Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая анионными пероксидазами растений, и ее применение в иммуноферментном анализе

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая анионными пероксидазами растений, и ее применение в иммуноферментном анализе"

На правах рукописи

Вдовенко Марина Михайловна

РЕАКЦИЯ УСИЛЕННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМАЯ АНИОННЫМИ ПЕРОКСИДАЗАМИ РАСТЕНИЙ, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологин)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА-2011

4844246

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Иван Юрьевич Сахаров

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Александр Габибович Габибов

Ведущая организация:

Институт экспериментальной кардиологии,

ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится 29 марта 2011 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета

доктор биологических наук, профессор Марина Александровна Мягкова

МГУ.

г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммуноферментный анализ (ИФА) в настоящее время является одним из самых распространенных аналитических методов, используемых для определения разнообразных аналитов. На практике в современных условиях наиболее интенсивно применяется твердофазный вариант ИФА (тИФА). Известно несколько форматов тИФА, при этом во всех форматах последним этапом является определение каталитической активности фермента-метки. Для этого в тИФА используют различные методы детекции, но наиболее чувствительным является хемилюминесцентный метод.

Традиционно в тИФА в качестве метки используется катионный изофермент с пероксидазы хрена (ПХ). И в этом случае субстратом для хемилюминесцентной регистрации активности ПХ является люминол. Так как каталитическая активность ПХ в отношении люминола крайне низка, требуется введение в реакционную среду дополнительных соединений, которые называются усилителями. Наиболее известным усилителем для ПХ является 4-йодофенол. Предел обнаружения ПХ в этом случае составляет 1.0 пМ. Изучение кинетики данной ферментативной реакции показало, что ПХ продуцирует аналитический сигнал, сильно изменяющийся во времени. Таким образом, для развития новых высокочувствительных тИФА методов требуется решить проблему нестабильности хемилюминесцентного сигнала (ХЛС), а также понизить предел обнаружения пероксидазы.

В последние годы был выделен ряд новых ферментов, относящихся к группе анионных изопероксидаз. В отличие от ПХ эти пероксидазы продуцируют практически неизменный во времени аналитический сигнал. Этот факт позволил продемонстрировать преимущества использования анионной пероксидазы сои (ПС) по сравнению с ПХ в тИФА с хемилюминесцентной детекцией (ХЛ-тИФА). К сожалению, данная группа пероксидаз также имеет недостаток, заключающийся в том, что ХЛС, продуцируемый ими, значительно ниже, чем с применением ПХ. Введение в реакционную среду усилителей ПХ не дает значительного усиления хемилюминесценции. Данный факт ограничивает чувствительность разрабатываемых иммуноферментных тест-систем. Все вышеперечисленное однозначно указывает на актуальность поиска эффективных усилителей для анионных пероксидаз, приводящих к высокому по величине и стабильному во времени аналитическому сигналу, что, в конечном счете, позволит качественно улучшить аналитические параметры иммуноферментных тест-систем.

Цели и задачи исследования. Обнаружить эффективные усилители ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами, и продемонстрировать

преимущества их применения при разработке высокочувствительных иммуноферментных тест-систем с хемилюминесцентной детекцией.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

• Оценить способность 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната натрия

(ФТПС) в качестве усилителя ХЛС, продуцируемого анионными

пероксидазами сои и батата;

• Сравнить ФТПС с другими производными фенотиазина как

потенциальными усилителями ХЛС, продуцируемого ПС;

• Изучить влияние некоторых производных пиридина на усиливающую

способность ФТПС;

• Оценить возможности детектирующей системы на основе ПС и ФТПС с 4-

морфолинопиридином (МП) в сэндвич и конкурентном форматах ХЛ-

тИФА.

Научная новизна работы. Открыто, что ФТПС является эффективным усилителем хемилюминесценции, продуцируемой анионными пероксидазами в процессе окисления люминола пероксидом водорода. Впервые для анионных пероксидаз был продемонстрирован эффект вторичного усиления ХЛС под воздействием ряда производных пиридина. Добавление пары усилителей ФТПС/МП в реакционную смесь при наиболее благоприятных условиях окисления люминола пероксидом водорода приводило к понижению предела обнаружения пероксидазы сои до 0.03 пМ. Кроме того, показано, что образующийся ХЛС практически неизменен в течение длительного времени. Продемонстрированы преимущества использования разработанной системы усиления на основе анионной ПС и усилителей ФТПС/МП в сравнении с традиционно используемой в ХЛ-тИФА катионной ПХ и усилителя 4-йодофенола на примере сэндвич формата тест-системы для определения тиреоглобулина человека. Более того, возможности разработанной детектирующей системы были продемонстрированы в конкурентном формате тИФА для определения охратоксина А и 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Практическая значимость работы. Продемонстрировано, что использование разработанной детектирующей системы на основе коммерчески доступной анионной пероксидазы сои вместо пероксидазы хрена в составе иммуноферментных наборов с хемилюминесцентной детекцией позволяет существенно улучшить их качество за счет понижения предела обнаружения, расширения линейного диапазона определяемых концентраций и большей стабильности хемилюминесцентного сигнала во времени. Разработанный метод анализа был успешно применен для определения тиреоглобулина в сыворотке

человека, охратоксина А в образцах соевых бобов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в образцах апельсинов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге, 2009» (Санкт-Петербург, 2009), «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), «Перспективы развития инноваций в биологии, 2009» (Москва, 2009) и «Ломоносов-2009» (Москва, 2009) и международных симпозиумах «The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, 2010» (Тель-Авив, Израиль, 2010), «Bioluminescence and Chemiluminescence, 2010» (Лион, Франция, 2010) и «Luminescence Spectrometry, 2010» (Прага, Чехия, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы: 4 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 8 тезисов докладов на международных конференциях и симпозиумах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы ссылок). Работа изложена на /^у страницах и включает рисунков и /¿""таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. 3-(10'-феиотиази11ил)-пропан-1-сульфанат натрия - усилитель хемилюмннесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами.

Как известно, ряд соединений различной химической природы является усилителями люминесценции, катализируемой ПХ в процессе окисления люминола пероксидом водорода. В отличие от этого, люминесценция, образующаяся в аналогичной реакции и катализируемая анионными пероксидазами, практически не увеличивается в присутствии традиционных усилителей ПХ. Отсутствие в арсенале исследователей усилителей анионных пероксидаз сдерживало применение этих ферментов в практической аналитической практике.

Недавно было найдено, что натриевая соль 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфаната (ФТПС, рисунок 1) способна усиливать интенсивность XJI, образующейся в присутствии ПХ. Учитывая этот факт, нами была предпринята попытка оценить усиливающую способность ФТПС в отношении анионных пероксидаз, выделенных из сои (ПС) и батата (ПБ). Так как ПБ, в отличие от

ЙОзЫа

Рисунок 1. Химическая структура патриевой соли 3-(10'-фепотиази-нил)-пропан-1-сульфа-ната (ФТПС).

ПС, коммерчески недоступна, то предварительно этот фермент был нами выделен в препаративных количествах из кожуры клубней батата.

Первоначальная оценка усиливающего эффекта ФТПС проводилась в условиях, ранее описанных в литературе как наиболее благоприятные для каталитического соокисления люминола и ФТПС под действием ПХ. Как видно на рисунке 2, добавление ФТПС в субстратную смесь значительно увеличивало интенсивность регистрируемой хемшпоминесценции, продуцируемой как ПС, так и ПБ. Усиливающий эффект ФТПС, рассчитанный при концентрации ферментов, равной 30 пМ, в случае ПС и ПБ составил 37 и 25 раз, соответственно.

[ПБ], пМ

Рисунок 2. Зависимость интенсивности хемилюмииесценции от концентрации анионных перокендаз сои (А) и батата (Б) в отсутствие (а) и в присутствии (б) ФТПС. Экспериментальные условия: [ФТПС] = 0.75 мМ; [люминол] = 1.25 мМ; [Н2О2] = 2.5 мМ; 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.6.

Конечно, эти величины не так значительны, как величины усиления, обнаруженные ранее для усилителей ПХ, которые в некоторых случаях достигали 1000 раз. Однако неверно было бы уделять этой разнице слишком большое значение. Это связано с тем, что в отсутствие усилителей в субстратной смеси ПС и ПБ являются значительно более активными биокатализаторами по отношению к люминолу, чем ПХ. Более того, первичная оценка усиливающего действия ФТПС была проведена при условиях, благоприятных для катализа ПХ. В целом, значения интенсивности свечения (рисунок 2), полученные в ходе этих предварительных экспериментов,

однозначно свидетельствуют о том, что в лице ФТПС был обнаружен эффективный усилитель ХЛС, катализируемого ПС и ПБ. Здесь следует подчеркнуть, что ФТПС является первым обнаруженным усилителем анионных пероксидаз.

Из литературных данных хорошо известно, что субстратная специфичность и рН-стабильность ПХ и анионных пероксидаз сильно отличаются между собой. Из этого следует, что условия для наиболее продуктивного каталитического соокисления люминола и ФТПС в присутствии ПС, ПБ и ПХ могут быть различными. Таким образом, нами была поставлена задача оптимизировать условия реакции соокисления люминола и ФТПС пероксидом водорода, катализируемой ПС и ПБ.

При поиске наиболее благоприятных условий для катализа ПС в субстратной смеси варьировались концентрации люминола, пероксида водорода, триса, ФТПС, а также значение рН реакционной среды. В качестве параметра слежения было использовано отношение ХЛС, образующегося в присутствии ПС (ХЛСпс), к фоновой интенсивности ХЛС, полученного в отсутствие фермента (ХЛСФ). Данное отношение было использовано нами, так как именно этот параметр является определяющим для оценки предела обнаружения любой детектирующей ферментной системы. В результате оптимизации наиболее благоприятные условия в случае использования ПС в качестве катализатора соокисления люминола и ФТПС пероксидом водорода оказались: 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3, содержащий 0.75 мМ люминола, 0.5 мМ Н202 и 1 мМ ФТПС. По той же методике были оптимизированы условия соокисления люминола и ФТПС пероксидом водорода, катализируемого и ПБ: 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3, содержащий 0.75 мМ люминола, 0.1 мМ Нг02 и 1 мМ ФТПС.

