Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинантный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе"

< ъ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Франк Людмила Алексеевна

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФОТОПРОТЕИН ОБЕЛИН ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА ОЬеИа 1ощжт\а\ выделение и использование в иммуноферментном

■ анализе

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1997

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН (Красноярск)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Е.С. Высоцкий (Институт биофизики СО РАН)

доктор биологических наук Т.Г. Волова (Институт биофизики СО РАН)

кандидат биологических наук Е.В. Смолина (Красноярский Государственный университет)

Ведущая организация:

Институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Министерства здравоохранения РФ, г. Санкт-Петербург

Защита состоится " ^ " 1997 г. в часов на

заседании Специализированного Совета Д 003.45.01 по защитам диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики СО РАН (660036 г. Красноярск, Академгородок). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан " г

Учеиый секретарь Специализированного Совета, доктор технических наук

А.П.Шевырногов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кальций-зависимые фотопротеины представляют собой устойчивые фермент-субстратные комплексы, состоящие нз полипептидной цепи - апопротеина (около 20 кДа), молекулы кислорода и целентеразина. В присутствии ионов кальция происходит внутримолекулярная реакция окисления целентеразина с образованием апобел-ка, целентерамида и молекулы СОг и испусканием кванта света. Характерной особенностью биолюминесцентной реакции, и фотопротеиновой реакции в том числе, является высокий квантовый выход и низкий уровень шума по сравнению с хемютоминесцентными реакциями. Это позволяет обнаруживать аттомолярные концентрации фотопротеинов и обусловливает перспективность их использования в качестве метки в различных аналитических схемах.

Однако из-за ограниченных количеств природных белков их потенциальные возможности долгое время не были реализованы. Снять эту проблему позволило бы получение рекомбинантных фотопротеинов. Несмотря на то, что к настоящему времени известно около 25 видов люми-несцирующих морских кишечнополостных, обладающих фотопротеиновым типом биолюминесцентной системы, только шесть из них выделены и частично охарактеризованы. Гены только четырех фотопротеинов клонированы и экспрессированы в клетках бактерий. И только для рекомби-нантного фотопротеина акворина разработаны методы выделения и очистки. Полученный рекомбинантный акворин активно и весьма успешно используется как метка в различных анализах. Несомненными преимуществами фотопротеиновых меток являются простота регистрации люминесцентного сигнала, широкий линейный диапазон зависимости люминесценции от концентрации белка, высокая чувствительность и безопасность применения.

В 1992. году в лаборатории фотобиологии Института биофизики

СО РАН был получен другой рекомбинантный фотопротеин обелин из гидроидного полипа Obelia longissima.

Цели и задачи исследования. Целью представленной работы являлось изучение рекомбинантного фотопротеина обелина и исследование возможности его использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе (ИФА).

Выполнение данного исследования требовало решения следующих экспериментальных задач:

1. Разработать метод выделения и очистки рекомбинантного апо-фотопротеина обелина из биомассы трансформированных клеток E.coli, на его основе получить высокоочищенный препарат этого белка и исследовать его основные физико-химические свойства.

2. С помощью химических и генноинженерных методов разработать способы получения модифицированных производных рекомбинантного обелина, пригодных для дальнейшего применения их в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе.

3. Продемонстрировать пригодность полученных производных рекомбинантного обелина для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе и сравнить их с уже известными метками.

На защиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

J. Эффективная технология выделения и очистки рекомбинантного фотопротеина обелина и его основные физико-химические свойства.

2. Методы получения производных рекомбинантного обелина, обладающих биолюминесцентной активностью и способностью встраиваться в иммуноаналитический комплекс.

3. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием меток, полученных на основе рекомбинантного обелина, характеристики которого не уступают, а иногда и превосходят по основным аналитическим

показателям традиционные мепси - пероксидазную и изотопную.

Научная новизна и практическая ценность.

1. Впервые из биомассы трансформированных клеток E.coli в гомогенном виде получен рекомбинантный фотопротеин обелин. Разработана эффективная технология выделения и очистки белка, позволяющая получать гомогенный препарат с выходом около 50%. Исследованы основные физико-химические свойсгва полученного белка: молекулярная масса, спектр поглощения, термостабильность, удельная активность, константа спада люминесценции, квантовый выход.

