Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция функциональных свойств белков за счет сайт-специфичного убиквитилирования
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Регуляция функциональных свойств белков за счет сайт-специфичного убиквитилирования"
На правах рукописи
ЧЕРНОРУДСКИЙ АЛЕКСАНДР ЛЕОНИДОВИЧ
РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ ЗА СЧЕТ САЙТ-СПЕЦИФИЧНОГО УБИКВИТИЛИРОВАНИЯ
03 00 04 - биохимия 03 00 13 - физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Нижний Новгород 2008
» , г-, г- г* г. р.
О < ¡.Ы Л"»
003445926
Работа выполнена на базе кафедры физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им Н.И Лобачевского и группы постгеномных технологий Научно-исследовательского института прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской государственной медицинской академии
Научные руководители: доктор биологических наук, доцент
Корягин Александр Сергеевич
кандидат медицинских наук Гайнуллин Мурат Рушанович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Новиков Виктор Владимирович
кандидат биологических наук Мошковский Сергей Александрович
Ведущая организация: ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава»
Защита диссертации состоится г в часов на
заседании диссертационного совета Д 21216615 при Нижегородском государственном университете им НИ Лобачевского по адресу 603950, Нижний Новгород, пр Гагарина, 23
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ им Н И Лобачевского
Автореферат разослан « /У 2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент
Корягин А.С.
Список сокращений а м е — абсолютные массовые единицы ЭФР - эпидермальный фактор роста СаМ - кальмодулин
Е1-убиквитин-активирующий фермент
Е2 -убиквитин-конъюгирующий фермент
ЕЗ - убиквитин-протеин лигаза
EGFR- рецептор зпидермального фактора роста
MALDI - матричная лазерная десорбция/ионизация
ODC - оротидин 5'-фосфат декарбоксилаза
PCS — пероксисомальная цитрат синтаза
SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле в
присутствии додецилсульфата натрия
XI АР -Х-связанный ингибитор апоптоза
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы
Убиквитшшрование представляет собой ковалентное присоединение небольшого бежа убиквитина к акцепторному лизину, экспонированному на поверхности белка-мишени Модифицированный таким образом лизин принято называть сайтом убиквитилирования Молекула убиквитина содержит 7 остатков лизина, которые также могут служить сайтами убиквитилирования. В результате полимеризации нескольких молекул убиквитина формируются так называемые мультиубиквитиновые цепи, структура которых может варьировать. Показана множественность форм модификации белков убиквитином
Процесс убиквитилирования катализируется иерархическим каскадом из 3-х ферментов- убиквитин-активирующего фермента Е1, убиквитин-коньюгирующего фермента Е2 и убиквитинлигазы ЕЗ. Следует отметить, что убиквитшшрование обратимо, так как разнообразные деубиквитилирующие ферменты (DUBs) способны отщеплять убиквитин от субстратов, а также расщеплять мультиубиквитиновые цепи.
Механизмы убиквитин-зависимой регуляции контролируют большинство клеточных процессов эукариот За счет модификации разнообразных белков-мишеней убиквитшшрование участвует в регуляции таких важнейших клеточных процессов, как пролиферация и дифференцировка, репарация ДНК, передача внутриклеточного сигнала, апоптоз и иммунный ответ Естественно, что любой сбой в системе убиквитина ведет к развитию разного рода патологий, в том числе злокачественных новообразований и нейродегенеративных заболеваний Регуляторное значение убиквитилирования для физиологии клетки вполне сопоставимо со значением фосфорилирования, а по разнообразию осуществляемых через него функций превосходит все известные посттрансляционные модификации Все это определяет актуальность исследований в данной области
При этом далеко не все убиквитин-зависимые механизмы на сегодняшний день полно охарактеризованы Это связано с тем, что кодируемый
убиквитилированием сигнал гетерогенен и определяется как типом
модификации (присоединение одного остатка убиквитина или мультиубиквитиновых цепей различного строения), так и специфичностью сайтов убиквитилирования Изучение механизмов и молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования невозможно без определения специфических сайтов модификации, так как присоединение убиквитина по разным остаткам лизина различным образом влияет на судьбу белка-мишени и может давать старт различным клеточным процессам
Прямая идентификация сайтов убиквитилирования открывает возможности для анализа пространственного расположения присоединенного остатка убиквитина по отношению к функционально важным участкам поверхности белка-мишени Это позволяет анализировать и прогнозировать прямые эффекты убиквитилирования, реализующиеся на уровне индивидуального белка-мишени и непосредственно затрагивающие его функциональную активность.
Цели и задачи исследования
Цель работы - идентифицировать сайты убиквитилирования ряда белков и определить функциональное значение данных сайтов в регуляторном контексте. В качестве объектов исследования были выбраны 2 различных клеточных процесса
1) Убиквитин-зависимая внутриклеточная передача сигнала с участием рецептора эпидермального фактора роста,
2) Убиквитин-зависимый механизм репарации ДНК у дрожжей, опосредованный ферментативным комплексом Ubcl3/Mms2
В соответствии с целью и выбором объектов исследования были поставлены следующие задачи
1) Проанализировать механизм убиквитилирования рецептора ЭФР и определить сайты модификации в процессе эндоцитоза с помощью методов масс-спектрометрии,
2) Идентифицировать сайты модификации в процессе аутоубиквитилирования фермента Ubcl3 in vitro,
3) Проанализировать функциональное значение обнаруженных сайтов модификации с точки зрения молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования;
4) На основании полученных данных и in sihco анализа выявить возможный механизм прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белков-мишеней
Научная новизна
Впервые с помощью методов масс-спектрометрии идентифицированы сайты убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) на поздней стадии эндоцитоза Обнаружено, что молекула EGFR может подвергаться убиквитилированию во внеклеточном лиганд-связывающем домене
Впервые показано, что дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubcl3 подвергается автоубиквитилированию в области N-конца Предполагается, что такая модификация может регулировать переключение между различными путями репарации ДНК
Впервые с помощью методов биоинформатики проанализированы пространственные структуры ряда убиквитин-белковых конъюгатов и предложен механизм прямого действия убиквитилирования на функциональную активность белков-мишеней, реализующийся за счет стерических ограничений
Научно-практическая значимость
Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения убиквитин-зависимых метаболических процессов В частности, в работе получены новые данные об участии убиквитина в процессах пострепликативной репарации ДНК и внутриклеточной передачи сигнала с участием рецептора эпидермального фактора роста. Ввиду огромного значения этих процессов для жизнедеятельности клетки и участия рассматриваемых систем в патогенезе рака, полученные в работе данные могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов к лечению злокачественных новообразований Используемый в данной работе экспериментальный подход, основанный на сочетании методов протеомики и биоинформатики, может в дальнейшем использоваться для анализа разнообразных молекулярно-физиологических процессов Материалы диссертации могут быть использованы в учебных лекционных курсах по биохимии и биоинформатике
Основные положения, выносимые на защиту
1 Убиквитилирование белка EGFR в процессе эндоцитоза - крайне динамичный процесс, характеризующийся наличием разнообразных модифицированных форм, отличающихся между собой как сайтами убиквитилирования, так и числом присоединенных молекул убиквитина. При этом эффективность убиквитилирования EGFR зависит от активности тирозинкиназного домена рецептора и наличия полноразмерного С-конца, который необходим для достижения высокой степени модифицированное™
2 Дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubcl3 при отсутствии адаптерного белка Mms2 способен автоубиквитилироваться по нескольким остаткам лизина Автоубиквитилирование белка Ubcl3 по остатку лизина, находящемуся на N-конце молекулы (Lys 14), не ведет к протеасомной деградации Ubcl3. Такая модификация может блокировать сборку комплексов Ubcl3 с убиквитинлигазами в отсутствие Mms2 Данный механизм предположительно задействован в переключении процессов пострепликативной репарации ДНК с безошибочного на мутагенный путь
3 Присоединение убиквитина может напрямую влиять на функциональную активность белка-мишени за счет реализации стерических эффектов,
вызванных перекрыванием молекулой убиквитина
функционально важных зон на поверхности субстрата Этот регуляторный феномен имеет сайт-специфичный характер
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях
- 30th FEBS Congress & 9th IUBMB Conference "Protein World" (Budapest, Hungary, 2005)
- XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006)
- 5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, Russia, 2006)
- EMBO Practical Course "Ubiquitin and SUMO" (Split, Croatia, 2006)
- EMBO Practical Course "Bioinformatics for Mass Spectrometiy in Proteomics" (Les Diablerets, Switzerland, 2006)
- Annual joint meeting of the Genetics Society and the British Societies for the Cell and Developmental Biology (Edinburgh, UK, 2007)
- 4th International Symposium on Computational Methods m Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (Moscow, Russia, 2007)
- EMBO Conference "Ubiquitm and Ubiquitin-like Modifiers in Cellular Regulation" (Riva Del Garda, Italy, 2007)
- II Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007)
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на /с^? страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы источник) Работа иллюстрирована рисунками и содержит £ таблиц
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы
Реактивы Все использованные реактивы были аналитического качества или лучше, производства фирм Sigma, Reanal и др Для приготовления всех использованных в работе растворов использовалась вода высшей степени очистки MilhQ, полученная на установке фирмы Millipore
Рекомбинантные белки Дрожжевые белки GST-Ubcl3, GST-Ubcl3 K92R и Mms2, а также убиквитин-активирующие ферменты Е1 человека, пшеницы и дрожжей были ранее получены в лаборатории д-ра Ульрих (Cancer Research UK) Также использовали белок Е1 млекопитающих производства Boston Biochem В работе использовался убиквитин дикого типа из эритроцитов коровы (Sigma) и мутантные формы убиквитина с заменой на аргинин лизина 63 (K63R) или всех остальных лизинов убиквитина (K63only)(Boston Biochem)