Таким образом, наиболее благоприятные условия, определенные для ПС и ПБ, в значительной степени отличались от условий проведения аналогичной реакции, катализируемой ПХ (100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.6, 1.25 мМ люминола, 2.5 мМ Н2О2, 0.75 мМ ФТПС), что с нашей точки зрения объясняется различием каталитических свойств катионных и анионных пероксидаз. Кроме того, условия, определенные для ПБ, были практически идентичны, за исключением более низкой концентрации Н202, условиям, определенным для ПС. Причина более низкой концентрации Н2О2, по-видимому, связана с меньшей стабильностью ПБ по отношению к пероксиду водорода, который является суицидным субстратом пероксидаз. Оптимизация экспериментальных условий проведения реакции ферментативного соокисления люминола и ФТПС в присутствии пероксидаз позволила повысить

величину усиливающего эффекта ФТПС для ПС и ГШ до 240 и 139 раз, соответственно.

Как хорошо известно, одним из важнейших аналитических параметров любой детектирующей системы является значение предела обнаружения (ПО) анализируемого вещества. Поэтому были изучены зависимости интенсивности свечения от концентраций ПХ, ПС и ПБ, полученные при условиях, благоприятных для каждого из ферментов. Из полученных данных были рассчитаны значения ПО для каждой пероксидазы (таблица 1). Данный расчет основывался на определении, что величина ПО равна концентрации фермента, при которой регистрируется интенсивность хемилкшинесценции, превышающая интенсивность фоновой (неферментативной) реакции на удвоенное значение стандартного отклонения.

Таблица 1. Сравнение систем усиления хемшиоминесценции.

Экспериментальные условия: для ПХ: [люминол] = 1.0 мМ; [Н202] = 2.0 мМ; [4-йодофенол]= 2.0 мМ; 100 мМ трис-буферный раствор, рН 8.5;

для ПС: [люминол] = 0.75 мМ; [Н202] = 0.5 мМ; [ФТПС]= 1.0 мМ; 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3;

для ПБ: [люминол] = 0.75 мМ; [Н202] = 0.1 мМ; [ФТПС]= 1.0 мМ; 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3.

В эксперименте, где в качестве катализатора и усилителя были применены ПХ и 4-йодофенол (4-ИФ) значение ПО оказалось равным 0.9 пМ. В отличие от ПХ, в случае ПС значение ПО было равно 0.16 пМ, т.е. ПО был ниже более чем в 5 раз. При использовании ПБ в качестве биокатализатора реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствии ФТПС, проведенной при оптимальных условиях, ПО был равен 0.5 пМ. Полученное значение ПО было несколько выше, чем ПО для ПС в присутствии ФТПС, но ниже, чем ПО для ПХ в присутствии 4-йодофенола. Таким образом, применение детектирующей системы на основе анионных пероксидаз и усилителя ФТПС привело к понижению значения предела обнаружения по сравнению с традиционно используемой системой усиленной хемилюминесценции.

Пероксидаза Предел обнаружения пероксидазы, пМ

Сои 0.16

Батата 0.50

Хрена 0.90

Как сообщалось ранее, одним из преимуществ анионных пероксидаз перед ПХ является их практически неизменный во времени ХЛС. Эти исследования проводились без добавления в реакционную среду каких-либо усилителей, так как в то время не было известно ни одного усилителя анионных пероксидаз. Как можно видеть на рисунке 3, максимальная интенсивность свечения, образующаяся в присутствии ФТПС, как в случае ПБ (кривая а), так и в случае ПС (кривая б) достигалась через 5 минут после начала реакции, а затем очень медленно спадала. Нельзя не заметить, что значение интенсивности ХЛС, продуцируемого ПС, было более чем в 3 раза выше ХЛС, продуцируемого ПБ. По-видимому, этот факт связан с различным составом субстратных смесей для исследуемых пероксидаз. Как уже отмечалось выше, концентрация пероксида водорода в составе субстратной смеси, используемой для анализа ПС, в 5 раз выше концентрации Н2О2, входящего в состав субстратной смеси ПБ, что и приводило к более интенсивному ферментативному соокислению люминола и ФТПС, катализируемому ПС.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что ФТПС является эффективным усилителем хемилюминесценции, продуцируемой как минимум двумя анионными пероксидазами, и остававшейся стабильной в течение длительного промежутка времени. Учитывая информацию, что ФТПС усиливает ХЛС, продуцируемый также и катионной ПХ, можно предположить, что ФТПС будет проявлять свои усиливающие качества и в случаях применения других пероксидаз растений.

Рисунок 3. Кинетика интенсивности ХЛС, образующегося в процессе соокисления люмниола и ФТПС в присутствии пероксидаз батата (а) и СОИ (&). Экспериментальные условия: [ПБ] = [ПС] = 30 пМ; [люминол] = 0.75 мМ; [ФТПС] = 1.0 мМ; 50 мМ трис-буферньш раствор, рН 8.3;

(а): [НА] = 0.1 мМ;

(б): [Н202] = 0.5 мМ.

Время,сек

В связи с тем, что из анионных пероксидаз только ПС является коммерчески доступной, все последующие исследования проводились исключительно с ПС. Принятое решение также подкреплялось полученными данными о том, что интенсивность продуцируемого ХЛС и чувствительность

-т—^—£—I—

•—■б

О ЗОО 600 900 1200 1500

определения пероксидазной активности выше в присутствии ПС, чем в присутствии ПБ.

II. Сравнение производных фенотиазина как усилителей пероксидаза-зависимой хемилюмнпесценцнн.

Обнаруженный нами эффект усиления хемилюминесценции под действием ФТПС в присутствии анионных пероксидаз стимулировал проведение сравнительного изучения производных фенотиазина, содержащих различные заместители, как потенциальных усилителей пероксидаза-зависимой ХЛ. Для сравнения были выбраны следующие доступные нам производные фенотиазина: дипразин, хлорацизин, нонахлазин, этацизин, перфеназин, (3-(10'-фенотиазинил)-пропионовая кислота (ФПК) и 3-(10'-(2'-хлор)-фенотиазинил)-пропионовая кислота (ХФПЬС). Химические формулы исследуемых производных фенотиазина приведены на рисунке 4. В контрольных экспериментах была использована ФТПС (рисунок 1).

Ц^СН) сц

Дипразин Хлорацизин

„ 1 ^н.

о=с—сн,—сн,—¡г? * ' сгн,

л

I I 0=С-СН,—СН,—< " " 0=С—СН,—СН;—___^ С2На

■о-с,н,

Нонахлазин

Этацизин

X та—

Перфеназин

АА^а кЛЛ^

ш I 1

СНгСНгСООН сн,-сн2-соон

3-(10'-(2'-хлор)-фенотиазинил)- З-(Ю'-фенотиазинил)-

пропионовая кислота (ХФПК) пропионовая кислота (ФПК)

Рисунок 4. Структурные формулы производных фенотиазина.

Все эксперименты по оценке усиливающего эффекта фенотиазинов проводились в одинаковых условиях, а именно в условиях, благоприятных для ферментативного окисления люминола, катализируемого ПС. Как видно из данных таблицы 2, практически все производные фенотиазина с положительно заряженными ионогенными группами (дипразин, хлорацизин, нонахлазин, этацизин) обладали отрицательным усиливающим эффектом, т.е. являлись не усилителями свечения, а его тушителями. Из этой группы веществ лишь перфеназин проявлял свойства усилителя пероксидаза-зависимой

хемилюминесценции, однако величина усиливающего эффекта этого вещества была крайне низка. С другой стороны, присутствие в субстратной смеси производных фенотиазина с отрицательно заряженными ионогенными группами в значительной степени повышало интенсивность

хемилюминесценции.

Таблица 2. Влияние производных фенотиазина на величину усиливающего эффекта хемилюминесценции, производимой при окислении люмпнола в присутствии псроксидазы сои.

Экспериментальные условия: 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3; [люминол] = 0.75 мМ; [Н202] = 0.5 мМ; [ПС] = 30 пМ.

Производное фенотиазина Концентрация производного фенотиазина, мМ Эффект усиления

А. с положительно заряженными ионогенными группами

Дипразин 0.2 0.45 ±0.06

Хлорацизин 0.2 0.35 ± 0.02

Нонахлазин 0.2 0.20 ±0.02

Этацизин 0.2 0.19 ±0.01

Перфеназин 0.2 5.52 ±0.32

Б. с отрицательно заряженными ионогенными группами

ФПК 1.0 237 ±5

ХФПК 1.0 76 ±5

ФТПС 0.2 159 ± 9

1.0 240 ±13

Таким образом, максимальным усиливающим эффектом обладали ФПК и ФТПС, которые содержат в своей структуре отрицательно заряженные (в условиях эксперимента) карбоксильную группу и сульфогруппу, соответственно, присоединенные к фенотиазиновому ядру через К-пропильную группировку.

-И -

Последующие эксперименты проводились с использованием ФТПС в качестве усилителя ХЛС, продуцируемого ПС.

III. Вторичное усиление пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.

Как отмечено ранее в литературе, некоторые производные пиридина такие как 4-диметиламинопиридин (ДМАП), 4-морфолинопиридин (МП) и 4-пирролидинопиридин (ПирП) (рисунок 5), не влияя на реакцию окисления люминола, катализируемую ПХ, в присутствии ФТПС, повышали усиливающий эффект данного усилителя. Эти вещества были названы вторичными усилителями. Помня об отмеченном феномене, влияние ДМАП, МП и ПирП на образование ХЛС при соокислении люминола и ФТПС в присутствии ПС было исследовано.

N NN

ДМАП МП ПирП

Рисунок 5. Структурные формулы

4-диметиламинопиридина, 4-морфолинопиридина и 4-нирролидинопиридина,

Рисунок 6. Зависимость значения ХЛС, продуцируемого ПС при соокислении люминола и ФТПС, (А) и отношения ХЛСпс/ХЛС® (Б) от состава и кислотности среды. Экспериментальные условия: [ПС] = 30 пМ; [люминол] = 0.75 мМ; [Н202] = 0.5 мМ; [ФТПС]= 1.0 мМ; [МП] = [ДМАП] = [ПирП]= 1.5 мМ; [Н202] = 0.5 мМ; 50 мМ трис-буферный раствор.

