опосредованный рецептором ЭФР

3.4.1. ЭФР и его рецептор

3.4.2. Динамика эндоцитоза, опосредованного рецептором ЭФР

3.4.3. Сортировка молекул в ПЭ

3.5. Участие цитоскелета в регуляции эндоцитоза

3.6. Микротрубочки

3.7. Белки, взаимодействующие с микротрубочками

4. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ

4.1. Культивирование клеточных линий

4.2. Лиганды и их производные

4.3. Антитела

4.4. Обработка клеток цитохалазином D

4.5. Обработка клеток буфером для экстракции растворимых цитоплазматических белков цитоскелетным буфером)

4.6. Исследование динамики эндоцитоза

4.7. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17 %-ного Перколла

4.8. Определение степени деградации лиганда

4.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

4.10. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

4.11. Измерение интенсивности флуоресценции антител, связанных с тубулином, в цитоплазме клеток

4.12. Воспроизводимость экспериментов

5. РЕЗУЛЬТАТЫ

5.1. Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

5.2. Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках с разной скоростью эндоцитоза

5.3. Количественный подход к характеристике разных типов реорганизации системы МТ

5.4. Чувствительность МТ к экстракции изменяется в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

5.5. Ацетилированность тубулина изменяется в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

5.6. Зависимость реорганизации сети МТ от других типов цитоскелета

5.7. Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках, экспрессирующих мутантные формы рецептора ЭФР

6. ОБСУЖДЕНИЕ

7. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клетках"

Актуальность проблемы

Эндоцитоз - один из видов везикулярного транспорта, присущего всем эукариотам. В случае эндоцитоза, опосредованного рецептором, лиганд взаимодействует со своим рецептором, находящимся на плазматической мембране, и образовавшийся лиганд-рецепторный комплекс поступает внутрь клетки (интернализуется). Затем комплексы либо рециклируют на плазматическую мембрану, либо деградируют в лизосомах. Лиганд-рецепторные комплексы, направляемые на деградацию, переходят в поздние мультивезикулярные эндосомы (МВЭ), локализованные в околоядерной области. В этой части клетки зрелые МВЭ взаимодействуют с лизосомами. Считается, что такие перемещения происходят с участием компонентов цитоскелета, в том числе, микротрубочек (МТ). Это предположение получило в дальнейшем множество подтверждений. Были идентифицированы белки, обеспечивающие взаимодействие эндосом с плюс-концами МТ и движение везикул в сторону центра организации МТ (ЦОМТ), такие как CLIP170, динеин-динактиновый комплекс, Rab-белки и др. (Folker et al., 2005; Oda et al., 1995; Valetti et al., 1999; Harrison et al., 2003). Перемещения эндосом с периферии клетки в околоядерную область не происходит после обработки клеток агентами, разрушающими МТ (van Deurs et al., 1985; Соколова и др., 1998; Xie et al., 2004). Данные различных исследователей о роли МТ в эндоцитозе чрезвычайно противоречивы. Сообщается, например, о замедлении разных стадий эндоцитоза после разрушения МТ деполимеризующими агентами (Aniento et al., 1993; D'Arrigo et al., 1997; Xie et a!., 2004). В других работах этот факт ставится под сомнение (Diaz et al., 1991; van Deurs et al., 1995; Соколова и ДР., 1998).

Клетки, экспрессирующие рецепторы эпидермального фактора роста (ЭФР), широко используются для изучения эндоцитоза, передачи внутриклеточного сигнала, а также взаимосвязи этих двух процессов. За последние два десятилетия были идентифицированы многие белки, участвующие в регуляции эндоцитоза на разных этапах (такие, как адаптерный белок Eps15, убиквитин-лигаза с-СЫ, малые ГТФазы Rab5 и Rab7, фосфатидилинозитол-3-киназы и др.). Выяснены также некоторые механизмы сортировки. Однако морфология тубулинового цитоскелета после стимуляции эндоцитоза до сих пор не изучалась, поскольку предполагалось, что радиальная сеть МТ в ходе эндоцитоза принципиально не меняется. В ходе наших исследований роли фосфатидилинозитол-3-киназ 1-го класса в регуляции эндоцитоза было показано, что эти молекулы ассоциируются с внутриклеточными структурами, отличными от эндосом (Железнова и др., 2003). Эти структуры находятся в области ЦОМТ совместно с МТ. В дальнейшем мы впервые описали перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза, связанные с нарушением радиального расположения МТ. Научная новизна работы

Мы впервые показали, что радиальная сеть МТ претерпевает последовательные изменения в ходе эндоцитоза. Описанный феномен характерен для широкого ряда культивируемых клеточных линий эпителия и фибробластов. Впервые выявлена связь между стадиями эндоцитоза и архитектурой тубулинового цитоскелета. Впервые продемонстрировано, что радиально расположенные МТ на ранних и на поздних стадиях эндоцитоза отличаются по свойствам.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Харченко, Марианна Викторовна

7. ВЫВОДЫ

2. Длительность, характер и степень проявления отдельных этапов реорганизации МТ связаны с динамикой эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Харченко, Марианна Викторовна, Санкт-Петербург

1. Авров К.О., Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1996. Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10): 1084-1091.

