Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция NMDA-рецепторами функций Т-лимфоцитов человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция NMDA-рецепторами функций Т-лимфоцитов человека"

На правах рукописи

ЗАЙНУЛЛИНА ЛИАНА ФАНЗИЛЕВНА

РЕГУЛЯЦИЯ »Ш>А-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г ч ноя 2013

Уфа-2013

005540565

005540565

Работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и геиетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Вахитова Юлия Венеровна Официальные оппоненты:

Веселов Станислав Юрьевич

Доктор биологических наук

Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский Государственный Университет

Гейн Сергей Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится « » декабря 2013 г. в «_» часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра PAII по адресу: Уфа, проспект Октября, д. 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: vak.ed.gov.ru; ibg.anrb.ru e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «"1$ » 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Нейромедиаторы традиционно рассматриваются в качестве молекул, секретируемых нервными окончаниями и влияющих на те или иные функции нервных клеток. Вместе с тем появляется все больше доказательств функционирования нейромедиаторной системы глугамата на периферии (Gill, 2001).

На сегодняшний день в клетках иммунной системы обнаружены оба класса глутаматных рецепторов - метаботропные и ионотропные (mGluR и iGluR), а также система транспортеров медиатора в клетку из внешней среды (Pacheco, 2007). Полагают, что глутамат играет определенную роль в иммунорегуляции в качестве нейро-иммуномедиатора (Levite, 2012). Считается, что глутамат, связываясь с метаботропными и ионотропными рецепторами на мембране иммунокомпетентных клеток, принимает участие в регуляции пролиферации (Lombardi, 2004), секреции цитокинов, в механизмах дифференцировки субпопуляций Т-хелперов (Gao, 2011), в контроле клеточного цикла и апоптоза (Lombardi, 2001), изменения мембранного потенциала клеток (Poulopoulou, 2005), в усилении образования свободных радикалов (Boldyrev, 2004), в интегрин - опосредованной адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса (Ganor, 2003). На наш взгляд, заслуживают внимания данные об участии iGluR и mGluR в регуляции кальциевого гомеостаза в активированных Т-клетках (Lombardi, 2001; Miglio, 2005). Между тем, на данный момент имеются лишь единичные работы, в которых показана экспрессия субъединиц NMDA-рецепторов в иммунокомпетентных клетках (Miglio, 2005; Kvaratskhelia, 2009; Mashkina, 2010). В основном авторы ограничиваются тем, что демонстрируют представленность только GluNl-субъединицы. Однако известно, что функционально-активные NMDA-рецепторы формируются в результате ассоциации GluNl-субъединицы с представителями GluN2- и/или GIuN3-ceMeñciB. Таким образом, вопрос о субъединичном составе NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека на данный момент остается открытым. Кроме того, несмотря на накопленный экспериментальный материал, механизмы стимуляции и регуляции активности NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах остаются в значительной степени не изученными. Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование структуры NMDA-рецепторов и их роли в регуляции функций Т-лимфоцитов человека. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать и локализовать субъединицы NMDA-рецепторов в Т- лимфоцитах человека;

2. Изучить возможное участие NMDA-рецепторов в механизмах депо -зависимого входа Са2+ в Т-лимфоциты;

3. Изучить вклад NMDA-рецепторов в регуляцию пролиферации, прогрессии

клеточного цикла и апоптоза Т-лимфоцитов, активированных через Т-клеточный комплекс;

4. Исследовать вовлеченность КМИА-рецепторов в регуляцию процесса дифференцировки Т-лимфоцитов и секреции цитокинов;

5. Выявить пути сигнальной трансдукции, сопряженные с ЫМОА-рецспторами Т-лимфоцитов человека.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование субъединичного состава КМОА-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. С применением трех методических подходов идентифицированы и локализованы субъединицы КМОА-рецепторов в этом типе клеток. Показано, что при активации Т-лимфоцитов происходит изменение субъединичного состава КМОА-рецепторов: ИиШЛЛиШВ и/или 01иЫ2П в нестимулированных клетках на ОЬШЛЗЬША и/или С1иК2В в ТСЯ-сгимулированных Т-лимфоцитах. Установлено, что ИМОА-рецепторы являются компонентами депо - зависимого входа Са2+ в Т-лимфоциты. Показано участие глутаматных рецепторов КМВА подтипа в регуляции апоптоза и клеточного цикла активированных Т-лимфоцитов. Впервые выявлена вовлеченность ЫМПА-рецепторов в регуляцию пролиферативного ответа Т-лимфоцитов при активации последних через Т-клеточный комплекс. Проведенные исследования дополнили имеющиеся сведения об участии ММОА-рецепторов в контроле секреции про- и противовоспалительных цитокинов и регуляции процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. В работе впервые охарактеризованы протеинкиназные каскады, участвующие в передаче сигнала от ЫМОА-рецепторов в клетках иммунной системы. Научно-практическая значимость. Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы - изучению механизмов нейроиммунного взаимодействия. В ходе выполнения данной работы получены новые данные о структуре К\ГОА-рецепторов Т-лимфоцитов человека и их участии в механизмах регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток, что позволяет, по крайней мере, частично, выявить общие закономерности взаимодействия нервной и иммунной систем. Расшифровка механизмов этого взаимодействия имеет как фундаментальное, так и прикладное значение, связанное, главным образом, с совершенствованием диагностики и формированием новых подходов к фармакотерапии воспалительных нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, изучение механизмов активации и регуляции ЫГУША-рецспторов в Т-лимфоцитах человека позволяет расширить теоретические знания об особенностях сигнализации в электрически невозбудимых клетках.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены па XIV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - Наука

XXI века" (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа,

2011), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011, 2013), III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург,

2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), IV Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2012), XXV Международной зимней молодёжной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2013), VI Российском Симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе, 1 статья в журнале из перечня ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3-6), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 234 наименования, в том числе 229 работ иностранных авторов. Работа изложена на 15Z страницах и содержит 27 рисунков и 7 таблиц.

Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Салимгарееву М.Х., аспирантов Фаткуллину У.Ш. и Кудоярова Э.Р. за помощь при выполнении и обсуждении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использовали Т-лимфоциты периферической венозной крови условно-здоровых доноров-добровольцев. Все доноры давали письменное добровольное согласие на участие в исследовании. Работа получила одобрение в Локальном этическом комитете при ФГБУН ИБГ УНЦ РАН. Забор крови (20 мл) осуществляли из локтевой вены в амбулаторных условиях. Выделение мононуклеаров проводили по стандартной методике градиентного центрифугирования в плотности фиколла (1.077 г/см3) (Boyum, 1968). Культивирование лимфоцитов проводили в полной среде культивирования RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США), 2x10"3 М L-глутамина (или без L-глутамина) и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (ПанЭко, Россия). Активацию клеток проводили инкубацией с фитогемагглютинином (ФГА; 10 мкг/мл; ПанЭко, Россия), моноклональными антителами (МКА) против е-