Как видно из рисунка 6А, добавление в реакционную смесь, содержащую ФТПС, всех исследуемых вторичных усилителей приводило к повышению

значения ХЛС в 2-3 раза. В отсутствие ФТПС исследуемые вещества на ХЛС не влияли. При этом было найдено, что максимальным усиливающим действием при всех значениях рН реакционной среды обладал 4-морфолинопиридин. Кроме того, максимальное значение отношения ХЛСпС/ХЛСф (рисунок 6Б) также наблюдалось в случае введения МП в субстратную смесь. Дополнительным положительным свойством МП является то, что это вещество в отличие от ДМАП и ПирП нетоксично. Таким образом, в нашей дальнейшей экспериментальной работе МП использовался в качестве вторичного усилителя.

Сравнение кривых зависимости ХЛС от концентрации ПС в присутствии и отсутствие МП (рисунок 7А) показало, что добавление МП до концентрации 1 мМ приводило к повышению крутизны градуировочных кривых, а, следовательно, добавление этого соединения повышало чувствительность определения пероксидазной активности. При концентрациях МП выше 1 мМ все кривые были практически одинаковыми. Этот факт позволил нам выбрать концентрацию МП, равную 1 мМ, как наиболее благоприятную для использования в дальнейших экспериментах.

Рисунок 7. Зависимость (А) интенсивности ХЛС, катализируемого ПС, и (Б) предела обнаружения ПС от концентрации 4-морфолинопиридина (О (а), 0.5 (б), 1.0 (в), 2.0 (г), 3.0 (д) и 4.0 мМ (е)). Экспериментальные условия: [люминол] = 0.75 мМ; [Н2О2] = 0.5 мМ; [ФТПС] = 1.0 мМ; 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3.

Добавление МП в реакционную смесь (1 мМ) приводило к понижению значения ПО до 0.03 пМ (рисунок 7Б), т.е. МП, действуя как вторичный усилитель, уменьшал значение ПО дополнительно более чем в 5 раз.

Безусловно, добавление в субстратную смесь вторичного усилителя приводило к улучшению характеристик детектирующей системы. Однако с аналитической точки зрения также чрезвычайно важно, чтобы при этом сохранялась и стабильность ХЛС во времени. В этой связи нами была изучена

кинетика ХЛС, продуцируемого при соокислении люминола и ФТПС в присутствии МП как вторичного усилителя и ПС как биокатализатора этой реакции (рисунок 8). Процесс тушения ХЛС формально подчинялся уравнению реакции первого порядка с константами скорости тушения ХЛС в отсутствие и присутствии МП, равными 5.9 х 10"5 с"1 и 1.1 х 1СГ4 с"', соответственно. Хотя введение в реакционную среду дополнительно МП и приводило к 2-х-кратному увеличению скорости тушения ХЛС, все же абсолютная величина наблюдаемой константы тушения оставалась чрезвычайно низкой, и во временных пределах анализа (определение пероксидазной активности в тИФА и родственных методах) ХЛС можно считать практически неизменным.

Таким образом, проведенное

160000

di

tjf 120000 s

s 2 с;

s 2

(В

X

80000

40000-

н-

ФТПС+МП

ФТПС

300

Рисунок

600 900 1200 1500

Время, сек

8. Кинетические кривые ферментативной

реакции окисления люминола, катализируемой пероксндазой

сои. Экспериментальные условия: [ПС] = 30 пМ; [люминол] = 0.75 мМ; [Н202] = 0.5 мМ; [ФТПС]= 1.0 мМ; [МП] = 1.0 мМ; 50 мМ трис-буферный раствор, рН 8.3.

исследование продемонстрировало, что введение в субстратную смесь МП приводит к увеличению значения отношения ХЛСпс/ХЛСф до 700 раз. Кроме того, совместное использование ФТПС/МП, люминола и ПС позволяет иметь детектирующую систему со стабильным в течение длительного интервала времени ХЛС, предел обнаружения которой ниже аналогичного параметра, характерного для традиционной системы детекции на основе 4-йодофенола, люминола и ПХ, более чем в 30 раз. Все эти обнаруженные качества делают, с нашей точки зрения, исследуемую систему чрезвычайно перспективной для ее использования в различных форматах иммуно-ферментного анализа.

IV. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в сэндвич формате тИФА.

Для того, чтобы оценить возможности полученной нами детектирующей системы на основе ПС/ФТПС/МП, был разработан сэндвич формат тИФА для определения тиреоглобулина (ТГ) человека. Полученная хемилюминесцентная тест-система, после ее оптимизации, была сравнена с тест-системой с колориметрической детекцией для определения ТГ, ранее разработанной в

НИИ вакцин и сывороток имени Мечникова РАМН- Колориметрическая иммуноферментная тест-система (КОЛ-тИФА) имела в своем составе те же реагенты (поликлональные антитела против ТГ и ТГ человека), что и использованные нами в ХЛ-тИФА с применением ПС/ФТПС/МП. В колориметрической тест-системе использовался иммуноконъюгат ПХ с поликлональными антителами против ТГ (анти-ТГ-АТ-ПХ), пероксидазная активность которого определялась в реакции окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина. Анализ зависимости оптической плотности от концентрации определяемого ТГ в полулогарифмических координатах позволил рассчитать значение ПО, которое составило 2.0 нг/мл. В отличие от КОЛ-тИФА при детекции ТГ ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП предел обнаружения ТГ был в 10 раз ниже и равен 0.2 нг/мл (таблица 3).

Градуировочные кривые в линейных координатах дали возможность оценить линейный диапазон определяемых концентраций при сравнении двух тест-систем (таблица 3). Переход от КОЛ-тИФА к ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП позволил расширить линейный диапазон анализа ТГ с 2.0-340 нг/мл до 0.2-700 нг/мл.

Таблица 3. Сравнительная характеристика иммуноферментных тест-систем с различной детекцией пероксидазной активности, разработанных для определения тиреоглобулина человека.

Тест-система Аналитические характеристики тест-системы

ПО, нг/мл Линейный диапазон определяемых концентраций ТГ, нг/мл Коэффициент вариации, %

КОЛ-тИФА 2.0 2.0 - 340 0.04 - 3.6

ХЛ-тИФА-ПХ/4-ИФ 2.0 2.0 - 700 0.02 - 2.0

ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП 0.2 0.2 - 700 0.12-2.1

Для демонстрации преимуществ ХЛ детектирующей системы на основе ПС в ХЛ-тИФА нами было проведено сравнение аналитических параметров тест-систем для определения ТГ человека с применением ПС/ФТПС/МП и ПХ/4-ИФ. Детектирующая система на основе ПХ/4-ИФ была выбрана нами как наиболее чувствительная система (к началу проведения данной работы) и широко используемая в ХЛ-тИФА тест-системах.

Градуировочные кривые (в полулогарифмических (А) и линейных (Б) координатах) для определения ТГ ХЛ-тИФА с применением как анти-ТГ-АТ-ПХ конъюгата, так и анти-ТГ-АТ-ПС, представлены на рисунке 9. ХЛ-тИФА выполнялся в наиболее благоприятных условиях, найденных для каждого вида конъюгата. При использовании анти-ТГ-АТ-ПХ ПО (рисунок 9А) составил 2.0 нг/мл, что в 10 раз выше по сравнению с ПО, получаемым при использовании разработанной нами детектирующей системы (таблица 3). Кроме того, ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП обладал более высокой чувствительностью по сравнению с ХЛ-тИФА-ПХ/4-ИФ, что следует из большего значение тангенса угла наклона градуировочной кривой для тИФА с ПС/ФТПС/МП системой (рисунок 9).

Что касается линейного диапазона определяемых концентраций, то для ХЛ-тИФА-ПХ/4-ИФ можно отметить его сужение по сравнению с ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП до 2.0 - 700 нг/мл за счет увеличения значения нижней его границы (таблица 3).

Рисунок 9. Градуировочные кривые в полулогарифмических (А) и линейных (Б) координатах для определения ТГ ХЛ-тИФА с применением анти-ТГ-АТ, меченными ПС (/) и ПХ (2).

Таким образом, применение системы детекции, основанной на ПС/ФТПС/МП, в сэндвич формате ХЛ-тИФА, разработанном для определения ТГ человека, позволило на порядок понизить значение ПО и расширить линейный диапазон определяемых концентраций ТГ (таблица 3).

С одной стороны, тиреоглобулин человека был выбран нами как модельный объект для демонстрации преимуществ разработанной нами системы усиления ХЛС в сэндвич формате тИФА. С другой стороны, выбор ТГ в качестве антигена был не случаен, а обусловлен также и практической значимостью данного метода анализа.

Известно, что повышение уровня ТГ - неспецифический признак дисфункции щитовидной железы (в большинстве случаев доброкачественного характера), поэтому в лабораторной диагностике ТГ используется в качестве опухолевого маркера для наблюдения пациентов с диагнозом высокодифференцированного рака щитовидной железы. Выявление повышенной концентрации ТГ у таких пациентов до операции подтверждает способность опухоли продуцировать ТГ и целесообразность использования этого показателя для данного больного в послеоперационном мониторинге в качестве опухолевого маркера. Уровень ТГ быстро снижается после тиреоидэктомии и после постоперационного периода восстановления не должен присутствовать в крови. Поэтому любое появление ТГ в крови человека после проведения операции может сигнализировать о рецидиве рака щитовидной железы. Таким образом, чем чувствительнее будет метод определения ТГ, тем быстрее пациент будет подвержен повторному курсу лечения и тем больше будет вероятность положительного исхода лечения.

В настоящее время иммуноферментной тест-системой с наиболее чувствительной детекцией является коммерческий иммуноферментный набор 1ттиШе®, где ферментом-маркером является щелочная фосфатаза (ЩФ), активность которой определяется хемилюминесцентным методом. Данная тест-система позволяет определять ТГ в сыворотке человека на уровне 0.2 нг/мл, т.е. ее ПО равен ПО для ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП, разработанного в процессе выполнения данной работы.