2. Методами химической модификации получены биотинилиро-ванные производные рекомбинантного обелина, обладающие как био-лю-мннесцентной активностью, так и способностью встраиваться в иммунный комплекс через авидин-биотиновую систему, пригодные для использования в ИФА в качестве биолюминесцентной метки.

3. Сконструирован, впервые выделен в гомогенном виде и охарактеризован химерный белок proZZ-Obe, обладающий биолюминесцентной активностью и аффинностью белка А из Staphiloccocus aureus к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G.

4. С помощью полученных производных обелина проведены ИФА альфафетопротеинов в сыворотке крови человека, иммуноглобулинов кролика, мыши и человека и антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке крови.

5. Проведено сравнение биолюминесцентной фотопротеиновой метки с традиционно используемыми радиоизотопной и пероксидазной.

Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что синтезированные биолюми'несцентные метки, полученные на основе рекомбинантного обелина, обладают высокой чувствительностью, широким линейным диапазоном зависимости люминесцентного сигнала от концентрации белка, простотой и безопастностью процедуры анализа и

не уступают, а иногда и превосходят по этим показателям традиционные метки - пероксидазную и изотопную. Полученные биолюминесцентные метай могут найти широкое применение в области иммунологии и медицинской диагностики.

На основе разработанной в данной работе технологии очистки ре-комбинантного апообелина налажено его мелкосерийное производство.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 1991), III-й Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Москва, 1993), Симпозиуме по биолюминесценции (Гаваи, США, 1993), VI1I-OM Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж, Великобритания, 1994), П-й Международной коференции по клинической хемилюминесценции (Берлин, Германия, 1996), 31-ом Европейском симпозиуме по морской биологии (С. Петербург, 1996), IX-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Вудсхолл, США, 1996), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 91 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (71 источников, в том числе 58 иностранных). Диссертационная работа проиллюстрирована 32 рисунками, содержит 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рекомбинантный апообелин выделяли из клеток E.coli BL21, несущих плазмиду pD02 выращенных в двукратной LB среде, содержащей ампициллин (200 мг/л) при 37°С. Индукцию проводили добавлением

ИПТГ (100 мг/л).

Химерный белок proZZ-Obe выделяли из клеток E.coli С600, содержащих плазмиду pTZZ02, выращенных в стандартной среде LB, содержащей ампициллин и канамицин (по 50 мг/л). Индукцию проводили повышением температуры среды с 30°С до 42°С на 30 мин.

Выращенные клетки осаждали центрифугированием (11000 g, 20 мин). Разрушение клеток проводили при помощи ультразвукового дезинтегратора UD-20 (Techpan,Польша).

Активацию апообелина проводили небольшим избытком синтетического целентеразина (Molecular probes Inc., США) в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl pH 7,0, 500 мМ NaCI, 5 мМ ß-меркаптоэтанола или дитиотреитола, 5 мМ ЭДТА при 4°С не менее 4-х часов.

Биолюминесцентный сигнал обелина в 100 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 10 мМ ЭДТА измеряли с помощью люминометра. (модель БЛМ 8802, СКВ Наука, Красноярск), калиброванного по радиоактивному стандарту Гастингса-Вебера (Hastings, Weber, 1963), сразу после внесения насыщающей концентрации СаСЬ. Одна люминесцентная единица (lu) равна 108 фотонов/сек. Сигнал регистрировали с помощью самописца (LKB, модель 2210).

Люминесцентный сигнал обелина при проведении иммунофер-ментного анализа измеряли с помощью планшетного люминометра Luminoscan v 1.30 (Labsystems, Финляндия).

При очистке белков использовали стандартное хроматографичес-кое оборудование фирм "LKB" и "Pharmacia".

Чистоту белковых препаратов при выделении контролировали электрофорезом в 12,5% ПААГ, содержащем 0,1% SDS, по методу Лэммли (Laemmli, 1970).

Содержание белка в растворах определяли по методу Лоури (Кочетов, 1971).

Твердофазный иммуноферментный анализ проводили в непрозрачных планшетах фирмы Dynatech (США).

