Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II

Рубцов, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II"

На правах рукописи

РУБЦОВ МИХАИЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

РЕЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ-ПАРТНЕРОВ ПО НЕЗАКОННОЙ РЕКОМБИНАЦИИ В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫII

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003471960

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории Структурно-функциональной организации хромосом Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Яровая Ольга Владимировна

чл.-корр. РАН,

доктор биологических наук,

профессор

Разин Сергей Владимирович

доктор биологических наук Карпова Ольга Вячеславовна

кандидат биологических наук Акопов Сергей Борисович

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита состоится "19" . июня 2009 г. в " / ( " часов на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, лабораторный корпус «А», аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Москва.

Автореферат разослан "_"_2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Развитие острой миелоидной лейкемии обычно связывают с хромосомными перестройками, приводящими к возникновению химерных генов. Транслокация t(8;21)(q22;q22), объединяющая гены AML1 и ЕТО, известна как одна из наиболее частых хромосомных транслокаций, наблюдаемых при острой миелоидной лейкемии. Эта транслокация часто наблюдается при так называемых «обусловленных лечением» (treatment related) или вторичных лейкозах. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что во многих случаях' к развитию вторичных лейкозов приводит противораковая химиотерапия «первичных» опухолей, проводящаяся с использованием препаратов, специфически ингибирующих фермент ДНК-топоизомеразу II. Ингибиторы эукариотических топоизомераз относятся к числу наиболее широко используемых противоопухолевых агентов. В силу всего сказанного чрезвычайно важным представляется изучение механизма возникновения хромосомных перестроек в клетках, обработанных ингибиторами ДНК-топоизомеразы И. Одна из проблем состоит в том, что многие гены-партнеры по хромосомным транслокациям имеют мало шансов оказаться в одном и том же месте в ядре в силу особенностей позиционирования хромосомных территорий. Это относится и к генам AML1 и ЕТО. Так, хромосома 21, содержащая ген AML1, локализуется в центральной части ядра, а несущая ген ЕТО хромосома 8 - ближе к его периферии. Между тем представляется очевидным, что для осуществления транслокации необходим физический контакт между точками разрыва хромосом. Кажущееся противоречие может быть разрешено, если допустить, что в условиях ингибирования активности ДНК-топоизомеразы II нарушается нормальная пространственная организация интерфазных хромосом. Проверка данного предположения представляет большой интерес как с фундаментальной, так и с практической точек зрения. Действительно, это может способствовать раскрытию механизмов позиционирования хромосом в интерфазном ядре, которые в настоящее время не охарактеризованы. С другой стороны, полученные фундаментальные знания могут быть использованы при разработке новых подходов к химиотерапии опухолей, снижающих вероятность возникновения вторичных лейкозов. Все вышесказанное определяет актуальность настоящей работы.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение взаимного расположения генов -партнеров по транслокации t(8;21)(q22;q22) в норме и после обработки клеток человека ингибиторами ДНК-топоизомеразы II. В частности мы предполагали выяснить вопрос о том,

влияет ли обработка клеток ингибиторами ДНК-топоизомеразы II на позиционирование в интерфазном ядре генов АМН и ЕТО. При получении положительного ответа на этот вопрос, ставилась задача изучить характер изменений в пространственном расположении этих генов и механизмы возникновения данных изменений. Для достижения поставленных целей были определены следующие экспериментальные задачи:

• определить взаимное пространственное расположение генов AML1 и ЕТО в ядрах эмбриональных фибробластов человека;

• выяснить, приводит ли ингибирование ДНК-топоизомеразы II этопозидом к изменению радиальных позиций генов AML1 и ЕТО в ядрах эмбриональных фибробластов и среднего расстояния между этими генами;

• отработать технику трехмерной гибридизации in situ с использованием фиксированных трехмерных препаратов культивируемых Т-клеток (линия Jurkat) и подтвердить либо опровергнуть наличие тех эффектов, которые наблюдаются на фибробластах.

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе впервые показано, что взаимное пространственное расположение генов AML1 и ЕТО в ядрах клеток первичной культуры нормальных фибробластов человека отличается от случайного, и что данные гены расположены в разных ядерных слоях (ядерных орбитах). Также показано, что обработка клеток этопозидом, ингибитором ДНК-топоизомеразы II, широко применяемым в противораковой химиотерапии, вызывает такое пространственное перемещение гена ЕТО, которое в значительной части клеток приводит к локализации генов AML1 и ЕТО в одном и том же ядерном слое. Продемонстрировано, что данный эффект связан с формированием на ДНК арестованного промежуточного комплекса ДНК-топоизомеразы II. С использованием ингибиторного анализа получены косвенные свидетельства того, что релокализация гена ЕТО в клетках, обработанных этопозидом, является активным процессом, в котором участвует ядерный миозин. Полученные результаты поддерживают гипотезу, постулирующую, что поврежденные участки разных хромосом, локализованные в отстоящих друг от друга областях ядра, могут быть активно сближены, в результате чего становится возможным осуществление реципрокных транслокаций между этими участками.

Получены результаты, демонстрирующие, что в условиях ингибирования активности ДНК-топоизомеразы II ген ЕТО релокализуется в область ядрышка, и указывающие на возможное участие ядрышковых белков (ДНК-топоизомеразы Ilß, нуклеолина и др.) в осуществлении незаконной рекомбинации. Таким образом, получены указания на существование еще одной ранее неизвестной неканонической функции ядрышка.

Наиболее важные результаты работы не имеют аналогов в мировой литературе. Они вносят важный вклад в современные представления о пространственной организации клеточного ядра, демонстрируя, в частности, динамический характер этой организации. Более того, некоторые из сделанных наблюдений намечают перспективные пути решения проблемы вторичных лейкозов. Эти пути могут быть связаны с предпочтительным использованием для химиотерапии опухолей агентов, не вызывающих существенных изменений в пространственной организации клеточного ядра. Если говорить об ингибиторах ДНК-топоизомеразы II, то этим требованиям удовлетворяют те из них, которые не вызывают накопления ковалентных комплексов этого фермента с ДНК. Дальнейшее изучение роли ядерного миозина в релокализации генов может показать и другие пути снижения риска возникновения реципрокных транслокаций между генами AML1 и ЕЮ.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на XV и XVI международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2008, 2009), на конференции «Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability» (Санкт Петербург, Россия, 2008) и на 33-ем международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ "33-rd FEBS CONGRESS & 11th IUBMB CONFERENCE "Biochemistry of Cell Regulation" (Афины, Греция, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Из них статей - 2, материалов конференций - 4.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 17 рисунков и 4 таблицы, и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы» (325 цитированных работ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что противораковая химиотерапия с использованием лекарственных препаратов, специфически ингибирующих ДНК-топоизомеразу II, нередко приводит к развитию вторичных лейкозов. Возникновение таких лейкозов связывают с различными хромосомными перестройками, в том числе с транслокацией t(8;21)(q22;q22), которая приводит к возникновению химерного гена AML1-ЕТО. (Andersen et al., 2001; Felix, 1998; Rowley, 1993; Rowley et al, 1997; Zhang et al., 2002; Zhang et al., 2004). Существуют веские основания полагать, что хромосомные перестройки, возникающие в условиях ингибирования активности ДНК-топоизомеразы II, связаны с репарацией возникающих в этих условиях двухцепочечных разрывов ДНК. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК, вносимых ДНК-топоизомеразой II в условиях ингибирования ее активности многими противоопухолевыми агентами, осуществляется преимущественно посредством негомологичного соединения концов ДНК (non-homologous end joining, NHEJ). Этот путь репарации двунитевых разрывов ДНК характеризуется низкой точностью особенно в тех ситуациях, когда в ДНК внесено много разрывов. Некорректное соединение расщепленных цепей ДНК, рассматривается в качестве основной причины транслокаций, происходящих в клетках, обработанных ингибиторами ДНК-топоизомеразы II (Kantidze et а!., 2006). Представляется очевидным, что разорванные цепи ДНК различных хромосом могут быть некорректно соединены только в случае их близкой пространственной локализации. В связи с этим важно напомнить, что в эукариотической клетке различные хромосомы занимают определенные и по большей части не перекрывающиеся позиции внутри ядра, известные как хромосомные территории (Cremer & Cremer, 2001). Более того, было продемонстрировано, что для каждой хромосомы характерно расположение в определенном ядерном слое (на определенном расстоянии от центра ядра). Богатые генами хромосомы располагаются в центральной части ядра, а бедные генами хромосомы - ближе к ядерной периферии (Boyle et al., 2001; Cremer & Cremer, 2001; Croft et al., 1999). Хотя в некоторых случаях партнеры по транслокациям локализуются рядом друг с другом (Parada et al., 2002), это не является общим правилом. Можно ожидать, что транслокации между хромосомами, расположенными в различных ядерных слоях, будут крайне редкими. Между тем, результаты анализа взаимного расположения генов, транслокации между которыми связывают с развитием вторичных лейкозов, свидетельствуют о том, что часто эти гены расположены в разных ядерных слоях, что делает крайне маловероятной возможность их прямого контакта. Это в частности относится к генам AML1 и ЕЮ, транслокации между которыми (t(8;21)(q22;q22)) часто детектируются при вторичных лейкозах,, возникающих в ответ на химиотерапию опухолей ингибиторами ДНК-топоизомеразы II (Zhang et al., 2002).

Хромосома 21, несущая ген AML1, расположена близко к центру ядра, в то время как хромосома 8, несущая ген ЕТО, занимает более периферическое положение (Boyle el а!., 2001). С целью объяснить существующее противоречие, мы проанализировали вопрос о том, изменяется ли предпочтительная локализация генов АМН и ЕТО внутри ядра после обработки клеток ингибиторами ДНК-топоизомсразы II.

1. Анализ взаимного расположения генов AMLl и ЕТО в культуре первичных эмбриональных фибробластов человека

В первую очередь мы проанализировали взаимное расположение генов AMLl и ЕТО в первичной культуре эмбриональных фибробластов человека (HEF 1698). Выбор данной культуры клеток был обусловлен следующими факторами. Во-первых, использование перевиваемых линий опухолевых клеток представлялось не вполне оправданным, так как пространственное положение хромосом и интересующих нас генов в таких клетках может быть изначально нарушено в силу присущей таким клеткам генетической нестабильности, приводящей к накоплению хромосомных перестроек, ансуплоидии и другим аберрациям. Во-вторых, относительно плоские и протяженные ядра фибробластов (соотношение диаметра ядра к его высоте достигает 10:1) являются хорошей двумерной моделью для изучения радиальных позиций различных объектов внутри ядра (Boyle et а!., 2001; Zink et а!., 2004). Кроме того, использование прикрепленной культуры клеток с хорошо развитым цитоскелстом уменьшает техническую сложность экспериментов и способствует сохранению морфологии ядер в процессе гибридизации in situ.

При проведении флюоресцентной гибридизации in situ в качестве зондов для

выявления положения генов AML! и ЕТО использовалась ДНК бакмидных клонов,

соответственно, ВАС RP1-140K16 и ВАС RPII-777J24 (CHORI, США). В препараты ДНК

включали биотин- либо дигоксигснин-11-дУТФ с помощью набора Random-Prime Labeling

Рисунок 1. (А) Принцип измерения расстоянии между гибридизационными сигналами, соответствующими генам AMLl (красные) и ЕТО (зеленые), реализуемый в программе Nucleus Marker v3.I.

(Б) Распределение расстояний между сигналами AMLl и ЕТО (круги), и между двумя случайными точками (треугольники). Значения по оси X соответствуют отношению расстояния между генами AMLI и ЕТО к радиусу либо к диаметру ядра. Значения по оси Y отражают процент клеток, характеризующихся определенными расстояниями между сигналами. График построен по результатам анализа взаимного расположение генов AML! и ЕТО в 260 клетках (1040 событий). Погрешность отражает стандартное квадратичное

отклонение 0 г. Радиус ~ Диаметр

уклонение. Расстояние между сигналами

Kit (Roche, Швейцария). Гибридизацию этих проб с выращенными на предметных стеклах клетками осуществляли в соответствии с ранее опубликованным протоколом (Pctrova et ai, 2005).

Программное обеспечение, использованное для определения позиций гибридизационных сигналов внутри ядра (Nuclcus Marker v3.1, Россия), позволяет установить дистанции между идентифицированными сигналами каждого типа и. таким образом, вычислить расстояния между генами AMLI и ЕТО в ядре (рис. 1А). Для того чтобы сделать сопоставимыми результаты, полученные при анализе различающихся по размерам ядер, экспериментально определенные расстояния выражаются в процентах от теоретически посчитанного «радиуса» ядра (радиуса круга, имеющего ту же площадь, что и ядро в каждом конкретном случае). Результаты обсчета взаимного расположения сигналов AML] и ЕТО в ядрах эмбриональных фибробластов человека (рис. 1Б) демонстрируют, что распределение расстояний между этими сигналами отличается от случайного распределения (в качестве последнего рассматривается распределение расстояний между двумя случайными точками в круге для 1000 событий). Таким образом, в подавляющей части клеток, присутствующих в популяции первичных фибробластов человека, гены AML1 и ЕТО расположены ближе по отношению друг к другу по сравнению с такой теоретической ситуацией, когда данные гены были бы равномерно распределены внутри ядра, и существовала бы равная вероятность встретить каждый из данных генов в любой точке внутриядерного пространства. Однако, по нашему мнению, выявленное в этих экспериментах относительное сближение генов AML1 и ЕТО не может отражать их локализации в одном и том же ядерном слое либо в определенном внутриядерном компартменте. Действительно, среднее расстояние между сигналами

. „ является значительным (-50% от радиуса

Рисунок 2. (А и Ь) Иллюстрация принципа

построения профилей радиального распределения ядра). Наблюдаемая сближенность генов одиночных (красных) и двойных (реплицированных,

зеленых) гибридизационных сигналов внутри ядра. AML1 и ЕТО скорее всего является Строятся два вектора: от центра ядра до сигнала и от центра ядра через сигнал до границы ядра. Отношение длины первого вектора к длине второго принимается как радиальная позиция (или орбита) каждого конкретного сигнала. Зная радиальную позицию сигнала, можно определить, в какой из пяти концентрических зон равной площади локализуется данный сигнал.