субъединицы CD3 (aCD3 МКА, клон ОКТЗ; eBioscience, США), антителами против CD28 (aCD28 МКА, клон CD28.2; BD Phanningen™, США), рекомбинантным IL-2 (15 нг/мл; Invitrogen, США) в течение 24-72 ч. Участие NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-клеток устанавливали с помощью неконкурентного антагониста (+)-МК-801 (10"4 М; Tocris, США). Для оценки пролиферации активированных Т-лимфоцитов использовали набор «CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit» (Invitrogen, США). Все процедуры проводили в соответствии с протоколом производителя. Анализ клеточного цикла осуществляли на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США) после окрашивания клеток пропидием йодидом (PI). Численную обработку гистограмм проводили с помощью модуля для оценки клеточного цикла и пролиферации программы FCS Express 4.0 (De Novo Software, Канада). Характеристику апоптотических событий проводили с помощью набора «Annexin V-FITC Kit» (Beckman Coulter, США) в соответствии с протоколом производителя. Измерение уровня цитокинов проводили с помощью коммерческих наборов для иммуноферментного анализа «ИФА-1Ь6», ИФА-ILIO», «ИФА-TNFa», «ИФА-INFy» (Цитокин, Россия). Оптическую плотность образцов измеряли на мультипланшетном флуориметре EnSpire® Multimode Plate Readers (Perkin Elmer, США) при 450 нм и референсной длине волны 650 нм. Для измерения концентрации внутриклеточного Са2* Т-лимфоциты ресуспендировали в безкальциевом буфере (1* PBS, 1.1x10 s М глюкозы, 5*10"3 М Хепес, 2*10"3 М пробенецида, рН 7.4.), добавляли 2х10"6 М Са2+-индикатора Fluo-4AM и 0.02% плюроновой кислоты (Invitrogen, США) и инкубировали в темноте 20 мин при 30°С. Анализ данных о динамике уровня Са2+ проводили с помощью кинетического модуля программы FCS Express 4.0 (De Novo Software, Канада). В качестве положительного и отрицательного контролей, необходимых для расчета концентрации ионов кальция, использовали растворы иономицина (2.5* 10"5 М) и ЭГТА (1 х 10 2 М). Содержание фосфорилированных форм протеинкиназ изучали методом проточной цитофлуориметрии с использованием антител к р-р44/42 (ERK 1/2), pSAPK/JNK 1/2, р-р38, pPKCG, pCaMKII, pGSK3|3 (разведение 1:200; Cell Signaling, США). Анализ содержания протеинкиназ проводили по среднему геометрическому гистограммы флуоресценции. При изучении поверхностной экспрессии субъединиц NMDA-рецепторов клетки ресуспендировали в 100 мкл блокирующего буфера (lx PBS + 0.5% БСА или lx PBS, 2% глицина, 2% БСА, 0.2% желатина, 5х10'2 М NH4C1, рН 7.4) и инкубировали 30 мин на льду. Далее добавляли первичные антитела к субъединицам NMDA-рецепторов (60 мин на льду). В качестве отрицательного контроля использовали изотопические антитела, рекомендованные производителем (табл. 1). В качестве маркера плазматической мембраны использовали антитела к

CD45, меченные комплексом фикоэритрин - техасский красный (ECD) (разведение 1:20; Beckman Coulter, США). Клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом 10 мин при 37°С и окрашивали вторичными антителами anti-mouse/rabbit IgG (H+L), F(ab')2 - Alexa Fluor® 488/594 (разведение 1:200) в течение 30 мин на льду. При внутриклеточном окрашивании субъединиц NMDA-рецепторов клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом в течение 10 мин при 37°С. Плазматическую мембрану пермеабилизовали 0.1%-ным Triton-XlOO в течение 10 мин на льду. В дальнейшем клетки окрашивали описанным выше способом. В качестве маркера эндоплазматического ретикулума (ЭПР) использовали антитела к кальнексину (5 мкг/мл; Abeam, США). Клетки рассаживали на предметные стекла, покрытые поли-Ь-лизином (0.01%). Препарат обрабатывали реагентом Mowiol® 4-88 с добавлением 0.1%-ого р-фенилендиамина. Изображения получали на конфокальном микроскопе Axio Observer ZI, оснащенном лазерным сканирующим модулем LSM 5 EXCITER VarioTwo RGB (Carl Zeiss, Германия). Для измерений использовали объектив Plan-Apochromat 63х/1,4 Oil Die М27.

Таблица 1

Список антител к субъединицам NMDA-рецепторов, использованных в работе

Антитела Изотип Локализация эпитопа Производитель, № по каталогу

GluNl IgG2a Экстраклеточная петля между III и IV трансмембранными доменами Invi trogen, 32-0500

GluN2A IgGl 1099-1213 амк -цитоплазматический домен LSBio, LS-C16900

GIuN2A IgG N-концевая последовательность полипептндной цепи Invitrogen, 480031

GluN2B IgG2b N-концевая последовательность полипептидной цепи (20-271 амк ) Abeam, ab93610

GluN2C IgG N-концевая последовательность полипептидной цепи (25-130 амк) Abeam, abllO

GluN2D IgG N-концевая последовательность полипептидной цепи (268-386 амк) Santa Cruz, sc-10727

GluN3A IgG 782-812 амк -цитоплазматический домен Lifespan Biosciences, С166679

Суммарную РНК выделяли с помощью коммерческого набора «Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit» (Zymo Research, США). кДНК получали из 0.5-5 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием 0.5 мкг oligo(dT)12-18-праймеров или «случайных» праймеров (9-меры) и 40 ед. акт. обратной транскриптазы RevertAid™ Reverse (Thermo Scientific, США). Анализ уровней мРНК проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе iQ™5 Multicolor RealTime PCR Detection System (BioRad, США). В качестве внутреннего контроля был использован ген HPRT1. Изменения в уровнях экспрессии генов

рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы REST 2005 v.1.9.9 (Corbertt Research, США). Выделение тотального клеточного лизинга (10-12 х L О6 клеток) проводили стандартным методом (Уап, 1995). Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ) с 0.1%-ным ДЦС-Na в линейном градиенте акриламида (6 - 16 %). Электроперенос белков осуществляли с использованием оборудования Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell, Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer Cell (BioRad, США). Все операции выполняли в соответствии с инструкцией производителя. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в рамках стандартного пакета методов статистического анализа Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, США), GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, США), применяя непараметрический /-критерий Вилкоксона. Эксперименты проводили в 5-7 биологических повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация и локализация субъединиц NMDA-рецепторного комплекса в Т-лимфоцитах человека

Изучение представленности мРНК генов, кодирующих субъединицы NMDA-рецепторов, а также оценку качественного и количественного изменения относительного уровня мРНК исследованных генов в стимулированных Т-лимфоцитах проводили методом ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Согласно полученным нами данным, в Т-лимфоцитах детектируется мРНК генов, кодирующих GluNl (GRIN1), GluN2A (GRIN2A), GluN2B (GRIN2B), GluN2C 0GRIN2C), GluN2D (GRIN2D), GluN3A (GRINЗА) и GluN3B (GRIN3B) субъединицы (рис. 1).

500 л .о. 100 П.О.

Рис 1. Представленность мРНК генов, кодирующих субъединицы NMDA-peцeптopoв в покоящихся и аСВЗ/аС028-стимулированных Т-лимфоцитах (2.5/1.25 мкг/мл, 24 часа), «к» - контрольная группа нестимулированных Т-лимфоцитов; «аСО» - активированные клетки; НРЯТ1 - ген «домашнего хозяйства»; М - ДНК-маркер (100-3000 п.о.). На рисунке представлены данные одного из трех независимых экспериментов.

При сравнительном анализе относительных уровней экспрессии в активированных Т-лимфоцитах нами было показано, что наиболее представленными являются мРНК генов, кодирующих ЯиМ-, С1иЫ2С- и С1иЮА-субъединицы, тогда

как гены, кодирующие субъединицы СТиША- и СТиШВ-, экспрессируются на более низком уровне (рис. 2).

Рис. 2. Изменение уровня мРНК генов, кодирующих субъединицы NMDA-рецепторов, при активации Т-лимфоцитов через Т-клеточный комплекс. Клетки инкубировали в присутствии аСОЗ/аСВ28 МКА (2.5/1.25 мкг/мл, 24 часа). В контрольной группе клетки культивировали без стимулятора. Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия атш оты2А еяшв аяшс втнго ваюл етнзв Вилкоксона (п=5: * - р<0,05).

Сборка NMDA-рецепторного комплекса и его локализация в клетке являются строго регулируемыми процессами (Rao, 1997; Tovar, 1999). Показано, что единичные субъединицы NMDA-рецепторов подвергаются деградации в том случае, если не будет образован рецепторный комплекс (Fukaya, 2003). Поэтому, несмотря на наличие мРНК генов, кодирующих субъединицы изучаемого рецептора в Т-лимфоцитах человека, необходимо доказать наличие соответствующих белков. Как следует из рис. 3, GluNl-, GluN2A-, GluN2B-, GluN2C-, GluN2D-, GluN3A-субъединицы NMDA-рецепторов детектируются как в покоящихся, так и в активированных Т-лимфоцитах.