В этой связи ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП был сравнен с набором 1тти1ке® для определения ТГ человека в образцах сывороток крови. Анализ с применением набора 1ттиШе , выполнялся в соответствии с инструкциями производителя. Используя ХЛ-тИФА-ПС/ФТПС/МП, нами были определены концентрации ТГ в тех же образцах сывороток крови (п=10), что были использованы и в работе с набором 1гпггш1ке®. Хорошая корреляция между данными, полученными при измерении ТГ с помощью ХЛ-тИФА с ПС и ЩФ (у = 1.15х + 2.88, 11=0.998), свидетельствует о достоверности результатов разработанного нами метода.

Суммируя полученные данные, следует подчеркнуть, что использование коммерчески доступного препарата анионной ПС в качестве метки в тИФА в комбинации с такими усилителями как ФТПС и МП позволило разработать высокочувствительный ХЛ-тИФА для определения ТГ в сыворотке крови человека, удовлетворяющий требованиям современной эндокринологии. Чувствительность разработанного метода была сопоставима с ЩФ-зависимым коммерческим набором. Однако принимая во внимание, что стабильность ПС значительно выше по сравнению со стабильностью ЩФ, а цена ее ниже,

использование ПС в качестве фермента-метки открывает широкие перспективы для ее использования в высокочувствительных ХЛ-тИФА (сэндвич формат) для определения самых различных веществ.

V. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-тИФА.

В предыдущем разделе на примере метода определения ТГ человека были продемонстрированы преимущества использования детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в сэндвич формате ХЛ-тИФА. Но, как известно, сэндвич формат позволяет анализировать только высокомолекулярные соединения в тИФА. Когда же речь идет о низкомолекулярных веществах, то необходимо использовать конкурентный формат тИФА. Поэтому далее мы продемонстрируем возможности изучаемой детектирующей системы в конкурентном формате ХЛ-тИФА на примере двух аналитов, присутствие которых требуется контролировать в пищевых продуктах, а именно охратоксина A (OTA) и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д).

V.l. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-тИФА для определения OTA.

Ранее нашими коллегами из Медицинского Университета г. Тайчунг (Тайвань) был разработан прямой конкурентный КОЛ-тИФА для определения OTA. При этом ферментом-маркером являлась ПХ. При создании ХЛ-тИФА на основе детектирующей системы ПС/ФТПС/МП нами использовались те же моноклональные антитела против OTA, что и антитела, использованные в КОЛ-тИФА.

Таблица 4. Сравнительная характеристика иммуноферментных тест-систем с различной детекцией пероксидазной активности, разработанных для определения ОТА.__

Тест-система Аналитические характеристики тест-системы

ПО, нг/мл IC50, нг/мл Линейный диапазон определяемых концентраций OTA, нг/мл Коэффициент вариации, %

КОЛ-тИФА 0.06 0.58 0.17-2.20 1.7-3.2

ХЛ-тИФА 0.02 0.08 0.02-0.30 8-14

Аналитические параметры этих двух тест-систем были сравнены между собой (таблица 4). Результаты свидетельствует о том, что при переходе от KOJI-тИФА к XJI-тИФА метод анализа OTA был существенно улучшен, что выразилось в том, что значения ПО и 1С50 стали значительно ниже, а линейный диапазон определяемых концентраций сместился в область меньших концентраций OTA.

При анализе количественного содержания OTA в экстрактах соевых бобов методом «введено-найдено» значения «открытия» лежали в интервале 72-125% (таблица 5). Полученный разброс значений «открытия» считается вполне допустимым при проведении тИФА.

Таблица 5. Анализ количественного содержания OTA в образцах экстрактов соевых бобов методом «введено-

найдено».

У.2. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-тИФА для определения 2,4-Д.

Применимость детектирующей системы ПС/ФТПС/МП была также оценена в конкурентном формате ХЛ-тИФА, разработанном для определения

2,4-Д. Данный метод позволил получить типичную для

конкурентного формата Б-образную градуировочную кривую (рисунок 10). Предел обнаружения 2,4-Д составил 1.5 нг/мл, в то время как рабочий диапазон лежал в интервале 6.5-545 нг/мл. Коэффициент вариации в этом случае не превышал 9%.

Разработка высокочувствительного ХЛ-тИФА для определения 2,4-Д являлась фрагментом российско-вьетнамского проекта, финансируемого РФФИ (08-03-90301-Вьет_а), где планировалось определение

Введенная концентрация OTA, нг/мл Определенная концентрация OTA, нг/мл Открытие, %

0.070 0.050 ±0.001 72 ±2

0.100 0.100 ±0.001 100 ± 1

0.150 0.187 ±0.007 125 ±4

Рисунок 10. График зависимости хемилюминесцентного сигнала от концентрации 2,4-Д, определенной ХЛ-тИФА на основе детектирующей системы ПС/ ФТПС/МП.

данного аналита в плодах цитрусовых. По этой причине образцы экстрактов кожуры апельсинов были получены и переданы нам сотрудниками института биотехнологии (г. Ханой, Вьетнам).

Применимость разработанного тИФА для количественного определения

2,4-Д в экстрактах кожуры апельсинов оценивали методом «введено-найдено».

Для этого в образцы экстрактов кожуры апельсинов, не содержащих 2,4-Д,

было введено точно известное количество пестицида и проведено определение

концентрации аналита. Результаты приведены в таблице 6. Высокая степень

т е ' £ I «открытия» указывает на

Таблица 6. Анализ количественного

содержания 2,4-Д в образцах экстрактов отсутствие эффекта матрикса кожуры апельсинов методом «введено- и' следовательно, на найдено». применимость разработанного

метода для определения 2,4-Д в образцах экстрактов кожуры апельсинов.

Разработанный ХЛ-

тИФА был применен для

проведения количественного

определения содержания 2,4-

Д в 14 образцах экстрактов

кожуры апельсинов. В 5 из

них концентрация 2,4-Д была определена количественно (таблица 7). В

остальных образцах содержание 2,4-Д было столь высоким, что для ее

количественного определения требовалось дальнейшее разведение полученных

, _ „ , . образцов. Здесь следует отметить,

Таблица 7. Содержание 2,4-Д в г '

образцах экстрактов кожуры что во всех анализируемых образцах

апельсинов, определенное ХЛ-тИФА- Уровень 2,4-Д существенно ПС/ФТПС/МП. превышал ПДК (0.005 мг/кг).

Таким образом, на основе детектирующей системы

ПС/ФТПС/МП нами был разработан прямой конкурентный формат тИФА с хемилюминес-центной детекцией, позволяющий с высокой чувствительностью проводить определение 2,4-Д как в буферном растворе, так и в реальных образцах экстрактов кожуры апельсинов.

Введенная концентрация 2,4-Д, нг/мл Определенная концентрация 2,4-Д, нг/мл Открытие, %

10.0 10.4 ±0.2 104.0 ±1.8

100.0 92.0 ± 6.5 92.0 ± 7.0

300.0 299.0 ±22.5 99.0 ±7.5

Образец Обнаружено

нг/мл мг/кг

1 396.0 ± 24.0 0.079 ± 0.005

2 510.0 ± 10.0 0.102 ±0.002

3 517.0 ±19.0 0.103 ±0.004

4 521.5 ±4.5 0.104 ±0.001

5 522.0 ±20.0 0.104 ±0.004

Подводя итоги всего раздела, посвященного применению детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в ХЛ-тИФА, следует сказать, что внедрение разработанной нами системы детекции пероксидазнон активности как в сэндвич, так и в конкурентный форматы тИФА привело к очевидным улучшениям аналитических характеристик. Таким образом, для разработанной детектирующей системы открываются широкие перспективы ее применения в иммунофермеитных тест-системах с повышенной чувствительностью.

ВЫВОДЫ

1. Оценена способность различных производных фенотиазина усиливать интенсивность хемилюминесценции, образующейся в процессе ферментативного окисления люминола пероксидом водорода в присутствии пероксидазы сои. Показано, что соли 3-(10'-фенотиазинкл)-пропан-1 -сульфоната (ФТПС) и 3-(10'-фенотиазинил)-пропионата являются первыми усилителями люминол-зависимого хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами. Найдено, что эффективность производных фенотиазина как усилителей реакции усиленной хемилюминесценции напрямую зависит от их способности окисляться пероксидом водорода в присутствии пероксидаз.

2. Продемонстрировано, что ФТПС является эффективным усилителем люминол-зависимого хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами. В оптимизированных условиях каталитического соокисления люминола и ФТПС эффект усиления для пероксидаз сои и батата составил 240 и 139 раз, соответственно.

3. Обнаружено, что введение, помимо ФТПС, в субстратную смесь 4-диметиламинопиридина, 4-морфолинопиридина или 4-пирролидинопиридина приводит к дополнительному повышению интенсивности свечения, катализируемого пероксидазой сои, что позволяет позиционировать эти производные пиридина как вторичные усилители пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.

4. Продемонстрировано, что использование системы усиления, включающей ФТПС и 4-морфолинопиридин, позволило понизить предел обнаружения пероксидазы сои до 0.03 пМ. Полученная величина более чем в 30 раз ниже по сравнению с пределом обнаружения пероксидазы хрена в присутствии 4-йодофенола, традиционно используемого усилителя. Дополнительным преимуществом разработанной детектирующей системы является высокая стабильность в течение длительного периода времени хемилюминесцентного сигнала.

5. Оценена возможность системы усиления, включающей ФТПС и 4-морфолинопиридин, в сэндвич формате хеми люминесцентного иммуноферментного анализа на примере метода определения тиреоглобулина в сыворотке человека. Предел обнаружения и рабочий диапазон тест-системы с применением пероксидазы сои как маркерного фермента составили 0.2 нг/мл и 0.2-700 нг/мл, соответственно. Сравнение аналитических характеристик тест-систем с применением пероксидаз сои и хрена показали очевидные преимущества первого фермента. Разработанный метод анализа был успешно применен для определения тиреоглобулина в сыворотке человека.