2. Василенко К.П, Бурова Е.Б, Цупкина Н.В, Никольский Н.Н. 1998. Интактная сеть микротрубочек необходима для ЭФР-индуцированного транспорта транскрипционного фактора STATI в ядро клеток А-431. Цитология. 40 (12): 1063-1069.

3. Железнова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ р85/р110 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФР-рецепторных комплексов. Цитология. 45: 574-581.

4. Пузиков В.Н. 2006. Экзоцитоз белков. М.: ИКЦ «Академкнига». 253 с.

5. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. Эпидермальный фактор роста. П.: Наука. 1987. 200 с.

6. Смурова К.М., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2007. Свободные и связанные с центросомой микротрубочки: количественный анализ и моделирование двухкомпонентной системы. Цитология. 49: 270-279.

7. Харченко М.В., Аксенов Н.Д., Корнилова Е.С. 2002. Влияние гипертонического раствора сахарозы и 5-(М,М-гексаметилен)-амилорида на рецептор-опосредованный и жидкофазный эндоцитоз. Цитология. 44 (7): 681690.

8. Чернобельская О.А., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2004. Динамика восстановления микротрубочек в клетке: быстрый рост от центросомы и медленное восстановление свободных микротрубочек. Цитология. 46 (6): 531544.

9. Arnal I., Heichette С., Diamantopoulos G.S., Chretien D. 2004. CLIP-170/tubulin-curved oligomers coassemble at microtubule ends and promote rescues. Curr Biol. 14(23): 2086-2095.

10. Al-Bassam J.,. Ozer R. Safer D., Halpain S., Milligan R. 2002. MAP2 and tau bind longitudinally along the outer ridges of microtubule protofilaments. The Journal of Cell Biology. 157 (7): 1187-1196.

11. Alieva I.В., Vaisberg E.A., Nadezhdina E.S., Vorobjev I.A. 1992. Microtubule and intermediate filament patterns around the centrosome in interphase cells. In: The centrosome (ed. V. C. Kalnins). San Diego: Academic Press: 103-129.

12. Amayed P., Pantaloni D., Carlier M.-F. 2002. The effect stathmin phosphorylation on microtubule assembly depends on tubulin critical concentration. J. Biol. Chem. 277: 22718-22724.

13. Amos L.A., Schlieper D. 2005. Microtubules and MAPS. Adv. Protein Chem. 71: 257-298.

14. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. 1993. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 123: 1373-1387. i

15. Apodaca G. 2001. Endocytic traffic in polarized epithelial cells: role of the actin and microtubule cytoskeleton. Traffic. 2: 149-". 59.

16. Babst M, Katzmann D.J./Estepa-Sabaf ;E.J., Meerloo Т., Emr S.D. 2002. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev. Cell. 3: 271-282.

17. Babst M., Odorizzi G., Estepa E.J. Emr S.D. 2000. Mammalian tumor susceptibility gene 101 (TSG101) and the yeast homologue, Vps23p, both function in late endosomal trafficking. Traffic. 1: 248-258.

18. Bache K.G., Raiborg C., Mehlum A. Stenmark H. 2003. STAM and Hrs are subunits of a multivalent ubiquitin-binding complex on early endosomes. J. Biol. Chem. 278: 12513-12521.

19. Barbero P., Bittova L., Pfeffer S.R. 2002. Visualization of Rab9-mediated vesicle transport from endosomes to the trans-Golgi in living cells. J. Cell Biol. 156: 511-518.

20. Barra H.S., Arce C.A., Rodriguez J.A., Caputto R. 1974. Some common properties of the protein that incorporates tyrosine as a single unite into microtubule proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 60: 1384-1390.

21. Bastiaens P., Majoul I., Verveer P., Soling H.-D., Jovin T. 1996. Imaging the intracellular trafficking and state of the AB5 quaternary structure of cholera toxin. EMBO J. 15: 4246-4253.

22. Beguinot L., Liall R.M., Willingham M.C., Pastan I. 1984. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells in due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 81: 2384-2388.

23. Belmont L.D., Mitchison T.J. 1996. Indentification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84: 623631.

24. Bergeron J.J.M., Cruz J., Khan M.N., Posner B.J. 1985. Uptake of insulin and other ligands into receptor-rich endocytic components of target cells: the endosomal apparatus. Ann. Rev. Physiol. 47: 383-403.

25. Betz R.C., Planko L., Eigelshoven S., Hanneken S., Pasternack S.M., Bussow H., Bogaert K.V., Wenzel J., Braun-Falco M., Rutten A. 2006. Loss-of-function mutations in the keratin 5 gene lead to Dowling-Degos disease. Am. J. Hum. Genet. 78: 510-519.