GluNl

GIUN2A

GluN2B

контроль aCD3/aCD28 контроль aCD3/aCD28 контроль aCD3/aCD28

103 кДа (ИН| вНМЙ) 180 кда г; --. ■■■ 166 Kfla¡j|

GluN2C

GluN2D

контроль aCD3/aCD28 контроль aCD3íaC028

140 кДа тип.. ~Ц>М.Д|п 165 кДа ¡

GluN3A

контроль «CD3/aCO20

Рис. 3. Вестсрн-блот анализ субъединиц ЫМОА-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. Клетки активировали аС03/аС028 (2.5/1.25 мкг/мл, 56 часов), в контрольной группе клетки инкубировали в отсутствии стимуляции. Содержание субъединиц КМОА-рецепторов определяли в 200 мкг тотального клеточного лизата. На рисунке представлены данные одного из трех независимых экспериментов.

С использованием метода конфокальной микроскопии мы детектировали как внутриклеточную (рис. 4А), так и мембранную локализацию (рис. 4Б) субъединиц КМПЛ-рсцеитороп в нестимулированных и аСБЗ/С028-активированных Т-лимфоцитах.

С1и№

аи№А

С1иЫ2В

\дО контроль аС 03/28

О' О

° О

о О

1?., °

С1иЫ2С

1дв контроль аСОЗ/28

-

о О

о О

ЙЙШЙ Г яйн 1

С1иЫ1

|дв контроль аСОЗ/28

о О

о о

о о

1дО контроль аСР3128

О <9

О 0

о р

в1иЫ20

1дС контроль аСОЗ/28

■ о в

■ о в

о в

43 111

С1иЫ2А

1дй контроль аС03(28

/ ч

о 0

о 0

ШЗД I НВ

то контроль ■ аСОЗ/28 В

и 0 О

я о О

- • . А'"1!5'

вШЫЗА

1дО контроль аСЭЗ/28

о ©

о О

о о

0\иЫ2В

1дС контроль аСОЗ/28

о 0

о 0

щ. й -

GluN2C

GluN2D

Рис. 4.

(А) Локализация субъсдиниц NMDA-рецепторов на ЭПР Т-лимфоцитов. Нестимулированные (контроль) и aCD3/aCD28-активированные Т-лимфоциты (aCD3/aCD28 МКА (2.5/1.25 мкг/мл; 56 часов) были пермеабилизованы и окрашены антителами против GluN-субъединиц (зеленый) и маркера ЭПР - капьнексина (Спх) (красный).

(Б) Локализация субъединиц NMDA-рецепторов на

плазматической мембране Т-лимфоцитов.

Клетки были окрашены антителами против GluN-субъединиц (зеленый) и маркера плазматической мембраны - CD45 (красный). Объектив Plan-Аро 63х/1.4 Oil DIC М27; функция ROI. Для каждой из субъединиц представлены данные одного из трех независимых экспериментов.

О о

о о

Ш! i

г >

О о

о о

Ь, ' У

С помощью метода проточной цитофлуориметрии в контрольной группе нестимулированных клеток нами обнаружен незначительный уровень 01иК' 1-, СТиЮС, СЛиШО-субъединиц. При этом представленность ИиША- и, в значительной степени, СТиШВ-. ИиЮ А-субъед ин иц находится на высоком уровне (рис. 5А). Стимуляция клеток через Т-клеточный комплекс приводит к увеличению содержания С1иЫ1-, С1и№А-субъединиц в 5 и 2.5 раза, соответственно. Кроме того, детектируется повышение внутриклеточной экспрессии субъединиц в №N2 и 01и№-семейств, в среднем, в 2 раза по отношению к контрольному уровню (рис. 5Б).

GIUN1 GluN2A GluNÍB GluN2C GluN20 G!uN3A

GluN1 GluN2ñ GluN2B GluN2C GIUN2D GluN3A

Рис. 5. Внутриклеточная экспрессия субъединиц ЫМОА-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. (А) относительный уровень белка в нестимулированных Т-лимфоцитах, рассчитанный по отношению к изотипическому контролю; (Б) увеличение экспрессии субъединиц в аСОЗ/аС028-стимулированных Т-лимфоцитах (аС03/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл), 56 часов) по отношению к относительному уровню белка в нестимулированных клетках (контроль). Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью ¿-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

Регуляция на уровне транскрипции и трансляции является первым этапом в контроле формирования того или иного подтипа NMDA-рецепторов. Кроме того, для изучаемого рецептора, как и для большинства рецепторных белков, характерна регуляция направленного транспорта субъединиц с ЭПР на внешнюю мембрану (Hampton, 2002). Таким образом, данные о внутриклеточной экспрессии субъединиц только косвенно подтверждают сведения о субъединичном составе функционально-активного рецепторного комплекса на поверхности клетки.

На плазматической мембране нестимулированных Т-лимфоцитов нами обнаружено наличие GluNl- и С1иЫ2В-субъедиыиц. Обращает на себя внимание, что нами не детектировано присутствие на поверхности нестимулированных клеток 01иША-субъединицы. Хотелось бы отметить, что коммерческие антитела к поверхностному эпитопу С1иЮА-субъединицы в настоящее время отсутствуют, поэтому о наличии данной субъединицы судили по экспрессии мРНК и внутриклеточной представленности белка. В целом, наши предположения о строении NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах основаны на сведениях об экспрессии мРНК и белков субъединиц GluNl и 01и№-семейств (рис. 6А). В связи с обнаружением определенных субъединиц NMDA-рецепторов на мембране клеток, особый интерес представляло изучение возможного изменения субъединичного состава рецептора при активации Т-лимфоцитов. При стимуляции Т-лимфоцитов через Т-клеточный комплекс нами обнаружено увеличение поверхностной экспрессии GluNl -субъединицы в 24 раза и 01иШВ-субъединицы - в 9 раз по сравнению с контролем (рис. 6Б). Кроме того, при активации клеток наблюдается появление на плазматической мембране йШША-субъединицы (увеличение экспрессии в 1.6 раз по отношению к контролю).

А

s

I 0 4Н о *

nh

rr

Sr.

GluN2A GIUN2B GIUN2C GIUN20

GIUN2A GluN2B GluN2C GluN2D

Рис. 6. Экспрессия субъединиц Ы!УША-рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов человека. (А) относительный уровень белка в нестимулированных Т-лимфоцитах, рассчитанный по отношению к изотипическому контролю; (Б) увеличение экспрессии субъединиц в аСОЗ/аС028-стимулироваиных Т-лимфоцитах (аС03/аС028 МКА; 2.5/1.25 мкг/мл; 56 часов) по отношению к относительному уровню белка в нестимулированных клетках (контроль). Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью (-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

Таким образом, полученные нами сведения подтверждают известные ранее факты о наличии GluNl-, GluN2A- и С1иЫ2В-субъединиц в составе NMDA-рецепторного комплекса (Miglio, 2005; Mashkina, 2007; Kvaratskhelia, 2009) в иммунокомпетентных клетках и впервые демонстрируют экспрессию представителей семейства GiuN3. В тоже время, комплексный анализ данных свидетельствует об изменении субъединичного состава NMDA-рецепторов при антигенной активации Т-лимфоцитов. Так, в нестимулированных Т-клетках NMDA-рецепторы представлены, в основном, GluNl/GluN2B и/или 01иЫ20-субъединицами, тогда как в TCR-стимулированных Т-лимфоцитах, вероятнее всего, комплексом GluNl/GluN2A и/или GluN2B- субъединиц. Можно предположить, что антигенная стимуляция периферических лимфоцитов ведет к запуску процессов, регулирующих синтез субъединиц NMDA-рецепторов как на уровне мРНК (GRINI, GRIN2C, GR1N3A), так и на уровне отдельных белков (GluNl, GluN2A, GluN2B). Кроме того, не исключен опосредованный Т-клеточным рецептором механизм активации внутриклеточного транспорта субъединиц и сборки функционально-активных NMDA-рецепторов, вероятнее всего, отличающихся таковых в нейрональных тканях.