На графике (В) показано распределение гибридизационных сигналов, соответствующих генам АМН (треугольники) и ЕТО (круги) между пятью концентрическими зонами равной площади. Графики отражают результат анализа 250 клеток (500 значений в случае каждого гена). Ошибка соответствует стандартному квадратичному отклонению. Отметим, что ген AMLI локализуется ближе к центру ядра по сравнению с геном ЕТО.

Рисунок 3. (А) Результаты проточной цитофлуориметрии (РАСБ) культуры первичных фибробластов человека.

(Б) Различные паттерны репликации, наблюдаемые в культуре фибробластов человека. В культуральную среду добавляли

бромодезоксиуридин (Вг<Ш, 50 мкг/мл, 30 мин), затем клетки инкубировали в течение 1 часа, после чего фиксировали формальдегидом по стандартному протоколу, и проводили иммуноокрашивание с использованием антител против Вгёи, коньюгированных с Р1ТС (Фотографии). Процент клеток, демонстрирующих ранний, средний и поздний паттерны репликации указан над микрофотографиями.

следствием ограничения, наложенного расположением этих генов внутри соответствующих хромосомных территорий, одна из которых, согласно ранее опубликованным результатам (Во1гег ег а/., 2005), располагается в центральной части ядра. Следовало, однако, отдавать себе отчет в том, что радиальные позиции индивидуальных генов могут существенно отличаться от среднестатистических радиальных позиций хромосомных территорий, которые имеют достаточно большие размеры. В этой связи важным было установить радиальные позиции генов АМЫ и ЕТО в клетках, которые мы использовали в качестве экспериментальной модели. Для этого мы проанализировали распределение гибридизационных сигналов, соответствующих генам АМН и ЕТО, по 5 концентрическим зонам равной площади (внутренние границы данных зон имеют радиальные позиции, соответствующие 0%; 45%; 63,2%; 77,5% и 89,4% радиуса ядра).

Результаты, представленные на рисунке 2, показывают, что ген АМН расположен ближе к центру ядра по сравнению с геном ЕТО. В самом деле, 96% сигналов, соответствующих гену АМЫ, и только 52% сигналов, соответствующих гену ЕТО, находятся в центральной части ядра, заключающей в себе 50% площади ядра. В то же время важно отметить, что ген ЕТО характеризуется более широким радиальным распределением. Вследствие этого в ряде случаев ген ЕТО локализуется в том же ядерном слое, что и ген АМЫ. Можно предположить, что достаточно широкое распределение гена ЕТО по ядерным слоям отражает тот факт, что популяция клеток, которая была проанализирована в вышеупомянутых экспериментах, состоит из субпопуляций, характеризующихся различными радиальными позициями гена ЕТО. Например, данные субпопуляции могут составлять клетки, находящиеся на разных стадиях клеточного цикла. Анализ культуры первичных эмбриональных фибробластов человека методом проточной цитофлуориметрии

Фаза цикла 61 Э Э2

Доля клеток 60% 25% 13%

Профиль Э-фазы: Поздняя 12%

Средняя 3%

(FACS) продемонстрировал, что 60% присутствующих в популяции клеток находятся в GO либо G1 фазах клеточного цикла (рис. ЗА). Такая ситуация закономерна для монослойной популяции клеток, характеризующейся контактным торможением. Около 38% клеток содержало удвоенное (13%) либо промежуточное (25%) количество ДНК, то есть находилось в G2 либо в S фазе клеточного цикла. В согласии с данными результатами около 25% клеток включали бромодезоксиуридин (bromodeoxyuridine, BrdU) и демонстрировали ранний (~10%), поздний (-12%) либо промежуточный (~3%) профиль репликационных фокусов (рис. ЗБ).

С тем чтобы установить, различаются ли радиальные позиции генов АМН и ЕТО в делящихся и покоящихся клетках, мы проанализировали распределение реплицированных генов AML1 и ЕТО по 5 концентрическим внутриядерным зонам с равной площадью. Реплицированные гены можно легко дифференцировать по характерным двойным гибридизационным сигналам (см. пример на рис. 2Б) (Handeli et ah, 1989). Результаты анализа показали, что радиальное распределение реплицированного гена ЕТО является достоверно бимодальным (у}, р<0,05), и его меньший пик расположен в том же хромосомном слое, что и пик распределения гена AML1 (рис. 4). Что касается AMLl, то распределение реплицированных копий данного гена (х2, р>0,2) практически не отличается от распределения данного гена в общей популяции клеток.

2. Ингибирование лигирующей активности ДНК-топоизомеразы II вызывает перемещение гена ЕТО в направлении центра ядра

ДНК-топоизомераза II действует как регулятор топологии ДНК. Она может релаксировать позитивные и негативные супервитки в кольцевой ДНК (либо в петлевых доменах ДНК эукариот), а также распутывать либо разделять молекулы ДНК посредством внесения в них кратковременных двухцепочечных разрывов (Wang, 2002). В норме такие разрывы религируются после разрешения топологических проблем. Однако, многие ингибиторы ДНК-топоизомеразы II, такие как доксорубицин (doxorubicin), амсакрин (amsacrine), тенипозид (teniposide) и этопозид (etoposide), известные под общим названием

Рисунок 4. Распределение

гибридизационных сигналов,

соответствующих гену АМН

(треугольники), реплицированному АМН (закрашенные треугольники), ЕТО (круги) и реплицированному ЕТО (закрашенные круги) между 5 концентрическими зонами равной площади. Графики,

демонстрирующие распределение

реплицированных генов АМН и ЕТО отражают результаты анализа 60 и 50 клеток соответственно. Ошибка соответствует стандартному квадратичному отклонению.

Рисунок 5. Распределение генов ЕТО и AML! между 5 концентрическими зонами равной площади в нормальных фибробластах человека, обработанных этопозидом. Верхний график демонстрирует распределение гибридизационных сигналов, соответствующих гену ЕТО, в контрольных клетках (круги) и в клетках, обработанных этопозидом (треугольники). Распределение реплицированного гена ЕТО в обработанных этопозидом клетках показано закрашенными кругами. Внутриядерные позиции гена ЕТО после обработки клеток этопозидом были определены в 180 клетках, включая 87 клеток с реплицированным геном ЕТО. Нижний график демонстрирует распределение гибридизационных сигналов, соответствующих гену AML! в контрольных клетках (треугольники) и в клетках, обработанных этопозидом (круги). Распределение реплицированного гена AML! в обработанных этопозидом клетках показано закрашенными треугольниками. Внутриядерные позиции гена AML! после обработки клеток этопозидом были определены в 180 клетках, включая 60 клеток с реплицированным геном АМН. Ошибка соответствует стандартному квадратичному отклонению.

«топоизомеразные яды», блокируют

катализируемую ДНК-топоизомеразой II

реакцию на стадии промежуточного комплекса

и, таким образом, обуславливают внесение

потенциальных двухцепочечных разрывов в

ДНК. Другие ингибиторы ДНК-топоизомеразы

И, в частности мербарон (merbarone),

действуют по иному принципу и не приводят к

накоплению арестованных промежуточных

комплексов фермента с разорванной

молекулой ДНК (D'Arpa & Liu, 1989; Liu,

1989; Chen & Liu, 1994).

Для того чтобы выяснить, стимулирует

ли обработка фибробластов различными

ингибиторами ДНК-топоизомеразы II

внутриядерную релокализацию генов AML! и

ЕТО, мы определили радиальные позиции этих генов в клетках, обработанных (в течение 1,5

часов) этопозидом либо мербароном. Наиболее интересные результаты были получены после

обработки клеток этопозидом. Даже в случае анализа всей клеточной популяции наблюдался

отчетливый сдвиг гена ЕТО в направлении центра ядра, а радиальное распределение данного

гена являлось бимодальным (х2, р<0,05) (верхний график на рис. 5). Этот сдвиг становился

намного более заметным, когда в рассмотрение брались только те клетки, которые несут

реплицированный ген ЕТО. В этих клетках ген ЕТО был почти равномерно распределен

между двумя ядерными слоями: одним, содержащим ген AMLI, и другим, - расположенным

ближе к периферии ядра (/Д р<0,05). Радиальная позиция гена AML1 не изменялась после

обработки клеток этопозидом (нижний график на рис. 5).

Обработка клеток мербароном индуцировала лишь небольшой позиционный сдвиг гена ЕТО по направлению к центру ядра. При этом распределение не становилось отчетливо

Рисунок 6. Распределение реплицированного гена ЕТО между 5 концентрическими зонами равной площади в нормальных фибробластах человека, обработанных камптотецином (закрашенные квадраты) либо мербароном (треугольники). Распределение реплицированного гена ЕТО между теми же внутриядерными зонами в контрольных клетках показано кругами. Ошибка соответствует стандартному квадратичному отклонению. Внутриядерные позиции гена ЕТО после обработки клеток камптотецином либо мербароном были определены в 110 и 80 клетках соответственно, бимодальным (рис. 6) (х2, р>0,05). В то же время обработка клеток камптотецином

(camptotecin), ингибитором ДНК-топоизомеразы I, который стимулирует арест

промежуточного комплекса фермента с ДНК, имела эффект сравнимый с таковым для

этопозида (рис. 6) (х2, р<0,05). Таким образом, вероятно, что именно присутствие на ДНК

арестованных промежуточных комплексов (независимо от природы фермента и характера

вносимого в ДНК разрыва) стимулирует релокализацию гена ЕТО.

Можно было предположить, что описанные выше изменения ядерной локализации гена ЕТО свидетельствуют о глобальной конденсации хроматина и перемещении его к центру ядра. Это может произойти, например, при индукции апоптоза. Для проверки этого предположения мы, прежде всего, определили долю мертвых клеток в нормальной популяции и после обработки клеток этопозидом (окраска трипановым синим). Было показано, что, спустя 3 часа после обработки клеток этопозидом (то есть в тот момент, когда клетки фиксировались для последующего анализа во всех наших экспериментах), эта доля остается неизменной. Данный вывод был также подтвержден результатами проточной цитофлуориметрии (данные не представлены). Кроме того, мы провели иммуноокрашивание клеток антителами против ламина А совместно с окрашиванием ДНК DAPI для проверки предположения о том, что обработка клеток этопозидом может каким-то иным образом индуцировать общую конденсацию хроматина в центральной части ядра (и, соответственно, появление обедненного хроматином пространства в периферической части ядра). По результатам проверки в клетках, обработанных этопозидом, не наблюдалось никаких признаков дополнительной конденсации хроматина (данные не представлены).

В следующем эксперименте мы попытались раскрыть механизм, ответственный за релокализацию гена ЕТО. Для этого мы обработали клетки этопозидом в присутствии 2,3-бутандионмонооксима (БДМ), предполагаемого ингибитора ядерного миозина (Aten el al, 2004). Было продемонстрировано, что релокализация гена ЕТО в присутствии БДМ

-Репл. ЕТО + камптотецин^ • Репл. ЕТО

- Репл. ЕТО + мербарон "Центр 1 2 3 4 Край" Зоны равной площади

Рисунок 7. Частичное подавление релокализации гена ЕТО 2,3-бутандионмонооксимом (БДМ). Нормальные фнбробласты человека инкубировали в течение 1,5 часов в присутствии 0,17 мМ этопозида либо в присутствии 0,17 мМ этопозида и 20 мМ БДМ, после чего среда была заменена на чистую культуральную среду, и клетки инкубировали еще 3 часа, после чего фиксировали. Распределение реплицнрованного гена ЕТО в клетках, обработанных этопозидом (контрольный эксперимент), и этопозидом в присутствии БДМ показано кругами и треугольниками, соответственно. Ошибка соответствует стандартному квадратичному отклонению.

Внутриядерные позиции гена ЕТО после обработки клеток этопозидом в присутствии БДМ были определены в 80 клетках.

в значительной степени, хотя и не полностью, подавляется (рис. 7). Такой результат позволяет предположить, что миозиновыс моторы могут принимать активное участие в процессе релокализации гена ЕТО в условиях ингибирования ДНК-топоизомсразы П.

3. Ингибированпе ДНК-топоизомеразы II вызывает релокалнзацию гена ЕТО в область

ядрышка

В первой части работы мы продемонстрировали, что обработка клеток этопозидом, ингибитором ДНК-топоизомсразы II, вызывает изменение ядерной позиции гена ЕТО таким образом, что в значительной части присутствующих в популяции клеток гены AMLl и ЕТО оказываются локализованными в одном ядерном слое. Ингибиторный анализ показал, что релокализация гена ЕТО, скорее всего, инициируется после формирования ковалентных комплексов ДНК-топоизомсразы И с ДНК. Вопрос о том, каково может быть функциональное значение релокализации гена ЕТО, остался открытым. Логично предположить, что для снятия арестованного промежуточного комплекса ДНК-топоизомеразы II и запуска процесса репарации двухцепочечных разрывов ДНК, необходимо привлечение специальных ферментативных комплексов. На сегодняшний день известно, что большинство сложных ферментативных белковых комплексов (например, фабрик репликации или сплайсосом) сосредоточено в специализированных ядерных компартментах (Spcctor 2003; Smithct el al., 1999; Carteret el al., 1993; Osborne el al., 2004). В связи с этим можно предположить, что наблюдаемая нами релокализация гена ЕТО, представляет собой ни что иное, как направленное перемещение данного гена, а точнее, перемещение арестованного промежуточного комплекса ДНК-топоизомсразы II в одну из тех областей ядра, где локализованы необходимые для репарации ферменты и вспомогательные белковые комплексы.

Е X? / ■ й /'

if. /») i " У

ч ' г.