6. С применением системы усиления, включающей пероксидазу сои, ФТПС и 4-морфолинопиридин, разработаны высокочувствительные конкурентные иммуноферментные тест-системы для определения охратоксина А и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Предел обнаружения и рабочий диапазон хемилюминесцентных тест-систем составили 0.02 нг/мл и 0.02-0.30 нг/мл для охратоксина А и 1.5 нг/мл и 6.5-545 нг/мл для 2,4-Д, соответственно. Разработанные тест-системы позволили успешно оценить содержание охратоксина А и 2,4-Д в образцах соевых бобов и апельсинов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1) М.М. Vdovenko. L. Delia Ciana, I.Yu. Sakharov. 3-(10'-Phenotbiazinyl)-propane-1-sulfonate is a potent enhancer of soybean peroxidase-induced chemiluminescence. Analytical Biochemistry, 2009, V. 392, P.54-58

2) M.M. Vdovenko, L. Delia Ciana, I.Yu. Sakharov. Enhanced chemiluminescence: a sensitive analytical system for detection of sweet potato peroxidase. Biotechnology Journal, 2010, V. 5, P.886-890

3) M.M. Vdovenko, A.V. Zubkov, G.I. Kuznetsova, L. Delia Ciana, N.S. Kuzmina, I.Yu. Sakharov. Development of ultrasensitive soybean peroxidase-based CL-ELISA for determination of human thyroglobulin. Journal of Immunological Methods, 2010, V. 362, P.127-130

4) F.-Y.Yu, M.M.Vdovenko, j.-J.Wang, I.Yu.Sakharov. Comparison of enzyme linked-immunosotbent assays with chemihiminescent and colorimetric detection for determination of ochratoxin A in food. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, V. 59, P.E09-813

5) М.М.Вдовенко, И.Ю. Сахаров. 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфонат - уникальный усилитель хемилюминесцентного сигнала, образующегося в процессе окисления люминола в присутствии пероксидазы сои. Материалы

докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 13-18 апреля, 2009, Москва, Россия, с.7

6) М.М.Вдовенко, А.В.Зубков, Г.И.Кузнецова, И.Ю.Сахаров, Н.С.Кузьмина. Определение тиреоглобулина в иммуноферментном анализе с системой усиленной хемилюминесценции при использовании пероксидазы сои. XIII Всероссийский научный форум с международным участием им. Акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Сант-Петербурге», 8-11 июня, 2009, Санкт-Петербург, Россия, с.472

7) М.М. Vdovenko. I.Yu. Sakharov. Novel potent enhancer of soybean peroxidese-induced chemiluminescence. International conference "BIOCATALYSIS-2009. Fundamentals and Applications", June 19-24, 2009, Arkhangelsk, Russia, P. 131

8) М.М.Вдовенко. Повышение чувствительности иммуноферментных тест-систем, основанное на применении реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой сои. Материалы III Научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии», 11-13 ноября, 2009, Москва, Россия, с.34-35

9) М.М. Vdovenko, L. Delia Ciana, I.Yu. Sakharov. Novel potent enhancer of soybean peroxidase-induced chemiluminescence. The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, January 19-20,2010, Tel Aviv, Israel, P.80

10) A.S.Stepanova, M.M. Vdovenko, Nguyen Van Cuong, S.A.Eremin, I.Yu.Sakharov. Chemiluminescent enzyme immunoassay for determination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, January 19-20,2010, Tel Aviv, Israel, P.118

11) M.M. Vdovenko, A.V. Zubkov, G.I. Kuznetsova, L. Delia Ciana, N.S. Kuzmina, I.Yu. Sakharov. Development of ultrasensitive chemiluminescent ELISA for determination of human thyroglobulin. 16th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, April 19-23, 2010, Lyon, France, P.18

12) L. Delia Ciana, M.M.Vdovenko. I.Yu. Sakharov, L. Covello, D. Foglietta. Ultrasensitive chemiluminescent systems for the detection of anionic peroxidases. XlVth Intern. Sym. on Luminescence Spectrometry, July 13-16,2010, Prague, Czech Republic, P. 103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФА - иммуноферментный анализ;

тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ;

ПХ - пероксидаза хрена;

ПС - пероксидаза сои; ПБ - пероксидаза батата;

ФТПС - натриевая соль 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната;

МП г 4-морфолинопиридин;

4-ИФ - 4-йодофенол;

ХЛС - хемшиоминесцентный сигнал;

ХЛ - хемшиоминесцентция;

КОЛ-тИФА - тИФА с колориметрической детекцией; ХЛ-тИФА - тИФА с хемилюминесцентной детекцией; ТГ - тиреоглобулин человека; ОТА - охратоксин А;

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;

анти-ТГ-АТ-ПХ - конъюгат поликлональных антител против ТГ с ПХ; анти-ТГ-АТ-ПС - конъюгат поликлональных антител против ТГ с ПС.

Подписано в печать:

22.02.2011

Заказ № 5026 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Вдовенко, Марина Михайловна

I. ВВЕДЕНИЕ.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Иммуноферментный метод анализа.

2.1.1. Классификация методов ИФА.

2.1.2. Аналитические характеристики иммуноанализа.

2.1.3. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток.

2.2 Пероксидазы.

2.2.1. Классификация и общая характеристика пероксидаз.

2.2.2. Структура пероксидаз.

2.2.3. Реакционный цикл пероксидаз.

2.2.4. Субстратная специфичность пероксидаз.

2.2.5. Методы регистрации ферментативной активности.

2.2.5.1. Реакция усиленной хемилюминесценции.

2.2.5.1.1. Механизм реакции усиленной хемилюминесценции.

2.2.5.1.2. Инактивация пероксидазы пероксидом водорода в ходе реакции хемилюминесцентного окисления люминола.

2.2.5.1.3. Анионные пероксидазы в реакции усиленной хемилюминесценции.

Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы исследований.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Колориметрическое определение активности пероксидазы.

3.2.2. Выделение пероксидазы батата.

3.2.3. Соокисление люминола пероксидом водорода в присутствии усилителей, катализируемое пероксндазой, с хемилюминесцентной детекцией.

3.2.4. Соокисление люминола, ФТПС и МП пероксидом водорода, катализируемое ПС, с хемилюминесцентной детекцией.

3.2.5. Изучение окисления производных фенотиазина.

3.2.6. Синтез коньюгатов пероксидаз сои и хрена с антителами кролика против тиреоглобулина человека.

3.2.7. Синтез коныогата охратоксина А с пероксидазой сои.

3.2.8. Синтез коньюгата пероксидазы сои с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

3.2.9. Пробоподготовка бобов сои для проведения ИФА для определения охратоксина А

3.2.10. Пробоподготовка реальных образцов для проведения ИФА для определения 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

3.2.11. Определение тиреоглобулина человека с помощью сэндвич формата ИФА с хемилюминесцентной и спектрофотометрической детекциями.

3.2.12. Определение охратоксина А с помощью конкурентного формата ИФА с хемилюминесцентной и спектрофотометрической детекциями.

3.2.13. Определение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты с помощью конкурентного формата ИФА с хемилюминесцентной детекцией.

3.2.14. Колориметрическая детекция пероксидазной активности коньюгата антител кролика к тиреоглобулину человека с пероксидазой хрена.

3.2.15. Колориметрическая детекция пероксидазной активности коньюгата охратоксина А с пероксидазой хрена.

3.2.16. Хемилюминесцентная детекция пероксидазной активности коньюгатов.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сулъфанат натрия - усилитель хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионной пероксидазой сои.

4.1.1. Оптимизация каталитического соокисления люминола и ФТПС пероксидазой сои в реакции усиленной хемилюминесценции.

4.2. ФТПС как усилитель хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой батата.

4.2.1. Применение ФТПС в реакции усиленной хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой батата.

4.2.1.1. Выделение пероксидазы батата.

4.2.1.2. Оптимизация каталитического соокисления люминола и ФТПС пероксидазой батата в реакции усиленной хемилюминесценции.

4.3. Сравнение производных фенотиазина как усилителей пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.

4.4. Вторичное усиление пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.

4.5. Применение ПС-зависимой РУХв ИФА.

4.5.1. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в сэндвич формате

4.5.1.1. Разработка сэндвич формата ИФА с хемилюминесцентной детекцией для определения тиреоглобулина человека.

4.5.1.2. Сравнение аналитических параметров ХЛ-ИФА с применением ПС/ФТПС/МП иКОЛ-ИФА.

4.5.1.3. Сравнение аналитических параметров XJI-ИФА с применением ПС/ФТПС/МП и ПХ/4-йодофенол.

4.5.1.4. Определение тиреоглобулина в сыворотке крови человека с помощью ХЛ-ИФ A-ПС/ФТПС/МП.

4.5.2. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-ИФ А.

4.5.2.1. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-ИФА для определения охратоксина А.

4.5.2.1.1. Оптимизация условий проведения ХЛ-ИФА-ПС/ФТПС/МП для определения OTA.

4.5.2.1.1.1. Выбор наиболее благоприятных концентраций анти-ОТА-мАТ и конъюгата ОТА-11С при использовании ХЛ-ИФ А-ПС/ФТПС/МП для определения OTA.

4.5.2.1.1.2. Выбор блокирующего раствора.

4.5.2.1.2. Сравнение аналитических параметров КОЛ-ИФА и.ХЛ-ИФА для определения OTA.

4.5.2.1.3. Эффект матрикса образцов экстрактов бобов сои.

4.5.2.2. Применение детектирующей системы ПС/ФТПС/МП в конкурентном формате ХЛ-ИФА для определения 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоты.

4.5.2.2.1. Оптимизация условий проведения ХЛ-ИФ А-ПС/ФТПС/МП для определения 2,4-Д.

4.5.2.2.1.1. Выбор наиболее благоприятных концентраций анти-2,4-Д-мАТ и конъюгата 2,4-Д-ПС в ХЛ-ИФ А-ПС/ФТПС/МП для определения 2,4-Д.

4.5.2.2.1.2. Варьирование концентрации твин-20 в реакционной среде на стадии конкуренции.

4.5.2.2.2. Анализ 2,4-Д в реальных образцах с помощью ХЛ-ИФА-ПС/ФТПС/МП.

4.5.2.2.2.1. Оценка эффекта матрикса образцов экстрактов кожуры апельсинов.Г.

4.5.2.2.2.2. Определение 2,4-Д в реальных образцах.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакция усиленной хемилюминесценции, катализируемая анионными пероксидазами растений, и ее применение в иммуноферментном анализе"

Иммуноферментный метод анализа (ИФА) в настоящее время является одним из самых распространенных аналитических методов анализа и используется в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, а также для контроля за состоянием окружающей среды. Это объясняется высокой аффинностью и уникальной специфичностью иммунохимической реакции между антигеном и антителом, а также высокой чувствительностью детекции ферментной метки.