Участие NMDA-рецепторов и механизмах входа Са2+ в Т-лимфоциты человека

Как известно, в Т-лимфоцитах связывание Т-клеточного рецептора чужеродным антигеном приводит к ins( 1,4,5)РЗ-зависимому высвобождению С а* из внутриклеточных депо с последующим его поступлением извне через кальциевые каналы плазматической мембраны (Smith-Garvin, 2009). К настоящему времени наиболее исследованный депо - управляемый путь входа кальция в лимфоциты -высокоселективный Са2+-ток через CRAC-каналы (calcium release-activated calcium), состоящие из порообразующей субъединицы, представленной трансмембранными белками семейства ORA1, и кальциевого сенсора ЭПР ST1M (Hogan, 2010). Несмотря на достигнутые успехи в расшифровке механизмов входа Са2+ при TCR-опосредованной активации Т-лимфоцитов, остается дискуссионным вопрос об иных каналах, ответственных за вход кальция в Т-клетки. Вопрос о путях поступления Са2" в Т-лимфоциты актуален и важен, поскольку известно, что в зависимости от типа и свойств канала меняются характеристики кальциевого входа, в частности амплитуда и продолжительность повышения содержания Са2+. Указанные характеристики в свою очередь предопределяют дальнейшие внутриклеточные события: активацию определенных сигнальных каскадов, транскрипционных факторов, дифференциальную экспрессию групп генов и, как следствие, специфичность клеточного ответа (Lewis, 2001). Мы предполагаем, что по аналогии с нейронами, в которых NMDA-рецепторы, наряду с потенциал - зависимыми кальциевыми каналами

L-типа обеспечивают основной вход Са2+ в клетки, в Т-лимфоцитах ионные каналы NMDA-рецепторов могут быть рассмотрены в качестве вероятных кандидатов, участвующих в депо - зависимом входе кальция. Для экспериментальной проверки гипотезы, клетки инкубировали в бескальциевой среде в присутствии тапсигаргина (ингибитор Са2+ - АТРаз мембран ЭПР (Rogers, 1995)). Далее заменяли среду на содержащую Са2+(10'3 М) и фиксировали изменения содержания внутриклеточного Са2+([Са2+],). Как следует из рис. 7А, на фоне тапсигаргина наблюдается характерный двухфазный Са2 сигнал: кратковременное и незначительное увеличение [Са2+]|, связанное с мобилизацией Са2+ из депо, и более продолжительная фаза, отражающая вход Са2+ из внеклеточной среды.

— TG-Ca

— TG-(+)-MK801

\

TG TG+(+)-MK801

время, мин

Рис. 7. Участие NMDA-рецепторов в механизме депо-зависимого входа кальция, вызванного тапсигаргином. (А) Т-лимфоциты (20x106 кл/мл) окрашивали Са2+-индикатором Fluo-4 AM в lx PBS без кальция и детектировали базовый уровень [Ca2+]i в течение 1 минуты. Увеличение [Са2+]| инициировали внесением в среду тапсигаргина (TG) (10 7 М, 10 мин), в условно бескальциевой среде, с последующей заменой среды на содержащую 10"3 М Са2+ (группа «TG-Са2"»). Для блокады NMDA-рецепторов в среду измерения вносили (+)-МК801 (10"4 М) в lx PBS + Ю"3 М СаСЬ и детектировали изменение [Ca2+]i в течение 5 минут. В контрольной группе вместо антагониста добавляли равный объем буфера. Все результаты нормализовали по отношению к контрольным группам без TG и Са2+. (Б) Отношение [Са2+]* после замены среды измерения на содержащую кальций (10"3 М Са2+) к [Ca2+]i в безкальциевой среде (0 М Са2+). На рис. А представлены данные одного из пяти независимых экспериментов. На рис. Б данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего по отношению к контролю. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

Добавление (+)-МК80! с одновременным внесением в среду кальция в 1.6 раз подавляет вход Са2+ в Т-лимфоциты, индуцированный тапсигаргином (рис. 7 А, Б). Блокада ЫМОА-рецепторов (+)-МК801 в течение 5 минут до начала эксперимента приводит к более существенному подавлению фазы входа Са2+ в лимфоциты (в 2.2 раза) (рис. 8А, Б).

\

Л

tg+(+)-mk801

время, мин

Рис. 8. Участие NMDA-рецепторов в механизме депо-зависимого входа кальция, вызванного тапсигаргином. (А) Т-лимфоциты (20* 106 кл/мл) окрашивали Са24-индикатором Fluo-4 AM в 1* PBS без кальция и инкубировали с (+)-МК801 (10"4 М) течение 5 минут до начала эксперимента. Затем клетки отмывали от антагониста (5 минут, 400 g) и детектировали базовый уровень [Са2+], в течение 1 минуты. Далее см. подпись к рис. 7. (Б) Отношение [Са2+]| после замены среды измерения на содержащую кальций (10"3 М Са2+) к [Са2+]| в безкальциевой среде (0 М Са2+). На рис. А представлены данные одного из пяти независимых экспериментов. На рис. Б данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего по отношению к контролю. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0.05).

При инкубации (+)-МК801 совместно с тапсигаргином (рис. 7А, 8А) не выявлено влияния антагониста на фазу мобилизации Са2+ из внутриклеточного депо.

В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецепторы принимают участие в механизмах входа Са2+ из внешней среды, вызванного опустошением внутриклеточных депо.

Оценка пролиферации активированных in vitro Т-лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов

Имеющиеся на данный момент немногочисленные литературные данные свидетельствуют об участии рецепторов глутамата в регуляции ключевых функций Т-лимфоцитов (Ganor 2003, 2007; Lombardi, 2004; Miglio, 2005; Boldyrev, 2012; Levite, 2012). Заметим, что сведения о роли NMDA-рецепторов в Т-клетках немногочисленны и противоречивы; зачастую, более поздние работы опровергают имеющиеся данные. В связи с этим, нами было проведено собственное исследование возможной функциональной роли данного типа глутаматных рецепторов в Т-лимфоцитах человека.

Для анализа пролиферативного ответа Т-лимфоцитов нами была выбрана методика окраски клеток флуоресцентной меткой CFSE (5-6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфир) (Invitrogen, США). При блокаде NMDA-рецепторов и антигенной стимуляции лимфоцитов нами обнаружено незначительное увеличение количество клеток в исходном поколении (рис. 9А, Б). В

тоже время, статистически значимое уменьшение количества клеток при блокаде ЫМОА-рецепторов обнаружено нами в третьем поколении клеток (рис. 9А). Одновременная стимуляция ФГА и блокада N МГЗЛ -рецепторов приводит к ингибированию пролиферации клеток в 1.8 раз уже в первом поколении. Снижение пролиферации приводит к уменьшению количества клеток во втором и третьем

Рис. 9. Ингибирование пролиферативного ответа Т-лимфоцитов при блокаде NMDA-peцeптopoв. Клетки (1x10 /мл) стимулировали аСЭЗ/аС028 МКА (5/2.5 мкг/мл) (А, Б) или ФГА (10 мкг/мл) (В, Г) с одновременной блокадой NMDA-peцeптopoв (+)-МК801 (10^ М) в течение 72 часов. Для поддержания пролиферативного ответа клеток и снижения возможного вхождения клеток в апоптоз в среду культивирования вносили 1Ь-2 (15 нг/мл). (А) процентное содержание клеток в исходной и трех клеточных поколениях при аС03/аС028 МКА стимуляции; (Б)гистограмма распределения клеточных поколений при аС03/аС028 МКА стимуляции; (В) процентное содержание клеток в исходной и трех клеточных поколениях при ФГА стимуляции; (Г) гистограмма распределения клеточных поколений при ФГА стимуляции. На рис. А и В данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05). На рис. Б и Г представлены данные одного из пяти независимых экспериментов.

При комплексном анализе пролиферативного ответа нами было обнаружено, что блокада ИМСА-рецепторов приводит к снижению индекса пролиферации в аСОЗ/аСЛ28- и митоген-стимулированной культуре Т-лимфоцитов на 12% и 18%, соответственно (рис. 10).

Iго-

Е 0-5"

гЬ

■

асрз/асогв ФГА асоэ/асоге ФГА

Рис. 10. Снижение индекса пролиферации аС'ПЗ/аСП28- и ФГА-стимулированных Т-лимфоцитов при блокаде ЫМВА-рецепторов. Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

Анализ клеточного цикла активированных in vitro Т-лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов

Анализ клеточного цикла Т-лимфоцитов проводили после 72-часовой стимуляции клеток aCD3/aCD28 МКА (2.5/1.25 мкг/мл). Как следует из табл. 2, aCD3/aCD28 стимуляция Т-лимфоцигов приводит к запуску клеточного цикла. При совместной инкубации активированных клеток с неконкурентным антагонистом NMDA-рецепторов (+)-МК801 (10"4 М) в течение 72 часов мы не обнаружили достоверного влияния антагониста на параметры клеточного цикла. Кроме того, при анализе subGO-фазы не наблюдается статистически значимого эффекта (+)-МК801 на апоптоз как покоящихся, так и активированных клеток (табл. 2).