\ / *; _ У

/ л

10 мкм

Рисунок 8. А-Д: Экспериментальный подход, использованный для определения положения ядрышек и гибридизационных сигналов, соответствующих гену ЕТО. внутри ядра первичных фибробластов человека. (А) ядра, окрашенные DAP1; (Б) ядрышки, окрашенные с использованием антител против нуклеофосмина; (В) гибридизационные сигналы; (Р) совмещение А и Б (стрелками указаны ядрышки); (Д) совмещение А, Б и В (стрелками указаны гибридизационные сигналы). Е: Ядра первичных фибробластов. в которых выявлено положение ядрышек и гибридизационных сигналов, соответствующих гену ЕТО: граница ядра обозначена белой линией, ядрышки, визуализированные с использованием антител против нуклеофосмина. окрашены в белый цвет, гибридизационные сигналы показаны красными точками. Фотографии получены с помощью флюоресцентного микроскопа DMR/HC5 (Leica), оснащенного объективом. НСХ PZ Fluotar 100х/1.3 и CCD камерой DC 350 F (Leica).

Во время осуществления первой части работы мы обратили внимание на то, что в клетках, обработанных этопозидом. ген ЕТО часто оказывался локализован рядом с ядрышком. Однако идентификация ядрышек на фотографиях окрашенных DAPI ядер не всегда является однозначной. Для получения дополнительной информации о взаимном расположении ядрышек и гена ЕТО в клетках первичной культуры эмбриональных

Таблица 1. Обработка первичных фибробластов человека этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком на 8 %.

Контроль Этопозид

Количество клеток 214 205

Количество касаний 128 157

Процент касаний 30% 38 %

фибробластов человека мы провели эксперимент, в которых наряду с визуализацией гена ЕТО посредством гибридизации in situ провели и иммуноокрашиванис ядрышек. Как и в предыдущих экспериментах, мы сравнивали две популяции клеток: контрольную и обработанную этопозндом. В каждой из популяций мы оценивали частоту, с которой гибридизационный сигнал, соответствующий гену ЕТО, находится в непосредственной близости от ядрышка или колокализустся с ним (так называемый "процент касаний"). Результаты данного эксперимента проиллюстрированы на рисунке 8 и суммированы в таблице 1.

Как можно видеть из таблицы 1, обработка первичных фибробластов человека этопозидом приводит к незначительному увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком либо нахождения его в непосредственной близости от ядрышка (на его границе).

Здесь важно отмстить, что высокий процент колокализации, наблюдаемый в контроле, может отчасти являться следствием простого наложения сигналов в двумерных препаратах, а не свидетельствовать о наличии контакта гена ЕТО с ядрышком (см. пример на рис. 9 Б2 фронтальный вид и вид слева). Для исключения такой возможности, мы поставили перед собой задачу визуализировать ген ЕТО и проследить его судьбу в условиях ингибирования ДНК-топоизомсразы II в культуре клеток Jurkat. Линия Jurkat - это иммортализованные Т-лимфоциты, традиционно используемые в качестве модели для изучения Т-клсточных лейкемий (Schneider et а!.,\9П). Выбор данной культуры клеток был обусловлен следующими факторами. Во-первых, линия Jurkat - это суспензионная культура, клетки в которой имеют правильную округлую форму и практически не различаются по размеру, при этом большую часть объема клетки занимает ядро, которое также имеет правильную шаровидную форму. Благодаря этому клетки Jurkat идеально подходят для приготовления объемных препаратов при проведении трехмерной флюоресцентной гибридизации in situ. А исследование объемных препаратов, в которых сохраняется исходная морфология ядер, позволяет избежать ошибок в определении взаимного расположения объектов в трехмерном пространстве, неизбежных в случае анализа двумерных препаратов. Во-вторых, иммортализованные Т-лимфоциты - это активно делящиеся клетки, в популяции

Фронтальный вид Вид слева Фронтальный вид Вид слева

слева Фронтальный вид

Вид слева

слева

Фронтальный вид

Рисунок 9. Три различные ситуации, наблюдаемые при определении положения гибридизационных сигналов, соответствующих гену ЕТО, и ядрышек внутри ядра клеток Jurkat. (А) Сигналы не касаются ядрышка. (Б) Один из сигналов касается ядрышка. (В) Оба сигнала касаются ядрышка. AI, Б1 и В1 - трехцветное окрашивание: ДНК. окрашенная Sytox® Green (зеленый), ядрышки, окрашенные с использованием антител против нуклеофосмина (синий) и гибридизационные сигналы, соответствующие гену ЕТО (красный), А2, Б2 и В2 - двухцветное окрашивание: ядрышки, окрашенные с использованием антител против нуклеофосмина (синий) и гибридизационные сигналы (красный). На рисунке (Г) представлена размерная шкала. Фотографии получены с помощью лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510, трехмерное реконструирование изображения производилось в программе ZEN 2008 LE (Carl Zeiss AG, Германия).

Таблица 2. Обработка клеток Лигка! этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком вдвое.

Контроль Этопозид

Количество клеток 156 208

Количество касаний 55 138

Процент касаний 17% 33 %

которых отсутствует значительная фракция покоящихся клеток. Следовательно, мы могли ожидать, что реакция на ингибирование ДНК-топоизомеразы II будет одинаковой в случае всех клеток в популяции.

Мы провели эксперимент, заключающийся в одновременном иммуноокрашивании ядрышка и проведении флюоресцентной гибридизации in situ с коммерчески доступной двуцветной флюоресцентно меченой пробой к локусам, содержащим гены AML1 и ЕТО (Vysis® LSI® AML1/ETO Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe, Abbott Laboratories, США). При этом препараты клеток Jurkat были приготовлены с использованием специальной методики, позволяющей изучать распределение сигналов в объемных образцах. Программное обеспечение, использованное для определения позиций гибридизационных сигналов и ядрышек внутри ядра (ZEN 2008 LE, Carl Zeiss AG, Германия), позволяет производить трехмерную реконструкцию изображения на основе набора параллельных оптических срезов препарата. Это дало нам возможность определить истинное взаимное расположение в пространстве ядра изучаемых нами объектов (ядрышек и гена ЕТО).

Как и в предыдущих экспериментах, мы сравнивали две популяции клеток: контрольную и обработанную этопозидом. В каждой из популяций мы оценивали частоту, с которой гибридизационный сигнал, соответствующий гену ЕТО, находится в непосредственной близости от ядрышка или колокализуется с ним (процент касаний). Результаты данного эксперимента проиллюстрированы на рисунке 9 и суммированы в таблице 2. Легко видеть, что после обработки клеток этопозидом частота касаний гена ЕТО и ядрышка увеличивается в 2 раза.

4. Ингибирование ДНК-топоизомеразы II приводит к предпочтительному связыванию

нуклеолина с Ьсг2 гена ЕТО

Как следует из результатов, представленных в таблице 2, обработка клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком либо его нахождения в непосредственной близости от ядрышка (на его границе), также как это было и в случае фибробластов. Нам показалось маловероятным, что это простое совпадение.

ЕТОэкзон 1а

BCR2

Возможно, биологический смысл наблюдаемого нами перемещения гена ЕТО заключается именно в том, что оно обеспечивает сближение данного гена с ядрышком, которое в свою очередь является необходимым условием

Рисунок 10. Схема, иллюстрирующая пространственную организацию фрагмента гена ЕТО. Черные прямоугольники - Ьсг2 и ЬсгЗ, серый квадрат - экзон, белые прямоугольники - участки, к которым подбирались праймеры и TaqMan-пробы, Е исследуемый участок гена ЕТО, ЕС - контрольный участок.

для привлечения специфических белков ядрышка в состав белковых комплексов, собирающихся в местах двухцепочечных разрывов ДНК и участвующих в репарационных и рекомбинационных процессах.

Для проверки данной гипотезы мы провели серию экспериментов по иммунопреципитации хроматина. Как и в предыдущем эксперименте, мы параллельно анализировали контрольные клетки Jurkat и клетки, обработанные этопозидом (0,17 мМ) в течение 1,5 часов. Иммунопреципитацию хроматина осуществляли по стандартному протоколу (Abeam) с использованием антител против ДНК-топоизомеразы IIa (Abeam), ДНК-топоизомеразы Ilß (Abeam), и против нуклеолина (Sigma). Количество ДНК, связанной с ДНК-топоизомеразой IIa, ДНК-топоизомеразой Ilß и с нуклеолином, определяли методом ПЦР в реальном времени с TaqMan пробами.

Поскольку анализ генов, участвующих в транслокациях, показал, что в большинстве известных генов-партнеров по транслокациям точки разрыва ДНК кластеризуются внутри относительно узких областей, названных кластерами точек разрыва (breakpoint cluster regions, ber) (Felix, 1998; Zhang & Rowley, 2006; Zhang et al., 2002), мы исследовали один из таких участков гена ЕТО. Праймеры и TaqMan пробы подбирали с помощью программы Primer Premier 5 (PREMIER Biosoft International, США) к району bcr2 гена ЕТО, так как именно в нем ранее были картированы сильные сайты связывания ДНК-топоизомеразы II (Zhang et al., 2002), а также к близлежащему «контрольному» участку (рис. 10).

Последовательности использованных праймеров и TaqMan проб приведены в таблице 3.

Праймеры

Еп T CT GATA GTOCCAATGCCTTTА

Ео CTTGCTAGTGCCTATGTAGGAATCT

ЕСП G CA TCCTTG А АТСС AGCG T А

ЕС0 CCTCCACATTICTCCTCCAA

TaqMan-пробы

(FAM)TTCATTTCCACCAACT(BTQ-DTATTTTCAACOTCT

(FAM)TGGAATGAGT(BHQ-l) CGCAGCAGAGACGA

Таблица 3. Праймеры и TaqMan-пpoбы, использованные для проведения ПЦР в реальном времени. Представлены 5 '-3 '-последовательности. Буквами «п» и «о» в индексе обозначены прямые и обратные праймеры (в соответствии с направлением транскрипции гена ЕТО). РАМ - флуоресцентный краситель на 5'-конце проб; ВН(2-1 - гаситель Флюоресценции внутш пробы на Т.

Рисунок 11. Содержание ДНК-топоизомеразы Ila (а), ДНК-топоизомеразы lip (б) и нуклеолина (в) в исследуемом участке Ьсг2 гена ЕТО до (белые столбцы - контроль) и после обработки клеток Jurkat этопозидом (заштрихованные столбцы) по результатам ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробэми. Погрешность соответствует стандартному квадратичному отклонению.

Сравнение представленности тест-фрагментов из контрольного участка и Ьсг2 гена ЕТО в препаратах хроматина, осажденных с помощью различных антител (Рис. 11), позволило заключить, что после обработки клеток этопозидом существенно возрастает связывание нуклеолина с Ьсг2 гена ЕТО. Что касается ДНК-топоизомеразы Па и ДНК-топоизомеразы Ир, то опытный и контрольный образцы были связаны с этими ферментами приблизительно в равной мере.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Обработка клеток ингибиторами ДНК-топоизомеразы II часто приводит к возникновению различных хромосомных аберраций, некоторые из которых ассоциированы с развитием лейкемий. Есть веские основания полагать, что хромосомные транслокации генерируются в результате некорректной репарации двухцепочечных разрывов ДНК (Agarwal et al., 2006; Elliott & Jasin, 2002; Kantidze et al., 2006). Для того чтобы разорванные концы различных хромосом были некорректно соединены, они, в первую очередь, должны физически встретиться. Однако известно, что разные хромосомы во внутриядерном пространстве расположены неслучайно (Boyle et al., 2001; Cremer & Cremer, 2001; Croft et al., 1999). Специфическое радиальное распределение хромосомных территорий должно накладывать определенные ограничения на мобильность большинства генов и, следовательно, на возможность транслокаций между ними (Taslerova et al., 2003). Существует предположение, что предпочтительные сайты транслокаций предопределяются именно пространственными позициями хромосом и субхромосомных доменов внутри ядра (Nikiforova et al., 2000; Savage, 2000). В самом деле, в некоторых случаях партнеры по транслокациям располагаются в непосредственной пространственной близости (Lukasova et al., 1997; Roccato et al., 2005; Roix et al., 2003). Однако это не является общим правилом. Во многих других случаях никакой корреляции между пространственной близостью партнеров по транслокациям и частотой возникновения хромосомных перестроек не наблюдается (Gue et al., 2006). Для объяснения данного различия была предложена так называемая "breakage

first" (разрыв первичен) модель. В соответствии с данной моделью, разорванные концы хромосом могут мигрировать на большие расстояния внутри ядра. Такая миграция на самом деле наблюдалась в ядрах, подвергнутых бомбардировке а-частицами (Aten et al., 2004). Авторами данной работы были также получены косвенные свидетельства того, что перемещение разорванных концов хромосом осуществляется активно с участием актин-миозиновых моторов (Aten et al2004). Однако в других исследованиях были получены противоречащие этому результаты. Было показано, что разорванные концы хромосом сохраняют свою позиционную стабильность внутри ядра (Soutoglou et al., 2007).