26. Beuret N., Stettler H., Renold A., Rutishauser J., Spiess M. 2004. Expression of regulated secretory 'proteins is sufficient to generate granule-like structures in constitutively secreting cells. J Biol Chem. 279 (19): 20242-2049.

27. Birukova A.A., Birukov K.G., Smurova K., Adyshev D., Kaibuchi K., Alieva I., Garcia J.G., Verin A.D. 2004. Novel role of microtubules in thrombin-induced endothelial barrier dysfunction. FASEB J. 18 (15): 1879-1890.

28. Bishop N., Woodman P.G. 2000. ATPase-defective mammalian VPS4 localizes to aberrant endosomes and impairs cholesterol trafficking. Mol. Biol. Cell. 11: 227239.

29. Blobel C. 2005. ADAMs: key components in EGFR signalling and development. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 6: 32-43.

30. Blocker A., Severin F.F., Burkhardt J.K., Bingham J.В., Yu H., Olivo J-C., Schroer T.A., Hyman A.A., Griffiths G. 1997. Molecular requirements for bidirectional movement of phagosomes along microtubules. J. Cell Biol. 137: 113129. '

31. Bosc C., Oenarier E., AncJrieux A., Job D. 1999. STOP proteins. Cell Struct. Funct. 24: 393-399.

32. Bre M.H., Karsenti E. 1990'. Effects of brain microtubule-associated proteins on microtubule dynamics and the nucleating activity of centrosomes. Cell. 15: 88-98.

33. Bre M.H., Kreis Т.Е., Karsenti E. 1987. Control of microtubule nucleation and stability in Madin-Darby canine kidney cells: the occurrence of noncentrosomal, stable detyrosinated microtubules. J. Cell Biol. 105: 1283-1296.

34. Bridges K., Harford J., Ashwell G., Klausner R.D. 1982. Fate of receptor and ligand during endocytosis of asialoglycoproteins by isolated hepatocytes. Prot. Nat. Acad. Sci. USA. 79: 350-354.

35. Brinkley B.R., Cox S.M., Pepper D.A., Wible L., Brenner S.L., Pardue R.L. 1981. Tubulin assembly sites and organization of cytoplasmic microtubules in cultured mammalian cells. J. Cell Biol. 90: 554-562.

36. Brinkley B.R., Fistel S.H., Marcum J.M., Pardue R.L. 1980. Microtubules in cultured cells: Indirect immunofluorescent staining with tubulin antibody. Int. Rev. Cytol. 63: 59-95.

37. Bucci C., Parton R.G., Mather I.H., Stunnenberg H., Simons K., Hoflack В., Zerial M. 1992. The small GTPase rab5 functions as a regulatory factor in the endocytic pathway. Cell. 70: 715-728.

38. Bulinski J.C., Richards J.E., Piperno G. 1988. Postranslational modifications of tubulin: detyrosination and acetylation differentiate populations of interphase microtubules in cultured cells. J. Cell Biol. 106: 1213-1220.

39. Carpenter G. 1992. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. FASEB J. 6: 3283-3289.

40. Carpenter G. 1987. Receptor for epidermal growth factor and other polypeptide mitogenes//Ann. Rev. Biochem. 56: 229-238.

41. Carpenter G., Cohen S. 1979. Epidermal growth factor. Ann. Rev. Biochem. 48: 193-216.

42. Carpentier J.-L., White M., Orci L., Kahn R. 1987. Direct visualization of EGF-R. J. Cell Biol. 105: 2751-2762.

43. Chang T.R. 1986. Redistribution of cell surface transferrin receptor prior to their concentration in coated pits as revealed by immunoferritin labels. Cell Tissue Res. 244: 613-619.

44. Chen W.S., Lazar C.S., Poenie M., Tsien R.Y., Cill G.N., Rosenfeld M.G. 1987. Requirement for intrinsic protein tyrosine kinase in the immediate and late action of the EGF-receptor. Nature. 328: 820-823.

45. Chin L., Raynor M.C., Wei X., Chen H.Q., Li L. 2001. Hrs Interacts with Sorting Nexin 1 and Regulates Degradation of Epidermal Growth Factor Receptor J. Biol. Chem. 276: 7069-7078.

46. Clague M.J., Urbe S., Aniento F., Gruenberg J. 1994. Vacuolar ATPase activity is required for endosomal carrier vesicle formation. J. Biol Chem. 269: 21-24.

47. Clarke M., Kohler J., Arana.Q., Liu Т., Heuser J., Gerisch G. 2002. Dynamics of the vacuolar H+-ATPase in the contractile vacuole complex and the endosomal pathway of Dictyostelium cells. J. Cell Sci. 115: 2893-2905.

48. Curmi P.A., Andersen S.S., Lachkar S., Gavet O., Karsenti E., Knossow M., Sobel A. 1997. The stathmin/tubulin interaction in vitro. J. Biol. Chem. 272: 2502925036.

49. DArrigo A., Bucci C., Toh B.H., Stenmark H. 1997. Microtubules are involved in bafilomycin A1-induced tubulation and Rab5-dependent vacuolation of early endosomes. Eur J Cell Biol. 72 (2): 95-103.