В работе использовали IgG кролика, мыши и человека (Sigma, США). Набор реактивов для иммунометрического определения туберкулезных антител (Акватуб) получен от фирмы Аквапаст (Санкт-Петербург, Россия). Высокоочищенный альфафетопротеин (АФП) человека из абортногр материала и аффинно очищенные антитела к АФП (AT) получены Навдаевым А.В (МПП "ДИАС", г. Красноярск). Калибровочные растворы готовили на основе человеческой сыворотки, очищенной от АФП с помощью аффинной хроматографии на антителах к АФП, иммобилизованных на BrCN-сефарозе (Навдаев A.B.).

Определение количества биотиновых групп, введенных в молекулы белков (обелина, пероксидазы хрена, антител на альфафетопротеины) проводили по методу, описанному в работе Грина (Green, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рекомбинантного апообелина. Клеточную пасту трансформированных клеток E.coli суспендировали в пятикратном объеме 20 мМ Трис-HCl pH 7,0 и разрушали озвучиванием (5 х 20 сек, 0°С). Полученную смесь центрифугировали (39000 g, 20 мин) и осадок промывали, ресуспендируя последовательно растворами 20 мМ Трис-HCl, pH 7,0, содержащими: 0,9% NaCl - дважды; 0,1% Тритон Х-100 - дважды; 5 мМ CaCh. Полученный в результате осадок ресуспендировали в 5 кратном объеме 6 М мочевины, содержащей 20 мМ Трис-HCl, рН7 и 5 мМ СаСЬ. Полученную смесь перемешивали при 4°С в течение 15-20 часов и вновь центрифугировали. Супернатант содержал 65-70% от общей активности обелина. Повторная экстракция показала в осадке не более 5% остаточной активности. В Таблице 1 представлены типичные данные по экстракции апообелина из трансформированных клеток Е. coli. Содержание апообелина, подсчитанное по специфической активности белка,

Таблица 1

Распределение люминесцентной активности по фракциям при выделении

апообелийа

Фракция Объем (мл) Активность (отн.ед/мл) % от общей активности

Супернатант после разрушения клеток 50 320 х 10« 26,8

0,9% ЫаС! 68 17,6x10« 2

1% Тритон Х-100 60 46,4 х 10* . 4,7

5 мМ СаСЬ 25 4,3 х 10« 0,2

6 М мочевина 43 920 х 10« 66,3

составляло 17-20 мг на грамм сырой биомассы. Полученный экстракт хроматографировали с помощью системы FPLC на колонке Mono Р HR 5/20 при комнатной температуре. Элюцию веществ с колонки проводили буфером, содержащим 6 М мочевину, 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ СаСЬ, 5 мМ ДТТ в градиенте концентраций NaOAc от 0 до 0,5 М. Скорость элюции 0,5 мл/мин. Фракции, содержащие апобелок объединяли (по специфической активности они содержали 80-90% от нанесенной на колонку), разводили в 10 раз буфером, содержащим 6 М мочевину, 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ СаСЬ, 5 мМ ДТТ и вновь хроматографировали в тех же условиях, без мочевины. В результате получали чистый апобелок с выходом 85-90%. Таким образом выход белка после 2-х стадийной хроматографической очистки составлял 70-80%. При обработке 15-20 г биомассы, хроматографию в 6М мочевине проводили на колонке, DEAE-Sepharose FF (2,5 х 10 см), позволяющей ускорить элюцию до 4 и .более мл/мин. Фракции, содержащие апообелин объединяли и диализо-

вали против буфера, содержащего 6 М мочевину, 20 мМ Трис-НС1 рН7,0, 5 мМ СаСЬ, 5 мМ ДТТ и вновь хроматографировали на колонке Mono Р без мочевины, как описано выше. Процесс очистки контролировали гель-электрофорезом. На Рис.1 приведены электрофореграммы бел-

V !

S S

к

1

! 1*» „t*

\ I f j

5 6 Kfla Электрофореграмма белко-

вых препаратов на этапах выделения апообелина.