Гены AMLI и ЕТО, исследованные в настоящей работе, расположены в различных ядерных слоях. Тем не менее, транслокации между данными генами являются типичными для вторичных лейкозов, возникающих вследствие противораковой химиотерапии с применением препаратов, специфично ингибирующих ДНК-топоизомеразу II (а именно «топоизомеразных ядов»). Мы обнаружили, что расстояния между генами АМН и ЕТО в ядрах нормальных фибробластов человека меньше, чем можно было бы ожидать в том случае, если бы оба данных гена характеризовались случайным распределением во внутриядерном пространстве. Это может отражать тот факт, что локализация гена AML1 ограничена центральной областью ядра. Этой причины достаточно для того, чтобы расстояния между генами AMLI и ЕТО не могли в значительной степени превышать длину радиуса ядра. Также мы продемонстрировали, что в условиях ингибирования лигирующей активности ДНК-топоизомеразы II, то есть в условиях, стимулирующих активацию репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством негомологичного зашивания концов (NHEJ), (Kantidze et al., 2006), значительная часть гена ЕТО релокализуется в центральную часть ядра, где расположен ген AMLI. Данный результат хорошо согласуется с первым предположением "breakage-first" модели и предоставляет разумное объяснение высокой частоты рекомбинаций между генами AML1 и ЕТО. Интересно, что релокализация гена ЕТО в направлении центра ядра происходит предпочтительно в делящихся клетках. После обработки делящихся клеток этопозидом, около 50% генов ЕТО было обнаружено в том же ядерном слое, что и ген AML1. Это может быть связано с тем фактом, что делящиеся клетки, в отличие от покоящихся, более чувствительны к последствиям ингибирования ДНК-топоизомеразы II. Механизмы, ответственные за релокализацию гена ЕТО остаются неизвестными. В связи с этим необходимо подчеркнуть, что распределение гена ЕТО по ядерным слоям является широким и практически равномерным, в силу чего в некоторой части клеток этот ген находится в одном ядерном слое с геном AML1 вне зависимости от обработки клеток ингибиторами ДНК-топоизомеразы И. Пространственное распределение хромосомных территорий внутри ядра является, по всей видимости, скорее динамичным,

нежели статичным (Spcctor, 2003). Поэтому появление бимодального распределения гена ЕТО в реплицирующихся фибробластах, обработанных ингибиторами ДНК-топоизомсразы II, вполне может объясняться простой фиксацией арестованных промежуточных комплексов ДНК-топоизомсразы II и/или арестованных рспликационных вилок в центральной части ядра. Такая фиксация может являться следствием неслучайного распределения внутри объема ядра тех ферментов, которые вовлечены в процсссинг промежуточных комплексов и в NHEJ. Другая возможность состоит в том, что арестованные промежуточные комплексы ДНК-топоизомсразы II могут активно перемещаться в направлении центра ядра. Подавление данного перемещения в присутствии БДМ, ингибитора ядерного миозина (Aten ct al., 2004), эту гипотезу поддерживает. К сожалению нам не удалось проверить, нарушается ли перемещение гена ЕТО вследствие деполимеризации актина, поскольку обработка клеток цитохапазином Б (cytochalasin В) либо латрункулином Д (latrunkulin D) приводила к радикальному изменению формы клеток и ядер.

В другой серии экспериментов мы показали, что обработка фибробластов и клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком. Здесь важно отмстить, что высокий процент колокализации, наблюдаемый в случае фибробластов, может отчасти являться следствием простого наложения сигналов в двумерных препаратах, а не свидетельствовать о наличии прямого контакта гена ЕТО с ядрышком. Для исключения такой возможности мы и исследовали объемные препараты клеток Jurkat, и это позволило нам избежать ошибок в определении взаимного расположения объектов в трехмерном пространстве. Тот факт, что обработка фибробластов и клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком, позволил нам предположить, что биологический смысл наблюдаемого нами перемещения гена ЕТО заключается именно в том, что оно обеспечивает сближение данного гена с ядрышком. Это пространственное сближение способствует привлечению белков ядрышка в места двухцепочечных разрывов ДНК, где они могут принимать участие в процессах репарации и рекомбинации. Это предположение подтверждается результатами, показавшими, что в условиях ингибирования активности ДНК-топоизомсразы II существенно возрастает уровень связывания нуклеолина с Ьсг2 гена ЕТО. Нуклеолин обладает широким спектром активностей. Показано, в частности, его участие в процессе гомологичной рекомбинации (Thyagarajan el al., 1998). Вопрос о возможном участии этого белка в нсгомологичном соединении концов ДНК должны прояснить дальнейшие исследования.

Выводы

1. Установлено, что в подавляющей части клеток, присутствующих в популяции первичных эмбриональных фибробластов человека (HEF 1698), гены АМН и ЕТО сближены, но находятся в разных ядерных слоях.

2. Продемонстрировано, что обработка клеток ингибиторами ДНК-топоизомсразы II приводит к перемещению внутри ядра гена ЕТО, в результате которого этот ген локализуется в одном ядерном слое с геном АМН, являющимся партнером гена ЕТО по хромосомным транслокациям.

3. Показано, что обработка первичных эмбриональных фибробластов человека (HEF 1698) и клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком.

4. Продемонстрировано, что ингибированис ДНК-топоизомсразы II этопозидом в клетках Jurkat приводит к предпочтительному связыванию нуклеолина с Ьсг2 гена ЕТО.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Rubtsov М.А.. Terekhov S.M., Razin S.V., Iarovaia O.V. (2008). Repositioning of ETO gene in cells treated with VP-16, an inhibitor of DNA-topoisomcrasc II. Journal of Cellular Biochemistry. 104: 850-857.

2. Рубцов M.A.. Разин С.В., Яровая О.В. (2008). Ингибированис ДНК-топоизомсразы II приводит к предпочтительному связыванию ДНК-топоизомеразы Па, ДНК-топоизомсразы lip и нуклеолина с BCR2 гена ЕТО. Доклады Академии Наук. Т 423, № 3: 405-407.

Тезисы конференций:

3. Рубцов М.А. Изменение взаимного расположения хромосомных территорий под действием этопозида. XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, Россия, 8-11 апреля, 2008, сборник тезисов, стр. 153.

4. Rubtsov М.А.. Terekhov S.M., Razin S.V., Iarovaia O.V. Repositioning of ETO gene in cells treated with VP-16, an inhibitor of DNA-topoisomcrasc II. Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigcnetic Regulation of Genome Stability, St. Petersburg, Russia, June 2426, 2008, abstract book, p. 80.

5. Rubtsov M.A.. Razin S.V., Iarovaia O.V. Repositioning of ETO gene in cells treated with VP-16, an inhibitor of DNA-topoisomerase II. 33-rd FEBS CONGRESS & 11th IUBMB CONFERENCE "Biochemistry of Cell Regulation", Athens, Greece, June 28 - July 3, 2008, abstract book, p. 100.

6. Рубцов M.A. Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, Россия, 13-18 апреля, 2009;

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рубцов, Михаил Александрович

список сокращений. введение. i. обзор литературы.

1.1. Хромосомные транслокации, ассоциированные с онкологическими заболеваниями.

1.1.1. Незаконная рекомбинация.

1.1.2. История изучения механизмов незаконной рекомбинации.

1.1.3. Хромосомные транслокации и ассоциированные с ними заболевания.

1.1.4. Семейства химерных белков.

1.1.5. Гены-партнеры по хромосомным транслокациям и кластеризация точек разрыва ДНК.

1.1.6. Механизм возникновения хромосомных транслокаций.

1.1.7. Структура кластеров точек разрыва ДНК как предпосылка для образования хромосомных транслокаций.

1.2. двухцепочечные разрывы ДНК и их репарация.

1.2.1. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК.

1.2.1. ДНК-топоизомераза II и ее функции в клетке.

1.2.2. Ингибирование ДНК-топоизомеразы II как причина образования двухцепочечных разрывов ДНК.

1.2.3. Ингибирование ДНК-топоизомеразы II как предпосылка для возникновения хромосомных транслокаций.

1.2.4. Гипотезы возникновения хромосомных транслокаций.

1.3. позиционирование хромосом в ядре и вероятность возникновения хромосомных транслокаций.

1.3.1. Хромосомные территории.

1.3.2. Пространственная близость хромосомных территорий способствует образованию транслокаций.

1.3.3. Перемешивание хромосомных территорий.

1.3.4. Современная модель организации хромосомных территорий.

1.3.5. Релокализация геномных локусов внутри ядра. Роль ядерных моторных белков в этих процессах. постановка задачи и методические подходы. ii. материалы и методы.

II. 1. Материалы.

II. 1.1. Клеточные линии.

II. 1.2. Антитела.

II. 1.3. Химические реактивы.

II. 1.4. Программное обеспечение.

II.2. Методы.

11.2.1. Культивирование клеточных линий.

11.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле.

11.2.3. Определение количества мертвых клеток.

11.2.4. Иммуноокрашивание.

11.2.5. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH).

11.2.5.1. Приготовление двумерных препаратов фиксированных клеток.

11.2.5.2. Выделение бакмидной ДНК из клеток E.coli.

11.2.5.3. Синтез пробы.

11.2.5.4. Гибридизация.

11.2.5.5. Приготовление трехмерных препаратов клеток Jurkat.

11.2.5.6. Гибридизация с пробой Vysis.

11.2.6. Компьютерная обработка изображений.

11.2.7. Статистический анализ данных.

11.2.8. Иммунопреципитация хроматина.

11.2.8.1. Растворы.

11.2.8.2. Методика.

11.2.8.3. ПЦР в реальном времени с ТадМап-пробами. iii. результаты исследований.

III. 1. Анализ взаимного расположения генов АМН и ЕТО в культуре первичных эмбриональных фибробластов человека.

111.2. ингибирование лигирующей активности ДНК-топоизомеразы И вызывает перемещение гена ЕТО в направлении центра ядра.

111.3. ингибирование ДНК-топоизомеразы ii вызывает релокализацию гена ЕТО в область ядрышка.

111.4. ингибирование днк-топоизомеразы ii приводит к предпочтительному связыванию нуклеолина с bcr2 гена ЕТО. обсуждение результатов. выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II"

Лейкемии составляют 3% от общего числа всех онкологических заболеваний в мире. Четырьмя основными типами лейкемий являются острая лимфоцитарная лейкемия (ALL), хроническая лимфоцитарная лейкемия (CLL), острая мпелоидная ле11кемия (AML) п хроническая миелоидная лейкемия (CML). Развитие острой мпелоидной лейкемии обычно связывают с хролюсомнымн перестройками, приводящими к возникновению химерных генов. Транслокация t(8;21)(q22;q22), объединяющая гены АМЫ и ЕТО, известна как одна из наиболее частых хромосомных транслокаций, наблюдаемых при острой мпелоидной лейкемии. Ежегодно она диагносцируется в 40% случаев AML типа М2 (острая миелобластная лейкемия), а также сопровождает до 40% случаев детской AML, и вероятность ее возникновения практически не зависит от пола ребенка (Huret, 1997). Но особенно часто эта транслокация наблюдается при так называелнлх «обусловленных лечением» (treatment related) или вторичных лейкозах (t-AML).Исследования последних лет свидетельствуют о том, что во многих случаях к развитию вторичных лейкозов приводит противораковая химиотерапия «первичных» онкологических заболеваний, проводящаяся с использованием препаратов, специфически ингибирующих фермент ДНК-топоизомеразу П. ДНК-топоизомераза II является жизненно необходимым ферментом, так как катализирует топологические изменения в ДНК в ходе множества клеточных процессов, таких как сегрегация дочерних хромосом после завершения процесса репликации ДНК, транскрипция, рекомбинация и реорганизация хроматина. Именно поэтому при терапии онкологических заболеваний применяются препараты, ингибирующие ее активность и вызывающие гибель активно делящихся клеток. Вследствие сказанного представляется важным изучение механизмов возникновения хромосомных перестроек, возникающих вследствие ингибирования ДНК-топоизомеразы П. Знание этих механизмов должно не только внести существенный вклад в представления об организации и ф}Ч1кционпровании клеточного ядра, но и показать исследователям новые пути решения проблемы вторичных лейкозов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Рубцов, Михаил Александрович

1. Установлено, что в подавляющей части клеток, присутствующих в популяции первичных эмбриональных фибробластов человека (HEF 1698), гены AML1 и ЕТО сближены, но находятся в разных ядерных слоях.2. Продемонстрировано, что обработка клеток ингибиторами ДНК-топоизомеразы II приводит к перемещению внутри ядра гена ЕТО, в результате чего этот ген оказывается в одном ядерном слое с геном AML1, являющимся партнером гена ЕТО по хромосомным перестройкам.3. Показано, что обработка первичных эмбриональных фибробластов человека (HEF 1698) и клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты ко локализации гена ЕТО с ядрышком.4. Продемонстрировано, что ингибирование ДНК-топоизомеразы II этопозидом в клетках Jurkat приводит к предпочтительному связыванию нуклеолина с Ьсг2 гена

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рубцов, Михаил Александрович, Москва

1. Abney Ж, Cutler В, Fillbach ML, Axelrod D, Scalettar В A (1997) Chromatin dynamics in interphase nuclei and its implications for nuclear structure. J. Cell. Biol. 137: 1459-1468.

2. Abranches R, Beven AF, Aragon-Alcaide L, Shaw PJ (1998) Transcription sites are not correlated with chromosome territories in wheat nuclei. J. Cell. Biol. 143: 5-12.

3. Agai^val S. Tafel AA, Kanaar R (2006) DNA double-strand break repair and chromosome translocations. DNA Repair (Amst). 5: 1075-1081.

4. Ahnesorg P, Smith P, Jackson SP (2006) XLF interacts with the XRCC4-DNA ligase FV complex to promote DNA nonliomologous end-joining. Cell. 124(2): 301-13.

5. Andersen MK, Johansson B. Larsen SO, Pedersen-Bjergaard J (1998) Chromosomal abnormalities in secondary MDS and AML. Relationship to drugs and radiation with specific emphasis on the balanced rearrangements. Haematologica. 83(6): 483-8.

6. Andoh T & Ishida R (1998) Catalytic inhibitors of DNA topoisomerase 11, Biochim. Biophys. Acta. 1400: 155-194.

7. Apian PD (2006) Chromosomal translocations involving the MLL gene: molecular mechanisms. DNA Repair (Amst). 5(9-10): 1265-72.

8. Asami Y, Jia DW, Tatebayashi K, Yamagata K. Tanokura M, Ikeda H (2002) Effect of the DNA topoisomerase II inliibitor VP-16 on illegitimate recombination in yeast chromosomes. Gene. 291: 251-257.

9. Aten J A, Stap J, Krawczyk PM, van Oven CH, Hoebe RA, Essers J, Kanaar R (2004) Dynamics of DNA double-strand breaks revealed by clustering of damaged chromosome domains. Science. 303: 92-95.

