Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции"

швах рукописи

ЧЕРНУХА Марина Юрьевна

РЕАЛИЗАЦИЯ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CEPACIA ПРИ РАЗНЫХ ФОРМАХ ИНФЕКЦИИ.

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2008

003166508

Работа выполнена в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н Ф Гамалеи РАМН

Научный консультант Доктор медицинских наук Игорь Андроникович Шагинян

Официальные оппоненты.

- Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Владимир Викторович Кутырев

- Доктор медицинских наук, профессор Виктор Михайлович Бондаренко

- Доктор медицинских наук, профессор Роман Сергеевич Козлов

Ведущая организация ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И И. Мечникова РАМН

Защита состоится «у¿У» апреля 2008 г в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001 007 01 в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (123098 Москва, ул Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « марта 2008 г

Ученый Секретарь Диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор Е В Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В течение последнего десятилетия были получены данные, свидетельствующие о том, что бактерии В cepacia, ранее относимые к роду Pseudomonas, являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать госпитальные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии) Особую опасность бактерии В cepacia представляют для лиц с иммунодефицитами различного генеза - больных кистозным фиброзом (или муковисцидозом) и хроническим грануломатозом, у которых данные микроорганизмы способны вызвать эндокардиты, некротизирующую пневмонию с септицемией, зачастую заканчивающуюся летальным исходом (так называемый «цепация -синдром») (Gilligan Р.Н,1995, Lutter Е, Lewenza S, Dennis J J et al ,2001) Вопрос, почему бактерии В cepacia в одних случаях выделяются из мокроты больных муковисцидозом и не вызывают инфекционных осложнений, а в других вызывают тяжелые поражения легких, приводящие к смерти, до настоящего времени остаётся открытым В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции легких Учитывая ограниченные данные, касающиеся микробиологических свойств этого микроорганизма и патогенеза вызываемой им инфекции, можно отнести его к малоизученным возбудителям оппортунистических инфекций

Одним из наиболее клинически значимых представителей рода Pseudomonas является вид Р aeruginosa Бактерии Р aeruginosa нередко вызывают тяжелые поражения легких у больных муковисцидозом при смешанной инфекции в ассоциации с бактериями В cepacia Учитывая вышесказанное, целесообразным является сравнительное изучение вирулентных свойств видов В cepacia и Р aeruginosa для определения вирулентности бактерий В cepacia и путей развития инфекционного процесса при инфицировании В cepacia

В 1992 г вид Р cepacia на основании секвенирования гена 16S rRNA был отнесен к новому роду Burkholderia, включающему в настоящее время 22 вида, среди которых есть возбудители особо опасных инфекций человека и животных - сапа и мелиоидоза- В mallei и В pseudomallei Вид В cepacia является наименее изученным представителем этого рода Бактерии этого вида обитают в почве и воде, а также способны вызывать заболевания у человека, животных и растений, которые можно отнести к сапронозам (Anzai, Kim Y H, Park J Y et al 2000, Gilligan P H ,1995, Lutter E , Lewenza S , Dennis J J et al ,2001, Luczak J В , Cannon С L, Pier G В , 2002, Gilligan P H ,1995) Возможность существования этих бактерий в различных средах обитания может быть обусловлена необычно большим геномом (в 2 раза больше, чем у Е coli и в 1,5 раза больше генома Р aeruginosa), а также наличием в его составе многочисленных инсерционных последовательностей и 3-х

\

кольцевых репликонов (Mahenthiralingam Е, Urban Т A., Goldberg J В , 2005) Данные, касающиеся факторов патогенности В cepacia и механизмов их регуляции, практически отсутствуют, так же как и недостаточно изучены причины возникновения инфекции у больных с иммунодефицитами различного генеза, механизмы и факторы ее передачи и молекулярно-генетические механизмы изменчивости, обеспечивающие высокие адаптационные возможности этого микроорганизма для существования и размножения в различных условиях обитания До середины 1990-х годов оставалось неясным, являются ли бактерии В cepacia самостоятельными этиологическими агентами оппортунистических инфекций или они являются микроорганизмами, выявляемыми при тяжелых легочных инфекциях, вызываемых Р aeruginosa и S aureus В настоящее время достоверно доказана способность к колонизации В cepacia в бронхоальвеолярных путях У клинических штаммов В cepacia доказано наличие таких факторов патогенности, как пили, адгезины и гемолизин, кроме этого, как и все грамотрицательные бактерии, бактерии В cepacia имеют липополисахарид-эндотоксин Можно предположить, что эти факторы детерминируются генами, имеющими сложную структуру и регуляцию и, возможно, обладающими свойствами мобильных генетических элементов транспозонов, ряд из которых, вероятно, расположен на нескольких кольцевых ДНК Подтверждением этому является чрезвычайная пластичность комплекса В cepacia (Mahenthiralingam Е et al, 2005)

Исследования экспрессии генов факторов патогенности бактерий В cepacia являются чрезвычайно важными для понимания адаптивной изменчивости этих микроорганизмов, проблем эволюции бактерий В cepacia, эпидемиологии инфекций, вызываемых этими возбудителями

Актуальным является вопрос о родстве штаммов В cepacia, выделяемых из окружающей среды (прежде всего, почвы) и от больных Это необходимо для понимания эволюции этих микроорганизмов и их устойчивости ко многим антимикробным препаратам, связанной, возможно, с горизонтальной передачей генов Помимо изучения родства между штаммами В cepacia необходимо для предупреждения тяжелых осложнений и назначения эффективного лечения, а также для уточнения таксономии, проводить идентификацию этих бактерий Несмотря на интенсивные исследования В cepacia, проведенные в 1990-е годы, многие вопросы, касающиеся идентификации и типирования В cepacia остаются недостаточно изученными Прежде всего, это связано с несовершенством микробиологических методов, используемых для выделения и идентификации В cepacia В настоящее время 9 фенотипически сходных, но генетически различных видов (геномоваров) в литературе принято называть «комплексом бактерий В cepacia» Учитывая наличие 9 геномоваров, для окончательного типирования В cepacia необходимо использовать молекулярно-биологические методы Бактерии В cepacia принадлежат к патогенам, идентификация которых требует одновременного использования

современных бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов Подобным комплексом микробиологических методов исследования обладает не каждая бактериологическая клиническая лаборатория, что затрудняет быструю и эффективную диагностику Можно полагать, что разработка оптимальной схемы идентификации и типирования позволит значительно эффективнее выявлять В cepacia, а следовательно, решать разнообразные проблемы микробиологии и эпидемиологии ВБИ, вызываемых бактериями В cepacia

Цель работы: Выявление свойств В cepacia, ассоциированных с патогенностью, и изучение путей их различной реализации при острой и персистентной формах экспериментальной инфекции

Задачи исследования:

1 Разработать экспериментальную модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В cepacia и Р aeruginosa, и изучить условия и факторы, необходимые для перехода персистентной инфекции в острую форму и обратно

2. Исследовать молекулярно-генетические механизмы перехода острой формы инфекции, вызванной бактериями В cepacia и Р aeruginosa, в персистентную инфекцию под действием субингибирующих концентраций некоторых антибиотиков и идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся при острой и персистентной формах инфекции

3 Выявить продукцию факторов патогенности, в том числе и способность к формированию биопленки, у клинических штаммов В cepacia и определить влияние бактерий В cepacia на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных

4 Изучить роль регуляторной системы «Quorum sensing» в генетическом контроле экспрессии факторов патогенности В cepacia

5 Оценить характер взаимодействия бактерий В cepacia и Р aeruginosa in vitro и in vivo на разработанной экспериментальной модели инфекции

6 Испытать действие химически синтезированных ацилгомосерин лактонов, отличающихся длиной углеродной цепи, на свойства бактерий В cepacia и Р aeruginosa in vitro и in vivo

7 Разработать комплексную микробиологическую систему индикации бактерий В cepacia у больных и определить эпидемиологическую значимость штаммов, выделенных от больных пневмониями в клиниках г Москвы

Научная новизна работы.

Впервые изучены свойства бактерий В cepacia, ассоциированные с патогенностью, и пути их различной реализации при разных формах экспериментальной инфекции

Показано, что антибиотик ципрофлоксацин, являющийся ингибитором ДНК-гиразы и подавляющий синтез белков, в субингибирующей концентрации снижает экспрессию гена cepl, регулирующего продукцию синтазы автоиндуктора, у бактерий В cepacia и гена plcR, отвечающего за продукцию гемолизина Р. aeruginosa Экспрессия гена cepl В cepacia, который участвует в регуляции экспрессии факторов патогенности, и гена plcR Р aeruginosa обнаружена при острой форме инфекции и подавляется при персистентной форме, созданной с использованием субингибирующей концентрации (СИК) ципрофлоксацина

Создана управляемая экспериментальная модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В cepacia, на основе полученных данных об ингибировании экспрессии факторов патогенности СИК ряда антибиотиков, позволившая изучить действие различных индукторов и супрессоров на инфекционный процесс При оценке модели впервые учитывались четыре критерия персистенции отсутствие гибели экспериментальных животных, высев из органов возбудителя, замедленный рост бактерий на питательных средах с изменением морфологии колоний, а также подавление экспрессии факторов патогенности Установлено, что сигнальные молекулы лактона у-гидроксибутановой кислоты способствовали индукции перехода персистентной инфекции, вызываемой В. cepacia, в острую форму Показано, что иммунодепрессант циклофосфан содействовал переходу персистентной инфекции, вызываемой Р aeruginosa, в острую форму Критерием перехода персистентной формы в острую была гибель мышей, из селезенки которых выделяли бактерии В cepacia и Р aeruginosa

Установлено, что патогенез инфекционного процесса, обусловленного В cepacia, отличается от такового, вызванного бактериями Р aeruginosa, что выражается в различных влияниях В cepacia и Р aeruginosa на массу иммунокомпетентных органов - селезенки и тимуса, на образование АОК мышей к гетерологичному антигену (ЭБ) и на пролиферативную активность спленоцитов мышей, вследствие реализации действия различных факторов патогенности бактериями В cepacia и Р aeruginosa

Продемонстрировано, что бактерии В cepacia обладают регуляторной системой CepI/CepR "Quorum sensing". Регуляция экспрессии генов факторов патогенности у бактерий В cepacia и Р aeruginosa осуществляется с помощью сходных регуляторных систем "Quorum sensing" CepI/CepR (В cepacia) и LasI/LasR, Rhll/RhlR (P aeruginosa), относящихся к LuxIR -типу, отличающихся незначительными различиями у автоиндукторов -ацилгомосерин лактонов, а именно длиной углеродной цепи

Впервые выдвинута гипотеза о том, что у штаммов В cepacia, имеющих cepl и cepR гены, активация продукции факторов патогенности происходит под действием собственных лактонов, что может быть при моноинфекции, тогда как штаммам В cepacia, содержащим только cepR ген, для активации продукции факторов патогенности необходимы экзогенные ацилгомосерин лактоны бактерий, имеющих полноценную регуляторную систему "Quorum sensing" Подобное явление может происходить при смешанной инфекции, что подтверждено на модели экспериментальной смешанной инфекции in vitro и in vivo обнаружением синэргического усиления патогенности ассоциации В cepacia и Р aeruginosa

Установлена возможность взаимодействия регуляторных систем этих бактерий, включая систему "Quorum sensing", приводящего к взаимовыгодному использованию компонентов регуляторных систем

Впервые показано, что причиной роста вирулентности бактерий В cepacia и Р aeruginosa при экспериментальной смешанной инфекции и в опытах с синтетическими ацилгомосерин лактонами in vitro и m vivo может быть совместное действие автоиндукторов системы "Quorum sensing" этих близкородственных микроорганизмов

Впервые продемонстрировано различное действие отдельных лактонов и их сочетаний на В cepacia и Р aeruginosa на основании изучения действия искусственно синтезированных ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной боковой цепи на свойства бактерий

Установлено, что бактерии В cepacia и Р aeruginosa могут использовать в своей жизнедеятельности сразу несколько экзогенных лактонов, продуцируемых другими близкородственными бактериями,

приспосабливаясь, таким образом, к условиям своего обитания in vitro и in vivo

Впервые показано, что на способность В cepacia образовывать биопленки влияет одновременное добавление в среду выращивания двух ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной цепи, что подтвердило роль системы "Quorum sensing" в этом процессе

Впервые продемонстрировано, что у штаммов, обладающих выраженной способностью к образованию биопленки, наиболее часто выявляются факторы патогенности (гемолитическая и хитинолитическая активность), а также гены cepl и cepR, являющиеся компонентами регуляторной системы "Quorum sensing", что может служить доказательством взаимосвязи между наличием генов системы "Quorum sensing", продукцией факторов патогенности и формированием биопленок

Впервые определены критерии потенциальной способности к формированию биопленки у исследуемых штаммов выявление в ПЦР гена сЫ, ответственного за продукцию пилей, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности тканей, органов и поверхностей медицинского оборудования при образовании биопленок, и принадлежность штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР

Практическая значимость.

Собрана коллекция из 74 штаммов В cepacia, включающая 55 клинических штаммов, выделенных от больных пневмониями в больницах г Москвы, которые используются в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов и в лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН в микробиологических и молекулярно-генетических исследованиях

Разработан алгоритм индикации бактерий В cepacia, включающий бактериологический анализ и ПЦР для идентификации геномоваров В cepacia, генотипирование штаммов с помощью RAPD-ПЦР и выявление эпидемиологических маркеров BCESM (маркера эпидемических штаммов), ISH (гибрида двух инсерционных последовательностей), обнаруженного у эпидемических штаммов, и гена cbl При использовании этого алгоритма установлено, что клинические штаммы, циркулирующие в различных стационарах города Москвы, относятся к геномовару IIIA, обозначенному как Burkholderia cenocepacia Доказана эпидемиологическая значимость российских штаммов, у которых были выявлены эпидемиологические маркеры Показано, что в стационарах г Москвы циркулируют штаммы типичные для московского региона, и штаммы со специфическими генотипическими характеристиками для каждого стационара Разработанный алгоритм индикации В cepacia оформлен в виде методических рекомендаций «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia» (Чернуха МЮ, Алексеева Г В, Шагинян И А, Москва, 2005г) для клинических бактериологических лабораторий, которые утверждены советом по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН Алгоритм индикации В cepacia описан в главе «Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР» (Алексеева Г В, Чернуха М Ю, Шагинян И А) в учебно-методическом пособии «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии» (Ред Гинцбург A JI , Романова ЮМ, М, 2006) Алгоритм индикации бактерий В cepacia используется в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН при обследовании больных муковисцидозом для идентификации бактерий В cepacia и может быть использован в любой бактериологической лаборатории при наличии приборов и реактивов для проведения ПЦР

Полученные результаты позволяют представить механизм смешанной инфекции у больных муковисцидозом, вызванной бактериями В cepacia и Р aeruginosa, обладающих сходными регуляторными системами "Quorum sensing", и определить, что причиной тяжелого клинического состояния пациентов является рост вирулентности этих близкородственных бактерий за счет совместного действия ацилгомосерин лактонов- компонентов системы "Quorum sensing"

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на VII, VIII и IX съездах ВНПО эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997, 2002, 2007), на 4-й и 5-й Всероссийских конференциях «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2000, 2004), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней» (Санкт-Петербург, 2003), IY Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2003), международном конгрессе МАЬСМАХ (Москва, 2006), на конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Москва, 2007) Апробация диссертации состоялась 25 10 07 на научной конференции отделов эпидемиологии, медицинской микробиологии и отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 работ, в том числе 12 статей, а также оформлены методические рекомендации, написана глава в методическое пособие

Научные программы. Работа была выполнена в рамках грантов РФФИ и МО РФ (1997-2005 гг)

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 232 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследований, 7 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов Работа иллюстрирована 24 таблицами и 24 рисунками Указатель литературы содержит 230 источников, из них 17 отечественных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы. В течение 1999 -2005 годов в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУНИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН впервые в Российской Федерации собрана коллекция штаммов В cepacia, состоящая из 74 культур Коллекция насчитывает 55 клинических Российских штаммов В cepacia В коллекцию вошли 6 штаммов, полученных в 1998 году из Волгоградского противочумного института, 8236, 8237, 8238, 8239, 8240, АТСС17558, штаммы «почва» и «нора» (из лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУНИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН), 2 штамма из института им Пастера (Франция) и 4 штамма из Германии, поступивших в 1998-1999гг, а также 5 референс-штаммов из Бельгии (представители геномовара I - В complex (В cepacia sensu stricto), геномовара II (В multivorans), геномовара IIIA- ЗА16656 (В cenocepacia), геномовара IIIB-

ЗВ18829 (В. cenocepacia), геномовара IV (В stabilis) (2005г)). Коллекция охарактеризована по морфологическим, биохимическим,

микробиологическим свойствам

Моделирование инфекции проводили на беспородных мышах, самцах, весом 18-20 г и мышах линии C57BL/6 с использованием штаммов В cepacia 8236 и Р aeruginosa -103 , выращенных с субингибирующими концентрациями (СИК) ципрофлоксацина на L-бульоне Концентрацию микробных клеток определяли с помощью «стандарта мутности» (McFarland Standard "bioMerieux"), а также высева культур на чашки с кровяным агаром

СИК антибиотиков ципрофлоксацина и канамицина определяли методом серийных (двукратных) разведений в бульоне Мюллер-Хинтона (Holden MTG et al ,1995) После приготовления бульона с серийными разведениями антибиотика осуществляли посев исследуемых штаммов в концентрации 1x10s КОЕ/мл Штаммы выращивали при 37°С в течение 18 часов и затем учитывали результаты За СИК антибиотика принимали ту концентрацию, при которой в пробирке еще наблюдали рост культуры, тогда как в следующей за ней видимый рост отсутствовал (МИК-минимальная ингибирующая концентрация) Дня штаммов В cepacia 8236 и Р aeruginosa -103 СИК ципрофлоксацина составляет 0,06 мкг/мл

Для перехода персистентной инфекции в острую форму и обратно использовали циклофосфан (200мкг/мышь) и лактон у - гидроксибутановой кислоты (2 мкг/мышь), а также антибиотики ципрофлоксацин и канамицин, использовавшиеся в субингибирующих концентрациях

Анализ кДНК в клетках B.cepacia и P.aeruginosa по матрице иРНК.

Культуры Р aeruginosa РА103 и В cepacia 8236 высевали в концентрации 105 КОЕ/мл в 30 мл бульона Мюллер-Хинтона с СИК ципрофлоксацина и без него и выращивали в течение 18 ч при 37°С Полученные микробные культуры были изучены с использованием метода фингерпринтирования РНК с произвольными праймерами (Зигангирова Н А и авт, 2000).