50. Davis R.J. 1988. Independent mechanism account for the regulation by PKC of the EGFR affinity and tyrosine kinase activity. J. Biol. Chem. 263: 9462-9469.

51. Denarier E., Fourest-Lieuvin A., Docs C., Pirollet F., Chapel A., Margolis R.L., Job D. 1998. Nonneuronal isoforms of STOP protein are responsible for microtubule cold stability in mammalian fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6055-6060.

52. Diaz R. Colombo M.I., Koval M., Mayorga L., Stahl P. 1991. Endosomal density shift is related to a decrease in fusion capacity. Eur. J. Cell Biol. 56 (2): 223-232.

53. Dickson R., Hanover J.A., Willingham M.C., Pastan I. 1983. Prelysosomal divergence of transferrin and epidermal growth factor during receptor-mediated endocytosis. Biochemistry. 22: 5667-5674.

54. Downward J., Parker P., Waterfield M.D. 1984. Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor receptor. Nature. 311: 483-485.

55. Dumontet С., Sikic B.I. 1999. Mechanisms of Action of and Resistance to Antitubulin Agents: Microtubule Dynamics, Drug Transport, and Cell Death. J. Clin. Oncol. 17: 1061.

56. Dunn K.W., Maxfield F.R. 1992. Delivery of ligands from sorting endosomes to late endosomes occurs by maturation of sorting endosomes. J. Cell Biol. 120: 7783.

57. Dunn W.A., Connoly T.P., Hubbard A.L. 1986. Receptor-mediated endocytosis of epidermal growth factor by rat hepatocytes: receptor pathway. J. Cell Biol. 102: 24-36.

58. Dupre S., Volland C., Haguenauer-Tsapis R. 2001. Membrane transport: ubiquitylation in endosomal sorting. Curr Biol. 13 (22): 932-934.

59. Durrbach A., Louvard D., Coudrier E. 1996. Actin filaments facilite two steps of endocytosis. J Cell Sci. 109: 457^65.

60. Eipper B.A. 1972. Rat brain microtubule protein: purification and determination of covalently bound phosphate and carbohydrate. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 69: 2283-2287.

61. Fanger G.R., Johnson N.L., Johnson G.L. 1997. MEK kinases are regulated by EGF and selectively interact with Rac/Cdc42. EMBO J. 16: 4961-4972.

62. Folker E., Baker В., Goodson H. 2005. Interactions between CLIP-170, tubulin, and microtubules: implications for the mechanism of CLIP-170 plus-end tracking behavior. Mol. Biol. Cell. 16: 5373-5384.

63. Fuchs E., Weber K. 1994. Intermediate filaments: structure, dynamics, function, and disease. Annu Rev Biochem. 63: 345-382.

64. Fujimoto L.M., Roth R., Heuser J.E., Schmid S.L. 2000. Actin assembly plays a variable, but not obligatory role in receptor-mediated endocytosis in mammalian cells. Traffic. 1: 161-171.

65. Gaidarov I., Santini F., Warren R.A., Keen J.H. 1999. Spatial control of coated-pit dynamics in living cells. Nat. Cell Biol. 1: 1-7.

66. Galcheva-Gargova Z., Theroux S.J., Davis R. J. 1995. The epidermal growth factor receptor is covalently linked to ubiquitin. Oncogene. 21 (12): 2649-2655.

67. Gard D.L., Kirschner M.W. 1985. A polymer-dependent increase in phosphorylation of beta-tubulin accompanies differentiation of a mouse neuroblastoma cell line. J. Cell Biol. 100: 764-774.

68. Ghosh R.N., Maxfield F.R. 1995. Evidence for nonvectorial retrograde transferring trafficking in the early endosomes of HEP2 cells. J. Cell Biol. 142: 923936.

69. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson R.G.W., Russell D.W., Schneider W.J. 1985. Receptor-mediated endocytosis: concepts emerging from the LDL receptor system. Ann. Rev. Cell Biol. 1: 1-39.

70. Griffiths G. 1992. Compartments of the endocytic pathway. Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag. 62: 73-83.

71. Griffiths G., Gruenberg J. 1991. The arguments for pre-existing early and late endosomes. Trends Cell Biol. 1(1): 5-9.

72. Gruenberg J., Griffiths G., Howell K.E. 1989. Characterization of the early endosome and putative endocytic carrier vesicles in vivo and with an assay of vesicle function in vitro. J. Cell Biol. 108: 1301-1316.

73. Gruenberg J., Howell K.E. 1989. Membrane traffic in endocytosis: insights from cell-free assays. Ann. Rew. Cell. Biol. 5: 453-481.

74. Gundersen G.G., Bulinski J.C. 1986. Microtubule arrays in differentiated cells contain elevated levels of a post-translationally modified form of tubulin. Eur. J. Cell Biol. 42: 288-294.