10. Austin CA, Marsh KL (1998) Eukaryotic DNA topoisomerase II. Bioessoys 20: 215-226.

11. Ayton PM & Cleary ML (2001) Molecular mechanisms of leukemogenesis mediated by MLL fusion proteins. Oncogene. 20: 5695-5707.

12. Azarova AM, Lyu YL, Lin CP, Tsai YC, Lau JY, Wang JC & Liu LF (2007) Roles of DNA topoisomerase II isozymes in chemotherapy and secondary malignancies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104: 11014-11019.

13. Bauman ME, Holden JA, Brown KA, Harker WG, Perkins SL (1997) Differential immunohistochemical staining for DNA topoisomerase II _ and _ in human tissues and for DNA topoisomerase Iip in non-Hodgkin's lymphomas. Mod. Pathol. 10(3): 168-175.

14. Baumann P & West SC (1998) DNA end joining catalyzed by human cell-free extracts. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 95(24): 14066-14070.

15. Bae YS. Kawasaki I, Ikeda H, Liu LF (1988) Illegitimate recombination mediated by calf thymus DNA topoisomerase II in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85(7): 2076-80.

16. Baguley ВС & Ferguson LR (1998) Mutagenic properties of topoisomerase-targeted drugs. Biochim. Biophys. Acta. 1400(1-3): 213-222.

17. Bakshi RP. Galande S, Muniyappa К (2001) Functional and regulatory characteristics of eukaryotic type II DNA topoisomerase. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 36(1): 1-37.

18. Baldwin EL & Osheroff N (2005) Etoposide, topoisomerase II and cancer. Ciirr. Med. Chem. Anticancer Agents. 5(4): 363-372.

19. Bantignies F, Grimaud C, Lavrov S, Gabut M, Cavalli G (2003) Inheritance of Polycomb- dependent chromosomal interactions in Drosophila. Genes Dev. 17: 2406-2420.

20. Bartlett J, Blagojevic J, Carter D, Eskiw C, Fromaget M, Job C, Shamsher M, Trindade IF, Xu M, & Cook PR (2006) Specialized transcription factories. Biochem. Soc. Symp. 2006: 67-75.

21. Bassing CH, Swat W, Alt FW (2002) The mechanism and regulation of cliromosomal V(D)J recombination. Cell 109 (SuppL): S45-S55.Borden J & Manuelidis L (1988) Movement of the X chromosome in epilepsy. Science. 242: 1687-1691.

22. Berger JM (1998) Structure of DNA topoisomerases. Biochim. Biophys. Acta. 1400: 3-18.

23. Bergerat A, de Massy B, Gadelle D, Varoutas PC, Nicolas A, Forterre P (1997) An atypical topoisomerase II from Archaea with implications for meiotic recombination. Nature. 386: 414-417.

24. Berrios М, Osheroff N, Fisher PA (1985) In situ localization of DNA topoisomerase II, a major polypeptide component of the Drosophila nuclear matrix fraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 4142-4146.

25. Bharti AK, Olson M OJ, Kufe DW, Rubin EH (1996) Identification of a Nucleolin Binding Site in Human Topoisomerase I. J. Biol. Chem. 271(4): 1993-1997.

26. Biedermann KA, Sun JR, Giaccia AJ, Tosto LM, Brown JM (1991) Scid mutation in mice confers hypersensitivity to ionizing radiation and a deficiency in DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88(4) 1394-1397.

27. Bystritskiy A & Razin S (2004) Breakpoint clusters: reason or consequence? Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 14: 65-78.

28. Bohlander SK (2000) Fusion genes in leukemia: an emerging network. Cytogenet. Cell. Genet. 91: 52-56.

29. Bolzer A, Kreth G, Solovei I, Koehler D, Saracoglu K, et al., (2005) Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes. PLoS Biol. 3(5): el57.

30. Boyle S, Gilchrist S, Bridger .TM, Mahy NL, Ellis JA, Bickmore WA (2001) The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells. Hum. Mol Genet 10: 211-219.

31. Branco MR & Pombo A (2006) Intermingling of chromosome territories in interphase suggests role in translocations and transcription-dependent associations. PLoS Biol. 4: el38.

32. Bressan DA, Vazquez J, Haber JE (2004) Mating type-dependent constraints on the mobility of the left arm of yeast cliromosome III. J. Cell. Biol. 164: 361-71.

33. Bridger .TM, Boyle S, Kill IR, Bickmore WA (2000) Re-modelling of nuclear architecture in quiescent and senescent human fi broblasts. Curr. Biol. 10(3): 149-152.

34. Brockstedt E, Rickers A, Kostka S, Laubersheimer A, Dorken B, Wittmann-Liebold B, Bommert K, Otto A (1998) Identification of Apoptosis-associated Proteins in a Human Burkitt Lymphoma Cell Line. J. Biol. Chem. 273: 28057-28064.

35. Brown JM, Leach J, Reittie JE, Atzberger A, Lee-Pradhoe J, Wood WG, Higgs DR, Iborra FJ, Buckle VJ (2006) Coregulated human globin genes are frequently in spatial proximity when active. J. Cell Biol. 172: \11-\Ю.

36. Brown KE, Amoils S, Horn JM, Buckle VJ, Higgs DR, Merkenschlager M, Fisher AG (2001) Expression of a- and P-globin genes occurs within different nuclear domains in haemopoietic cells. Nat. Cell Biol. 3: 602-606.

37. Bryans M, Valenzano MC, Stamato TD (1999) Absence of DNA ligase IV protein in XR-1 cells: evidence for stabilization by XRCC4. Miitat. Res. 433(1): 53-8.

38. Burden DA & Osheroff N (1998) Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase IT and drugs targeted to the enzjone. Biochim. Biophys. Acta. 1400(1-3): 139-154.

39. Calsou P, Delteil C, Frit P, Drouet J, Salles В (2003) Coordinated assembly of Ku and p460 subunits of the DNA-dependent protein kinase on DNA ends is necessary for XRCC4-ligase IV recruitment. J. Mol. Biol. 326(1): 93-103.

40. Carpenter AJ, Porter AC (2004) Construction, characterization, and complementation of a conditional-lethal DNA topoisomerase II alpha mutant human cell line. Mol. Biol. Cell. 15(12): 5700-5711.

41. Carter D, Chakalova L, Osborne CS, Dai YF, Fraser P (2002) Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nat. Genet. 32: 623-626.

42. Carter КС, Bowman D, Carrington W, Fogarty K, McNeil JA, Fay FS, Lav^ence JB (1993) A three-dimensional view of precursor messenger RNA metabolism within the mammalian nucleus. Science. 259: 1330-1335.

43. Chaly N & Brown DL (1996) Is DNA topoisomerase II beta a nucleolar protein? J. Cell. Biochem. 63(2): 162-173.

44. Chambeyron S & Bickmore WA (2004) Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes Dev. 18: 1119-1130.

45. Chambeyron S & Bickmore WA (2004) Does looping and clustering in the nucleus regulate gene expression? Curr. Opin. Cell Biol. 16: 256-262.

46. Champoux JJ (2001) DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Arvjii. Rev. Biochem. 70: 369-413.

47. Charron M & Hancock R (1991) Chromosome recombination and defective genome segregation induced in Chinese hamster cells by the topoisomerase II inhibitor VM-26. Chromoboma. 100: 97-102.

48. Chappell C, Hanakahi LA, Karimi-Busheri F, Weinfeld M, West SC (2002) Involvement of human polynucleotide kinase in double-strand break repair by non-homologous end joining, EMBOJ. 21(11): 2827-2832.

49. Chen AY, Liu LF (1994) DNA topoisomerases: essential enzymes and lethal targets. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34: 191-218.

50. Chen HT, Bhandoola A, Difilippantonio MJ, Zhu J, Brown MJ, Tai X et al., (2000) Response to RAG-mediated VDJ cleavage by NBSl and gamma-H2AX. Science. 290: 1962-1965.

51. Chen L, Trujillo K, Sung P, Tomkinson AE (2000) Interactions of the DNA ligase IV- XRCC4 complex with DNA ends and the DNA-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 275(34): 26196-26205.

52. Chen W, lida S, Louie DC, Dalla-Favera R, Chaganti RS (1998) Heterologous promoters fused to BCL6 by chromosomal translocations affecting band 3q27 cause its deregulated expression during B-cell differentiation. Blood. 91: 603-607.

53. Christensen MO, Larsen MK, Barthelmes HU, Hock R, Andersen CL, Kjeldsen E, Knudsen BR, Westergaard O, Boege F & Mielke С (2002) Dynamics of human DNA topoisomerases Пгт and Ш in living cells. J. Cell Biol. 157: 3 1 ^ 4 .

54. Chuang CH, Carpenter AE, Fuchsova B, Johnson T (2006) Long-Range Directional Movement of an Interphase Chromosome Site. Current Biology. 16: 825-831.

55. Chubb Ж, Boyle S, Perry P, Bickmore WA (2002) Chromatin motion is constrained by association witli nuclear compartments in human cells. Curr. Biol. 12: 439—445.

56. Cleary H, Boulton E, Plumb M (2001) Allelic loss on chromosome 4 (Lyr2/TLSR5) is associated with myeloid, B-ljmiph-myeloid and lymphoid (B & T) mouse radiation-induced leukemias. .fi/oocf. 98:1549-1554.

57. Cleary ML (1991) Oncogenic conversion of transcription factors by chromosomal translocations. Cell. 66: 619-622.

58. Constantinou A, Stoner GD, Mehta R, Rao K, Rimyan C, Moon R (1995) The dietary anticancer agent ellagic acid is a potent inhibitor of DNA topoisomerases in vitro. Nutrition Cancer. 23(2): 121-130.

59. Cook PR (1999) The organization of replication and transcription. Science. 284: 1790- 1795.

60. Cremer M, Kupper K, Wagler B, et al. (2003) Inheritance of gene.density-related higher order chromatin arrangements in normal and tumor cell nuclei. J. Cell. Biol. 162(5): 809-820.

61. Cremer M, von Hase J, Volm T, Brero A, Kreth G, Walter .1, Fischer C, Solovei 1. Cremer C, Cremer T (2001) Non-random radial higher-order chromatin arrangements in nuclei of diploid human cells. Chromosome Res. 9: 541-567.

62. Cremer T, Cremer С (2001) Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat. Rev. Genet. 2(4): 292-301.

63. Cremer T, Cremer M, Dietzel S, MuUer S, Solovei I, Fakan S (2006) Chromosome territories — A functional nuclear landscape. Curr. Opin. Cell Biol. 18: 307—316.

64. Cremer T, Lichter P, Borden J, Ward DC, Manuelidis L (1988) Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. Hum. Genet. 80: 235-246.

65. Croft JA, Bridger JM, Boyle S, Perry P, Teague P, Bickmore WA (1999) Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. J. Cell. Biol. 145(6): 1119-1131.

66. D'Anjou H, Chabot C, Chartrand P (2004) Preferential accessibility to specific genomic loci for the repair of double-strand breaks in human cells. Nucleic. Acids Res. 32: 6136^3.

67. D'Arpa P, Beardmore C, Liu L (1990) Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50: 6919-6934.

68. D'Arpa P. Liu LF (1989) Topoisomerase-targeting antitumor drugs. Biochim. Biophys. Acta. 989: 163-177.

69. Daniely Y & Borowiec JA (2000) Formation of a Complex between Nucleolin and Replication Protein A after Cell Stress Prevents Initiation of DNA Replication. J. Cell Biol. 149:799-810.

70. De A, Donaliue SL, Tabah A, Castro NE, Mraz N, Cruise JL, Campbell С (2006) A novel interation of nucleolin with RadSl. Biochem. Biophys. Res. Conunun. 344: 206-213.

71. DeFazio LG, Stansel RM, Griffith JD, Chu G (2002) Synapsis of DNA ends by DNAdependent protein kinase. EMBOJ. 21(12): 3192-3200.

72. Dempsey LA, Sun H, Hanakahi LA. Maizels N (1999) G4 DNA Binding by LRl and Its Subunits, Nucleolin and hnRNP D, A Role for G-G pairing in Immunoglobulin Switch Recombination. J. Biol. Chem. 274(2): 1066-1071.

73. Dereuddre S, Delaporte C, Jacquemin-Sablon A (1997) Role of topoisomerase II beta in the resistance of 9-OH-ellipticine-resistant Chinese hamster fibroblasts to topoisomerase II inhibitors. Cancer Res. 57(19): 4301^308.

74. Dickinson LA & Kohwi-Shigematsu T (1995) Nucleolin Is a Matrix Attachment Region DNA-Binding Protein That Specifically Recognizes a Region with High Base-Unpairing Potential. Mol. Cell. Biol. 15: 456^65.

75. Dietzel S. Schiebel K, Little G, Edelmann P, Rappold GA, et al., (1999) The 3D positioning of ANT2 and ANT3 genes within female X chromosome territories correlates with gene activity. Exp. Cell Res. 252: 363-375.

76. Drake FH, Hofmann GA. Bartus HF, Mattem MR, Crooke ST, Mirabelli CK (1989) Biochemical and pharmacological properties of pl70 and pl80 forms of topoisomerase II. Biochemistry. 28(20): 8154-8160.

77. Drake FH, Zimmerman JP, McCabe FL et al., (1987) Purification of topoisomerase II from amsacrine-resistant P388 leukemia cells. Evidence for two forms of the enzyme. J. Biol. Chem. 262(34): 16139-161 Al.

78. Dvir A, Peterson SR, Knuth MW, Lu H, Dynan WS (1992) Ku autoantigen is the regulatory component of a template-associated protein kinase that phosphorylates RNA polymerase II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 11920-11924.

79. Dynan WS & Yoo S (1998) Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucl. Acids Res. 26(7): 1551-1559.

80. Edelmann P, Bomfleth H, Zink D, Cremer T, Cremer С (2001) Morphology and dynamics of chromosome territories in living cells. Biochim. Biophys. Acta. 1551: M29-M39.