Таблица 2

Количественный анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла при блокаде NMDA-рецепторов. Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего (п=3)

Группы Клетки, %

subGO G1 S G2/M

Контроль 0,6±0,08 99,6±0,02 - -

aCD3/aCD28 2,4±0,3 92,7±0,8 5,9±0,6 1,3±0,7

aCD3/aCD28+(+)-MK801 2,3±0,8 92,06±1,6 5,7±0,17 2,3±1,8

(+)-МК801 0,9±0,15 99,4±0,05 - -

Участие NMDA-peцeптopoв в регуляции аионтоза Т-лимфоцитов

Блокада NMDA-peцenтopoв при одновременной активации клеток приводит к статистически значимому увеличению апоптотических событий в 1.2 раза (по отношению к группе «аС03/аС028») в случае раннего апоптоза (рис. 11 А, Б).

^ i_I ранний апоптоз

aCD3faCD28

aCD3/aCD28+{+)-MK801

1.34Ч

т 1 —

•СЕШаС02(«->4«К*01

и^п, ш- 14.10*

Рис. 11. Апоптоз в культуре Т-лимфоцитов при блокаде ЫМОА-рецепторов. Клетки (1 х 106/мл) активировали аС03/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) в течение 72 часов. Одновременно со стимуляцией в среду культивирования вносили (+)-МК801 (10"4 М). На рис. А данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05). На рис. Б представлены данные одного из пяти независимых экспериментов.

Цитокиновый профиль Т-лимфоцитов при блокаде NMDA-рецепторов

Для сравнительной оценки влияния антагониста NMDA-рецепторов (+)-МК801 на уровень мРНК генов и белков цитокинов были выбраны как про- IL-6 (IFNB2), TNFa (TNFÄ), IFNy (IFNG), так и противовоспалительные цитокины IL-10 (CSIF). Как следует из рис. 12 и табл. 3, при инкубации аСОЗ/аС028-активированных Т-лимфоцитов с (+)-МК801 синтез IL-6 угнетается, в среднем на 21 %, IL-10 - на 53 %, TNFa - на 50 %, а IFNy - на 57 %.

Рис. 12. Влияние блокады NMDA-рецепторов на экспрессию генов цитокинов в Т-лимфоцитах. Для определения относительного уровня мРНК клетки инкубировали 8 часов (■CSIF, IFNB2, TNFA) и 24 часа (INFG) в присутствии aCD3/aCD28 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) и (+)-МК801 (Ю^М). В контрольной группе Т-лимфоциты культивировались в указанные промежутки времени без антигенов. Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью i-критерия Вилкоксона (п=6; * - р<0,05).

Таким образом, эффект блокады NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов здоровых доноров наиболее выраженно проявляется в супрессии продукции провоспалительных цитокинов IFNy, TNFa, и противоспалительного цитокина IL-10, тогда как синтез плейотропного цитокина IL-6 подавляется в меньшей степени.

Таблица 3

Цитокиновый профиль Т-лимфоцитов при блокаде NMDA-рецепторов.

Стимул Цитокины^\ Контроль aCD3/aCD28 aCD3/aCD28+ (+)-MK801 (+)-MK801

IL-10 (пг/мл) 127,9±8,5 1418,3±478,9 666,2±173,2 * 195,7±22,7

IL-6 (пг/мл) 2844,6±202. 3 5208,7± 1309.9 4103,5±380,3 3993,8±518,5

TNFa (пг/мл) 755,9±143,5 2668,3±602,9 1324,1 ±90,7 * 749,3±135,3

IFNy (пг/мл) 3938,6±130, 5 12597,04±3179,1 5464,6±736,3 * 3588,5±134,5

Примечание: клетки (1хЮ6 кл/мл) стимулировали аС03/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) в присутствие (+)-МК801 (104 М). Уровень цитокинов определяли в супернатанте культуры Т-лимфоцитов через 24 часа (^-10,1Ь-6, Т№а) и 48 часов (ШЫу). Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

csif t

■CD3HCD28 «CD3/nCD2B KIMKS01

ifnb2

In

■C03/BCD2B aCD3/aCD28 MMK801 (•»>-MK801

ifng

Участие NMDA-peцeптopoв в регуляции линейной дифференцировки Т-лимфоцитов

Как известно, дифференцировка Т-хелперов при их взаимодействии с антигеном, активация, в зависимости от особенностей антигена и его концентрации, а также характера цитокинового микроокружения может осуществляться по пути формирования ТЫ, ТЬ2, ТЫ7 и индуцибельных регуляторных Трег клеток. Линейная дифференцировка Т-клетки и последующая ее функция определяется экспрессией ряда транскрипционных факторов. В случае ТЬ2-клеток это экспрессия йАТА-З, в случае ТЫ-клеток - Т-Ье1, в случае Трег клеток - экспрессия БохрЗ, ТЫ7-клеток -КОКу1. Считается, что присутствие специфичных транскрипционных факторов является "маркером" определенной субпопуляции Т-хелперов, и оценка экспрессии их генов позволяет дифференцировать эти субпопуляции.

В качестве экспериментальной модели запуска процесса дифференцировки Т-лимфоцитов нами было выбрана активация клеток форбол-меристат-ацетатом (ФМА) и кальциевым ионофором иономицином. При одновременной блокаде КМОА-рецепторов и стимуляции Т-лимфоцитов ФМА/иономицином мы обнаружили увеличение экспрессии гена ТВХ21 по отношению к йАТАЗ, приводящее, к изменению соотношения ТЬ1 /ТЬ2 в сторону ТЫ-клеток (рис. 13А). Снижение экспрессии гена йАТАЗ при блокаде NMDA-peцeптopoв, в свою очередь, обнаружено и по отношению к уровню мРНК гена ЛОЛу/ (рис. 13В).

I § 4

с

О 0.6-

Рис. 13. Влияние блокады NMDA-рецепторов на направление дифференциации Т-лимфоцитов в модельной системе in vitro. Т-лимфоциты (lxlO6 кл/мл) активировали ФМА/иономицином (25 нг/мл - 1 мкг/мл) в течение 2 часов в присутствии (+)-МК801 (10"4 М). Данные представлены в виде среднегоарифм. ± станд. ошибка среднего от значений нестимулированных клеток. Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Вилкоксона (п=6; * - р<0,05).

Блокада рецепторов приводит к изменению отношения ТЫ/ТЫ 7 в сторону ТЫ-клеток (рис. 13Б). Особое внимание привлекает снижение экспрессии гена РохрЗ (Трег) по отношению к САТАЗ (ТЬ2-клетки) (рис. 13Г) при блокаде ЫМОА-рецепторов, приводящее, возможно, к значительному снижению регуляторной роли Трег.

Пути сигнальной трансдукции, сопряженные с NMDA-peцeптopaми в Т-лимфоцитах человека

Для идентификации протеинкиназных каскадов, осуществляющих передачу сигналов от ЫМОА-рецепторов в активированных Т-лимфоцитах, клетки инкубировали с антагонистом (+)-МК801, затем стимулировали аС03/аС028 МКА и окрашивали антителами к фосфорилированным формам ключевых протеинкиназ МАР-активируемых, Са2+-зависимых, Р13/Ак|-зависимых и ДАГ-зависимых сигнальных путей. Как следует из рис. 14, предварительная обработка стимулированных Т-лимфоцитов (+)-МК801 приводит к ингибированию содержания рРКСЭ (12%), рСаМКН (6%), рЕКК 1/2 (22%), р-р38 (7%) и рСБКЗр (16%).