Протеолитическую активность штаммов определяли на среде, содержащей 2% LA и 30% молока Клетки тестируемых штаммов высевали уколом на эту среду и инкубировали 24-48 ч при 28-37°С В случае, когда штаммы обладали протеолитической активностью, вокруг колоний наблюдали просветленные зоны ферментативного гидролиза казеина молока

Хитинолитическую активность определяли методом, разработанным Monreal J , Rees Е Т в 1969г

Гемолитическую активность оценивали по зонам гемолиза вокруг колоний исследуемых штаммов на кровяном агаре

Определение липазной активности проводили по методу, описанному Lonon М К, Woods D Е , Straus DC (1988)

Антагонистическую активность тестируемых штаммов бактерий В cepacia в отношении Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa проверяли на среде LA Культуры сеяли уколом и выращивали при 28-37 °С в течение 1-2 суток Выросшие колонии обрабатывали парами хлороформа в течение 30 мин и затем, 30 мин облучали УФ-лучами После этого чашки заливали 3-мя мл 0,6% агара, содержащего 2x107 микробных клеток индикаторного штамма S aureus или Р aeruginosa и инкубировали в течение 18-24ч при 28-37 °С Для определения антагонистической активности оценивали зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг колоний В cepacia

Чувствительность к антимикробным препаратам определяли методом серийных разведений в бульоне Исследовали устойчивость к меропенему, цефтазидиму, ципрофлоксацину, гентамицину, имипенему, тобрамицину, цефепиму и комбинациям - цефтазидиму+клавулановой кислоте и пиперациллину+тазобактаму

АГЛ, продуцируемые бактериями В. cepacia, выявляли с помощью предоставленных двух биологических тест-систем (McClean К Н, Winson М К, Fish L etal ,1997)

Генетическое типирование штаммов В cepacia осуществляли с помощью ПЦР с использованием произвольных праймеров (Першина М Ю., Шагинян И А и авт, 1998)

Гены сер I и cepR регуляторной системы QS выявляли в ПЦР (Lewenza S , Conway В , Greenberg Е Р , Sokol Р А ,1999)

Образование биопленок (БП) изучали с помощью определения способности штаммов В cepacia к адгезии на поверхности 96-луночной полистероловой планшеты (Штейн И В, Аренде И М, Сорокина Т А и ДР Д989)

In vitro симбиотические взаимоотношения бактерий В cepacia и Р aeruginosa исследовали при высеве культур на 5% кровяной агар для сравнения их гемолитических свойств

In vivo взаимодействие бактерий В. cepacia и Р. aeruginosa изучали в экспериментальной модели заражения беспородных мышей самцов весом 1820г Суспензии культур вводили животным интраназально или внутрибрюшинно в дозе LD50> определенной предварительно Для штамма В cepacia 370 LD50 составляла 2х109 КОЕ/мышь (50мкл) по «стандарту мутности» (при высеве 108 КОЕ/мышь) в случае интраназального введения и 5х109 КОЕ/мышь (0,2 мл) по «стандарту мутности» (при высеве 2х108 КОЕ/мышь) для внутрибрюшинного введения Для штамма Р aeruginosa РА 103 дозы LD50 были, соответственно, 10б КОЕ/мышь и 3x106 КОЕ/ мышь по «стандарту мутности»

Влияние автоиндукторов на свойства штаммов В. cepacia и Р. aeruginosa исследовали в опытах in vitro и in vivo Лактоны С4 [N-(3-гидроксибутаноил)-Ь-гомосерин лактон], С6 (Ы-(З-оксогексаноил)-Ь-гомосерин лактон], С8 [Ы-(3-оксооктаноил)-Ь-гомосерин лактон], СО [L-гомосерин лактон-HBr] были синтезированы и очищены методом колоночной хроматографии на силикагеле 35/60 (элюент гексан-этилацетат 2.1) в НИИ Органической химии РАН Чистота продукта (95%) подтверждена методом ВЭЖХ (прибор Gilson 302, элюент гексан-этилацетат 2 1) Идентичность (соответствие формуле) продукта подтверждена с помощью 1Н ЯМР спектроскопии (растворитель DMSO d 6, прибор Bruker-SF300)

Для изучения действия лактонов in vitro культуры в концентрации 105 кл/мл с добавлением лактонов в концентрациях 10, 50 и 100 нг/мл выдерживали 3 часа при 37°С в L-бульоне После десятикратных разведений бактериальных суспензий по 0,1 мл культуры из каждого разведения высевали на 5 чашек с 5% кровяным агаром и инкубировали 48 часов при 30° С Измерение диаметров зон гемолиза вокруг колоний проводили на тех чашках, где количество колоний составляло от 50 до 200 После трехкратного повторения эксперимента показатели концентраций микробных клеток и диаметров зон гемолиза рассчитывали с учетом доверительных интервалов и достоверности различий (Ашмарин И П, Воробьев А А ,1962)

Для изучения действия лактонов in vivo суспензии культур В cepacia 370 и Р aeruginosa РА103 в дозах LD50, определенных для каждой модели предварительно, вводили животным одновременно с лактонами в следующих концентрациях С4 - 10 нг/г, С6 -10 нг/г, С8 - 50 нг/г массы животного

Для оценки влияния лактонов на образование биопленки штаммами В cepacia 370 и Р aeruginosa РА103 культуры выращивали с добавлением различных лактонов и затем изучали образование биоплёнок

Реакцию бласгтрансформации ставили по стандартной методике Принцип метода заключается в способности малых лимфоцитов трансформироваться в бластные клетки под влиянием митогенов В качестве митогенов использовали конконавалин А (Коп А) в концентрации 4 мкг/мл

(Т-митоген) и ЛПС Е coli 0111. В4 («Sigma») (В-митоген) в концентрации 200 мкг/мл Результаты реакции оценивали по включению 3Н тимидина . На 4-е сутки после внутрибрюшинного заражения культурами исследованных штаммов В cepacia 8236 и 8240 и Р aeruginosa РА 103 в дозе 1x106 КОЕ/мышь проводили учет результатов реакции бласттраснформации Эксперименты выполнены на беспородных и линейных мышах Balb/c самцах, весом 18-20 г, полученных из питомника "Столбовая" Животных заражали внутрибрюшинно в изученных дозах

Выявление антителообразующих клеток (АОК), синтезирующих антитела к гетерологичному антигену (эритроциты барана - ЭБ) проводили в реакции Ерне (Jerne N К ,1971)

С целью изучения влияния живых бактерий на иммунокомпетентные органы (тимус, селезенка) при моделировании персистентной инфекции определяли их массу у здоровых и инфицированных мышей

Идентификация бактерий. Все штаммы были идентифицированы с помощью коммерческих тест-систем API 20 NE "BioMerieux" (Франция), E/NE "Crystal" (США), NEFERMtest ("Lachema") в соответствии с инструкцией производителя Рост на селективном агаре для В cepacia (BCSA) (Henry D, Campbell M, McGimpsey С et al, 1999) наблюдали при t=37°C через 24ч и при t=30°C через 48ч Продукцию пигмента учитывали при выращивании бактерий на L-arape с 1% глицеролом при t=37°C в течение 24-х и 48 часов Рост бактерий при t=42°C в L-бульоне контролировали через 48 часов по наличию мутности

Определение геномовара проводили с помощью ПЦР согласно методам Bauernfeind А, Schneider I, Jungwirth R et al ,1999, Mahenthiralingam E, J Bischof, S К Byrne et al, 2000

Обнаружение эпидемиологических маркеров BCESM, ISH и cbl -

гена осуществляли в ПЦР (Clode F Е , Kaufmann М Е , Malnick Н et al, 2000)

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Excel», численных и графических методов описательной статистики

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.Создание экспериментальной модели персистентной инфекции.

Осуществляли два варианта разработки экспериментальной модели персистентной инфекции В первом варианте беспородных мышей заражали внутрибрюшинно LD50 штаммов В cepacia 8236 и Р aeruginosa (РА-ЮЗ) с одновременным введением СИК ципрофлоксацина и последующими инъекциями антибиотика в течение 5 дней Для сравнения результатов ципрофлоксацин вводили в трех концентрациях из расчета СИК (1,2 мкг/мышь), в 2 раза больше СИК (2,4 мкг/мышь), в 3 раза больше СИК (3,6 мкг/мышь) Контрольную группу составили животные, которым не вводили антибиотик При заражении В cepacia выживаемость мышей увеличивалась только с использованием наиболее высокой концентрации ципрофлоксацина При заражении мышей Р aeruginosa выживаемость мышей не превышала выживаемости контрольной группы

Наиболее оптимальным был 2-й вариант модели, при котором до внутрибрюшинного заражения делали инъекции СИК ципрофлоксацина в течение 5 дней (Рис 1) Как видно на рис 1 выживаемость мышей возросла при таком заражении Р aeruginosa до 70-80% по сравнению с контролем Только введение СИК ципрофлоксацина (1,2 мкг/мышь) не повлияло на выживаемость животных Наиболее показательными были результаты при 2-м варианте модели и заражении мышей В cepacia После введения всех доз ципрофлоксацина, включая СИК, выживаемость мышей увеличилась по сравнению с контролем до 80-90% В течение всего эксперимента контролировали наличие возбудителей в селезенке животных Бактерии В cepacia и Р aeruginosa высевали из ткани селезенки, начиная с 5-х суток после заражения Следует отметить, что продолжительность выделения бактерий В cepacia составляла 20 суток, тогда как выделение синегнойной палочки только 10 суток Можно предположить, что разница в длительности высева бактерий В cepacia и Р aeruginosa из селезенки связана с более высокими адаптационными возможностями В cepacia, позволяющими этим бактериям длительно персистировать в организме Сроки появления первых колоний В cepacia на плотной питательной среде (1111С) выросли от обычных 24-48 часов до 5-7 суток Разработанная модель дает возможность оценить персистенцию бактерий В cepacia и Р aeruginosa по следующим критериям выживаемости животных, выделению микробов из селезенки мышей, замедленного роста бактерий после высева из органов на питательные среды, подавление экспрессии факторов патогенности. Экспериментальная модель имеет преимущества по сравнению с другими моделями инфекций, так как позволяет оценить течение инфекции, наблюдая за выживаемостью мышей

Р аещгцива РА103

В сераиа £236

и выживаемости

ЦФ

' ' '

1 2 3 4 5

ЦФ

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

КОЕЛт

% выживаемости

"V

К

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

КОИмп

в...

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 [ 1x10' КОЕ/мышь]

1,2 мкгЦФ 2,4 нкгЦФ 3,6 нкгЦФ

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21

„^ I 3,1x105 КОЕ ЦФ

5 дней •-• 1,2 мкгЦФ

Л- 2,4 нкгЦФ

3,6 икгЦФ

--------- КОЕйт в селезенке мышей --------- КОЕ/нп в селезенке мышей

Рис 1 Результаты моделирования на животных экспериментальной инфекции (2 вариант)

Для оценки воспроизводимости разработанной модели внутрибрюшинного заражения с введением ципрофлоксацина до инфицирования в течение 5 дней мы подтвердили полученные данные, используя другие штаммы В cepacia - референс штамм ЗВ18829 и клинический штамм В cepacia 370 Переход острой инфекции в персистентную форму удалось наблюдать при инфицировании мышей дозами LD100 В cepacia 8236 и Р aeruginosa РА103 и предварительным введением СИК ципрофлоксацина

Разработанную модель удобно использовать для изучения влияния различных условий на персистенцию В cepacia и Р aeruginosa На этой модели были проведены исследования по изучению влияния иммунодепрессантов и неспецифических лактонов на переход персистентной инфекции в острую форму

Условия перехода персистентной инфекции в острую форму под действием различных индукторов. Для перевода персистентной формы инфекции в острую сначала воспроизвели разработанную ранее модель персистентной инфекции с предварительным введением животным антибиотиков После заражения мышей возбудителем Р aeruginosa, животным однократно вводили лактон у -гидроксибутановой кислоты или циклофосфан Аналогично проводили эксперимент при заражении животных возбудителем В cepacia Критерием перехода персистентной формы в острую считали гибель мышей, из органов которых одновременно выделяли клетки В cepacia и Р aeruginosa

В результате проведенных исследований было показано, что переход в острую форму инфекции происходит у 10% мышей, зараженных бактериями В cepacia, которым был введен лактон При этом, из селезенок погибших мышей, высевали клетки В cepacia в концентрации 10б КОЕ/мл В контрольной группе мышей, которым не вводили индуктор - лактон у -гидроксибутановой кислоты, гибели животных не наблюдали Таким образом, лактон у -гидроксибутановой кислоты влиял на переход персистентной инфекции в острую форму при инфицировании бактериями В cepacia.

Однократное введение циклофосфана мышам, зараженным В cepacia, не вызывало перехода персистентной инфекции в острую форму ни у одного из зараженных животных

И, напротив, у мышей зараженных Р aeruginosa (штамм РА 103), которым непосредственно после заражения однократно вводили циклофосфан, переход в острую форму инфекции наблюдали у 30% животных В то же время однократное введение лактона у гидроксибутановой кислоты не приводило ни к гибели мышей, ни к увеличению количества клеток возбудителя, высеваемых из селезенки животных

Различные эффекты действия циклофосфана и лактона на бактерии В

cepacia и P aeruginosa можно объяснить, по нашему мнению, различием инфекционных процессов, вызываемых бактериями В cepacia и Р aeruginosa, включающих экспрессию разных факторов патогенности Эксперименты in vivo показали, что циклофосфан может влиять на выбор бактериями Р. aeruginosa пути развития острой инфекции и не оказывает значительного эффекта на развитие инфекции, вызванной В cepacia

2. Изучение действия субннгибирующнх концентраций антибиотиков на экспрессию генов, регулирующих продукцию факторов патогенности у бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa. Следующим этапом данной работы явилось изучение на молекулярно-генетическом уровне причин перехода острой формы инфекции В cepacia и Р aeruginosa в персистентную под действием СИК антибиотика при моделировании инфекции in vitro Для изучения in vitro экспрессии генов факторов патогенности бактерий Р aeruginosa и В cepacia, выращенных в различных условиях - в присутствии антибиотика ципрофлоксацина и без него - был применен метод фингерпринтирования РНК с помощью произвольных праймеров Этот метод позволяет анализировать гены дифференцированно экспрессирующиеся в различных условиях и получить «молекулярный портрет» бактериальной клетки

В результате проведенных исследований были получены радиоавтографы кДНК, полученных из культур Р aeruginosa и В cepacia, выращенных в различных условиях (рис 2) Анализ профилей кДНК показал, что в профиле кДНК штамма В cepacia, выращенного без антибиотика, обнаружено 20 фрагментов, отсутствующих в профиле кДНК этого штамма, выращенного с СИК антибиотика В образце, полученном из культуры В cepacia, выращенной с СИК ципрофлоксацина выявлено 5 полос различной интенсивности, отсутствующих в кДНК культуры, выращенной без антибиотика В фингерпринте кДНК, полученном из культуры Р aeruginosa РА103, выращенной без антибиотика, выявлено 9 фрагментов, отсутствующих в профиле кДНК той же культуры, но выращенной с СИК ципрофлоксацина И, напротив, в профиле кДНК из культуры Р aeruginosa РА 103, выращенной с СИК ципрофлоксацина, выявлены 8 дополнительных фрагментов, различной интенсивности, отличных от фрагментов кДНК из культуры, выращенной без ципрофлоксацина Приведенные выше результаты служат доказательством влияния антибиотиков на экспрессию генов Ципрофлоксацин, являясь ингибитором ДНК-гиразы уменьшает экспрессию ряда генов Так как среди 17 различных фрагментов ДНК штамма Р aerugenosa и 25 фрагментов штамма В cepacia могли оказаться гены, кодирующие продукцию факторов патогенности, все полосы, характерные для каждой из исследованных культур, были отмечены и вырезаны из геля Затем 7 выбранных и выделенных из агарозного геля фрагментов (размером 500 — 1000 нп) были подвергнуты дальнейшим процедурам амплификации и клонирования Наличие клонированных

фрагментов 8,10,22,33,39,42 в составе векторной плазмиды было подтверждено в ПЦР с RSP праймером После секвенирования клонированных фрагментов проводили анализ прочитанных нуклеотидных последовательностей при сравнении с базой данных банка генов Это позволило идентифицировать гены, экспрессия которых подвержена регуляции антибиотиками, добавляемыми к культурам в субингибирующих концентрациях

Были получены образцы нуклеотидных последовательностей 4-х клонированных фрагментов фрагмента 8 штамма Р aeruginosa , выращенного без ципрофлоксацина, фрагментов 10 и 22 штамма В cepacia, также выращенного без антибиотика, фрагмента 42 штамма В cepacia , выращенного с СИК ципрофлоксацина При анализе нуклеотидной последовательности фрагмента 22 , выделенного из "молекулярного портрета" штамма В cepacia 8236, выращенного без антибиотика, обнаружена высокая степень гомологии (83%) в позициях 1532-1645 с геном cepl Данный ген, кодирует ацил-гомосерин синтазу (Cepl), которая участвует в синтезе автоиндукторов, включенным в активацию продукции факторов патогенности Cepl относится к семейству Lux I ацилгомосерин синтаз (Таб 1) При анализе нуклеотидных последовательностей фрагмента 8 Р aeruginosa, выращенного без ципрофлоксацина, установлено, что в позициях 144-274 он имеет высокую степень гомологии (90%) с геном plcR Ген plcR детерминирует продукцию гемолизина или фосфолипазы С, которая является одним из факторов патогенности у штаммов вида Р aeruginosa

При анализе нуклеотидной последовательности фрагмента 42, длиной 119 нуклеотидов, полученного из "молекулярного портрета" В cepacia 8236, выращенного в присутствии антибиотика, устновлена достаточная степень гомологии с геном 23 S рибосомальной РНК В cepacia в позициях 458-577, а также с геном гесА (гомология 58-72%) различных штаммов В. cepacia В последнем случае можно полагать, что при отсутствии действия субингибирующей концентрации антибиотика данный ген не экспрессируется, в связи с чем на "молекулярном портрете" В cepacia 8236, полученном из культуры, выращенной без ципрофлоксацина отсутствует фрагмент с аналогичной молекулярной массой Различия в степенях гомологии идентифицированного фрагмента с нуклеотидными последовательностями разных штаммов В. cepacia объясняются высоким уровнем полиморфизма гена гесА у штаммов В. cepacia Нам представляется, что активация экспрессии гена гесА под действием субингибирующих концентраций антибиотиков необходима для адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям в присутствии антибиотика, что требует дальнейшего изучения Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей фрагмента 10 (В cepacia) с известными нуклеотидными последовательностями банка генов В cepacia, Р aeruginosa и другими известными бактериальными нуклеотидными последовательностями не позволило провести идентификацию данного гена

Таблица 1.

Иденфицированные дифференциально экспрессирующиеся гены бактерий В.серас1а и Р.аеп^пова, выращенных в различных условиях.

Ген Продукт Бактерии В cepacia, выращенные без антибиотика Бактерии В cepacia, выращенные с антибиотиком Бактерии Р aeruginosa, выращенные без антибиотика Бактерии Р aeruginosa, выращенные с антибиотиком

Ген сер1 Ацилгомосерин-синтаза + - - -

Ген р1сЯ Гемолизин или фосфолипаза С - - + -

Ген гесА Регулятор генетической рекомбинации, рекомбинантно-го востановле-ния, регулятор ответа на стресс - + - -

I

п

ni П'

Рис. 2. Фингерпринтинг штаммов P.aeruginosa PA103 и В.cepacia 8236, выращенных в различных условиях.

I - клетки В.cepacia 8236, выращенные с субингибирующей концентрацией (СИК.) ципрофлоксацина.

II ■ клетки В.cepacia 8236, выращенные без антибиотика (контроль).

III - клетки P.aerugiriosa РА103, выращенные с СИК ципрофлоксацина.

IV ■ клетки P.aeruginosa РА103, выращенные без антибиотика (контроль).

1 -29 - дополнительные полосы в контролях по сравнению с опытом. 30-42 - дополнительные полосы в опытах по сравнению с контролем.