81. Elliott В & Jasin M (2002) Double-strand breaks and translocations in cancer. Cell. Mol. 1.ife. Sci. 59: 373-385.

82. Essers J, Hendriks RW, Swagemakers SM, Troelstra C, de Wit J, Bootsma D, Hoeijmakers JH J, Kanaar R (1997) Disruption of Mouse RAD54 Reduces Ionizing Radiation Resistance and Homologous Recombination. Cell. 89: 195-204.

83. Faro-Trindade I & Cook PR (2006) Transcription factories: Structures conserved during differentiation and evolution. Biochem. Soc. Trans. 34: 1133-1137.

84. Felix CA (1998) Secondary leukemias induced by topoisomerase-targeted drugs. Biochim. Biophys. Acta. 1400: 233-255.

85. Felix CA (2001) Leukemias related to treatment with DNA topoisomerase II inhibitors. Med. Pediatr. Oncol. 36(5): 525-535.

86. Felix CA (2006) Therapy-Related Leukemias. C.-H. Pui (Ed.) Childhood Leukemias, second ed., Cambridge University Press.: 774—804.

87. Felix CA (2006) Secondary Myelodysplasia/Acute Myeloid Leukemia. Clinical Hematology.: 374-388.

88. Forest T, Barnard S, Baines JD (2005) Active intranuclear movement of herpesvirus capsids. Nature Cell Biol. 7: 429-431.

89. Fortime JM & Osheroff N (2000) Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice. Prog. Nucleic. Acid Res. Molecular Biol. 64: 221-253.

90. Fuxa М, Skok J, Souabni A, Salvagiotto G, Roldan E, Busslinger M (2004) Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18:411-422.

91. Galiova G, Bartova E, Raska I, Krejci J, Kozubek S (2008) Chromatin changes induced by lamin A/C deficiency and the histone deacetylase inhibitor trichostatin A. Eur. J. Cell Biol. 87(5): 291-303.

92. Gasser SM, Walter R, Dang Q, Cardenas ME (1992) Topoisomerase II: its functions and phosphorylation. у4/7^ ои/е Van Leeuwenhoek. 62(1-2): 15-24.

93. Gasser SM (2002) Visualizing cliromatin dynamics in interphase nuclei. Science. 296: 1412-1416.

94. Gauss GH, Domain I, HsiehCL, Lieber MR (1998) V(D)J recombination activity in human hematopoietic cells: correlation with developmental stage and genome stability. Eur. J. Immun. 28(1): 351-358.

95. Gilbert N, Boyle S, Fiegler H, Woodfme K, Carter NP, et al., (2004) Chromatin architecture of the human genome: Gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers. Cell. 118: 555-566.

96. Ginisty H, Sicard H, Roger B, Bouvet P (1999) J. Cell. Sci. 112: 761-772.

97. Goldmit M, Л Y, Skok J, Roldan E, Jung S, Cedar H, Bergman Y (2005) Epigenetic ontogeny of the Igk locus during В cell development. Nat. Immunol. 6(2): 198-203.

98. Gottlieb TM & Jackson SP (1993) The DNA-dependent protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen. Cell. 72(1): 131-142.

99. Grawunder U, Wilm M, Wu X, Kulesza P, Wilson ТЕ, Mann M, Lieber MR (1997) Activity of DNA ligase IV stimulated by complex formation with XRCC4 protein in mammalian cells. Nature. 388: 492-5.

100. Grav^nder U, Zimmer D, Kulesza P, Lieber MR (1998) Requirement for an interaction of XRCC4 with DNA ligase IV for wild-type V(D)J recombination and DNA double-strand break repair in vivo. J Biol Chem. 273(38): 24708-14.

101. Grinstein E, Du Y, Santourlidis S, Christ J, Ulirberg M, Wemet P (2007) Nucleolin Regulates Gene Expression in CD34-positive Hematopoietic Cells. J. Biol. Chem. 282(17): 12439-12449.

102. Grue P, Grasser A. Sehested M et al., (1998) Essential mitotic functions of DNA topoisomerase Iip are not adopted by topoisomerase Iip in human H69 cells../. Biol. Chem. 273(50): 33660-33666.

103. Grammt I (2006) Actin and myosin as transcription factors. Curr. Opin. Genet. Dev. 16: 191-196.

104. Gravel S, Larrivee M, Labrecque P, Wellinger RJ (1998) Yeast Ku as a regulator of chromosomal DNA end structure. Science. 280: 741-4.

105. Gu Y, Cimino G, Alder H, Nakamura T, Prasad R, Canaani O, Moir DT, Jones C. Nowell PC, Croce CM, et al. (1992) The (4;ll)(q21;q23) chromosome translocations in acute leukemias involve the VDJ recombinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89(21): 10464-8.

106. Gue M, Sun JS, Boudier T (2006) Simultaneous localization of MLL, AF4 and ENL genes in inteфhase nuclei by 3D-FISH: MLL translocation revisited. BMC Cancer. 6: 20.

107. Guillot PV, Xie SQ, Hollinshead M, Pombo A (2004) Fixation-induced redistribution of hyperphosphorylated RNA polymerase II in the nucleus of human cells. Exp. Cell. Res. 295: 460^68.

108. Haber JE & Leung WY (1996) Lack of cliromosome territoriality in yeast: promiscuous rejoining of broken chromosome ends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 13949-54.

109. Hanakahi LA & West SC (2002) Specific interaction of IP6 with human Ku70/80, the DNA-binding subunit of DNA-PK. EMBOJ. 21(8): 2038-2044.

110. Hande KR (1998) Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor. Eur.J. Cancer. М{Щ: 1514-1521.

111. Hande ICR (1998) Clinical applications of anticancer drugs targeted to topoisomerase II. Biochim. Biophys. Acta. 1400(1-3): 173-184.

112. Handeli S, Klar A, Meuth M, Cedar И (1989) Mapping replication imits in animal cells. Cell. 57: 909-920.

113. Harmon В & Sedat J (2005) Cell-by-cell dissection of gene expression and chromosomal interactions reveals consequences of nuclear reorganization. PLoS Biol. 3: е67.

114. Hashimoto S (2002) CD56+, NKp46+ cell line (MZ93) expressing T-cell and myeloid antigens. Leukemia Research. 26(3): 289-295.

115. Heard E & Bickmore W (2007) The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Curr. Opin. Cell. Biol. 19: 311-316.

116. Heck MM & Eamshaw WC (1986) Topoisomerase II: A specific marker for cell proliferation. J. Cell Biol. 103(6 Pt 2): 2569-2581.

117. Heck MM, Hittelman WN, Eamshaw WC (1988) Differential expression of DNA topoisomerases 1 and II during the eukaryotic cell cycle, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 85: 1086-1090.

118. Hewitt SL, High FA, Reiner SL, Fisher AG, Merkenschlager M (2004) Nuclear repositioning marks the selective exclusion of lineage-inappropriate transcription factor loci during T helper cell differentiation. Eur. J. Immunol. 34: 3604—3613.

119. Hlatky L, Sachs RK, Vazquez M, Comforth MN (2002) Radiation-induced chromosome abeiTations: Insights gained from biophysical modeling. Bioessays. 24: 714-723.

120. Hofmaim WA, Johnson T, Klapczynski M, Fan JL, de Lanerolle P (2006) From transcription to transport: emerging roles for nuclear myosin I. Biochem. Cell Biol. 84: 418-426.

121. HoUey WR, Mian IS, Park SJ, Rydberg B, Chatterjee A (2002) A model for interphase chromosomes and evaluation of radiation-induced aberrations. Radiat. Res. 158: 568-580.

122. Holm C, Covey JM, Kerrigan D, Pommier Y (1989) Differential requirement of DNA replication for the cytotoxicity of DNA topoisomerase I and II inhibitors in Chinese hamster DC3F cells. Cancer Res. 49(22): 6365-6368.

123. Horowitz DS & Wang JC (1987) Mapping the active site tyrosine of Escherichia coli DNA gyrase. J. Biol. Chem. 262(11): 5339-5344.

124. Howard M, Neece S, Matson S, Kreuzer К (1994) Disruption of a topoisomerase-DNA cleavage complex by a DNA helicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 12031-12035.

125. Hsiang YH, Wu HY, Liu LF (1988) Proliferation-dependent regulation of DNA topoisomerase II in cultured human cells. Cancer Res. 48(11): 3230-3235.

126. Hunger S, Tkachuk D, Araylon M, Link M, Carroll A, Welbom J, Willman C, Cleary M (1993) HRX involvement in de novo and secondary leukemias with diverse chromosome llq23 abnormalities. Blood. 81: 3197-203.

127. Huret JL (2003) t(8;21)(q22;q22) in treatment related leukemia. Atlas Genet. Cytogenet. Oncol. Haematol. October.

128. Huret JL (1997) t(8;21)(q22;q22).J^/a5Gef7er. Cytogenet. Oncol. Haematol. September.

129. Iborra FJ, Pombo A, Jackson DA, Cook PR (1996) Active RNA polymerases are localized within discrete transcription "factories" in human nuclei. J. Cell Sci. 109(Pt 6): 1427— 1436.

130. Iborra FJ, Pombo A, McManus J. Jackson DA, Cook PR (1996) The topology of transcription by immobilized polymerases. Er/». Cell Res. 229: 167-173.

131. Ikeda H, Aoki K, Naito A (1982) Illegitimate recombination mediated in vitro by DNA gyrase of Escherichia coli: Structure of recombinant DNA molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 3724-3728.

132. Isaacs Ю, Davies SL, Sandri MI, Redwood C, Wells NJ, Hickson ID (1998) Physiological regulation of eukaryotic topoisomerase II. Biochim. Biophys. Acta. 1400 (1-3): 121—137.

133. Jackson DA, Iborra FJ, Manders EM, Cook PR (1998) Numbers and organization of RNA polymerases, nascent transcripts, and transcription units in HeLa nuclei. Mol. Biol. Cell 9: 1523-1536.

134. Jaffc ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds.) (2001) World Health Organization Classification of Tumours, Pathology and Genetics: Tumours of the Hematopoietic and 1.ymphoid Tissues, lARC, Lyon.

135. Jenkins JR, Ayton P, Jones T et al., (1992) Isolation of cDNA clones encoding the beta isozyme of human DNA topoisomerase II and localisation of the gene to chromosome 3p24. Nucl. Acids Res. 20(21): 5587-5592.

136. Ju BG, Lunyak VV, Perissi V, Garcia-Bassets I, Rose DW, Glass CK, Rosenfeld MG (2006) A Topoisomerase IIB-Mediated dsDNA Break Required for Regulated Transcription. Science. 312: 1798 - 1802.

137. Junop MS, Modesti M, Guarne A, Ghirlando R, Gellert M, Yang W (2000) Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining. EMBO J. 19(22): 5962-70.

138. Kantidze OL. larovaia OV, Razin SV (2006) Assembly of nuclear matrix-bound protein complexes involved in non-homologous end joining is induced by inliibition of DNA topoisomerase II. J. Cell. Physiol. 207: 660-667.

139. Karimi-Busheri F. Daly G, Robins P, Canas B, Pappin DJ, Sgouros J, Miller GG, Fakhrai H, Davis EM, Le Beau MM, Weinfeld M (1999) Molecular characterization of a human DNA kinase. J. Biol. Chem. 274(34): 24187-24194.

140. Kaufmann SH (1998) Cell death induced by topoisomerase-targeted drags: more questions than answers. Biochim. Biophys. Acta. 1400(1—3): 196-211.

141. Keeney S. Giroux CN, Kleckner N (1997) Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spol 1, a member of a widely conserved protein family. Cell. 88: 375-384.

142. Kingma PS, Corbett AH, Burcham PC, Mamett LJ, Osheroff N (1995) Abasic sites stimulate double-stranded DNA cleavage mediated by topoisomerase II. J. Biol. Chem. 270: 21441-21444.

143. Kingma PS, Greider С A, Osheroff N (1997) Spontaneous DNA lesions poison human topoisomerase II and stimulate cleavage proximal to leukemic l lq23 chromosomal breakpoints. Biochemistry. 36: 5934—5939.

144. Kingma PS & Osheroff N (1997) Apurinic sites are position-specific topoisomerase II poisons. J. Biol. Chem. 212: 1148-1155.

145. Kim J & Pelletier J (1999) Molecular genetics of chromosome translocations involving EWS and related family members. Р/гу /^о/. Genomics. 1: 127-138.

146. Kleckner N, Zickler D, Jones GH, Dekker J, Padmore R, et al., (2004) A mechanical basis for chromosome function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101: 12592-12597.

147. Koch CA, Agyei R. Galicia S, Metalnikov P, O'Donnell P, Starostine A, Weinfeld M, Durocher D (2004) XRCC4 physically links DNA end processing by polynucleotide kinase to DNA ligation by DNA ligase IV. Embo J. 23(19): 3874-3885.

148. Kosak ST & Groudine M (2004) Gene order and dynamic domains. Science. 306: 644-647.

149. Kosak ST, Skok .ТА, Medina KL, Riblet R, Le Beau MM, Fisher AG, Singh H (2002) Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphoc>^e development. Science 296: 158-162.

150. Kreiizer KN & Cozzarelli NR (1979) Escherichia coli mutants thermosensitive for deoxyribonucleic acid gyrase subunit A: effects on deoxyribonucleic acid replication, transcription, and bacteriophage growth. J. Bacterial. 140(2): 424-435.

151. Kruhlak MJ, Celeste A, Dellaire G, Femandez-Capetillo O, Muller WG, McNally JG. et al., (2006) Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. Ill: 823-34.

152. Kuhne M, Rothkamm K. Lobrich M (2002) Physical and biological parameters affecting DNA double strand break raisrejoining in mammalian cells. Radiat. Prat. Dosim. 99:129-132.

153. Kurz A, Lampel S, Nickolenko JE, Bradl.J, Benner A. et al., (1996) Active and inactive genes localize preferentially in the periphery' of chromosome territories. J. Cell Biol. 135: 1195-1205.