Л,

I aCD3/aCD28 I aCD3/aCD28+(+)-MK801

а

dg—

pERK 1/2

pSAPK/JNKI/2 p.p38

pPKCD

pCAMKIl

pGSK3[i

Рис. 14. Влияние блокады ММОА-рецепторов на активность ключевых протеинкиназ Са -зависимых и Са2+-независимых сигнальных путей в Т-лимфоцитах. Клетки инкубировали 5 мин с (+)-МК801 (10"4 М) и активировали аС03/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) в разные промежутки времени (для рЕЯК 1/2, рЗАРКЯЫК 1/2, р-р38 - 60, 120, 30 мин, соответственно; для рРКСЭ, и рСАМКЦ, рСБКЗР - 60 и 1 мин, соответственно). Данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего по отношению к контролю. Достоверность различий оценивали с помощью (-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

Обращает на себя внимание выраженное снижение уровня белков pSAPK/JNKl/2 на фоне блокады NMDA-рецепторов. Вестерн-блот анализ (рис. 15А, Б) позволил выявить различия в чувствительности протеинкиназ pSAPK/JNK 1 (46 кДа) и pSAPK/JNK 2/3 (54 кДа) к действию (+)-МК801.

А

PJNK2/3 (54 КДа) PJNK1 (46 «Да!

р-тубупин

i

аСОЗ/аСР28 аСОЗ/аС028*(*-)-МК801

Рис. 15. Вестерн-блот анализ содержания рЗАРКЛЫК 1/2 (ТЬг183/Туг185) при блокаде NMDA-peцeптopoв на фоне антигенной стимуляции. (А) Клетки инкубировали 5 мин с (+)-МК801 и активировали аС03/аС028 МКА (2.5/1.25 мкг/мл) 120 мин. (Б) Количественная оценка содержания рвАРК/ЖК 1. Нормализацию проводили по содержанию белка (3-тубулина. На рис. А представлены данные одного из пяти независимых экспериментов. На рис. Б данные представлены в виде среднего арифм. ± станд. ошибка среднего. Достоверность различий оценивали с помощью (-критерия Вилкоксона (п=5; * - р<0,05).

Как видно на рис. 15, наиболее значимо снижается содержание рБЛРК/ЖК 1 по сравнению с уровнем рЗАРК/ЖК 2/3, что, вероятно, свидетельствует в пользу ШУГОА-зависимой преимущественной активации ШК1 в Т-лимфоцитах. Кроме того, блокада №уША-рецспторов приводит к увеличению нефосфорилированной формы протеинкиназы ОвКЗр, которая, возможно, опосредует негативный эффект блокады рецепторов. В частности, увеличение активной формы ОБКЗр и ингибирование ключевых протеинкиназ МАР-пути, на наш взгляд, может участвовать в запуске процессов раннего апоптоза, ингибирования пролиферации и секреции цитокинов, которые были обнаружены нами при блокаде ЫМБА-рецепторов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые идентифицированы и локализованы субъединицы КМОА-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. На мембране покоящихся клеток обнаружено наличие С1иМ1-, 01иЫ2В- и вЫШО-субъединиц. При активации Т-лимфоцитов через Т-клеточный комплекс на поверхности клеток детектируются 01иШ-, С1иША- и С1иШВ-субъсдиницы. Установлено, что при активации Т-лимфоцитов происходит изменение субъединичного состава NMDA-peцeптopoв: 01иЫ1/01иЫ2В/С1иМ20 в нестимулировапных клетках на С1иЫ 1/01иША/01иЫ2В в аСОЗ/аСЦ28-стимулированных Т-лимфоцитах.

2. Показано, что №уГОА-рецепторы участвуют в механизмах депо-зависимого входа Са2+ в Т-лимфоциты человека. ■

3. При комплексном анализе параметров клеточного цикла и пролиферации активированных Т-лимфоцитов впервые установлено, что блокада КМПА-рсцспторов приводит не к ингибированию пролиферации, а к замедлению скорости клеточного деления в этом типе клеток.

4. Впервые показано, что блокада КМОА-рецепторов при одновременной активации Т-лимфоцитов сопровождается статистически значимым увеличением раннего апоптоза клеток.

5. Блокада ИМСА-рецспторов аСПЗ/аСП28-стимулированных Т-лимфоцитов здоровых доноров приводит к ингибированию синтеза провоспалительных (1Ь-б, ТОТа, и противовоспалительного (1Ь-10) цитокинов, что свидетельствует об иммуномодулирующей роли данного типа рецепторов глутамата.

6. Показано, что ЫМОА-рсцспторы участвуют в регуляции направления дифференцировки Т-лимфоцитов в модельных условиях ш VI/го. В частности обнаружено, что блокада КМОА-рсцспторов приводит к смещению соотношения ТМ/ТЫ в сторону ТЫ-клеток.

7. Установлено, что при блокаде ММОА-рецепторов снижение активности и содержания ДАГ-зависимой рРКСб и Са2+-зависимой протеинкиназы рСаМКП не столь выражено по сравнению с таковым Кая-активируемой протеинкиназы рЕЯК1/2 и Яас-активируемых белков р-р38 и рБАРК/ЖК 1/2, что, вероятно, отражает преимущественную регуляцию КМБА-рецепторами Кав/Нас-зависимого сишалинга в Т-лимфоцитах. Выявлено участие ключевой протеинкиназы РГЗ/АкЧ-зшшсимого сигнального пути ОЭКЗр в механизмах передачи сигналов от NMDA-peцeптopoв в Т-лимфоцнтах.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зайнуллина Л.Ф. NMDA-рецепторы - возможные компоненты депозависимого входа Са2+ в Т-лимфоциты человека / Зайнуллина Л.Ф., Ямиданов P.C., Вахитов В.А., Вахитова Ю.В. // Биохимия. - 2011. - Т.76. - Вып.11. - С.1517-1524;

2. Зайнуллина Л.Ф. Участие NMDA-рецепторов в механизмах входа Ca2t в Т-лимфоцнтах периферической крови человека / Зайнуллина Л.Ф., Ямиданов P.C., Вахитова Ю.В. // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. 2011. Том 1. С. 397-403;

3. Зайнуллина Л.Ф. Идентификация путей сигнальной трансдукции от NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах / Зайнуллина Л.Ф., Фаткуллина У.Ш., Вахитова Ю.В. // Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. 2013. -Т. 1. - С. 28-33;

4. Зайнуллина Л.Ф. Антагонист NMDA-рецептора МК-801 ингибирует пролиферацию и синтез цитокинов Т-клеток человека / Зайнуллина Л.Ф., Ямиданов P.C., Антипина Е.И., Вахитова Ю.В. // 14 Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. - 2010. - Т. 2. - С. 136;

5. Зайнуллина Л.Ф. NMDA-рецепторы опосредуют вход Са2+ в Т-лимфоцитах человека / Зайнуллина Л.Ф., Вахитова Ю.В. // II Всероссийская школа-конференция молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика-наука XXI века», Уфа. -2011. - Т. 1. -№2. - С. 40;

6. Зайнуллина Л.Ф. Поиск генов, регулируемых NMDA-рецептором, в Т-лимфоцитах человека / Зайнуллина Л.Ф., Фаткуллина У.Ш., Вахитова Ю.В. // V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома», Звенигород. - 2012. - С. 27;

7. Кудояров Э.Р. Участие НМДА-рецепторов лимфоцитов в депозависимом входе ионов Са2+/ Кудояров Э.Р., Зайнуллина Л.Ф., Вахитова Ю.В. // IV Международная научно-практическая конференция «Проблемы современной биологии», Москва. - 2012 - С. 6-9;

8. Зайнуллина Л.Ф. Роль NMDA-рецепторов в механизмах входа Са2+ в Т-лимфоциты человека / Зайнуллина Л.Ф., Кудояров Э.Р., Вахитова Ю.В. // III Съезд Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург. - 2012. -Т. 54. - С. 680;

9. Вахитова Ю.В. Роль NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-лимфоцитов человека / Вахитова Ю.В., Зайнуллина Л.Ф., Фаткуллина У.Ш., Кудояров Э.Р. // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды», Уфа. - 2013. - С. 82;

10. Зайнуллина Л.Ф. Пути передачи сигнала, сопряженные с NMDA-рецепторами, в Т-лимфоцитах человека / Зайнуллина Л.Ф., Вахитова Ю.В. // XXV Международная зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва. - 2013. - Т.2. - С. 31;

11. L. Zainullina. The subunit composition of NMDA receptors in human T-lymphocytes / L. Zainullina, U. S. Fatkullina and Y. V. Vakhitova. // 38й FEBS Congress "Mechanisms in Biology", Saint Petersburg. - 2013. - P. 192.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

MKA - моноклональные антитела; ФГА - фитогемагтлютинин; ФМА - форбол меристат ацетат; ЭПР - эндоплазматический ретикулум; IL-2 - интерлейкин-2; IL-6 -шггерлейкин-б; IL-10 - интерлейкин-10; INFy - интерферон гамма; NM ПА - N-метил-D-аспартат; TNFa - фактор некроза опухоли альфа.