1- экстракт 6 М мочевиной из клеток Е. coli до индукции; 2 - экстракт 6 М мочевиной из клеток после индукции; 3 - экстракт 6 М мочевиной; 4 - белковый препарат после хроматографии на DEAE-Sepharose FF; 5 - белковый препарат после хроматографии на колонке Mono Р; 6 - маркерные белки: фосфорилаза Б (94 кДа), БСА (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоксиангидраза (30 кДа), сое- . вый ингибитор трипсина (20кДа).

ковых препаратов, полученных на различных этапах очистки апобелка. Полученный белок гомогенен по данным электрофореза. Молекулярная масса полученного белка - 22,4 кДа, по данным гель-электрофореза. Константа спада биолюминесцентного сигнала 6,6 сек-' (4 сек1, для природного), удельная активность рекомбинантного обелина 6,5 х 1015 квантов на 1 мг белка (4,9 х 1015, для природного).

Определение минимальной концентрации обелина, проводили с помощью люминометра Luminoskan vi.30, помещая в лунки планшета для иммуноферментного анализа по 50 мкл растворов рекомбинантного обелина в 0,01 М Трис-HCl, pH 8,0, содержащих различные концентрации белка. Биолюминесцентный сигнал измеряли сразу после внесения 50 мкл 0,3 М СаСЬ. Время сканирования - 3 секунды. Полученный результат представленный на Рис.2, показывает, что таким образом можно

Рис. 2. Зависимость люминесценции рекомбинантного обе-лина от концентрации белка.

1

10 100

,01 ,1

Концентрация рекомбинантного обелина (нг/мл)

обнаружить до 0,0125 нг/мл обелина. Абсолютное количество рекомбинантного обелина, определяемое таким образом составляет 0,65 пикограмма или 25 амоль. Зависимость люминесценции от концентрации белка оста- ется линейной в интервале, перекрывающем 4 порядка.

Термоинактивацию рекомбинантного обелина проводили инкубируя в 0,01 М Трис-НС1, рН 7,0, 10 мМ ЭДТА при различных температурах. Белок стабилен при 4°С в течение 3-х суток , при 18-20°С в течение суток. При 30°С через час белок теряет 15-20% активности. При более высоких температурах инактивация белка резко ускоряется.

Белок стабилен в процессе лиофилъной сушки из того же раствора с добавлением 10%тригалозы.

Спектр поглощения рекомбинантного обелина. Спектр полученного белка в растворе 20мМ Тт-ЬЮ, рН8,0, 5мМ ЭДТА (0,65 мг/мл) при комнатной температуре содержит полосу поглощения при 270 нм с плечом при 280 нм (Е|мг/мл=0,62), характерную для белковой части молекулы и полосу при 460 нм (Е|мг/мл~0,022) в области поглощения целенте-рэзина.

Модификащш белка для нммуноферментного анализа. Использование ферментативных меток для иммуноанализа предполагает необходимость проведения определенных модификаций этих белков, которые бы обеспечили связывание фермента-метчика с формируемым иммуноком-плексом. При этом модификация не должна приводить к значительной потере специфической активности ферментов. Существующие методы можно разделить на две основные группы - химические и генноинженер-ные. В своей работе мы исследовали возможности модификации обелина с помощью обоих методов.

Получение биотинилнрованнмх производных рекомбинантиого обелина (Obe~Bio). Для введения биотиновых групп нами был выбран сук-цинимидный эфир D-биотинилил-е-аминокапроновой кислоты, реагирующий с аминогруппами, расположенными на внешней поверхности молекулы обёлина. В результате проведенных исследований нами были оптимизированы условия биотинилирования: молярное соотношение белок : реагент 1:5, время реакции 30 мин, 0,1 М бикарбонатный буфер pH 9,0. При этом активность белка сохранялась на 70% и на каждую молекулу обелина "пришивалось" по 2 молекулы биотина. Проведенные нами модельные эксперименты по определению биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (Bio~BSA), сорбированного на поверхности лунок для ИФА, через авидиновый (Avi) мостик с помощью Obe~Bio и биотинилированной пероксидазы хрена (HRP~Bio) (схемы 1 и 2) показали разницу в чувствительности анализа почти на 3 порядка. BSA~Bio + Avi + Obe~Bio + СаСЬ -> свет (1) BSA~Bio + Avi + HRP~Bio + о-фенилендиамин -> оранж. окр. (2) Получение коньюгатов обелина с антителами на альфафетопротеин (AFP). Химическую "сшивку" обелина с антителами (AT) проводили с использованием различных конденсирующих агентов - диметилсуберими-дат, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитиопропионат) (SPDP), 4-малеими-