154. Kysela K, Philimonenko AA, Philimonenko VV, Janacek J, Kahle M, Hozak P (2008) Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activity of the cell Histochem. Cell Biol. 124: 347-358.

155. Larsen AK, Escargueil AE, Skladanowski A (2003) Catalytic topoisomerase II inhibitors in cancer therapy. Р/гаготасо/. Ther. 99(2): 167-181.

156. Lee JW, Blanco L, Zhou T, Garcia-Diaz M, Bebenek K, Kunkel ТА, Wang Z, Povirk LF (2004) Implication of DNA polymerase lambda in alignment-based gap-filling for nonhomologous DNA end joining in human nuclear extracts. J. Biol. Chem. 279(1): 805-811.

157. Lee GR, Spilianakis CG, Flavell RA (2005) Hypersensitive site 7 of the TH2 locus control region is essential for expressing TH2 cytokine genes and for long-range intrachromosomal interactions. Nat. Immunol. 6: 42-48.

158. Levine C, Hiasa H, Marians KJ (1998) DNA gyrase and topoisomerase IV: biochemical activities, physiological roles during chromosome replication, and drug sensitivities. Biochim. Biophys. Acta. 1400: 29-43.

159. Li TK & Liu LF (2001) Tumor cell death induced by topoisomerase-targeting drugs. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41: 53-77.

160. Liang F, Romanienko PJ, Weaver DT, Jeggo PA, Jasin M (1996) Chromosomal double- strand break repair in Ku80-deficient cells. Proa. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 8929-33.

161. Lichten M & Haber JE (1989) Position effects in ectopic and allelic mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 123: 261-8.

162. Lindsey Jr. RH, Bromberg ICD, Felix С A, Osheroff N (2004) 1,4-Benzoquinone Is a Topoisomerase II Poison. Biochemistry. 43(23): 7563-7574.

163. Lindsey Jr. RH, Bender RP, Osheroff N (2005) Effects of benzene metabolites on DNA cleavage mediated by human topoisomerase II alpha: 1,4-hydroquinone is a topoisomerase II poison. Chem. Res. Toxicol. 18(4): 761-770.

164. Lindsey RH, Bender RP, Osheroff N (2005) Stimulation of topoisomerase Il-mediated DNA cleavage by benzene metabolites. Chem. Biol. Interact. 153-154: 197-205.

165. Liu LF (1989) DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annu. Rev. Biochem. 58: 351-75.

166. Liu LF, Rowe TC. Yang L, Tewey KM, Chen GL (1983) Cleavage of DNA by mammalian DNA topoisomerase II../. Biol. Chem. 258: 15365-15370.

167. Lisby M, Mortensen UH, Rothstein R (2003) Colocalization of multiple DNA double- strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell. Biol. 5: 572-7.

168. Look AT (1997) Oncogenic transcription factors in the human acute leucemias. Science. 278:1059-1064.

169. Ma Y & Lieber MR (2002) Binding of inositol hexakisphosphate (IP6) to Ku but not to DNA-PKcs. J: 5/o/. Chem. 277(13): 10756-10759.

170. Ma Y, Pannicke U, Schwarz K, Lieber MR (2004) На1ф1п opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end joining and V(D)J recombination. Cell. 108: 781-794.

171. Mahajan KN, Nick McElhinny SA, Mitchell BS, Ramsden DA (2002) Association of DNA polymerase mu (pol rau) with Ku and ligase IV: role for pol mu in end joining double-strand break repair. Mol. Cell. Biol 22(14): 5194-5202.

172. Mao Y, Desai SD, Ting CY, Hwang .1, Liu LF (2001) 26 S proteasome-mediated degradation of topoisomerase II cleavable complexes. J. Biol. Chem. 276(44): 40652-40658.

173. Marchetti F, Bishop JB, Lowe X, Generoso WM, Hozier J, Wyrobek AJ (2001) Etoposide induces heritable chromosomal abenations and aneuploidy during male meiosis in the mouse. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 98(7): 3952-7.

174. Meder VS, Boeglin M, de Murcia G, Schreiber V (2005) PARP-1 and РАБа'-2 interact with nucleophosmin/B23 and accumulate in transcriptionally active nucleoli./. Cell Sci. 118(Ptl):211-22.

175. Mi Y, Thomas SD, Xu X, Casson LK, Miller DM, Bates PJ (2003) Apoptosis in Leukemia Cells Is Accompanied by Alterations in the Levels and Localization of Nucleolin. J. Biol. Chem. 278(10): 8572-8579.

176. Mitelman F (2000) Recurrent chromosome aberrations in cancer. Mutat. Res. 462: 247- 253.

177. Modesti M, Hesse .Ш, Gellert M (1999) DNA binding of Xrcc4 protein is associated with V(D)J recombination but not with stimulation of DNA ligase IV activit>^ EMBO J. 18(7): 2008-18.

178. Moneypenny CG, Shao J, Song Y, Gallagher EP (2006) MLL rearrangements aie induced by low doses of etoposide in human fetal hematopoietic stem cells. Carcinogenesis. 27(4): 874-81.

179. Mongelard F & Bouvet P (2007) Nucleolin: a multiFACeTed protein. Trends Cell Biol. 17(2): 80-86.

180. Morey С, Da Silva NR, Perry P, Bickmore WA (2007) Nuclear reorganisation and chromatin decondensation are conserved, but distinct, mechanisms Hnked to Hox gene activation. Development. 134: 909-919.

181. Morgan WF, Corcoran J, Hartmann A, Kaplan MI, Limoli CL, Ponnaiya В (1998) Double strand breaks, cliiomosomal rearrangements, and genomic instability. Mutat. Res. 404: 125-128.

182. MuUer WG, Rieder D, Karpova TS, John S, Trajanoski Z, McNally JG (2007) Organization of chromatin and histone modifications at a transcription site. J. Cell Biol. Ill: 957-967.

183. Munkel C, Eils R, Dietzel S, Zink D, Mehring C, et al., (1999) Compartmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment. J. Mol. Biol. 285: 1053-1065.

184. Nagelhus ТА, Slupphaug G. Lindmo T, Krokan HE (1995) Cell cycle regulation and subcellular localization of the major human uracil-DNA glycosylase. Exp. Cell. Res. 220(2): 292-7.

185. Nakanishi M, Tanaka K, Shintani T, Takahashi T, Kamada N (1999) Chromosomal instability in acute myelocytic leukemia and myelodysplastic syndrome patients among atomic bomb survivors. J. Radial. Res. 40: 159-167.

186. Nelms BE, Maser RS, MacKay JF, Lagally MG, Petrini JH (1998) In situ visualization of DNA doublestrand break repair in human fibroblasts. Science. 280: 590-2.

187. Nikiforov YE (2002) RET/PTC rearrangement in thyroid tumors. Endocr. Pathol. 13: 3-16.

188. Nikiforova MN, Stringer Ж , Blough R. Medvedovic M, Fagin JA, Nikiforov YE (2000) Proximity of chromosomal loci that participate in radiation-induced rearrangements in human cells. Science. 290: 138-141.

189. Nitiss JL (1998) Investigating the biological functions of DNA topoisomerases in eukaryotic cells. Biochim. Biophys. Acta. 1400(1-3): 63-81.

190. Obata К, Hiraga Н, Nojima Т, Yoshida МС, Abe S (1999) Molecular characterization of tlie genomic breakpoint junction in a t(ll;22) translocation in Ewing sarcoma. Genes Chromosomes Cancer. 25: 6-15.

191. Ogiso Y, Tomida A, Lei S, Oura S, Tsuruo T (2000) Proteasome Inhibition Circumvents Solid Tumor Resistance to Topoisomerase Il-directed Drugs. Cancer Research. 60: 2429-2434.

192. Ohki M (1993) Molecular basis of the t(8;21) translocation in acute myeloid leukaemia. Semin. Cancer Biol. 4(6): 369-75.

193. Okuda T, Nisliimura M, Nakao M, Fujita Y (2001) RUNXl/AMLl: a central player in hematopoiesis. Int. J. HematoL 74: 252-257.

194. Olive PL (2000) The role of single and double strand breaks in cell killing by ionizing radiation. Radiat. Res. 150: 42-51.

195. Ondrej V, Lukasova E, Krejci J, Kozubek S (2008) Intranuclear trafficking of plasmid DNA is mediated by nuclear polymeric proteins lamins and actin. Acta Biochim._ Pol. 55(2): 307-15.

196. Ondrej V, Lukasova E, bCrejci J, Matula P, Kozubek S (2008) Lamin A/C and polymeric actin in genome organization. Mol Cells. 26(4): 356-61.

197. Onno M, Nakamura T, Hillova J, Hill M (1992) Rearrangement of the himian tre oncogene by homologous recombination between Alu repeats of nucleotide sequences from two different cliromosomes. Oncogene. 7: 2519-2523.

198. Osborne CS, Chakalova L, Brown KE, Carter D, Horton A, Debrand E, Goyenechea B, Mitchell JA, Lopes S, Reik W et al., (2004) Active genes dynamically colocaiize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36: 1065-1071.

199. Parada LA, McQueen PG, Munson PJ, Misteli T (2002) Conservation of relative chromosome positioning in normal and cancer cells. Curr. Biol. 12: 1692-1697.

200. Parada L, McQueen P, Misteli T (2004) Tissue-specifi с spatial organization of genomes. Genome Biol. 7(5): R44.

201. Parada L, Misteli T (2002) Chromosome positioning in the interphase nucleus. Trends Cell Biol. 12(9): 425.

202. Palstra RJ, Tolhuis B, Splinter E, Nijmeijer R, Grosveld F, et al, (2003) The beta-globin nuclear compartment in development and erjrtliroid differentiation. Nat. Genet. 35: 190— 194.

203. Parsons CA, Baumann P, Van Dyck E, West SC (2000) Precise binding of single-stranded DNA termini by human RAD52 protein. EMBO J. 19: 4175-4181.

204. Paull TT, Rogakou EP, Yamazaki V, Kirchgessner CU, Gellert M & Bonner WM (2000) A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. CtirrBiol 10: 886-895.

205. Philip P & Pedersen-Bjergaard J (1988) Cytogenetic, clinical, and cytologic characteristics of radiotherapy-related leukemias. Cancer Genet. Cytogenet. 31: 227-236.

206. Pombo A, Jackson DA, HoUinshead M, Wang Z, Roeder RG, et al., (1999) Regional specialization in human nuclei: Visualization of discrete sites of transcription by RNA polymerase III. EMBO J. 18: 2241-2253.

207. Pommier Y (1997) DNA Topoisomerase II inhibitors. Humana Press.: 153-174.

208. Purugganan MM, Shah S, Kearney JF, Roth DB (2001) Ku80 is required for addition of N nucleotides to V(D)J recombination junctions by terminal deoxynucleotidyl transferase. Nucl. Acids Res. 29(7): 1638-46.

209. Rabbitts TH (1994) Chromosomal translocations in human cancer. Nature. 372: 143-149.

210. Rabbitts TH (1999) Perspective: chromosomal translocations can affect genes controlling gene expression and differentiation—why are these functions targeted? J. Pathol. 187: 39-42.

211. Raghavan SC, Kirsch IR, Lieber MR (2001) Analysis of the V(D)J recombination efficiency at lymphoid chromosomal translocation breakpoints. J. Biol. Chem. 276(31): 29126-33.

212. Ragoczy T, Bender MA, Telling A, Byron R, Groudine M (2006) The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation. Genes Dev. 20:1447—1457.

213. Razin SV (1999) Chromosomal DNA loops may constitute basic units of the eukaryotic genome organization and evolution. Crit Rev. Eiikaiyot. Gene Expr. 9: 279-283.

214. Richardson C, Elliott B, Jasin M (1999) Cliiomosomal double-strand breaks introduced in mammalian cells by expression of I-Sce I endonuclease. Methods Mol. Biol. 113: 453-63.'

215. Richardson С & Jasin M (2000) Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks. Nature. 405: 697-700.

216. Rivera-Calzada A, Maman JD, Spagnolo L, Pearl LH, Llorca О (2005) Three-dimensional structure and regulation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs). Structure. 13(2): 243-55.

217. Roccato E, Bressan P, Sabatella G, Rumio C, Vizzotto L, Pierotti MA, Greco A (2005) Proximity of TPR and NTRKl rearranging loci in human thyrocytes. Cancer Res. 65: 2572-2576.

218. Rogakou EP, Boon C, Redon C, Boimer WM (1999) Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell. Biol. 146, 905-916.

219. Roix JJ, McQueen PG, Munson PJ, Parada LA, Misteli T (2003) Spatial proximity of translocation-prone gene loci in human lymphomas. Nat. Genet. 34(3): 287-291.

220. Rothkamm К & Lobrich M (2002) Misrepair of radiation-induced DNA double-strand breaks and its relevance for tumorigenesis and cancer treatment. Int. J. Oncol. 2: 433-440.

221. Rowley JD (1993) Rearrangements involving chromosome band 11Q23 in acute leukaemia. Semin. Cancer Biol. 4: 377-385.

222. Rowley JD (1998) The critical role of chromosome translocations in human leukemias. Annu. Rev. Genet. 32: 495-519.

223. Rowe TC, Chen GL, Hsiang YH, Liu LF (1986) DNA damage by antitumor acndines mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Cancer Res. 46: 2021-2026.

224. Rubtsov MA, Terekhov SM, Razin SV. larovaia OV (2008) Repositioning of ETO gene in cells treated with VP-16, an inhibitor of DNA-topoisomerase II. J. Cell. Biochem. 104(2): 692-699.

225. Sabourin M & Osheroff N (2000) Sensitivity of human type II topoisomerases to DNA damage: stimulation of enzyme-mediated DNA cleavage by abasic, oxidized and alkylated lesions. Nucl Acids Res. 28(9): 1947-1954.

226. Sachs RK, Levy D, Chen AM, Simpson PJ, Comforth MN, et al., (2000) Random breakage and reunion chromosome aberration formation model; an interaction-distance version based on chromatin geometry. Int. J. Radiat. Biol. 76: 1579-1588.