Подписано в печать 14.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60X84/16. Гарнитура Times. Усл.печ. л. 1,40. Тираж 100 экз. Заказ 748.

Типография ИИЯЛ УНЦ РАН г.Уфа, пр. Октября, 71. тел. (347)235-60-50

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайнуллина, Лиана Фанзилевна, Уфа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

На правах рукописи

ЗАЙНУЛЛИНА ЛИАНА ФАНЗИЛЕВНА

0420145^667

РЕГУЛЯЦИЯ ^БА-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Вахитова Ю.В.

Уфа-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ............................5

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................п

1.1 Глутамат и рецепторы глутамата в центральной нервной системе....................................................................................................................................12

1.1.1 Классификация рецепторов глутамата........................................................13

1.1.2 Ионотропные рецепторы глутамата ЫМОА-подтипа: структура, функции, динамика в онтогенезе........................................15

1.1.3 Зависимость фармакологических и биохимических свойств ЫМОА-рецепторов от субъединичного состава................................21

1.2 Рецепторы глутамата в периферических системах, в том числе, в иммунной системе....................................................................................25

1.3 Роль глутамата и его рецепторов в функционировании

клеток иммунной системы....................................................................................31

1.3.1 Влияние глутамата и рецепторов глутамата на выживаемость и пролиферацию Т-лимфоцитов................................31

1.3.2 Участие глутамата в механизмах кальциевой сигнализации

в Т-лимфоцитах................................................................................................................33

1.3.3 Роль глутамата и рецепторов глутамата в механизме апоптоза Т-лимфоцитов............................................................................................34

1.3.4 Влияние глутамата на механизмы адгезии и хемотаксиса Т-лимфоцитов....................................................................................................................35

1.3.5 Участие глутамата в регуляции секреции цитокинов..................36

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................................................39

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................39

2.1 Материалы исследования........................................................................................39

2.1.1 Общая характеристика доноров........................................................................39

2.1.2 Перечень использованных материалов и реактивов..........................39

2.2 Методы исследования..................................................................................................42

2.2.1 Методы исследования функционального состояния

отдельных компонентов иммунной системы..........................................42

2.2.1.1 Забор крови..........................................................................................................................42

2.2.1.2 Выделение лимфоцитов периферической крови................................43

2.2.1.3 Культивирование лимфоцитов периферической крови..............43

2.2.1.4 Оценка жизнеспособности Т-лимфоцитов в условиях блокады ЫМБА-рецепторов................................................................................44

2.2.1.5 Оценка пролиферативной активности и анализ клеточного цикла лимфоцитов........................................................................................................44

2.2.1.6 Оценка апоптоза в культуре Т-лимфоцитов..........................................46

2.2.1.7 Количественное определение уровня цитокинов с

помощью иммуноферментного анализа..........................................................46

2.2.1.8 Измерение концентрации внутриклеточного кальция в Т-лимфоцитах..............................................................................................................................47

2.2.2 Иммуноцитохимическое окрашивание лимфоцитов..........................48

2.2.2.1 Иммунофенотипирование лимфоцитов........................................................48

2.2.2.2 Определение содержания фосфорилированных форм протеинкиназ......................................................................................................................48

2.2.2.3 Изучение экспрессии субъединиц NMDA-рецепторов................49

2.2.2.3.1 Проточная цитофлуориметрия..........................................................................49

2.2.2.3.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия....................50

2.2.3 Молекулярно-генетические методы..............................................................51

2.2.3.1 Выделение суммарной РНК....................................................................................51

2.2.3.2 Синтез кДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы........................................................................................................................52

2.2.3.3 ОТ-ПЦР в режиме реального времени........................................................52

2.2.3.4 Приготовление тотального клеточного лизата для иммуноблоттинга............................................................................................................55

2.2.3.5 Электрофорез белков....................................................................................................55

2.2.3.6 Электроперенос белков из акриламидных гелей на мембранные фильтры (блоттинг)..................................................................55

2.2.3.7 Гибридизация с антителами................................................................................56

2.2.3.8 Детекция белков................................................................................................................56

2.2.4 Статистическая обработка результатов исследования......... 56

ГЛАВА 3. NMDА-РЕЦЕПТОРЫ В Т-ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА ... 57

3.1 Идентификация и локализация субъединиц NMDA-

рецепторного комплекса в Т-лимфоцитах человека........... 57

3.1.1 Экспрессия мРНК генов, кодирующих субъединицы NMDA-рецепторов.................................................... 57

3.1.2 Внутриклеточная экспрессия субъединиц NMDA-рецепторов. Локализация на эндоплазматическом ретикулуме............................................................................. 63

3.1.3 Представленность субъединиц NMDA-рецепторов на плазматической мембране Т-лимфоцитов....................... 69

ГЛАВА 4. NMDА-РЕЦЕПТОРЫ - КОМПОНЕНТЫ ДЕПО -

ЗАВИСИМОГО ВХОДА Са2+ В Т-ЛИМФОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА......... 75

4.1 Изучение влияния блокады NMDA-рецепторов на уровень Са2+ при использовании тапсигаргиновой модели емкостного входа ионов............................................. 77

ГЛАВА 5. NMDА-РЕЦЕПТОРЫ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЮЧЕВЫХ

ФУНКЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА.................................. 82

5.1 Оценка жизнеспособности культуры Т-лимфоцитов при

блокаде NMDA-рецепторов........................................ 83

5.2 Анализ клеточного цикла активированных in vitro Т- 88 лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов.........

5.3 Оценка пролиферации активированных in vitro Т-лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов......... 90

5.4 Участие NMDA-рецепторов в регуляции апоптоза Т-лимфоцитов............................................................. 95

5.5 Цитокиновый профиль Т-лимфоцитов при блокаде NMDA-рецепторов ............................................................... 98

5.6 Пути дифференцировки Т-лимфоцитов в условиях блокады NMDA-рецепторов.................................................... 102

ГЛАВА 6. ПУТИ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ ОТ NMDA-

РЕЦЕПТОРОВ В Т-ЛИМФОЦИТАХ........................................... 107

6.1 Активация ключевых протеинкиназ митоген-активируемого каскада (МАРК) в условиях блокады NMDA-рецепторов................................................... 109

6.2 Эффект блокады NMDA-рецепторов на активацию протеинкиназы Са2+ / кальмодулин- зависимых сигнальных путей - рСаМКИ...................................................... 114

6.3 Изменение уровня рРКСЭ - протеинкиназы ДАГ-зависимого сигнального пути при блокаде NMDA-рецепторов.............................................................. 116

6.4 Влиянии блокады NMDA-рецепторов на уровень pGSK-Зр - протеинкиназы PB/Akt-зависимого сигнального пути....................................................................... 117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................... 120

ВЫВОДЫ............................................................................. 127

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................... 129

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИП - индекс пролиферации

МКА - моноклональные антитела

ФГА - фитогемагглютинин

ФМА - форбол меристат ацетат

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

ЭГТА - этиленгликоль тетрауксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

FBS - эмбриональная бычья сыворотка

IL-2 - интерлейкин-2

IL-6 - интерлейкин-6

IL-10 - интерлейкин-10

INFy - интерферон гамма

NMDA - N-метил-О-аспартат

PBS - натрий-фосфатный буфер

TCR - Т-клеточный комплекс

TNFa - фактор некроза опухоли альфа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. К настоящему времени сформированы представления об основах взаимосвязи нервной и иммунной систем. Считается, что это взаимодействие осуществляется через гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось, автономную (симпатическую и парасимпатическую) нервную систему, иннервирующую в том числе лимфоидные органы, и посредством циркулирующих цитокинов, нейропептидов и нейромедиаторов (Sternberg, 2006; Wrona, 2006). В последние годы интерес исследователей вызывают нейромедиаторы, которые помимо выполнения основных функций в центральной нервной системе, выступают и в качестве системных и/или локальных иммунорегуляторов, действуя на уровне рецепторов иммунокомпетентных клеток, обеспечивая, таким образом, межсистемные связи. На данный момент накоплено достаточно данных о том, что на клетках иммунной системы присутствуют рецепторы и компоненты сопряженных с ними сигнальных систем практически ко всем известным нейромедиаторам, нейропептидам, нейрогормонам, и эндогенные лиганды, такие как ацетилхолин, дофамин, серотонин, глутамат, субстанция Р, соматостатин и др. непосредственно регулируют некоторые функции различных популяций иммунокомпетентных клеток (Levite, 2000; Levite, 2008; Pacheco, 2010). Следует отметить, однако, что роль и детали молекулярных механизмов регуляции функций иммунокомпетентных клеток нейромедиаторами и нейропептидами в норме и при патологии практически не изучены и исследования по данному научному направлению находятся на начальных этапах своего формирования.