3. Выявление вирулентных свойств и компонентов регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов бактерий Burkholderia cepacia. Первым этапом исследования было изучение фенотипических и генотипических свойств у клинических штаммов В cepacia, выделенных от больных в ряде стационаров г. Москвы

В данной работе использовали две тестерные системы, позволяющие определить продукцию большинства известных АГЛ, в том числе, описанных для В cepacia Тестерная система на основе штамма С violaceum CV026 позволяет обнаруживать с различной степенью чувствительности АГЛ с углеродными боковыми цепями, содержащими от 4-х до 8-ми ацильных (СН2) групп ( McClean К H, Winson M.K, Fish L et al ,1997) Репортерная система на основе Agrobacterium tumefaciens, содержащая traG lacZ конструкцию и регуляторный ген traR, позволяет определять алканоил-, 3-оксо- и 3-гидрокси- производные гомосеринлактона с длиной боковой цепи от 6 до 12 ацильных групп (Cha С , Gao Р , Chen J С et al ,1998) Результаты анализа показали, что большинство исследованных штаммов — 31 из 33 (94 %) синтезировали АГЛ и только у двух штаммов (6%) продукции АГЛ не выявлено Достоверно определить продукцию АГЛ, как правило, оказывалось возможным, только при использовании обеих тест-систем Однако, необходимо отметить, что синтез АГЛ, оцениваемый по интенсивности окрашивания штриха индикаторного штамма, был более слабым по сравнению с другими изученными нами в этом отношении бактериями, например, с Chromobacterium violaceum, использованными как контроль, Pseudomonas aureofaciens, Р putida, Erwinia spp, Pseudomonas aeruginosa и др , (Штейн И В , Аренде И M , Сорокина Т А и др , 1989) что согласуется с данными литературы (Loazdunski A M, Ventre I, Aturgis U N ,2004) Изменение условий культивирования клинических штаммов В cepacia, а именно, использование различных питательных сред (LA, LA с 1% глицерина или 0,2-1,0 % глюкозы, триптозного или кровяного агара), выращивание при различных температурах (от 28 до 37°С) не увеличивали продукции АГЛ

Наличие компонентов регуляторной системы QS - генов cepl и cepR, кодирующих синтез АГЛ и регуляторный белок, связывающийся с автоиндуктором, соответственно (Lutter Е, Lewenza S, Dennis J J et al, 2001), у исследуемых штаммов выявляли с помощью ПЦР Ген cepR, кодирующий регуляторный белок, выявлялся у всех исследуемых штаммов, в то время как ген cepl, кодирующий синтез АГЛ, не выявлялся у 11 штаммов из исследуемой коллекции При этом, как было отмечено выше, продукция АГЛ, определяемая в биологических тестах, не выявлялась только у двух штаммов (420 и 427), у которых и в ПЦР не выявляется ген cepl

Изучение продукции факторов патогениости клиническими штаммами B.cepacia. Выделенные клинические штаммы В cepacia были исследованы на продукцию протеаз, гемолизинов, хитинолитическую и

липазную активности При определении протеолитической активности установлено, что все исследуемые штаммы В cepacia синтезируют протеазы Как показало определение величины зон ферментативного гидролиза казеина молока вокруг колоний этих штаммов, самой низкой протеолитическая активность была у штамма 427 У остальных штаммов величины зон существенно не различались, особенно, в случае, когда их определяли через 4 суток инкубации клеток Синтез протеаз наблюдался при росте клеток как при 28° так и 37°С

По данным S Lewenza с соавт (Lewenza S , Conway В., Greenberg Е Р, Sokol РА ,1999), мутация в гене cepl В cepacia приводит к отсутствию синтеза АГЛ и протеолитической активности В связи с этим, была сделана попытка выявить корреляцию между синтезом АГЛ и величиной зон гидролиза казеина у исследуемых штаммов Такой корреляции мы не обнаружили У ряда штаммов, например, Б-515, Б-0467, 225, 421, 423, 375, 281, при слабом синтезе АГЛ зоны гидролиза казеина были такими же, как у других штаммов с более выраженной продукцией АГЛ То же наблюдалось и в случае штамма 420, у которого мы не обнаружили синтеза АГЛ, а зоны просветления были обычной величины Единственным исключением являлся штамм 427, у которого при отсутствии продукции АГЛ наблюдалась очень слабая по сравнению с другими штаммами зона гидролиза казеина, проявлявшаяся только после роста клеток в течение 4 суток

Исследование липазной активности показало ее наличие у всех штаммов, кроме штамма Б-511, обнаруживалась она также при 28 и 37°С Продукция гемолизина выявлена у 13 (39 3%) штаммов В cepacia

4. Формирование биоплёнок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик. В настоящее время известно, что способность формировать биопленки у бактерий является маркером хронической инфекции Следующим этапом наших исследований явилось изучение способности формирования биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса В cepacia, выделенными от больных различных стационаров г Москвы, за период 1999 - 2001 гг и сравнительный анализ их фенотипических и генотипических характеристик

Из 54 изученных клинических изолятов у 45 штаммов (83,3%) наблюдали способность к формированию биопленки У остальных 9 штаммов (16,7%) уровень абсорбции кристалвиолета этанолом, измеренный при длине волны 540 нм на спектрофотометре в единицах оптической плотности (ОП) соответствовал фону или отрицательному контролю Штаммы, способные формировать биопленку, на основании различий в ОП были разделены нами на три группы I — обладающие выраженной способностью к формированию биопленки (27,8%), II — с умеренной способностью образовывать биопленки (55,6%) и III - не способные формировать биопленки (16,6%)

Разная способность к формированию биопленок может свидетельствовать о различиях в вирулентности исследуемых штаммов, а также генотипических отличиях, таких, например, как наличие в составе генома генов системы Quorum sensing сер I и сер R, а также генетических маркеров эпидемиологической значимости штаммов («эпидемиологические» маркеры Cbl, ISH, BCESM)

В связи с этим следующим этапом работы было изучение возможной корреляции продукции факторов патогенности штаммами В cepacia с их способностью формировать биопленки

Продукция факторов патогенности бактериями комплекса В. cepacia и их способность к формированию биопленок. Протеолитической и липазной активностью обладали штаммы всех групп, дифференцированных по способности формировать биопленку, однако по способности расщеплять хитин и обладать гемолитической активностью штаммы указанных групп отличались Так 13 3% штаммов с выраженной способностью формировать биопленки обладали хитинолитической активностью, тогда как среди штаммов с умеренной способностью - было только 3,3% культур с подобной активностью, а среди штаммов, не способных образовывать биопленку, таких культур не было выявлено

Если штаммы с гемолитической активностью в I и II группе составляли около 40 и 36,6% соответственно, то среди штаммов, не обладающих способностью образовывать биопленки, их оказалось только 11,1% Максимальной способностью образовывать пигмент у колоний обладали штаммы с выраженной способностью пленкообразования (20%) У штаммов с умеренной способностью формирования биопленки и не образующих ее пигментообразование наблюдали соответственно только у 13,3 и 12,5% культур

Ген cepR выявлялся с незначительными различиями у всех штаммов исследованных групп (100, 96,6% и 100% соответственно) Процент выявления гена cepl слабо различался среди штаммов, способных к формированию биопленки и не способных ее образовывать (73%, 66,6% и 77,7%)

Среди штаммов I группы (таб 2), характеризующихся выраженной способностью формирования биопленок, более часто выявляются факторы патогенности, а также гены cepl и cepR, что может служить основанием для подтверждения патогенности этих штаммов Не исключается и вероятность того, что такие штаммы, возможно, обладают большими адаптационными возможностями при изменении условий или смене ниш обитания, а исследованные нами фенотипические и генотипические признаки не обязательно непосредственно участвуют в процессе формирования биопленок

Таблица 2.

Свойства штаммов бактерий комплекса В. cepacia с различной степенью пленкообразования.

Свойства Степень пленкообразования (в %)

I II III

Протеолитические свойства 100 100 100

Хитинолитическая активность 13,3 3,3 0

Гемолитическая активность 40 36,6 11,1

Липазная активность 86,7 100 100

Наличие пигмента 20,0 13,3 12,5

сер I % 73 66,6 77,7

сер Я % 100 96,6 100

Генотипирование штаммов бактерий комплекса В. cepacia с различной способностью к формированию биопленок.

Результаты геноидентификации показали, что все клинические штаммы бактерий комплекса В cepacia, выделенные от больных в разных клинических стационарах г Москвы, принадлежат к геномовару III подгруппы А (результаты представлены в следующей главе) Бактерии комплекса В cepacia геномовара III в настоящее время получили видовое наименование В cenocepacia

Далее штаммы В cenocepacia, обладающие различной способностью к формированию биопленки, были типированы с помощью ПЦР с произвольным праймером SH1

Таблица 3.

Генотипические варианты клинических штаммов В. cenocepacia в зависимости от способности формирования биопленки.

Генотипический вариант Степень пленкообразования (% штаммов)

I II III

1 33 3 - 50

3 - 5,3 25

4 66 7 42 0 25

5 - 5 3 -

В табл 3 видно, что штаммы, характеризующиеся выраженной способностью к формированию биопленки, принадлежат только к двум геновариантам (1 и 4)

Корреляция меяеду наличием у штаммов «эпидемиологических» маркеров и способностью штаммов к формированию биоплёнок.

И, наконец, представляло интерес, существует ли корреляция между наличием у штаммов В cenocepacia предполагаемых «эпидемиологических» маркеров и способностью к формированию биопленок С этой целью штаммы были исследованы на наличие нуклеотидных последовательностей гена cbl, BCESM и ISH маркеров (Clode F Е, Kaufmann М Е , Malnick Н et al ,2000) Почти у трети (31,5%) клинических штаммов В cenocepacia выявлялся хотя бы один эпидемиологический маркер При этом частота выявления хотя бы одного эпидемиологического маркера в I группе штаммов составила 46,7 %, а во II и III - 23,3 и 33,3 % соответственно По данным литературы — маркер BCESM (маркер эпидемических штаммов) присутствует только у штаммов 3-го геномовара В наших экспериментах BCESM был выявлен у 18,5% всех исследованных штаммов с приблизительно равной долей штаммов в каждой из трех сравниваемых групп (20% , 13,3% и 33,3% соответственно) ISH маркер чаще выявлялся в III группе штаммов (11,1%) Ген cbl, ответственный за продукцию пилей СЫ, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности ткани, органа, поверхности медицинского прибора при образовании биопленок, выявлен у 22,2% штаммов, причем в I группе, характеризующейся выраженной способностью к формированию биопленок, его выявляли более чем в два раза чаще, чем во II и III группах штаммов (26,3%, 13 3% и 11,1% соответственно) Таким образом, ген cbl, выявлявшийся в 1-й группе штаммов с выраженной способностью к формированию биопленок может считаться, вероятно, не только «эпидемиологическим» маркером, но и маркером потенциальной способности формирования биопленок у штаммов В cenocepacia

Изучение антибиотикочувствительности штаммов с разной способностью к формированию биоплёнки. Последним этапом изучения фено- и генотипических свойств клинических штаммов В cenocepacia было изучение их чувствительности к антимикробным препаратам, рекомендованным для лечения заболеваний, вызываемых грамотрицательными неферментирующими бактериями, и наиболее часто употребляемым в настоящее время для лечения

При анализе чувствительности штаммов В cenocepacia к антибиотикам имипенему (IPM) и ципрофлоксацину (CIP), наблюдали наиболее вариабельные результаты При этом для демонстративности полученных результатов чувствительным считали штамм, если он обладал чувствительностью хотя бы к одному из этих двух антибиотиков В I группе чувствительных штаммов выявлено только 13,3%, во II группе их было в два раза больше 33,3% и в III - 44,4% Таким образом, клинические штаммы В

cenocepacia с выраженной способностью к формированию биопленок характеризуются большим спектром резистентности к антибиотикам

Таким образом, фено- и генотипические характеристики клинических штаммов бактерий комплекса В cepacia, свидетельствуют о том, что более 83% последних способны формировать биопленку, а следовательно колонизировать поверхности органов и тканей (прежде всего, легких, ран) и вызывать хроническую госпитальную инфекцию Выявление в ПЦР гена сЫ, а также принадлежности штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР, обнаружение у штаммов хитинолитической способности могут считаться маркерами эпидемиологической значимости клинических штаммов В cepacia с потенциально выраженной способностью к формированию биопленки, а, следовательно, штаммов, способных вызывать хронические госпитальные инфекции или формировать хронические резервуары возбудителя на медицинских приборах, оборудовании и в госпитальной среде

5. Роль регуляторной системы «Quorum sensing» в симбиотическом взамодействии бактерий В. cepacia и P. aeruginosa при смешанной инфекции.

Взаимоотношения бактерий P. aeruginosa и В. cepacia in vitro.

Антагонистическая активность штаммов В cepacia по отношению к бактериям Р aeruginosa была проверена in vitro При совместном инкубировании культур тестируемых штаммов В cepacia и культуры Р aeruginosa РА103 вокруг колоний всех исследованных штаммов В cepacia отсутствовали зоны подавления роста индикаторного штамма Р aeruginosa Таким образом, у бактерий В cepacia не обнаружено антагонистической активности по отношению к бактериям Р aeruginosa in vitro.

Далее нами были изучены симбиотические взаимоотношения бактерий В cepacia и Р aeruginosa in vitro При посеве на одной чашке культур штаммов В cepacia 370 и Р aeruginosa РА103 зоны гемолиза увеличивались у одной и у другой культуры, по сравнению с зонами гемолиза, образуемыми культурами при раздельном посеве Было отмечено, что чем ближе росли культуры, тем больше были зоны гемолиза. Если гемолиз у колоний В cepacia проявлялся через 48 часов, а у P. aeruginosa через 24 часа инкубации, то при посеве «крест на крест» двух культур на одной чашке гемолиз отчетливо был виден через 24 часа То есть, симбиотические отношения двух исследуемых культур в этом тесте in vitro проявлялись в усилении синтеза фосфолипазы С одной из тестируемых культур или двумя сразу, что фенотипически выявлялось в увеличении зон просветления на чашках с кровяным агаром Поскольку фосфолипаза С является одним из факторов патогенности обоих возбудителей следующим этапом работы была проверка вирулентности штаммов в опытах in vivo

Взаимоотношение В. cepacia 370 и P. aeruginosa РА103 in vivo. При

одновременном заражении животных культурами В cepacia 370 и Р aeruginosa РА103 в дозе LD50 для каждой из них наблюдали усиление их вирулентных свойств, так как в течение суток наблюдали гибель всех животных, те доза заражения из LD50 становилась LD100 Полученные данные позволяют выдвинуть предположение, что симбиотические взаимоотношения исследуемых бактерий in vivo также выражаются в увеличенной продукции факторов патогенности и утяжелении инфекционного процесса у животных

Влияние авто индукторов (лактонов) системы QS на свойства В. cepacia и P. aeruginosa in vitro Для выявления роли отдельных компонентов системы QS на экспрессию факторов патогенности нами было изучено прямое действие химически синтезированных лактонов С4, С6, С8 на свойства бактерий В cepacia и Р aeruginosa в опытах in vitro Для экспериментов in vitro культуры штаммов В cepacia 370 и Р aeruginosa РА103 выращивали в питательной среде, в которую добавляли полученные лактоны по отдельности в концентрациях Юнг/мл, 50 нг/мл и 100нг/мл Концентрации лактонов были выбраны, учитывая результаты, полученные ранее для лактона у -гидроксибутановой кислоты Оптимальными дозами лактонов, вызывающими ускорение роста клеток В cepacia в проведенных экспериментах оказались для С4 - 10 нг/мл, для С6 - 10 нг/мл, и для С8 - 50 нг/мл При этом, инкубация бактерий с каждым из лактонов в выбранных концентрациях не влияла на изменение диаметров зон гемолиза, размеров и форм быстро растущих колоний (Табл 4) Таким образом, действие лактонов выражалось в ускорении размножения бактерий и не влияло на размеры и форму колоний, а также на гемолитические свойства штамма

При исследовании влияния лактонов на свойства бактерий Р aeruginosa, использовали те же концентрации, что и для клеток В cepacia Было показано, что лактоны различно влияют на скорость роста клеток В cepacia и Р aeruginosa (Табл 4) В отличие от В cepacia, добавление лактона С4 приводило не к увеличению количества колоний, а, наоборот, к снижению КОЕ/мл Р aeruginosa на 20 % Добавление лактона С6 также как и у В cepacia вызывало увеличение КОЕ/мл Число колоний при этом на 80% превышало показатели в контрольной группе Добавление С8 — увеличивало КОЕ/мл только на 20% Однако, в случае Р aeruginosa мы наблюдали различное действие отдельных лактонов уменьшение или увеличение размера колоний без изменения их формы, а также зон гемолиза вокруг них Так, под действием лактона С4 выросшие колонии были меньше в диаметре по сравнению с контрольными и зоны гемолиза вокруг них были меньше контрольных Действие же лактонов С6 и С8, напротив, выражалось в увеличении размера колоний P. aeruginosa и зон гемолиза Таким образом, если исследуемые лактоны активировали только скорость размножения бактерий В cepacia, то в случае P. aeruginosa лактон С4 не только снижал скорость размножения бактерий, что,

Таблица 4.

Характеристика свойств бактерий В.сераыа и Р.аегодпоза при добавлении в среду инкубации лактонов.

Инкубация бактерий с лактонами КОЕ/мл бактерий (%) Форма колоний Размер колоний (в мм) Наличие Гемолиза Диаметр зон гемолиза (в мм)

В cepacia без лактона - 100 Круглая 2,1±0,12 + 4,2±0,09

В cepacia+C4 180 Та же 2,2±0,09 + 4,1±0,13

В cepacia+C6 160 Та же 2,5±0,11 + 4,4±0,18

В cepacia+C8 180 Та же 2,3±0,08 + 4,4±0,12

В cepacia+C4C6 100 Та же 2,2±0,10 - -

В cepacia+C6C8 100 Эллипсовидная 4,1±0,11 + 6,3±0,15

В cepacia+C4C8 100 Та же 2,3±0,12 - -

В cepacia+C4C8 100 Та же 2,1±0,13 + 7,4±0,09

Г aeruginosa оез 100 Та же 3,5±0,10 + 7,5±0,13

Р aeruginosa+C4 80 Та же 2,3±0,14 + 4,3±0,15

Р aerugmosa+Сб 180 Та же 4,6±0,11 + 10,3±0,14

Р aerugmosa+C8 120 Та же 4,5±0,13 + 10,2±0,12

Р aerugmosa+C4C6 100 Та же 4,1±0,09 + 10,1±0,14

Р aeruginosa+C4C8 100 Та же 2,4±0,10 + 4,4±0,12

Р aeruginosa+C6C8 170 Та же 3,2±0,13 + 7,3±0,08

Р aeruginosa+C4C6C8 160 Та же 4,4±0,10 + 10,3±0,15

по-видимому, и приводило к уменьшению размера колоний и к ингибированию или снижению уровня продукции гемолизина Действие лактонов С6 и С8 на Р aeruginosa было аналогично действию на В cepacia что выражалось в ускорении скорости размножения бактерий, и, соответственно, в увеличении размера колоний и увеличении диаметра зон гемолиза вокруг них

Нами, с помощью биологических тест-систем было показано, что бактерии В cepacia продуцируют лактоны группы С4 - С8 и группы С6 - С12 (см выше) Поэтому, далее нами были проведены эксперименты по изучению сочетанного действия имеющихся в нашем распоряжении лактонов на бактерии В cepacia и Р aeruginosa Культуру В cepacia выращивали в L-бульоне с добавлением лактонов в определенных ранее оптимальных концентрациях Было показано, что сочетанное действие лактонов влияет на проявление гемолитических свойств (Табл 4) Наиболее выраженный гемолиз наблюдали при добавлении в среду одновременно трех лактонов - С4, С6, С8 Добавление к лактонам С6 или С8 лактона С4 приводило к тому, что диаметр зон гемолиза уменьшался до 0 мм, в отличии от экспериментов по изучению раздельного действия лактонов С6 и С8 Необходимо отметить, что добавление изучаемых лактонов к культуре В cepacia в различных сочетаниях не влияло на скорость роста бактерий В cepacia и количество колоний не изменялось по сравнению с контролем

Аналогичное исследование сочетанного действия лактонов на бактерии Р aeruginosa показало, что добавление к культуре одновременно двух лактонов С4+ С6 или С4+С8 не вызывало увеличения скорости размножения клеток по сравнению с контролем (Табл 4) При этом сочетанное действие лактонов С4+С6 не влияло на размер колоний и диаметр зон гемолиза в отличие от влияния одного лактона С6 Действие лактона С4 вместе с лактоном С8 выражалось в уменьшении размера колоний и зон гемолиза по сравнению с действием одного лактона С8. Добавление к лактону С6 лактона С8 или двух лактонов С4+С8 приводило к активации скорости размножения, однако процент увеличения КОЕ/мл был ниже, чем при воздействии лактона С6 Сочетанное использование лактонов С6+С8, по сравнению с применением одного лактона С6, уменьшало размер колоний Р aeruginosa и диаметр зоны гемолиза Таким образом, действие трех лактонов одновременно не отличалось от действия одного лактона С6 и выражалось в ускорении роста бактерий Р aeruginosa, увеличении размера колоний и диаметров зон гемолиза