На практике в современных условиях наиболее интенсивно применяется твердофазный вариант ИФА (тИФА). В настоящее время известно несколько форматов тИФА, последним этапом которых является определение каталитической активности фермента-метки. С этой целью в тИФА используют колориметрический, флуоресцентный или хемилюминесцентный методы детекции. Наиболее чувствительным является хемилюминесцентный метод детекции.

Традиционно в качестве фермента-метки используют коммерчески доступный катионный изофермент с пероксидазы хрена (ПХ). И в этом случае субстратом для хемилюминесцентной регистрации активности феремента является люминол. Так как каталитическая активность ПХ в отношении люминола крайне низка, требуется введение в реакционную среду дополнительных соединений, которые называются усилителями. Наиболее известным усилителем для ПХ является 4-йодофенол. Предел обнаружения ПХ при использовании такой реакции усиленной хемилюминесценции составляет 1.0 пМ [1]. Изучение кинетики данной ферментативной реакции показало, что ПХ продуцирует нестабильный аналитический сигнал [2, 3].

В последние годы был выделен ряд новых пероксидаз растений, которые относятся к группе анионных изопероксидаз. Такими ферментами являются пероксидазы пальмы, сои, чая, табака, батата, картофеля и г.д. [4-35]. В огличие от ПХ анионные пероксидазы в отсутствие усилителей продуцируют стабильный во времени аналитический сигнал [3, 36-38]. К сожалению, данная группа ферментов имеет недостаток, а именно: хемилюминесцентный сигнал, продуцируемый ими значительно ниже, чем при усиленной хемилюминесценции с применением ПХ, а введение в реакционную среду усилителей ПХ не дает значительного усиления хемилюминесценции [1, 3, 36, 39, 40]. Тем не менее, этот недостаток не помешал продемонстрировать преимущества использования пероксидазы сои (ПС) по сравнению с ПХ в тИФА с хемилюминесцентной детекцией (ХЛ-тИФА) на примере определения мыши и сульфаметоксипиридазина [41, 42]. Но когда появляется необходимость разрабатывать высокочувствительные иммуноферментные тест-системы, интенсивности хемилюминесцентного сигнала (ХЛС), продуцируемого анионными пероксидазами, может быть недостаточно. Поэтому встает вопрос о поиске эффективных усилителей для анионных пероксидаз, приводящих к высокому и стабильному аналитическому сигналу.

Недавно [43] было продемонстрировано, что одно из производных фенотиазина, а именно натриевая соль 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната (ФТПС), является перспективным усилителем ХЛ, катализируемой ПХ. Поэтому было решено оценить возможности производных фенотиазина в качестве усилителей ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами, и, в случае положительного результата, применить их при разработке высокочувствительных ХЛ тест-систем с использованием анионных пероксидаз в качестве фермента-метки. .

Задачами настоящей диссертационной работы являются:

• Оценить способность 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната натрия

ФТПС) в качестве усилителя ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами сои и батата;

• Сравнить ФТПС с другими производными фенотиазина как потенциальными усилителями ХЛС, продуцируемого ПС;

• Изучить влияние некоторых производных пиридина на усиливающую способность ФТПС;

• Оценить возможности детектирующей системы на основе ПС и ФТПС с 4морфолинопирйдргаШ"(МП)1з~сэндвич и конкурент1?ор^формагах ХЛ-тИФА.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Вдовенко, Марина Михайловна

V. выводы

1. Оценена способность различных производных фенотиазина усиливать интенсивность хемилюминесценции, образующейся в процессе ферментативного окисления люминола пероксидом водорода в присутствии пероксидазы сои. Показано, что соли 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната (ФТПС) и 3-(10'-фенотиазинил)-пропионата являются первыми усилителями люминол-зависимого хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами. Найдено, что эффективность производных фенотиазина как усилителей реакции усиленной хемилюминесценции напрямую зависит от их способности окисляться пероксидом водорода в присутствии пероксидаз.

2. Продемонстрировано, что ФТПС является эффективным усилителем люминол-зависимого хемилюминесцентного сигнала, продуцируемого анионными пероксидазами. В оптимизированных условиях каталитического соокисления люминола и ФТПС эффект усиления для пероксидаз сои и батата составил 240 и 139 раз, соответственно.

3. Обнаружено, что введение, помимо ФТПС, в субстратную смесь 4-диметиламинопиридина, 4-морфолинопиридина или 4-пирролидинопиридина приводит к дополнительному повышению интенсивности свечения, катализируемого пероксидазой сои, что позволяет позиционировать эти производные пиридина как вторичные усилители пероксидаза-зависимой хемилюминесценции.

4. Продемонстрировано, что использование системы усиления, включающей ФТПС и 4-морфолинопиридин, позволило понизить предел обнаружения пероксидазы сои до 0.03 пМ. Полученная величина более чем в 30 раз ниже по сравнению с пределом обнаружения пероксидазы хрена в присутствии 4-йодофенола, традиционно используемого усилителя. Дополнительным преимуществом разработанной детектирующей системы является высокая стабильность в течение длительного периода времени хемилюминесцентного сигнала.

5. Оценена возможность системы усиления, включающей ФТПС и 4-морфолинопиридин, в сэндвич формате хемилюминесцентного иммуноферментного анализа на примере метода определения тиреоглобулина в сыворотке человека. Предел обнаружения и рабочий диапазон тест-системы с применением пероксидазы сои как маркерного фермента составили 0.2 нг/мл и 0.2-700 нг/мл, соответственно. Сравнение аналитических характеристик тест-систем с применением пероксидаз сои и хрена показали очевидные преимущества первого фермента. Разработанный метод анализа был успешно применен для определения тиреоглобулина в сыворотке человека.

6. С применением системы усиления, включающей пероксидазу сои, ФТПС и 4-морфолинопиридин, разработаны высокочувствительные конкурентные иммуноферментные тест-системы для определения охратоксина А и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д). Предел обнаружения и рабочий диапазон хемилюминесцентных тест-систем составили 0.02 нг/мл и 0.02-0.30 нг/мл для охратоксина А и 1.5 нг/мл и 6.5-545 нг/мл для 2,4-Д, соответственно. Разработанные тест-системы позволили успешно оценить содержание охратоксина А и 2,4-Д в образцах соевых бобов и апельсинов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Вдовенко, Марина Михайловна, Москва

1. Сахаров И.Ю. (2004) Пероксидазы пальм. Биохимия. 69. 1013-1020.

2. Сахаров И.Ю. (2001) Пероксидаза из листьев африканской мясляничной пальмы дает стабильный хемилюминссцентный сигнал в процессе окисления люминола перекисью водорода. Биохимия. 66. 640-644.

3. Kim S.J., Shoda М. (1999) Purification and characterization of a novel peroxidase from Geotrichum candidum dec 1 involved in decolorization of dyes.Appl Environ Microbiol. 65. 10291035.

4. Thongsook Т., Barrett D.M. (2005) Purification and partial characterization of broccoli (Brassica oleracea Var. Italica) peroxidases. J Agric Food Chem. 53. 3206-3214.

5. Roberts E., Kutchan Т., Kolattukudy P.E. (1988) Potato Peroxidase. Plant Mol Biol. 11. 15-31.

6. Pomar M.F., Bernal A., Diaz J., Merino F. (1997) Purification, characterization a kinetic properties ofpepper fruit acidic peroxidase. Phytochemistry. 46. 1313-1317.

7. Duarte-Vazquez M.A., Whitaker J.R., Rojo-Dominguez A., Garcia-Almendarez B.E., Regalado C. (2003) Isolation and thermal characterization of an acidic isoperoxidase from turnip roots. J Agric Food Chem. 51. 5096-5102.

8. Schmitz N., Giles K.A., van Huystee R.B. (1989) Characterization of anionic soybean (Glycine max) seed coat peroxidase. Can J of Botany. 75. 1336-1341.

9. Brooks J.L. (1986) Oxidase reactions of tomato anionic peroxidase. Plant Physiol. 80. 130-133.

10. Mazza G., Welinder K.G. (1980) Covalent structure of turnip peroxidase 7. Cyanogen bromide fragments, complete structure and comparison to horseradish peroxidase C. Eur J Biochem. 108. 473-479.

11. Clemente E. (1998) Purification and thermostability of isoperoxidase from oranges. Phytochemistry. 49. 29-41.

12. McLcllan K.M., Robinson D.S. (1987) Purification and heat stability of Brussels sprout peroxidase isoenzymes. Food Chem. 23. 305-319.

13. Gazaryan I.G., Urmantseva V.V., Veryovkin A.N., Fechina V.A. (1991) Peroxidase Preparation FromMedicago SativaL-1 Cell Culture. 505-506.

14. Lagrimini L.M., Burkhart W., Moyer M., Rothstein S. (1987) Molecular cloning of complementary DNA encoding the lignin-forming peroxidase from tobacco: Molecular analysis and tissue-specific expression. Proc Natl Acad Sci USA. 84. 7542-7546.

15. Abeles F.B., Dunn L.J., Morgens P., Callahan A., Dinterman R.E., Schmidt J. (1988) Induction of 33-kD and 60-kD Peroxidases during Ethylene-Induced Senescence of Cucumber Cotyledons. Plant Physiol. 87. 609-615.

16. Anthon G.E., Barrett D.M. (2002) Kinetic parameters for the thermal inactivation of quality-related enzymes in carrots and potatoes. J Agric Food Chem. 50. 4119-4125.

17. Мухамеджанов Б.Г. (1983) Новые Источники Пероксидаз. Биология. 48. 14-17.

18. Lee M.Y., Choi Y., Pare J.H., Jang S.G., Kim S.S. ( 1991) Characteristics of One Cationic and Two Anionic Isoperoxidases From Korean-Radish Root. 159-168.

19. Halpin В., Pressey R., Jen J., Mondy N. (1989) Purification and characterization of peroxidase isoenzymes from green peas (Pisum sativum). J Food Sci. 54. 644.

20. Triplett B.A., Mellon J.E. (1992) Purification and characterization of anionic peroxidases from cotton (Gossypium hirsutum). Plant Sci. 81. 147-154.

21. Civello P.M., Martinez G.A., Chaves A.R., Anon M.C. (1995) Peroxidase from strawberry fruit (Fragaria ananassa-Duch)-partial-purification and determination of some properties. J Agric Food Chem. 43. 2596-2601.

22. Buffard D., Breda C., van Huystee R.B., Asemota O., Pierre M., Ha D.B., Esnault R. (1990) Molecular cloning of complementary DNAs encoding two cationic peroxidases from cultivated peanut cells. Proc Natl Acad Sci USA. 87. 8874-8878.

23. Kristensen B.K., Bloch H., Rasmussen S.K. (1999) Barley coleoptile peroxidases. Purification, molecular cloning, and induction by pathogens. Plant Physiol. 120. 501-512.

24. Ito H., Hiraoka N., Ohbayashi A., Ohashi Y. (1991) Purification and characterization of rice peroxidases. Agric Biol Chem. 55. 2445-2454.

25. Salcharov I.Y., Castillo Leon J., Areza J.C., Galaev I.Y. (2000) Purification and stability of peroxidase of African oil palm Elaies guineensis. Bioseparation. 9. 125-132.

26. Sakharov I.Y., Vesga Blanco M.K., Galaev I.Y., Sakharova I.V., Pletiushkina O.Yu. (2001) Peroxidase from leaves of royal palm tree Roystonea regia: purification and properties. Plant Science. 161. 853-860.

27. Castillo Leon J., Alpeeva I.S., Chubar T.A., Galaev I.Yu., Csoregi E., Sakharov I.Yu. (2002) Purification and substrate specificity of peroxidase from sweet potato tubers. Plant Science. 163. 1011-1019.

28. Rompel A., Albers M., Naseri J.I., Gerdemann C., Buldt-Karentzopoulos K., Jasper В., Krebs B. (2007) Purification, cloning and characterization of a novel peroxidase isozyme from sweet potatoes (Ipomoea batatas). Biochim Biophys Acta. 1774. 1422-1430.

29. Alpeeva I.S., Sakharov I.Y. (2005) Soybean peroxidase-catalyzed oxidation of luminol by hydrogen peroxide. J Agric Food Chem. 53. 5784-5788.

30. Алпеева И.С., Сахаров И.Ю. (2007) Окисление люминола, катализируемое пероксидазой, выделенной из листьев королевской пальмы. Прик биохимия и микробиол. 43. 31-35.

31. Alpeeva I.S., Sakharov I.Y. (2007) Luminol-hydrogen peroxide chemiluminescence produced by sweet potato peroxidase. Luminescence. 22. 92-96.

32. Akimoto K., Shinmen Y., Sumida M., Asami S., Amachi Т., Yoshizumi H., Saeki Y., Shimizu S., Yamada H. (1990) Luminol chemiluminescence reaction catalyzed by a microbial peroxidase. Anal Biochem. 189. 182-185.

33. Kim B.B., Pisarev V.V., Egorov A.M. (1991) A comparative study of peroxidases from horse radish and Arthromyces ramosus as labels in luminol-mediated chemiluminescent assays. Anal Biochem. 199. 1-6.

34. Sakharov I.Y., Alpeeva I.S., Efremov E.E. (2006) Use of soybean peroxidase in chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. J Agric Food Chem. 54. 1584-1587.

35. Marzocchi E., Grilli S„ Delia Ciana L, Prodi L., Mirasoli M., Roda A. (2008) Chemiluminescent detection systems of horseradish peroxidase employing nucleophilic acylation catalysts. Anal Biochem. 377. 189-194.

36. Swerdlow P.S., Finley D., Varshavsky A. (1986) Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal Biochem. 156. 147-153.

37. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M. (1991) Теория и практика иммуноферментного аиализа. Высш шк. 288

38. Casino P., Morais S., Puchades R., Maquieira A. (2001) Evaluation of enzyme-linked immunoassays for the determination of chloroacetanilides in water and soils. Environ Sci Technol. 35.4111-4119.

39. Xie C., Gao S., Guo Q., Xu K. (2010) Electrochemical sensor for 2,4-dichlorophenoxy acetic acid using molecularly imprinted polypyrrole membrane as recognition element. Microchim Acta. 169. 145-152.

40. Striley C.A.F., Biagini R.E., Mastin J.P., MacKenzie B.A., Robertson S.K. (1999) Development and validation of an ELISA for metolachlor mercapturate in urine. Anal Chim Acta. 399. 109-114.

41. Tessier D.M., Clark J.M. (1998) An enzyme immunoassay for mutagenic metabolites of the herbicide alachlor. Anal Chim Acta. 376. 103-112.

42. Sittampalam G.S., Smith W.C., Miyakawa T.W., Smith D.R., McMorris C. (1996) Application of experimental design techniques to optimize a competitive ELISA. J Immunol Methods. 190. 151161.

43. Золотов Ю.А., Дорохова E.H., Фадеева В.И. (2000) Основы аналитической химии. Общие вопросы. Методы разделения. Высш шк. 1. 359

44. Popelka S.R., Miller D.M., Holen J.T., Kelso D.M. (1981) Fluorescence polarization immunoassay. II. Analyzer for rapid, precise measurement of fluorescence polarization with use of disposable cuvettes. ClinChem. 27. 1198-1201.

45. Miles L.E., Hales C.N. (1968) Labelled antibodies and immunological assay systems. Nature. 219. 186-189.54. van Weemen B.K., Schuurs A. (1971) Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Letters. 15. 232-236.

46. Engvall E., Perlmann P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. hnmunochemistry. 8. 871-874.

47. Welinder K.G., Rusmussen S.K., Penel C., Greppin H. (1993) Structure and Evolution of Peroxidases. Plant Peroxidases Biochemistry and Physiology. 35-42.

48. Welinder K.G. Plant peroxidases. (1985) Their primary, secondary and tertiary structures, and relation to cytochrome с peroxidase. Eur J Biochem. 151. 497-504.

49. Ryan B.J., Carolan N., O'Fagain C. (2006) Horseradish and soybean peroxidases: comparable tools for alternative niches?. Trends Biotechnol. 24. 355-363.

50. Liu W., Cholli A.L., Nagarajan R., Kumar J., Tripathy S., Bruno F.F., Samuelson L. (1999) Enzymatically synthesized conducting polyaniline. J Am Chem Soc. 121. 71-78.

51. Pina D.G., Shnyrova A.V., Gavilanes F., Rodriguez A., Leal F., Roig M.G., Sakharov I.Yu., Zhadan G.G., Villar E., Shnyrov V.L. (2001) Thermally induced conformational changes in horseradish peroxidase. Eur J Biochem. 268. 120-126.

52. Chattopadhyay K., Mazumdar S. (2000) Structural and conformational stability of horseradish peroxidase: effect of temperature and pH. Biochemistry. 39. 263-270.

53. Березин И.И., Угарова H.H., Кершенгольц Б.М., Бровко Л.Ю. (1975) Влияние простетической группы пероксидазы хрена на стабильность фермента. Биохимия. 40. 297300.

54. Gillikin J.W., Graham J.S. (1991) Purification and Developmental Analysis of the Major Anionic Peroxidase from the Seed Coat of Glycine max. Plant Physiology. 96. 214-220.

55. McEldoon J.P. (1995) Substrate Specifity and Thermal stability of plant peroxidases. Ph.D. Thesis, University of Iowa. 154.

56. McEldoon J.P., Pokora A.R., Dordick J.S. (1995) Lignin peroxidase-type activity of soybean peroxidase. Enzyme microb technol. 17. 359-365.

57. Kamal J.K., Behere D.V. (2003) Activity, stability and conformational flexibility of seed coat soybean peroxidase. J Inorg Biochem. 94. 236-242.

58. Wright H., Nicell J.A. (1999) Characterization of soybean peroxidase for wastewater treatment. Bioresource Technology. 70. 69-79.

59. McEldoon J.P., Dordick J.S. (1996) Unusual thermal stability of soybean peroxidase. Biotechnol Prog. 12. 555-558.

60. Klibanov A.M., Berman Z., Alberti B.N. (1981) Preparative hydroxylation of aromatic compounds catalyzed by peroxidase. J Amer Chem Soc. 103. 6263-6264.

61. Schuller D.J., Ban N., van Huystee R.B., McPherson A., Poulos T.L. (1996) The crystal structure of peanut peroxidase. Structure. 4. 311-321.

62. Gajhede M., Schuller D.J., Henriksen A., Smith A.T., Poulos T.L. (1997) Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nat Struct Biol. 4. 1032-1038.

63. Henriksen A., Welinder K.G., Gajhede M. (1998) Structure of barley grain peroxidase refined at 1.9-A resolution. A plant peroxidase reversibly inactivated at neutral pH. J Biol Chem. 273. 22412248.

64. Mirza О., Henriksen A., Ostergaard L., Welinder K.G., Gajhede M. (2000) Arabidopsis thaliana peroxidase N: structure of a novel neutral peroxidase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 56. 372375.

65. Хушпульян Д.М. (2007) Рекомбинантная пероксидаза табака: получение и каталитические свойства. Дисс.к.х.н., МГУ. 127

66. Berglund G.I., Carlsson G.H., Smith A.T., Szoke H., Henriksen A., Hajdu J. (2002) The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. Nature. 417. 463-468.

67. Harris R.Z., Newmyer S.L., Ortiz de Montellano P.R. (1993) Horseradish peroxidase-catalyzed two-electron oxidations. Oxidation of iodide, thioanisoles, and phenols at distinct sites. J Biol Chem. 268. 1637-1645.

68. Rodriguez-Lopez J.N., Gilabert M.A., Tudela J., Thomeley R.N., Garcia-Canovas F. (2000) Reactivity of horseradish peroxidase compound II toward substrates: kinetic evidence for a two-step mechanism. Biochemistry. 39. 13201-13209.

69. Staffer В., Rasmussen C.B., Welinder K.G. (1991) Amino Acid Sequence of Acidic Horseradish Peroxidase HRP A. 43-48.

70. Cormier M.J., Prichard P.M. (1968) An investigation of the mechanifm of the luminescent peroxidation of luminol by stopped flow techniques. J Biol Chem. 243. 4706-4714.