75. Haigler H.T., McCanna J.A., Cohen S. 1979. Direct visualization of the binding and internalization of a ferritin conjugates of the epidermal growth factor in human carcinoma cells A431. J. Cell Biol. 81: 392-395.

76. Harada A., Takei Y., Kanai Y., Tanaka Y., Nonaka S., Hirokawa N. 1998. Golgi Vesiculation and Lysosome Dispersion in Cells Lacking Cytoplasmic Dynein. J. Cell Biol. 141 (1): 51-59.

77. Harding C., Heuser J., Stahl P. 1984. Endocytosis and intracellular processing of transferrin and colloidal gold-transferrin in rat reticulocytes: demonstration of a pathway for receptor shedding. Europ. J. Cell Biol. 35: 256-263.

78. Harrison R., Bucci C., Vieira O., Schroer Т., Grinstein S. 2003. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23: 6494-6506.

79. Helfand B.T., Chang L., Goldman R.D. 2004. Intermediate filaments are dynamic and motile elements of cellular architecture. J Cell Sci. 15: 133-141.

80. Heuser J.E., Anderson R.G.W. 1989. Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. J. Cell Biol. 108: 389-400.

81. Hewlett L.J., Prescott A.R., Watts C. 1994. The coated pit and macropinocytic pathway serve distinct endosome populations. J. Cell Biol. 124: 689-703.

82. Holbro Т., Civenni G., Hynes N.E. 2003. The ErbB receptors and their role in cancer progression. Exp. Cell. Res. 284: 99-110.

83. Hopkins C.R. 1983. Intracellular routing of transferrin and transferrin receptors in epidermoid carcinoma A431 cells. Cell. 35: 321-330.

84. Hopkins C.R. 1985. The appearance and internalization of transferrin receptors at the margins of spreading human tumor cells. Cell: 40: 199-208.

85. Hopkins C.R., Miller K., Baerdmore J.M. 1985. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and epidermal growth factor receptors: a comparison of constitutive and ligand-induced uptake. J. Cell Sci. Suppl. 3: 173-186.

86. Hotani H., Horio T. 1988. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability.Cell Motility and the Cytoskeleton. 10: 229-236.

87. Hu J., Wittekind S.G., Barr M.M. 2007. STAM and Hrs Down-Regulate Ciliary TRP Receptors. Mol. Biol. Cell. 18: 3277-3289.

88. Kashles O., Szapary D., Bellot F., Ullrich A., Schlessinger J., Schmidt A. 1988. Ligand-induced stimulation of EGF-receptor mutants with altered trans-membrane region. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 85: 9567-9571.

89. Kasuga M„ Zick Y., Blith D.L., Karlsson F„ Haring H.U., Kahn C.R. 1982. Insulin stimulation of phosphorylation of the beta-subunit of the insulin receptor. Formation of both phosphoserine and phosphotyrosine. J. Biol. Chem. 257: 98919894.

90. Kim M.H., Cierpicki Т., Derewenda U., Krowarsch D., Feng Y., Devedjiev Y., Dauter Z., Walsh C. A., Otlewski J., Bushweller J. H., Derewenda Z.S. 2003. The DCX-domain tandems of doublecortin and doublecortin-like kinase. Nat. Struct. Biol. 10: 324-333.

91. Kim S., Coulombe P.A. 2008. Intermediate filament scaffolds fulfill mechanical, organizational, and signaling functions in the cytoplasm. Genes & Dev. 21:15811597.

92. Kirschner M.W., Mitchison T. 1986. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45: 329-342.

93. Klausner R.D., Ashwell G., van Renswoude J., Harford J.В., Bridges K.R. 1983. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Prot. Nat. Acad. Sci. USA. 80: 2263-2266.

94. Komada M., Masaki R., Yamamoto A. Kitamura N. 1997. Hrs, a tyrosine kinase substrate with a conserved double zinc finger domain, is localized to the cytoplasmic surface of early endosomes. J. Biol. Chem. 272: 20538-20544.

95. Kong C., Su X., Chen P.-l., Stahl P.D. 2007. Rin1 Interacts with Signal-transducing Adaptor Molecule (STAM) and Mediates Epidermal Growth Factor Receptor Trafficking and Degradation. J. Biol. Chem. 282: 15294-15301.

96. Kreitzer G., Liao G., Gundersen G.G. 1999. Detyrosination of tubulin regulates the interaction of intermediate filaments with microtubules in vivo via a kinesin-dependent mechanism. Mol. Biol. Cell. 10: 1105-1118.

97. Maly I.V., Borisy G.G. 2002. Self-organization of treadmilling microtubules into a polar array. Trends Cell Biol. 12 (10): 462-465.

98. Margolis В., Rhee S.G., Felder S„ Mervic M., Lyall R., Levitzki A., Ullrich A., Zilberstein A., Schlessinger J. 1989. EGF induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C-ll: a potential mechanism for EGF receptor signaling. Cell. 57: 1101-1107.