дометилциклогексилкарбоновой кислоты сукцинимидный эфир (БМСС). В результате проведенных экспериментов целевые коньюгаты (АТ~ОЬе) удалось получить только с помощью БРЮР и БМСС, с очень низким выходом (не более 0,5%, по активности) Полученные коньюгаты после выделения гель-фильтрацией на иИп^е! АсА-34 использовали для определения альфафетопротеинов в стандартных сыворотках (схема 3).

АТ + АФП + АТ~ОЬе + СаС12 -> свет (3)

Из полученных результатов (Рис.3) видно, что полученные коньюгаты обладают как иммуноглобулинсвязывающей так и биолюминесцентной активностью и могут быть использованы в качестве меток, однако низкий выход при их получении определяет необходимость дальнейших исследований по оптимизации условий синтеза.

0 20 40 60 80 100 Концентрация АФП (нг/мл)

0 20 40 60 80 100 Концентрация АФП (нг/мл)

Рис. 3. Зависимость люминесценции коньюгата обелин-антитело от концентрации АФП. Слева - коныогат получен с помощью SPDP, справа - с помощью SMCC.

Получение химерного белка proZZ-Obe. Сконструированный нами-химерный белок содержал обелиновый домен и синтетический домен ZZ, представляющий собой удвоенный иммуноглобулннсвязывающий фрагмент белка А из Staphilococcus aureus (Lowenadler at el.,1987). Структура

этого домена представляет собой альфа-спираль, в состав которой не входят цистеиновые остатки, что исключает побочные реакции с цистеи-новыми остатками обелинового домена.

Плазмида pTZZ02, содержащая ген фьюжин белка была сконструирована и экспрессирована в клетки E.coli Илларионовой В.А. (Frank et al., 1996). Несмотря на то, что proZZ-обелин содержит сигнальный пептид белка А, обеспечивающий перенос белка через цитоплазма-тическую мембрану, в питательной среде мы обнаружили не более 2% белка. Экстракцию целевого белка из клеточной пасты проводили после ультразвукового дезинтегрирования в 20 мМ Трис-HCl рН 8,0, содержащем 500 мМ NaCl при 0°С. Полученную смесь центрифугировали, су-пернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 2 М мочевине и • выдерживали при 4°С в течении ночи. Полученную смесь вновь центрифугировали, осадок суспендировали в 6 М мочевине и выдерживали при 4°С при периодическом встряхивании. Через 10 часов смесь центрифугировали, полученный супернатант содержал окрло 65-70% химерного белка (от суммарной активности). Из 1 г сырой биомассы было выделено до 12 мг химерного белка (по биолюминесцентной активности). По-лучен-ный экстракт разбавляли в 10 раз буфером, (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 5мМ ДТТ, 5 мМ ЭДТА), добавляли целентеразин и выдерживали при 4° С ночь. Полученную смесь хроматографировали в колонке с IgG-Agarose, последовательно промывая ее 3-я объемами 50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20, 5 мМ ЭДТА и 3-я объемами 5 мМ ацетата аммония рН 5, 5 мМ ЭДТА. Химерный белок элюировали 150 мМ АсОН рН 3,5, 5 мМ ЭДТА. Элюаты немедленно нейтрализовали 500 мМ Трис-HCl рН 8,0. Процесс очистки контролировали с помощью гель-электрофореза (Рис.4). Выделенный белок представлял собой два полипептида с молекулярной массой 41,7 и 43,6 кДа. Предполагается, что пептид с меньшей массой является следствием час-

тичного N-концевого протеолиза белка в клетках Е.соИ (НеНеЬит е1 аК, 1989). Специфическая активность полученного белка - 8,5 х 1015 квантов на 1 мг белка. Константа спада биолюминесцентной реакции - 5.9 сек '. Определение зависимости люминесцентного сигнала от концентрации химерного белка проводили в лунках планшета для ИФА с помощью

1

Ц|| 1ИИГ

г-. . ., .