71. Whitehead T.P., Thorpe G.H., Carter T.J.N., Groucutt C., Kricka L.J. (1983) Enhanced Luminescence Procedure for Sensitive Determination of Peroxidase-Labelled Conjugates in Immunoassays. Nature. 305. 158-159.

72. Thorpe G.H., Williams L.A., Kricka L.J., Whitehead T.P., Evans H., Stanworth D.R. (1985) A rapid luminescently monitored enzyme immunoassay for IgE. J Immunol Methods. 79. 57-63.

73. Sankolli G.M., Stott R.A., Thorpe G.H., Smith D., Rudd B.T., Kricka L.J. (1988) An enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay for serum oestradiol. Ann Clin Biochem. 25 ( Pt 3). 288292.

74. Thorpe G.H., Kricka L.J., Moseley S.B., Whitehead T.P. (1985) Phenols as enhancers of the chemiluminescent horseradish peroxidase-luminol-hydrogen peroxide reaction: application in luminescence-monitored enzyme immunoassays. Clin Chem. 31. 1335-1341.

75. Kuroda N., Nakashima K., Akiyama S., Shiraki H., Maeda Y. (1992) Photographic chemiluminescent ELISA for detection of anti-human T-cell leukemia virus type-I antibodies by using synthetic peptides as antigens. Clin Chim Acta. 211. 113-119.

76. Kricka L.J., Cooper M., Ji X. (1996) Synthesis and characterization of 4-iodophenylboronic acid: a new enhancer for the horseradish peroxidase-catalyzed chemiluminescent oxidation of luminol. Anal Biochem. 240. 119-125.

77. Kuroda N., Kawazoe K., Nakano H., Wada M., Nakashima K. (1999) New phenylboronic acid derivatives as enhancers of the luminol-H(2)0(2)-horseradish peroxidase chemiluminescence reaction. Luminescence. 14. 361-364.

78. Kuroda N., Shimoda R., Wada M., Nakashima K. (2000) Lophine derivatives and analogues as new phenolic enhancers for the luminol-hydrogen peroxide-horseradish peroxidase chemiluminescence system. Anal Chim Acta. 403. 131-136.

79. Lind J., Merenyi G., Eriksen Т.Е. (1983) Chemiluminescence mechanism of cyclic hydrazides such as luminol in aqueous solutions. J Amer Chem Soc. 105. 7655-7661.

80. Easton P.M., Simmonds A.C., Rakishev A., Egorov A.M., Candeas L.P. (1996) Quantitative Model of the Enhancement of Peroxidase-Induced Luminol Luminescence. J Amer Chem Soc. 118. 6619-6624.

81. Капелюх Ю.Л. (1998) Кинетика и механизм инактивации пероксидазы в хемилюминесцентной реакции окисления люминола в присутствии производных фенола. Дисс.к.х.н., МГУ. 74.

82. Вдовенко М.М., Ульрих Р., Хофрихтер М., Сахаров И.Ю. (2010) Окисление люминола пероксидом водорода с образованием хемилюминесцентного сигнала, катализируемое пероксигеназой гриба Agrocybe aegerita V.Brig. Прик биохимия и микробиол. 46. 73-77.

83. Hofiichter М., Ullrich R. (2006) Heme-thiolate haloperoxidases: versatile biocatalysts with biotechnological and environmental significance. Appl Microbiol Biotechnol. 71. 276-288.

84. Kluge M.G., Ullrich R., Scheibner К., Hofrichter M. (2007) Spectrophotometric assay for detection of aromatic hydroxylation catalyzed by fungal haloperoxidase-peroxygenase. Appl Microbiol Biotechnol. 75. 1473-1478.

85. Сахаров И.Ю. (2010) Использование новых пероксидаз растений в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией. Наука. 349-367.

86. Dzgoev A.B., Gazaryan I.G., Lagrimini L.M., Ramanathan К., Danielsson В. (1999) High-sensitivity assay for pesticide using a peroxidase as chemiluminescent label. Anal Chem. 71. 52585261.

87. Surugiu I., Ye L., Yilmaz E., Dzgoev A., Danielsson В., Mosbach К., Haupt К. (2000) An enzyme-linked molecularly imprinted sorbent assay. Analyst. 125. 13-16.

88. Boscolo В., Laurenti E., Ghibaudi E. (2006) ESR spectroscopy investigation of the denaturation process of soybean peroxidase induccd by guanidine hydrochloride, DMSO or heat. Protein J. 25. 379-390.

89. Kamal J.K., Behere D.V. (2002) Thermal and conformational stability of seed coat soybean peroxidase. Biochem. 41. 9034-9042.

90. Скоупс P. (1985) Методы очистки белков. Мир. 358.

91. Газарян И.Г., Решетникова И.А., Досеева И.И., Беккер Е.Г. (1995) Выделение и сравнительная характеристика пероксидаз гриба Phellinus-Igniarius (L.F.R) QueI-90-l и табака. Биохимия. 60. 1017-1022.

92. Остерман Л.А. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука. 536.

93. Goodwin D.C., Grover T.A., Aust S.D. (1996) Redox mediation in the peroxidase-catalyzed oxidation of aminopyrine: possible implications for drug-drug interactions. Chem Res Toxicol. 9. 476-483.

94. Iervasi A., Iervasi G., Bottoni A., Boni G., Annicchiarico C., Di Cecco P., Zucchelli G.C. (2004) Diagnostic performance of a new highly sensitive thyroglobulin immunoassay. J Endocrinol. 182. 287-294.

95. Iervasi A., Iervasi G., Carpi A., Zucchelli G.C. (2006) Serum thyroglobulin measurement: clinical background and main methodological aspects with clinical impact. Biomed Pharmacother. 60. 414-424.

96. Morgenthaler N.G., Froehlich J., Rendl J., Willnich M. Alonso C., Bergmann A., Reiners C. (2002) Technical evaluation of a new immunoradiometric and a new immunoluminometric assay for thyroglobulin. Clin Chem. 48. 1077-1083.

97. Zophel K., Wunderlich G., Smith B.R. (2003) Serum thyroglobulin measurements with a high sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay: is there a clinical benefit in patients with differentiated thyroid carcinoma?. Thyroid. 13. 861-865.

98. Marquette C.A., Blum L.J. (2006) Applications of the luminol chemiluminescent reaction in analytical chemistry. Anal Bioanal Chem. 385. 546-554.

99. Tsukagoshi K., Jinno N., Nakajima R. (2005) Development of a micro total analysis system incorporating chemiluminescence detection and application to detection of cancer markers. Anal Chem. 77. 1684-1688.

100. Fan A., Cao Z., Li H., Kai M., Lu J. (2009) Chemiluminescence platforms in immunoassay and DNA analyses. Anal Sci. 25. 587-597.

101. Schaap A.P., Akhavan H., Romano L.J. (1989) Chcmiluminescent substrates for alkaline phosphatase: application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA probes. Clin Chem. 35. 1863-1864.

102. Tsuji A., Maeda M., Arakawa H. (1989) Chcmiluminescent enzyme immunoassay, a review. Analyt Sci. 5. 497-506.

103. Dunford H.B. (1999) Heme Peroxidases. Wiley-VCH. 507.

104. Fosset M., Chappelet-Tordo D., Lazdunski M. (1974) Intestinal alkaline phosphatase. Physical properties and quaternary structure. Biochemistry. 13. 1783-1788.

105. Kricka L.J. (2003) Clinical applications of chemiluminescence. Anal Chim Acta. 500. 279286.

106. Cabanes F.J., Accensi F., Bragulat M.R., Abarca M.L., Castella G., Minguez S., Pons A. (2002) What is the source of ochratoxin A in wine?. Int J Food Microbiol. 79. 213-215.

107. Ochratoxin A (1993) IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 56. 489-521.

108. Battaglia R., Hatzold T., Kroes R. (1996) Occurrence and significance of ochratoxin A in food. Food Addit Contam. 13. 1-3.

109. Trucksess M.W., Giler J., Young K., White K.D., Page S.W. (1999) Determination and survey of ochratoxin A in wheat, barley, and coffee. J AOAC Int. 82. 85-89.

110. Jorgensen K. (1998) Survey of pork, poultry, coffee, beer and pulses for ochratoxin A. Food Addit Contam. 15. 550-554.

111. The evaluation of carcinogenic risks to human (1997) IARC Monographs. 56. 489-521.

112. European Commission. (2002). 18-20.

113. European Commission. (2005). 3-5.

114. Yu F.Y., Chi T.F., Liu B.H., Su C.C. (2005) Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of ochratoxin A. J Agric Food Chem. 53. 6947-6953.

115. Liu B.H., Tsao Z.J., Wang J.J., Yu F.Y. (2008) Development of a monoclonal antibody against ochratoxin A and its application in enzyme-linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip. Anal Chem. 80. 7029-7035.

116. Reinhard H., Zimmerli B. (1999) Reversed-phase liquid chromatographic behavior of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A. J Chromatogr A. 862. 147-159.

117. Romani S., Sacchetti G., Chaves Lopez C., Pinnavaia G.G., Dalla Rosa M. (2000) Screening on the occurrence of ochratoxin A in green coffee beans of different origins and types. J Agric Food Chem. 48. 3616-3619.

118. Гигиенические нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды. ГН 1.2.1323-03

119. Koester С.J., Simonich S.L., Esser В.К. (2003) Environmental Analysis. Anal Chem. 75. 2813-2829.

120. Vanderlaan M., Watkins B.E., Stankler L. (1988) Environmental monitoring by immunoassay. Environ. Sci Technol. 22. 247-253.

121. Clement R.E., Yang P.W., Koester C.J. (2001) Environmental Analysis. Anal Chem. 73. 27612790.

122. Mallat E., Barcelo D. (2001) Immunosensors for pesticide determination in natural waters. Trends Anal Chem. 20. 124-132.

123. Richardson S.D. (2003) Water Analysis: Emerging Contaminants and Current Issues. Anal Chem. 75.2831-2857.

124. Ahmed F.E. (2001) Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks. Trends Anal Chem. 20. 649-661.

125. Вдовенко M.M., Пенг Ч.Ф., Щу 4.JI., Вылегжанина Е.С., Комаров А.А., Сахаров И.Ю. , (2011) Иммуноферментный метод определения гексестрола в мясе животных. Прикбиохимия и микробиол. 47. 84-89.