99. Martys J.L., Ho C.-L., Liem R.K.H., Gundersen G.G. 1999. Intermediate Filaments in Motion: Observations of Intermediate Filaments in Cells Using Green Fluorescent Protein-Vimentin. Mol. Biol. Cell. 10:1289-1295.

100. Maxfield F.R., Willingham M.C., Haigler H., Dragsten P., Pastan I. 1981. Binding, surface mobility, internalization and degradation of rodamine-labeled macroglobulin. Biochemistry. 22: 5353-5358.

101. Mc Kean P.G., Vaughan S., Gul K. 2001. The extended tubulin superfamily. J. Cell Sci. 114: 2723-2733.

102. McNally F.J., Okawa K., Iwamatsu A., Ronald D. 1996. Katanin, the microtubule-severing ATPase, is concentrated at centrosomes. JCS. 109: 561-567.

103. Melikova M.S., Kondratov K.A., Kornilova E.S. 2006. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG132. Cell Biol. Int. 30 (1): 31-43.

104. Miller К., Beardmore J., Kanety H., Schlessinger J., Hopkins C.R. 1986. Localization of the epidermal growth factor (EGF) receptor within the endosomes of EGF-stimulated epidermoid carcinoma (A431) cells. J. Cell Biol. 102: 500-509.

105. Miranda M., Sorkin A. 2007. Regulation of Receptors and Transporters by Ubiquitination: New Insights into Surprisingly Similar Mechanisms. Mol. Interv. 7: 157-167.

106. Mostov K.E., Freidlander M., Blobel G. 1984. The receptor of transepithelial transport of IgA and IgM contains multiple immunoglobuline-like domains. Nature: 308. 37-43.

107. Murray J.W.; Bananis E.; Wolkoff A.W. 2000. Reconstitution of ATP-dependent movement of endocytic vesicles along microtubules in vitro: an oscillatory bidirectional process. Mol Biol Cell.11: 419-433.

108. Murthy R. 1991. Maturation models in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 1: 77-82.

109. Myung J., Kim K.B., Crews C.M. 2001. The ubiquitin-proteasome pathway and proteasome inhibitors. Med. Res. Rev. 21: 245-273.

110. Ng D.C., Lin B.H., Lim C.P., Huang G„ Zhang Т., Poli V., Cao X. 2006. Stat3 regulates microtubules by antagonizing the depolymerization activity of stathmin. J. Cell Biol. 172 (2): 245-257.

111. Nielsen E., Severin F., Backer J.M., Hyman A.A., Zerial M. 1999. Rab5 regulates motility of early endosomes on microtubules. Nat. Cell Biology 1: 376382.

112. Novikoff P.M., Cammer M., Tao L., Oda H., Stockert R.J., Wolkoff A.W., Satir P. 1996. Three-dimensional organization of rat hepatocyte cytoskeleton: relation to the asiaioglycoprotein endocytosis pathway. J. Cell Sci. 1996. 109 (Pt 1): 21-32.

113. Oda H„ Stockert R.J., Collins C„ Wang H., Novikoff P.M., Satir P., Wolkoff A.W. 1995. Interaction of the microtubule cytoskeleton with endocytic vesicles and cytoplasmic dynein in cultured rat hepatocytes. J. Biol. Chem. 270: 15242.

114. Olsnes S., Sandvig K. 1985. Endocytosis. In: Toxins. NY: Plenum Press: 195234.

115. Osborn M., Born Т., Koitsch H-J., Weber K. 1978. Stereoimmunofluorescence microscopy. I. Three-dimensional arrangement of microfilaments, microtubules, and tonofilaments. Cell. 14: 477-488.

116. Ozcan F., Klein P., Lemmon M.A., Lax I., Schlessinger J. 2006. On the nature of low- and high-affinity EGF receptors on living cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103: 5735-5740.

117. Piasek A., J Thyberg. 1980. Effects of colchicine on endocytosis of horseradish peroxidase by rat peritoneal macrophages. J Cell Sci. 45: 59-71.

118. Pierre P., Scheel J., Rickard J.E., Kreis Т.Е. 1992. CLIP-170 links endocytic vesicles to microtubules. Cell. 70 (6): 887-900.

119. Piperno G., Fuller M.T. 1985. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of a-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. J. Cell Biol. 101: 2085-2094.

120. Posner B.I., Khan M.N., Bergeron J.J.M. 1982. Endocytosis of peptide hormones and other ligands. Endocrine Rev. 3: 280-298.

121. Potokar M., Kreft M., Li L., Andersson J.D., Pangrsic Т., Chowdhury H.H., Pekny M., Zorec R. 2007. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8: 12-20.

122. Raymond, C.K., Howald-Stevenson, I., Vater, C.A., Stevens, Т.Н. 1992. Morphological classification of „the yeast vacuolar protein sorting mutants: evidence for a prevacuolar compartment in Class E vps mutants. Mol. Biol. Cell. 3: 13891402.

123. Reed N.A., Cai D., Blasius T.L., Jih G.T., Meyhofer E., Gaertig J., Verhey K.J. 2006. Microtubule acetylation promotes kinesin-1 binding and transport. Curr Biol. 16 (21): 2166-2172.