Таким образом, в результате экспериментов были получены данные, свидетельствовавшие о том, что добавление лактонов С4, С6, С8 к растущим культурам В cepacia и Р aeruginosa отдельно или в различных сочетаниях по-разному влияет на эти родственные бактерии Лактоны могут влиять на скорость размножения клеток, размер и форму колоний, а также активировать или подавлять продукцию такого фактора патогенности этих бактерий как гемолизин

Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства В. cepacia и P. aeruginosa in vivo. Для выяснения действия С4, С6, С8 на вирулентные свойства исследуемых штаммов В cepacia и Р aeruginosa in vivo использовали экспериментальные модели внутрибрюшинного и интраназапьного заражения мышей Животных заражали клетками В cepacia и Р aeruginosa в дозе LD50> предварительно, как и в опытах in vitro, в течение 3-х часов проинкубированных с добавлением лактонов при 37°С Лактоны С4, С6, и С8 добавляли отдельно или в сочетаниях, аналогично опытам in vitro. Дозы лактонов в бактериальной суспензии для заражения были рассчитаны, исходя из опытов in vitro (10 нг/г, 10 нг/г, 50 нг/г массы животного) Контрольное введение животным одних лактонов в тех же концентрациях, что при заражении, не вызывало гибели мышей Результаты, полученные при внутрибрюшинном инфицировании, не показали усиления вирулентности штаммов под действием лактонов При использовании интраназапьного заражения мышей были получены данные, подтверждающие усиление вирулентности В cepacia и Р aeruginosa под действием лактонов С4, С6, С8 Было показано, что только сочетание трех лактонов в суспензии бактерий В cepacia вызывало возрастание гибели животных на 20% (погибало 80% мышей по сравнению с 60%-ой гибелью в контрольной группе) В случае Р aeruginosa рост показателя гибели животных наблюдали не только при внесении в культуру трех лактонов одновременно, но и при добавлении только одного лактона С6 При добавлении лактона С6 процент гибели животных увеличивался на 20%, а при добавлении трех лактонов одновременно - на 10% по сравнению с контрольной группой, где наблюдали 60%-ю гибель мышей

Влияние автоиндукторов на образование биоплёнок у бактерий В. cepacia и P. aeruginosa. Исследовали действие лактонов СО (гомосерин без углеродной боковой цепи), С4, С6, С8 и их сочетаний С4+С6, С4+С8, С6+С8, С4+С6+С8 на изменение оптической плотности бактериальной суспензии В cepacia и Р aeruginosa через 1 сутки, 2-е суток и образование биопленки на поверхности полистероловой планшеты Культуры штаммов В cepacia 370 и Р aeruginosa РА 103 в концентрации 105 кл/мл сеяли в L-бульон в пробирки по 5 мл с добавлением лактонов в концентрациях, которые были определены в опытах m vitro (СО,С4,С6-Юнг/мл, С8-50нг/мл) Пробирки помещали в термостат при 30°С на 24 часа Затем суточные бульонные культуры вносили в полистероловые плоскодонные планшеты и измеряли оптическую плотность (ОП) проб (Р<0,05) При определении ОП планктонных клеток В cepacia сразу после внесения в планшеты показано, что культура В cepacia, выращенная с добавлением трех лактонов С4+С6+С8, имела показатель ОП в 2 раза больше, чем контрольная культура без добавления лактонов (Рис 3) Таким образом, лактоны С4,С6,С8 в сочетании активировали рост культуры В. cepacia ОП планктонных клеток Р aeruginosa, выращенных в присутствии лактонов С4+С8 и С6+С8, превышала показатель контроля (культуры без лактонов) соответственно в 2,4 и в 2,35 раза (Рис 4) То есть лактоны С4,С8 и

С6,С8 в сочетании активировали рост культуры Р aeruginosa При измерении ОП культуры Р aeruginosa, которую выращивали вместе с лактономи, было показано, что показатели ОП не отличались от контроля без лактонов, кроме показателей пробы с добавлением СО (гомосерина без углеродной боковой цепи) ОП планктонных клеток Р aeruginosa, культивированных в присутствии СО в 1,6 раза была ниже контроля, что может свидетельствовать о торможении роста культуры Р aeruginosa в присутствии лактона СО В результате измерения показателей ОП спиртового раствора кристалвиолета, полученного после обработки окрашенных биопленок спиртом, было показано, что биопленка образуется в 1,39 и 1,29 раза интенсивнее при выращивании бактерий В cepacia вместе с лактонами С4+С8 и С6+С8 Показатель роста биопленки при выращивании Р aeruginosa с лактонами был ниже показателя контроля без лактонов в 1,9 раза при выращивании с С4, в 1,8 раза при культивировании с С8 или с С4+С6, в 2,2 и 2,3 раза соотвественно при добавлении лактонов С4+С8 или С6+С8 Лактон СО ингибировал образование биопленки в 7,1 раза (Рис.4) Лактоны С6 и С4+С6+С8 практически не влияли на показатели ОП спиртового раствора после обработки биопленки по сравнению с контролем Таким образом, было показано, что лактоны С4+С6+С8 в сочетании активируют рост бактерий В cepacia, а лактоны С4+С8 и С6+С8 при добавлении в среду культивирования усиливают рост биопленки В cepacia Лактоны С4+С8 и С6+С8 активируют рост культуры Р aeruginosa, а СО подавляет ее рост При анализе показателей ОП биопленки P. aeruginosa было обнаружено, что лактоны С4,С8, С4+С6, С4+С8, С6+С8 тормозят образование биопленки Наиболее выраженным было снижение показателя ОП биопленки Р aeruginosa при выращивании культуры с лактоном СО

6. Влияние бакггерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

Показано, что введение вирулентного штамма Р aeruginosa в дозе 1х107 КОЕ/мышь сопровождалось увеличением массы селезенки и снижением массы тимуса более чем в 2 раза по сравнению с органами контрольной группы животных Штамм В cepacia 8236 в дозе 4,5х108 КОЕ/мышь более чем в два раза вызывал увеличение массы селезенки и тимуса При введении более низких доз, 7,5х107 КОЕ/мышь и 7,5х106 КОЕ/мышь, масса селезенки и тимуса соответствовала таковой у контрольной группы животных Зависимые от дозы изменения массы иммунокомпетентных органов оказывал штамм В cepacia 8240. Введение бактерий в дозе 2х107 КОЕ/мышь сопровождалось гипоплазией тимуса и селезенки, тогда как заражение дозой 2х105 КОЕ/мышь приводило к увеличению массы обоих органов

Таким образом, оценка массы иммунокомпетентных органов животных, зараженных микробными клетками Р aeruginosa РА 103, В cepacia 8236 и 8240 свидетельствовала о развитии выраженной спленомегалии и одновременно гиперплазии или гипоплазии тимуса у всех исследованных штаммов

инок.1сут. йпл.кл.2 сут. ПОП краски биоппёнок

Рис. 3. Влияние лактонов на рост планктонных клеток и биопленок у B.cepacia. По оси абсцисс - серые столбики - ОП инокулируемой культуры, черные - ОП -планктонных клеток, белые — ОП окрашенного спирта после обработки биоплёнок; по оси ординат - показатели оптической плотности.

Ü инок. 1 сут. @ пл.кл.2 сут. ООП краски биоплёнок

Рис. 4. Влияние лактонов на рост планктонных клеток и биопленок у P.aeruginosa. По оси абсцисс — серые столбики - ОП инокулируемой культуры, черные - ОП планктонных клеток, белые - ОП окрашенного спирта после обработки биоплёнок; по оси ординат — показатели оптической плотности.

Для оценки иммуномодулирующей активности трех отобранных штаммов проводили определение АОК в селезенке инфицированных мышей

Введение клеток Р aeruginosa РА 103 приводило к выраженной супрессии образования АОК, синтезирующих антитела к гетерологичному антигену, по сравнению с аналогичным показателем интактной группы мышей (Р<0,05) В то же время введение живых бактерий В cepacia 8236 существенно усиливало функциональную активность В-лимфоцитов, синтезирующих антитела к гетерологичному антигену (Р<0,05) Эффект воздействия В cepacia 8240 характеризовался снижением уровня АОК к гетерологичному антигену, подобно штамму Р aeruginosa РА 103, выраженным в меньшей степени (Р< 0,05)

Развитие иммунного ответа сопровождается активацией лимфоидных клеток, которая заканчивается их пролиферацией и дифференциацией Бласттрансформация иммунокомпетентных клеток является результатом кооперативного взаимодействия Т-, В- лимфоцитов и А-клеток Интенсивность реакции характеризует иммуномодулирующее влияние инфекционных агентов на развитие клеточного иммунного ответа Поэтому нами также было проведено определение пролиферативной активности спленоцитов инфицированных мышей

Результаты исследования показали увеличение пролиферативной активности спленоцитов в присутствии Т- и В- митогенов при заражении Р aeruginosa РА 103 по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных (Р<0,05) Штамм В cepacia 8236 вызывал слабо выраженное усиление пролиферации Т-лимфоцитов Уровень включения 3Н тимидина клетками селезенки в присутствии ЛПС (В-митоген) соответствовал аналогичному показателю интактных мышей

Введение мышам штамма В cepacia 8240 не влияло на митогенную активность спленоцитов в присутствии Т- и В-митогенов (Р<0,05)

Результаты проведенных исследований выявили различный характер пролиферативной активности спленоцитов мышей, инфицированных штаммами Р aeruginosa и В cepacia

Полученные результаты позволяют полагать, что каждый из исследованных штаммов - Р aeruginosa РА 103, В cepacia 8236 и В cepacia 8240- характеризующийся отличными друг от друга факторами патогенности, обладает различной модулирующей активностью на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных Развитие экспериментальной персистентной инфекции у мышей характеризуется изменением лимфоидных органов (селезенка, тимус), проявляющееся в спленомегалии и гипоплазии тимуса

Полученные нами данные косвенно указывают на то, что различные дозы возбудителя в организме экспериментальных животных могут вызывать развитие различных форм инфекционного процесса - острую инфекцию, персистенцию или, когда доза заражения недостаточна, бактерии могут легко выводиться из организма, не вызывая воспалительных процессов. При этом,

как для каждого вида возбудителя - Р aeruginosa и В cepacia, так и для разных штаммов одного вида - В cepacia (штаммы 8236 и 8240), развитие инфекционного процесса происходит индивидуально Следовательно, было подтверждено, что факторы патогенности и механизмы патогенеза инфекций, вызываемых данными штаммами, различны

7. Разработка системы идентификации бактерий Burkholderia cepacia. Разработанная схема идентификации штаммов включает 2 последовательных этапа исследования (Рис 5) применение бактериологических методов и молекулярно-биологических методов

Бактериологические методы позволяют провести первоначальную селекцию штаммов и определить их фенотипические свойства, именно пигментообразование, оксидазную, липазную, гемолитическую активность, способность расти при различных температурах, ферментировать различные соединения (биохимические тесты), способность образовывать биопленку, антибиотикоустойчивость. Данные исследования возможно провести в течение 5-7 суток, как установлено нами Фенотипические методы позволяют только отнести исследуемые штаммы к бактериям комплекса В cepacia, но не идентифицировать бактерии до определенных геномоваров

Принадлежность всех исследованных 55 штаммов к бактериям комплекса В cepacia была подтверждена с помощью биохимических коммерческих тест-систем. Все 100% штаммов росли на BCSA-селективном агаре, обладали оксидазной и липазной активностью Гемолитической активностью обладали 28,8% штаммов Пигмент имели 11,5% исследованных штаммов бактерий и 63,5% из них обладали способностью расти при 42° С. Согласно схеме, предложенной D А Henry, Е. Mahenthiralingam и авт (2001) мы оценили биохимическую активность штаммов с целью изучения их биохимических свойств, а также принадлежность к определенному геномовару Установлено, что практически все штаммы ферментировали лизин (LYS), орнитин (ORN), эскулин (ESC), глюкозу (GLU) и не ферментировали адонитол (ADO) Лактозу (LAC) и мальтозу (MLT) ферментировали 55,8% штаммов, сахарозу (SUC) 65,4%, и /3-галактозидазу (ONP) - 30,8% Была исследована способность штаммов образовывать биопленку Показано, что более 83% штаммов способны формировать биопленку, что подтверждает потенциальную возможность развития хронической инфекции При анализе фенотипических свойств удалось определить, что все штаммы в одинаковой степени проявляют свойства, характерные для I, III и IV геномоваров — то есть В cepacia, В cenocepacia и В stab ¡Iis Геномовары I, III и IV обладают крайне похожими фенотипическими свойствами, вследствие чего трудно только с использованием фенотипических методов точно определить принадлежность к какому- либо одному геномовару.

Практически все штаммы были чувствительны к меропенему, цефтазидиму, цефтазидиму/клавуланату и пиперациллину/тазобактаму Все штаммы были устойчивы к аминогликозидам гентамицину и тобрамицину

(что является видовым признаком) Анализ антибиотикограмм не позволил выявить клональности по спектру антибиотикочувствительности у изучаемых штаммов, но обнаружил возрастание устойчивости к цефепиму, ципрофлоксацину и имипенему по годам Если в 1999 году к ципрофлоксацину были устойчивы и умеренно устойчивы 56% штаммов, то в 2001 году 93,7% В 1999 году к цефепиму были устойчивы и умеренно устойчивы 44,4% выделенных бактерий, а в 2001 году 75% К имипенему были устойчивы в 1999 году 25,9% штаммов, в 2000 году 16,7% и в 2001 году 38,5% изолятов

Зарубежные штаммы, как и отечественные, были устойчивы и умеренно устойчивы к аминогликозидам (амикацину, тобрамицину, гентамицину), аугментину, ванкомицину и чувствительны к азлоциллину, цефтазидиму и ципрофлоксацину

Молекулярно-биологические методы. Использование молекулярно-биологических методов позволяет точно идентифицировать и типировать штаммы на геномовары, выявлять их эпидемиологическую значимость, определять их потенциальную способность быть патогенными для человека Молекулярно-генетические методы могут включать ПЦР для выявления 16S и 23S рибосомальной ДНК, позволяющей отнести штаммы к I-V геномоварам, ПЦР для идентификации гесА гена, обладающего полиморфизмом, с праймерами, специфичными для бактерий комплекса В cepacia и геномовар-специфическими праймерами Для определения эпидемиологической значимости штаммов можно использовать ПЦР для выявления эпидемиологических маркеров сЫ гена, ISH, BCESM- маркеров У эпидемических штаммов, принадлежащих к геномовару IIIA, присутствуют контагиозные пили, посредством которых происходит специфическое связывание с муцинкарбогидратами и эпителиальными клетками Одним из эпидемиологических маркеров бактерий комплекса В cepacia является сЫ ген Другими эпидемиологическими маркерами у бактерий комплекса В cepacia являются гибрид двух инсерционных последовательностей IS 402 и IS 1356 (ISH), маркер эпидемических штаммов BCESM - консервативная открытая рамка считывания длиной 1 4 kb ISH, BCESM- маркеры выявляются только у эпидемических штаммов и отсутствуют у штаммов В cepacia, вызывающих спорадические случаи заболеваний (Sun L et al, 1995, Tyler S D , К R Rozee, W M Johnson, 1996, van Pelt C., CM Verduin, WHF. Goessens et al, 1999) К молекулярно-биологическим методам, которые целесообразно использовать для исследования штаммов бактерий комплекса В cepacia можно отнести RAPD-ПЦР для выявления внутривидового многообразия штаммов, а также для установления идентичности исследуемых штаммов К комплексу молекулярно-генетических методов можно отнести ПЦР для выявления cepl и cepR генов, являющихся компонентами регуляторной системы "Quorum sensing", ответственной за экспрессию факторов патогенности

Все вышеперечисленные молекулярно-биологические методы были использованы для исследования клинических штаммов нашей коллекции

Исследование штаммов в ПЦР для выявления 16S гРНК показало, что в результате реакции с ДНК большинства (89%) штаммов был получен репликон размером 463 нп Это позволило предварительно отнести штаммы к группе, включающей I-V геномовары

При исследовании наличия гесА гена, которому свойственен полиморфизм, в ПЦР с различными праймерами было установлено, что штаммы, выделенные в клиниках Москвы, принадлежали к III -му геномовару, группе IIIA Зарубежные штаммы из Франции и Германии принадлежали к группе IIIB, кроме одного немецкого штамма, который принадлежал к I -му геномовару

Генетическое типирование Российских штаммов с помощью RAPD -ПЦР привело к тому, что было обнаружено 23 профиля ПЦР - фрагментов, что свидетельствует о генетическом разнообразии бактерий комплекса В cepacia Анализ полученных данных показал, что в различных московских стационарах циркулируют как свои, характерные для каждого стационара штаммы, так и общие для Москвы Зарубежные штаммы (из института им Пастера (Франция), из Германии, полученные в 1998-1999гг, 5 референс-штаммов из Бельгии) отличались от Российских

Изучение штаммов на предмет наличия эпидемиологических маркеров показало, что у 8 (16%) московских штаммов была обнаружена открытая рамка считывания (BCESM) , у 9 (18%) сЫ — ген и ни один штамм не обладал ISH эпидемиологическим маркером Ни у одного из штаммов, выделенных от больных с раневой инфекцией, не был обнаружен ни один из эпидемиологических маркеров По сравнению с Российскими штаммами все немецкие штаммы имели ISH эпидемический маркер, один из которых обладал открытой рамкой считывания BCESM Из двух французских штаммов у одного была обнаружена последовательность, кодирующая синтез контагиозных пилей СЫ Процент штаммов, выделенных в различных стационарах, у которых было обнаружено несколько эпидемиологических маркеров, был характерен для каждой клиники Например, наибольшее количество (31,6%) штаммов из клиники НИИ Нейрохирургии, выделенных только от больных пневмонией, обладали cbl-геном Среди штаммов, выделенных от больных в ГКБ им Боткина, наибольшее число (30%) обладало BCESM - эпидемиологическим маркером

Московские штаммы были исследованы в ПЦР на наличие компонентов регуляторной системы «Quorum sensing» - генов сер I и cepR, участвующих в регуляции синтеза факторов патогенности бактерий Ген cepR выявлен у всех исследуемых штаммов, тогда как ген сер I не был определен у 29,6% исследуемых штаммов Это подтверждает патогенность Российских штаммов и имеющуюся у них потенциальную способность вызывать заболевание, персистировать в организме больного и передаваться

от человека к человеку, что указывает на эпидемиологическую значимость исследованных нами штаммов

В результате проведенных исследований был разработан комплексный микробиологический подход для идентификации и изучения клинических штаммов В cepacia Разработанная схема идентификации штаммов позволила четко дифференцировать Российские штаммы Ш-го геномовара (В cenocepacia), отнеся их к группе IIIA, определить их эпидемиологическую значимость С помощью генетического типирования штаммов удалось показать, что в стационарах города Москвы циркулируют как штаммы В cepacia, характерные для каждого стационара, так и общие для московского региона

В качестве положительного контроля для подтверждения эффективности разработанной схемы для выявления бактерий В cepacia были идентифицированы 5 референс-штаммов Идентификация соответствовала видовой принадлежности каждого из 5 референс-штаммов

Рис 5 Схема идентификации бактерий В cepacia

выводы.