Антитела В работе были использованы кроличьи поликлональные антитела к следующим антигенам убиквитин (DAKO), EGFR (Cell Signaling), Ubcl3 (Boston Biochem), а также мышиные моноклональные к экстраклеточному домену EGFR (Sigma), белку с-СЫ (Ceil Signaling) и фосфотирозину (Sigma) В качестве
вторичных антител при иммуноблоттинге использовали козьи
антитела, полученные против иммуноглобулинов кролика, сконъюгированные с пероксидазой (GAR-HRP) и козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов мыши, сконъюгированные с пероксидазой (GAM-HRP) (Sigma)
Реакция убиквитилирования т vitro
Реакционная смесь содержала по 5 цМ рекомбинантных белков Übe 13 и Mms2, 70-190 nM El, по 10 шМ АТФ и дитиотреитола, 10 гаМ MgCl2, 50 mM NaCl, 25 mM TrisHCl (pH 7,5) и убиквитин в концентрации 0,5 мг/мл Реакция проводилась при 30°С в течение 1-12 часов, остановка инкубации осуществлялась добавлением эквивалентного объема 2Х буфера Лэммли и нагреванием до 65°С в течении 15 минут
Так как в эксперименте использовались рекомбинантные варианты белка Ubcl3, слитые с остатком глутатион-З-трансферазы (GST), перед масс-спектрометрическими исследованиями проводилось отщепление GST тромбином (Novagen) в соответствии с рекомендациями производителя Культивирование клеточных линий
Клетки эпидермоидной карциномы человека А431, а также клетки, полученные на основе фибробластов мыши линии NIH ЗТЗ и экспрессирующие нормальные или мутантные формы рецептора ЭФР человека (HER14, CD165, CD123, CD63 и K721R), были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН) Клетки культивировались в чашках Петри с использованием среды Игла, модифицированной Дюльбекко (DMEM), содержащей 10% (v/v) эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (РАА) Инкубация проводилась 2-3 суток при 37°С в атмосфере 5%-ного С02 Перед проведением опыта клетки переводились на обедненную среду, содержащую около 0,1% сыворотки
Стимуляция эндоцитоза с предварительным связыванием лиганда
Монослойные культуры клеток инкубировали в рабочей среде DMEM, содержащей 0,1% БСА (Sigma) и 20 мМ HEPES (pH 7,4) при 4°С в течение 60 мин в присутствии ЭФР в концентрации от 20 до 100 нг/мл После отмывки несвязавшегося эпидермального фактора роста эндоцитоз стимулировали переводом клеток в рабочую среду, не содержащую лиганда, при температуре 37 С на определенное время По окончании инкубационного периода клетки помещали на лед, среду удаляли Иммунопреципитация
Клетки лизировали в буфере, содержащем 1% (w/v) Тритона Х-100, 0,5% (w/v) NP40, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM PMSF, 20 mM Tns-HCl (pH 7,6), 1 mM ортованадата натрия, 1 mM N-этилмалеимида и 1 500 коктейля ингибиторов протеаз (Sigma) Концентрацию белка измеряли по методу Лоури (Lowry et al, 1951) Параллельные пробы уравнивались по концентрации белка. Инкубацию с антителами проводили при 4°С 10-12 часов при перемешивании Затем добавляли сефарозу, конъюгированную с A/G-белком, по 10 мкл на пробу, и инкубировали еще 4 часа при тех же условиях После отмывки 3 раза на льду лизисным буфером к сефарозе добавляли 2-кратный раствор буфера Лэммли и кипятили 2 раза по 5 минут, центрифугировали 1 минуту на 12000 об/мин, отобранный буфер в дальнейшем использовали дтя электрофореза
Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS
Электрофорез в геле проводили по методу Лэммли (Laemmli et al, 1970) с использованием камеры Mini Protean (Bio-Rad) При необходимости белки перед
нанесением концентрировали осаждением в 10% растворе ТХУ Осажденные белки растворяли в буфере для проб (0,0625 M Tns-HCl, pH 6,8, 10% глицерин, 0,001% бромфеноловый синий, 5% ß-меркаптоэтанол, 2,3% SDS), pH 6,8 По окончании электрофореза гель использовали для последующего иммуноблоттинга или окрашивали 30-60 мин в растворе, содержащим Coomassie Blue R250, 40% метанола, 10% уксусной кислоты Несвязанный краситель удаляли отмывкой геля в растворителе (40% метанол, 10% уксусная кислота) Иммуноблотгинг
Белки переносили из полиакриламидного геля на мембрану методом полусухого или мокрого переноса с помощью блотгеров Bio-Rad Использовали поливинилиден-дифлюоридную (PVDF) мембрану Problot-Membran (Applied BioSystems) или нитроцеллюлозную мембрану Immobilon-P (Millipore) Визуализация результатов блотганга проводилась с помощью метода хемилюминисценции, в соответствии с методическими рекомендациями производителя набора для детекции ECL Western Blotting Analysis System (Amersham Biosciences) Трипсинолиз и экстракция пептидов
Вырезанные из полиакриламидного геля белок-содержащие полосы измельчались скальпелем и многократно промывались смесью ацетонитрила и 50 тМ бикарбоната аммония в равных объемных долях для удаления красителя После добавления к кускам геля рабочего раствора трипсина (50 нг модифицированного свиного трипсина в 10 мкл 50 тМ раствора аммония бикарбоната) пробы оставлялись на льду на 20 мин для вхождения трипсина в гель Затем добавляли 30 мкл 50 тМ раствора бикарбоната аммония и инкубировали пробы 4 часа при температуре 37°С После инкубации пептиды экстрагировали из геля 5% муравьиной кислотой и высушивали на SpeedVac (Thermo Savant) Масс-спектрометрия с MALDI-ионизацией
Высушенные экстракты пептидов ресуспендировали в растворе 50% (v/v) ацетонитрила и 0,1% (v/v) трифторуксусной кислоты и наносили на мишень MALDI в смеси с эквивалентным количеством раствора матрицы (альфа-циано-4-гидрокси-В-фенилакриловая кислота в концентрации 10 мкг/мкл) Раствор матрицы также содержал 20 фемтомолей ангиотензина I в качестве внутреннего стандарта калибровки и 3,3 наномоля монофосфата аммония для подавления образования побочных продуктов Нанесенный на мишень раствор высушивали и анализировали на времяпролетном масс-спектрометре ABI 4700 Proteomic Analyser (Applied Biosystems) Сгенерированные спектры калибровали по пикам пептидов, соответствующих ангиотензину I (1296,6853 а.ме) и/или продуктам автолиза трипсина (842,5100 аме и 2211,1046 ам е) с помощью программного пакета ABI Data Explorer (Applied Biosystems) Поиск совпадений масс пептидов проводили по базе данных ÑCBInr с помощью инструмента Protein Prospector MS-FIT (http //prospector ucsf edu/)
Масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса
Смесь триптических пептидов в растворе 50% (v/v) ацетонитрила и 0,1% (v/v) трифторуксусной кислоты анализировалась на гибридном масс-спектрометре LTQ-FT (Thermo Electron) с HPLC-хроматографом Agilent 1100 (Agilent Technologies) Пептиды вначале загружали в микрокапиллярную колонку с материалом CI8 для обратнофазовой хроматографии Элюирование пептидов проводили линейным градиентом 5-40% буфера А (97,5% ацетонитрил/0,15% муравьиная кислота) в буфере Б (2,5% ацетонитрил/0,15% муравьиная кислота) Разделенные фракции напрямую поступали в масс-спектрометр Снятие спектров проходило в режиме автоматического переключения на тандемную масс-спектрометрию в зависимости от
интенсивности сигнала Полученные спектры анализировались с помощью алгоритма Phenyx (http //phenyx vital-it ch/pwiA с использованием баз данных белковых последовательностей NCBInr и Swiss-Prot, с обязательной ручной верификацией результатов
БиоинформатическиП аналнз убиквитилирования белков
Аминокислотные последовательности анализируемых бечков были взяты из базы данных Swiss-Prot (http //www expasy org/sprot/) (Gasteiger et al, 2003), известные 3D структуры - из базы данных Protein Data Bank (PDB, http //www rcsb org/pdbA (Berman et al, 2000) В случае отсутствия известных 3D структур проводили сравнительное моделирование пространственной структуры белковой глобулы с помощью сервиса Swiss-Model (Automated Comparative Protein Modelling Server, http //swissmodel expasv oral (Schwede et al, 2003) Последовательность активного центра выявляли с помощью инструмента ScanProsite (http //www expasv org/tools/scanprositeA (Gattiker et al, 2002) Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW (http //www ch embnet org/software/ClustalW htm) (Thompson et al, 1994) Локальная программа BioEdit Sequence Alignment Editor 7 0 5 2 (http //www mbio ncsu edu/BioEdit/bioedit html) (Hall, 1999) использовалась для попарного выравнивания последовательностей Выравнивание трехмерных структур производилось методом комбинаторного растягивания (http //cl sdsc edu/ce html) (Shmdyalov and Bourne, 1998) Участие аминокислот в межсубъединичных контактах рассчитывалось при помощи Protein-Protein Interaction Server v 15 (http //www biochem ucl ac uk/bsm/PP/server/) (Jones and Thornton, 1996) Для визуализации результатов и анализа моделей использовалась программа Swiss-PdbViewer (Guex and Peitsch, 1997)
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
In vivo исследование убиквитилирования рецептора эпидермального
фактора роста
Данная часть работы выполнялась совместно с Лабораторией динамики внутриклеточных мембран Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта Института цитологии РАН, г Санкт-Петербург (зав лабораторией - проф Е.С Корнилова) На данном этапе ставилась задача проанализировать механизмы убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в процессе эндоцитоза данного белка и осуществления им сигнальной функции EGFR - один из ключевых компонентов каскада передачи сигнала в клетках высших эукариот В ответ на связывание лиганда рецептор димеризуется, в результате активируется его тирозинкиназа, фосфорилирующая тирозины в области С-конца рецептора (Ullrich, Schiessinger, 1990) Активация тирозинкиназы в результате образования лиганд-рецепторного комплекса необходима для стимуляции всех внутриклеточных сигналов, идущих с рецептора ЭФР Фосфорилированные тирозины затем узнаются белком c-Cbl, который убиквитилирует EGFR
Нами было установлено, что паттерн убиквитилирования рецептора меняется в зависимости от прогрессии ЭФР-индуцированного эндоцитоза В клетках эпидермоидной карциномы человека А431 максимум убиквитилирования EGFR приходится на 30 минут после запуска эндоцитоза (рис 1) На стадии 90 минут уровень убиквитилирования заметно падает,
причем это изменение коррелирует с падением уровня фосфоршшрования. Эти наблюдения подтверждаются полученными ранее данными (МеШсоуа е( а!., 2006).
ЭФР (мин)
Рисунок 1. Паттерны модификации БОРИ на разных стадиях эндоцитоза.
Нами было проведено выделение модифицированных форм рецептора на разных стадиях эндоцитоза, соответствующих 5, 30 и 60 минутам после запуска ЭФР-стимулированного эндоцитоза, с помощью иммунопреципитации. Далее выделенные модифицированные формы рецептора анализировались масс-спекгромегрически. В пробе, соответствующей поздней стадии эндоцитоза (60 минут после добавления ЭФР) было успешно идентифицировано несколько | модифицированных пептидов, сводная информация по которым представлена в таблице 1.
Таблица 1.
Обнаруженные в эксперименте модифицированные пептиды ЕвГЯ.
Пептид Модификация Модифицированный остаток
УЬСЗОАРОТУУК Убиквитилирование К704
УК1РУА1К Убиквитилирование К715
ЗЬКЕ^оовуибсж Убиквитилирование К430
ЕЬУЕРЬТРЗОЕАРЫОАЬЬЯ Фосфорилирование Т669
ИРА08УдМ>УУШ(ЗРич[РАР511 Фосфорилирование У1086
Обнаружение фосфорилированного тирозина У1086 одновременно с убиквитилированными сайтами указывает на тесную взаимосвязь между этими : пост-трансляционными модификациями. Данный остаток тирозина в фосфорилированной форме вместе с У1068 и У1101 служит сайтом связывания адаптерного белка ОгЬ2, с помощью которого осуществляется непрямое связывание рецептора с убиквитин-протеин лигазой с-СЫ. Известно, что фосфорилирование 3-х остатков тирозина на С-конце ЕСРЯ, в том числе и У1086, необходимо для изменения конформации этого участка (Е^Ьауее е! а)., 1999). Фосфорилирование даже по минорным сайтам способно сильно влиять
на конформацию молекулы рецептора. В свою очередь, изменение конформации С-конца может быть существенным для ассоциации рецептора с убиквитин-лигазой с-СЫ и последующего убиквитилирования. Это подтверждается данными эксперимента по убиквитилированию мутантного ЕвРЯ с С-концевыми делециями, а также с инактивированным тирозинкиназным доменом рецептора (рис. 2).
В данной части работы было исследовано влияние С-концевого домена на убиквитилирование ЕСЕН. в процессе ЭФР-индуцированного эндоцитоза. В качестве модели использовалась панель клеточных линий МНЗТЗ, экспрессирующих человеческий рецептор дикого типа (линия НЕК14), рецептор, лишенный тирозинкиназной активности (К721Я), и укороченные формы рецептора с делециями 63,123 или 165 С-концевых аминокислот (С063, СО 123 и СШ65, соответственно). В таблице 2 представлена подробная характеристика клеточных линий по наличию в экспрессируемом рецепторе функционально значимых аминокислотных остатков.
Таблица 2.
Клеточная Сайт прямого Сайты непрямого связываия Активный
линия связывания с- с-СЫ (через СгЬ2) центр
СЫ тирозинкиназы
У1045 У1068 У1086 У1101 К721
НЕЮ4(\УТ) + + + + +
СП63 + + + + +
СБ 123 + - - - +
СБ 165 - - - - +
К721Я + + + + - (замена Кн>Я)
НЕШ4 СРбЗ СР123 СР165 К721И 1Р:еоек
\УВ:
Убиквитнн РУ
[ §•#'<!_______________
Рисунок 2. Делеции в С-концевом домене ЕС И К вызывают снижение убиквитилирования рецептора.__
К 15 306090 К 15 306090 К 15 306090 К 15 306090 К 1530 6090
1»
м мииайааа
ЕОЕЯ
Таким образом, С-концевой домен длиной в 63 аминокислотных остатка играет важную роль в модуляции степени убиквитилирования, несмотря на отсутствие в нем известных сайтов связывания с с-СЫ. При этом сайты непрямого связывания ЕвЕК. с убиквитин-лигазой, локализованные несколько
дальше от С-конца, необходимы для достижения высокой степени модифицированное™ рецептора.
Нами были идентифицированы 3 ранее неизвестных сайта убиквитилирования в молекуле EGFR, 2 из которых находятся в тирозинкиназном домене, и 1 - во внеклеточном лиганд-связывающем домене. Ранее в работе проф. Соркина и коллег также было идентифицировано несколько сайтов убиквитилирования в тирозинкиназном домене рецептора (Huang et al, 2006) и показано, что такая модификация регулирует сортировку и деградацию EGFR в лизосомах. Интересно, что обнаруженные нами сайты модификации не совпадают с идентифицированными группой Соркина, хотя также локализованы в тирозинкиназном домене (рис. 3).
Домены: Лиганб-связывающий
У
К.430
пм
Трансмембранный
Тирозинкиназный
/
С-концевой
У
Сайты
убиквитилирования
Кб 92
К? 04 К713
К715
К730 К843
К905
К946 J
Сайт прямого Y1045 ^ связывания с-СЫ
068 j Сайты непрямого Y1086 г" связывания с-СЫ Y1101J (через Grb2)
Рисунок 3. Локализация идентифицированных сайтов модификации в различных доменах молекулы EGFR. Черным цветом показаны ранее идентифицированные сайты (Huang et al., 2006); штриховкой - обнаруженные в настоящей работе. ПМ - плазматическая мембрана.
Это может свидетельствовать о специфической роли в процессе распознавания не столько самих точек убиквитилирования, сколько архитектуры мультиубиквитиновых цепей. С другой стороны, в результате деятельности деубиквитилирующих ферментов и с-СЫ паттерн модификации может меняться очень быстро. Сотрудники Соркина использовали культуру
клеток эпителия аорты свиньи РАЕ II и наблюдали убиквитилирование после 2 минут протекания эндоцитоза (Huang et al, 2006), в то время как мы изучали паттерн модификации в клетках А431 на 4-х разных стадиях эндоцитоза, что может объяснять различия в идентифицированных сайтах Следует отметить, что выбор временной точки в работе Соркина и коллег не совсем релевантен, т к в течение 2 минут эндоцитоза может быть эффективно интернализовано не более 10% молекул активированного рецептора (Корнилова и др, 1987), а следовательно, данная точка не отражает картины внутриклеточной сортировки рецепторных комплексов
Идентифицированные нами сайты убиквитилирования были найдены в пробе, соответствующей 60 минутам после запуска эндоцитоза в клетках В клетках А431 данная временная точка примерно соответствует поздней стадии внутриклеточной сортировки EGFR, на которой интернализованный рецептор переходит из ранних эндосом в поздние При этом для прохождения данной стадии необходимо доубиквитилирование рецептора (Melikova et al, 2006) В совокупности эти данные свидетельствуют, что для эффективной сортировки рецептора в поздние эндосомы и последущей деградации в лизосомах могут быть важны не столько определенные сайты убиквитилирования, сколько степень модификации, т е большое число присоединенных молекул убиквитина
Особенно интересен факт обнаружения акцепторного лизина во внеклеточном домене рецептора Принято считать, что убиквитилирование -процесс исключительно внутриклеточный, соответственно молекула EGFR также конститутивно убиквитилируется внутри клетки Однако ручной анализ спектров подтвердил достоверность идентификации Lys430 в качестве сайта убиквитилирования Кроме того, в литературе присутствуют свидетельства о существовании внеклеточной убиквитин-конъгирующей системы (Sawada et al, 2002, Sakai et al, 2003, Sakai et al, 2004, Baska et al., 2007) Таким образом, модификация внеклеточной части молекулы рецептора представляется вполне вероятной Если в дальнейшем возможность убиквитилирования молекулы EGFR во внеклеточном домене подтвердится, это может привести к открытию совершенно нового механизма регуляции за счет присоединения убиквитина Можно предположить, что убиквитилирование во внеклеточном домене будет интерферировать со способностью рецептора связывать лиганд и, таким образом, предотвращать активацию EGFR
Изучение механизма автоубиквитилирования дрожжевого убиквитин-конъюгирующего фермента Ubcl3 in vitro
Данная часть работы проводилась совместно с Лабораторией устойчивости к повреждениям ДНК Лондонского исследовательского института Cancer Research UK (руководитель лаборатории - д-р Хелле Ульрих) Объектом для исследования убиквитилирования in vitro послужил белок Ubcl3 - компонент Е2 комплекса убиквитин-протеин лигазы из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae Комплекс Übe 13 с адаптерным белком Mms2 синтезирует длинные мультиубиквитиновые цепи, полимеризованные по лизину-63, и взаимодействует с ЕЗ-ферментом Rad5 в так называемом Rad6-
пути пострепликативной репарации ДНК (Ulrich, 2000). Интересно, что в случае отсутствия адаптера Mms2, Ubcl3 катализирует реакцию переноса убиквитина на собственные остатки лизинов, т.е. автоубиквитилируется. Механизмы и физиологическое значение данного процесса оставались крайне плохо изученными, что и обусловило наше внимание к данному феномену.
Для идентификации сайтов модификации Ubcl3 на первом этапе требовалось оптимизировать реакцию автоубиквитилирования in vitro. Ранее было показано, что автоубиквитилирование человеческого Ubcl3 проходит по сайту Lys92 (McKenna et al., 2001). Нами было установлено, что кроме данного сайта, молекула дрожжевого Ubcl3 содержит дополнительные сайты модификации, т.к. мутантный белок Ubcl3 K92R сохраняет способность автоубиквитилироваться (рис. 4). Используемый в работе белок GST-Ubcl3 в немодифицированной форме мигрирует в полиакриламидном геле с массой около 55 кДа. При использовании антител к Ubcl3 были выявлены дополнительные полосы иммунореактивности в диапазоне масс от 55 до 72 кДа, что указывает на присутствие модифицированных убиквитином форм белка.
к Ubcl3wt Ubcl3 wt+Mms2 Kl K2 Ubcl3 K92R Ubcl3 K92R
0 2 4 0 2 4_0 2 4 0 2 4
Рисунок 4. Мутантный Übe 13 K92R сохраняет способность подвергаться автоубиквитилированию в отсутствие Mms2.
Антитела к Ubcl3. Внизу указана продолжительность инкубации в часах. К1 - реакционная смесь без убиквитина, К2 - реакционная смесь без Ubcl3.
После оптимизации условий реакции автоубиквитилирования Übe 13 in vitro реакция была масштабирована для получения количества продукта (модифицированного Ubcl3), достаточного для масс-спектрометрического анализа. Продукты реакции разделялись с помощью SDS-PAGE. После окраски геля Coommassie G250 интересующие нас полосы были вырезаны и отправлены для дальнейшего анализа в Центр анализа белков Cancer Research UK (Лондон, Великобритания). В результате анализа полученных спектров, сочетая результаты автоматического поиска и ручной обработки списка масс ионов, для
Ubcl3 удалось идентифицировать ряд специфических пептидов, один из которых содержит сайт убиквитилирования - Lys 14 (Таблица 3)
Таблица 3
Идентифицированные в эксперименте пептиды Ubcl3
Моноизотопная Пептид Позиция в
масса, Да последовательности
790 AREWTK 140-145
1027 IYHPNIDR 75-82
1185 TNWSPALQIR 93-102
2045 LVSDPVPGITAEPHDDNLR 15-33
2646 ETEK'LVSDPVPGITAEPHDDNLR 11-33
Звездочкой помечен модифицированный лизин (Lys 14).
Таким образом, в дополнение к ранее известному сайту модификации (Lys92) был идентифицирован остаток лизина, находящийся на N-конце молекулы (Lys 14) Этот феномен может играть роль в регуляции активности Ubcl3 Хотя вопрос о роли убиквитилирования именно остатка Lysl4 в молекуле фермента требует дальнейшего изучения, уже сейчас можно сказать, что такая модификация скорее всего не ведет к деградации белка в протеасоме, так как нами было показано, что ранее неизвестные сайты убиквитилирования преимущественно модифицируются ЕувбЗ-полимеризованными цепями (данные не показаны) Такая модификация может служить специфическим сигналом для узнавания Ubcl3 белками-партнерами, имеющими соответствующие убиквитин-связывающие домены. С другой стороны, возможно и ограничение взаимодействия фермента с такими белками из-за перекрывания специфических зон узнавания присоединенной молекулой убиквитина. Возможно, автоубиквитилирование Ubcl3 по одному или нескольким сайтам в отсутствие Mms2 - своего рода блокирующий механизм, делающий образование комплексов с любыми другими белками-партнерами невозможным
Известно, что Ubcl3 в качестве фермента Е2 способен взаимодействовать с несколькими RING-доменными убиквитинлигазами, в том числе с TRAF6 (Deng et al, 2000) и Rad5 (Ulrich, 2003) По данным ряда исследователей, это взаимодействие осуществляется через связывание RING-домена с областью N-конца Ubcl3 (Zheng et al, 2000, Moraes et al, 2001; Chan et al, 2001) Как видно из рис 5, идентифицированный нами сайт модификации находится непосредственно в зоне взаимодействия Этот факт позволяет предположить, что автоубиквитилирование по Lys 14 способно предотвращать взаимодействие Ubcl3 с Rad5, TRAF6 и другими RING-доменными лигазами в отсутствие Mms2 Для решения этого вопроса необходимо в дальнейшем точно определить области взаимодействия Ubcl3 с белками-партнерами
Рисунок 5. Схема взаимодействия комплекса Ubcl3/Mms2 субиквитином и ЕЗ лигазой. А-Уб - «акцепторная» молекула убиквитина; Д-Уб - «донорная» молекула убиквитина; RJNG - функциональный домен ЕЗ лигазы. Светлым кружком обозначен активный центр Ubcl3, черными - сайты автоубиквитилирования.
А-Уб
Mms2
RING
U be 13
Автоубиквитилирование Ubcl3 может иметь серьезные физиологические последствия в силу критической роли данного фермента в процессах репарации ДНК. В клетках эукариот существует система преодоления репликативного блока, позволяющая продолжить репликацию без удаления повреждений и включающая 2 пути. В первом случае включаются специализированные полимеразы с низкоспецифичными активными центрами, реплицирующие поврежденную ДНК с высокой вероятностью образования мутаций (т.н. error-prone transiesion synthesis). Второй вариант - исключение полимеразой поврежденных участков и считывание неповрежденной информации с новосинтезированной комплементарной цепи. Переключение между этими двумя путями осуществляется через варьирование паттерна модификации белка PCNA (Shelter, Ulrich, 2003). Моноубиквитилирование этого белка лигазным комплексом Rad6-Radl8 запускает мутагенную быструю репарацию, мультиубиквитилирование комплексом Ubcl3/Mms2-Rad5 - безошибочную аккуратную обработку поврежденных участков специализированными полимеразами (см. схему на рис. 6). При этом ЕЗ лигаза Rad5 пришивает к PCNA длинную мультиубиквитновую цепь, заранее собранную комплексом Ubcl3/Mms2. Специфичность полимеризации цепи по Lys63 определяет белок Mms2, роль которого заключается в правильном ориентировании остатков убиквитина. Таким образом, автоубиквитилирование Ubcl3 может предотвращать ассоциацию последнего с лигазой Rad5 в отсутствие Mms2, что позволяет избежать неспецифического убиквитилирования субстрата неправильно собранной мультиубиквитиновой цепью.
Мутагенный путь Безошибочный путь репарации репарации Рисунок 6. Схема переключения между двумя путями пострепликативной репарации ДНК за счет убиквитилирования белка PCNA (по Ulrich, 2007, с изменениями)._
Такая модификация Ubcl3 может быть «вышестоящим» механизмом переключения между двумя вышеописанными путями репарации. В результате нарушения сборки функционально активного комплекса Ubcl3/Mms2-Rad5 репарационные процессы могут переключаются на альтернативный мутагенный путь.
Insilico исследование влияния убиквитилирования на функциональную активность белков-мишеней
Идентификация точек убиквитилирования для множества разнообразных белков делает возможным системный анализ феномена убиквитилирования, т.е. изучение как механизмов самого убиквитилирования, так и последствий данного процесса для белков-мишеней. Особый интерес представляет изучение непротеолитических регуляторных эффектов убиквитилирования, так как далеко не все убиквитилированные белки подвергаются протеасомной деградации. Обнаруженные в данной работе сайты модификации EGFR и Ubcl3 также позволили нам оценить влияние убиквитилирования на судьбу этих белков. Полученные нами данные свидетельствуют, что убиквитилирование как EGFR, так и Ubcl3 не ведет к протеасомной деградации этих белков, а следовательно, имеет регуляторный характер. Регуляторные эффекты в данном случае могут реализовываться за счет влияния убиквитилирования на белок-белковые взаимодействия. Механизм подобной регуляции представляет особый интерес для изучения, вследствие почти полного отсутствия литературных сведений о его реализации. Поэтому нашей задачей на данном этапе работы было предсказание возможного прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белков-мишеней.
Для систематизации большого количества разрозненных данных об убиквитилированных белках, с целью сделать эти данные доступными для проведения комплексного анализа, нами была создана специализированная база данных UbiProt (http://ubiprot.org.ru). В настоящее время в базе данных представлена информация о более чем 400 индивидуальных белках из различных организмов; процесс внесения новых записей продолжается. Каждая запись состоит из блоков, объединенных на отдельной странице. Первый
информационный блок содержит общие характеристики белка название и синонимы, гены, организм-источник, а также общие свойства белковой молекулы - молекулярная масса, полная длина и длина зрелой формы Второй блок описывает особенности убиквитилирования белка и включает описание модифицируемого остатка/остатков лизина, а также тип убиквитилирования - количество присоединяемых молекул убиквитина и структуру разветвленных мультиубшсвитиновых цепей Следующий информационный блок посвящен ферментам системы убиквитилирования-деубиквитилирования - убиквитин-конъюгирующим белкам, убиквитин-протеин лигазам, деубиквитилирующим ферментам и неферментативным адапторным белкам, в случае, если эти компоненты известны Каждая запись содержит также ссылки на статьи, из которых получена информация об убиквитилировании данного белка Кроме того представлена перекрестная ссылка на соответствующую запись в Swiss-Prot/TrEMBL В случае, если для белка представлена пространственная структура, дается ссылка на соответствующую запись Protein Data Bank База данных оснащена полнотекстовой поисковой системой, использующей логические операторы
Из всего массива данных, депонированных в UbiProt, для дальнейшего анализа были отобраны растворимые белки с известными точками убиквитилирования, содержащие охарактеризованные функциональные домены Необходимым условием было также наличие экспериментальных данных о пространственной организации, или возможность моделирования структуры с высокой степень достоверности
В итоге были проанализированы следующие белки, дрожжевые ферменты оротидин 5'-фосфат декарбоксилаза (ODC) и пероксисомальная цитрат синтаза (PCS), кальмодулин позвоночных (СаМ) и Х-связанный ингибитор апоптоза (XIAP). Для проверки гипотезы о возможном прямом влиянии убиквитилирования на функциональную активность белков-мишеней был проведен анализ взаимного расположения сайтов убиквитилирования и функционально важных доменов выбранных белков Пример колокализации акцепторных лизинов и аминокислот активного центра фермента показан на рис. 7 В приведенном примере рассматривалось убиквитилирование оротидин 5'-фосфат декарбоксилазы (ODC) В работе (Peng et al, 2003) идентифицировано 3 сайта убиквитилирования ODC Lys93, Lys209 и Lys253 Анализ участия Lys93 в каталитическом акте показывает, что е-аминогруппа этого лизина участвует в формировании водородных связей с субстратом и Asp96 другой субъединицы (Miller et al, 2000) Таким образом, убиквитилирование белка по Lys93 и соответственно блокирование его £-аминогруппы будет приводить к полной потере ферментативной активности Это согласуется с данными литературы о потере активности при замене этого лизина на цистеин (Smiley, Jones, 1992) Кроме того, ODC проявляет свою ферментативную активность в гомодимерном состоянии Анализ поверхности димера показал, что акцепторный Lys93 находится в глубине активного центра, который сформирован обеими субъединицами ODC (рис 7).
Таким образом, внедрение убиквитина в область активного центра будет нарушать взаимодействие субъединиц
Lys93
Рисунок 7. Поверхность димера оротидин 5'-фосфат декарбоксилазы (ODC), доступная для растворителя, с отмеченными аминокислотами активного центра и акцепторными лизинами. Две субъединицы ODC отмечены соответственно светло- и темно-серым. Аминокислоты активного центра заштрихованы. Сайты убиквитилирования выделены черным._
Экспонированность 3-х потенциальных акцепторных лизинов в димерной форме ODC убывает в ряду 253-209-93. Экспонированность этих лизинов в мономерной форме практически одинакова. Это позволяет предположить, что Lys93 может быть модифицирован только в мономерной форме ODC. Lys209, который также может убиквитилироваться, находится очень близко к активному центру, и его модификация также может затрагивать связывание субстрата. Lys253 же расположен относительно далеко от активного центра, и его убиквитилирование не может вести к тем же последствиям с точки зрения стерической регуляции.
Проведенный in silico анализ выявил следующие прямые эффекты присоединения убиквитина, затрагивающие функциональную активность белков-мишеней:
1. убиквитилирование может стерически блокировать или ограничивать доступность функциональные домены и/или активный центр белка-мишени, как это было показано для ODC и PCS (рис. 8,А);
2. также оно может препятствовать гомо-олигомеризации, как в случае с ODC и PCS (рис. 8,В), и влиять на гетерологические взаимодействия белков, мешая связыванию белков-мишеней с их партнерами, как в случае с XIAP и СаМ;
3. взаимодействие с белками-партнерами также может нарушаться из-за ограничения конформационной подвижности, что наблюдается на примере кальмодулина.
и j А W \ i к j уЯг та тЩг «и А - ограничение доступности активного центра. Последовательно показаны: активный фермент; модификация лизина в активном центре; модификация лизина около «входа» в полость активного центра. В - нарушение формирования активного димера. Последовательно показаны: функциональный димер; модификация лизина в области межсубъединичного контакта; модификация рядом с областью контакта.
jX / I 4 1 WW в
Рисунок 8. Схема реализации прямых эффектов убиквитилирования (на примере ферментов ODC и PCS).
Весь спектр рассматриваемых эффектов реализуется за счет стерических ограничений, вносимых присоединением к молекуле фермента крупного модификатора. Особенно важно отметить, что для рассмотренных в данной работе белков реализация таких эффектов напрямую зависит от убиквитилирования конкретных остатков лизина, т.е. является сайт-специфичной. Любой из этих эффектов будет вести к падению активности модифицируемого белка. Таким образом, мы предполагаем наличие нового механизма регуляции белков за счет убиквитилирования. Следует отметить, что функциональные нарушения могут предшествовать дальнейшей убиквитин-зависимой трансформации белка-мишени, например, протеасомальной деградации. В то же время представляется вероятным, что влияние убиквитилирования на функцию ряда белков крайне важно с точки зрения регуляции и не зависит от катаболической функции, так как убиквитилирование обратимо. Под действием специфических деубиквитилирующих ферментов может происходить отщепление убиквитина от белка-мишени, что в рассматриваемых случаях будет сопровождаться восстановлением функции белков-мишеней.
Наши наблюдения, основанные на использовании биоинформатического подхода, хорошо согласуются с экспериментальными данными об убиквитилировании ряда других белков. В частности, для N0 синтазы показано преимущественное убиквитилирование неактивной мономерной формы, по сравнению с каталитически активным олигомером (Bender et al., 2000; Dunbar et al., 2004). Для цитохрома Р450 выявлена ко-локализация точки связывания убиквитина и активного центра, причем связывание убиквитина ведет к снижению ферментативной активности (Banerjee et al., 2000). Подобные стерические эффекты описаны также для сумоилирования, т.е. модификации белков убиквитиноподобным белком SUMO. Показано, что сумоилирование белка Е2-25К сильно снижает его ферментативную активность (Pichler et а!.. 2005). При этом модификация не ведет к конформационным изменениям или перекрыванию активного сайта Е2-25К, но присоединенный SUMO
перекрывает другой функционально важный участок поверхности белка-мишени, ответственный за специфические белок-белковые взаимодействия Интересно, что белок Е2-25К - классический убиквитин-конъюгирукмций фермент Е2 В данном случае наблюдается схожесть с механизмом регуляции, предполагаемым нами для иЬс13 в соответствующем разделе данной работы Таким образом, все приведенные выше данные свидетельствуют о биологической релевантности предлагаемого регуляторного механизма
ВЫВОДЫ
1 Идентифицирован ряд новых сайтов убиквитилирования рецепторного белка EGFR на поздней стадии эндоцитоза Обнаруженные сайты локализованы в тирозинкиназном (Lys704 и Lys715) и внеклеточном (Lys430) доменах рецептора Установлено, что С-концевой домен и активность тирозинкиназного домена рецептора необходимы для достижения высокой степени убиквитилирования молекулы EGFR
2 Показано, что дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubcl3 имеет дополнительный, ранее неизвестный сайт автоубиквитилирования - Lys 14 Модификация по данному сайту не ведет к протеасомальной деградации белка, а имеет регуляторное значение
3. Продемонстрировано влияние специфичности сайтов модификации на молекулярно-физиологические последствия убиквитилирования белков Ubcl3, ODC, PCS и XIAP
4. Предложен новый механизм регуляции функциональных свойств белков-мишеней за счет убиквитилирования Данный механизм реализуется за счет стерических эффектов, вызванных перекрыванием молекулой убиквитина функционально важных зон на поверхности субстрата
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:
1 Chernorudskiy A L Prediction of direct effects of protein ubiquitylation using computational analysis / Chernorudskiy A.L., Shonna A S, Garcia A, Gainullin M R. // Biophysics, 2006 V 51, S 1, P. 39-43.
2. Chernorudskiy A.L UbiProt: a database of ubiquitylated proteins / Chernorudskiy A.L., Garcia A, Eremin E V , Shorma A S, Kondratieva E V, Gainullin M R //BMC Biomformatics, 2007 V 8,N 1, Article 126
3 Кондратов К А Участие С-концевого домена рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) в регуляции убиквитинирования рецептора / Кондратов К А, Чернорудский АЛ., Амосова А.П, Корнилова ЕС// Цитология, 2007 Т 49, № 9, С 759-760
П. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и международных конференций
1 Chernorudskiy A L. UbiProt. a tool for the study of protein ubiquitylation / Chernorudsky A.L., Garcia A., Eremin E V., Gainullm MR// Keystone Symposia meeting "Ubiquitin and Signaling", Taos, New Mexico, USA, February 22-27, 2005 Abstract book, P. 46.
2 Chernorudskiy A L Spatial limitations caused by ubiquitylation analysis of 3D model of yeast peroxisomal citrate synthase-ubiquitin complex / Chernorudskiy A.L., Garcia A, Gainullm MR.//FEBS Journal, 2005, V. 272, S 1,P 106 З.Чернорудский АЛ Биоинформатический анализ влияния убиквитилирования на каталитическую активность ферментов / Чернорудский АЛ., Шорина А.С., Гарсия А , Корягин А С, Гайнуллин М Р. // XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2006 г, С 54
4 Chernorudskiy A L Direct influence of ubiquitylation on a target protein activity "loss-of-function" mechanism revealed by computational analysis / Chernorudskiy A.L., Shorina A.S, Garcia A, Gainullm MR // Proceedings of the Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Eds N. Kolchanov, R Hofest&dt), V. 1, P. 252-255 Novosibirsk, Russia, July 1622,2006
5 Chernorudskiy A L UbiProf a database of ubiquitylated proteins as a tool for computational analysis of ubiquitylation / Chernorudskiy A.L., Garcia A, Eremm E.V, Shorina A.S., Kondratieva E V, Gainullm M.R. // A joint meeting of the Genetics Society and the British Societies for the Cell and Developmental Biology, Edinburgh, UK, 29th March - 1st April 2007, P 102-103
6 Гайнуллин M P База данных UbiProt объектно-ориентированный Интернет-ресурс, посвященный убиквитилированным белкам / Гайнуллин М Р, Гарсия А, Чернорудский АЛ., Шорина А С, Кондратьева Е В., Еремин Е.В. // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 57 июня 2007 г, Пущино, С. 12-15.
7 Кондратов К А. Анализ влияния синтетического ингибитора тирозинкиназы рецептора ЭФР тирфостина AG1478 на фосфорилирование различных тирозиновых остатков рецептора / Кондратов К А., Амосова А.П, Чернорудский A.JL, Корнилова ЕС // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 5-7 июня 2007 г, Пущино, С. 6466.
8 Chernorudskiy A.L Ubiprot Database and analysis of protein ubiquitylation for application in pharmacological research / Chernorudskiy A, Garcia A,, Eremin E, Shonna-Zhabereva A., Kondratieva E., Gainullm M. // Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources, Moscow, Russia, September 1-5,2007, P. 88.
9 Chernorudskiy A.L Direct effects of protein ubiquitylation revealed by computational analysis / Chernorudskiy A., Shonna-Zhabereva A, Garcia A, Gamullin M // EMBO Conference "Ubiquitm and Ubiquitin-hke modifiers in cellular regulation", Riva Del Garda, Italy, September 22-26,2007, P 45.
Подписано в печать 07 07 2008 г Печать трафаретная Объем - 1,0 уел п л Заказ № 587 Тираж 100 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чернорудский, Александр Леонидович
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Компоненты системы убиквитина
1.1.1 Убиквитин — структура и свойства
1.1.2 Строение мультиубиквитиновых цепей и убиквитин- 8 белковых конъюгатов
1.1.3 Убиквитиноподобные белки
1.1.4 Убиквитин-связывающие домены
1.2 Механизм убиквитилирования и его регуляция
1.2.1 Организация ферментативного каскада 14 убиквитилирования
1.2.2 Узнавание субстратов убиквитин - лигазами
1.2.3 Деубиквитилирующие ферменты
1.2.4 Автоубиквитилирование
1.3 Клеточные функции убиквитилирования
1.3.1 Убиквитин - протеасомная система деградации белка
1.3.2 Непротеолитические функции убиквитилирования
1.4 Роль убиквитина в патологии
1.4.1 Нейродегенеративные заболевания
1.4.2 Гипоксия / ишемия
1.4.3 Злокачественные образования
1.5 Применение масс-спектрометрии для исследования 30 системы убиквитина
2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.2.1 Реакция убиквитилирования in vitro
2.2.2 Культивирование клеточных линий
2.2.3 Стимуляция эндоцитоза по схеме с 36 предварительным связыванием лиганда
2.2.4 Иммунопреципитация
2.2.5 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в 37 присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ГТААГ)
2.2.6 Иммуноблоттинг
2.2.7 Трипсинолиз и экстракция пептидов
2.2.8 Масс-спектрометрия с MALDI-ионизацией
2.2.9 Масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса
2.2.10 Биоинформатический анализ убиквитилирования 40 белков
3. Результаты и их обсуждение 42 3.1 In vivo исследование убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста
3.1.1 Функции EGFR и пути его внутриклеточной сортировки
3.1.2 Идентификация сайтов убиквитилирования EGFR
3.1.3 Влияние подавления тирозинкиназной активности 5 О EGFR на его убиквитилирование
3.1.4 Влияние С-концевого домена молекулы рецептора на 53 убиквитилирование EGFR
3.1.5 Обсуждение
3.2 Изучение механизма автоубиквитилирования 59 дрожжевого убиквитин-конъюгирующего фермента
Ubc 13 in vitro
3.2.1 Ubc 13 - функции и механизмы
3.2.2 Оптимизация реакции автоубиквитилирования Ubc
3.2.3 Идентификация сайтов убиквитилирования Ubc 13 с 67 помощью масс-спектрометрии
3.2.4 Обсуждение
3.3 In silico исследование влияния убиквитилирования на 73 функциональную активность белков мишеней
3.3.1 Создание базы данных убиквитилированных белков 73 UbiProt
3.3.2 Убиквитилирование оротидин 5'-фосфат 77 декарбоксилазы (ODC)
3.3.3 Убиквитилирование пероксисомальной цитрат синтазы 79 (PCS)
3.3.4 Убиквитилирование кальмодулина (СаМ)
3.3.5 Убиквитилирование Х-связанного ингибитора апоптоза 83 (XIAP)
3.3.6 Обсуждение
Выводы
Цитированная литература
Список основных сокращений и обозначений
Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция функциональных свойств белков за счет сайт-специфичного убиквитилирования"
Убиквитилирование представляет собой ковалентное присоединение небольшого белка убиквитина к акцепторному лизину, экспонированному на поверхности белка-мишени. Модифицированный таким образом лизин принято называть сайтом убиквитилирования. Молекула убиквитина содержит 7 остатков лизина, которые также могут служить сайтами убиквитилирования. В результате полимеризации нескольких молекул убиквитина формируются так называемые мультиубиквитиновые цепи, структура которых может варьировать. Показана множественность форм модификации белков убиквитином.
Процесс убиквитилирования катализируется иерархическим каскадом из 3-х ферментов: убиквитин-активирующего фермента Е1, убиквитин-конъюгирующего фермента Е2 и убиквитинлигазы ЕЗ. Следует отметить, что убиквитилирование обратимо, так как разнообразные деубиквитилирующие ферменты (DUBs) способны отщеплять убиквитин от субстратов, а также расщеплять мультиубиквитиновые цепи.
Механизмы убиквитин-зависимой регуляции контролируют большинство клеточных процессов эукариот. За счет модификации разнообразных белков-мишеней убиквитилирование участвует в регуляции таких важнейших клеточных процессов, как пролиферация и дифференцировка, реакция на стресс и патогены, репарация ДНК, передача внутриклеточного сигнала, апоптоз и иммунный ответ. Естественно, что любой сбой в системе убиквитина ведет к развитию разного рода патологий, в том числе злокачественных новообразований и нейродегенеративных заболеваний. Регуляторное значение убиквитилирования для физиологии клетки вполне сопоставимо со значением фосфорилирования, а по разнообразию осуществляемых через него функций намного превосходит все известные посттрансляционные модификации. Все это определяет актуальность исследований в данной области.
При этом далеко не все убиквитин-зависимые механизмы на сегодняшний день полно охарактеризованы. Это связано с тем, что кодируемый убиквитилированием сигнал гетерогенен и определяется как типом модификации (присоединение одного остатка убиквитина или мультиубиквитиновых цепей различного строения), так и специфичностью сайтов убиквитилирования. Изучение механизмов и молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования невозможно без определения специфических сайтов модификации, так как присоединение убиквитина по разным остаткам лизина различным образом влияет на судьбу белка-мишени и может давать старт различным клеточным процессам.
Применение масс-спектрометрии к исследованию системы убиквитина позволяет не только идентифицировать белки-мишени убиквитилирования, но и определять сайты модификации и архитектуру мультиубиквитиновых цепей. В свою очередь, прямая идентификация сайтов убиквитилирования открывает возможности для анализа пространственного расположения присоединенного остатка убиквитина по отношению к функционально важным участкам поверхности белка-мишени. Это позволяет в ряде случаев спрогнозировать прямые эффекты убиквитилирования, реализующиеся на уровне индивидуального белка-мишени и непосредственно затрагивающие его функциональную активность.
Цель работы — идентифицировать сайты убиквитилирования ряда белков и определить функциональное значение данных сайтов в регуляторном контексте. В качестве объектов исследования были выбраны 2 различных клеточных процесса:
1) Убиквитин-зависимая внутриклеточная передача сигнала с участием рецептора эпидермального фактора роста;
2) Убиквитин-зависимый механизм репарации ДНК у дрожжей, опосредованный ферментативным комплексом Ubcl3/Mms2.
В соответствии с целью и выбором объектов исследования были поставлены следующие задачи:
1) Проанализировать механизм убиквитилирования рецептора ЭФР и определить сайты модификации в процессе эндоцитоза с помощью методов масс-спектрометрии;
2) Идентифицировать сайты модификации в процессе аутоубиквитилирования фермента Ubcl3 in vitro;
3) Проанализировать функциональное значение обнаруженных сайтов модификации с точки зрения молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования;
4) На основании полученных данных и in silico анализа выявить возможный механизм прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белков-мишеней.
1. Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чернорудский, Александр Леонидович
Выводы:
1. Идентифицирован ряд новых сайтов убиквитилирования рецепторного белка EGFR на поздней стадии эндоцитоза. Обнаруженные сайты локализованы в тирозинкиназном (Lys704 и Lys715) и внеклеточном (Lys430) доменах рецептора. Установлено, что С-концевой домен и активность тирозинкиназного домена рецептора необходимы для достижения высокой степени убиквитилирования молекулы EGFR.
2. Показано, что дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubc 13 имеет дополнительный, ранее неизвестный сайт автоубиквитилирования - Lysl4. Модификация по данному сайту не ведет к протеасомальной деградации белка, а имеет регуляторное значение.
3. Продемонстрировано влияние специфичности сайтов модификации на молекулярно-физиологические последствия убиквитилирования белков Ubcl3, ODC, PCShXIAP.
4. Предложен новый механизм регуляции функциональных свойств белков-мишеней за счет убиквитилирования. Данный механизм реализуется за счет стерических эффектов, вызванных перекрыванием молекулой убиквитина функционально важных зон на поверхности субстрата.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернорудский, Александр Леонидович, Нижний Новгород
1. Абрамова Е.В., Шарова Н.П., Карпов В.Л. Протеасома: разрушать, чтобы жить // Молекулярная биология. 2002. Т. 36, № 5. С. 761-776.
2. Бунеева О.А., Медведев А.Е. Убиквитин-протеинлигаза Паркин: роль в развитии болезни Паркинсона // Биохимия. 2006. Т. 71, № 8. С. 10501061.
3. Гайнуллин М.Р., Гарсия А. Роль системы убиквитина в патогенезе злокачественных новообразований // Нижегородский медицинский журнал. 2005. № 1. с. 128-134.
4. Говорун В.М., Арчаков А.И. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке // Биохимия. 2002. Т. 67, № 10. С. 1341-1359.
5. Горшков М.В., Харыбин О.Н., Вилков А.Н., Дривен В.В., Попов И.А., Даштиев М.И., Николаев Е.Н. Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса для биохимических исследований // Химическая физика. 2002. Т. 21, № 4. С. 32-38.
6. Ивахно С., Корнелюк А. Количественная протеомика и ее применение в системной биологии // Биохимия. 2006. Т. 71, № 10. С. 1312-1327.
7. Йенниссен Г.П., Хватова Е.М., Гайнуллин М.Р. Убиквитин фактор деградации белков клетки и регуляции ее функций. Роль в патологии // Нижегородский медицинский журнал. 2000. № 4. С. 104-109.
8. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431 // Цитология. 1987. Т. 29. С. 904-910.
9. Нолтинг Р. Новейшие методы исследования биосистем. М., «Техносфера», 2005. 256 с.
10. A1-Hakim A. K., Zagorska A., Chapman L., Deak M., Peggie M., Alessi D. R. Control of AMPK-related kinases by USP9X and atypical Lys(29)/Lys(33)-linked polyubiquitin chains // Biochem J. 2008. Vol.411, №2. P. 249-260.
11. Alves-Rodrigues A., Gregori L., Figueiredo-Pereira M.E. Ubiquitin, cellular inclusions and their role in neurodegeneration // Trends Neurosci. 1998. Vol. 21. P. 512-520.
12. Amerik A. Y., Li S. J., Hochstrasser M. Analysis of the deubiquitinating enzymes of the yeast Saccharomyces cerevisiae // Biol. Chem. 2000a. Vol.381, №9-10. P. 981-992.
13. Amerik A. Y., Nowak J., Swaminathan S., Hochstrasser M. The Doa4 Deubiquitinating Enzyme Is Functionally Linked to the Vacuolar Protein-sorting and Endocytic Pathways // Mol. Biol. Cell. 2000b. Vol.11, №10. P. 3365-3380.
14. Arnold J.E., Gevers W. Auto-ubiquitination of ubiquitin-activating enzymes from chicken breast muscle // Biochem. J. 1990. Vol.267. P. 751-757.
15. Ashley C., Pastushok L., McKenna S., Ellison M. J., Xiao W. Roles of mouse UBC 13 in DNA postreplication repair and Lys63-linked ubiquitination // Gene. 2002. Vol.285, №1-2. P. 183-191.
16. Bachmair A., Varshavsky A. The degradation signal in a short-lived protein // Cell. 1989. Vol.56, №6. P. 1019-1032.
17. Bairoch A. The ENZYME data bank // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 27. P. 3155-3156.
18. Banerjee A., Gregori L., Xu Y., Chau V. The bacterially expressed yeast CDC34 gene product can undergo autoubiquitination to form a multiubiquitin chain-linked protein // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, No. 8. P. 5668-5675.
19. Banerjee A., Kocarek T. A., Novak R. F. Identification of a ubiquitination-Target/Substrate-interaction domain of cytochrome P-450 (CYP) 2E1 // Drug Metab Dispos. 2000. Vol.28, №2. P. 118-124.
20. Banerjee A., Wade R. C. Elusive recognition determinants for ubiquitination //J. Mol. Recognit. 2002. Vol.15, №1. P. 3-5.
21. Bardag-Gorce F., van Leeuwen F. W., Nguyen V., French B. A., Li J., Riley N., McPhaul L. W., Lue Y. H., French S. W. The role of the ubiquitin-proteasome pathway in the formation of mallory bodies // Exp. Mol. Pathol. 2002. Vol.73, №2. P. 75-83.
22. Baska К. M., Manandhar G., Feng D., Agca Y., Tengowski M. W., Sutovsky M., Yi Y. J., Sutovsky P. Mechanism of extracellular ubiquitination in the mammalian epididymis // J. Cell Physiol. 2008. Vol.215, №3. P. 684-696.
23. Bender А. Т., Demady D. R., Osawa Y. Ubiquitination of neuronal nitric-oxide synthase in vitro and in vivo // J. Biol. Chem. 2000. Vol.275, №23. P. 17407-17411.
24. Berman H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T. N., Weissig H., Shindyalov I. N., Bourne P. E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. Vol.28, №1. P. 235-242.
25. Bonifacino J. S., Weissman A. M. Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. Vol.14. P. 19-57.
26. Brusky J., Zhu Y., Xiao W. UBC13, a DNA-damage-inducible gene, is a member of the error-free postreplication repair pathway in Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet. 2000. Vol.37, №3. P. 168-174.
27. Camus S., Higgins M., Lane D. P., Lain S. Differences in the ubiquitination of p53 by Mdm2 and the HPV protein E6 // FEBS Lett. 2003. Vol.536, №13. P. 220-224.
28. Chan N. L., Hill C. P. Defining polyubiquitin chain topology // Nat. Struct. Biol. 2001. Vol.8, №8. P. 650-652.
29. Chen A., Kleiman F. E., Manley J. L., Ouchi Т., Pan Z. Q. Autoubiquitination of the BRCA1*BARD1 RING ubiquitin ligase // J. Biol. Chem. 2002. Vol.277, №24. P. 22085-22092.
30. Chiu Y. H., Sun Q., Chen Z. J. E1-L2 activates both ubiquitin and FAT 10 // Mol. Cell. 2007. Vol.27, №6. P. 1014-1023.
31. Clague M. J. Membrane transport: a coat for ubiquitin // Curr. Biol. 2002. Vol.12, №15. P. R529-R531.
32. Clague M. J., Urbe S. Endocytosis: the DUB version // Trends Cell Biol. 2006. Vol.16, №11. P. 551-559.
33. Cooper H. J., Heath J. K., Jaffray E., Hay R. Т., Lam Т. Т., Marshall A. G. Identification of sites of ubiquitination in proteins: a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry approach // Anal. Chem. 2004. Vol.76, №23. P. 6982-6988.
34. Denis N. J., Vasilescu J., Lambert J. P., Smith J. C., Figeys D. Tryptic digestion of ubiquitin standards reveals an improved strategy for identifyingubiquitinated proteins by mass spectrometry // Proteomics. 2007. Vol.7, №6. P. 868-874.
35. Denison C., Kirkpatrick D. S., Gygi S. P. Proteomic insights into ubiquitin and ubiquitin-like proteins // Curr. Opin. Chem. Biol. 2005. Vol.9, №1. P. 69-75.
36. Dewar D., Graham D.I., Teasdale G.M., McCulloch J. Cerebral ischemia induces alterations in tau and ubiquitin proteins // Dementia. 1994. Vol. 5. P. 168-173.
37. Doskeland A. P. A method for simple identification of signature peptides derived from polyUb-K48 and K63 by MALDI-TOF MS and chemically assisted MS/MS fragmentation // Amino Acids. 2006. Vol.30, №1. P. 99103.
38. Fang S., Jensen J. P., Ludwig R. L., Vousden К. H., Weissman A. M. Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53 // J. Biol. Chem. 2000. Vol.275, №12. P. 8945-8951.
39. Finley D., Bartel В., Varshavsky A.The tails of ubiquitin precursors are ribosomal proteins whose fusion to ubiquitin facilitates ribosome biogenesis //Nature. 1989. Vol.338, №6214. P. 394-401.
40. Frampton J., Irmisch A., Green С. M., Neiss A., Trickey M., Ulrich H. D., Furuya K., Watts F. Z., Carr A. M., Lehmann A. R. Postreplication repair and PCNA modification in Schizosaccharomyces pombe // Mol. Biol. Cell. 2006. Vol.17, №7. P. 2976-2985.
41. Galcheva-Gargova Z., Theroux S.J., Davis R.J. The epidermal growth factor receptor is covalently linked to ubiquitin // Oncogene. 1995. Vol. 11. P. 2649-2655.
42. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis //Nucleic Acids Res. 2003. Vol.31, №13. P.3784-3788.
43. Gazit A., Osherov N., Gilon C., Levitzki A. Tyrphostins. 6. Dimeric benzylidenemalononitrile tyrphostins: potent inhibitors of EGF receptor tyrosine kinase in vitro И J. Med. Chem. 1996. Vol.39. P. 4905-4911.
44. Glickman M. H., Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction // Physiol Rev. 2002. Vol.82, №2. P. 373-428.
45. Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. Vol.18, №15. P. 2714-2723.
46. Haglund 1С., Dikic I. Ubiquitylation and cell signaling // EMBO J. 2005. Vol.24, №19. P. 3353-3359.
47. Haglund K., Sigismund S., Polo S., Szymkiewicz I., Di Fiore P. P., Dikic I. Multiple monoubiquitination of RTKs is sufficient for their endocytosis and degradation // Nat. Cell Biol. 2003. Vol.5, №5. P. 461-466.
48. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser. 1999. Vol.41. P. 95-98.
49. Haracska L., Unlc I., Prakash L., Prakash S. Ubiquitylation of yeast proliferating cell nuclear antigen and its implications for translesion DNA synthesis //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol.103, №17. P. 64776482.
50. Hatakeyama S., Jensen J. P., Weissman A. M. Subcellular localization and ubiquitin-conjugating enzyme (E2) interactions of mammalian HECT family ubiquitin protein ligases // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272, №24. P. 1508515092.
51. Hatakeyama S., Nakayama К. I. U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol.302, №4. P. 635-645.
52. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol.67. P. 425-479.
53. Hicke L., Schubert H. L., Hill C. P. Ubiquitin-binding domains //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol.6, №8. P. 610-621.
54. Hoeller D., Hecker С. M., Wagner S., Rogov V., Dotsch V., Dikic I. E3-independent monoubiquitination of ubiquitin-binding proteins // Mol. Cell. 2007. Vol.26, №6. P. 891-898.
55. Hofmann R. M., Pickart С. M. Noncanonical MMS2-encoded ubiquitin-conjugating enzyme functions in assembly of novel polyubiquitin chains for DNA repair// Cell. 1999. Vol.96, №5. P. 645-653.
56. Hofrnann R. M., Pickart С. M. In vitro assembly and recognition of Lys-63 polyubiquitin chains // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276, №30. P. 27936-27943.
57. Holler D., Dikic I. Receptor endocytosis via ubiquitin-dependent and -independent pathways // Biochem. Pharmacol. 2004. Vol.67, №6. P. 10131017.
58. Huang F., Kirkpatrick D., Jiang X., Gygi S., Sorkin A. Differential regulation of EGF receptor internalization and degradation by multiubiquitination within the kinase domain // Mol. Cell. 2006. Vol.21, №6. P. 737-748.
59. Jariel-Encontre I., Salvat C., Steff A. M., Pariat M., Acquaviva C., Furstoss O., Piechaczyk M. Complex mechanisms for c-fos and c-jun degradation // Mol. Biol. Rep. 1997. Vol.24, №1-2. P. 51-56.
60. Jennissen H.P. Ubiquitin and the enigma of intracellular protein degradation // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 231. P. 1-30.
61. Jentsch S., Pyrowolakis G. Ubiquitin and its kin: how close are the family ties? // Trends Cell Biol. 2000. Vol.10, №8. P. 335-342.
62. Jiang X., Huang F., Marusyk A., Sorkin A. Grb2 regulates internalization of EGF receptors through clathrin-coated pits // Mol. Biol. Cell. 2003. Vol.14, №3. P. 858-870.
63. Joazeiro C. A., Weissman A. M. RING finger proteins: mediators of ubiquitin ligase activity // Cell. 2000. Vol.102, №5. P. 549-552.
64. Johnston S. C., Riddle S. M., Cohen R. E., Hill C. P. Structural basis for the specificity of ubiquitin C-terminal hydrolases // EMBO J. 1999. Vol.18, №14. P. 3877-3887.
65. Jones S., Thornton J. M. Principles of protein-protein interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol.93, №1. P. 13-20.
66. Kakhniashvili D. G., Chaudhary Т., Zimmer W. E., Bencsath F. A., Jardine I., Goodman S. R. Erythrocyte spectrin is an E2 ubiquitin conjugating enzyme // Biochemistry. 2001. Vol.40, №38. P. 11630-11642.
67. Kirkpatrick D. S., Denison C., Gygi S. P. Weighing in on ubiquitin: the expanding role of mass-spectrometry-based proteomics // Nat. Cell Biol.2005. Vol.7, №8. P. 750-757.
68. Kumar S., Kao W. H., Howley P. M. Physical interaction between specific E2 and Hect E3 enzymes determines functional cooperativity // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272, №21. P. 13548-13554.
69. Laemmli U. K. Clevage of structural proteins during assembly of head of bacteriofage T4 //Nature. 1970. Vol. 227, №. 5259. P. 680-685.
70. Laine A., Ronai Z. Ubiquitin chains in the ladder of МАРК signaling // Sci. STKE. 2005. Vol.2005, №281. P. re5.
71. Laine A., Topisirovic I., Zhai D., Reed J. C., Borden K. L., Ronai Z. Regulation of p53 localization and activity by Ubc 13 // Mol. Cell Biol.2006. Vol.26, №23. P. 8901-8913.
72. Layfield R., Alban A., Mayer R. J., Lowe J. The ubiquitin protein catabolic disorders //Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2001. Vol.27, №3. P. 171-179.
73. Levkowitz G., Waterman H., Zamir E., Kam Z., Oved S., Langdon W. Y., Beguinot L., Geiger В., Yarden Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor // Genes Dev. 1998. Vol.12, №23. P. 3663-3674.
74. Li M., Brooks C. L., Wu-Baer F., Chen D., Baer R., Gu W. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2 // Science. 2003. Vol.302, №5652. P. 1972-1975.
75. Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. Vol.193, №1. P. 265-275.
76. Mattila Р. M., Roytta M., Torikka H., Dickson D. W., Rinne J. O. Cortical Lewy bodies and Alzheimer-type changes in patients with Parkinson's disease // Acta Neuropathol. 1998. Vol.95, №6. P. 576-582.
77. Mayer R. J. The meteoric rise of regulated intracellular proteolysis // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000. Vol.1, №2. P. 145-148.
78. McKenna S., Spyracopoulos L., Moraes Т., Pastushok L., Ptalc C., Xiao W., Ellison M. J. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human
79. DNA repair protein Mms2 is required for Ubc 13-mediated polyubiquitination // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276, №43. P. 40120-40126.
80. Meek D. W., Knippschild U. Posttranslational modification of MDM2 // Mol. Cancer Res. 2003. Vol.1, №14. P. 1017-1026.
81. Melikova M. S., Kondratov K. A., Kornilova E. S. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG132 // Cell Biol. Int. 2006. Vol.30, №1. P. 31-43.
82. Moraes T. F., Edwards R. A., McKenna S., Pastushok L., Xiao W., Glover J. N., Ellison M. J. Crystal structure of the human ubiquitin conjugating enzyme complex, hMms2-hUbcl3 //Nat. Struct. Biol. 2001. Vol.8, №8. P. 669-673.
83. Moms J. R., Solomon E. BRCA1 : BARD1 induces the formation of conjugated ubiquitin structures, dependent on K6 of ubiquitin, in cells during DNA replication and repair // Hum. Mol. Genet. 2004. Vol.13, №8. P. 807-817.
84. Nuber U., Schwarz S. E., Scheffner M. The ubiquitin-protein ligase E6-associated protein (E6-AP) serves as its own substrate // Eur. J. Biochem. 1998. Vol.254, №3. P. 643-649.
85. Okubo K., Yamano K., Qin Q., Aoyagi K., Ototake M., Nakanishi Т., Fukuda H., Dijkstra J. M. Ubiquitin genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) //Fish Shellfish Immunol. 2002. Vol.12, №4. P. 335-351.
86. Osley M. A. Transcription RINGs in repair // Nat. Cell Biol. 2005. Vol.7, №6. P. 553-555.
87. Ozkaynak E., Finley D., Solomon M. J., Varshavsky A. The yeast ubiquitin genes: a family of natural gene fusions // EMBO J. 1987. Vol.6, №5. P. 1429-1439.
88. Ozkaynak E., Finley D., Varshavsky A. The yeast ubiquitin gene: head-to-tail repeats encoding a polyubiquitin precursor protein // Nature. 1984. Vol.312, №5995. P. 663-666.
89. Passmore L. A., Barford D. Getting into position: the catalytic mechanisms of protein ubiquitylation // Biochem. J. 2004. Vol.379, №Pt 3. P. 513-525.
90. Pastushok L., Spyracopoulos L., Xiao W. Two Mms2 residues cooperatively interact with ubiquitin and are critical for Lys63poly ubiquitination in vitro and in vivo // FEBS Lett. 2007. Vol.581, №28. P. 5343-5348.
91. Peng J., Schwartz D., Elias J. E., Thoreen С. C., Cheng D., Marsischky G., Roelofs J., Finley D., Gygi S. P. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination // Nat. Biotechnol. 2003. Vol.21, №8. P. 921-926.
92. Pichler A., Knipscheer P., Oberhofer E., van Dijk W. J., Korner R., Olsen J. V., Jentsch S., Melchior F., Sixma Т. K. SUMO modification of the ubiquitin-conjugating enzyme E2-25K//Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol.12, №3. P. 264-269.
93. Pickart С. M. Targeting of substrates to the 26S proteasome // FASEB J. 1997. Vol.11, №13. P. 1055-1066.
94. Polo S., Sigismund S., Faretta M., Guidi M., Capua M. R., Bossi G., Chen H., De C. P., Di Fiore P. P. A single motif responsible for ubiquitinrecognition and monoubiquitination in endocytic proteins // Nature. 2002. Vol.416, №6879. P. 451-455.
95. Sakai N., Sawada H., Yokosawa H. Extracellular ubiquitin system implicated in fertilization of the ascidian, Halocynthia roretzi: isolation and characterization // Dev. Biol. 2003. Vol.264, №1. P. 299-307.
96. Sakai N., Sawada M. Т., Sawada H. Non-traditional roles of ubiquitin-proteasome system in fertilization and gametogenesis // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol.36, №5. P. 776-784.
97. Schmidt M. H., Dikic I. Ubiquitin and NEDD8: brothers in arms // Sci. STKE. 2006. Vol.2006, №362. P. e50.
98. Schwede Т., Kopp J., Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Res. 2003. Vol.31, №13. P. 3381-3385.
99. Shih S. C., Prag G., Francis S. A., Sutanto M. A., Hurley J. H., Hicke L. A ubiquitin-binding motif required for intramolecular monoubiquitylation, the CUE domain // EMBO J. 2003. Vol.22, №6. P. 1273-1281.
100. Shih S. C., Sloper-Mould К. E., Hicke L. Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors // The EMBO Journal. 2000. Vol.19, №2. P. 187-198.
101. Shin H., Okada K., Wilkinson J. C., Solomon К. M., Duckett C. S., Reed J. C., Salvesen G. S. Identification of ubiquitination sites on the X-linked inhibitor of apoptosis protein // Biochem. J. 2003. Vol.373, №Pt 3. P. 965-971.
102. Shindyalov I. N., Bourne P. E. Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path // Protein Eng. 1998. Vol.11, №9. P. 739-747.
103. Sigismund S., Polo S., Di Fiore P. P. Signaling through monoubiquitination // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2004. Vol.286. P. 149-185.
104. Smiley J. A., Jones M. E. A unique catalytic and inhibitor-binding role for Lys93 of yeast orotidylate decarboxylase // Biochemistry. 1992. Vol.31, №48. P. 12162-12168.
105. Stelter P., Ulrich H. D. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation // Nature. 2003. Vol.425, №6954. P. 188-191.
106. Strous G. J., Govers R. The ubiquitin-proteasome system and endocytosis//J. Cell Sci. 1999. Vol.112 ( Pt 10). P. 1417-1423.
107. Swaminathan S., Amerik A. Y., Hochstrasser M. The Doa4 Deubiquitinating Enzyme Is Required for Ubiquitin Homeostasis in Yeast // Mol. Biol. Cell. 1999. Vol.10, №8. P. 2583-2594.
108. Swanson K. A., Kang R. S., Stamenova S. D., Hicke L., Radhakrishnan I. Solution structure of Vps27 UIM-ubiquitin complex important for endosomal sorting and receptor downregulation // EMBO J. 2003. Vol.22, №18. P. 4597-4606.
109. Swerdlow P. S., Finley D., Varshavsky A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters // Anal. Biochem. 1986. Vol. 156. P. 147-153.
110. Terrell J., Shih S., Dunn R., Hicke L. A function for monoubiquitination in the internalization of a G protein-coupled receptor // Mol. Cell. 1998. Vol.1, №2. P. 193-202.
111. Torres-Ramos C. A., Prakash S., Prakash L. Requirement of RAD5 and MMS2 for postreplication repair of UV-damaged DNA in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell Biol. 2002. Vol.22, №7. P. 24192426.
112. Ullrich A., Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity // Cell. 1990. Vol.61, №2. P. 203-212.
113. Ulrich H. D. Natural substrates of the proteasome and their recognition by the ubiquitin system // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002a. Vol.268. P. 137-174.
114. Ulrich H. D. Protein-protein interactions within an E2-RING finger complex. Implications for ubiquitin-dependent DNA damage repair // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278, №9. P. 7051-7058.
115. Ulrich H. D., Jentsch S. Two RING finger proteins mediate cooperation between ubiquitin-conjugating enzymes in DNA repair // EMBO J. 2000. Vol.19, №13. P. 3388-3397.
116. Ulrich H. D. Degradation or maintenance: actions of the ubiquitin system on eukaryotic chromatin // Eukaryotic Cell. 2002b. Vol.1, №1. P. 110.
117. Urbe S., McCullough J., Row P., Prior I. A., Welchman R., Clague M. J. Control of growth factor receptor dynamics by reversible ubiquitination // Biochem. Soc. Trans. 2006. Vol.34, №Pt 5. P. 754-756.
118. Varadan R., Assfalg M., Haririnia A., Raasi S., Pickart C., Fushman D. Solution conformation of Lys63-linked di-ubiquitin chain provides clues to functional diversity of polyubiquitin signaling // J. Biol. Chem. 2004. Vol.279, №8. P. 7055-7063.
119. Varadan R., Walker O., Pickart C., Fushman D. Structural properties of polyubiquitin chains in solution // J. Mol. Biol. 2002. Vol.324, №4. P. 637-647.
120. Varshavsky A. The N-end rule pathway of protein degradation // Genes Cells. 1997a. Vol.2, №1. P. 13-28.
121. Varshavsky A. The ubiquitin system // Trends Biochem. Sci. 1997b. Vol.22, №10. P. 383-387.
122. Wang H., Wang L., Erdjument-Bromage H., Vidal M., Tempst P., Jones R. S., Zhang Y. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing//Nature. 2004. Vol.431, №7010. P. 873-878.
123. Waterman H., Levkowitz G., Alroy I., Yarden Y. The RING finger of c-Cbl mediates desensitization of the epidermal growth factor receptor // J. Biol. Chem. 1999. Vol.274, №32. P. 22151-22154.
124. Weekes J., Morrison K., Mullen A., Wait R., Barton P., Dunn M. J. Hyperubiquitination of proteins in dilated cardiomyopathy // Proteomics. 2003. Vol.3, №2. P. 208-216.
125. Weissman A. M. Themes and variations on ubiquitylation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. Vol.2, №3. P. 169-178.
126. Welchman R. L., Gordon C., Mayer R. J. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. Vol.6, №8. P. 599-609.
127. Wen R., Newton L., Li G., Wang H., Xiao W. Arabidopsis thaliana UBC13: implication of error-free DNA damage tolerance and Lys63-linked polyubiquitylation in plants // Plant Mol. Biol. 2006. Vol.61, №1-2. P. 241253.
128. Wen R., Torres-Acosta J. A., Pastushok L., Lai X., Pelzer L., Wang H., Xiao W. Arabidopsis UEV1D promotes Lysine-63-linked polyubiquitination and is involved in DNA damage response // Plant Cell. 2008. Vol.20, №1. P. 213-227.
129. Winkler G. S., Albert Т. K., Dominguez C., Legtenberg Y. I., Boelens R., Timmers H. T. An altered-specificity ubiquitin-conjugating enzyme/ubiquitin-protein ligase pair // J. Mol. Biol. 2004. Vol.337, №1. P. 157-165.
130. Xia Y., Pao G. M., Chen H. W., Verma I. M., Hunter T. Enhancement of BRCA1 E3 ubiquitin ligase activity through direct interaction with the BARD1 protein // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278, №7. P. 5255-5263.
131. Xu P., Peng J. Dissecting the ubiquitin pathway by mass spectrometry // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol.1764, №12. P. 1940-1947.
132. Yaish P., Gazit A., Gilon C., Levitzki A. Blocking of EGF-dependent cell proliferation by EGF receptor kinase inhibitors // Science. 1988. Vol. 242. P. 933-935.
133. Yamashita Т., Nakahata T. Current knowledge on the pathophysiology of Fanconi anemia: from genes to phenotypes // Int. J. Hematol. 2001. Vol. 74. P. 33-41.
134. Yamakami M., Yoshimori Т., Yokosawa H. Toml, a VHS domain-containing protein, interacts with tollip, ubiquitin, and clathrin // J. Biol. Chem. 2003. Vol.278, №52. P. 52865-52872.
135. Yamamoto M., Sato S., Saitoh Т., Sakurai H., Uematsu S., Kawai Т., Ishii K. J., Takeuchi O., Akira S. Cutting Edge: Pivotal function of Ubc 13 in thymocyte TCR signaling // J. Immunol. 2006b. Vol.177, №11. P. 75207524.
136. Yang Y., Yu X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way // FASEB J. 2003. Vol.17, №8. P. 790-799.
137. Yarden Y., Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases // Annu. Rev. Biochem. 1988. Vol. 57. P. 443-478.
138. Zheng N., Wang P., Jeffrey P. D., Pavletich N. P. Structure of a c-Cbl-UbcH7 complex: RING domain function in ubiquitin-protein ligases // Cell. 2000. Vol.102, №4. P. 533-539.
139. Zhou H., Wertz I., O'Rourke K, Ultsch M., Seshagiri S., Eby M., Xiao W., Dixit V. M. Bel 10 activates the NF-kappaB pathway through ubiquitination of NEMO //Nature. 2004. Vol.427, №6970. P. 167-171.
140. Zhu В., Zheng Y., Pham A. D., Mandal S. S., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Reinberg D. Monoubiquitination of human histone H2B: the factors involved and their roles in HOX gene regulation // Mol. Cell. 2005. Vol.20, №4. P. 601-611.
141. СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
142. Е1- убиквитин-активирующий фермент
143. Е2 убиквитин-конъюгирующий фермент
144. ЕЗ (УПЛ) убиквитин-протеин лигаза
145. УПЛК убиквитин-протеин лигазный комплекс1. АТФ аденозинтрифосфат
146. ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
147. ЭФР — эпидермальный фактор роста
148. EGFR рецептор эпидермального фактора роста
149. РТК рецепторные тирозинкиназы
150. DUB — деубиквитилирующий фермент
151. SDS-PAGE — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
152. MALDI матричная лазерная десорбция/ионизация
153. ESI ионизация электроспреем
154. ODC — оротидин 5'-фосфат декарбоксилаза
155. PCS пероксисомальная цитрат синтаза
156. MCS митохондриальная цитрат синтаза1. СаМ кальмодулин
157. XIAP Х-связанный ингибитор апоптоза АЦ - активный центр БД - база данных
158. УПБ — убиквитиноподобные белки AG1478 4-(3-Хлороанилино)-6,7-диметоксихиназолин а.м.е. — абсолютные массовые единицы а. к. - аминокислотный остаток
159. Названия аминокислот представлены в виде международного трехбуквенного латинского кода, в составе пептидов — в виде однобуквенного латинского кода
-
Чернорудский, Александр Леонидович
-
кандидата биологических наук
-
Нижний Новгород, 2008
-
ВАК 03.00.04
- Компьютерный анализ закономерностей кодирования функциональных сайтов белков в генах позвоночных
- Компьютерный контекстный анализ последовательностей ДНК мобильных генетических элементов
- Структурно-функциональная организация регуляторной области гена уридинфосфорилазы E. coli и Salmonella typhimurium
- Клонирование кДНК и функциональный анализ нового белка человека СВР1, принадлежащего к классу КН-доменных белков
- Регуляция функционирования промотора протоонкогена С-FOS в клетках линий тератокациномы мышей F9