Основной возбуждающий нейромедиатор ЦНС глутамат регулирует многие базовые процессы нервных клеток, такие как дифференцировка нейронов в онтогенезе, поддержание выживаемости клеток, контроль механизмов формирования памяти и обучения, моторной координации, патогенеза ряда психических и неврологических заболеваний (Hardingham, 2009). К настоящему времени рецепторы глутамата хорошо охарактеризованы и подразделены на три

класса ионотропных (iGluR) и восемь классов метаботропных (mGluR) рецепторов (Nakanishi, 1998). Ионотропные рецепторы глутамата, активируемые N - метил - D - аспартатом (NMDA-рецепторы), привлекают особое внимание в связи с их ролью в контроле таких важных процессов как рост и развитие нейронов, формирование и поддержание синаптической пластичности, патогенез психо-неврологических и нейродегенеративных заболеваний (Ewald, 2009). Структурно NMDA-рецептор представляет собой тетрамерный комплекс, формируемый комбинацией субъединиц GluNl, GluN2A-*D, Glun3A—»B, которые образуют ионный канал, высокопроницаемый для К+, Na+, Са2+. Комбинация субъединиц NMDA-рецепторов определяет такие его функциональные свойства как кинетика Са2+ - токов, параметры активации/деактивации, десенситизации канала, сопряженность с различными системами сигнальной трансдукции, и, как следствие специфичность клеточного ответа (Mayer, 2005).

Нейромедиаторы традиционно рассматриваются как молекулы, секретируемые нервными окончаниями и влияющие на те или иные функции нервных клеток. Вместе с тем появляется все больше доказательств того, что нейромедиаторная система глутамата функционирует в периферических системах (Gill, 2001). На сегодняшний день в клетках иммунной системы обнаружены оба класса глутаматных рецепторов (метаботропные mGluR и ионотропные iGluR), а также система транспортеров медиатора в клетку из внешней среды (Pacheco, 2007). Полагают, что глутамат является одним из посредников, обеспечивающих взаимодействие нервной и иммунной систем (Levite, 2012). На сегодняшний день известно, что, глутамат, связываясь с метаботропными и ионотропными рецепторами на мембране иммунокомпетентных клеток, принимает участие в регуляции пролиферации клеток, секреции цитокинов, в механизмах дифференцировки субпопуляций Т-хелперов, в контроле клеточного цикла и апоптоза, в усилении образования свободных радикалов, в интегрин -опосредованной адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса (Lombardi, 2001; Тунева, 2003; Ganor, 2003; Boldyrev, 2004; Lombardi, 2004; Pacheco, 2004; Miglio, 2005; Mashkina, 2007; Miglio, 2007). На наш взгляд, заслуживают

внимания данные об участии ЮШЯ и шв^Я в регуляции кальциевого гомеостаза в активированных Т-клетках (ЬотЬагсН, 2001; М1§1ю, 2005).

На данный момент имеются лишь единичные работы, в которых показана экспрессия субъединиц ММЮА-рецепторов в иммунокомпетентных клетках 2005; КуагагэкЬеНа, 2009; МазЫ-ипа, 2010). В основном авторы ограничиваются тем, что демонстрируют представленность только 01иМ1-субъединицы. Вместе с тем известно, что функционально-активный ?ч!МОА-рецептор формируется в результате ассоциации 01иЫ1 с С1иМ2- и/или 01иЫЗ-субъединицами. Однако лишь в одной работе (Куага18кЪеНа, 2009) методом вестерн-блот анализа показана экспрессия вШША и ИиШВ-субъединиц. Таким образом, вопрос о субъединичном составе функционально активных ЫМОА-рецепторов Т-лимфоцитов человека на данный момент остается открытым. Кроме того, несмотря на накопленный экспериментальный материал, механизмы стимуляции и регуляции активности №уГОА-рецепторов в Т-лимфоцитах, их возможной сопряженности с Т-клеточным комплексом, остаются в значительной степени не изученными.

Цель и задачи исследования: Цель данной работы - исследование структуры ЫМОА-рецепторов и их роли в регуляции функций Т-лимфоцитов человека. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать и локализовать субъединицы МУША-рецепторов в Т-лимфоцитах человека.

2. Изучить возможное участие ЫМБА-рецепторов в механизмах депо-зависимого

2+

входа Са в Т-лимфоциты.

3. Изучить вклад ТчПУГОА-рецепторов в регуляцию пролиферации, прогрессии клеточного цикла и апоптоза Т-лимфоцитов, активированных через Т-клеточный комплекс.

4. Исследовать вовлеченность ИМЛА-рецепторов в регуляцию процесса дифференцировки Т-лимфоцитов и секреции цитокинов.

5. Выявить пути сигнальной трансдукции, сопряженные с ЫМБА-рецепторами Т-лимфоцитов человека.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование субъединичного состава МУГОА-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. Полученные нами сведения подтверждают известные ранее факты о наличии 01и1чГ1-, С1иМ2А- и вЫШВ-субъединиц в составе ЫМОА-рецепторного комплекса (М1§1ю, 2005; МавЫста, 2007; Куага1зкЬеНа, 2009) в иммунокомпетентных клетках и впервые демонстрируют экспрессию представителей семейства вЫЮ. С применением трех методических подходов идентифицированы и локализованы субъединицы ЫМОА-рецепторов в этом типе клеток. В нестимулированных Т-клетках МУПЗА-рецепторы представлены, в основном, С1и№/01иМ2ВЛ31иШО-субъединицами, а в антиген-стимулированных Т-лимфоцитах, вероятнее всего, комплексом 01иЫ1/01иЫ2АЛл1иШВ- субъединиц. Можно предположить, что антигенная стимуляция периферических лимфоцитов ведет к запуску процессов, регулирующих синтез субъединиц ИМВА-рецепторов как на уровне мРНК ОШИ2С, ОШИЗА), так и на уровне отдельных белков

(01и1\Г1, 01иК2А, 01иЫ2В). Установлено, что КМОА-рецепторы являются

О 4- ___

компонентами депо-зависимого входа Са в Т-лимфоциты. Показано участие глутаматных рецепторов ЫМЭА подтипа в регуляции апоптоза и клеточного цикла активированных Т-лимфоцитов. Впервые выявлена вовлеченность ЫМОА-рецепторов в регуляцию пролиферативного ответа Т-лимфоцитов при активации последних через Т-клеточный комплекс. Проведенные исследования дополнили имеющиеся сведения об участии МУПЗА-рецепторов в контроле секреции про- и противовоспалительных цитокинов и регуляции процесса дифференцировки Т-лимфоцитов. В работе впервые охарактеризованы протеинкиназные каскады, участвующие в передачи сигнала от ИМБА-рецепторов в клетках иммунной системы.

Научно-практическая значимость работы. Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы - изучению механизмов нейроиммунного взаимодействия. В ходе выполнения данной работы получены новые данные о структуре ИМОА-рецепторов Т-лимфоцитов человека и их участии в механизмах регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток, что позволяет, по

крайней мере, частично, выявить общие закономерности взаимодействия нервной и иммунной систем. Расшифровка механизмов этого взаимодействия имеет как фундаментальное, так и прикладное значение, связанное, главным образом, с совершенствованием диагностики и формированием новых подходов к фармакотерапии воспалительных нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, изучение механизмов активации и регуляции КМОА-рецепторов в Т-лимфоцитах человека позволяет расширить теоретические знания об особенностях сигнализации в электрически невозбудимых клетках.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XIV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -Наука XXI века" (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011, 2013), III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генет