Ж??

-'.гаи»'

•92.5

■67

■45

^^ с кГ)я Электрофореграмма

«я»», , белковых препаратов на эта-

пах вьщеления. химерного белка.

1,2 - лизаты клеток (2% БОБ, 100°С, 3 мин.) до и после температурной индукции, соответственно; 3 - экстракт 29 6 М мочевиной; 4 - фракция после IgG-Agaгose; 5 - калибровочные белки: фосфо-рилаза (92,5 кДа), БСА (67 кДа), яичный альбумин (45 кДа), карбоксиангидраза (29 кДа).

люминометра Ьшшповсап VI.30, как это описано для рекомбинантного обелина. Полученный результат приведен на Рис. 5. Концентрация белка

1000

,1

Концентрация гг-ОЬе (нг/мл)

Рис. 5. Зависимость люминесценции от концентрации химерного белка.

в последней лунке составляла 0,25 нг/мл. Абсолютное количество белка составляло 0,025 нг, что равно 0,6 фемтомолям.

IgG-связывающую способность proZZ-обелина в биолюминесцентном иммуноанализе определяли модельными экспериментами по связыванию иммуноглобулинов кролика, мыши и человека. В лунки планшета для ИФА вносили по ЮОмкл растворов иммуноглобулинов разной концентрации в PBS (0,1 M фосфатный буфер рН 7,0, 0,15 M NaCl), сорбировали при 4°С ночь и промывали (трехкратно, PBS, 0,05% Tween-20). Незанятые места на поверхности лунок блокировали обработкой 0,5% раствором BSA в PBS, в течение часа при 37°С. После промывки в лунки вносили по 100 мкл раствора химерного белка (0,1 M Трис-HCl рН 8; 5 мМ ЭДТА) выдерживали 1,5-2 часа при 4°С и промывали раствором, со-" держащим 5 мМ ЭДТА. Люминесцецию связавшегося химерного белка измеряли сразу после внесения 0,3 M раствора СаСЬ. Результаты, приведенные на Рис. 6, показывают, что полученный белок обладает как биолюминесцентной, так и иммуноглобулинсвязывающей активностью.

Î 1000

Рис. 6. Зависимость люминесценции химерного белка от концентрации иммуноглобулинов человека (А), кролика (•) и мыши (□).

,01 ,1 1 10 IgG, мкг/мл

Метка обладает определенной универсальностью, поскольку фрагмент ZZ эффективно связывается с иммуноглобулинами G разных организмов.

Использование биотинилироваиного обелина для ИФА альфафето-протеииов. Анализ содержания АФП в сыворотке крови крайне важен при диагностике опухолевых заболеваний, а также патологий беременности. Схема проведенного нами твердофазного биолюминесцентного иммуноанализа вылядит следующим образом:

AT +АФП + AT-Bio +Avi + Obe-Bio +CaCh -> свет (4) В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора антител на АФП (AT) (5 мкг/мл) в PBS и сорбировали 1 час при 37°С. После промывки PBS, содержащим 0,1% Tween-20 (буфер А), блокировали незанятые места на поверхности лунок 0,5% раствором BSA при 4°С, 14 часов. После промывки буфером А в лунки вносили по 100 мкл калибровочных, тестовых или контрольных растворов АФП и инкубировали при 37°С час. Последовательные инкубации биотинилированных антител (AT~Bio) (2,5 мкг/мл) и авидина (Avi) (2,5 мкг/мл) проводили аналогично. Obe~Bio (1,5 мкг/мл) инкубировали при комнатной температуре в течение 1-1,5 часов. При последней промывке буфер А содержал 5 мМ ЭДТА. Люминесценцию связавшегося Obe~Bio обнаруживали с помощью Luminoscan vi.30, как описано ранее. Рис. 7А показывает зависимость свечения от концентрации АФП. Эти результаты сравнили с результатами радиоиммунного анализа (РИА) АФП (Рис.7Б), проведенного Петуниным А.И. и Навдаевым A.B. (МПП "ДИАС", г. Красноярск). Каждая точка на обоих рисунках представляет усредненный результат 10 независимых определений. Коэффициент вариации по кривой колебался в пределах 5-10% для обоих вариантов анализа. Из рисунков видно, что наблюдается линейная зависимость биолюминесцентного ответа от концентраций АФП во всем рассматриваемом диапазоне от 200 до 5 нг/мл. В случае радио-