1 Впервые разработана модель экспериментальной персистентной инфекции, вызванной бактериями В cepacia и Р aeruginosa, с помощью которой выявлено, что причиной перехода острой формы инфекции в персистентную является введение антибиотика в организм животного в субингибирующей концентрации (СИК), подавляющей экспрессию факторов патогенности

2 Показано, что стимулятор роста бактерий лактон у-гидроксибутановой кислоты для В cepacia и иммунодепрессант циклофосфан для Р aeruginosa способствовали индукции перехода персистентной инфекции в острую форму

3 Доказано влияние СИК ципрофлоксацина на экспрессию факторов патогенности В cepacia и Р aeruginosa Выявлена дифференциальная экспрессия генов cepl В cepacia и pIcR Р aeruginosa при острой инфекции и персистенции Экспрессия гена cepl В cepacia и гена plcR Р aeruginosa была обнаружена при острой форме инфекции и подавлялась при создании персистентной формы инфекции

4 Установлено, что бактерии В cepacia могут воспринимать одновременно несколько экзогенных лактонов с различной длиной углеродной цепи В отсутствии гена cepl — компонента регуляторной системы "Quorum sensing"- бактерии В cepacia способны использовать сходные ацилгомосерин лактоны, имеющиеся у бактерий Р aeruginosa с полноценной регуляторной системой

5. Взаимное усиление гемолитической активности В cepacia и Р aeruginosa in vitro и вирулентности in vivo свидетельствует о возможности взаимного использования компонентов регуляторной системы "Quorum sensing" близкородственными бактериями В этом случае бактерии выбирают стратегию развития острой инфекции, что может быть одной из причин ухудшения клинического состояния больных муковисцидозом, страдающих смешанной инфекцией

6. Впервые продемонстрировано, что более 83% клинических штаммов В cepacia способны формировать биопленку, колонизировать поверхности органов и тканей, вызывать хроническую госпитальную инфекцию, а также формировать постоянные резервуары инфекции в госпитальной среде Определены маркеры эпидемиологической значимости штаммов В cepacia с потенциально выраженной способностью к формированию биопленки выявление гена сЫ, принадлежность к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР

7 Показано, что ацилгомосерин лактоны по-разному действуют на рост и образование биопленки у бактерий В cepacia и Р aeruginosa, что подтверждает роль регуляторной системы "Quorum sensing" в формировании биопленок Выявлено, что лактоны С4,С6,С8 в сочетании активируют рост, и гемолитические свойства В cepacia и Р. aeruginosa, тогда как синтетический

гомосерин лактон без углеродной цепи (СО) существенно ингибирует рост бактерий Р aeruginosa и формирование биопленки Это указывает на возможность и целесообразность разработки синтетических бактериостатических препаратов, ингибирующих рост и продукцию факторов патогенности бактерий на молекулярном уровне

8 Разработан алгоритм индикации бактерий В cepacia, включающий комплекс бактериологических и молекулярно-биологических методов Впервые в схему исследований включены фенотипический тест — выявление образования биопленок и молекулярно-биологические методы — ПЦР для выявления эпидемиологических маркеров (сЫ -гена, ISH, BCESM маркеров), RAPD-ПЦР для генотипирования штаммов, ПЦР для определения cepl и cepR генов системы "Quorum sensmg" Разработанная схема позволяет а) идентифицировать возбудитель до геномовара, б) определить способность возбудителя вызывать острую или хроническую форму инфекции; в) выявить эпидемиологические связи циркулирующих в стационарах и среди больных штаммов В cepacia

9 Установлено, что клинические штаммы комплекса В cepacia, циркулирующие в различных стационарах г Москвы, относятся к геномовару IIIA (Burkholderia cenocepacia) У российских штаммов выявлены эпидемиологические маркеры (сЫ -ген, BCESM маркер) Установлено, что в каждом из стационаров циркулируют как типичные только для него штаммы, так и региональные или «московские» штаммы

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1 Шагинян И А, Першина (Чернуха) М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций//Журн Микробиол - 1997.-№4-С 54-60

2 Шагинян И А, Першина (Чернуха) М.Ю Универсальные и специфические требования, предъявляемые к молекулярно-генетическим методам для генетического типирования возбудителей инфекций//Клин лаб диагностика- 1997-№6 - С 68

3 Першина (Чернуха) М.Ю., Шашкина Е Ф, Ананьина Ю В, Голышевская В И, Гинцбург А Л, Шагинян И А Разработка различных вариантов ПЦР-генетического типирования возбудителей бактериальных инфекций // Тр 7 съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов- Москва- 1997-С 388-389.

4 Першина (Чернуха) М.Ю., Шагинян И А, Ананьина Ю В, Прозоровский С В Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами // Молекул генетика-1998 -№1 -С 29-32

5 Чернуха М.Ю., Шагинян И А , Заикин В Л, Малышев Н А ПЦР-генетическое типирование штаммов Salmonella enteritidis, выделенных от больных с сальмонеллезной инфекцией// Материалы Всеросс конференции «Генодиагностика в современной медицине» - Москва -2000-С 316-317

6 Чернуха М.Ю., Ковтун В П, Николаева Т Н, Шагинян И А Изучение молекулярно-генетических механизмов патогенности батерий родов Pseudomonas и Burkholderia I Биохимические, вирулентные свойства штаммов Р aeruginosa и В cepacia различного происхождения// Клин лаб диагностика - 2001 - № 11 - С 40

7 Чернуха М.Ю., Ковтун В.П, Николаева Т Н, Шагинян И А Изучение молекулярно-гшенетических механизмов патогенности батерий родов Pseudomonas и Burkholderia II Разработка экспериментальной модели персистирующей инфекции для Р aeruginosa и В cepacia// Клин лаб диагностика - 2001 - № 11 - С 41

8 Чернуха М.Ю., Шагинян И А Изучение молекулярно-генетических механизмов патогенности батерий родов Pseudomonas и Burkholderia III Влияние субингибирующих концентраций антибиотиков на генетический аппарат Р aeruginosa и В cepacia // Клин лаб диагностика -2001.-№ 11 - С. 42

9 Чернуха М.Ю, Ковтун В П, Шагинян И А Изучение молекулярно-биологических механизмов патогенности Pseudomonas aeruginosa и В cepacia I Разработка экспериментальной модели персистирующей инфекции // Материалы VIII Всероссийского научно-практического

общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М - 2002 -т1 - С 276

10 Чернуха М.Ю , Ковтун ВП, Шагинян И А Изучение молекулярно-биологических механизмов патогенности Pseudomonas aeruginmsa и В cepacia II Условия перехода инфекции из персистирующей инфекции в острую и обратно под действием различных индукторов // Материалы VIII Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М - 2002 - т 1 - С 275

11 Чернуха М.Ю , Шагинян И А Изучение молекулярно-биологических механизмов патогенности Pseudomonas aeruginuisa и В cepacia III Клонирование, секвенирование и идентификация генов дифференциально экспресирующихся под действием различных индукторов // Материалы VIII Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М - 2002 -т 1 - С 277-278

12 Шагинян И А, Чернуха М.Ю Бактерии комплекса Burkholderia cepacia особенности диагностики, генома и метаболических свойств // Мол генетика, микробиол , вирусол - М - 2003 - №2 -С. 3-10

13 Шагинян И А , Хмель И А , Романова Ю М , Веселова М А , Чернуха М.Ю., Чернин JIС , Сидоренко С В , Липасова В А , Ковтун В П , Алексеева Г В , Алексеева Н В , Степанова Т В , Гинцбург А Л Клинические штаммы комплекса Burkholdena cepacia характеристика и выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing // Мол генетика, микробиол , вирусол - М - 2003 - №4 - С 15-20

14 Чернуха М.Ю, Шагинян И А , Романова Ю М, Хмель И А , Веселова М А, Алексеева Г В, Гинцбург А Л Факторы патогенности и компоненты регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов комплекса Burkholderia cepacia // Материалы Международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней -прогресс и проблемы» - г Санкт-Петербург -2003 -С 181

15 Чернуха М.Ю , Ковтун В П , Шагинян И А , Гинцбург А Л Изучение факторов патогенности и молекулярно-биологи ческих механизмов изменчивости Pseudomonas aeruginosa и Burkholdena cepacia с использованием управляемой модели инфекции Санкт-Петербург, VI российский съезд врачей- инфекционистов, 29-31 октября 2003 г Материалы съезда, С.-Петербург, 2003, с 430

16 Чернуха М.Ю , Ковтун В П , Николаева Т Н., Шагинян И А , Гинцбург А Л Разработка модели персистирующей инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa и бактериями комплекса Burkholdena cepacia // Журн микробиол - 2004-№ 2 - С 14-20.

17 Алексеева ГВ, Чернуха МЮ, Шагинян И.А, Гинцбург АЛ. Значение молекулярно-генетических методов в индикации возбудителей внутрибольничных инфекций (ВБИ), вызванных бактериями комплекса Burkholdena cepacia XXXVII научная

конференция «Оптимизация больничной среды средствами новых технологий» // ч II «Вопросы профилактики внутрибольничной инфекции» - С-Петербург - 2004 - С 67-70

18 Чернуха М.Ю, Алексеева ГВ, Шагинян И А, Гинцбург AJI Молекулярно-генетические методы как основа полифазного таксономического подхода в индикации и выявлении источника внутрибольничной инфекции, вызванной бактериями комплекса Burkholderia cepacia // Сб Трудов 5-й Всероссийской научно-практ конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» -М -2004-т2-С 136-139

19 Чернуха М.Ю, Алексеева ГВ, Сидоренко СВ, Шагинян И А, ГинцбургА JI Исследование динамики антибиотикорезистентности госпитальных штаммов Burkholderia cepacia, выделенных от больных из московских клиник «Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций» // Тезисы докл Российской научно-практической конференции с международным участием - М - 2004 -С 93

20 Чернуха М.Ю , Алексеева Г В , Сидоренко С В , Шагинян И А , ГинцбургА J1 Использование фенотипических и генотипических методов для исследования госпитальных штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» // Материалы Российской научно-практической конференции - С-Петербург,- 2004 - С 274-275

21 Чернуха М.Ю, Зигангирова НА, Шагинян И А., Гинцбург AJI Изучение действия субингибирующих концентраций антибиотиков на экспрессию генов, регулирующих продукцию фкаторов патогенности у бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa // Мол генетика - 2005 -№ 2 - С 13-16

22 Чернуха М.Ю , Николаева Т Н , Шагинян И А , Гинцбург A JI Влияние бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных // Журн микробиол - 2005 - № 3 - С 53-57

23 Chernukha M.U., Alekseeva G V, Shaginyan IA , Ginzburg A L The virulent properties of nosocomial strains of Burkholderia cepacia complex, isolated from parients of Moscow hospitals // CMI Clinical Microbiology and Infection, 15 Europian Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases - V 11 - Suppl. 2 - April - 2005 - P 607-608

24 Шагинян И A, Чернуха М.Ю. Неферментирующие грам-отрицательные микроорганизмы в этиологии внутрибольничных инфекций клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности // Клин микробиол антимикробн химиотерапия - 2005 - Т 7 - №3 -С 271-285

25 Чернуха М.Ю., Алексеева Г В , Романова Ю М, Степанова Т В , Батов А Б , Шагинян И А , Гинцбург A JI Исследование вирулентных свойств

госпитальных штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia, выделенных в стационарах города Москва // Журн микробиол - 2005 -№6 -С 46-51

26 Чернуха М.Ю Смешанные инфекции, вызываемые неферментирующими грамотрицательными бактериями видов Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia // International Scientific Conference Proceedings - Yerevan - 2005 -P 388-390

27 Чернуха М.Ю , Данилина Г А, Алексеева Г В , Батов А Б , Шагинян И А, Гинцбург A JI Антибиотикорезистентность и формирование биопленок у клинических штаммов бактерий комплекса В cepacia Тезисы докладов VIII Международного конгресса MAJIMAX/ASM антимикробной терапии Москва 2006 // Клин микробиология и антимикробн химиотерапия - 2006 - Т 8 - №2 - С 41-42

28 Чернуха М.Ю., Романова Ю М , Малеев Г В , Шагинян И А , Гинцбург A JI Роль регуляторной системы "Quorum sensing" в симбиотическом взаимодействии бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa при смешанной инфекции // Журн микробиол - 2006 - № 4 - С 32-37

29 Шагинян И А , Чернуха М.Ю., Данилина Г А, Алексеева Г В Эпидемиологическая значимость формирования биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia // «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней» Сборник научных трудов (выпуск 8) - М - 2006 - С 193-199

30 Avdeeva S V , Chernukha M.U., Shagmyan I A , Tarantul V Z , Naroditsky В S Human angiogenin lacks specific antimicrobial activity //Current microbiology, Springer Science+Business Media Inc 10 1007/s00284-006-0033-6 Published online - 2006 - 13 November

31 Алексеева Г В, Чернуха М.Ю., Шагинян И А Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР // «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в бактериологии» Учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов - Москва - 2006 - глава 2 7 - С 117-126

32 Чернуха М.Ю., Алексеева Г В, Шагинян И А Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia // Методические рекомендации - Москва - 2005

33 Ananyina Y V, Samsonova А Р, Petrov Е М , Chernukha M.Yu., Shaginyan I A , Zemskaya IA, Alyapkina Yu S Ecological and Genetic Diversity within the Leptospiraceae Family Implications for Epidemiology Molecular Biology of Spirochetes // Eds F С Cabello, D Huhnska, H P Godfrey - IOS Press - 2006 -P 200-207

34 Шагинян И A , Данилина Г A , Чернуха М.Ю., Алексеева Г В , Батов А Б Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик // Журн микробиол - 2007 - № 1 - С 3-9

35 Батов А Б , Данилина Г А, Чернуха М.Ю., Семыкин С Ю , Передерко J1 В , Капранов Н И, Шабалова Л А , Шагинян И А Микрофлора дыхательных путей у детей, больных муковисцидозом, находящихся на амбулаторном и стационарном лечении // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва - 2007 - т 2 - С 94

36 Данилина Г А , Чернуха М.Ю , Батов А Б , Конищева Н А , Шагинян И А Эпидемиологическая значимость формирования биопленок госпитальными штаммами комплекса Burkholdena cepacia, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва - 2007 - т 2 - С 103-104

37 Чернуха М.Ю., Батов А Б, Шагинян И А Регуляторная система "Quorum sensing" и её роль в симбиотическом взаимодействии бактерий видов Burkholderia sepacia и Pseudomonas aeruginosa при экспериментальной смешанной инфекции // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - Москва - 2007 - т 2 - С 282-283

38 Батов А Б , Данилина Г А , Чернуха М.Ю., Семыкин С Ю , Передерко Л В, Капранов Н И, Шабалова Л А, Шагинян И А Антибиотикорезистентность клинических изолятов P.aeruginosa и S aureus, выделенных от детей с муковисцидозом Тезисы IX Международного конгресса MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии // Клин микробиология и антимикробн химиотерапия - 2007 -Т9-№2-С 12-13

39.Чернуха М.Ю., Шагинян И А , Батов А Б , Данилина Г А , Гинцбург А Л Смешанные инфекции у больных муковисцидозом, вызываемые бактериями Pseudomonas aeruginosa и Burkholderia cepacia, и причины тяжелого состояния больных, инфицированных этими возбудителями // Материалы Российской научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» - Москва -2007-С 109-110

40 Габриелян Н И, Арефьева Л И, Горская Е М, Ковтун Н А, Преображенская Т Б , Спирина Т.С , Дроздова Н Е , Чернуха М.Ю., Шагинян И А Угроза синегнойной инфекции для хирургического стационара // Стерилизация и госпитальные инфекции - 2007 - 3 (5) - С 24-29

Использованные сокращения

АОК - антителобразующие клетки ВБИ - внутрибольничные инфекции СИК - субингибирующие концентрации ЭБ - эритроциты барана

BCSEM - маркер эпидемических штаммов В cepacia cepl - ген, кодирующий синтазу автоиндуктора В cepacia CepI -синтаза автоиндуктора В cepacia

cepR - ген, кодирующий транскрипционный регулятор В cepacia CepR - транскрипционный регулятор В cepacia

ISH - эпидемиологический маркер В cepacia (гибрид двух

инсерционных последовательностей) LasI - синтаза автоиндуктора Р aeruginosa LasR - транскрипционный регулятор Р aeruginosa Luxl - синтаза автоиндуктора Vibrio fisheri LuxR - транскрипционный peryiwTopVibrio fisheri

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Чернуха, Марина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Сравнительный микробиологический анализ неферментирующих грамотрицательных бактерий В.cepacia и P.aeruginosa - возбудителей оппортунистических инфекций.

1.1. Клиническое значение бактерий В.cepacia и патогенез, вызванной ими инфекции.

1.2. Клиническая значимость P.aeruginosa.

1.3. Таксономия бактерий В.cepacia.

1.4. Особенности генома В.cepacia.

1.5. Необычные метаболические свойства В.cepacia.

1.6. Таксономия бактерий рода Pseudomonas.

1.7. Геном P.aeruginosa.

ГЛАВА II. Идентификация бактерий В.cepacia. Сравнительный анализ с идентификацией P.aeruginosa.

2.1. Идентификация и дифференциация бактерий B.cepacia.

2.2. Идентификация бактерий P.aeruginosa.

2.3. Устойчивость к антимикробным препаратам B.cepacia.

ГЛАВА III. Факторы патогенности бактерий комплекса B.cepacia и P.aeruginosa.

3.1. Факторы патогенности бактерий B.cepacia.

3.2. Факторы патогенности P.aeruginosa.

3.3. Биоплёнки, как способ выживания клинически значимых микроорганизмов. Формирование биоплёнки у бактерий комплекса B.cepacia и

P.aeruginosa.

3.4. Пути развития острой или персистентной формы инфекции, вызванной бактериями P.aeruginosa.

3.5. «Quorum sensing» - система регуляции внеклеточных факторов патогенности у бактерий комплекса В.cepacia и P.aeruginosa.

3.6. Изучение патогенеза инфекций, вызванных бактериям комплекса В.cepacia при моделировании на животных.

3.7. Изучение патогенеза инфекций, вызванных бактериями P.aeruginosa при моделировании на животных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1У.Материалы и методы.

4.1. Штаммы.

4.2. Модель персистентной инфекции.

4.3. Анализ кДНК в клетках В.cepacia и P.aeruginosa по матрице иРНК.

4.4. Методы изучения свойств госпитальных штаммов Burkholderia cepacia

4.5. Изучение действия лактонов на бактерии B.cepacia и P.aeruginosa.

4.6. Изучение клеточных иммунных реакций.

4.7. Разработка комплексного микробиологического подхода для идентификации бактерий Burkholderia cepacia.

ГЛАВА V. Создание управляемой модели персистентной инфекции и выяснение причин реализации патогенности бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa.

5.1. Характеристика штаммов, использованных в опыте.

5.2. Создание экспериментальной модели персистентной инфекции.

5.3. Условия перехода персистентной формы инфекции в острую под действием различных индукторов.

5.4. Условия перехода инфекции, вызванной В.cepacia, из острой в персистентную форму.

ГЛАВА VI. Изучение действия субингибирующих концентраций антибиотиков на экспрессию генов, регулирующих продукцию факторов патогенности у бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa.

6.1. Изучение влияния ципрофлоксацина на экспрессию генов факторов патогенности.

ГЛАВА VII. Выявление и характеристика компонентов регуляторной системы

Quorum sensing у клинических штаммов бактерий Burkholderia cepacia.

7.1.Выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов В.cepacia.

7.2.Изучение продукции потенциальных факторов патогенности клиническими штаммами В.cepacia.

ГЛАВА VIII. Формирование биоплёнок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик.

8.1. Определение способности клинических штаммов бактерий комплекса В.cepacia формировать биоплёнку.

8.2. Продукция потенциальных факторов патогенности бактериями комплекса В.cepacia и их способность к формированию биоплёнок.

8.3. Генотипирование штаммов бактерий комплекса В.cepacia с различной способностью к формированию биоплёнок.

8.4. Корреляция между наличием у штаммов «эпидемических» маркеров и способностью штаммов к формированию биоплёнок.