124. Reid E., Connell J., Edwards T.L., Duley S., Brown S.E., Sanderson C.M. 2005. The hereditary spastic paraplegia protein spastin interacts with the ESCRT-III complex-associated endosomal protein CHMP1B. Hum. Mol. Genet. 14: 19-38.

125. Riese D.J. 2nd, Gallo R.M., Settleman J. 2007. Mutational activation of ErbB family recep-tor tyrosine kinases: insights into mechanisms of signal transduction and tumorigenesis. BioEssays. 29: 558-565.

126. Roth Т.Е., Porter K.R. 1964. Yolk protein uptake in the oocyte of the mosquito Aedes aegypti L. J. Cell Biol. 20: 313-332.

127. Ruff-Jamison S., Zhong Z., Wen Z., Chen K., Darnell J.E., Cohen S. 1994. Epidermal growth factor and lipopolysaccharide activate Stat3 transcription factor in mouse liver. J. Biol. Chem. 269: 21933-21935.

128. Salisbury J.L., Condeelis J.S., Satir P. 1980. Role of coated vesicles, microfilaments, and calmodulin in receptor-mediated endocytosis by cultured В lymphoblastoid cells. J Cell Biol. 87: 132-141.

129. Sandoval I.V., Cuatrecasas P. 1976. Opposing effects of cyclic AMP and cyclic GMP on protein phosphorylation in tubulin preparations. Nature. 262: 511-514.

130. Sandvig K., Olsnes G., Peterson O.W., van Deurs B. 1987. Acidification of the cytosol inhibits endocytosis from coated pits. J. Cell Biol. 105: 679-689.

131. Schmidt S.L., Fuchs R., Male P., Mellman I. 1988. Two distinct subpopulation of endosomes involved in membrane recycling and transport to lysosomes. Cell. 52: 72-83.

132. Schroer T.A., Schnapp B.J., Reese T.S., Sheetz M.P. 1988. The role of kinesin and other soluble factors in organelle movement along microtubules. J Cell Biol. 107(5): 1785-1792.

133. Schulze E., Kirschner M. 1986. Microtubule dynamics in interphase cells. J. Cell Biol. 102: 1020-1031.

134. Scott A., Gaspar J., Stuchell-Brereton M.D., Alam S.L., Skalicky J.J., Sundquist W.I. 2005. Structure and ESCRT-III protein interactions of the MIT domain of human VPS4A. PNAS. 102: 13813-13818.

135. Seals D.F. and Courtneidge S.A. 2003. The ADAMs family of metalloproteases: multidomain proteins with multiple functions. Genes & Dev. 17: 7-30.

136. Smith R.M., Jarett L. 1987. Ultrastructural evidence for the accumulation of insulin in nuclei of intact 3T3-L1 adipocytes by an insulin-receptor mediated process. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 84 (2): 459-463.

137. Smythe E., Warren G. 1991. The mechanism of receptor-mediated endocytosis. Europ. J. Biochem. 202: 689-699.

138. Sobel A., Boutterin M.C., Beretta L., Chneiweiss H., Doye V., Peyro-Saint-Paul H. 1989. Intracellular substrates for extracellular signaling. Characterization of a ubiquitous, neuron-enriched phosphoprotein (stathmin). J. Biol. Chem. 264: 37653772.

139. Soderquist A.M., Carpenter G. 1984. Glycosylation of the epidermal growth factor receptor in A-431 cells. The contribution of carbohydrate to receptor function. J. Biol. Chem. 259: 12586-12594.

140. Soltys B.J., Borisy G.G. 1985. Polymerization of tubulin in vivo: direct evidence for assembly onto microtubule ends and from centrosomes. J. Cell Biol. 100:16821689.

141. Sorkin A., Kornilova E., Teslenko L., Sorokin A., Nikolsky N. 1988. Recycling of epidermal growth factor-receptor complexes in A431 cells. Biochem. Biophys. Acta. 1011: 88-96.

142. Sorkin A., Krolenko S., Kudrijavtseva N., Lazebnik J., Teslenko L., Soderquist A.M., Nikolsky N. 1991. Recycling of epidermal growth factor-receptor complexes in A431 cells: identification of dual pathway. J. Cell Biol. 112: 55-63.

143. Staub O., Rotin D. 2006. Role of ubiquitylation in cellular membrane transport. Physiol Rev. 86: 669-707.

144. Steinman R.M., Mellman I.S., Muller W.A., Cohn Z.A. 1983. Endocytosis and the recycling of plasma membrane. J. Cell Biol. 96: 1-27.

145. Stochem W., Wohlfarth-Botterman K.E. 1969. Pinocytosis (enocytosis). In: Handbook of molecular cytology. Amsterdam: Elsevier: 1373-1400.

146. Stoorvogel W., Geuze H., Strous G.J. 1987. Sorting of endocytosed transferrin and asialoglycoprotein occurs immediately after internalization in HepG2 cells. J. Cell Biol. 104: 1261-1268.