0 50 100 150 200 250 АФП (нг/мл)

60000

о 40000 Я

е

& 20000

100 200 АФП (нг/мл)

Рис. 7. Иммуноаналнз альфафегопротеинов в сыворотке человека с помощью люминесцентной (А) и радиоизотопной (Б) меток. .

изотопной метки линейная зависимость сигнала от концентрации АФП наблюдается в диапазоне от 50 до 5 нг/мл.

Кроме того аналитические характеристики иммунометрического определения АФП исследовали по основным параметрам, рекомендованным государственным Институтом по стандартизации и контролю лекарственных средств. Полученные характеристики представлены в Таблице 2. Абсолютная чувствительность анализа составила 0,08-0,2 нг АФП для РИА и 0,2-0,25 нг АФП для биолюминесцентного.

Таким образодо, полученные результаты показывают, что биолюминесцентный вариант анализа по основным параметрам не уступает традиционному РИА. При этом предложенная схема биолюминесцентного анализа, в отличие от РИА, универсальна по отношению к выбору анализируемых антигенов, т.е. с помощью полученной метки можно анализировать любые антигены через биотинилированные производные соответствующих антител. Полученная метка устойчива при хранении в

0

Таблица 2

Основные аналитические характеристики иммунометрического определения АФП.

Метка

изотопная биолюминесцентная

Процент связывания метай в отсутствии АФП(фон) 1.5% 0,5%

Чувствительность (нг/мл) 0,8-2,2 2-2,5

"Открытие"* 90-110% 98-105%

♦"Открытие"- тест на определение концентрации в пробе, полученной при смешивании проб с известным содержанием АФП.

замороженном состоянии не менее полугода и не теряет активности при многократном замораживании-оттаивании. В растворе (10 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 5 мМ ЭДТА) активность сохраняется при 4°С не менее 2-х недель. Кроме того биолюминсцентные метки безопасны для здоровья персонала.

Использование белка рго2Х-ОЪе для определения антител к возбудителю туберкулеза. Определения антител (АТ) к возбудителю туберку-ле-за (АГ) в стандартных сыворотках проводили по схеме 5:

АГ + АТ + ргогг-ОЬе + СаСЬ-> свет (5)

Анализ туберкулезных антител в стандартных сыворотках проводили в соответствии с инструкцией фирмы Акватуб (С. Петербург). Серийные разведения контрольной ангисывортки (от 50 до 3 иг/мл, по 100 мкл) вносили в лунки иммунологического планшета, сенсибилизированные туберкулезным антигеном, выдерживали 0,5 час при 37°С и промывали как описано ранее. Затем в лунки вносили растворы химерного белка или коньюата белок А-пероксидаза хрена и инкубировали, соответственно, при 4°С в течение 1-1,5 часов или при 37°С 0,5 часа. После промывки биолюминесцентный сигнал определяли как описано выше.

Активность связавшегося пероксидазного коньюгата определяли в соответствии с рекомендациями! Акватуб, колориметрически, используя ор-то-фенилендиамин в качестве субстрата, измеряя оптическую плотность полученных, в лунках растворов при 490 нм. Полученные результаты приведены на Рис.8. Можно видеть линейную зависимость между кон-

0 20 40 60 Концентрация антител к возбудителю туберкулеза (нг/мл)

Концентрация антител к возбудителю туберкулеза (нг/мл)

Рис. 8. Иммуноанализ антител к возбудителю туберкулеза с использованием люминесцентной (А) и пероксидазной меток (Б).

центрацией АТ в пробе и биолюминесцентным сигналом рго/Н-ОЬе, в отличие от пероксидазного ответа.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработана схема выделения и хроматографической очистки рекомбинантного йпообелина, позволяющая получать гомогенный апо-белок с выходом 50%, что составляет около 10 мг белка из 1 г сырой биомассы трансформированных клеток Е.соН.

2. Определены основные характеристики рекомбинантного обели-на. Полученный белок обладает молекулярной массой 22.4 кДа. Удельная активность обелина составляет 6,5 х Ю15 квант на 1 мг белка; квантовый выход - 0,24, константа псевдопервого порядка спада люминес-

ценции - 6,6 сек-'.

3. Разработан способ получения биотинилированных производных обелина. Показано, что использование при модификации 5-ти кратного избытка N-гидроксисукцинимидного эфира D-биотшшл-е-капронсвой кислоты в течении 30 минут и при рН 9 позволяет сохранить около 70% исходной активности белка. При этом на одну молекулу обелина "пришивается" 2 биотиновых фрагмента. Полученная биолюминесцентная метка стабильна при хранении и не обладает токсичностью.

4. С использованием биотинилированных производных обелина проведен иммуноферментный анализ альфафетопротеинов в сыворотке крови человека. Показано, что биотиншшрованные производные обелина не уступают по своим основным аналитическим характеристикам радиоизотопной метке и позволяют определять альфафетопротеины в концентрации 2-2,5 нг/мл.

5. Разработан метод выделения и очистки химерного белка proZZ-Obe. Гомогенный химерный белок был получен с выходом 48%, что составляет 6 мг из одного грамма сырой биомассы E.coli.

6. Определены основные характеристики химерного белка proZZ-Obe, обладающего иммуноглобулинсвязывающей способностью белка А из S. aureus и люминесцентной активностью обелина. Полученный химерный белок устойчив при хранении и представляет собой два полп-пептида с молекулярной массой 41,7 и 43.6 кДа. Удельная активность химерного белка proZZ-Obe составила 8,5 х 1015 квант на 1 мг белка; квантовый выход - 0,59, константа пссвдопервого порядка спада люминесценции - 5,9 сек Показано, что химерный белок эффективно связывается с иммуноглобулинами мыши, кролика и человека.

7. С помощью химерного белка проведен иммуноаналнз туберкулезных антител в стандаргных сыворотках. Показано, что полученный химерный белок proZZ-Obe, использованный в качестве биолюминес-

центной метки, позволяет определять туберкулезные антитела в концентрации 3 нг/мл, а по сравнению с пероксидазной, обладает более широким линейным диапазоном и более прост в применении.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ:

1. Франк Л.А., Бондарь B.C., Тюлькова H.A., Высоцкий Е.С.. Са2+-активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе,- Препринт N113 Б, Красноярск: Изд-во ИФ СО РАН, 1992,22 с.

2. Frank L.A., Markova S.V., Illarionova V.A., Illarionov . B.A., Vysotski E.S. Calcium-activated photoprotein obelin derivatives in immuno-assay:perspectives.- Bioluminescence and Chemiluminescence. Fundamentals and Applied Aspects. Eds. A.K.Campbell, LJ.Kricka and P.E. Stanley.-1994.-John Wiley & Sons, Chichester/ New York/ Brisbane/ Toronto/ Singapure. -P.249-252.

3. Vysotski E.S., Trofimov, C.P., Bondar' V.S., Frank L.A., Markova S.V., Iüarionov B.A. Mn2+-activated luminescence of photoprotein obelin.-Archives of Biochemistry and Biophysics.-1995,- V.316.N1.-P.92-99.

4. Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Fusion protein proZZ-Obelin as a label in bioluminesceht immunoassay.-Biochemical and Biophysical Research Communication.-1996,- V.219.N2.-P.475-479.

5. Франк Л.А., Высоцкий E.C., Петунин А.И., Навдаев A.B. Са2+-активируемый фотбпротеин обелин как метка в иммуноферментном анализе.- Иммунология.- 1997.-С.59-61.

6. Frank L.A., Vysotski E.S. Bioluminescent immunoassay for alpha-fetoprotein using the Ca++-activated photoprotein obelin.- Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons. Eds. J.W. Hastings, L.J.Kricka and P.E.Stanley.-1997.-John Wiley & Sons, Chichester/ New York/ Brisbane/Toronto/ Singapure. -P.435-438.

/fia*^---