8.5. Изучение антибиотикочувствительности штаммов с разной способностью к формированию биоплёнки.

ГЛАВА IX. Роль регуляторной системы «QUORUM SENSING» в симбиотическом взаимодействии бактерий BURKHOLDERIA CEPACIA и PSEUDOMONAS AERUGINOSA при смешанной инфекции.

9.1.Взаимоотношения бактерий P.aeruginosa и B.cepacia.

9.2.Взаимоотношение B.cepacia 370 и P.aeruginosa РА103 in vivo.

9.3.Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B.cepacia и P.aeruginosa in vitro.

9.4.Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B.cepacia и P.aeruginosa in vivo.

9.5.Влияние автоиндукторов на образование биоплёнок у бактерий B.cepacia

P.aeruginosa.

ГЛАВА X. Влияние бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

10.1 .Влияние штаммов B.cepacia и P.aeruginosa на функциональную активность иммунокомпетентных Т- и В- лимфоцитов.

Глава XI. Разработка системы идентификации бактерий Burkholderia cepacia.

11.1.Фенотипические методы для исследования свойств госпитальных штаммов бактерий В .cepacia.

11.2.Молекулярно-биологические методы для исследования госпитальных штаммов бактерий комплекса B.cepacia.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции"

Актуальность работы. В течение последнего десятилетия были получены данные, свидетельствующие о том, что бактерии В.cepacia, ранее относимые к роду Pseudomonas, являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать госпитальные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии). Особую опасность бактерии В.cepacia представляют для лиц с иммунодефицитами различного генеза -больных кистозным фиброзом (или муковисцидозом) и хроническим грануломатозом, у которых данные микроорганизмы способны вызвать эндокардиты, некротизирующую пневмонию с септицемией, зачастую заканчивающуюся летальным исходом (так называемый «цепация - синдром») (Gilligan Р.Н.,1995, Lutter Е., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001). Вопрос, почему бактерии В. cepacia в одних случаях выделяются из мокроты больных муковисцидозом и не вызывают инфекционных осложнений, а в других вызывают тяжёлые поражения лёгких, приводящие к смерти, до настоящего времени остаётся открытым. В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции лёгких. Учитывая ограниченные данные, касающиеся микробиологических свойств этого микроорганизма и патогенеза вызываемой им инфекции, можно отнести его к малоизученным возбудителям оппортунистических инфекций.

Одним из наиболее клинически значимых представителей рода Pseudomonas является вид P. aeruginosa. Бактерии P. aeruginosa нередко вызывают тяжёлые поражения лёгких у больных муковисцидозом при смешанной инфекции в ассоциации с бактериями В. cepacia. Учитывая вышесказанное, целесообразным является сравнительное изучение вирулентных свойств видов В. cepacia и P. aeruginosa для определения вирулентности бактерий В. cepacia и путей развития инфекционного процесса при инфицировании В. cepacia.

В 1992 г. вид Р. cepacia на основании секвенирования гена 16S rRNA был отнесен к новому роду Burkholderia, включающему в настоящее время 22 вида, среди которых есть возбудители особо опасных инфекций человека и животных - сапа и мелиоидоза- В. mallei и В. pseudomallei. Вид В. cepacia является наименее изученным представителем этого рода. Бактерии этого вида обитают в почве и воде, а также способны вызывать заболевания у человека, животных и растений, которые можно отнести к сапронозам (Anzai, Kim Y.H., Park J.Y. et al. 2000, Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001, Luczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B., 2002, Gilligan P.H.,1995). Возможность существования этих бактерий в различных средах обитания может быть обусловлена необычно большим геномом (в 2 раза больше, чем у Е. coli и в 1,5 раза больше генома Р. aeruginosa), а также наличием в его составе многочисленных инсерционных последовательностей и 3-х кольцевых репликонов (Mahenthiralingam Е., Urban Т.А., Goldberg J.B., 2005). Данные, касающиеся факторов патогенности В. cepacia и механизмов их регуляции, практически отсутствуют, так же как и недостаточно изучены причины возникновения инфекции у больных с иммунодефицитами различного генеза, механизмы и факторы её передачи и молекулярно-генетические механизмы изменчивости, обеспечивающие высокие адаптационные возможности этого микроорганизма для существования и размножения в различных условиях обитания. До середины 1990-х годов оставалось неясным, являются ли бактерии В. cepacia самостоятельными этиологическими агентами оппортунистических инфекций или они являются микроорганизмами, выявляемыми при тяжелых легочных инфекциях, вызываемых P. aeruginosa и S. aureus. В настоящее время достоверно доказана способность к колонизации В.cepacia в бронхоальвеолярных путях. У клинических штаммов В.cepacia доказано наличие таких факторов патогенности, как пили, адгезины и гемолизин, кроме этого, как и все грамотрицательные бактерии, бактерии В. cepacia имеют липополисахарид- эндотоксин. Можно предположить, что эти факторы детерминируются генами, имеющими сложную структуру и регуляцию и, возможно, обладающими свойствами мобильных генетических элементов -транспозонов, ряд из которых, вероятно, расположен на нескольких кольцевых ДНК. Подтверждением этому является чрезвычайная пластичность комплекса В. cepacia (Mahenthiralingam Е. et al, 2005).

Исследования экспрессии генов факторов патогенности бактерий В. cepacia являются чрезвычайно важными для понимания адаптивной изменчивости этих микроорганизмов, проблем эволюции бактерий В. cepacia, эпидемиологии инфекций, вызываемых этими возбудителями.

Актуальным является вопрос о родстве штаммов В. cepacia, выделяемых из окружающей среды (прежде всего, почвы) и от больных. Это необходимо для понимания эволюции этих микроорганизмов и их устойчивости ко многим антимикробным препаратам, связанной, возможно, с горизонтальной передачей генов. Помимо изучения родства между штаммами В. cepacia необходимо для предупреждения тяжёлых осложнений и назначения эффективного лечения, а также для уточнения таксономии, проводить идентификацию этих бактерий. Несмотря на интенсивные исследования В. cepacia, проведенные в 1990-е годы, многие вопросы, касающиеся идентификации и типирования В. cepacia остаются недостаточно изученными. Прежде всего, это связано с несовершенством микробиологических методов, используемых для выделения и идентификации В. cepacia. В настоящее время 9 фенотипически сходных, но генетически различных видов (геномоваров) в литературе принято называть «комплексом бактерий В. cepacia». Учитывая наличие 9 геномоваров, для окончательного типирования В. cepacia необходимо использовать молекулярно-биологические методы. Бактерии В. cepacia принадлежат к патогенам, идентификация которых требует одновременного использования современных бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов. Подобным комплексом микробиологических методов исследования обладает не каждая бактериологическая клиническая лаборатория, что затрудняет быструю и эффективную диагностику. Можно полагать, что разработка оптимальной схемы идентификации и типирования позволит значительно эффективнее выявлять В. cepacia, а следовательно, решать разнообразные проблемы микробиологии и эпидемиологии ВБИ, вызываемых бактериями В.cepacia.

Цель работы: Выявление свойств В. cepacia, ассоциированных с патогенностью, и путей их различной реализации при острой и персистентной формах экспериментальной инфекции.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, и изучить условия и факторы, необходимые для перехода персистентной инфекции в острую форму и обратно.

2. Исследовать молекулярно-генетические механизмы перехода острой формы инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, в персистентную инфекцию под действием субингибирующих концентраций некоторых антибиотиков и идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся при острой и персистентной формах инфекции.

3. Выявить продукцию факторов патогенности, в том числе и способность к формированию биоплёнки, у клинических штаммов В. cepacia и определить влияние бактерий В. cepacia на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

4. Изучить роль регуляторной системы «Quorum sensing» в генетическом контроле экспрессии факторов патогенности В. cepacia.

5. Оценить характер взаимодействия бактерий В. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo на разработанной экспериментальной модели инфекции.

6. Испытать действие химически синтезированных ацилгомосерин лактонов, отличающихся длиной углеродной цепи, на свойства бактерий В. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo.

7. Разработать комплексную микробиологическую систему индикации бактерий В. cepacia у больных и определить эпидемиологическую значимость штаммов, выделенных от больных пневмониями в клиниках г. Москвы.

Научная новизна работы.

Впервые изучены свойства бактерий В. cepacia, ассоциированные с патогенностью, и пути их различной реализации при разных формах экспериментальной инфекции.

Показано, что антибиотик ципрофлоксацин, являющийся ингибитором ДНК-гиразы и подавляющий синтез белков, в субингибирующей концентрации снижает экспрессию гена cepl, регулирующего продукцию синтазы автоиндуктора, у бактерий В. cepacia и гена plcR, отвечающего за продукцию гемолизина P. aeruginosa. Экспрессия гена cepl В. cepacia, который участвует в регуляции экспрессии факторов патогенности, и гена plcR P. aeruginosa обнаружена при острой форме инфекции и подавляется при персистентной форме, созданной с использованием субингибирующей концентрации (СИК) ципрофлоксацина.

Создана управляемая экспериментальная модель персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia, на основе полученных данных об ингибировании экспрессии факторов патогенности СИК ряда антибиотиков, позволившая изучить действие различных индукторов и супрессоров на инфекционный процесс. При оценке модели впервые учитывались четыре критерия персистенции: отсутствие гибели экспериментальных животных, высев из органов возбудителя, замедленный рост бактерий на питательных средах с изменением морфологии колоний, а также подавление экспрессии факторов патогенности. Установлено, что сигнальные молекулы лактона у-гидроксибутановой кислоты способствовали индукции перехода персистентной инфекции, вызываемой В. cepacia, в острую форму. Показано, что иммунодепрессант циклофосфан содействовал переходу персистентной инфекции, вызываемой P. aeruginosa, в острую форму. Критерием перехода персистентной формы в острую была гибель мышей, из селезёнки которых выделяли бактерии В. cepacia и P. aeruginosa.

Установлено, что патогенез инфекционного процесса, обусловленного В. cepacia отличается от такового, вызванного бактериями P. aeruginosa, что выражается в различных влияниях В. cepacia и P. aeruginosa на массу иммунокомпетентных органов - селезёнки и тимуса, на образование АОК мышей к гетерологичному антигену (ЭБ) и на пролиферативную активность спленоцитов мышей, вследствие реализации действия различных факторов патогенности бактериями В. cepacia и P. aeruginosa.

Продемонстрировано, что бактерии В. cepacia обладают регуляторной системой CepI/CepR "Quorum sensing". Регуляция экспрессии генов факторов патогенности у бактерий В. cepacia и P. aeruginosa осуществляется с помощью сходных регуляторных систем "Quorum sensing" CepI/CepR (В. cepacia) и LasI/LasR, Rhll/RhlR (P. aeruginosa), относящихся к LuxIR -типу, отличающихся незначительными различиями у автоиндукторов - ацилгомосерин лактонов, а именно длиной углеродной цепи.

Впервые выдвинута гипотеза о том, что у штаммов В. cepacia, имеющих cepl и cepR гены, активация продукции факторов патогенности происходит под действием собственных лактонов, что может быть при моноинфекции, тогда как штаммам В. cepacia, содержащим только cepR ген, для активации продукции факторов патогенности необходимы экзогенные ацилгомосерин лактоны бактерий, имеющих полноценную регуляторную систему "Quorum sensing". Подобное явление может происходить при смешанной инфекции, что подтверждено на модели экспериментальной смешанной инфекции in vitro и in vivo обнаружением синэргического усиления патогенности ассоциации В. cepacia и P. aeruginosa.

Установлена возможность взаимодействия регуляторных систем этих бактерий, включая систему "Quorum sensing", приводящего к взаимовыгодному использованию компонентов регуляторных систем.

Впервые показано, что причиной роста вирулентности бактерий В. cepacia и P. aeruginosa при экспериментальной смешанной инфекции и в опытах с синтетическими ацилгомосерин лактонами in vitro и in vivo может быть совместное действие автоиндукторов системы "Quorum sensing" этих близкородственных микроорганизмов.

Впервые продемонстрировано различное действие отдельных лактонов и их сочетаний на В. cepacia и P. aeruginosa на основании изучения действия искусственно синтезированных ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной боковой цепи на свойства бактерий.

Установлено, что бактерии В. cepacia и P. aeruginosa могут использовать в своей жизнедеятельности сразу несколько экзогенных лактонов, продуцируемых другими близкородственными бактериями, приспосабливаясь, таким образом, к условиям своего обитания in vitro и in vivo.

Впервые показано, что на способность В. cepacia образовывать биоплёнки влияет одновременное добавление в среду выращивания двух ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной цепи, что подтвердило роль системы "Quorum sensing" в этом процессе.

Впервые продемонстрировано, что у штаммов, обладающих выраженной способностью к образованию биоплёнки, наиболее часто выявляются факторы патогенности (гемолитическая и хитинолитическая активность), а также гены cepl и cepR, являющиеся компонентами регуляторной системы "Quorum sensing", что может служить доказательством взаимосвязи между наличием генов системы "Quorum sensing", продукцией факторов патогенности и формированием биоплёнок.

Впервые определены критерии потенциальной способности к формированию биоплёнки у исследуемых штаммов: выявление в ПЦР гена cbl, ответственного за продукцию пилей, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности тканей, органов и поверхностей медицинского оборудования при образовании биоплёнок, и принадлежность штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР.

Практическая значимость.

Собрана коллекция из 74 штаммов В. cepacia, включающая 55 клинических штаммов, выделенных от больных пневмониями в больницах г. Москвы, которые используются в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов и в лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН в микробиологических и молекулярно-генетических исследованиях.

Разработан алгоритм индикации бактерий В. cepacia, включающий бактериологический анализ и ПЦР для идентификации геномоваров В. cepacia, генотипирование штаммов с помощью RAPD-ПЦР и выявление эпидемиологических маркеров BCESM (маркера эпидемических штаммов), ISH (гибрида двух инсерционных последовательностей), обнаруженного у эпидемических штаммов, и гена cbl. При использовании этого алгоритма установлено, что клинические штаммы, циркулирующие в различных стационарах города Москвы, относятся к геномовару IIIA, обозначенному как Burkholderia cenocepacia. Доказана эпидемиологическая значимость российских штаммов, у которых были выявлены эпидемиологические маркеры. Показано, что в стационарах г. Москвы циркулируют штаммы типичные для московского региона, и штаммы со специфическими генотипическими характеристиками для каждого стационара. Разработанный алгоритм индикации В. cepacia оформлен в виде методических рекомендаций «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia» (Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005г.) для клинических бактериологических лабораторий, которые утверждены советом по внедрению ГУ НИИЭМ им

Н.Ф.Гамалеи РАМН. Алгоритм индикации В. cepacia описан в главе «Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР» (Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А.) в учебно-методическом пособии «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» (Ред. Гинцбург A.JI., Романова Ю.М., М., 2006). Алгоритм индикации бактерий B.cepacia используется в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН при обследовании больных муковисцидозом для идентификации бактерий В. cepacia и может быть использован в любой бактериологической лаборатории при наличии приборов и реактивов для проведения ПЦР.

Полученные результаты позволяют представить механизм смешанной инфекции у больных муковисцидозом, вызванной бактериями В. cepacia и Р. aeruginosa, обладающих сходными регуляторными системами "Quorum sensing", и определить, что причиной тяжёлого клинического состояния пациентов является рост вирулентности этих близкородственных бактерий за счёт совместного действия ацилгомосерин лактонов- компонентов системы "Quorum sensing".

Научные программы. Работа была выполнена в рамках грантов РФФИ и МО РФ (1997-2005гг).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чернуха, Марина Юрьевна

выводы.

1. Впервые разработана модель экспериментальной персистентной инфекции, вызванной бактериями В. cepacia и P. aeruginosa, с помощью которой выявлено, что причиной перехода острой формы инфекции в персистентную является введение антибиотика в организм животного в субингибирующей концентрации (СИК), подавляющей экспрессию факторов патогенности.

2. Показано, что стимулятор роста бактерий лактон у-гидроксибутановой кислоты для В. cepacia и иммунодепрессант циклофосфан для P. aeruginosa способствовали индукции перехода персистентной инфекции в острую форму.

3. Доказано влияние СИК ципрофлоксацина на экспрессию факторов патогенности В. cepacia и P. aeruginosa. Выявлена дифференциальная экспрессия генов cepl В. cepacia и plcR P. aeruginosa при острой инфекции и персистенции. Экспрессия гена cepl В. cepacia и гена plcR P. aeruginosa была обнаружена при острой форме инфекции и подавлялась при создании персистентной формы инфекции.

4. Установлено, что бактерии В. cepacia могут воспринимать одновременно несколько экзогенных лактонов с различной длиной углеродной цепи. В отсутствии гена cepl - компонента регуляторной системы "Quorum sensing"- бактерии B.cepacia способны использовать сходные ацилгомосерин лактоны, имеющиеся у бактерий P. aeruginosa с полноценной регуляторной системой.

5. Взаимное усиление гемолитической активности В. cepacia и Р. aeruginosa in vitro и вирулентности in vivo свидетельствует о возможности взаимного использования компонентов регуляторной системы "Quorum sensing" близкородственными бактериями. В этом случае бактерии выбирают стратегию развития острой инфекции, что может быть одной из причин ухудшения клинического состояния больных муковисцидозом, страдающих смешанной инфекцией.

6. Впервые продемонстрировано, что более 83% клинических штаммов В. cepacia способны формировать биоплёнку, колонизировать поверхности органов и тканей, вызывать хроническую госпитальную инфекцию, а также формировать постоянные резервуары инфекции в госпитальной среде. Определены маркеры эпидемиологической значимости штаммов В. cepacia с потенциально выраженной способностью к формированию биоплёнки: выявление гена сЫ, принадлежность к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР.

7. Показано, что ацилгомосерин лактоны по-разному действуют на рост и образование биоплёнки у бактерий В. cepacia и P. aeruginosa, что подтверждает роль регуляторной системы "Quorum sensing" в формировании биоплёнок. Выявлено, что лактоны С4,С6,С8 в сочетаниии активируют рост, и гемолитические свойства В. cepacia и P. aeruginosa, тогда как синтетический гомосерин лактон без углеродной цепи (СО) существенно ингибирует рост бактерий P. aeruginosa и формирование биоплёнки. Это указывает на возможность и целесообразность разработки синтетических бактериостатических препаратов, ингибирующих рост и продукцию факторов патогенности бактерий на молекулярном уровне.

8. Разработан алгоритм индикации бактерий В. cepacia, включающий комплекс бактериологических и молекулярно-биологических методов. Впервые в схему исследований включены фенотипический тест — выявление образования биоплёнок и молекулярно-биологические методы - ПЦР для выявления эпидемиологических маркеров (cbl -гена, ISH, BCESM маркеров); RAPD-ПЦР для генотипирования штаммов; ПЦР для определения cepl и cepR генов системы "Quorum sensing". Разработанная схема позволяет а) идентифицировать возбудитель до геномовара; б) определить способность возбудителя вызывать острую или хроническую форму инфекции; в) выявить эпидемиологические связи циркулирующих в стационарах и среди больных штаммов В. cepacia.

9. Установлено, что клинические штаммы комплекса В. cepacia, циркулирующие в различных стационарах г.Москвы, относятся к геномовару III A (Burkholderia cenocepacia). У российских штаммов выявлены эпидемиологические маркеры (cbl -ген, BCESM маркер). Установлено, что в каждом из стационаров циркулируют как типичные только для него штаммы, так и региональные или «московские» штаммы.

Специальное приложение.

Выражаю искреннюю благодарность за консультации и плодотворное сотрудничество академику РАМН А.Л.Гинцбургу, профессору, д.б.н. Ю.М.Романовой, д.б.н. Н.А.Зигангировой, д.м.н. Т.Н.Николаевой, д.б.н. И.А.Хмель.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Чернуха, Марина Юрьевна, Москва

1. Ашмарин И.П., Воробьёв А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях// Ленинград, 1962.- С. 70-78.

2. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. "Quorum sensing" или социальное поведение бактерий// Журн. микробиол.- 2003.- № 5. С. 86-93.

3. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом.//Молекуляр. Биология. 2001.- Т.35. -№ 2. - С. 268-277.

4. Зигангирова Н.А., Бархатова О.И., Хойкова О.Ч. , Гинцбург А.Л. Молекулярно-генетические механизмы циркуляции патогенных микоплазм в организме хозяина.//Вестн. РАМН.- 2000.- №1.- С.29-34.

5. Зигангирова Н.А. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биол. наук «Персистенция патогенных микоплазм и ее молекулярно-генетические механизмы»//М.- 2001.

6. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающенй среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития.// Генетика.-2004.-том40.-№11.-С. 1-12.

7. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике// Из-во «Мир». Пер. с англ.- 1976.

8. Мороз А.Ф. Синегнойная инфекция// М.- 1985.

9. Першина М.Ю., Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Прозоровский С.В. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции спроизвольными праймерами.// Мол. генетика, микробиол. вирусол. -1998. № 1. - С.29-32.

10. Рыбальченко О.В, Бондаренко В.М. Ультраструктура и функции биоплёнки симбиотических, патогенных и оппортунистических микроорганизмов// Хлопинские чтения. Современные проблемы медицинской микробиологии. Санкт-Петербург.-2007.- С.245-247.

11. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы// Вестн. РАМН.- 2000.- т. 1.- С. 22-28.

12. Штейн И.В., Аренде И.М., Сорокина Т.А и др.И Биотехнология. -1989.-т.5.-С. 133-136.

13. Agodi A., Mahenthiralingam Е., Barchitta М. et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis: prevalence, epidemiology, and genomovar status// J.Clinical microbiology. -2001. -Vol. 39.- N.8.- P. 2891-2896.

14. Albus A.M., Pesci E.C., Runyen-Janecky L.J., et al. Vfr controls quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa// J Bacteriol.- 1997.- Vol. 179.- P.3928-35.

15. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.G. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res.- 1997. Vol.25. -P. 3389-3402.

16. Anzai, Kim Y.H., Park J.Y. et al. Phylogenetic affiliation of the pseudomonds based on 16S rRNA sequence// Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2000.-Vol.50.-P. 1563-1569.

17. Appelbaum P.C., Leathers D.J. Evaluation of the rapid NFT system for identification of gram-negative, nonfermenting rods// J.Clin. Microbiol.- 1984.- Vol. 20.-P.730-734.

18. Balandrean J., Viallard V., Cournoyer B. et al. Burkholderia cepacia Genomovar 111 is a common plant associated Bacterium// Applied and Environmental Microbiol. -2001.- N2.-P. 982-985.

19. Baselski V. Microbiologic diagnosis of ventilator-associated pneumonia// Infect.Dis. Clin. North Am.- 1993,- N 7.-P.331-357.

20. Bauernfeind A., Schneider I., Jungwirth R. et al. Discrimination of Burkholderia multivorans and Burkholderia vietnamiensis from Burkholderia cepacia genomovars I,III, and IV by PCR// J.Clinical microbiology. -1999.- Vol.37.- N5.-P.1335-1339.

21. Bernier S.P., Silo-Suh L., Woods D.E. et al. Comparative analysis of plant and animal models for characterization of Burkholderia cepacia virulence// Infect. Immun. -2003.- Vol. 71.-P. 5306-5313.

22. Berry A., Devault J.D., Chakrabarty A.M. High osmolarity is a signal for enhanced algD transcription in mucoud and nonmucoid Pseudomonas aeruginosa strains//J.Bacteriol.- 1989.-Vol. 171.-P. 2312-2317.

23. Bertani I., Sevo M„ Kojic M., Venturi V. Role of GacA, Lasl, Rhll, Ppk, PsrA, Vfr and ClpXP in the regulation of the stationary-phase sigma factor rpoS/RpoS in Pseudomonas// Arch Microbiol .-2003.-Vol. 180.-P.264-271.

24. Bingen E.E., Denamur В., Picard B. et al. Molecular epidemiological analysis of Pseudomonas aeruginosa strains causing failure of antibiotic therapy in custic fibrosis patients// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect.Dis.- 1992.- N 11.-P.432-437.

25. Bottone E.J., Perez A.A. II. Pseudomonas aeruginosa folliculitis acquired through use of contaminated loofah sponge: an unrecognized potential public health problem// J.clin.microbial.- 1993.-Vol. 31.-P. 480-483.

26. Brooun A., Liu S., Lewis K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms// Antimicrob Agents Chemother.-2000.-Vol. 44.-P.640-646.

27. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs// Phytophathology.- I950.-Vol. 40.-P. 115-117.

28. Burns J.L., Siman L., Whittier D. et al. Comparison of agar diffusion methodologies of antimicrobial susceptibility testing of pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients// J.Clin Microbiol.- 2000.-Vol.38.-P. 1818-1822.

29. Cha C., Gao P., Chen J.C et al. Mol.Plant-Microbe Interact. Production of Acyl-Homoserine Lactone Qurum-Sensing Signals by Gram-Negative Plant-Associated Bacteria// 1998.- N 11.- P.l 119-1129.

30. Chaparro C., Maurer J., Gutierrez C. et al. Infection with Burkholderia cepacia in Cystic Fibrosis. Outcome following lung transplantation// Am. Journ.

31. Resp. and Crit. care medicine.-2001.-N 163.-P.43-48.

32. Cheng H., T.Lessie Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17616//J.Bacteriol.- 1994.- Vol .176.-P. 4034-4042.

33. Chiarini L., Bevivino A., Dalmastri C., Tabacchioni S., Visca P. Burkholderia cepacia complex species: health hazards and biotechnological potential. //TRENDS in Microbiology.- 2006.-Vol.l4.-N6.-P.277-286.

34. Chung J.W., Altman E., Beveridge TJ. et al. Colonial morphology of Burkholderia cepacia complex genomovar III: implications in exopolysaccharide production, pilus expression, and persistence in the mouse// Infect. Immun.-2003.-Vol .71.-P. 904-909.

35. Chugani S.A., Whiteley M., Lee K.M. et al. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2001.- Vol .98.- P.2752-2757.

36. Clitnis C.E., Ohman D.E. Genetic analysis of the alginate biosynthesis gene claster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure// Mol.Microbiol.- 1993.- N 8.- P. 583-590.

37. Coleman F.T., Mueschenborn S., Meluleni G. et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection// Medical Sceinces.PNAS.-2003.- Vol.100.-N4.-P.1949-1954.

38. Coenye Т., J.J.LiPuma, D.Henry et al. Burkholderia cepacia genomovar VI, a new member of the Burkholderia cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients//Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 2001.- N 51.-P. 271-279.

39. Coenye Т., E. Mahenthiralingam, D.Henry et al. Burkholderia ambirafaria sp.nov., a novel member of the Burkholderia cepacia complex including biocontroland cystic fibrosis-related isolates// Int.J.Syst.Evol.Microbiol.- 2001.- Vol .51.- P. 1481-1490.

40. Coenye Т., Spilker Т., Martin A. et al. Comparative Assessment of genotyping Methods for epidemiologic study of Burkholderia cepacia genomovar III// J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol. 40.-N9.-P. 3300-3307.

41. Coenye Т., P.Vandamme, J.R.W. Gowan, J.J. Lipuma Taxonomy and identification of the Burkholseria cepacia complex/Л. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol. 39.-P. 3427-3436.

42. Coeney Т., Vandamme P., Govan J.R.W. et al. Taxonomy and Identification of the Burkholderi cepacia complex// J. Clinical Microbiol.- 2001.- N 10 (Oct).-P. 3427- 3436.

43. Conway B.A., Chu K.K., Bylund J. et al. Production of exopolysaccharide by Burkholderia cenicepacia results in altered cell-surface interactions and altered bacterial clearance in mice// J. Infect. Dis.- 2004.- Vol. 190(5).-P.957-966.

44. Conway B. A., Greenberg E.P. Quorum sensing signals and quorum sensing genes in Burkholderia vietnamiensis// J. Bacterid.- 2002.- Vol.184.-P.1187-91.

45. Conway B.A., Venu V., Speert D.P. Biofilm formation and acyl homoserine lactone production in the Burkholderia cepacia complex// J. Bacteriol.-2002.- N 184.-P.5678-85.

46. Corbett C.R., Burtnick M.N., Kooi C. et al. An extracellular zinc metalloprotease gene of Burkholderia cepacia// Microbiology.- 2003.- Vol. 149.-P.2263-2271.

47. Cunha M.V., Leitao J.H., Mahenthiralingam et al. Molecular analysis of Burkholderia cepacia complex isolates from Portuguese cystic fibrosis center: a 7-year study// J.Clin. Microbiol. Vol. 41.-P. 4113-4120.

48. Davies J.E. Origins, acquisition and dissemination of antibiotic resistance determinants// In: Chadwick D.J, editor. Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread. Chinester (UK): John Wiley and Sons Ltd.- 1997. -P. 15-35.

49. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., et al. The involvement of cell-to cell signals in the development of a bacterial biofilm// Science.-1998.- Vol .280.-P.295-298.

50. De Vos D., Lim A., Pirnay J.J.P. et al. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on Vol .35.-P. 1295-1299.

51. De Vos D., Lim A., De Vos A. et al. Detection of outer membrane lipoprotein I and its gene in fluorescent and nonflourescent pseudomonads: its implication for taxonomy and diagnosis// J.Gen. Microbiol.- 1993.- Vol .139.-P. 2215-2223.

52. Donlan R.M. Biofilms and device-associated infections// Emerg Infect ' Dis.- 2001.-N 7.-P.277-281.

53. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms// Clin Microbiol Rev.- 2002.- Vol .15.-P. 167-193.

54. Drenkard E., Ausubel F.M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation// Nature.- 2002.- Vol.416.-740-743.

55. Fick R.B. Pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa lung lession in cystic fibrosis//Chest.- 1989.- Vol .46.- P. 158-164.

56. Fisher M.C., Goldsmith J.F.,Gilligan P.H. Sneakers as a source of Pseudomonas aeruginosa in children with osteomyelitis following puncture wounds// J. Pediatr. -1985.- Vol .106.- P.607-609.

57. FitzSimmons S.C. The changing epidemiology of cystic fibrosis// Curr. Probl. Pediatr.- 1994.- Vol .24.-P.171-179.

58. Flynn J.L., Ohman D.E. Cloning of genes from mucoid Pseudomonasaerugenosa which control spontaneous conversion to the alginate production phenotype// J.Bacteriol.- 1988,-Vol .170.-P. 1452-1460.

59. Foca M.C., Jacob S., Whitter P.D. Endemic Pseudomonas aeruginosa infection in a neonatal intensive care unit// N.Engl. J. Med.- 2000.- Vol .343.-P.695-700.

60. Fuqua W.C, Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators.// J.Bacteriol.- 1994. Vol.176. -N2.- P.269-275.

61. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. // Annu. Rev. Microbiol.- 1996.- Vol. 50.- P. 727-751.

62. Furukawa S, Kuchma S.L., O'Toole G. A. Keeping their options open: acute versus perssistent infections// Minireview. Journal of Bacteriology.- 2006.- Vol. 188.-N4.- P. 1211-1217.

63. Gambello M.J., Kaye S., Iglewski B.H. LasR of Pseudomonas aeruginosa is a transcriptional activator of the alkaline protease gene (apr) and an enhancer of exotoxin A expression. // Infect. Immun. 1993.- Vol. 61. -N 4. - P. 1180-1184.

64. Geiss H.K., Geiss M. Evaluation of a new commercial system for the identification of Enterobacteriaceae and non-fermentative bacteria// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 1992.-N 11.-P.610-616.

65. Gilligan P.H. Microbiology of airway disease in patients with cysticfibrosis// Clin Microbiol. Rev.- 1991.-N 4.- P. 35-51.

66. Gilligan P.H. Pseudomonas and Burkholderia// In "Manual of Clinical Microbiology", 6 th cd„ Washington Press.- 1995.-P. 509-519.

67. Gilligan P.H. Report on the consensus document for microbiology and infectious diseases in cystic fibrosis// Clin. Microbiol. News 1996.-N 18.-P.83-87.

68. Goldstein R., Sun Li, Ru-zhang Jjang et al. Structurally variant classes of pilus appendage fibers coexpressed from Burkholderia (Pseudomonas) cepacia// J.Bacteriol.- 1995.-Vol. 177.-N4.- P.1039-1052.

69. Goodman, A. L., B. Kulasekara, A. Rietsch, D. Boyd, R. S. Smith, and S. Lory. A signaling network reciprocally regulates genes associated with acute infection and chronic persistence in Pseudomonas aeruginosa// Dev. Cell .-2004.-N 7.- P.745-754.

70. Gotschlich A., Huber В., Geisenberger O., et al. Synthesis of multiple N-acylhomoserine lactones is widespread among members of the Burkholderia cepacia complex// Syst Appl Microbiol.- 2001,- Vol .24.-P.1-14.

71. Govan J.R.W., Brown P.H., Maddison J. et al. Evidence for transmission of P.cepacia by social contact in cystic fibrosis// Lancet.- 1993.- Vol .342.- P. 15-19.

72. Govan J.R.W, Deretic V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia// Microbiol. Rev.- 1996.-Vol .60.-P. 539-574.

73. Govan J.R.W., Hughes J.E., Vandamme P. Burkholderia cepacia: medical, taxonomic and ecological issues// J. Med. Microbiol.- 1996.- Vol .45.-P. 395-407.

74. Govan J.R.W., P.Vandamme Agricultural and medical microbiology: atime for bridging gaps// Microbiol.- 1998.- Vol .144.- P. 2373-2375.

75. Grimwood К., M. Tu, Rabin H.R. at al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa exoenzyme expression by subinhibitory antibiotic concentrations// Antimicrob.Agents Chemother.- 1989.- Vol .33.-P. 41-47.

76. Grkovic S., Brown M.H., Skurray R.A. Regulation of bacterial drug export systems// Microbiol Mol .Biol. Rev.- 2002.- Vol .66.-P.671-701.

77. Grundman H., Schneider C., Hartung D. et al. Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa// J. Clin. Microbiol.- 1995.- Vol .33.-P.528-534.

78. Hall-Stoodley, L., J. W. Costerton, and P. Stoodley. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases// Nat. Rev. Microbiol.-2004.-N 2.-P.95-108.

79. Hedberg M. Acetamide agar medium selective for Pseudomonas aeruginosa// Appl. Microbiol. -1969.- Vol .17.-P.481.

80. Henry D., Campbell M, McGimpsey C. et al. Comparison of isolation media for recovery of Burkholderia cepacia complex from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis// J.Clinical microbiology.- 1999.- Vol.37.- N 4.- P. 10041007.

81. Henry D.A., Mahenthiralingam E., Vandamme P. et al. Phenotypic methods for determining genomovar status Burkholderia cepacia complex// J.Clinical microbiology. -2001.- Vol.39.- N 3.- P.1073-1078.

82. Henry D.A., E.Mahenthiralingam, P.Vandamme et al. Biochemical and molecular approaches for determining genomovar status of the of Burkholderia cepacia complex//Pediatr. Pulmonol.-1999.- Suppl. 19.-P.271.

83. History of CF.- 2005. http://www3.nbnet.nb.ca/normap/cfhistory.htm.

84. Hogardt, Trebesius M.K., Geiger A.M. et al. Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients// J. Clin. Microbiol. -2000.- Vol .38.-P.818-825.

85. Holden M.T.G. et al. Genomic plasticity of the causative agent ofmelioidosis Burkholderia pseudomallei// Proc. Nait. Acad. Sci. Usa.- 2004.- Vol. 101.-P. 14240-14250.

86. Holland S.P., Pulido J.S., Shires Т.К. et al. Pseudomonas aeruginosa ocular infections// In R.B.Fick, Jr.(ed), Pseudomonas aeruginosa: the Opportunist. CRC Press, Inc., Boca Raton, На.- 1993.-P. 159-176.

87. Holmes A., J.Govan, R. Goldstein. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human health//Emerg.Infect.Dis.- 1998.- N 4.-P. 221-227.

88. Holt J.G.N., Kreig P.H.A., Sneath J.T. Bergey's Manual of determinative Bacteriology// 9th ed. The Williams & Wilkins Co., Philadelphia,Pa. -1994.-P.93-94, 151-168.

89. Horinouchi S., Berru Т. Autoregulatory factors and communication in actinomycetes//Ann. Rev. Microbiol. Vol .1192.-N.16. - P.377-398.

90. Huber В., Riedel K., Hentzer M., et al. The сер quorum-sensing system of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility// Microbiology.- 2001.- Vol .147.-P.2517-2528.

91. Hutchison M., Poxton I.R., Govan J.R. Burkholderia cepacia produces a Hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes// Infect.Immun.- 1998.-Vol. 66.-N 5.-P. 2033-2039.

92. International Pseudomonas aeruginosa Typing Study Group. A multicenter comparison of methods for typing strains of Pseudomonas aeruginosa predominantly from patients with cystic fibrosis// J.Infect.Dis.- 1994.-Vol. 169.-P. 134-142.

93. Isles A., I.maclusky, M.Corey et al. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem//J.Pediatr.- 1984,- Vol .104.-P. 206-210.

94. Ivobe S., Kusadocoro H, Ozaki J. et al. Amino acid substitutions in a variant of imp-1 metallo-p-lactamase// Antimicrob. Agents Chemother.-2000.-Vol.44.-P.2023-2027.

95. Jack D.L., Yang N.M., Saier M.H. Jr. The drug/metabolite transportersuperfamily// Eur. J. Biochem.- 2001,- Vol .268.-P.3620-39.

96. Jerne N.K. The somatic generation of immune recognition// Eur.J.Immunol. -1971.- N 1.-P.1-9.

97. Jones A.M., Todd M.E., Webb A.K. Burkholderia cepacia: current clinical issues, environmental controversies and ethical dilemmas// Eur. Respir. J. 2001.-N 17.-P.295-301.

98. Keivit T.R., Iglewski B.H. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships// Infect. Immun.-2000.- Vol .68.-P.4839-4849.

99. Kell D.B., Kaprelyants A.S.,Grafen A. On pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria// Els.Trends.J. 1995. -Vol.10.-N3.-P. 126-129.

100. Kenneth T. Todar's online textbook of bacteriology. http//textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html.-2004.-P.l-9.

101. Kersters K., Ludwig W., Vancanneyt M. et al. Recent changes in the classification of the pseudomonads: an overview// Syst. Appl. Microbiol.- 1996.- Vol .19.-P.465-477.

102. Kiska D.L., Gilligan P.H. Pseudomonas// In: Murray P.R., Baron E.J., Jorgensen J.H., Pfaller M.A., Yolken R.H., editors. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington: ASM Press.- 2003.-P. 719-728.

103. Kitch T.T., Jacobs M.R., Appelbaum P.C. Evaluation of the 4-hour RapidID NF Plus method for identification of 345 gram-negative nonfermentativerods//J. Clin. Microbiol. -1992.-Vol. 30.-P.1267-1270.

104. Koh A.Y., Priebe G.P., Pier G.B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia// Infect, and Immun.- 2005.-Vol.73.-P.2262-2272.

105. Komshian S.V., Tablan O.C., Palutke W. et al. Characteristics of left-sided endocarditis due to Pseudomonas aeruginosa in the Detroit Medical Center// Rev. Infect. Dis.- I990.-Vol. 12.-P.693-702.

106. Kothe M., Antl M., Huber B. et al. Killing of Caenorhabditis elegans by Burkholderia cepacia is controlled by the сер quorum- sensing system// Cell. Microbiol.- 2003.-N 5-P.343-351.

107. Krueger C.L., Sheikh W. A new selective medium for isolating Pseudomonas spp. from waterII Appl. Environ. Microbiol.- 1987.-Vol. 53.-P.895-897.

108. Kuchma, S. L., J. P. Connolly, and G. A. O'Toole. 2005. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa//. Bacterid.- Vol.87.-P. 1441-1454.

109. Kulasekara, H. D., I. Ventre, B. R. Kulasekara, A. Lazdunski, A. Filloux, and S. Lory. 2005. A novel two-component system controls the expression of Pseudomonas aeruginosa fimbrial cup genes// Mol. Microbiol.-Vol. 55.-P.368-380.

110. Lambre D.W., Stewart W. Evaluation of pseudosel agar as an aid in the identification of PSEUDOMONAS AERUGINOSA// Appl. Microbiol.- 1972.-Vol.23.-P.377-381.

111. Lamothe J., Thyssen S., Valvano M.A. Burkhoderia cepacia complex isolates survive intracellularly without replication within acidic vacuoles of Acanthamoeba polyphaga// Cell Microbiol.- 2004.-Vol.6.-N 12.-P.1127-1138.

112. Laskowski, M. A., E. Osborn, and В. I. Kazmierczak. 2004. A novel sensor kinase-response regulator hybrid regulates type III secretion and is required for virulencc in Pseudomonas aeruginosa// Mol. Microbiol.- Vol. 54.-P. 1090-1103.

113. Lau Y.J., Liu P.Y.F., Hu B.S. et al. DNA fingerprinting of Pseudomonasaeruginosa serotype Oil by enterobacterial repetitive intergenic consesus-polymerase chain reaction and pulsed-field gel electrophoresis// J. Hosp. Infect.- 1995.- Vol.31.-P.61-66.

114. Lennin E. and B.DeCicco. Plasmid of P.cepacia strains of diverse origins.// Appl.Environ.Microbiol.- 1991.- Vol.57.-P.2345-2350.

115. Lewenza S., Conway В., Greenberg E.P., Sokol P.A. Quorum Sensing in Burkholderia cepacia: Identification of the LuxRI Homologs CepRI // J. Bacterid 1999.- Vol. 181. P. 748-756.

116. Lewenza S., Sokol P.A. Regulation of Ornibactin Biosynthesis and N-Acyl-L-Homoserine Lactone Production by CepR in Burkholderia cepacia. // J. Bacteriol.- 2001.- Vol. 183.- P. 2212-2218.

117. Chiarini L., Bevivino A., Dalmastri C., Tabacchioni S., Visca P. Burkholderia cepacia complex species: health hazards and biotechnological potential. //TRENDS in Microbiology.- 2006.-VoU4.-N6.-P.277-286.

118. LiPuma J.J., E.Mahenthiralingam Commercial use of Burkholderia cepacia//Emerg.Infect.Dis.- 1999.- N5.-P.305-306.

119. Liu P.Y.-F., Lay Y.-J., Hu B.-Sh., Shyr J.-M., Shi Z.-Y., Tsai W.-S., Lin Y.-H., Tseng C.-Y. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different Molecular Typing Methods.// J.Clin. Microbiol.-1995.- Vol. 33.-P.1779-1783.

120. Liu P.V. Toxins of Pseudomonas aeruginosa// In: Pseudomonas aeruginosa ( clinical manifestation and current therapy). Ed. R.G. Dogett. New York. -1979.-P.90-135.

121. Livermore D.M. Multiple mechanisms of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa: our worst nightmare?// Clin. Infect. Dis. -2002.- Vol. 34.-P.634-640.

122. Loazdunski A.M., Ventre I, Aturgis U.N. Gram-negative bacteria circuits and communication in Gram-negative bacteria// Nature Rev. Microbiol.- 2004.-N2.-P.581-592.

123. Lonon M.K., Woods D.E., Straus D.C. Production of lipase by clinical isolates of Pseudomonas cepacia.// J. Clin. Microbiol.-1988.- Vol. 26. P. 979-984.

124. Luczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B. Lung infections associated with cystic fibrosis// Clin Microbiol Rev.- 2002.- Vol. 15.-P. 194-222.

125. Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al. Distribution of Quorum-Sensing Genes in the Burkholderia cepacia complex// Infect.Immun. 2001. - Vol. 69. -N7. -P.4661^666.

126. MacGeorge J., Korolik V., Morgan A.F. et al. Transfer of a chromosomal locus responsible for mucoid morphology in Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients to P.aerugenosa РАО// J. Med.Microbiol.- 1986.- Vol. 21.-P.331-336.

127. Mahenthiralingam E., Baldwin A., Vandamme P. Burkholderia cepacia complex infection in patients with cystic fibrosis // J. Med. Microbiol. 2002.-Vol.51.-P. 533-538.

128. Mahenthiralingam E., Urban T.A., Goldberg J.B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nature Reviews// Microbiology.-2005.- Vol.3.-N.2.-P. 144-156.

129. Marolda CL, Haureder B, John MA, Michel R, Valvano M.A: Intracellular survival and saprophytic growth of isolates from the Burkholderia cepacia complex in free-living amoebae// Microbiology.-1999.- Vol.145.- P.1509-1517.

130. Masuda N., Sakagawa E., Ohya S. Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa// Antimicrob Agents Chemother.- 1995,- Vol.39.-P.645-649.

131. Mayhall C.G. Nosocomial pneumonia: diagnosis and prevention// Infect.

132. Dis. Clin. North Am.- 1997.-N11.-P.427-457.

133. McDowell A., Mahenthiralingam E., Dunbar K.E.A. et al. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex species recovered from cystic fibrosis patients: issues related to patient segregation// J. Med. Microbiol.- 2004.- Vol.53.-P.663-668.

134. McDowell A., Mahenthiralingam E., Moore J.E. et al. PCR-based detection and identification of Burkholderia cepacia complex pathogens in sputum from cystic fibrosis patients// J.Clinical microbiology.-2001.-Vol.39.-N12.- P.4247-4255.

135. McClean K.H., Winson M.K., Fish L. et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones// Microbiology.-1997.- Vol. 143.-P. 37033711.

136. McCubbin M., Fick R.B. Pathogenesis of Pseudomonas lung disease in cystic fibrosis. In Pseudomonas aerugenosa: the Opportunist// CRC Press.- 1993.-P.189-211.

137. Miller, M.B., Bassler, B.L . Quorum sensing in bacteria. // Annu. Rev. Microbiol.-2001.- Vol. 55.- P. 165-199.

138. Miller S.C.M., LiPuma J.J., Parke J.I. Cultured based and non-growthdependent detection of the Burkholderia cepacia complex in soil environments// Applied and Environmental Microbiol. -2002.-N8(Aug).-P.3750-3758.

139. Monreal J., Rees E.T. The chitinase of Serratia marcescens. // Can. J. Microbiol.- 1969 Vol. 15. - P. 689-696.

140. Moore R.A., DeShazer D., Reckseidler S., et al. Efflux-mediated aminoglycoside and macrolide resistance in Burkholderia pseudomallei// Antimicrob Agents Chemother.-1999.- Vol.43.-P.465-470.

141. Morlin G.L., Hedges D.L., Smith A.L. et al. Accuracy and cost of antibiotic susceptibility testing of mixed morphotypes of Pseudomonas aeruginosa// J. Clin. Microbiol.-1994.- Vol.32.-P. 1027-1030.

142. Morrison A.J., Wenzel R.P. Epidemiology of infections due to Pseudomonas aeruginosa//Rev. Infect. Dis. -1984.- Vol.6.-Suppl.3.-P.S627-S642.

143. Nakazawa Т., Y.Yamada, M. Ishibashi Characterization of hemolysin in extracellular products of Pseudomonas cepacia//J.Clin.Microbiol.- 1987.-Vol.25.-P. 195-198.

144. Neyfakh A.A. Mystery of multidrug transporters: the answer can be simple// Mol Microbiol.- 2002.- Vol.44.-P.l 123-1130.

145. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development// Annu Rev Microbiol.- 2000.- Vol.54.-P.49-79.

146. Palleroni N.J., Kunisawa R., Contopoulou R. et al. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas// Int. J. Syst.Bacteriol.- 1973.- Vol.23.-P.333-339.

147. Parsek, M. R., and P. K. Singh. 2003. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis// Annu. Rev. Microbiol. Vol .57.-P.677-701.

148. Pearson J.P., Van Delden C., Iglewski B.H. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals// J Bacterid.- 1999.- Vol.l81.-P.1203-1210.

149. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P. Quinoline signaling in the cell- to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa// Proc. Natl. Acad. Sci USA. -1999.- Vol. 96.-P. 11229-11234.

150. Pesci E.C., Pearson J.P., Seed P.C. et al. Regulation of las and rhl Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa// J. Bacteriology.-1997/- Vol. 179.-N10.-P.3127-3132.

151. Philipon L.N., Naas Т., Bouthors A.T. et al. OXA-18, a class D clavulanic acid inhibited extended-spectrum P-lactamase from Pseudomonaqs aeruginosa// Antimicrob. Agents Chemother.- 1997.- Vol.41.-P.2188-2195.

152. Pollack M. Pseudomonas aeruginosa// In G.L. Mandell, J.E. Bennett and R. Dolin (ed.). Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th ed. Churchill Livingstone. Inc. New York. N.Y.-2000.-P. 1980-2003.

153. Poole К. Multidrug efflux pump and antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa and related organisms// J. Mol. Microbiol. Biotechnol.-2001.-N3.-P.255-264.

154. Pujana J., Gallego L., Canduela M.J. et al. Specific and rapid identification of multiple-antibiotic resistant Pseudomonas aeruginosa clones isolated in an intensive care unit// Diagn. Microbiol. Infect. Dis.- 2000.- Vol.36.-P.65-68.

155. Pukatzki S., Kessin R.H., Mekalanos J.J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum// Microbiology. PNAS.-2002.- Vol.99.-N5.-P.3159-3164.

156. Reddi K., Phagoo S.B., Anderson K.D. et al. Burkholderia cepacia-induced IL-8 gene expression in an alveolar epithelial cell line signaling through CD 14 and mitogen-activated protein kinase// Pediatr. Res.- 2003.- Vol.54.-P.297-305.

157. Rhoads S., Marinelli L., Imperatrice C.A. et al. Comparison of the MicroScan Walk-away system and Vitek system for identification of gram-negative bacilli//J. Clin. Microbiol.-1995.- Vol.33.-P.3044-3046.

158. Riedel K., Hentzer M., Geisenberger O. et al. N-Acylhomoserine-lactone-mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed biofilms// Microbiology. -2001.- Vol.147.-P.3249-3262.

159. Rioddan J.R., Romens J.M., Keren B.S. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA// Science.- 1989.-Vol.245.-P. 1066-1073.

160. Robinson A., McCarter Y.S., Tetreault J. Comparison of Crystal enteric/nonfermenter system, API 20E system, and Vitek Automicrobic system for identification of gram-negative bacilli// J. Clin. Microbiol. -1995.- Vol. 33.-P.364-370.

161. Saijan S and J. Forstner. Role of a 22-kilodalton pilin protein in binding of P.cepacia to buccal epithelial cells//Infect.Immun.-1993.- Vol. 61.-P.3156-3163.

162. Sajjan U., Keshvjee S., Forstner J. Responses of well-differentiated airway epithelial cell cultures from healthy donors and patients with cystic fibrosis to Burkhoderia cenocepacia infection// Infect. Immun. -2004.- Vol.72.-N7.-P.4188-4199.

163. Sajjan U., Wu Y., Kent G. et al. Preferential adherence of cable-piliated Burkholderia cepacia to respiratory epithelia of CF knockout mice and cystic fibrosis lung explants // J. Med. Microbiol.- 2000.- Vol. 49.-P.875-885.

164. Saiman L., Siegel J. Infection control in cystic fibrosis// Clinical Microbiology Reviews. -2004.- N1.-P.57-71.

165. Saint-Onge A., Romeyer F., Lebel P. et al. Specificity of the Pseudomonas aeruginosa PA01 lipoprotein I gene as a DNA probe and PCR target region within the Pseudomonadaceae// J. Gen. Microbiol. -1992.-Vol.l38.-P.733-741.

166. Schmidt and Hensel. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis//

167. Clin. Microbiol. Rev.- 2004.- Vol.l7.-P.25-26.

168. Schwab U., Leigh M., Ribeiro C. et al. Patterns of epithelial cell invasion by different species of the Burkholderia cepacia complex in well- differentiated human airwayepithelia// Infect, and Immun.- 2002.- Vol.70.-N 8.-P.4547-4555.

169. Scordilis G.E., H.Ree, T.G. Lessie Identification of transposable elements which activate gene expression in Pseudomonas cepacia//J. Bacteriol.- 1987.-Vol.169.-P.8-13.

170. Shaw D., Poxton I.R., Govan J.R. Biological activity of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia lipopolysaccharide// FEMS Immunol. Mol. Microbiol.-1995.-N11 .-P.99-106.

171. Shelly D.B., T.Spilker, E.J. Gracely et al. Utility of commercial systems for identification of Burkholderia cepacia complex from cystic fibrosis sputum culture//J.Clin.Microbiol.-2000.- Vol. 38.-P.3112-3115.

172. Shen D.F., Tai P.C., Vasil M.L. Nucleotide sequences and expression in Escherichia coli of the in-phase overlapping Pseudomonas aeruginosa plcR genes// J.Bacteriol. 1987.- Vol. 169. - P.4602-4607.

173. Singh P.K., Schaeer A.L., Parsek M.R., et al. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms// Nature .-2000.-Vol.407.-P.762-764.

174. Smith D.L., Gumery L.B., Smith E.G. et al. Epidemic of P.cepacia in an adult cystic fibrosis unit: evidence of person-to-person transmission// J.Clin. Microbiol.- 1993 .-Vol.31 .-P.3017-3022.

175. Smith J.J., Travis S.M., Greenberg E.P.,Welsh M.J. Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid// Cell.-1996,- Vol. 85.-P.229-236.

176. Sokol P.A., Sajjan U., Visser M.B. et al. The CepIR quorum-sensing system contributes to the virulence of Burkholderia cenocepacia respiratory infections// Microbiology.-2003,- Vol.l49.-P.3649-3658.

177. Speert D.P., Farmer S.W., Campbell M.E. et al. Conversion of Pseudomonas aeruginosa to the phenotype characteristic of strains from patients with cystic fibrosis//J.Clin.Microbiol.- 1990.- Vol.28.-P.188-194.

178. Speert D.P., Steen В., Halsey K. et al. A murine model for infection with Burkholderia cepacia with sustained persistence in the spleen// Inf. and Immun. -1999.- Vol.67.-P.4027-4032.

179. Statistics & CF// http:// www3.nbnet.nb.ca/normap/cfstats.htm.-2005.

180. Stead D.E. Grouping of plant-pathogenic and some other Pseudomonas spp. by using cellular fatty acid profiles// Int. J. Syst. Bacteriol.-1992.- Vol.42.-P.281-295.

181. Stover C.K., Pham X.Q., Erwin A.L. et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen// Nature.-2000.- Vol. 406.-P.959-964.

182. Summer E.J.,Gonzales C.F.,Carlisle T. et al. Burkholderia cenocepacia phage BcepMu and a family of Mu-like phages encoding potential pathogenesis factors// J. Mol.Biol. 2004.- Vol.340.-P.49-65.

183. Sun L., Jiang L.Z., Steinbach S. et al. The emergence of a highly transmissible lineage of cbl+ Pseudomonas (Burkholderia) cepacia causing CF center epidemics in North America and Britain// Nat. Med.- 1995.-N1.-P.661-666.

184. Swift, S., Downie, J.A., Whitehead, N.A et al. Quorum sensing as a population-density-dependent determinant of bacterial physiology// Adv. in Microb. Physiol. -2001. Vol. 45. - P. 199-270.

185. Taga E.M., Bassler B.L. Chemical communication among bacteria. // Proc. Nat. Acad. Sci. 2003. - Vol.100. -Suppl.2. -P.14549 -14554.

186. Tateda K., Ishii Y., Horikawa M. et al. The Pseudomonas aeruginosa Autoinducer N-3-Oxododecanoyl Homoserine Lactone Accelerates Apoptosis in Macrophages and Neutrophils // Infect.Immun. 2003. - Vol.71. - N10. - P.5785-5793.

187. Todar K. Pseudomonas aeruginosa// Todar's Online Textbook of Bacteriology. -2004.-P. 1-9

188. Thomassen M.J., C.Demko, J.Klinger et al. Pseudomonas cepacia colonization among patients with cystic fibrosis a new opportunist //Am. Rev. Respir. Dis.- 1985.- Vol.l31.P.791-796.

189. Tyler S.D., K.R.Rozee, W.M. Johnson Identification of IS1356, a new insertion sequence, and its association with IS402 in epidemic strains of Burkholderia cepacia infecting cystic fibrosis patients// J.Clin.Microbiol.- 1996.- Vol.34.-P.1610-1616.

190. Urban T.A., Griffith A., Torok A.M et al. Contribution of Burkholderia cenocepacia flagella to infectivity and inflammation// Infect.Immun.-2004.- Vol.72.-N9.-P.5126-5134.

191. Vandamme P., B.Pot, M.Gillis et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics// Microbiol.Rev.- 1996.- Vol. 60.-P.407-438.

192. Van Delden C., Iglewski B.H. Cell-to-cell signaling and Pseudomonas aeruginosa infections//Emerg. Infect. Dis.- 1998.-N 4.-P.561-570.

193. Vasil M.L., Chamberlain C., Grant C.C.R. Molecular studies of Pseudomonas exotoxin A gene// Infect. Immun.-1986.- Vol. 52.-P.538-548.

194. Venter J.C., Ramington K., Heidelberg J.F. et al. Environmental genome shotgun secueencing of the Sargasso Sea// Science.- 2004.- Vol.304.-P.66-74.

195. Venturi V., Friscina A., Bertani I. et al. Quorum sensing in the Burkholderia cepacia complex// Res. Microbiol. -2004.- Vol.l55.-N4.-P.238-244.

196. Vinion-Dubiel A.D., Goldberg J.B. Lipopolysaccharide of Burkholderia cepacia complex// Endotoxin Res. -2003.-N9.-P.201-213.

197. Vinion-Dubiel A.D., Spilker Т., Dean C.R. et al Correlation of wbil genotype, serotype and isolate source within species of the Burkholderia cepacia complex// J. Clin. Mikrobiol.- 2004.- Vol.42.-P.4121-4126.

198. Visser M.B., Majumdar S., Hani E. et al. Importance of the omibactin and pyochelin siderophore transport systems in Burkholderia cenocepacia lung infections// Infect. Immun. -2004.- Vol.72.-P.2850-2857.

199. Whiteley M., Lee M.K., Greenberg E.P. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa// PNAS.-1999.- Vol.96.-N24.-P.13904-13909.

200. G.L.Woods, J.A.Washington. Antibacteria susceptibility tests: Dilution and disk diffusion methods// Manual of clinical microbiology. 6th edition. ASM. -1995.-P.1327-1341.

201. Xu K.D., McFeters G.A., Stewart P.S. Biofilm resistance to antimicrobial agents//Microbiology.- 2000.- Vol.l46.-P.547-549.

202. Yeager C.M., Bottomley P.J., Arp D.J. Requirement of DNA Repair mechanisms for survival of Burkholderia cepacia G4 upon degradation of trichloroethylene// Appl. and Environmental Microbiol. -2001.- Vol. 67.-N12.-P.5384-5391.

203. Zhang L., Li X.Z., Poole K. SmeDEF multidrug efflux pump contributes to intrinsic multidrug resistance in Stenotrophomonas maltophilia// Antimicrob Agents Chemother.- 2001,- Vol.45.-P.3497-3503.

204. Zhou M., Clark S.E., Gomes-Sanchez C.E. Universal cloning method by ТА strategy. //Biothechniques. 1995. - Vol.19. - P.34.

205. Zierdt C.H. Autolytic nature of iridescent lysis in Pseudomonas aeruginosa// Antonie Leeuwenhoek. -1971.- Vol. 37.-P.319-337.