227. Sander M & Hsieh T (1983) Double strand DNA cleavage by type II DNA topoisomerase йот Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem. 258(13): 8421-8428.

228. Savage Ж (2000) Cancer. Proximity matters. Science. 290: 62-63.

229. Savage JR (1993) Interchange and intra-nuclear architecture. Environ. Mol. Mutagen. 22: 234-44.

230. Sayegh C, Jhunjhunwala S, Riblet R, Murre С (2005) Visualization of looping involving the immvmoglobulin heavy-chain locus in developing В cells. Genes Dev. 19: 322-327.

231. Schaefer C, Grouse L, Buetow K, Strausberg RL (2001) A new cancer genome anatomy project web resource for the commtmity. Cancer J. 7: 52-60.

232. Schar P (2001) Spontaneous DNA damage, genome instability, and cancer when DNA replication escapes control. Cell 104: 329-332.

233. Scheuermaim MO, Tajbakhsh J. Kurz A, Saracoglu K, Eils R, et al., (2004) Topology of genes and nontranscribed sequences in human interphase nuclei. Exp. Cell Res. 301: 266— 279.

234. Schneider R & Grosschedl R (2007) Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression. Genes Dev. 21: 3027-3043.

235. Schneider U, Schwenk H, Bomkamm G (1977) Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int. J. Cancer. 19(5): 621-6.

236. Seinsoth S, Uhlmann-Schiffler H, Stahl H (2003) Bidirectional DNA unwinding by a ternary complex of T antigen, nucleolin and topoisomerase I. EMBO reports. 4: 263—268.

237. Sekiguchi JM & Alt FW (1999) Non homologous endjoining proteins are required for V(D)J recombination, normal growth and neurogenesis. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 64: 169-181.

238. Shin CG, Strayer JM, Wani MA, Snapka RM (1990) Rapid evaluation of topoisomerase inhibitors: caffeine inhibition of topoisomerases in vivo. Teratogen. Carinog. Mutagen. 10: 41-52.

239. Shrivastav M, De Haro LP and Nickoloff JA (2008) Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice. Cell Research. 18: 134-147.

240. Sibanda BL, Critchlow SE, Begun J, Pei XY, Jackson SP, Blundell TL, Pellegrini L (2001) Crystal structure of an Xrcc4-DNA ligase IV complex. Nat, Struct. Biol. 8(12): 1015-9.

241. Siraonis M, Klous P, Splinter E, Moshkin Y, Willemsen R, de Wit E, van Steensel B, de 1.aat W (2006) Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat. Genet. 38: 1348-1354.

242. Sirri V, Roussel P, Hernandez-Verdun D (2000) The AgNOR proteins: qualitative and quantitative changes during the cell cycle. Micron. 31: 121-126.

243. Skok JA, Gisler R, Novatchkova M, Farmer D. de Laat W, Busslinger M (2007) Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nat. Immunol. 8: 378-387.

244. Smider V, Rathmell WK, Lieber MR, Chu G (1994) Restoration of X-ray resistance and V(D)J recombination in mutant cells by Ku cDNA. Science. 266(5183): 288-291.

245. Smith KP, Moen PT, Wydner KX, Coleman JR, Lawrence JB (1999) Processing of endogenous pre-mRNAs in association with SC-35 domains is gene specific. J. Cell. Biol. 144: 617-629.

246. Smith MA, McCaffrey RP, Каф JE (1996) The secondary leukemias: challenges and research directions. J. Natl. Cancer Inst. 88(7): 407-18.

247. Snyder RD & Gillies PJ (2002) Evaluation of the clastogenic, DNA intercalative, and topoisomerase Il-interactive properties of bioflavonoids in Chinese hamster V79 cells. Environ. Molec. Mutagen. 40(4): 266-276.

248. Song Z & Wu M (2005) Identification of a novel nucleolar localization signal and a degradation signal in Survivin-deltaExS: a potential link between nucleolus and protein degradation. Oncogene. 24: 2723-2734.

249. Soutoglou E, Dom JF, Sengupta K, Jasin M, Nussenzweig A, Ried T, Danuser G, Misteli T (2007) Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nat. Cell. Biol. 9: 675-682.

250. Spagnolo L, Rivera-Calzada A, Pearl LH, Llorca О (2006) Three-dimensional structvire of the human DNA-PKcs/Ku70/Ku80 complex assembled on DNA and its implications for DNA DSB repair. Mol. Cell. 22(4): 511-9.

251. Spanopoulou E, Cortes P, Shih C, Huang CM, Silver DP, Svec P, Baltimore D (1995) 1.ocalization, interaction, and RNA binding propeilies of the V(D)J recombination-activating proteins RAGl and RAG2. Immunity. 3(6): 715-26.

252. Sperry АО, Blasquez VC, Garrard WT (1989) Dysfunction of chromosomal loop attachment sites: illegitimate recombination linked to matrix association regions and topoisomerase II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 5497-5501.

253. Spector DL (2003) The dynamics of chi'omosome organization and gene regulation. Anmi. Rev. Biochem. 72: 573-608.

254. Spilianakis CG & Flaveli RA (2004) Long-range intrachromosomal interactions in the T helper type 2 cytokine locus. Nat. Immunol. 5: 1017-1027.

255. Spilianakis CG, Lalioti MD, Town T, Lee GR, Flaveli RA (2005) Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature. 435: 637-645.

256. Snvastava M & Pollard HB (1999) Molecular dissection of nucleolin's role in growth and cell proliferation: new insights. FASEB J. 13: 1911-1922.

257. Strick R, Strissel PL, Borgers S, Smith SL, Rowley JD (2000) Dietary bioflavonoids induce cleavage in the MLL gene and may contribute to infant leukaemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97(9): 4790-4795.

258. Strick R, Zhang Y, Emmanuel N, Strissel PL (2006) Common chromatin structures at breakpoint cluster regions may lead to chromosomal translocations found in chronic and acute leukemias. Hum. Genet. 119: 479-495.

259. Strissel PL, Strick R, Rowley JD, Zeleznik-Le NJ (1998) An in vivo topoisomerase II cleavage site and a DNase I hypersensitive site colocalize near exon 9 in the MLL breakpoint cluster region. Blood. 92: 3793-3803.

260. Sullivan DM, Latham MD, Ross WE (1987) Proliferation-dependent topoisomerase II content as a determinant of antineoplastic drug action in human, mouse, and Chinese hamster ovary cells. Cancer Res. 47: 3973-3979.

261. Sung P & Klein H (2006) Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7(10): 739-50.

262. Taylor EM & Lehmann AR (1998) Conservation of eukaryotic DNA repair mechanisms. Int. J. Radiat. Biol. 74(3): 277-86.

263. Thomson I, Gilchrist S, Bickmore WA, Chubb JR (2004) The radial positioning of chromatin is not inherited through mitosis but is established de novo in early Gl. Curr. Biol. 14: 166-172.

264. Thompson LH & Schild D (2001) Homologous recombinational repair of DNA ensures mammalian chromosome stability. Mutat. Res. 477(1-2): 131-53.

265. Thyagarajan B, Lundberg R, Rafferty M, Campbell С (1998) Nucleolin promotes homologous DNA pairing in vitro. Somat. Cell. Mol. Genet. 24(5): 263-72.

266. Tolhuis В, Palstra RJ, Splinter E, Grosveld F, de Laat W (2002) Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol. Cell. 10: 1453-1465.

267. Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Xiu AA et al., (1988) Cloning and sequencing of cDNA encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q21-22. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85(19): 7177-7181.

268. Tsukamoto Y & Ikeda H (1998) Double-strand break repair mediated by DNA end-joining. Genes to Cells. 3: 135-144.

269. Tsutsui K, Tsutsui K, Hosoya O, Sano K, Tokunaga A (2001) Immunohistochemical analyses of DNA topoisomerase II isoforms in developing rat cerebellvim. J. Сотр. Neurol. 431(2): 228-239.

270. Van Dyck E, Hajibagheri NM, Stasiak A, West SC (1998) Visualisation of human rad52 protein and its complexes with hRad51 and DNA. J. Mol. Biol. 284(4): 1027-38.

271. Van Dyck E, Stasiak AZ, Stasiak A, West SC (1999) Binding of double-strand breaks in DNA by human Rad52 protein. Nature. 398: 728-731.

272. Van Gent DC & van der Burg M (2007) Non-homologous end-joining, a sticky affair. Oncogene. 26:11Ъ\-ПА0.

273. Vascotto C, Fantini D. Romanello M, Cesaratto L, Deganuto M, Leonardi A et al., (2009) APEl/Ref-1 interacts with NPMl within nucleoli and plays a role in the rRNA quality control process. M?/. Cell. Biol. 1%1): 1834-1854.

274. Vazquez J, Belmont AS, Sedat JW (2001) Multiple regimes of constrained chromosome motion are regulated in the inteфhase Drosophila nucleus. Ciirr. Biol. 11: 1227—1239.

275. Velez-Cruz R, Riggins Ж , Daniels JS et al., (2005) Exocyclic DNA lesions stimulate DNA cleavage mediated by human topoisomerase II alpha in vitro and in cultured cells. Biochemistry. 44(10): 3972-3981.

276. Verschure PJ, van DK, I, Manders EM, van Driel R (1999) Spatial relationship between transcription sites and chromosome territories. J. Cell Biol. 147: 13-24.

277. Visser AE & Aten JA (1999) Chromosomes as well as chromosomal subdomains constitute distinct units in inteфhase nuclei. J. Cell Sci. 112(Pt 19): 3353-3360.

278. Walker JR, Corpina RA, Goldberg J (2001) Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair. Nature. 412: 607-14.

279. Wang JC (2002) Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(6): 430^40.

280. Wang JC (1996) DNA topoisomerases. Annu. Rev. Biochem. 65: 635-692.

281. Wang Y. Guan J, Wang H, Wang Y, Leeper D, Iliakis G (2001) Regulation of DNA Replication after Heat Shock by Replication Protein A-Nucleolin Interactions. J. Biol. Chem. 276: 20579-20588.

282. Williams RR, Azuara V, Perry P, Sauer S, Dvorkina M, Jorgensen H, Roix J, McQueen P, Misteli T, Merkenschlager M, et al. (2006) Neural induction promotes largescale chromatin reorganisation of the Mashl locus. J Cell Sci. 119: 132-140.

283. Williams RR, Broad S, Sheer D, Ragoussis J (2002) Subchromosomal positioning of the epidermal differentiation complex (EDC) in keratinocyte and lymphoblast interphase nuclei. ?rp. Cell Res. 212: 163-175.

284. Wilmut I & Campbell KH (1998) Quiescence in nuclear transfer. Science. 281: 1611.

285. Woessner RD, Mattem MR, Mirabelli CK, Johnson RK, Drake FH (1991) Proliferation- and cell cycle-dependent differences in expression of the 170 kilodalton and 180 kilodalton forms of topoisomerase II inNIH-3T3 cells. Cell Growth Differ. 2: 209-214.

286. Worland ST & Wang JC (1989) Inducible overexpression, purification, and active site mapping of DNA topoisomerase II fiom the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 264(8): 4412-4416.

287. Wurtele Н & Chartrand P (2006) Genome-wide scanning of HoxBl-associated loci in mouse ES cells using an openended chromosome conformation capture methodology. Chromosome Res. 14: 477-495.

288. Wyman C, Ristic D, Kanaar R (2004) Homologous recombination-mediated double-strand break repair. DNA Repair (Amst). 3(8-9): 827-33.

289. Yanagida M (2005) Basic mechanism of eukaryotic chromosome segregation. Philos. Trans. R. Soc. Land B. Biol. Sci. 360: 609-21.

290. Yaneva M, Kowalewski T, Lieber MR (1997) Interaction of DNA-dependent protein kinase with DNA and with Ku: biochemical and atomicforce microscopy studies. EMBO J. 16(16): 5098-5112.

291. Yin H, Wang MD, Svoboda K, Landick R, Block SM, Gelles J (1995) Transcription against an appHed force. Science. 270: 1653-1657.

292. Ying GG, Proost P, van Damme J, Bruschi M, Introna M, Golay J (2000) Nucleolin, a Novel Partner for the Myb Transcription Factor Family That Regulates Their Activity. J. Biol. Chem. 275(6): 4152-4158.

293. Zechiedrich EL, Christiansen K, Andersen AH, Westergaard O, Osheroff N (1989) Double- stranded DNA cleavage religation reaction of eukaryotic topoisomerase П: Evidence for a nicked DNA intermediate. Biochemistry. 28: 6229-6236.

294. Zink D, Cremer T, Saffrich R, Fischer R, Trendelenburg MF, et al., (1998) Structure and dynamics of human interphase chromosome territories in vivo. Himi. Genet. 102: 241-251.

295. Zhang Y, Rowley JD (2006) Chromatin structural elements and chromosomal translocations in leukemia. DNA Repair (Amst). 5(9-10): 1282-1297.

296. Zhang Y, Zeleznik-Le N, Emmanuel N, Jayathilaka N, Chen J, Strissel P, Strick R, Li L, Neilly MB, Taki T et al. (2004) Characterization of genomic breakpoints in MLL and СВР in leukemia patients with Х{\\;\в).Genes Ch-omosomes Cancer. 41: 257-265.

297. Zhang Z, Zhu L, Lin D, Chen F, Chen DJ, Chen Y (2001) The three-dimensional structure of the C-terminal DNA-binding domain of human Ku70. J. Biol. Chem. 276(41): 38231-6.

298. Zhou GL, Xin L, Song W, Di LJ, Liu G, Wu XS, Liu DP, Liang CC (2006) Active chromatin hub of the mouse alpha-globin locus forms in a transcription factory of clustered housekeeping genes. Mol Cell. Biol. 26: 5096-5105.

Информация о работе

Рубцов, Михаил Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Релокализация генов-партнеров по незаконной рекомбинации в условиях ингибирования ДНК-топоизомеразы II - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы