Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регистрация неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилирования

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регистрация неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилирования"

На правах рукописи

00345470Э Юрков Владимир Игоревич

Регистрация неравновесных состояний ме.мбраносвязанных но нов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилирования.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

003454709

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского Московского Государственного Университета им МБ Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ягужинский Лев Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Зинченко Валерий Петрович доктор биологических наук, профессор Кобляков Валерий Александрович

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Защита состоится 27 октября 2008 г. в №_ ч. на заседании

диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ, аудитория ББ^ .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан« 24 » <>2 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В.Медведева

а/

Регистрация неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилирования.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Известно, что мультиферментные системы клетки могут работать в двух качественно различных состояниях - в диссоциированном, когда ферменты работают независимо друг от друга, и в состоянии суперкомплекса (метаболона), когда ферменты тесно контактируют друг с другом. В первом случае продукты реакции выбрасываются в объем водной фазы, из которой избирательно захватываются активным центром следующего по цепи фермента. При образовании метаболона промежуточные продукты-субстраты не выбрасываются в водную фазу, а передаются по метаболической цепи от фермента к ферменту "из рук в руки". В случае мембранной системы окислительного фосфорилирования ключевым промежуточным продуктом окислительных реакций является ион водорода, обладающий избытком свободной энергии и выполняющий в митохондриях роль переносчика энергии окислительных реакций на АТФ-синтазный комплекс. Работа этой системы в форме суперкомплекса, когда ион водорода не выходит в водную фазу предполагает существование относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны. В настоящее время хорошо изучен и экспериментально обоснован первый механизм (модель Митчела). В этом случае ион водорода является основным промежуточным продуктом-субстратом реакции (который выполняет роль переносчика энергии окислительных реакций на ЛТФ-синтазный комплекс), выходит из мембраны в объем водной фазы (Mitchel, 1961). Второй механизм (модель Вильямса), предполагает возможность работы мультиферментных систем в форме суперкомплекса, при котором ионы водорода переносится от дыхательной помпы на АТФ-синтазный комплекс в составе суперкомплекса дыхательная помпа-мембрана-АТФ-синтаза без выхода в объем водной фазы (Williams, 1961). Существование такого механизма работы системы окислительного фосфорилирования до последнего времени не было однозначно показано. Усилия многих лабораторий направлены в настоящее время на выделение из митохондрий суперкомплексов, включающих основные элементы дыхательной цепи, а также АТФ-синтазу. В частности выделен суперкомплекс, включающий 1,1П и IV комплексы, входящие в состав дыхательной цепи митохондрий и предпринимаются также усилия для получения полного комплекса системы окислительного фосфорилирования (Stroh et al., 2004)

Ранее нам удалось обнаружить существование двух структурных состояний мембран митохондрий, переход между которыми контролировался системой осморегуляции (КгаБтБкауа е1 а1., 1989). Кинетические параметры системы сопряжения дыхания и фосфорилирования в одном из этих состоян соответствуют модели мультиферментного суперкомплекса. Эти наблюдения рассматривались нами как указание на существование системы окислительног фосфорилирования в двух состояниях, в одном из которых реализуется делокализованное, в другом - локальное сопряжение дыхания и фосфорилирования. Необходимым условием работы системы окислительного фосфорилирования в режиме локального сопряжения является способность ионов водорода достаточно долго существовать в мембраносвязанном состоянии после того как дыхательные Н^-помпы переносят его через гидрофобный изолирующий барьер мембраны. К настоящему времени на различных модельных системах показано, что реакция отрыва протона от поверхности липидных мембранных структур имеет при определенных условиях относительно высокий кинетический барьер, существование которо определяет возможность возникновения неравновесного состояния (пула) ион водорода, связанных с поверхностью мембраны (АпЮпепко с1 а1., 1993; СЬегерапоу е1 а1., 2004). Обнаружение такого пула при трансмембранном переносе ионов водорода через БЛМ показало возможность латерального переноса протонов вдоль поверхности мембраны без выхода в водную фазу, наблюдение, сделанное в нашей лаборатории на модельной системе доказало принципиальную возможность реализации механизма локального сопряжения митохондриях. Кроме того на модельной мембране (БЛМ) был найден катализатор отрыва Нт-ионов от поверхности мембраны и описана химическ природа пула мембраносвязанных Н+-ионов. Важно указать, что работ по изучению переноса протонов через межфазные границы внутренней мембрань митохондрий в условиях протекания процесса окислительного фосфорилирования до начала настоящего исследования не проводилось. Цели и основные задачи исследования. Настоящая работа направлена на экспериментальное обоснование возможности переноса протонов от дыхательных Н^-помп к АТФ-синтетазе в условиях работы системы окислительного фосфорилирования митохондрий в составе мембранного суперкомплекса (без выхода в водную фазу). Основное внимание было уделен изучению влияния катализаторов реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий на объем пула мембраносвязанных ионов водорода и на функционирование дыхательных Н*' помп и АТФ-синтазы. В соответствии с целью работы были поставлены конкретные задачи: 1) на фосфорилирующих митохондриях продемонстрировать образование пула мембраносвязанных ионов водорода н внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны в состоянии 3 по Чансу. 2) Показать участие пула мембраносвязанных ионов водорода в

работе системы окислительного фосфорилирования. 3) Сравнить влияние катализаторов отрыва Н+-ионов от поверхности мембраны на скорость дыхания в разобщенных и фосфорилирующих митохондриях. 4) Показать возникновение неравновесных состояний мембраносвязанных Н^-ионов в разобщенных митохондриях.

Научная новизна работы. Разработан метод ковалентной пришивки рН-зонда (ФИТЦ) к митохондриям, при использовании которого практически полностью сохраняется фосфорилирующая функция этих органелл. На препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий обнаружено явление катализа реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны.

На препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий, в условиях фосфорилирования зарегистрировано образование пула мембраносвязанных ионов водорода с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны. Тем самым было показано существование относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. Этот результат был подтвержден на препаратах интактных разобщенных митохондрий. Установлено, что мембраносвязанные ионы водорода принимают участие в процессе окислительного фосфорилирования. Найдена прямая корреляция между величиной неравновесного пула мембраносвязанных Н^-ионов и, с другой стороны, скоростью фосфорилирующего дыхания и эффективностью фосфорилирования (параметром ADP/0).

Практическое значение работы. Полученные результаты показали возможность работы системы окислительного фосфорилирования в режиме мультиферментного суперкомплекса, что является принципиально новой фундаментальной информацией о свойствах одной из важнейших систем энергообеспечения клетки. В работе показана возможность направленного регулирования скорости и эффективности работы системы окислительного фосфорилирования путем воздействия на внешнюю поверхность внутренней митохондриальной мембраны. Результаты этих экспериментов открывают новые подходы для лекарственной терапии заболеваний, связанных с нарушениями митохондриальной энергетики, а также для разработки методов, позволяющих управлять митохондриальной энергетической системой. Апробация. Результаты диссертационной работы были доложены на Ш съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005), Международной конференции "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке" (Москва, 2005), Международной конференции "Европейская конференция по биоэнергетике" (Москва, 2006), теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИФХБ им. Белозерского МГУ (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 101 странице и включает: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Приложение», «Список цитируемой литературы». В работе содержится 18 рисунков и 2 таблицы.

Материалы и методы исследования

Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования из печени белых крыс по стандартной методике. Опыты проводились в гипотонических условиях (120 мОсм). Среда выделения содержала 210 мМ маннитола, 40 мМ сахарозы, 10 мМ Тпб-НС1, 0,5 мМ ЭДТА (рН 7,5). Скорость дыхания митохондрий измеряли полярографическим методом с помощью кислородного электрода Кларка на полярографе ЬР-7Е. Условия экспериментов: использовано несколько сред инкубации, которые содержали: 1) 0,093 М сахарозы, ЗмМ НереБ (рН 7,5), 0,25 мМ ЭДТА натрия, 1мМ сульфата магния, 17 мМ КС1; 2) 0,068 М сахарозы, 20мМ Нереэ, (рН 7,5), 0,25мМ ЭДТА натрия, 1мМ сульфата магния, 3 мМКС1.

Величина коэффициента АДФ/О определялась полярографически по методу Чанса. Концентрацию белка определяли биуретовым методом. Присутствие локального Н+-градиента с наружной стороны внутренней мембраны митохондрий регистрировали по изменению степени диссоциации ковалентно присоединённого к митохондриям рН-зонда флуоресцеинизотиоционата (ФИТЦ) в ответ на добавление непроникающего катализатора реакции отрыва ЕГ-ионов от поверхности митохондриальной мембраны (НЕРЕБ). Измерения поглощения ФИТЦ проводили на спектрофотометре ШасЫ-557 (Япония) в дифференциальном режиме (Хт^ 499 нм). Метод получения препарата фосфорилирующих ФИТЦ-меченых митохондрий детально описан нами в работе (Солодовниковой И.М. и соавт., 2004, Биофизика, 49(1),47-56). Изменения величины трансмембралного потенциала регистрировали при помощи ТФФ+- селективного электрода. Регистрацию величины локальных Н+-градиентов при разных концентрациях непроникающего катализатора (НЕРЕБ), измерения скоростей дыхания и параметра АДФ/О, а также величины ДЧ* проводили параллельно на одних и тех же препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий в течение первых одного-двух часов после выделения. Стояние препарата митохондрий >1-2 часов при 0-4°С приводит к нарушению их интактности и обращению наблюдаемых эффектов. Скорости и значения параметров АБР/О при разных концентрациях катализатора были проведены также на интактных (немеченых ФИТЦ) митохондриях.

Результаты и обсуждение Метод идентификации и химическая природа высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности митохондриалыюй мембраны

(механизм катализа реакции отрыва Н* -ионов от поверхности мембраны)

Ранее на модельной системе (БЛМ) в нашей лаборатории было показано, что в условиях трансмембранного переноса Нойонов возникает неравновесный пул ионов водорода, связанных с поверхностью бислоя в форме протонированных карбоксильных групп фосфатидилсерина (ФС), входящего в состав мембраны (АпЮпепко й а!., 1993). При отсутствии ФС в составе бислоя пул мембраносвязанных ЬГ-ионов близок к нулевому значению. Образование такого неравновесного состояния ионов водорода, связанных с основаниями Льюиса на поверхности мембраны свидетельствует о существовании относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва протона от поверхности мембраны в объем водной фазы. Высота этого барьера определяется фактически соответствующей энергией активации (Е0) диссоциации карбоксильных групп, в зоне межфазной границы (связанной с взаимодействием между основанием Льюиса (5") и ионом водорода (б4) в переходном состоянии) (рис.1). Реакцию можно записать в виде (1а): ЛСООН—>[ЯССЮ ' ■ Н 1—>ЯСОО +Н (1а)

координаты реакции

Рис. 1 Переходное состояние реакции отрыва протона от поверхности мембраны (Д-мембраны).

Катализатор ('Л\т11з) обладает электронодонорными свойствами, он уменьшает положительный заряд на водороде в переходном состоянии, соответственно снижая высоту кинетического барьера ускоряя реакцию отрыва Н+-ионов (16,1в).

[ЯСОО3" Н-йй, ] КСОО + ИШ3 -» КЯ, + Н" (16) ШЯз КЫ3 + Н+ (1в)

Наблюдающееся в таких условиях ускорение трансмембранного переноса Н+-ионов говорит о том, что процесс переноса лимитирован стадией отрыва Нойонов от границы БЛМ.

Обнаружение эффекта катализа реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны фосфорилирующих митохондрий

В настоящей работе, в опытах на фосфорилирующих митохондриях по существу был использован такой же подход, что и в работе на БЛМ с тем различием, что вместо прямого измерения тока ЬГ- ионов через мембрану измерялась скорость дыхания, которая жестко скоррелирована со скоростью потока электронов в дыхательной цепи и трансмембранным транспортом Нойонов. В качестве катализатора отрыва Н+- ионов от внешней поверхности внутренней мембраны было использовано слабое основание (НЕРЕБ), которое слабо проникает через митохондриальную мембрану. Поэтому такой катализатор избирательно ускоряет реакцию диссоциации Н*- кислот (и в том числе рН-зонда ФИТЦ, коватентно присоединенного к мембране) только с внешней поверхности мембраны митохондрий. Благодаря этому, мы смогли избирательно зарегистрировать снижение неравновесного пула мембраносвязанных ионов водорода на митохондриях, равномерно меченых ФИТЦ. Существование относительно высокого барьера в реакции отрыва протона от мембраны было показано нами двумя независимыми способами: путем регистрации увеличения степени диссоциации и соответственно экстинкции рН-зонда (ФИТЦ) на внешней поверхности мембраны в ответ на добавление катализатора в условиях работы дыхательных ЬГ-помп, а также кинетическим методом - по изменению скорости дыхания митохондрий после добавления того же катализатора. Вслучае разобщенных митохондрий удалось увидеть, что скорость дыхания лимитирована реакцией отрыва Н+-ионов от мембраны.

I. Регистрация возникновения неравновесного пула ионов водорода с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны в условиях работы дыхательных Н+ - помп.

Использование непроникающих катализаторов отрыва Н+-ионов от мембраны позволило нам варьировать объем неравновесного пула мембраносвязанных ионов водорода с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий, возникающего при работе дыхательных Н+-помп. В свою очередь это дало возможность проследить корреляцию между объемом указанного пула и скоростью дыхания в разобщенных и фосфорилирующих митохондрий. При этом была найдена корреляция между объемом пула и эффективностью (КПД) фосфоршгарования - параметром АБР/О.

Регистрация изменений экстинкции ФИТЦ-зонда в препаратах митохондрий проводились в дифференциальном режиме в двух параллельных пробах, содержащих разное количество катализатора (НЕРЕ8 ЗшМ и 20 тМ) в соответствии с протоколом, подробно описанным в разделе «Материалы и методы исследования». О существовании пула мембраносвязанных протонов на внешней поверхности мембраны в условиях работы дыхательных Н - помп судили по увеличению степени диссоциации ковалентно связанного рН-зонда (в равномерно меченых митохондриях) в ответ на повышение концентрации катализатора. Катализатор ускоряет реакцию отрыва Н4" -ионов от поверхности (см. выше реакция I) и тем самым увеличивает степень диссоциации Н4'- кислот на поверхности, (и в том числе степень диссоциации зонда ФИТЦОН) на поверхности мембраны (рис.2) (при этом возрастает степень диссоциации и, соответственно, экстинкции зонда - ДОЛ).

Рис.2 Дифференциальные спектры ФИТЦ-меченых митохондрий в условиях работы дыхательных Н1' - помп при высокой (а) и низкой (б) концентрациях непроникающего катализатора. Субстрат дыхания сукцинат, добавлен ротенон. В контрольной кювете добавлен ТТТА. Наблюдаемое увеличение поглощения, обусловленное повышением степени диссоциации зонда связано со снижением активности Н* - ионов с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий после добавления высоких концешраций катализатора (НЕРЕБ) в среду инкубации. Падение локального Н+ -градиента под действием катализатора является свидетельством существования неравновесного пула мембраносвязанных Нойонов.

Можно видеть, что экстинкция рН-зонда при высокой концентрации непроникающего катализатора (НЕРЕБ) (рис. 2а) выше, чем при низкой концентрации (рис. 26). Наблюдаемое различие в величине абсорбции ФИТЦ-зонда показывает присутствие градиента активности И1"- кислот с наружной стороны внутренней митохондриальной мембраны.

Результаты экспериментов, проведенных на митохондриях при разных концентрациях разобщителя (рис. 3) показывают, что степень снижения НГ-активности с внешней стороны мембраны в условиях работы дыхательных Н1"-помп почти не зависит от концентрации разобщителя при высоких (рис.3 А,

[о,с

НЕРЕБ 20 шМ

НЕРЕЭ3 тМ

кривые 1,2) и низких концентрациях катализатора (рис.3 Б, кривые 1,2). Только те концентрации разобщителя, которые снижают величину пула мембраносвязанных Н4- ионов, которые подавляют работу Н4"-помп (рис.3 А,Б,

Рис.3 Измерение зкстинкции (степени диссоциации) рН-зонда (ФИТЦ) при повышении концентрации разобщителя (НТВ). В обе кюветы добавлены ротенон (1мкМ), в кювету "контроль" добавлен ТТФА (бмкМ); 1) В обе кюветы добавлен НТВ (1 мкМ), 2) В кюветы добавлен избыток ПТВ (3 мкМ), 3) В кюветы добавлен избыток НТВ (б мкМ); А) концентрация НЕРЕБ 20 мМ, Б) концентрация НЕРЕБ 3 мМ. Результаты воспроизведены на восьми препаратах митохондрий Сукцинат (2 тМ добавлялся в обе кюветы после записи нулевой линии, перед измерением

Это показывает, что разобщитель в указанных концентрациях сам по себе, в отличие от катализатора слабо взаимодействует с мембраносвязанными протонами и практически при этом не влияет на величину локальных 1Г-градиентов. Повышение скорости дыхания говорит о том, что под влиянием разобщителя происходит ускорение трансмембранного переноса ионов водорода на разобщителе и ускорение работы дыхательных Н^-помп. Наблюдается картина, которая говорит о том, что разобщитель, не изменяя объема пула мембраносвязанных Н*- ионов стимулирует дыхание только за счет эффективного переноса ионов водорода из воды в воду. Это важный результат, поскольку он говорит о том, что зонд действительно регистрирует пул мембраносязанных ионов водорода, которые качественно отличаются от Нойонов в объеме водной фазы, так как химически связанные на мембране Нойоны (рис.1) слабее взаимодействуют с анионом разобщителя.

Обсуждая это свойство пула мембраносвязанных ионов водорода следует указать на два важных обстоятельства: во-первых, теоретически ясно, что реакция взаимодействия мембраносвязанных ионов водорода с анионом разобщителя должна иметь более высокий активационный барьер, чем реакция "свободных" Н+- ионов в водной фазе. Во-вторых, также надо принять во внимание то обстоятельство, что концентрация разобщителя в условиях опытов на 2-3 порядка ниже, чем концентрация катализаторов. Важно указать также, что качественно аналогичный результат был получен ранее в нашей

лаборатории на модельной бислойной мембране. В этой системе, в условиях трансмембранного переноса протонов, было показано, что образование неравновесного состояния (пула) мембраносвязанных ионов водорода может наблюдаться в присутствии разобщителей.

Эффект повышения концентрации проникающего катализатора (Trisj на экстинкцию ФИТЦ-меченых митохондрий в состоянии 3 по Чансу

Опыты с "непроникающим" катализатором (HEPES) имеют тот недостаток, что проницаемость митохондриальной мембраны для катализатора может заметно возрастать во времени при продолжительном стоянии в открытом сосуде при 0°, возможно в результате открывания неспецифической поры (РТР) в митохондриях. Поэтому в качестве контроля представлялось важным определить, что происходит при попадании проникающего через мембрану катализатора в матрикс митохондрий. Этот вопрос имеет большое значение еще и потому, что в качестве катализаторов мы использовали слабо проникающие основания Льюиса (HEPES, MES), обладающие свойствами рН-буферов. В условиях работы Н+- помп рН матрикса выше, чем рН внешней среды на 0,5-0,7 единицы. Поэтому проникновение буфера внутрь митохондрий должно снижать эту разницу. В условиях откачки протонов Н+- помпой при попадании в матрикс буфера-катализатора в высокой концентрации в общем случае рН матрикса должен снижаться сильнее, чем при низкой концентрации буфера. Соответственно, повышение концентрации проникающего концентрированного буфера-катализатора должно с одной стороны снижать активность Н4"- ионов с внешней стороны мембраны за счет каталитических свойств и увеличивать экстинкцию наружной фракции зонда, но с другой стороны такой катализатор в высокой концентрации должен эффективнее повышать активность НГ- ионов в матриксе за счет буферных свойств, что может приводить к уменьшению скорости дыхания митохондрий и, соответственно степени протонированности внешней фракции ФИТЦ. В предельном случае закисление матрикса может приводить к обращению эффекта - в концентрированном буфере наблюдаемая степень диссоциации (экстинкция) зонда может оказаться ниже, чем в слабом буфере за счет эффективного протонирования его матриксной фракции. Серия экспериментов с использованием проникающего через внутреннюю митохондриальную мембрану катализатора-буфера (Tris), подтвердила сделанное выше предположение. Опыты показали, что при повышении концентрации Tris в среде инкубации экстинкция ФИТЦ-зонда в митохондриях снижается (рис.4).

Рис.4 Влияние повышения концентрации проникающего в матрикс катализатора-буфера (Tris), на величину наблюдаемой экстинкции равномерно ФИТЦ-меченых митохондрий, а) среда инкубации содержит 20 мМ Tris, б) среда инкубации содержит 3 мМ Tris.

Такие же эффекты наблюдаются при использовании катализатора-буфера на препаратах митохондрий с высокой проницаемостью мембраны для HEPES. Проницаемость наблюдается после длительного (1,5-2 часа) стояния митохондрий при 0-4°С, а также на свежих препаратах митохондрий, обладающих низким дыхательным контролем.

Эффект ускорения разобщенного дыхания митохондрий под влиянием непроникающего катализатора реакции отрыва Н* от внешней поверхности внутренней митохондриапъной мембраны.

Выше было показано, что в процессе трансмембранного переноса ионов водорода в митохондриях в условиях работы дыхательных FT-помп на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны происходит локальное повышение активности ионов водорода, что говорит о существовании относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва ЬГ-ионов от поверхности мембраны в водную фазу.

Очевидно, что низкая скорость реакции отрыва rf- ионов может лимитировать процесс работы дыхательных lf-помп в полностью разобщенных митохондриях. Как показано выше, анионы разобщителя (в разобщающих концентрациях (рис.66)) не способны эффективно снижать уровень неравновесного пула мембраносвязанных ионов водорода (рис.3 А). В этом случае при добавлении катализатора, который ускоряет реакцию отрыва Нойонов от мембраны следовало ожидать повышения скорости переноса протона через мембрану (также как в случае модельной системы) и, соответственно, повышения скорости разобщенного дыхания.

Действительно, удалось обнаружить эффект повышения скорости разобщенного дыхания в ответ на повышение концентрации катализатора (HEPES) (рис.5).

F ССР, (10TM)

ФЕНОЛ (t 5*104 M)

OH

Ж

Cl

тригпорфенол (10 M)

011

Рис.5. Увеличение скорости разобщенного дыхания митохондрий при повышении концентрации слабопроникающего катализатора (HEPES) реакции отрыва Нойонов от поверхности мембраны. Добавки: сукцинат (2мМ), ротенон (1чкМ), pH 7,5; разобщители а-фенол, б- трихлорфенол, в- FCCP, г- пентахлорфенол Пунктирные линии - ЗмМ Hepes, сплошные - 20мМ Hepes. Среда инкубации содержала 0,25 мМ ЭДТА, 1мМ сульфата магния, 10 мМ KCl, сахарозу добавляли в таких концентрациях, чтобы тоничность среды составляла 120 мОсм.

Результаты, приведенные на рис.5 показывают, что скорость работы дыхательных fT"- помп лимитирована реакцией отрыва протона от внешней поверхности мембраны в условиях нашего эксперимента. Кроме того, из рис.5 следует, что изменение концентрации катализатора HEPES само по себе (в отсутствие разобщителей) не влияет на скорость дыхания митохондрий. В работе были использованы разобщители разного химического строения и с разной эффективностью: соединения ряда фенола - (фенол, трихлорфенол и пентахлорфенол); производное бензимидазола (ТТФБ), производное фенилгидразона (FCCP). Было показано, что полученные результаты имеют количественные различия для случаев разных разобщителей, однако основной эффект стимуляции дыхания катализатором не зависит от химического строения молекул разобщителей.

Влияние непроникающих катализаторов с разным химическим строением на скорость отрыва FT - ионов от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны

Было показано также, что наблюдаемый эффект не связан с конкретной структурой катализатора. Параллельно поставленные опыты с двумя разными слабопроникающими катализаторами (HEPES и MES) (рис.6) показали, что использование различных по химической структуре катализаторов качественно

не изменяет эффекта ускорения разобщенного дыхания в ответ на повышение концентрации катализатора.

Рис.6. Влияние слабопроникающих катализаторов с разным химическим строением (HEPES, MES) на скорость дыхания митохондрий, разобщенных TTFB. a) Mes ЗмМ (пунктир), 20мМ (сплошная линия), б) Hepes ЗмМ (пунктир), 20мМ(сллошная линия). Условия измерения см подпись к рис.5

О возможном участии транслокатора адениновых нуклеотидов в процессе ускорения разобщенного дыхания катализаторами реакции отрыва ионов водорода

В работах В.П. Скулачева показано, что при низких концентрациях разобщителя их анионы могут переноситься на ADP/ATP транслокаторе. Можно было предположить поэтому, что катализатор отрыва ]-Г- ионов ускоряет работу транслокатора. Чтобы исключить эту возможность были проведены эксперименты с разобщителем и катализатором, в которых работа транслокатора нуклеотидов была подавлена с помощью карбоксиатрактилазида (catr). Как видно из рисунка 7, в этом случае также сохраняется качественно сходная картина - повышение концентрации катализатора (HEPES) усиливает разобщенное дыхание и, следовательно, наблюдаемый эффект не связан и с влиянием HEPES на функционирование транслокатора нуклеотидов.

Рис.7. Увеличение максимальной скорости разобщенного дыхания митохондрий при повышении концентрации катализатора (НЕРЕ8) в присутствии карбоксиатрактилазида Среда инкубации содержит: сукцинат (2мМ), ротенон (1мкМ), карбоксиатрактилазид (2мкМ), рН 7,5; детали см. подпись к рис.5

II. Регистрация образования неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны с помощью ФИТЦ-зонда в условиях фосфорилирования

Использование препарата меченых ФИТЦ-зондом фосфорилирующих митохондрий позволило зарегистрировать образование локального Н^-градиента с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны в состоянии 3 по Чансу. В этих опытах использовалась та же методика, как и в случае разобщенных митохондрий. Повышение степени диссоциации рН-зонда под влиянием непроникающего катализатора реакции отрыва ионов водорода свидетельствует о присутствии локального НГ- градиента с внешней стороны митохондриальной мембраны, который снижается под влиянием катализатора. Результаты этих измерений приведены на рис.8А.

4-Ю 460 480 500 520 540 560 440 460 430 500 520 540 560 лиша волны, нм ллнка вотки |ш

Рис. 8 (А) Регистрация изменения активности Н"1"- ионов с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий под влиянием слабопроникающего катализатора реакции отрыва Н4- ионов (в состоянии 3 по Чансу). Дифференциальные спектры ФИТЦ-меченых митохондрий в условиях фосфорилирования зарегистрированы в двух средах- а) при низкой (ЗмМ) и б) высокой (20мМ) концентрациях катализатора НЕРЕЭ. При регистрации дифференциальных спектров в обе кюветы добавлены: АОР (1тМ), добавлен ротенон (1мкМ), в контрольной кювете - ПТА (бмкМ). После записи нулевой линии добавлен в обе кюветы сукцинат (2 тМ). (Б) Регистрация параметра АОР/О в ФИТЦ-меченых митохондриях печени при а) низкой (3 мМ) и б) высокой (20 мМ) концентрациях катализатора НЕРЕБ. "мх.", "рот.", "сукц " - добавки в ячейку: митохондрий, ротенона и сукцината соответственно. АБР добавлено 200 мкм Цифрами на полярограммах обозначена скорость поглощения кислорода (в нг.ат.О в мин. на 1 мг белка). Представленная на рисунке картина наблюдалась на трех препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий.

На том же препарате митохондрий было показано, что в суспензии митохондрий, суспендированных в среде с низкой концентрацией катализатора (НЕРЕБ) скорость дыхания (в состоянии 3 по Чансу) выше, чем в среде с повышенной концентрацией катализатора (рис.8Б). Иными словами, в отличие от дыхания разобщенных митохондрий которое ускоряется катализатором, в состоянии 3 последний замедляет дыхание фосфорилирующих митохондрий (Рис. 8Б, таблица1).

Опыты были повторены в условиях, когда трансмембранный градиент рН сведен к минимуму. В присутствии нигерицина экстинкция рН-зонда почти такая же, как без нигерицина (рис.8), а величина параметра АБР/О коррелирует с объемом пула мембраносвязанных ионов водорода. При повышении концентрации катализатора объем пула Н1"- ионов снижается (рис. 9 А,а) и коэффициент АОР/О падает (рис. 9Б,б, табл.1).

Рис.9. Опыты на ФИТЦ-меченых митохондриях по измерению локальных Н+-градиентов и АОР/О в присутствии нигерицина при постоянном значении рН среды (7,5). Использована экспериментально установленная, максимальная концентрация нигерицина (1 10"9М), не ускоряющая дыхания митохондрий в состоянии 2 (4) по Чансу. Повышение степени диссоциации рН-зонда при возрастании концентрации катализатора (НЕРЕБ) А) Спектр ФИТЦ-меченых фосфорилирующих митохондрий при концентрации катализатора: а) 20 мМ, б) ЗмМ. В обе кюветы добавлен нигерицин (10"9М). В контрольной кювете добавлен ТТРА, субстрат - сукцинат. Б) Измерение скоростей дыхания и АОР/О в присутствии нигерицина в тех же условиях, а и б - разные концентрации катализатора. Результат, приведенный на рисунке наблюдался на 2-х образцах митохондрий.

4=13 460 480 500 520 540 «О 440 460 430 500 520 540 560

длина волны, нм

Положительная корреляция между величиной пула мембраносвязанных протонов и величиной АИР/О и скоростью фосфорширующего дыхания в препаратах интактныхмитохондрий.

Ранее в нашей лаборатории на БЛМ было показано, что образующийся при трансмембранном переносе 1-Г- ионов неравновесный пул ионов водорода, связанных с поверхностью мембраны обладает избытком свободной энергии, которая может быть использована для совершения полезной работы (Антоненко и соавт.,1982). В принципе обнаруженный нами неравновесный пул 1Г- ионов в митохондриях также может быть использован для полезной работы, в частности для синтеза АТФ. Как отмечалось выше, эффективность и скорость синтеза АТФ в наших условиях коррелирует с объемом пула неравновесно связанных с внешней поверхностью внутренней мембраны ионов водорода. В таблице 1 приведены результаты, на основании которых сформулировано предположение о участии мембраносвязанных Н+- ионов в процессе фосфорилирования. Можно видеть, что в суспензии митохондрий в средах с низкой концентрацией катализатора (НЕРЕБ), достоверно увеличен параметр АВР/'О, что говорит о том, что в условиях, когда локальный Н+- градиент повышен, параллельно повышается скорость синтеза АТФ.

Табл. 1. Возрастание величины АБР/О и скорости дыхания митохондрий в состоянии 3 по Чансу от концентрации слабопроникающего катализатора (НЕРЕБ) в среде инкубации. Осмолярность 120 мосМ.

Л» опыта Концентрация НЕРЕЭ, шМ Параметры фосфорилирования Добавки субстратов, (скорости дыхания даны в нг-ат. О/мин * мг белка)

Сукцинат Сукцинат, АБР АБР/О

1 3 26 147 1.9

20 23 133 1.6

2 3 15 88 1.2

20 13 49 0.9

3 3 15 134 1.6

20 12 112 1.1

Следует отметить, что в изотонических (250 мосМ) условиях отсутствует эффект замедления скорости фосфорилирующего дыхания при отрыве Н*-

ионов от поверхности мембраны. Это говорит о том, что при переходе от изотонических к гипотоническим условиям кинетические параметры системы сопряжения дыхания и фосфорилирования в митохондриях изменяются - они приходят в соответствие с моделью локального сопряжения.

В связи с наблюдаемой перестройкой более высокую эффективность использования энергии окислительных реакций в условиях образования пула мембраносвязанных ионов водорода заманчиво объяснить тем, что перенос энергии окислительных реакций происходит не только в форме электрохимического потенциала ионов водорода (ДцН1), но также и термодинамического (сольватационного) потенциала (Д|^0и) ионов водорода, который обусловлен частичной дегидротацией ионов водорода, на которую затрачивается часть энергии окислительных реакций в митохондриях.

Заключение

Как отмечалось во введении, система осморегуляции может переключать процесс окислительного фосфорилирования из режима делокализованного в режим локального сопряжения. В последнем случае выполняется основной принцип работы мультиферментных систем, существующих в форме суперкомплексов (метаболонов) - согласно которому в цепи последовательных реакций передача промежуточных продуктов/субстратов от фермента к ферменту осуществляется "из рук в руки", без выхода в объем водной фазы. В соответствии с данными нашего эксперимента, на схеме 16 показано, что в условиях локального сопряжения ион водорода пересекает гидрофобный барьер мембраны, что приводит к образованию электрохимического мембранного потенциала. Однако, в отличие от случая делокализованного сопряжения, основной поток энергии к АТФ-синтазе реализуется в форме переноса ионов водорода, связанных с внешней поверхностью мембраны в составе суперкомплекса - протонные помпы - мембрана - АТФ-синтаза (16). На схемах транспорта энергии (ионов водорода) в митохондриях (1 а,б) даны не только направления основных потоков этих ионов в условиях локального сопряжения (схема 1 б, жирные стрелки), но также и трансмембранные потоки, которые характерны для делокализованного сопряжения (рис. 1а и рис 16, тонкие стрелки).

межфазная мембрана граница

ЛОР + Р,^

межфазная мембрана граница катал« отрыва

(1)

II'-»

протона

Н тИ,0

- (2)

Схема 1. Модель транспорта ионов водорода в условиях (а) разобщения и (б) фосфорилирования.

Проведенные в работе эксперименты показали (рис.8, таб.1), что в условиях синтеза АТФ добавление катализатора реакции отрыва Н^-ионов от внешней межфазной границы замедляет скорость фосфорилирующего дыхания и, соответственно, процесс фосфорилирования. В разобщенных митохондриях катализатор напротив, ускоряет дыхание (рис.5). Как видно на схеме, различие между этими процессами заключается в том, что в разобщенных митохондриях (схема 1а) через межфазную границу (и мембрану) в матрикс переносится не гидратированный ион водорода (рГпНгО), а его связанная форма - кислота Бренстеда (ТН). в которой протон соединен с гидрофобным анионом разобщителя (Т). Трансмембранный перенос такой молекулы протекает быстро, поэтому протонный цикл в разобщенных митохондриях лимитирован только реакцией отрыва ионов водорода, неравновесно связанных на поверхности мембраны Н+-ионов. В процессе фосфорилирования добавление катализатора переключает локальное сопряжение на трансмембранный перенос ионов водорода (схема 16, тонкие линии), свойственный для делокапизованного сопряжения. В этих условиях процесс переноса протона через межфазную границу и его встраивание в протонный канал АТФ-синтазы затруднен вследствие гидратации этого иона, поэтому скорость фосфорилирующего дыхания лимитирована стадией присоединения протона к мембране. Экспериментальной базой для этой модели явилось, таким образом, наблюдаемое изменение знака эффекта катализатора на скорость дыхания при переходе от разобщенного к фосфорилирующему состоянию митохондрий (см. рис.5, рис.8, таб.1), а также эффект замедления скорости фосфорилирующего дыхания при повышении концентрации непроникающего катализатора реакции отрыва ЬГ-ионов от поверхности внутренней мембраны (таб. 1). Схемы 1 а,б основаны на двух положениях: 1) анион разобщителя (в разобщающих концентрациях) эффективно не взаимодействует с мембраносвязанными ионами водорода, он преимущественно взаимодействует со свободными КГ-ионами в

водной фазе. Это было показано ранее на модельной бислойной мембране и в настоящей работе на митохондриях (рис. 3 а,б, кривые 1,2). 2) Полярные молекулы непроникающего катализатора (НЕРЕБ) ускоряют только отрыв неравновесно связанных ионов водорода (рис.1, реакция 1) и не могут поэтому эффективно ускорять обратную реакцию, поскольку при этом должен происходить сдвиг влево равновесия реакции 1 на рис.1.

Рисунок 1 предполагает, что мембраносвязанные ионы водорода взаимодействуют с изотропной, равномерно заряженной поверхностью мембраны. В рамках такой модели уравнение свободной энергии мембраносвязанных ионов водорода (ДЕ0Х) может быть записано в следующем виде:

ДЕ0Х=ДцН+ + ДЦН+8Ыу (1)

Существование сольватационной компоненты подчеркивает то обстоятельство, что в выбранных нами условиях, при локальном сопряжении, энергия окислительных реакций может запасаться не только в форме электрохимического потенциала ионов водорода, по также в качественно иной форме, в форме энергии сольватации И1"- ионов.

Выводы:

1. Разработан метод регистрации неравновесных состояний ионов водорода, связанных с внешней стороны внутренней мембраны митохондрий, которые возникают при трансмембранном переносе ЕГ-ионов в условиях работы дыхательных протонных помп.

2. Обнаружено явление катализа реакции отрыва неравновесно связанных ЕГ- ионов от внешней поверхности внутренней мембраны фосфорилирующих митохондрий.

3. Зарегистрировано образование неравновесных состояний ионов водорода, возникающих с внешней стороны мембраны митохондрий при трансмембранном переносе этих ионов в условиях окислительного фосфорилирования.

4. На разобщенных митохондриях получены доказательства того, что в присутствии разобщителя скорость дыхания лимитирована стадией отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны.

5. Установлено, что ускорение реакции отрыва протонов от внешней поверхности мембраны митохондрий, приводящее к уменьшению объема фракции ионов водорода, неравновесно связанных с поверхностью мембраны замедляет скорость фосфорилирования, а также и снижает эффективность фосфорилирования (параметр АДФ/О, тем самым показано участие пула мембраносвязанных ионов водорода в процессе фосфорилирования.

6. Предложена конкретная модель локального сопряжения, непротиворечиво объясняющая полученные в работе данные.

Основные результаты диссертационной работы Юркова В.И. изложены в

следующих публикациях:

1. В.И. Юрков, М.С.Фадеева, Л.С. Ягужинский. Перенос протона через межфазные границы мембрана-вода в разобщенных митохондриях, (2005), Биохимия, 241-245

2. Solodovnikova IM, Iurkov VI, Ton'shin АА, Iaguzhinskii LS. Local coupling of respiration processes and phosphorylation in rat liver mitochondria Biofizika. 2004 Jan-Feb;49(l):47-56.

3. L.S. Yaguzhinsky, V.I. Yurkov, I.P.Krasinskaya. On the local coupling of respiration and phosphorylation m mitochondria, BBA. 2006, May-Jun; 1757(5-6):408-14

4. V.I. Yurkov, M.S. Fadeeva. About proton transfer through interfaces of inner membrane of the uncoupled mitochondria. Сборник тезисов докладов международной конференции "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке ", Москва, МГУ, 2005 г. С.68

5. Юрков В.И., Ягужинский Л.С., Регистрация локального Н-градиента в условиях фосфорилирования на препаратах митохондрий с ковалентно присоединенным рН-зондом (ФИТЦ). Сборник тезисов докладов III съезд биофизиков России, Воронеж, 2004, с. 481

Подписано в печать 2.09.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 801 Тираж' 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юрков, Владимир Игоревич

Введение.

Часть I Обзор литературы.

1. Основные этапы развития теории сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования.

Химическая схема сопряжения.

Хемиосмотическая гипотеза Митчелла.

Теория Вильямса.

Схема Бойера.

2. Суперкомплексы дыхательной цепи.

Роль липидов в формировании белковых суперкомплексов в мембране митохондрий.

Функциональная значимость мембранных дыхательных суперкомплексов.

3. Высокий кинетический барьер в реакции отрыва протона от поверхности мембраны.

4. Идентификация неравновесных состояний мембраносвязанных состояний мембраносвязанных ионов водорода в модельных системах.

5. Латеральный перенос протона вдоль поверхности биологических мембран.

Часть II Материалы и методы.

Выделение митохондрий из печени крысы.

Часть III Результаты и обсуяедение.

1. Разработка нового метода регистрации неравновесных состояний ионов водорода, связанных с внешней поверхностью внутренней мембраны митохондрий в условиях работы дыхательных НГ-помп.

1.1 Препарат ФИТЦ-меченых митохондрий, обладающих фосфорилирующей активностью.

1.2 Методика приготовления препарата фосфорилирующих ФИТЦ-меченых митохондрий и регистрация изменений спектров рН-зонда, возникающих при работе протонных помп.

1.3 Свойства препарата ФИТЦ-меченых митохондрий. а) Компоненты и природа наблюдаемого дифференциального спектра поглощения рН-зонда, возникающего при включении работы дыхательных протонных помп в препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий. б) О связывании рН-зонда (ФИТЦ) с внутренней митохондриальной мембраной.

1.4 Метод регистрации локальных Н-градиентов в фосфорилирующих ФИТЦ-меченых митохондриях с помощью дифференциальной спектроскопии.

2. Разработка метода обнаружения относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва мембраносвязанных ионов водорода на внешней стороне мембраны разобщенных интактных (в условиях работы дыхательных ЕГ-помп) митохондрий.

3. Метод идентификации и химическая природа высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности митохондриальной мембраны.

3.1 Обнаружение эффекта катализа реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны фосфорилирующих митохондрий.

4. Экспериментальное исследование неравновесных состояний ионов водорода на мембране митохондрий. а) Регистрация локального ЬГ^-градиента на внутренней мембране митохондрий в состоянии 4 по Чансу и в разобщенных митохондриях. б) Эффект подавления дыхания разобщителем (НТВ). в) Обнаружение кинетического барьера в реакции отрыва Н+-ионов от поверхности мембраны митохондрий. (Эффект ускорения разобщенного дыхания митохондрий под влиянием непроникающего катализатора реакции отрыва Н1 от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны). г) Влияние непроникающих катализаторов с разным химическим строением на скорость отрыва Н+- ионов от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны. д) О возможном участии транслокатора адениновых нуклеотидов в процессе ускорения разобщенного дыхания катализаторами реакции отрыва ионов водорода. е) Регистрация образования неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны с помощью ФИТЦ-зонда. В условиях фосфорилирования. ж) Интактные митохондрии (не меченые ФИТЦ). Положительная корреляция между величиной пула мембраносвязанных ионов водорода, величиной параметра АОР/О и скоростью фосфорилирующего дыхания.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регистрация неравновесных состояний мембраносвязанных ионов водорода в митохондриях и их роль в процессе окислительного фосфорилирования"

Актуальность проблемы

Известно, что мультиферментные системы клетки могут работать в двух качественно различных состояниях - в диссоциированном, когда ферменты работают независимо друг от друга, и в состоянии суперкомплекса (метаболона), когда ферменты тесно контактируют друг с другом. В первом случае продукты реакции выбрасываются в объем водной фазы, из которой избирательно захватываются активным центром следующего по цепи фермента. При образовании метаболона промежуточные продукты-субстраты не выбрасываются в водную фазу, а передаются по метаболической цепи от фермента к ферменту "из рук в руки". В случае мембранной системы окислительного фосфорилирования ключевым промежуточным продуктом окислительных реакций является ион водорода, обладающий избытком свободной энергии и выполняющий в митохондриях роль переносчика энергии окислительных реакций на АТФ-синтазный комплекс. Работа этой системы в форме суперкомплекса, когда ион водорода не выходит в водную фазу, предполагает существование относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны. В настоящее время хорошо изучен и экспериментально обоснован первый механизм (модель Митчелла). В этом случае, ион водорода является основным промежуточным продуктом-субстратом реакции (который выполняет роль переносчика энергии окислительных реакций на АТФ-синтазный комплекс), выходит из мембраны в объем водной фазы (Mitchell, 1961). Второй механизм (модель Вильямса), предполагает возможность работы мультиферментных систем в форме суперкомплекса, при котором ионы водорода переносится от дыхательной помпы на АТФ-синтазный комплекс в составе суперкомплекса дыхательная помпа-мембрана-АТФ-синтетаза без выхода в объем водной фазы (Williams, 1961) (рис.1). Нами обоснован вариант модели Вильямса, согласно которому ион водорода пересекает гидрофобный барьер мембраны, но остается в связанном неравновесном состоянии на межфазной границе. Выход Н+-иона в водную фазу в этом случае ограничен (не полностью) высоким кинетическим барьером. межфазная мембрана граница мембрана-АТФ-синтетаза.

Существование такого механизма работы системы окислительного фосфорилирования до последнего времени не было однозначно показано.

Ранее нам удалось обнаружить существование двух структурных состояний мембран митохондрий, переход между которыми контролировался системой осморегуляции (КгаБтякауа ^ а1., 1989). Кинетические параметры системы сопряжения дыхания и фосфорилирования в одном из этих состояний соответствуют модели мультиферментного суперкомплекса. Эти наблюдения рассматривались нами как указание на существование системы окислительного фосфорилирования в двух состояниях, в одном из которых реализуется делокализованное, в другом - локальное сопряжение дыхания и фосфорилирования. Таким образом было показано, что модели Митчелла и Вильямса не являются альтернативными. Необходимым условием работы системы окислительного фосфорилирования в режиме локального сопряжения является способность ионов водорода достаточно долго существовать в мембраносвязанном состоянии после того как дыхательные ГГ-помпы переносят их через гидрофобный изолирующий барьер мембраны. К настоящему времени на различных модельных системах показано, что реакция отрыва протона от поверхности липидных мембранных структур имеет при определенных условиях относительно высокий кинетический барьер, существование которого определяет возможность возникновения неравновесного состояния (пула) ионов водорода, связанных с поверхностью мембраны (АпШпепко е1 а1., 1993; СЬсгерапоу е1 а1., 2004). Обнаружение неравновесно связанных с поверхностью бислоя Н+-ионов при трансмембранном потоке этих ионов через БЛМ показало возможность латерального переноса протонов вдоль поверхности мембраны без выхода в водную фазу. Это наблюдение, сделанное в нашей лаборатории на модельной системе, доказало принципиальную возможность реализации механизма локального сопряжения в митохондриях. Кроме того, на модельной мембране (БЛМ) было обнаружено явление катализа отрыва Н+-ионов от поверхности мембраны и показана химическая природа пула мембраносвязанных Н+-ионов. Важно указать, что работ по изучению переноса протонов через межфазные границы внутренней мембраны митохондрий в условиях протекания процесса окислительного фосфорилирования до начала настоящего исследования не проводилось.

Цель настоящей работы - экспериментальное обоснование возможности переноса протонов от дыхательных Н4" -помп к АТФ-синтетазе в условиях работы системы окислительного фосфорилирования митохондрий в составе мембранного суперкомплекса (без выхода в водную фазу) и их участия в процессе синтеза АТФ.

Задачи исследования: 1) на фосфорилирующих митохондриях продемонстрировать образование пула мембраносвязанных ионов водорода на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны в состоянии 3 по Чансу. 2) Показать участие пула мембраносвязанных ионов водорода в работе системы окислительного фосфорилирования. 3) Сравнить влияние катализаторов отрыва Нойонов от поверхности мембраны на скорость дыхания в разобщенных и фосфорилирующих митохондриях. 4) Показать возникновение неравновесных состояний мембраносвязанных Н^-ионов в разобщенных митохондриях. Научная новизна работы: Разработан метод ковалентной пришивки рН-зонда (ФИТЦ) к митохондриям, при использовании которого практически полностью сохраняется фосфорилирующая функция этих органелл. На препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий обнаружено явление катализа реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны.

На препаратах ФИТЦ-меченых митохондрий, в условиях фосфорилирования зарегистрировано образование пула мембраносвязанных ионов водорода с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны. Тем самым было показано существование относительно высокого кинетического барьера в реакции отрыва ионов водорода от внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. Этот результат был подтвержден на препаратах интактных разобщенных митохондрий. Установлено, что мембраносвязанные ионы водорода принимают участие в процессе окислительного фосфорилирования. Найдена прямая корреляция между величиной неравновесного пула мембраносвязанных Н+-ионов и, с другой стороны, скоростью фосфорилирующего дыхания и эффективностью фосфорилирования (параметром АБР/О).

Практическое значение работы: Полученные результаты показали возможность работы системы окислительного фосфорилирования в режиме мультиферментного суперкомплекса, что является принципиально новой фундаментальной информацией о свойствах одной из важнейших систем энергообеспечения клетки. В работе показана возможность направленного регулирования скорости и эффективности работы системы окислительного фосфорилирования путем воздействия на внешнюю поверхность внутренней митохондриальной мембраны. Результаты этих экспериментов открывают новые подходы для лекарственной терапии заболеваний, связанных с нарушениями митохондриальной энергетики, а также для разработки методов, позволяющих управлять митохондриальной энергетической системой.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Юрков, Владимир Игоревич

Основные результаты диссертационной работы Юркова В.И. изложены в следующих публикациях:

1. В.И. Юрков, М.С.Фадеева, JI.C. Ягужинский. Перенос протона через межфазные границы мембрана-вода в разобщенных митохондриях, (2005), Биохимия, 241-245

2. Solodovnikova IM, Iurkov VI, Ton'shin АА, laguzhinskii LS. Local coupling of respiration processes and phosphorylation in rat liver mitochondria Biofizika. 2004 Jan-Feb;49(l):47-56.

3. L.S. Yaguzhinsky, Y.I. Yurkov, I.P.Krasinskaya. On the local coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria, BBA. 2006, May-Jun; 1757(5-6):408-14

4. V.I. Yurkov, M.S. Fadeeva. About proton transfer through interfaces of inner membrane of the uncoupled mitochondria, сборник тезисов докладов международной конференции "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке ", Москва, МГУ, 2005 г. С.68

5. Юрков В.И., Ягужинский JI.C., Регистрация локального Н-градиента в условиях фосфорилирования на препаратах митохондрий с ковалентно присоединенным рН-зондом (ФИТЦ). Сборник тезисов докладов III съезд биофизиков России, Воронеж, 2004, с. 481

Благодарности

В заключение хочу выразить огромную благодарность Тепловой Вере Викторовне за обучение методам выделения митохондрий и исследования их функциональной активности; Смирновой Елене Георгиевне, Солодовниковой Ирине Михайловне и Тонынину Антону Александровичу за помощь при работе с моделью моему научному руководителю Ягужинскому Льву Сергеевичу за предоставленную свободу в планировании и проведении экспериментов, за оказанную помощь в процессе написания данной работы, а также за обучение искусству анализа полученных экспериментальных результатов и литературных данных.

Заключение

Как отмечалось во введении, система осморегуляции может переключать процесс окислительного фосфорилирования из режима делокализованного в режим локального сопряжения. В последнем случае выполняется основной принцип работы мультиферментных систем, существующих в форме суперкомплексов (метаболонов) - согласно которому в цепи последовательных реакций передача промежуточных продуктов/субстратов от фермента к ферменту осуществляется "из рук в руки", без выхода в объем водной фазы. В соответствии с данными нашего эксперимента, на схеме 16 показано, что в условиях локального сопряжения ион водорода пересекает гидрофобный барьер мембраны, что приводит к образованию электрохимического мембранного потенциала. Однако, в отличие от случая делокализованного сопряжения, основной поток энергии к АТФ-синтазе реализуется в форме переноса ионов водорода, связанных с внешней поверхностью мембраны в составе суперкомплекса - протонные помпы - мембрана - АТФ-синтетаза (16). На схемах транспорта энергии (ионов водорода) в митохондриях (1 а,б) даны направления основных потоков этих ионов в условиях локального сопряжения (схема 1 б, жирные стрелки), и трансмембранные потоки, которые характерны для делокализованного сопряжения (схема 16, тонкие стрелки). Проведенные в работе эксперименты показали (рис.13, таб.1), что в условиях синтеза АТФ добавление катализатора реакции отрыва Н+-ионов от внешней межфазной границы замедляет скорость фосфорилирующего дыхания и, соответственно, процесс фосфорилирования. В разобщенных митохондриях катализатор напротив, ускоряет дыхание (рис.10).

Схема 1а. Модель транспорта ионов водорода в условиях разобщения; 1) медленная стадия отрыва протона от внешней поверхности внутренней мембраны, 2) быстрая стадия переноса протона через межфазную границу и мембрану на разобщителе (Т",ТН - диссоциированная и недиссоциированная формы разобщителя).

Схема 16. Модель транспорта ионов водорода в условиях фосфорилирования; 1) быстрая стадия переноса протона 2) медленная стадия переноса протона из объема водной фазы к АТФ-синтетазе (через межфазную границу).

Различие между этими процессами связано с тем, что в разобщенных митохондриях (схема 1а) через межфазную границу (и мембрану) в матрикс переносится не гидратированный ион водорода (Н+ пН20), а его связанная форма -кислота Бренстеда (ТН), в которой протон соединен с гидрофобным анионом разобщителя (Т"). Трансмембранный перенос такой молекулы протекает быстро, поэтому протонный цикл в разобщенных митохондриях лимитирован только реакцией отрыва ионов водорода, неравновесно связанных на поверхности мембраны ЬГ-ионов. В процессе фосфорилирования добавление катализатора переключает локальное сопряжение на трансмембранный перенос ионов водорода (схема 16, тонкие линии), свойственный для делокализованного сопряжения. В этих условиях процесс переноса протона через межфазную границу и его встраивание в протонный канал АТФ-синтазы затруднен вследствие гидратации этого иона, поэтому скорость фосфорилирующего дыхания лимитирована стадией присоединения протона к мембране. Экспериментальной базой для этой модели явилось, таким образом, наблюдаемое изменение знака эффекта катализатора на скорость дыхания при переходе от разобщенного к фосфорилирующему состоянию митохондрий (см. рис.10, рис.13, таб.1), а также эффект замедления скорости фосфорилирующего дыхания при повышении концентрации непроникающего катализатора реакции отрыва Н+-ионов от поверхности внутренней мембраны (таб.1). Схемы 1 а,б основаны на двух положениях: 1) анион разобщителя (в разобщающих концентрациях) практически не взаимодействует с мембраносвязанными ионами водорода, при этом он эффективно связывается со свободными Н+-ионами в водной фазе. Это было показано ранее на модельной бислойной мембране и в настоящей работе на митохондриях (см. приложение). 2) Полярные молекулы непроникающего катализатора (НЕРЕ8) ускоряют только отрыв неравновесно связанных ионов водорода (рис.7, реакция 1) и не могут поэтому эффективно ускорять обратную реакцию, поскольку при этом должен происходить сдвиг влево равновесия реакции 1 на рис.7. Наличие потенциала на мембране подтверждено экспериментально (рис. 15).

Рис.15 Типичный результат измерений электрического потенциала митохондрий при различных концентрациях катализатора реакции отрыва Н+-иопов от поверхности мембраны а) 20 тМ НЕРЕБ, б) 3 тМ НЕРЕ8. Среда инкубации содержит: ТРР (0,5 мкМ), сукцинат (2мМ ), ротенон (1мкМ), рН 7,5. Шкала ТРР - линейная.

Можно видеть, что значения потенциала при разных концентрациях катализатора (НЕРЕБ) различаются незначительно.

Рисунок 7 предполагает, что мембраносвязанные ионы водорода взаимодействуют с изотропной, равномерно заряженной поверхностью мембраны. В рамках такой модели уравнение свободной энергии мембраносвязанных ионов водорода (ЛЕ0Х) может быть записано в следующем виде:

ДЕ0Х =Л|Ш+ + Л|1Н+8о1у (1)

Существование сольватационной компоненты подчеркивает то обстоятельство, что в выбранных нами условиях, при локальном сопряжении, энергия окислительных реакций может запасаться не только в форме электрохимического потенциала ионов водорода, но также в качественно иной форме, в форме энергии сольватации Н+- ионов. В заключение представляется важным еще раз подчеркнуть то обстоятельство, что модели делокализованного и локального сопряжения не являются взаимоисключающими. Напротив, это два взаимодополняющих механизма работы системы окислительного фосфорилирования (как впрочем и других мультиферментных систем), которые реализуются в различных строго специфичных условиях. Переход между двумя режимами работы фосфорилирующего комплекса митохондрий контролируется системой осморегуляции и соответствует переходу между диссоциированным и кластеризованным состояниями мультиферментного мембранного комплекса митохондрий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юрков, Владимир Игоревич, Москва

1. Alexiev U, Mollaaghababa R, Scherrer P, Khorana HG, Heyn MP. (1995) Rapid longrange proton diffusion along the surface of the purple membrane and delayed proton transfer into the bulk. Proc Natl Acad Sei USA; 92(2):372-6.

2. Antonenko YN, Kovbasnjuk ON, Yaguzhinsky LS. (1993) Evidence in favor of the existence of a kinetic barrier for proton transfer from a surface of bilayer phospholipid membrane to bulk water. Biochim Biophys Acta;l 150(l):45-50.

3. Antonenko YN, Pohl P. (1998) Coupling of proton source and sink via H+-migration along the membrane surface as revealed by double patch-clamp experiments. FEBS Lett.;429(2): 197-200.

4. Arnesano F, Banci L, Bertini I, Faraone-Mennella J, Rosato A, Barker PD, Fersht AR. (1999) The solution structure of oxidized Escherichia coli cytochrome b562. Biochemistry; 38(27):8657-70.

5. Ausländer W, Junge W. (1974) The electric generator in the photosynthesis of green plants. II. Kinetic correlation between protolytic reactions and redox reactions. Biochim Biophys Acta; 357(2):285-98.

6. Berry EA, Trumpower BL (1985) Isolation of ubiquinol oxidase from Paracoccus denitrificans and resolution into cytochrome bcl and cytochrome c-ааЗ complexes. J Biol Chem.; 260(4):2458-67.

7. Bränden M, Sanden T, Brzezinski P, Widengren J. (2006) Localized proton microcircuits at the biological membrane-water interface. Proc Natl Acad Sei USA.103(52): 19766-70. Epub 2006 Dec 15.

8. CHANCE B, WILLIAMS GR, HOLMES WF, HIGGINS J. (1955) Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. J Biol Chem.; 217(1): 383-451.

9. Chappell J.B., Crofts (1966) Regulation of metabolic processes in mitochondria. Elsevier. 293-314

10. Chappell JB. (1968) Systems used for the transport of substrates into mitochondria. Br Med Bull.; 24(2): 150-7.

11. Cherepanov, D. A., B. A. Feniouk, W. Junge, and A. Y. Mulkidjanian. (2003) Low dielectric permittivity of water at the membrane interface: effect on the energy coupling mechanism in biological membranes. Biophys. J. 2:1307-1316.

12. CRANE FL, HATEFI Y, LESTER RL, WIDMER C. (1957) Isolation of a quinone from beef heart mitochondria. Biochim Biophys Acta; 25(1):220-1.

13. CRANE RK, LIPMANN F.(1953) The relationship of mitochondrial phosphate to aerobic phosphate bond generation. J Biol Chem.; 201(l):245-6.

14. Cruciat CM, Brunner S, Baumann F, Neupert W, Stuart RA. (2000) The cytochrome bcl and cytochrome c oxidase complexes associate to form a single supracomplex in yeast mitochondria. J Biol Chem 275: 18093- 18098.

15. Drachev, A. L., A. D. Kaulen, and V. I. Skulachev. (1984) Correlation of photochemical cycle, H 1 release and uptake, and electric events in bacteriorhodopsin. FEBS1.tt. 178:331-336.

16. Drachev, A. L., A. D. Kaulen, and V. I. Skulachev. (1984) Correlation of photochemical cycle, H 1 release and uptake, and electric events in bacteriorhodopsin. FEBS Lett. 178:331336.

17. Drachev, Jasaitis A. A, Kaulen A.D. et al., (1976) The reconstitution of biological molecular generators of electric current cytochrome oxidase. J. Biochem., 251, 7066.

18. Dragunova SF, Krasinskaia IP, Iaguzhinskiï LS. (1981) Control of proton transport across the double electrical layers of mitochondrial membranes Biokhimiia. 46(6): 1087-95.

19. Dudkina NV, Eubel H, Keegstra W, Boekema EJ, Braun HP. (2005) Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Natl Acad Sei USA 102: 3225-3229.

20. Fahien LA, MacDonald MJ, Teller JK, Fibich B, Fahien CM. (1989) Kinetic advantages of hetero-enzyme complexes with glutamate dehydrogenase and the ketoglutarate complex. J Biol Chem 264: 12303-12312.

21. Feniouk BA, Cherepanov DA, Junge W, Mulkidjanian AY. (1999) ATP-synthase of Rhodobacter capsulatus: coupling of proton flow through F0 to reactions in Fl under the ATP synthesis and slip conditions. FEBS Lett.;445(2-3):409-14.

22. Feniouk BA, Mulkidjanian AY, Junge W. (2005) Proton slip in the ATP synthase of Rhodobacter capsulatus: induction, proton conduction, and nucleotide dependence. Biochim Biophys Acta; 1706(1-2): 184-94.

23. FLEISCHER S, BRIERLEY G, KLOUWEN H, SLAUTTERBACK DB. (1962) Studies of the electron transfer system. The role of phospholipids in electron transfer. J Biol Chem.;237:3264-72.

24. Fleischer S, Fleischer B, Stoeckenius W. (1967) Fine structure of lipid-depletedmitochondria. J Cell Biol 32: 193-208.

25. FOWLER LR, RICHARDSON SH. (1963) Studies on the electron transfer system. L. On the mechanism of reconstitution of the mitochondrial electron transfer system. J Biol Chem.;238:456-63.

26. Friedman R, Nachliel E, Gutman M. (2005) Molecular dynamics of a protein surface: ion-residues interactions. Biophys J.;89(2):768-81. Epub May 13.

27. Fry M, Green DE. (1981) Cardiolipin requirement for electron transfer in complex I and III of the mitochondrial respiratory chain. J Biol Chem 256: 1874-1880.

28. Gabriel B, Prats M, Teissie J. (1994) Proton lateral conduction along a lipid monolayer spread on a physiological subphase. Biochim Biophys Acta; 1186(3): 172-6.

29. Giess F, Friedrich MG, Heberle J, Naumann RL, Knoll W. (2004) The protein-tethered lipid bilayer: a novel mimic of the biological membrane. Biophys J.;87(5):3213-20.

30. Gil T, Ipsen JH, Mouritsen OG, Sabra MC, Sperotto MM, Zucker-mann MJ. (1998) Theoretical analysis of protein organization in lipid membranes. Biochim Biophys Acta 1376: 245-266.

31. Green DE, Tzagoloff A. (1966) The mitochondrial electron transfer chain. Arch Biochem Biophys.;l 16(l):293-304.

32. Green DE, Tzagoloff A. (1966) The mitochondrial electron transfer chain. Arch Biochem Biophys.26;l 16(l):293-304.

33. Gwak SH, Yu L, Yu CA. (1986) Spin-label electron paramagnetic resonance and differential scanning calorimetry studies of the interaction between mitochondrial succinate-ubiquinone and ubiquinol-cytochrome c reductases. Biochemistry 25: 7675-7682.

34. Hackenbrock CR, Hammon KM. (1975) Cytochrome c oxidase in liver mitochondria. J Biol Chem 250:9185-9187.

35. Hansford RG, Chappell JB. (1967) The effect of Ca2+ on the oxidation of glycerol phosphate by blowfly flight-muscle mitochondria. Biochem Biophys Res Commun.; 27(6):686-92.

36. Harrison DE, Chance B. (1970) Fluorimetric technique for monitoring changes in the level of reduced nicotinamide nucleotides in continuous cultures of microorganisms. Appl Microbiol.;19(3):446-50.

37. Hatefi Y, Haavik AG, Fowler LR, Griffiths DE. (1962) Studies on the electron transfer system. XLII. Reconstitution of the electron transfer system. J Biol Chem 237: 2661-2669.

38. Hatefi Y. (1978) Introduction-preparation and properties of the enzymes and enzymes complexes of the mitochondrial oxidative phosphorylation system. Methods Enzym.;53:3-4.

39. Heberle J, Dencher NA. (1990) Bacteriorhodopsin in ice. Accelerated proton transfer from the purple membrane surface. FEBS Lett.;277(l-2):277-80.

40. Heberle J, Dencher NA.(1990) Bacteriorhodopsin in ice. Accelerated proton transfer from the purple membrane surface. FEBS Lett.; 277(1-2):277-80.

41. Jagendorf A.T., Uribe E. (1970) ATP-formation caused by acid-base transition of spinack chloroplasts. Proc. Nat.Acad.Sci. USA,55,170.

42. Jagendorf, Uribe (1966) ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts. Proc Natl Acad Sci USA; 55(1): 170-7.

43. Jasaitis A.A., Severina I.I., Skulachev V.P., Smirnova S.M. (1972) A study of the mechanism of energy coupling in the redox chain. . J. Bioencrg., 243, 54.

44. Jones, M. R., and J. B. Jackson. (1990). Proton efflux from right-side-out membrane vesicles of Rhodobacter sphaeroides after short flashes. Biochim. Biophys. Acta. 1019:5158.

45. Junge, W., and A. Polle. (1986) Theory of proton flow along appressed thylakoid membranes under both non-stationary and stationary conditions. Biochim. Biophys. Acta. 848:265-273.

46. Junge, W., and A. Polle. (1986) Theory of proton flow along appressed thylakoid membranes under both non-stationary and stationary conditions. Biochim. Biophys. Acta. 848:265-273.

47. Junge, W., and S. McLaughlin. (1987). The role of fixed and mobile buffers in thekinetics of proton movement. Biochim. Biophys. Acta. 890:1-5.

48. KagavaY., Kandrash A., Racker E. (1973) Partial resolution of the enzymes catalysing oxidative phosphorylstion. J. Biochem. 248,676

49. Kang SY, Gutowsky HS, Hsung JC, Jacobs R, King TE, Rice D, Oldfield E. (1979) Nuclear magnetic resonance investigation of the cytochrome oxidase-phospholipid interaction: a new model for boundary lipid. Biochemistry 18: 3257-3267.

50. Kayalar C, Rosing J, Boyer PD. (1977) An alternating site sequence for oxidative phosphorylation suggested by measurement of substrate binding patterns and exchange reaction inhibitions. J Biol Chem.;252(8):2486-91.

51. Kell DB. (1979) On the functional proton current pathway of electron transport phosphorylation. An electrodic view. Biochim Biophys Acta;549(l):55-99.

52. Kinnally KW, Antonenko YN, Zorov DB. (1992) Modulation of inner mitochondrial membrane channel activity. J Bioenerg Biomembr.;24(l):99-l 10.

53. Kotlyar AB, Maklashina E, Cecchini G. (2004) Absence of NADH channelling in coupled reaction of mitochondrial malate dehydrogenase and Complex I in alamethicin-permeabilized rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 318: 987-991.

54. Kotlyar AB, Sled VD, Burbaev DS, Moroz IA, Vinogradov AD. (1990) Coupling site I and the rotenone-sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles. FEBS Lett.; 264(1): 17-20.

55. Krasinskaya IP, Lapin MV, Yaguzhinsky LS. (1998) Detection of the local H+ gradients on the internal mitochondrial membrane. FEBS Lett.;440(l-2):223-5.

56. Marantz Y, Nachliel E, Aagaard A, Brzezinski P, Gutman M. (1998) The proton collecting function of the inner surface of cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides. Proc Natl Acad Sci U S A;95(15):8590-5.

57. Massari S., Azzone G.F. (1970) The mechanism of ion tranzlocation in mitochondria. Active transport and proton pump. Eur.J. Biochem. 12,310.

58. Mitchel P. (1965) Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Bodmin.Glynn Research.

59. Mitchel P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature, 191,144.

60. Mitchel P., Moyle J. (1967) Acid-base titration across the membrane system of rat-liver mitochondria catalisys by uncouplers. Biochem.J.,104,588.

61. Mitchell P, Moyle J. (1967) Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria. Biochem J.; 105(3): 1147-1162.

62. Mitchell P, Moyle J. (1969) Translocation of some anions cations and acids in rat livermitochondria. Eur J Biochem.;9(2): 149-55.

63. Mitchell P. (1974) A chemiosmotic molecular mechanism for proton-translocating adenosine triphosphatases. FEBS Lett.;43(2): 189-94.

64. Mitchell, Moyle (1975) Active/inactive state transitions of mitochondrial ATPase molecules influenced by Mg2+, anions and aurovertin. FEBS Lett.;56(l):55-61.

65. Mitchell, Moyle, 1968 (1968) Proton translocation coupled to ATP hydrolysis in rat liver mitochondria. Eur J Biochem.;4(4):530-9.

66. Mitchell, Moyle. (1958) Group-translocation: a consequence of enzyme-catalysed group-transfer. Nature; 182(4632):372-3.

67. Mitchell, Moyle. (1965) Evidence discriminating between the chemical and the chemiosmotic mechanisms of electron transport phosphorylation. Nature;208(5016): 1205-6.

68. Mitchell, Moyle. (1965) Stoichiometry of proton translocation through the respiratory chain and adenosine triphosphatase systems of rat liver mitochondria. Nature;208(5006):147-51.

69. Mitchell, Moyle. (1969) Estimation of membrane potential and pH difference across the cristae membrane of rat liver mitochondria. Eur J Biochem.;7(4):471-84.

70. Mochizuki M, Aoyama H, Shinzawa-Itoh K, Usui T, Tsukihara T, Yoshikawa S.(1999) Quantitative réévaluation of the redox active sites of crystalline bovine heart cytochrome c oxidase. J Biol Chem.;274(47):33403-11.

71. Morgan H, Taylor DM, Oliveira ON Jr. (1991) Proton transport at the monolayer-water interface. Biochim Biophys Acta; 1062(2): 149-56.

72. Morgunov I, and Srere PA. (1998) Interaction between citrate synthase and malate dehydrogenase. Substrate channelling of oxaloacetate. J Biol Chem 273: 29540-29544.

73. Moroney JV, McCarty RE. (1979) Reversible uncoupling of photophosphorylation byanew bifunctional maleimide. J Biol Chem.;254(18):8951-5.

74. Mulkidjanian AY, Heberle J, Cherepanov DA. (2006) Protons and interfaces: implications for biological energy conversion. Biochim Biophys Acta. 1757(8):913-30. Epub. Review.

75. Nachliel, E., and M. Gutman. (1996) Quantitative evaluation of the dynamics of proton transfer from photoactivated bacteriorhodopsin to the bulk. FEBS Lett. 393:221-225.

76. Neumann, Jagendorf. (1964) Light-induced pH changes related phosphorylation by chloroplasts. Arch Biochem Biophys.;107:109-19.

77. Nicholls (1974) The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat-liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur J Biochem.;50(1):305-15.

78. Ozawa T, Nishikimi M, Suzuki H, Tanaka M, Shimomura Y. (1987) Structure and assembly of mitochondrial electron-transfer complexes. Japan Sci. Soc., p. 101-119.

79. Paradies G, Petrosillo G, Pistolese M, Ruggiero FM,.(2002) Reactive oxygen species affect mitochondrial electron transport complex I. activity through oxidative cardiolipin damage. Gene 286: 135-141.

80. Petty KM, Dutton PL. (1976) Properties of the flash-induced proton binding encountered in membranes of Rhodopseudomonas sphaeroides: a functional pK on theubisemiquinone? Arch Biochem Biophys.;172(2):335-45.

81. Pfeiffer,K.,GohilsV.,Stuart,R.A.,Hunte,C.,Brandt,U.,Greenberg,M.L. and Schagger,H.(2003) Cardiolipin stabilizes respiratory chain supercomplexes. J.Biol.Chem.278,52873 -52880

82. Porschke, D. (2002) Reaction coupling, acceptor pK, and diffusion control in light induced proton release of bacteriorhodopsin. J. Phys. Chem. B. 106:10233-10241.

83. Prats M, Tocanne JF, Teissie J. (1987) Lateral proton conduction at a lipid/water interface. Effect of lipid nature and ionic content of the aqueous phase. Eur J Biochem.; 162(2):379-85.

84. Qiu ZH, Yu L, Yu CA. (1992) Spin-label electron paramagnetic resonance and differential scanning calorimetry studies of the interaction between mi-tochondrial cytochrome c oxidase and adenosine triphosphate synthase complex. Biochemistry 31: 32973302.

85. Racker E., Kandrash A. (1971) Reconstotution of the third site of oxidative phosphorilation. J. Biochem., 246, 7069.

86. Rich PR. (1984) Electron and proton transfers through quinones and be complexes. Biochim Biophys Acta 768: 53-79.

87. Riesle J, Oesterhelt D, Dencher NA, Heberle J.(1996) D38 is an essential part of the proton translocation pathway in bacteriorhodopsin. Biochemistry;35(21):6635-43.

88. Robinson JB Jr, Srere PA. (1985) Organization of Krebs tricarboxylic acid cycle enzymes in mitochondria. J Biol Chem.;260(19): 10800-5.

89. Rochel S, Nachliel E, Huppert D, Gutman M. (1990) Proton dissociation dynamics in the aqueous layer of multilamellar phospholipid vesicles. J Membr Biol.;l 18(3):225-32.

90. Rottenberg H. (1975) The measurement of transmembrane electrochemical proton gradients. J Bioenerg.; 7(2):61-74.

91. Ryrie IJ, Jagendorf AT. (1972) Correlation between a conformational change in the coupling factor protein and the high energy state in chloroplasts. J Biol Chem.; 247(14):4453-9.

92. Scha'gger H and Pfeiffer K. (2000) Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J 19: 1777-1783.

93. Scha'gger H, de Coo R, Bauer MF, Hofmann S, Godinot C, Brandt U. (2004) Significance of respirasomes for the assembly/stability of human respiratory chain complex I. J Biol Chem 279: 36349-36353.

94. Schagger H. (2001) Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life 52: 119- 128.

95. Schafer E, Seelert H, Reifschneider NH, Krause F, Dencher NA, Vonck J. (2006) Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem 281: 15370-15375.

96. Schoepp B, Brugna M, Riedel A, Nitschke W, Kramer DM. (1999) The Qo-site inhibitor DBMIB favours the proximal position of the chloroplast Rieske protein and induces a pK-shift of the redox-linked proton. FEBS Lett.;450(3):245-50.

97. Serowy S, Saparov SM, Antonenko YN, Kozlovsky W, Hagen V, Pohl P. (2003) Structural proton diffusion along lipid bilayers. Biophys J.;84(2 Pt 1): 1031-7.

98. Severina II, Skulachev VP, Zorov DB. (1988) Coupling membranes as energy-transmitting cables. II. Cyanobacterial trichomes. J Cell Biol.; 107(2):497-501.

99. Sharyshev AA, Kostava VT, Ismailov AD, Evtodienko IuV, IaguzhinskiT LS. (1979) Ion currents in mitochondrial and liposome membranes induced by acid action. Biofizika.;24(3):484-8.

100. Slater EC. (1953) Mechanism of phosphorylation in the respiratory chain. Nature.; 172(4387):975-8.

101. Sokolov VS and Kuz'min VG., (1980). Measurement of differences in the surface potentials of bilayer membranes according to the second harmonic of a capacitance current. Biofizika.;25(l): 170-2.

102. Solodovnikova IM, Iurkov VI, Ton'shin AA, Iaguzhinskii LS. (2004) Local coupling of respiration processes and phosphorylation in rat liver mitochondria. Biofizika.;49(l):47-56.

103. Sone N, Sekimachi M, Kutoh E. (1987) Identification and properties of a quinol oxidase supercomplex composed of a be 1 complex and cytochrome oxidase in the thermophilic bacterium PS3. J Biol Chem 262: 15386-15391.

104. Sowers E, Hackenbrock CR. (1981) Rate of lateral diffusion of intramembrane particles: measurement by electrophoretic displacement and rerandomization. Proc Natl Acad Sci USA 78:6246-6250.

105. Spivey HO, Merz JM. (1989) Metabolic compartmentation. Bioassays 10: 127-130.

106. Srere PA. (1987) Complexes of sequential metabolic enzymes. Annu Rev Biochem 56: 89-124.

107. Stroh A, Anderka O, Pfeiffer K, Yagi T, Finel M, Ludwig, Schagger (2004) Assembly of respiratory complexes I, III, and IV into NADH oxidase supercomplex stabilizes complex I in Paracoccus denitrificans. J Biol Chem 279: 5000-5007.

108. Sumegi B, Porpaczy Z, Alkonyi I. (1991) Kinetic advantage of the interaction between the fatty acid beta-oxidation enzymes and the complexes of the respiratory chain. Biochim Biophys Acta 1081: 121-128.

109. Teissie J, Prats M, Soucaille P, Tocanne JF. (1985) Evidence for conduction of protons along the interface between water and a polar lipid monolayer. Proc Natl Acad Sci U S A.; 82(10):3217-21.

110. Wagner R, Junge W. (1982) Coupling factor for photophosphorylation labeled with eosin isothiocyanate: activity, size, and shape in solution. Biochemistry.; 21(8):1890-9.

111. Williams R.J. (2001) The structures of organelles and reticula: localised bioenergetics and metabolism. Chem. Biochem. 2:637-641.

112. Williams R.J.P. (1967) Possible functions of chain of catalysists. J.Theoret. Biol., 3,209.

113. Yaguzhinsky LS, Boguslavsky LI, Volkov AG, Rakhmaninova AB.(1976) Synthesis of ATP coupled with action of membrane protonic pumps at the octane-water interface. Nature. 259(5543):494-6.

114. Yaguzhinsky LS, Yurkov VI, Krasinskaya IP. (2006) On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1757(5-6):408-14.

115. Yu A, Yu L, King TE. (1974) Soluble cytochrome b-cl complex and the reconstitutionof succinate-cytochrome с reductase. J Biol Chem 249: 4905-4910.

116. Yurkov VI, Fadeeva MS, Yaguzhinsky LS. (2005) Proton transfer through the membrane-water interfaces in uncoupled mitochondria. Biochemistry (Mosc).;70(2): 195-9.

117. Zhang,M.,Mileykovskaya,E.,and Dowhan,W.(2002) Gluing the respiratory chain together. Cardiolipin is required for supercomplex formation in the inner mitochondrial membrane. J. Biol.Chem.277, 43553 -43556

118. Zhang,M.,Mileykovskaya,E.,and Dowhan,W.(2005) Cardiolipin is essential for organization of complexes III and IV into a supercomplex in intact yeast mitochondria. J.Biol.Chem.280, 29403 -29408

119. Бойер П.Д. (1964) Новые гипотезы о механизмах фосфорилирования и передачи энергии в мышцах и митохондриях. Сб. Молекулярная биология.М., Наука, стр.227.