147. Stoorvogel W., Strous G.J., Geuze H.J., Oorschot V., Schwartz A. 1991. Late endosomes derive from early endosomes by maturation. Cell. 65: 417-427.

148. Stoscheck C.M., Carpenter G. 1984. Characterization of the metabolic turnover of epidermal growth factor receptor protein in A431 cells. J. Cell Phisiol. 120: 296302.

149. Styers M.L, Salazar G., Love R., Peden A.A., Kowalczyk A.P., Faundez V. The endo-lysosomal sorting machinery interacts with the intermediate filament cytoskeleton. Molecular biology of the cell. 15(12): 5369-5382.

150. Styers M.L., Kowalczyk A.P., Faundez V. 2005. Intermediate filaments and vesicular membrane traffic: the odd couple's first dance? Traffic. 6: 359-365.

151. Synnes M., Prydz K., Lovdal Т., Brech A., Berg T. 1999. Fluid phase endocytosis and galactosyl receptor-mediated endocytosis employ different early endosomes. BBA. 1421 (2): 317-328.

152. Tuma P.L., Hubbard A.L. 2003. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol Rev. 83: 871-932.

153. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptor with tyrosine kinase activity. Cell. 61: 287-307.

154. Unanue E.R., Ungewickell E., Branton D. 1981. The binding of clathrin triskelions to membranes from coated pits. Cell. 26: 439-446.

155. Uttam J., Hutton E., Coulombe P.A., Anton-Lamprecht I., Yu Q.C., Gedde-Dahl Т., Fine J.D., Fuchs E. 1996. The genetic basis of epidermolysis bullosa simplex with mottled pigmentation. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 9079-9084.

156. Vaaraniemi J., Halleen J.M., Kaarlonen K., Ylipahkala H., Alatalo S.L., Andersson G., Kaija H., Vihko P., Vaananen H.K. 2004. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. J Bone Miner Res. 19 (9): 14321440.

157. Vale R.D. 2000. AAA Proteins: Lords of the Ring. J. Cell Biol. 150: 13-20.

158. Vorobjev I.A., Chentsov Y.S. 1983. The dynamics of reconstitution of microtubules around the cell center after cooling. Eur J Cell Biol. 30 (2): 149-153.

159. Waguri S., Dewitte F., Le Borgne R., Rouille Y., Uchiyama Y., Dubremetz J.F., Hoflack B. 2003. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol. Biol. Cell. 14 (1): 142-155.

160. Wang L., MacDonald R.C. 2004. Effects of microtubule-depolymerizing agents on the transfection of cultured vascular smooth muscle cells: enhanced expression with free drug and especially with drug-gene lipoplexes. Mol. Ther. 9 (5): 729-737.

161. Ward D.M., Perou C.M., Lloyd M., Kaplan J. 1995. "Synchronized" endocytosis and intracellular sorting in alveolar macrophages: the early sorting endosome in a transient organelle. J. Cell Biol. 129: 1229-1240.

162. Warren G. 1990. Trawling for receptors. Nature. 346: 318-319.

163. West M.A., Brestcher M.S., Watts C. 1989. Distinct endocytic pathways in EGF stimulated human carcinoma A431 cells. J. Cell Biol. 109: 2731-2739.

164. White J., Keilian M., Helenius A. 1983. Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses. Quart. Rev. Biophys. 16: 151-195.

165. Wileman Т., Harding C., Stahl P. 1985. Receptor-mediated endocytosis. Biochem. J. 232: 1-14.

166. Wiley H.S., Cunningham D.D. 1982. The endocytic rate constant. A cellular parameter for quantitative receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 257: 4222-4229.

167. Wilkinson C.R. New tricks for ubiquitin and friends. 2002. Trends Cell Biol. 12 (12): 545-546.

168. Wittmann Т., Bokoch G.M., Waterman-Storer C.M. 2004. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J. Biol. Chem. 279: 6196-6203.

169. Xiang X. 2006. A +TIP for a smooth trip. JCB. 172: 651-654.

170. Xie J., Quan L., Wang Y., Hamma-Alvares S.F., Mircheff A.K. 2004. Role of the microtubule cytoskeleton in traffic of EGF through the lacrimal acinar cell endomembrane network. Exp Eye Res. 78(6): 1093-1106.

171. Yamashiro D.J., Tycko В., Fluss S.R., Maxfield F.R. 1984. Segregation of transferrin to a mildly acidic (pH 6.5) para-Golgi compartment in the recycling pathway. Cell. 37: 789-800.

172. Yoon M., Moir R.D., Prahlad V., Goldman R.D. 1998. Motile properties of vimentin intermediate filament networks in living cells. J Cell Biol. 143: 147-157.

173. Zhang X., Gureasko J., Shen K., Cole P.A., Kuriyan J. 2006. An allosteric mechanism for activation of the kinase domain of epidermal growth factor receptor. Cell. 125: 1137-1149.

Информация о работе

Харченко, Марианна Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клетках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы