Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакция нейронов спинального ганглия на стимулирование посттравматической регенерации нерва в раннем постнатальном периоде крысы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Реакция нейронов спинального ганглия на стимулирование посттравматической регенерации нерва в раннем постнатальном периоде крысы"

на правах рукописи

Нигметзянова Мария Владимировна

РЕАКЦИЯ НЕЙРОНОВ СПИНАЛЬНОГО ГАНГЛИЯ НА СТИМУЛИРОВАНИЕ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ НЕРВА В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЫЮМ ПЕРИОДЕ КРЫСЫ

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗ159НОг

Москва-2007

003159687

Работа выполнена в Государственном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Чельпнев Юрий Александрович Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор Швалев Вадим Николаевич доктор биологических наук, профессор Викторов Илья Васильевич

Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «"^Г<< О^Г-яЗ/?-* » 2007 г в ^^ час, на заседании диссертационного совета Д 212.203 08 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан «¿Й> 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета,

/а

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Массовая физиологическая гибель нейронов протекает в нейроонтогенезе при формировании нервных связей (Oppenheim, 1991) Она реализуется путем апоптоза, строго регулируемой формы активной клеточной гибели (Kerr, 1972). При повреждении нейроны также вступают в anomœ (Beikelaar et al, 1994; Garcia-Valenzuela et al, 1994) Выявлены принципиальные различия в регуляции физиологической и посттравматической гибели чувствительных нейронов В эмбриональном периоде циклин-зависимая киназа участвует в регуляции пролиферации и цитодифференцировки, а также стимулирует апоптоз нейронов (Nguyen et ai, 2002) У половозрелой крысы эта киназа находится в неактивном состоянии и активируется только при дегенерации нейронов Рост аксонов в нейрогенезе и после травматического повреждения нейронов контролируют различные сигнальные молекулы Дефицит ключевых молекул, таких как мшоген-акгавируемая киназа (МЕК) и фосфатидилино-зитол-3-киназа (PI3-K), блокирует удлинение отростков чувствительных нейронов в эмбриональном периоде, но не влияет на их постгравматическое удлинение у половозрелой крысы (Lui, Snider, 2001) Угнетение экспрессии ассоциированной с рецепторами цитокинов тирозинкиназы JAK в эмбриональном периоде не влияет на аксоноге-нез чувствительных нейронов, в то время как у половозрелой крысы ее дефицит останавливает регенераторный рост аксона Несмотря на наличие сведений о молекулярных основах различных реакций чувствительных нейронов в раннем развитии и в половозрелом организме, сравнительные феноменологические данные о поведении этих нейронов на разных этапах онтогенеза явно недостаточны Отсутствует сравнительная оценка выраженности большинства морфогенетичео^их процессов, таких как выживание нейронов конкретных популяций, рост аксонов и формирование связей с иннер-вируемой тканью-мишенью

Данные о реакции чувствительных нейронов на травму в раннем постнатальном периоде недостаточны и противоречивы Перерезка периферического нерва на Р0 приводит к гибели 54% чувствительных нейронов к 15-м суткам после травмы (Hirnes, Tessler, 1989) В спинальных ганглиях через 7 суток после перерезки периферического отростка у новорожденных крысят погибает более 70% нейронов (Lewis et al, 1999) В аналогичных условиях у половозрелой крысы погибает 37% нейронов (Tandrup et al, 2000) У половозрелой крысы к 30 суткам после лигирования седалищного нерва погибает до 30% нейронов спинальных ганглиев L4-L5 (Ратинов и др, 2001) Воздействие радиационного излучения (Tongetal ,1997), капсаицина (Winter et al, 1993) или вирусной инфекции (Griffin et al, 1997) вызывает выраженную гибель нейронов в спинальном ганглии новорожденных крысят Чувствительные нейроны у половозрелой крысы, напротив, намного более устойчивы к подобным воздействиям Ни передавливание периферического отростка (Swettetal, 1995, Lekanetal, 1997), ни недостаток фактора роста нервов in vivo и in vitro (Johnson et al, 1980) не приводят к значительной гибели чувствительных нейронов у половозрелой крысы. По мнению Lewis et al (1999), эта различия являют следствием дифференциальной активности генов на разных стадиях онтогенеза. У половозрелых животных количество нейронов спинального ганглия, вступающих в апоптоз после повреждения периферического отростка, зависит от их принадлежности к конкретной популяции (Tandrup et al, 2000, Ратинов, Челышев, 2003) Раньше и в наибольшем количестве пога-

бают малые нейроны с темным перикарионом и безмиелиновым отростком (В-клетки) и в меньшей мере большие нейроны со светлым перикарионом и миелинизированным отростком (А-клетки) У новорождённых крысят при воспалении седалищного нерва раньше других погибают малые непептидергические нейроны (Ве1апс1,2001) Остается неясной реакция чувствительных нейронов конкретных популяций на травму периферического отростка в раннем постнатальном периоде

Важное практическое значение для восстановления нервных связей имеют фармакологические стимуляторы регенерации Одним из таких стимуляторов является производное пиримидина лекарственный препарат ксимедон (1,2-дигидро-4,6-даметал.-МЧР-оксдатил) пиримидон-2) Он поддерживает посправматическое выживание чувствительных нейронов, преимущественно связывающихся с изолектином В4 (1В4+-нейроны), стимулируя в них экспрессию антиапоптозного белка Вс1-2 (Ратинов и др, 1997) Этот эффект сопровождается усилением регенерации и ранним восстановлением контактов нейронов с клетками-мишенями у половозрелых животных Однако остается неясным, влияют ли нейропротекторы и, в частности, ксимедон на выживание нейронов в раннем постнатальном периоде в ходе выраженной физиологической гибели чувствительных нейронов Изучение механизмов действия нейропро-текторов и потенциальных стимуляторов регенерации нервных волокон является актуальной практической задачей для предотвращения процесса нейродегенерации, в том числе постгравматической и постишемической гибели нейронов В последнее время особенно актуальным становится поиск новых эффективных цйгопротекторов стволовых и прогениторных нейральных клеток с целью увеличения сроков их выживания при клеточной терапии

Цель и задачи исследования. Цель работы — оценка в раннем постнатальном периоде влияния стимулятора нейрорегенерации ксимедона на физиологическую и посттравматическую гибель чувствительных нейронов, а также на эффективность постгравматической регенерации их периферических отростков

В работе были поставлены следующие задачи

1 В спинальном ганглии Ь5 крысы оценить динамику общего количества нейронов, количества малых, средних и больших нейронов, ]ЖЮ0+-, 1В4+- и каспаза-9+-нейронов, а также количества миелиновых волокон в седалищном нерве в раннем постнатальном периоде

2 Исследовать влияние травмы периферического нерва на выживание нейронов спи-напьного ганглия Ь5 в раннем постнатальном периоде

3 Оценить в раннем постнатальном периоде влияние стимулятора нейрорегенерации ксимедона на эффективность посттравматической регенерации нейронов спинального ганглия Ь5 и седалищного нерва

Научная новизна исследования. Впервые в раннем постнатальном периоде крысы показано изменение количества нейронов спинального ганглия, принадлежащих конкретным популяциям Получены данные о том, что ксимедон не только сдерживает физиологическую гибель нейронов спинального ганглия Ь5 в раннем постнатальном периоде, но и избирательно влияет на различные популяции чувствительных нейронов Впервые установлено, что выраженность постгравматической гибели чувствительных нейронов этих популяций у новорожденных крысят и половозрелых животных различаются В раннем постнатальном периоде 1В4+-нейроны более устой-

чивы к травме периферического отростка. Впервые показано, что М^ОО^-нейроны раньше других реагируют на введение ксимедона в период от рождения до половой зрелости, а также на травму в раннем постнатальном периоде на фоне введения ксимедона. Получены новые данные о различной динамике численности нейронов конкретных популяций в ходе посттравматической регенерации периферических отростков в раннем постнатальном периоде Ранее других на травму периферического отростка реагируют малые нейроны Цри этом гибель этих нейронов выражена в меньшей мере, по сравнению с нейронами других популяций в спинальном ганглии. Получены новые данные о том, что в раннем постнатальном периоде ксимедон не только сдерживает посттравматическую гибель чувствительных нейронов, но и стимулирует регенерацию миелиновых волокон периферического нерва и восстановление чувствительной функции

Научно-практическая значимость. Полученные результаты значимы для понимания механизмов пластичности периферических нейронов в раннем постнатальном периоде и в условиях их постгравматической регенерации, зависимости их выживания и фенотипа от нейротрофических сигналов Полученные данные о динамике по-справмахической гибели нейронов спинального ганглия позволяют оценить перспективы полноты восстановления сенсорной функции периферического нерва в клинической практике Результаты исследований, свидетельствующие о различной степени выживания №200+- и Ш4+-нейронов как в нейроонтогенезе, так и при травме периферического отростка, имеют практическое значение для прогноза восстановления функции афферентных волокон различной сенсорной модальности (болевая, температурная, тактильная чувствительность, проприорецешщя) Данные о влиянии ксимедона не только на сформированную, но и на развивающуюся периферическую нервную систему позволят глубже понять механизм действия данного препарата и его значение, как эффективного нейропротектора при нейродегенеративных заболеваниях, ней-ротравмах и ишемии мозга. Полученные результаты о влиянии ксимедона на по-сттравматаческое выживание чувствительных нейронов обосновывают применение фармакологических нейропротекторов и стимуляторов регенерации при культивировании нейралытых клеток Представляется особенно перспективным их применение для поддержания выживания и дифференцировки стволовых и прогениторных ней-ральных клеток при их трансплантации с целью стимулирования процесса нейрореге-нерации

Положения, выносимые на защиту:

1 В раннем постнатальном периоде при травме периферического отростка Ш4+-нейроны спинального ганглия проявляют наибольшую пластичность

2 Стимулятор постгравматической регенерации нервных волокон производное пиримидина ксимедон сдерживает физиологическую гибель чувствительных нейронов в раннем постнатальном периоде

Апробация работы. Материалы работы доложены на международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), X Всероссийской научно-пракгаческой конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005), П Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов (Ижевск, 2005), 4-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле» (2005), 8-м Европейском конгрессе по неврологии (Амстердам, 2005), 5-м междуна-

родном симпозиуме экспериментальной и клинической нейробиологии (Стара Лесна, Словакия, 2005), 9-м конгрессе Европейской Федерации Неврологических Обществ (EFNS) (Афины, 2005), ХП Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), 5-м Европейском форуме неврологии (FENS) (Вена, 2006), 10-м конгрессе Европейской Федерации Неврологических Обществ (EFNS) (Глазго, 2006), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы морфологии» (Минск, 2006), ХП Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в мед ицине» (Казань, 2007), 11-м конгрессе Европейской Федерации Неврологических Обществ (EFNS) (Брюссель, 2007)

Публикации, По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 337 источник. Работа изложена на 134 странице машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 13 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для характеристики нейронов спинального ганглия L5 интактного животного в процессе раннего постнатального развития использованы белые беспородные крысы различного возраста и пола от новорожденных (Р0) до половозрелых (Р90) Животных содержали в пластмассовых клетках при температуре 18-20°С со свободным доступом к воде и пище. В экспериментах было использовано 193 разновозрастных крысы (отРО доР90).

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заключали в парафин по стандартной методике Каждый пятый серийный срез спинального ганглия (толщина 7 мкм) окрашивали метиленовым синим, подсчитывали количество малых (<30 мкм2), средних (30-50 мкм2) и больших (>50 мкм2) (Lawson, 1992) нейронов с видимыми ядрышками (Henken et al, 1990) Для электронной микроскопии фрагменты нерва фиксировали в глутаральдегиде и четырехокиси осмия, обезвоживали и заключали в эпон-аралдит Поперечные полутонкие срезы нерва окрашивали метиленовым синим и использовали для подсчета количества миелиновых волокон Иммуногистохимиче-ский анализ проводили непрямым стрептавидан-биотиновьм методом с использованием LSAB-kit (DAKO) с применением антител против тяжелого компонента нейро-филаментного триплета NF200 (Sigma) и каспазы-9 (Sigma) Ш4+-нейроны идентифицировали при помощи изолектина В4 (Sigma) из растения Gnffonia simphcifolia, конь-югированного с пероксидазой хрена

Опыты по исследованию поведения нейронов спинального ганглия L5 под влиянием ксимедона в период раннего постнатального развития проведены на 28 крысах Ежедневно 1 раз в день в одно и то же время на протяжении всего опыта начиная со дня рождения внутрибрюшинно вводили ксимедон (ИОХ КФАН) в дозе 30 мг/кг, разведенный в стерильной дистиллированной воде Доза ксимедона соответствует его терапевтической дозе, применяемой в клинической практике (Измайлов и др, 2001) Животным контрольных групп внутрибрюшинно вводили физраствор в эквивалентом объеме Забор материала проводили у животных на сроках PI 5, РЗО и Р90

В экспериментах по изучению посттравмагаческого выживания нейронов спи-нального ганглия L5 были использованы 65 разновозрастных крысят Животные были разделены на 2 группы Первую группу составили 32 животных, которым проводили передавливание нерва и вводили физраствор (контроль) Вторая группа животных была использована для изучения посправмагаческих реакций нейронов спинального ганглия L5 крысы в раннем постнатальном периоде на системное введение ксимедона Животным этой экспериментальной группы ежедневно 1 раз в день в одно и то же время на протяжении всего опыта начиная со дня операции внутрибрюшинно вводили ксимедон (ИОХ КФАН) в дозе 30 мг/кг, разведенный в стерильной дистиллированной воде Животными контрольных групп внутрибрюшинно вводили физраствор в эквивалентом объеме Передавливание нерва осуществляли под уретановым наркозом (Sigma, 1Д г/кг внутрибрюшинно) в асептических условиях (De Angelis et al, 1994) На разных сроках после операции у животных на уровне середины бедра выделяли участок седалищного нерва длиной 5 мм дистальнее линии метки на месте передавлива-ния Седалинщый нерв фиксировали в 2%-м растворе глутаральдегида и в 2%-м растворе четырехокиси осмия и заключали в эпон-аралдит Поперечные полутонкие срезы нерва окрашивали метиленовым синим и использовали для подсчета количества миеяиновых волокон У тех же животных после ламинэктомии выделяли спинальный ганглий L5 с обеих сторон Результаты подсчетов во всех сериях обрабатывали по Стьюденху

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

!

Характеристика нейронов спинального ганглия LS интактной крысы в раннем постнатальном периоде

Структура спинального ганглия L5 новорожденного крысенка практически сформирована и существенно не отличается от морфологии данного ганглия у половозрелого животного Он располагается по ходу дорсального корешка и имеет овальную форму Однако линейные размеры ганглия пока невелики Так, если длина ганглия у половозрелого животного составляет 1,5 мм, а ширина 0,8 мм, то у новорожденного длина достигает ОД мм и ширина 0,1 мм В спинальном ганглии, как у половозрелых, так и у новорожденных животных, можно различить два полюса проксимальный и дисгальный. Снаружи ганглий покрыт капсулой, под которой располагаются псевдоуниполярные нейроны и окружающие их клетки-сателлиты Нейроны имеют перикарион округлой формы и у новорожденных животных распределены практически равномерно по всему объему ганглия При этом нейроны с перикарионами малых, больших и средних размеров не имеют строго определенной локализации в объеме ганглия На данном сроке развития соединительнотканный компонент ганглия выражен слабо

Подсчет общего количества нейронов и распределение их по популяциям были произведены в билатеральных ганглиях на уровне L5. По морфо-функциональным критериям в спинальном ганглии различают три основные популяции нейронов, малые, средние и большие По нашим данным, у новорожденных крысят количество больших нейронов составляет 15,6%, средних — 27,3% и малых нейронов — 57,1% При этом Ю4+-нейроны, относящиеся к популяции малых нейронов, составляют 1,8%,

а МР200+-нейроны — 3,8% Экспрессия каспазы-9 обнаружена в нейронах с перика-рионами малого, среднего и большого диаметра. По локализации каспазы-9 нейроны спинального ганглия могут быть подразделены на три группы В первой — каспаза-9 определялась преимущественно в ядре, во второй — только в цитоплазме и в третьей как в ядре, так и в цитоплазме Каспаза-9+-нейроны составляют 22,6% от общего количества нейронов

К Р15 ганглий значительно увеличивается в размерах, его длина достигает 0,5 мм и ширина 0,5 мм Псевдоуниполярные нейроны с перикарионами типичной округлой формы располагаются группами, преимущественно по периферии Подобный характер распределения нейронов сохраняется и на последующих сроках, а также наблюдается в ганглиях половозрелой крысы Центральная часть ганглия занята нервными волокнами, между которыми залегают тонкие прослойки соединительной ткани, содержащей кровеносные сосуды К этому сроку общее количество нейронов в ганглии увеличивается на 36% (рис 1А) Меняется и соотношение нейронов, принадлежащих к различным популяциям. Так, количество больших нейронов увеличивается и достигает 25,4% Количество средних нейронов практически не изменяется, а количество малых нейронов уменьшается и составляет 46% (рис 1Б). Цри этом иммуноги-стохимически можно выделить 12,7% №'200+-нейронов, относящихся преимущественно к популяции больших нейронов, и 18% Ш^ -нейронов (рис 2А) Количество нейронов, имеющих ядерную локализацию каспазы-9 и с локализацией фермента в ядре и цитоплазме, увеличилось на 49,6% и 83%, соответственно (рис 2Б) К этому сроку количество каспаза-9+-нейронов составляет 27% от общего количества нейронов (рис 2Б)

К РЗО линейные размеры ганглия продолжают нарастать, но еще не достигают значений у половозрелой крысы Общее количество нейронов в ганглии увеличивается, по сравнению с новорожденными, более чем в 2 раза (рис 1А) На данном сроке можно констатировать, что количество больших нейронов составляет 19,1%, средних — 25,3% и малых — 54,7% (рис 1Б) Количество NF200 -нейронов возрастает до 16,5%, а количество Ш4+-нейронов достигает 22,7% от общего количества нейронов в ганглии (рис 2А) К РЗО количество каспаза-9+-нейронов составляет 15,6% от общего количества нейронов (рис 2Б)

К Р90 длина ганглия достигает 1,5 мм, а ширина 0,8 мм Ганглий имеет веретено-видную форму, окружен капсулой из плотной соединительной ткани От капсулы в паренхиму узла проникают тонкие прослойки соединительной ткани, в которой расположены кровеносные сосуды Нейроны располагаются группами, преимущественно по периферии ганглия Центральная часть ганглия содержит отростки нейронов, образующие главным образом миелиновые нервные волокна и тонкие прослойки соединительной ткани с обилием кровеносных сосудов На данном сроке наблюдения общее количество нейронов увеличивается на 16%, по сравнению с РЗО (рис 1 А) Количество больших нейронов составляет 28,1%, средних — 12,6% и малых — 59,2% (рис 1Б) Количество NF200+-HeftpoHOB к этому сроку достигает 25,9%, а количество Ю/-нейронов — 48,5% (рис 2А) К Р90 количество нейронов, экспрессирующих каспазу-9, составило 48,9% от общего количества нейронов (рис 2Б)

25СО

азоо 1500 1000 600

1400 1200 1000 800 600 400 200 О

-^—большие нейроны -О— средние нейроны —Ф- малые нейроны

А Б

Рис 1 Динамика количества нейронов в спинальном ганглии Ь5 крысы в раннем постнаталь-ном периоде. А — общее количество нейронов. Б — численность популяций больших, средних и малых нейронов По оси ординат—относигелыное количество нейронов На этом и последующих рисунка по оси абсцисс—возраст животного (сутки) (*)—Р<0,05 при сравнении с соответствующим показателем на предыдущем сроке.

1В4+-нейроны NF200+-He8poHbi

□ каспзэа-9 -нейроны ■ каспзэа-Э'-нейроны

Рис.2 Нейроны спинального ганглия L5 крысы в раннем постнатальном периоде. А—Ю4 -И №200+-нейроны. Б — каспаза-9+-нейроны. По оси ординат — относительное количество нейронов. (*)—Р<0,05 при сравнении с соответствующим показателем на предыдущем сроке.

В постнатальном онтогенезе крысы, по нашим данным, количество нейронов в спинальном ганглии увеличивается, что наблюдается, по крайней мере, до Р90, Эти результаты согласуются с данными Devor et al (1985), Cecchmi et al. (1995) и Farel et al (1997) Farel (2002) показал, что в интервале между PI и PI 1 численность всей популяции нейронов в спинальном ганглии увеличивается приблизительно на 1500 нейронов. Данное увеличение количества нейронов не является линейным Оно может быть связано с пролиферацией и последующей достаточно быстрой дифференцировкой нейральных клеток-предшественниц, сохраняющихся в ганглии в постнатальном онтогенезе Предположение о существовании подобных медленно дифференцирующихся нейронов (L-типа) (long-differentation neurons) было высказано Farel et al (1997) Подобные нейроны могут формироваться из пула постмитотических нейробластов (Meeker, Farel, 1997), идентифицируемых при помощи нейроспецифических маркеров,

таких как, вещество Р, Р(Ш)тубулин, а также NF200 и нейропептидов (Репу et al, 1991, Chen et al, 1998) Исследования показали, что нейроны L-типа экспрессируют р(Щ)тубулин, но не являются №200-позитивными Ни один из новообразованных нейронов не маркировался бромдезоксиуридином (BrdU) (Репу et al, 1991) Используя другой митотический маркер — ЗН-тимидин, Lawson et al (1974) установили, что процесс митотического деления предшественников нейронов спинального ганглия заканчивается к El 5

Нами показано, что в раннем постнатальном периоде наиболее динамично изменяется количество малых нейронов. Представляется весьма вероятным, что в условиях физиологической гибели малые нейроны ранее других реагируют на морфогенетиче-ские сигналы, поступающие из иннервируемой ткани-мишени Одним из подобных сигналов, влияющих на малые нейроны и поддерживающих их выживание и диффе-ренцировку, является фактор роста нервов (NGF) (Geffen et al, 1996) Уровень экспрессии NGF в ткани-мишени сохраняется высоким и в раннем постнатальном периоде (Wong et al, 1991), что может свидетельствовать о продолжении дифференци-ровки малых нейронов Более растянутое в онтогенезе увеличение количества средних и больших нейронов может быть связано с тем, что нейроны этих популяций являются производными предшественников L-типа, которые продолжают дифференцировку после рождения (Farel et al, 2002)

Характеристика нейронов спинального ганглия L5 под влиянием ксимедона в период раннего постнатального развития

Контролем для сравнения характеристик нейронов служили животные, которым в условиях эксперимента вводили физраствор в том же объеме, что и ксимедон. К Р15 введение ксимедона начиная с Р0 не влияет на размеры ганглия, его структурную организацию, локализацию скоплений нейронов Однако, при сравнении общего количества нейронов в ганглии и количества нейронов, принадлежащих конкретным популяциям, у получавших ксимедон животных выявлены существенные изменения К Р15 количество нейронов в ганглии под влиянием ксимедона увеличивается на 18% (рис ЗА) Меняется также и соотношение нейронов различных популяций Так, количество больших нейронов увеличивается на 33,5% (рис ЗБ), средних — на 20,9% (рис ЗВ), а количество малых нейронов не изменяется По сравнению с контролем, содержание №200+-нейронов увеличивается на 38,5% (рис 4), а 1В4+-нейронов — на 10,5% На фоне введения ксимедона количество каспаза-9+-нейронов уменьшилось более чем в 2 раза (рис 5), по сравнению с контролем

В опытной группе с ксимедоном к РЗО ганглий увеличивается в размерах, но также как и интактный ганглий на данном сроке, не достигает размеров у половозрелой крысы Общая структура спинального ганглия под влиянием ксимедона не изменяется К РЗО на фоне введения ксимедона общее количество нейронов в спинальном ганглии L5 на 11,5% превышает количество нейронов в контроле (введение физраствора) (рис ЗА) Увеличивается также количество больших и средних нейронов на 27% (рис ЗБ) и 11,3% (рис ЗВ), соответственно, а количество малых нейронов не изменяется По сравнению с контролем, количество NF200!-нейронов возрастает на

25,4% (рис 4), а количество 1В/-нейронов увеличивается только на 11,3% Количество нейронов, экспрессируюищх каспазу-9, на 31,5% превышает данный показатель в контроле (рис 5)

2000 1500 1000 50О

* контроль -ксмиедон

-О-контроль 300

•&-КОМ8ДОН

контроль -О-кеимедон

Р15 РЗО

Б

Р15 РЗО

В

Рис 3 Динамика количества нейронов в спинальном ганшии Ь51фысы в раннем посшаталь-ном периоде под влиянием ксимедона. А — общее количество нейронов. Б — большие нейроны В — средние нейроны По оси ордигаг — относительное количество нейронов (*) — Р<0,05 при сравнении с количеством нейронов соответствующей популяции в группе животных с введением физраствора (контроль)

У животных с введением ксимедона к Р90 нами не зафиксировано отличий от контроля в размерах спинального ганпшя Ь5 В этих же экспериментальных условиях общее количество нейронов достоверно не отличается от значения в контроле Структурная организация спинального ганглия сходна с интактной При этом количество больших нейронов увеличивается на 10,7% (рис ЗБ), а количество средних и малых нейронов не отличается от кошроля (рис ЗВ) Количество №200+-нейронов увеличивается на 13,3% (рис. 4), аЮДнейронов не меняется, по сравнению с показателями в контроле Количество каспаза-9-нейронов уменьшилось более, чем в 3 раза и составило 14,8% от общего количества каспаза-9+-нейронов (рис 5)

Рис. 4 Количество №200+-нейронов в спинальном ганглии Ь5 при введении ксимедона с РО Белые сшпбики — при введении физраствора (контроль), черные — при введении ксимедона По оси ординат — относительное количество нейронов (*) — Р<0,05 при сравнении с контролем в соотвегсвую-щей возрастной группе

2500 2000 1500 1000 300 0

Рис. 5 Количество каспаза-9+-нейронов в спинальном ганглии Ь5 при введении ксимедона с Р0 В каждой паре левый стоблик—физраствор, правый— ксимедон. По оси ординат—относительное количество нейронов. (*)—Р<0,05 при сравнении с контролем в соответсвующей возрастной труппе

В интервале между РО и Р90 ксимедон в наибольшей степени поддерживает выживание больших и №200+-нейронов спинального ганглия Этот вывод согласуется с нашими результатами о преримущественном увеличении численности именно этих нейронов в раннем постаатальном периоде, а также с данными Рагинова и др (2003) о том, что ксимедон поддерживает выживание именно №200+-нейронов Можно полагать, что преимущественной мишенью ксимедона служат нейроны, вероятность вступления которых в апоптоз под влиянием препарата уменьшается Выживающие нейроны, в свою очередь, оказывают поддерживающее влияние на клетки-сателлиты, шванновские и другие ненервные клетки, расположенные в потенциальном пространстве роста нервных волокон (Ратинов и др, 2001) Молекулярными сигналами подобного влияния могут служить нейрегулины, которые транспортируются антероградно по аксонам и после выделения из нервных терминалей контролируют выживание, миграцию, пролиферацию и дифференцировку предшественников шванновских клеток (Buananno et al, 2001), а также поддерживают процесс миелинизации (Michailov et al, 2004) С другой стороны, ксимедон может стимулировать прорастание нервных волокон, прямо влияя на клетки-сателлиты и шванновские клетки Регистрируемый при этом нейропротекторный эффект преимущественно в отношении больших и NF200+-нейронов может быть следствием увеличения количества ненервных клеток и вырабатываемых ими нейротрофических факторов, например нейротрофинов, которые транспортируются ретроградно в перикарионы нейронов именно этих популяций и поддерживают их выживание.

Наиболее важными регуляторами апоптоза, действующими в эффекторной стадии, являются белки семейства Вс1-2 В регуляции апоптоза чувствительных нейронов участвуют антиапоптозные белки Вс1-2, Bcl-Хь и проапоптозные белки Вах и Bad (Zamzani et al, 1997) Большинство исследований указывает на то, что именно миго-хондриальная локализация обеспечивает белкам семейства Вс1-2 способность регулировать апоптоз (Kroemer, Reed, 2000) Эффект влияния ксимедона, возможно, связан с его действием на трансмембранный потенциал митохондрий, являющийся ключевым механизмом апоптоз-ингибирующей активности Вс1-2. Антиапоптозная активность ксимедона опосредована не только его влиянием на Вс1-2, но и на друше белки одноименного семейства, например, Bag-1 (Черепнев, 1997) Ксимедон — малотоксичный антиапоптоген и митохондриальный протектор, который регулирует ряд важных контрольных точек на пересечении путей мутагенеза/антимутагенеза и апоптоза, содействуя переключению на репаративный путь клеточного ответа на повреждение (Черепнев, 2002) На основании вышеизложенного можно предположить, что внутриклеточные сигнальные пути реализации физиологического и постгравматического апоптоза чувствительных нейронов близки или идентичны

Каспаза-9 является ключевым фактором в реализации апоптоза нейронов, опосредованного выходом цитохрома с из митохондрий Она выделяется из митохондрий в результате воздействия на них Са21 или проапоптозного белка Вах (Krajewski etal, 1999) Апоптоз-индуцирующие агенты активируют транслокацию каспазы-9 из митохондрий в ядро, что угнетается противоапоптозным белком Bcl-2 (Bates, Vousden, 1999) Нами показано, что при травме нерва основанная масса нейронов погибает к Р30 Вероятно, пик гибели нейронов при введении ксимедона на фоне травмы прихо-

дится на интервал между Р15 и РЗО (по результатам подсчета количества каспаза-9-нейронов). Эти результаты коррелируют с изменением общего количества нейронов. При введении ксимедона на фоне травмы к РЗО уже наблюдается тенденция к увеличению общего количества нейронов, по сравнению с Р15

Посттравмапшческое выживание нейронов сттального ганглия L5 у новорождённых крысят

Контролем для сравнения характеристик псевдоуниполярных нейронов служили интакгные животные того же возраста. К Р15 после передавливания нерва ганглий на ипсилатеральной стороне значительно уменьшается в размерах, по сравнению с контролем, длина его достигает 0,5 мм, а ширина — 0,3 мм В нейронах прослеживаются реактивные изменения В них развивается неравномерный центральный и иногда тотальный хроматолиз Часть нейронов имеет гиперхромный вид Встречаются нейроны с перикарионами неправильной угловатой формы

На Р15 при передавливании седалищного нерва количество нейронов в ганглии уменьшается на 39,8% (рис 6А) При этом количество средних и малых нейронов снижается на 59,9% (рис 6В)и43Д%(рис 6Г), соответственно Численность популяции больших нейронов не изменяется (рис. 6Б) По сравнению с интактным ганглием, характер распределения продуктов иммуногистохимической реакции с антителами против белка NF200 в ганглии после травмы нерва изменяется В опытной группе появляются NF200+-HeiipoHbi с малыми размерами перикариона. В интактном ганглии и в ганглии после травмы нерва характер распределения продуктов реакции с не различается По сравнению с интакшыми к Р15 (контроль), в труппе животных с травмой нерва количество NF200+-HeiipoHOB уменьшается на 19,9% (рис 7Б), а Ю4+-нейронов — на 63,6% (рис 7А) При травме нерва к Р15 увеличивается количество каспаза-9+-нейронов на 59%, по сравнению с контролем

К РЗО после передавливания нерва ганглий незначительно увеличивается в размерах, но не достигает значений в контроле. Псевдоуниполярные нейроны располагаются группами, преимущественно по периферии ганглия, образуя небольшие скопления в его центральной части Выраженность прослоек соединительной ткани уменьшается. К РЗО у животных с передавливанием нерва общее количество нейронов в спинальном ганглии L5 на ипсилатеральной стороне на 58,6% меньше, чем у интактного животного (рис. 6А) К этому сроку резко изменяется качественный состав нейронов Так, при сравнении с показателями у интактных животных к РЗО выявлено значительное снижение количества больших нейронов (на 48,6%) (рис 6Б). При сравнении же с показателями у животных с травмой нерва, но на сроке Р15, отмечено снижение общего количества нейронов на 30,3% Количество средних и малых нейронов по сравнению с контролем уменьшается на 76,2% (рис 6В) и 46,6% (рис. 6Г), соответственно При сравнении с аналогичными показателями у животных к Р15 с травмой седалищного нерва на Р0 также зафиксированы статистически значимые различия в численности популяций средних и малых нейронов В этой серии экспериментов нами отмечено, что количество NF200+-HeftpoHOB уменьшается на 24,9% (рис 7Б), а количество 1В4+-нейронов—на 50,3% (рис 7А). В группе животных с травмой нерва к РЗО сохраняется повышенное количество каспаза-9+-нейронов (на75% большего сравнению скотршем)

К Р90 объем сгошального ганглия незначительно отличается от контроля В нейронах восстанавливается тигроидное вещество, выраженность тигролиза уменьшается К Р90 в серии экспериментов с передавливанием седалищного нерва на РО общее количество нейронов на 21,8% меньше их количества в ганглии половозрелого животного (рис 6А) При этом качественный состав популяций нейронов значительно различается По сравнению с контролем, количество больших нейронов уменьшается на 16,9% (рис 6Б), количество средних нейронов увеличивается на 60,8% (рис 6В), а количество малых нейронов уменьшается на 64,8% (рис 6Г) При иммуногастохимиче-ской маркировке нейронов установлено, что при сравнении с ганглиями интактных половозрелых животных количество №200+-нейронов уменьшается на 19,2% (рис 7Б), а количество Ш4+-нейронов не изменяется (рис 7А) Достоверно значимые отличия сохраняются в количестве каспаза-9+-нейронов К Р90 после травмы нерва количество нейронов с положительной реакцией на каспазу-9 на 26% больше, по сравнению с контролем, и составляет 37,4% от общего количества нейронов

2000 1500 1000

«<винтактмые ■фа травма

_ король

Р0 Р15 РЭО

Р15 РЗО

1400 1200 10С0

контроль «{^травма

—контроль • травма

В Г

Рис. 6 Д инамика количества нейронов в спинальном ганглии Ь5 крысы в раннем посшагаль-ном периоде после передавливания седалищного нерва на РО А — общее количество нейронов. Б—большие нейроны В — средние нейроны Г—малые нейроны. По оси орд инат— относительное количество нейронов. (*)—Р0.05 при сравнении с количеством нейронов соответствующей популяции у интактных животных (контроль)

А Б

Рис. 7 Количество 1В4+- и №200+-нейронов в спинальном гангаии L5 при травме седалищного нерва на PO А — Ю4+-нейроны. Б — №200+-нейроны. По оси орденах — относительное количество нейронов (*) —Р<0,05 при сравнении с количеством нейронов соответствующей популяции у интаюных животных (контроль)

Травма седалищного нерва на РО вызывает значительную гибель нейронов в спи-нальном ганглии L5 При этом на ранних сроках после травмы гибнет большее количество нейронов Так, на 15-е сутки после травмы погибает 60% нейронов, а на 30-е— 41% Полученные нами данные согласуются с результатами о том, что постгравмати-ческая гибель чувствительных нейронов в раннем посгнатальном периоде более выражена, чем у половозрелых животных В спинальном ганглии L5 у новорожденных крысят при травме седалищного нерва выявлено более 60% TUNELZ-нейронов (Oliveira et al, 1997) В том же ганглии перерезка седалищного нерва на Р1 вызывет гибель 40-50% нейронов (Yip et al, 1984, Bahadon et al, 2001) Авторы установили прямую зависимость количества погибающих нейронов от возраста животного, чем раньше была произведена перерезка седалищного нерва, тем большее количество нейронов гибнет в спинальном ганглии Постгравматическая гибель нейронов, по-видимому, накладывается на физиологическую гибель, которая продолжается после рождения как минимум до Р5 (Coggeshall et al, 1994) Если при передавливании нерва на Р0, согласно нашим данным, к РЗО в спинальном ганглии погибает 58% нейронов, то у половозрелого животного при аналогичной травме выживают практически все нейроны (Ратинов и др, 2002) После лигирования седалищного нерва в спинальном ганглии L5 погибает 30% у половозрелых животных и 75% нейронов у новорожденных (Hunes, Tessler, 1989) Возможной причинной посггравматической гибели значительной части популяции чувствительных нейронов в раннем постнатальном периоде является выраженный дефицит нейротрофических факторов, по сравнению с ситуацией в половозрелом организме Этот дефицит может быть связан с тем, что отростки нейронов еще не сформировали функциональные связи с иннервируемой тканью-мишенью, которая и является главным источником нейротрофических факторов, в отличие от тканей, через которые нервные волокна проходят «транзитом» (Coggeshall et al, 1994) Несмотря на то, что у новорожденных имеет место более выраженная гибель чувствительных нейронов на всех экспериментальных сроках (Goldman, 1974, Bregman, Goldberger, 1983), численность популяций этих нейронов у новорожденных

животных после перерезки нерва восстанавливается быстрее, чем у половозрелых животных

Реакция чувствительных нейронов различных популяций на повреждение отростков неодинакова У половозрелых животных раньше и в наибольшем объёме гибнут малые нейроны и в меньшей степени большие (Tandrup et al, 2000, Ратинов, Челышев, 2002) Аксоны малых нейронов регенерируют быстрее (Brown et ai, 1992) и характеризуются большей способностью к ветвлению (Ktfinmanetal, 1992) Малые нейроны с большей вероятностью вступают в посправматический апоптоз (Ратинов и др, 2002) Нами показано, что большие нейроны к Р15 не погибают при травме их периферического отростка. К Р30 количество подобных нейронов значительно уменьшается, что может быть связано с недостатком нейротрофических факторов, поддерживающих их выживание К Р90 количество больших нейронов существенно возрастает, вероятно, за счет пролиферации или дифференцировки предшественников, но не достигает уровня у интакшого животного

Д инамика выживания средних нейронов после травмы периферического отросла наРО отличается от выживания больших нейронов Их значительная гибель зафиксирована нами уже к Р15, а к Р30 76,2% средних нейронов погибает, по сравнению с интакг-ными к этому сроку. Но к 90-м суткам развития происходит резкое увеличение количества средних нейронов, которое более чем в 2 раза превышает количество средних нейронов в спинальных ганглиях интактных животных Столь резкое увеличение количества средних нейронов может быть связано с повышением в данный период развития экспрессии таких нейротрофических факторов, как мозговой нейротрофический фактор (BDNF) и глиальный нейротрофический фактор (GDNF), которые поддерживают их выживание Кривая же постгравматического выживания малых нейронов не имеет таких резких всплесков, как у средних нейронов. Исследованиями было показано, что малые нейроны менее устойчивы к травме отростков (Tandrup et al, 2000) и воздействию нейротоксических веществ (Schionnmg et al, 1998) Более выраженная гибель малых нейронов, по сравнению с большими и средними нейронами, может происходить вследствие того, что при передавливании нерва поступление нейротрофических факторов в перикарион в составе ретроградного аксоннош транспорта практически не нарушается (Hammarberg et al, 1996) Ш4+-нейроны, входящие в состав популяции малых нейронов, активно реагируют на травму периферического отростка в раннем постнатальном периоде, как и у половозрелых животных в процессе посиравматиче-ской регенерации Вместе с тем, нами к Р90 зафиксировано отсутствие сдвигов в количестве ГО4+-нейронов при травме нерва, что согласуется с данными, полученными на половозрелых животных о наиболее быстром восстановление нейронов данной популяции после травмы (Рапинов и до, 2000)

Рядом исследований при травматическом и ишемическом повреждении ЦНС установлена возможность активации нейрогенеза за счет собственных нейральных предшественников в ответ на действие сигналов пока неясной природы (Yagrta et al, 2001, Jm et al, 2003, Rice et al, 2003) Нейрогенез в зрелом мозге оказывается возможным не только в обонятельной луковице и зубчатой извилине гиппокампа. Активно обсуждается возможность образования новых нейронов и их функциональная пластичность в других областях нервной системы (см обзор Lledo et al, 2006) Ке et al

(2006) показали, что при острой травме спинного мозга собственные нейральные предшественники пролиферируют и мигрируют в область повреждения Они рассматриваются как потенциальный источник для восстановления утраченных клеток и ней-рорегенерации Существование подобного резерва в структурах периферической нервной системы остается неясным Появляются первые работы, свидетельствующие в пользу такой возможности По мнению Li et al (2007), в зрелом спинальном ганглии имеются общие предшественники для нейронов и клеток-сателлитов, которые в условиях травмы могут вступать в нейрогенез После перерезки седалищного нерва в спинальном ганглии у половозрелой крысы появляются клетки, которые экспрессируют маркер нейральных предшественников нестин наряду с маркерами нейральной диф-ференцировки, такими как NF200, Р(ПГ)тубулин, белок 9 5, GAP-43, trkA и CGRP (Кио et al, 2005) Эти данные, с одной стороны, могут косвенно свидетельствовать в пользу существования в зрелом спинальном ганглии нейральных предшественников. С другой стороны, они могут отражать усиление в условиях травмы экспрессии нестина дифференцированными нейронами Полученные этими же авторами факты о стимулирующем влиянии нейротрофического фактора NT-3 на экспрессию нестина в клетках спинального ганглия поддерживают второе предположение. Действительно, в литературе отсутствуют указания на то, что в нейроонгогенезе нейротрофиньг увеличивают количество нейральных предшественников, экспрессирующих нестин Наоборот, нейротрофические факторы в нейроонтогенезе контролируют спецификацию чувствительных нейронов, принадлежащих конкретным популяциям (Farinas et al, 2002), а в условиях постгравматической регенерации поддерживают выживание и удлинение отростков (Li et al, 2007)

Посттравматические реакции нейронов спинального ганглия L5 в раннем постнатальном периоде на системное введение ксимедона

Контролем для сравнения количества и характеристик нейронов служили животные, которым проводили передавливание седалищного нерва на Р0, но не вводили ксимедон, а также шгакгные животные того же возраста. У животных с передавлива-нием седалищного нерва на Р0 и получавших ксимедон в течение всего эксперимента к Р15 ганглий значительно увеличивается в размерах, но не достигает величины у животных в контрольных группах (без ксимедона и интактные животные)

При сравнении с группой животных на сроке Р15, но без введения ксимедона, выявлено увеличение общего количества нейронов на ипсилатеральной стороне на 46,6% В этих же экспериментальных условиях не было зафиксировано статистически значимых различий в количестве нейронов в ганглии при сравнении с шггактными животными к Р15 (рис 8) При сравнении с Р15, но без введения ксимедона нами выявлено достоверно увеличение количества больших, средних и малых нейронов (рис 9А,Б,В) Показатель выживания в наибольшей степени выражен для больших нейронов (33,5%) В этих условиях нами выявлено увеличение количества NF200+-нейронов на 502%, что достоверно больше, чем в контроле (в тех же экспериментальных условиях, но без введения ксимедона) (рис 10Б), а количество Ш4+-нейронов возрастает на 48,9% (рис 10А). По сравнению с интакгньши животными к Р15 нами

зафиксировано увеличение количества МР200+-нейронов на 37,8% (рис 10Б), а количество 1В4+-нейронов не отличается от соответствующего показателя в интактном ганглии На фоне введения ксимедона к Р15 количество каспаза-9+-нейронов не отличается от соответствующего показателя в группе животных с травмой нерва, но без введения ксимедона, и продолжает оставаться повышенным по сравнению с интакт-ными животными

К РЗО после травмы на фоне введения ксимедона размер ганглия не отличается от интакгаого ганглия на сроке РЗО Нейроны располагаются группами, преимущественно по периферии, в центре образуя небольшие скопления Общее количество нейронов в спинальном ганглии не отличается от контроля (интакшый РЗО) При сравнении с животными на РЗО с травмой седалищного нерва на РО, но без введения ксимедона общее количество нейронов увеличивается на 58% (рис 8) При этом также выявлено достоверное увеличение количества больших, средних и малых нейронов При сравнении с интактными животными на РЗО, зафиксировано достоверное повышение количества больших нейронов (рис 9А) Количество №200+-нейронов возрастает на 10,7% (рис 10Б), а количество Ю4+-нейронов не отличается от количества подобных нейронов в интакгаом ганглии к РЗО (рис 10А) Количество каспаза-9+-нейронов на 23% больше, чем у интактных животных и на 62% меньше, при сравнении с животными с травмой, но без введения ксимедона

К Р90 после травмы на фоне введения ксимедона размер ганглия не отличается от интактного ганглия к Р90 На данном сроке зафиксировано значительное количество нейронов с двумя ядрышками Общее количество нейронов достоверно не отличается от соответствующего показателя в интакшом ганглии (рис. 8) При этом сохраняется достоверно значимое различие в количестве больших нейронов на 18,5%, по сравнению с контролем (в тех же экспериментальных условиях, но без введения ксимедона) (рис. 9А) Количество малых нейронов на 11,6% меньше, чем в контроле (рис 9В) Количество МР200+-нейронов не изменяется, а количество Ш4+-нейронов уменьшается на 13,7% (рис 10А) К Р90 наблюдается достоверно значимое снижение количества каспа-за-9+-нейронов более чем в 3 раза, по сравнению с соответствующим показателем в интактном спинальном ганглии

ш^т интактные -g. травма

травма+

ШШВДОН

Рис 8 Влияние ксимедона на по-справмашческое выживание нейронов в спинальном ганглии Ь5 на шсилаге-ральной стороне. По оси ординат — относительное количество нейронов (*) — Р<0,05 при сравнении с интактными животными.

Р15 РЗО

-о—ингакгные -о-травма -й-травма+ ксимедон

А Б В

Рис. 9 Распределение нейронов по популяциям в спишлшом ганглии Ь5 при травме седалищного нфва и введении ксимедона. А — большие нейроны, Б — средние нейроны, В — малые нейроны. По оси ординат — относительное количество нейронов (*) — Р<0,05 при сравнении с количеством нейронов соответствующей популяции у интактных животных. (**) -— Р<0,05 при сравнении с количеством нейронов соответствующей популяции у животных с травмой седалищного нерва

—5— интактные —О— травма тй—тгЗавма+ ксимедон

600 500 400 300 200 100 о

-О— интактные -О—травма травма* ксимедон

А Б

Рис 10 Количество Ш4+- и МР200+-нейронов в спинальном ганглии Ь5 при введении ксимедо-наживотным с травмой седалишного нерва наРО А—Ш/-нейроны; Б—№200+-нейроны. По оси ординат—относительное количество нейронов. (*)—Р<0,05 при сравнении с количеством нейронов соответствующей популяции у интактных животных.

Нейропротекторное действие фармакологического стимулятора регенерации периферического нерва ксимедона оказывается более эффективным в отношении популяции Ш4+-нейронов спинального ганглия (Ратинов, Чельппев, 2002) В отличие от этих данных, нами установлено, что введение ксимедона с момента рождения до 90-х суток развития при травме седалищного нерва у новорожденного в наибольшей мере поддерживает выживание больших нейронов Это наблюдение согласуется с нашими данными о выживании больших нейронов после травмы нерва Можно предположить, что противоапоптозное действие ксимедона универсально и неспецифично, оно проявляется как при посправматической, так и физиологической гибели чувствительных нейронов Наибольшее значение для посправматического выживания нечувствительных к нейротрофинам малых нейронов, связывающих Ш4, может иметь ОВОТ

(Petruska et al., 2000), который также стимулирует регенерацию центральных отростков часта чувствительных нейронов (Ramer et al, 2000)

В постмитотических клетках стабильной популяции, какими являются нейроны или кардиомиоциты, прокаспаза-9 должна быть надежно «спрятана» в компартменге для снижения вероятности ее спонтанного выхода в цитозоль и запуска апогггоза. Апогггоз-индуцирующие сигналы в нейронах активируют транслокацию каспазы-9 из митохондрий в ядро (Krajewski et al, 1999) Не исключено, что именно поэтому к Р15 после травмы нерва количество чувствительных нейронов с локализацией фермента в ядре, а также в ядре и цитоплазме, достоверно возрастает. Это наблюдение согласуется с выявленным нами уменьшением общего количества нейронов на 90 сутки после травмы нерва. При введении ксимедона к Р15 значительно увеличивается количество нейронов с экспрессией каспазы-9 в цитоплазме, что может свидетельствовать об активировании апоптоза нейронов При этом количество нейронов с ядерной локализацией каспазы-9 было значительно меньше, по сравнению с контролем К РЗО характер экспрессии фермента во всех трех популяциях нейронов не отличается от соответствующего показателя в интактном спинальном ганглии Эти данные с учетом динамики экспрессии каспазы-9 позволяют высказать предположение о том, что увеличение уровня каспазы-9, по крайней мере, в ядре, не может расцениваться как признак необратимого вступления клетки в апоптоз (Cheng, Zochodne, 2003)

Регенерация миелиноеых волокон седалищного нерва в раннем постнаталь-ном периоде под действием ксимедона

По нашим данным, у новорожденных крысят в седалищном нерве содержится 1790,0±92,0 миелиновых волокон К Р15 их количество увеличивается на 11% К РЗО количество миелиновых волокон, по сравнению с Р0, увеличивается на 31,4% Нами не выявлено различий по этому показателю при сравнении 30- и 90-дневных животных Под влиянием ксимедона в раннем постнатальном периоде нами зафиксированы изменения количества миелиновых волокон в коседалищном нерве. К Р15 при введении ксимедона с Р0 по Р15 количество миелиновых волон увеличивается на 29,5% На 30 сутки введения ксимедона количество миелиновых волокон возрастает на 11% К Р90, при сравнении с интактным седалищным нервом, статистически значимых различий в количестве миелиновых волокон не обнаружено (рис 11 А)

На фоне травмы седалищного нерва на Р0 нами отмечены изменения количества миелиновых волокон в нерве К Р15 на фоне травмы на Р0 количество миелиновых волокон увеличивается на 7,3%, по сравнению с контролем (интакгные Р15) На 30 сутки после травмы количество миелиновых волокон уменьшается на 32,9%, по сравнению с контролем При сравнении с интактным седалищным нервом к Р90 нами выявлено уменьшение количества миелиновых волокон на 27,4% (рис 11Б)

*

___+ X <1>

А Б

Рис. 10. Количество миелиновых волокон в сепалищном нерве. А — при введении ксимедона (стшбики с вертикальным штрихом). Столбики с точками — при введагии физраствора (контроль). Б — при травме нерва на Р0 (белые столбики). Черные стшгбики — - интжтные (контроль). По оси ординат- количество миегиновых волокон в нерве. (*)—РО,()5.

К 90-м суткам развитая нами зафиксировано увеличение количества миелиновых волокон в седалищном нерве крысы, по сравнению с новорождёнными животными. Нами установлено, что на Р90 количество миелиновых волокон В 1.5 раза меньше, чем выявленное Рагиновым и др. (2000) и Масгутовым и др. (2005) в седалищном нерве половозрелой крысы. Количество миелиновых волокон нарастает бу+срее количества нейронов в спинальном ганглии Ь5. Данное расхождение может быть следствием того, что седалищный нерв образован отростками не только нейронов Ь5, но также включает отростки нейронов, локализованных в ганглиях ЬЗ-Ьб. Кроме того, седалищный нерв крысы содержит не только афферентные волокна (80%), но Я эфферентные (ЗсЬтаЗЬшсЬ, 1982). Созревание миелина продолжается длительное время после рождения. В процессе развития у крысы количество миелиновых волокон достигает окончательных значений достаточно быстро, а дефинитивные размеры их диаметра уст^шавливаются значительно позже. Нами показано, что в спинальном ганглии 1.5 наиболее значимое увеличение количества миелиновых волокон происходит в интервале между Р15 и РЗО. Таким образом, количество волокон на данном сроке больше, чем количество выживающих нейронов в раннем постнатальном периоде. По-видимому, количество миелиновых волокон превосходит количество нейронов, за счет спраутанга.

Нами было показано, что в интервале Р0-Р15 количество миелиновых волокон после травмы нерва продолжает нарастать. По нашим данным к Р90 количество миелиновых волокон достоверно меньше, чем у интактных животных. Когда одна из ветвей аксона восстанавливает связь с клеткой-мишенью, все его пополнительные всгви постепенно дегенерируют, и этот процесс может продолжаться месяцы и даже годы (Маек ¡п поп еЕ а1, 1991), Значительное уменьшение количества миелиновых волокон (на 32,9%). выявленное нами к РЗО, может быть связано с этой особенностью.

До настоящего времени не до конца понятна ситуация со скоростью регенерации миелиновых волокон. Ранее было постулировано, что безмиелиновые волокна, обра-

зованньге малыми и частью средних нейронов, регенерируют быстрее миелиновых (Brown et al, 1992) Однако, Lozeron et al (2004) показали что скорость регенерации безмиелиновых и миелиновых волокон не различается Так как общее количество нейронов в спинальном ганглии L5 после передавливания нерва меньше количества регенерирующих миелиновых волокон, до конца не понятно отростки каких нейронов в наибольшей степени участвуют в процессе посттравматической регенерации

На сроке PI 5 нами выявлено увеличение количества миелиновых волокон под влиянием ксимедона При этом увеличивается также количество больших и NF200+-нейронов, которые и образуют миелиновые волокна Наши данные согласуются с данными Рагинова и др (2003) о том, что ксимедон обладает нейропротекгорным свойством в отношении №200+-нейронов К Р90 под влиянием ксимедона нами не зафиксировано различий в количестве миелиновых волокон при сравнении с количеством миелиновых волокон в интакшом седалищном нерве Ксимедон на ранних сроках постнагального развития может ускорять образование миелина, в ходе же дальнейшего развития происходит только увеличение толщины миелиновой оболочки Данный процесс происходит более медленными темпами и может продолжаться в течение года (Bunge et al, 1986)

При передавливании седалищного нерва у новорожденных крысят нами не зафиксировано изменений в количестве миелиновых волокон при сравнении с контролем (интактные животные) Кожная чувствительность поврежденной лапы начинает восстанавливаться только с Р12 При введении ксимедона начиная со дня операции на нерве (Р0) чувствительность начинает восстанавливаться уже с Р7 При этом к PI 6 чувствительная функция нерва восстанавливается полностью Полученные данные дают основания полагать, что введение ксимедона стимулирует восстановление чувствительности иннервируемой ткани-мишени

ВЫВОДЫ

1 В раннем постнатальном периоде темпы прироста количества нейронов спинально-го ганглия нарастают в следующих рядах

-NF200+->m4+,

- средние —» большие —> малые

2 Стимулятор регенерации периферического нерва ксимедон сдерживает гибель чувствительных нейронов в раннем постнатальном периоде. В интервале между рождением и 90-и сутками развития ксимедон в наибольшей степени поддерживает выживание больших и NF200+-HefipoHOB спинального ганглия

3 При передавливании седалищного нерва у новорожденных крысят значительно снижается выживание нейронов всех популяций, при этом гибель 1В4+-нейронов выражена в наибольшей степени

4 Постгравматическое введение ксимедона новорожденным крысятам в наибольшей мере поддерживает выживание больших нейронов спинального ганглия, в отличие от Ю4+-нейронов при посттравматическом введении препарата половозрелым животным.

5 Введение ксимедона в раннем постнатальном периоде к моменту половой зрелости увеличивает антиапоптозный потенциал нейронов спинального ганглия

- более чем в 2 раза снижается количество каспаза-9+-нейронов,

- на фоне травмы нерва количество каспаза-9+-нейронов снижается более чем в 3 раза.

6 Параллельно с процессом увеличения количества нейронов в спинальном ганглии в раннем постнатальном периоде увеличивается количество миелиновых волокон в периферическом нерве К 90-м суткам развития количество миелиновых волокон в седалищном нерве у крысы возрастает на 31,4%, по сравнению с новорожденными животными

7 Посттравматическое уменьшение количества нейронов сопровождается уменьшением количества миелиновых волокон. К 30 суткам после травмы количество миелиновых волокон уменьшается на 32,9%

8 В раннем постнатальном периоде ксимедон стимулирует регенерацию периферического нерва. Увеличивается количество миелиновых волокон и восстанавливается кожная чувствительность

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Козлова MJB (Нигметзяиова) Изменение количества нейронов различных популяций в спинальных ганглиях у крысы в нейроонтогенезе / М В.Козлова (Нигмет-зянова), ИСРагинов // Тезисы докладов Международного молодежного Форума «Ломоносов — 2005» ХП Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» -12-15 апреля 2005 - Москва. - С 501-502

2 Козлова М В (Нигметзянова) Изменение объема популяции нейронов спинальных ганглиев у крыс в процессе нейроонтогенеза / MB Козлова (Нигметзянова), И С Раганов // Тезисы докладов X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» - 26-27 апреля 2005 - Казань - С 223

3 Козлова М В (Нигметзянова) Влияние нейропротектора ксимедона на количество нейронов различных популяций в нейроонтогенезе / М В.Козлова (Нигметзянова), И С.Рагинов // Материалы П Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» -25-28апреля2005 -Ижевск.-С28-29.

4 Ратинов И С Взаимодействие в системе «нейрон-шванновская клетка» при стимуляции посттравматической регенерации нерва / ИСРагинов, MB Козлова (Нигметзянова), Г А Фомина, Р Ф.Масгутов, Ю АЧелышев // Материалы 4-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле», Альманах Ретиноиды, выпуск 21 -3-4 июня Орел -2005 -С.65-66

5 Мастутов Р Ф Пути влияния ксимедона на рост аксонов in vitro и in vivo / Р Ф MaciyroB, Г А Фомина, И С Ратинов, М.В Козлова (Нигметзянова), ТО А Челышев //Морфологическиеведомости -2005 -№3-4 -С66-69

6 Козлова MB (Нигметзянова) Поддерживает ли нейропротектор ксимедон численность популяций нейронов спинального ганглия и рост миелиновых волокон в раннем постнатальном периоде7 / MB Козлова (Нигметзянова), И С Ратинов, Г А.Фомина, Р Ф Масгутов, Ю АЛелышев // Морфологические ведомости - 2005 -№3-4 - С 47-49

7 Kozlova M.V (Nigmetzyanova) Number of different populations DRG neurons during of rats development under influence of neuroprotecter xymedon / M.V.Kozlova (Nigmetzyanova), I S.Ragmov, Y A Chelyshev // "8th European Congress of Neuropathology". Books of abstracts - June 25-28,2005 - Amsterdam, Holland - P11

8 Kozlova M V. (Nigmetzyanova) Number of DRG neurons during rat's development under influence of xymedon / M V.Kozlova (Nigmetzyanova), IS Raginov, Y A Chelyshev // "5th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology" Books of abstracts - September 19-22, 2005 - Tatranske Lommca - Stara Lesna. The High Tatras Slovak Republic -P54

9 Kozlova M.V (Nigmetzyanova) The volume of rat DRG neurons population in neuroontogenesis / MVKozlova (Nigmetzyanova), IS Raginov // European Journal of Neurology Abstract of the 9th Congress of the European Federation of Neurological Societies -September 17-20,2005 - Athens, Greece - Volume 12 - Supplement 2 -P242

10 Козлова MB (Нигметзянова) Влияние ксимедона на количество нейронов различных популяций в процессе раннего постнатального развития крысы / М В Козлова (Нигметзянова), И С Ратинов, Ю А Челышев // Тезисы докладов Международного молодежного Форума «Ломоносов - 2006» ХШ Международной научной

конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» -12-15 апреля 2006 - Москва. -С.542-543

И Козлова M В (Нигметзянова) Изменение объема популяций нейронов спиналь-ного ганглия L5 и количества миелиновых волокон в седалищном нерве крысы в нейроонтогенезе под влиянием нейропротекгора ксимедон / M В Козлова (Нигметзянова), РФМааутов, И С Ратинов, Г А Фомина, M В Арефьева, ЮА.Челышев // Сборник научных трудов «Актуальные проблемы морфологии» — 2006 - Красноярск -№5 - С 70-74

12 Masgutov R Stimulation of the rat's sciatic nerve regeneration by local treatment with Xymedon® / KMasgutov, IRagmov, GFomina, MKozlova (Nigmetzyanova), YuChelyshev//Cellular and Molecular Neurobiology -2006 - Nov, 26(7-8) -P1411-1419

13 Kozlova M V (Nigmeteyanova) Influence of neuroprotectant xymedon on number of different population DRG neurons during early postnatal rat's development / M V Kozlova (Nigmetzyanova), G A.Fomma, I.S Raginov, R.F Masgutov // "5th forum of European Neuroscience" Books of abstract - July 8-12,2006 - Vienna, Austria. - P.479

14 Kozlova M V (Nigmetzyanova) The number of myelin fibers in sciatic nerve and number of DRG neurons during rats' postnatal development under influence of Xymedon / M V Kozlova (Nigmetzyanova), GA Fomina, IS Raginov // 10th congress of the European Federation of Neurological Societies Books of abstracts - September 2-5,2006 - Glasgow, UK.-P128

15 Нигметзянова MB. Выживание нейронов различных популяций спинального ганглия L5 после травмы седалищного нерва у новорожденной крысы / М.В Нигметзянова, И.С Ратинов, СИЛиколаев, ЮАЧеяышев // Сборник трудов Международной научно-практической конференции посвященной 85-летию Белорусского государственного медицинского университета. «Актуальные проблемы морфологии» - 22-23 ноября 2006 - Минск, Белоруссия - С 113

16 Нигметзянова M В Нейроны спинального ганглия L5 в раннем постнатальном развитии крысы / M В Нигметзянова, И С Ратинов, M В Арефьева // Тезисы докладов ХП Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - 25-26 апреля 2007 -Казань - С301

17 Nigmetzyanova M.V (Kozlova) Survival of different population if DRG neurons after sciatic nerve injury of pups rats / M V Nigmetzyanova (Kozlova), IS Raginov, Yu A Chelyshev //11th congress of the European Federation ofNeurological Societies. Books of abstracts - August 25-58,2007 - Brussels, Belgium -P246.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нигметзянова, Мария Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фенотипическая характеристика, гетерогенность и классификация нейронов дифференцированного спи-нального ганглия.

1.2. Динамика численности популяции нейронов в нейроон-тогенезе

1.3. Становление фенотипов нейронов спинального ганглия в нейроонтогенезе.

1.4. Роль нейротрофических факторов в спецификации чувствительных нейронов.

1.5. Апоптоз нейронов в нейроонтогенезе и при нейро-травме.

1.6. Влияние травмы периферического нерва на выживание и фенотипические характеристики нейронов спинального ганглия.

1.7. Влияние потенциальных стимуляторов регенерации периферического нерва на нейроны спинального ганглия.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Экспериментальные группы.

2.2. Введение ксимедона.

2-3. Передавливание нерва.

2.3.1. Передавливание нерва и введение ксимедона.

2.4. Введение ксимедона беременным крысам.

2.5. Функциональные тесты.

2.6. Морфометрия и иммуногистохимические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Характеристика нейронов спинального ганглия L5 интактной крысы в раннем постнатальном периоде.

3.2. Характеристика нейронов спинального ганглия L5 под влиянием ксимедона в период постнатального развития.

3.3. Характеристика нейронов спинального ганглия L5 по

• томства под влиянием ксимедона при его введении беременным крысам.

3.4. Посттравматическое выживание нейронов спинального ганглия L5 у новорождённых крысят.

3.5. Посттравматические реакции нейронов спинального ганглия L5 в раннем постнатальном периоде на системное введение ксимедона.

3.6. Регенерация миелиновых волокон седалищного нерва в раннем постнатальном периоде под действием ксимедона

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реакция нейронов спинального ганглия на стимулирование посттравматической регенерации нерва в раннем постнатальном периоде крысы"

Актуальность. Массовая физиологическая гибель нейронов протекает в нейроонтогенезе при формировании нервных связей (Oppenheim, 1991). Она реализуется путем апоптоза, строго регулируемой формы активной клеточной гибели (Kerr, 1972). При повреждении нейроны также вступают в апоптоз (Berkelaar et al., 1994; Garcia-Valenzuela etal., 1994). Выявлены принципиальные различия в регуляции физиологической и посттравматической гибели чувствительных нейронов. В эмбриональном периоде циклин-зависимая киназа участвует в регуляции пролиферации и цитодифференцировки, а также стимулирует апоптоз нейронов (Nguyen et al., 2002). У половозрелой крысы эта киназа находится в неактивном состоянии и активируется только при дегенерации нейронов. Рост аксонов в нейрогенезе и после травматического повреждения нейронов контролируют различные сигнальные молекулы. Дефицит ключевых молекул, таких как митоген-активируемая киназа (МЕК) и фосфатидилинози-тол-3-киназа (PI3-K), блокирует удлинение отростков чувствительных нейронов в эмбриональном периоде, но не влияет на их посттравматическое удлинение у половозрелой крысы (Lui, Snider, 2001). Угнетение экспрессии ассоциированной с рецепторами цитокинов тирозинкиназы JAK в эмбриональном периоде не влияет на аксоногенез чувствительных нейронов, в то время как у половозрелой крысы её дефицит останавливает регенераторный рост аксона. Несмотря на наличие сведений о молекулярных основах различных реакций чувствительных нейронов в раннем развитии и в половозрелом организме, сравнительные феноменологические данные о поведении этих нейронов на разных этапах онтогенеза явно недостаточны. Отсутствует сравнительная оценка выраженности большинства морфогенетических процессов, таких как выживание нейронов конкретных популяций, рост аксонов и формирование связей с ин-нервируемой тканью-мишенью.

Данные о реакции чувствительных нейронов на травму в раннем постна-тальном периоде недостаточны и противоречивы. Перерезка периферического нерва на Р0 приводит к гибели 54% чувствительных нейронов к 15-м суткам после травмы (Himes, Tessler, 1989). В спинальных ганглиях через 7 суток после перерезки периферического отростка у новорождённых крысят погибает более 70% нейронов (Lewis et al., 1999). В аналогичных условиях у половозрелой крысы погибает 37% нейронов (Tandrup et al., 2000). У половозрелой крысы к 30 суткам после лигирования седалищного нерва погибает до 30% нейронов спинальных ганглиев L4-L5 (Рагинов и др., 2001). Воздействие радиационного излучения (Tongetal., 1997), капсаицина (Winter et al., 1993) или вирусной инфекции (Griffin et al., 1997) вызывает выраженную гибель нейронов в спиналь-ном ганглии новорождённых крысят. Чувствительные нейроны у половозрелой крысы, напротив, намного более устойчивы к подобным воздействиям. Ни пе-редавливание периферического отростка (Swettetal., 1995; Lekanetal., 1997), ни недостаток фактора роста нервов in vivo и in vitro (Johnson et al., 1980) не приводят к значительной гибели чувствительных нейронов у половозрелой крысы. По мнению Lewis et al. (1999), эти различия являют следствием дифференциальной активности генов на разных стадиях онтогенеза. У половозрелых животных количество нейронов спинального ганглия, вступающих в апоптоз после повреждения периферического отростка, зависит от их принадлежности к конкретной популяции (Tandrup et al., 2000; Рагинов, Челышев, 2003). Раньше и в наибольшем количестве погибают малые нейроны с тёмным перикарионом и безмиелиновым отростком (В-клетки) и в меньшей мере большие нейроны со светлым перикарионом и миелинизированным отростком (А-клетки). У новорождённых крысят при воспалении седалищного нерва раньше других погибают малые непептидергические нейроны (Beland, 2001). Остаётся неясной реакция чувствительных нейронов конкретных популяций на травму периферического отростка в раннем постнатальном периоде.

Важное практическое значение для восстановления нервных связей имеют фармакологические стимуляторы регенерации. Одним из таких стимуляторов является производное пиримидина лекарственный препарат ксимедон (1,2-дигидро-4,6-диметил,-М-(|3-оксиэтил) пиримидон-2). Он поддерживает посттравматическое выживание чувствительных нейронов, преимущественно связывающихся с изолектином В4 (1В4+-нейроны), стимулируя в них экспрессию антиапоптозного белка Вс1-2 (Ратинов и др., 1997). Этот эффект сопровождается усилением регенерации и ранним восстановлением контактов нейронов с клетками-мишенями у половозрелых животных. Однако остаётся неясным, влияют ли нейропротекторы и, в частности, ксимедон на выживание нейронов в раннем постнатальном периоде в ходе выраженной физиологической гибели чувствительных нейронов. Изучение механизмов действия нейропротекторов и потенциальных стимуляторов регенерации нервных волокон является актуальной практической задачей для предотвращения процесса нейродегенерации, в том числе посттравматической и постишемической гибели нейронов. В последнее время особенно актуальным становится поиск новых эффективных цито-протекторов стволовых и прогениторных нейральных клеток с целью увеличения сроков их выживания при клеточной терапии.

Цель и задачи исследования. Цель работы — оценка в раннем постнатальном периоде влияния стимулятора нейрорегенерации ксимедона на физиологическую и посттравматическую гибель чувствительных нейронов, а также на эффективность посттравматической регенерации их периферических отростков. В работе были поставлены следующие задачи:

1. В спинальном ганглии L5 крысы оценить динамику общего количества нейронов, количества малых, средних и больших нейронов, NF200+-, 1В4+- и каспа-за-9+-нейронов, а также количества миелиновых волокон в седалищном нерве в раннем постнатальном периоде.

2. Исследовать влияние травмы периферического нерва на выживание нейронов спинального ганглия L5 в раннем постнатальном периоде.

3. Оценить в раннем постнатальном периоде влияние стимулятора нейрорегенерации ксимедона на эффективность посттравматической регенерации нейронов спинального ганглия L5 и седалищного нерва.

Научная новизна. Впервые в раннем постнатальном периоде крысы показано изменение количества нейронов спинального ганглия, принадлежащих конкретным популяциям. Получены данные о том, что ксимедон не только сдерживает физиологическую гибель нейронов спинального ганглия L5 в раннем постнатальном периоде, но и избирательно влияет на различные популяции чувствительных нейронов. Впервые установлено, что выраженность посттравматической гибели чувствительных нейронов этих популяций у новорождённых крысят и половозрелых животных различаются. В раннем постнатальном периоде 1В4+-нейроны более устойчивы к травме периферического отростка. Впервые показано, что NF200+-HefipoHbi раньше других реагируют на введение ксимедона в период от рождения до половой зрелости, а также на травму в раннем постнатальном периоде на фоне введения ксимедона. Получены новые данные о различной динамике численности нейронов конкретных популяций в ходе посттравматической регенерации периферических отростков в раннем постнатальном периоде. Ранее других на травму периферического отростка реагируют малые нейроны. При этом гибель этих нейронов выражена в меньшей мере, по сравнению с нейронами других популяций в спинальном ганглии. Получены новые данные о том, что в раннем постнатальном периоде ксимедон не только сдерживает посттравматическую гибель чувствительных нейронов, но и стимулирует регенерацию миелиновых волокон периферического нерва и восстановление чувствительной функции.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты значимы для понимания механизмов пластичности периферических нейронов в раннем постнатальном периоде и в условиях их посттравматической регенерации, зависимости их выживания и фенотипа от нейротрофических сигналов. Полученные данные о динамике посттравматической гибели нейронов спинального ганглия позволяют оценить перспективы полноты восстановления сенсорной функции периферического нерва в клинической практике. Результаты исследований, свидетельствующие о различной степени выживания NF200+- и 1В4+-нейронов как в нейроонтогенезе, так и при травме периферического отростка, имеют практическое значение для прогноза восстановления функции афферентных волокон различной сенсорной модальности (болевая, температурная, тактильная чувствительность, проприорецепция). Данные о влиянии ксимедона не только на сформированную, но и на развивающуюся периферическую нервную систему позволят глубже понять механизм действия данного препарата и его значение, как эффективного нейропротектора при нейродегенеративных заболеваниях, нейротравмах и ишемии мозга. Полученные результаты о влиянии ксимедона на посттравматическое выживание чувствительных нейронов обосновывают применение фармакологических нейропротекторов и стимуляторов регенерации при культивировании нейральных клеток. Представляется особенно перспективным их применение для поддержания выживания и дифференци-ровки стволовых и прогениторных нейральных клеток при их трансплантации с целью стимулирования процесса нейрорегенерации. Положения, выносимые на защиту:

1. В раннем постнатальном периоде при травме периферического отростка 1В4-позитивные-нейроны спинального ганглия проявляют наибольшую пластичность.

2. Стимулятор посттравматической регенерации нервных волокон производное пиримидина ксимедон сдерживает физиологическую гибель чувствительных нейронов в раннем постнатальном периоде.

Апробация работы. Материалы работы доложены на международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), X Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2005), II Межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов (Ижевск, 2005), 4-й Всероссийской конференции «Бабу-хинские чтения в Орле» (2005), 8-м Европейском конгрессе по неврологии (Амстердам, 2005), 5-м междуна-родном симпозиуме экспериментальной и клинической нейробиологии (Стара Лесна, Словакия, 2005), 9-м конгрессе Европейской Федерации Неврологических Обществ (EFNS) (Афины, 2005), XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), 5-м Европейском форуме неврологии (FENS) (Вена, 2006), 10-м конгрессе Европейской Федерации Неврологических Обществ (EFNS) (Глазго, 2006), Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы морфологии» (Минск, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), 11-м конгрессе Европейской Федерации Неврологических Обществ (EFNS) (Брюссель, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 337 источник. Работа изложена на 134 странице машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 13 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Нигметзянова, Мария Владимировна

выводы

1. В раннем постнатальном периоде темпы прироста количества нейронов спинального ганглия нарастают в следующих рядах:

- NF200+-> 1В4+;

- средние —> большие —> малые.

2. Стимулятор регенерации периферического нерва ксимедон сдерживает гибель чувствительных нейронов в раннем постнатальном периоде. В интервале между рождением и 90-и сутками развития ксимедон в наибольшей степени поддерживает выживание больших и ЫР200+-нейронов спинального ганглия.

3. При передавливании седалищного нерва у новорождённых крысят значительно снижается выживание нейронов всех популяций, при этом гибель 1В4-нейронов выражена в наибольшей степени.

4. Посттравматическое введение ксимедона новорождённым крысятам в наибольшей мере поддерживает выживание больших нейронов спинального ганглия, в отличие от 1В4+-нейронов при посттравматическом введении препарата половозрелым животным.

5. Введение ксимедона в раннем постнатальном периоде к моменту половой зрелости увеличивает антиапоптозный потенциал нейронов спинального ганглия:

- более чем в 2 раза снижается количество каспаза-9+-нейронов;

- на фоне травмы нерва количество каспаза-9+-нейронов снижается более чем в 3 раза.

6. Параллельно с процессом увеличения количества нейронов в спинальном ганглии в раннем постнатальном периоде увеличивается количество миелино-вых волокон в периферическом нерве. К 90-м суткам развития количество мие-линовых волокон в седалищном нерве у крысы возрастает на 31,4%, по сравнению с новорождёнными животными.

7. Посттравматическое уменьшение количества нейронов сопровождается уменьшением количества миелиновых волокон. К 30 суткам после травмы количество миелиновых волокон уменьшается на 32,9%.

8. В раннем постнатальном периоде ксимедон стимулирует регенерацию периферического нерва. Увеличивается количество миелиновых волокон и восстанавливается кожная чувствительность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нигметзянова, Мария Владимировна, Москва

1. Билич TJL Современные проблемы фармакологической регуляции регенерации /• ГЛ Билич, В.Э. Кодла // В кн. Современные проблемы регенерации. Йошкар-Ола. -1980. -202с.

2. Вафин АЮ. Сравнительная характеристика влияния рибоксина и ноогропила на регенерацию периферического нерва: Авгореф. дис. канд. мед. наук. Саранск, 2000. - С20.

3. Грязнов АА Изучение нейротропных свойств ксимедона: Авгореф. дис. канд. мед. наук. -Казань, 2006.-25с.

4. Горбунов СМ Результаты экспериментального исследования ксимедона. / СМ Горубнов,

5. С.Г. Измайлов // В кн.: Ксимедон. Казань: Изд-во ИОФХ им. АЕ. Арбузова КФАН СССР. Казань. -1986. С.26-30.

6. Ермолаева И.В. Инструктивный апоптоз и рецепторы смерти / ИВ. Ермолаева // Вирусологии. 2001. - Москва.

7. Измайлов СГ. Ксимедон в клинической практике / СГ. Измайлов и др. // Издательство НГМА, Н.Новгород. 2001. - 186с.

8. Исмагилова АФ. Влияние некоторых производных пиримидина на экспериментальные язвы желуд ка у крыс / АФ. Исмагилова и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. -1998. Т.4. - С.23-25.

9. Лаврентьев Б.И. Стенограмма доклада на научной сессии ВИЭМ 25/ХП 1941 г. / Б.И. Лаврентьев // Томск. Цит. по «Теория строения вегетативной нервной системы». М.: Медицина. -1983. С. 49-61.

10. Масгугов Р.Ф. Пути влияния ксимедона на рост аксонов in vitro и in vivo / Р.Ф.Масгутов и др. // Морфологические ведомости. 2005. - №3-4. - С.66-69.

11. Рагинов КС. Влияние лекарственных препаратов ксимедон и ноотропил на регенерацию периферического нерва / И.С. Рагинов и др. // Российские морфологические ведомости. -1997.-№1(6).-С.120-126.

12. Раганов КС. Чувствительные нейроны и шванновские ютетки при фармакологической стимуляции регенерации нерва / И.С. Ратинов, ЮА Челышев // Морфология. 2000. -Т.118.-С.36-40.

13. Ратинов ПС. Выживание чувствительных нейронов различных субпопуляций после травмы нерва/И.С. Ратинов, ЮА Челышев//Морфологические ведомости. 2002. -№1-2.-С.151-152.

14. Ратинов И.С. Пошравматическое выживание чувствительных нейронов различных субпопуляций / КС. Ратинов, Ю А Челышев // Морфология. 2003. - Т.124(4). - С.47-50.

15. Ратинов И.С. Выживание и феношпическая характеристика аксотомированных нейронов спинальных ганглиев / И.С. Ратинов и др. // Морфология. 2004. - Т. 126(6). - С.4749.

16. Черепневым ГВ. Апошш-регулирующая активность ксимедона: Авгореф. дис. д-ра мед.наук: Казан.медун-т. Казань, 2002. - 41с. - Библиогр.С.41-44.

17. Acheson A A BDNF autocrine loop in adult sensory neurons prevents cell death / A Acheson et al. //Nature. -1995. Vol374, - №6521. - P.450453.

18. Adams J. The Bcl-2 protein family: Arbiters of cell survival / J. Adams, S. Cay // Science. -1998. -Vol. 253. P.1322-1326.

19. Agarwal S. Regulation of periodontal ligament cell function by intedeukin-lbeta/S. Agarwal et al. //Infect Immun. -1998. Vol.66, -№3. -P.932-937.

20. Adskogius H. Effects of sciatic neurectomy cm neuronal number and size distribution in L7 ganglion ofkittens/H. Adskogius, M. Risling//Exp. Neurol. -1981. Vol.74. - P.579-604.

21. Ambrus A Ontogeny of calretinin expression in rat dorsal root ganglia / A Ambrus, R Kraftsik, I. Barakat-Walter//Brain Res. Dev. -1998. -Vol.12, -№106(1-2). -P.101-108.

22. Amin V. Over-expression ofheat shock protein 70 protects neuronal cells against both thermal and ischaemic stress but with different efficiencies / V. Amin, D. Cumming, D. Latehman // Neurosci-Lett -19%. Vol. 8, -№206(1). - P.4548.

23. Anderson D. Molecular control of cell fate in the neural crest: The sympathoadrenal lineage /

24. D. Anderson // Amu. Rev. Neurosci. -1993. Vol. 16. - P.129-158.

25. Anderson D. Lineages and transcription factors in the specification of vertebrate primary sensory neurons / D. Anderson // Neuronal and glial cell biology. -1999. Vol.9. - P.517-524.

26. Anton E. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration /

27. E. Anton etal. //Proc.Natl. Acad Set USA -1994. Vol.91. -P2795-2799.

28. Aravind L. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery / L. Aravind, V. Dixit, E. Koonin//Trends Biochem. Sci. -1999. Vol.24, - №2. -P.47-53.

29. Arvidsson J. Cell loss in lumbar dorsal root ganglia and transganglionic degeneration afler sciatic nerve resection in Ihe rat / J. Arvidsson, J. Ygge, G. Grant // Exp. Brain Res. -1986. Vol.373. -P.15-21.

30. Ashkenazi A Death receptors: signaling and modulation / A Ashkenazi, V. Dixit // Science.1998. Vol. 28, - №281(5381). - P.1305-1308.

31. Atwal J. The TikB-She site signals neuronal survival and local axon growth via MEK and P13-kinase / J. Atwal et al. //Neuron. 2000. - Vol.27. - P.265-277.

32. Averill S. Immunocytochemical localization of trkA receptors in chemically identified subgroups of adult rat sensory neurons / S. Averill et al. // Eur. J. Neurosci. -1995. Vol.7, - №7. - P.1484-1494.

33. Azzduz M. Enhancement of mouse sciatic nave regeneration by the long chain My alcohol, N-Hexacosanol / M. Azzouz et al. // Exp. Neurol. -1996. Vol.138, -№2. -P.189-197.

34. Bahadori M. Sciatic nerve transection in neonatal rats induces apoptotiс neuronal death in L5 dorsal root ganglion / M, Bahadori, T. Al-Tiraihi, M. Valojerdi // J. Neurocytol. 2001. - Vol30, - №2. -P.125-130.

35. Bajrovic F. Long-term effects of deprivation of cell support in the distal stump on peripheral nerve regeneratkm/F. Bajrovic, M. Bresjanac, J. Sketelj //Neurosci. Res. -1994. Vol39. -P23-30.

36. Barrett G. The p75 nerve growth factor receptor mediates survival or death depending on the stage of sensory neuron development / G.Barrett, P.Bartlett // Proc.Nat Acad Sci.USA 1994. -Vol.91, - №14.-P.6501-6505.

37. Bates S. Mechanisms of p53-mediated apoptosis / S. Bates, K. Vousden // Cell Mol. Life Sci.1999.- Vol.55, -№l.-P.28-37.

38. Beland B. Mu- and delta-opioid receptors are downregulated in the largest diameter primary sensory neurons during postnatal development in rats / B. Beland//Pain. 2001. - Vol. 1, - №90(1-2). -P.143-150.

39. Benetello P. Therapeutic drug monitoring oflamotrigine in patients suffering from resistant partial seizures/P. Benetello etal. //EurNeurol. 2002. -Vol.48, - №4. - P.200-203.

40. Bengtsson H. Expression of activin receptors type I and П only partially overlaps in the nervous system/H. Bengtsson, S. Soderstrom, T. Ebendal/Neuroreport -1995. Vol.7, -№1. -P.l 13-116.

41. Berkelaar M Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats / M. Berkelaar et al. Ill Neurosci. -1994. Vol.14, - №7. - P.4368-4374.

42. Bemardi P. Mitochondria and cell death. Mechanistic aspects and methodological issues / P. Bemardi et al. // Eur. J. Biochem. -1998. Vol.264, - №3. - P.687-701.

43. Biige R A role for Schwann cells in the neurodegenerative effects of a non-immunosuppressive &506 derivative, jnj460/ R Birge, S. Wadsworth, R Akakura // Neuroscienee. 2004. - Vol. 124, -№2.-P.351-366.

44. BisbyM Regeneration of peripheral nervous systemaxons/M Bisby etal. //The Axon: Structure, Function and Pathophysiology Oxford University Press, New York, Oxford. -1995. - P.553-578.

45. Bondok A. Retrograde and transganglionic degeneration of sensory neurons after a peripheral nerve lesion at birth/A Bondok,F. Sansone // Experimental Neurology. -1984. Vol.86. - P.322-330.

46. Bormi A. Cell curvival promoted by the Ras-MAPK signaling pathway by transcription-dependent and -independent mechanisms / A Bonni et al. // Science. -1999. Vol.286. - P.1358-1362.

47. Bothwell M. Functional interactions ofneurotrophins and neurotrophin receptors / M Bothwell // Annu. Rev. Neurosci. -1995. Vol.18. - P.223-253.

48. Bradbury E. The expression of P2X3 purinoreceptors in sensory neurons: effects of axotomy and glial-derived neurotrophic factor/Е. Bradbury, G. Burnstock, S. McMahon//Mol. Cell Neurosci. -1998. Vol. 12. - P.256-268.

49. Bregman B. Infant lesion effect: П. Sparing and recovery of function after spinal cord damage in newborn and adult cats / B. Bregman, M Goldbeiger// Brain Res. -1983.-Vol.285,-№2.-P.l 19135.

50. Bronner-FraserM Enviromental influences on neural crest cell migration / M Bronner-Fraser//J. Neurobiol. -1992. Vol24. -P.233-247.

51. Brown M. Poor growth of mammalian motor and sensory axons into proximal nerve stumps / M Brown, E. Lunn, V. Репу//Eur. J. Neuro. Sci. -1992. Vol.3. - P.1366-1369.

52. Buchman V. Different neurotrophins are expressed and act in a developmental sequence to promote the survival of embryonic sensory neurons / V. Buchman, A. Davies //Development -1993.• Vol.118.-P.989-1001.

53. Buj-Bello A. GDNF is an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons / A. Buj-Bello, V. Buchman, A Hortan //Neuron. -1995. Vol. 15, - №4. - P.821-828.

54. Bunge R. Linkage between axonal ensheathment and basal lamina production by Schwann cells / R. Bunge, M. Bunge, C. Eldridge//Ana Rev. Neurosci. -1986. Vol.9. - P305-328.

55. Bursch W. Cell death by apoptosis and its protective role against disease / W.Bursch, э F. Oberhammer, R. Schulte-Hermann // Trends Pharmacol. Sci. -1992. Vol. 13. - P245-251.

56. Cajal R. Degeneration and Regeneration of the Nervous System / R Cajal // Oxford University Press, London. -1928.

57. Cardenas M. Molecular mechanisms of immunosuppression by cyclosporine, FK506, and rapa-mycin/ M Cardenas, D. Zhu, J. Heitman//Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. -1995. Vol.4, - №6. -P.472477.

58. Cardenas С. 5НГ4 receptors couple positively to tetrodotoxin-insensitive sodium channels in a subpopulation of capsaidn-sensMve rat sensory neurons / C. Cardenas et al. // J. Neurosci. -1997. -Vol.1,-№17(19).-P.7181-7189.

59. Ceballos D. Morphametric and ultrastructural changes with ageing in mouse peripheral nerve / D. Ceballos etal. //J. Anat -1999. Vol.195. -P.563-576.

60. Cecchini T. Changes in the number of primary sensory neurons in normal and \atamin-E-deficient rats during aging/ T. Cecchini et al. // Somatosens. Mot Res. -1995. Vol.l2, - №3-4. - P.317-327.

61. Ciaroni S. Are there proliferating neuronal precursors in adult rat dorsal root ganglia? / S. Ciaroni et al. // Neurosci. Lett 2000. - Vol.3, -№281(1).- P.69-71.

62. Chen С. A P2X purinoceptar expressed by a subset of sensory neurons / C. Chen, A Akopian, L. Sivilotti//Nature. -1995. Vol377. -P.428-431.

63. Chen Z. Glial cell line-derived neurotrophic factor enhances axonal regeneration following sciatic nerve transection in adultrat/Z. Chen, Y. Chai, L. Cao//J. Brain. 2001. - Vol.902, - №2. -P.272-276.

64. Cheng C. Sensory neurons with activated caspase-3 survive long-term experimental diabetes / C. Cheng, D. Zochodne // Diabetes. 2003. - Vol.52. - P2363-2371.

65. Chinnaiyan A Interaction of CED4 with CED-3 and CED-9: a molecular framework for cell death/A Chinnaiyan etal.//Science. -1997. Vol.275. -P.l 122-1126.

66. Chopra B. Cyclooxygenase-1 is a marker for a subpopuMon of putative nociceptive neurons in rat dorsal root ganglia / B. Chopra, S. Giblett, J. Little // Eur. J. Neurosci. 2000. - Vol.12. - P3911-3920.

67. Coggeshall R. Dorsal root ganglion cell death and surviving cell numbers in relation to the development of sensory innervation in the rat hindlimb / R. Coggeshall, C. Pover, M Fitzgerald // Dev. Brain. Res. -1994. Vol.82, - №1-2. - P.l93-212.

68. Cohen J. Apoptosis: the physiologic pathway of cell death / J. Cohen // Hosp. Pract (Off Ed). -1993. Vol.15, - №28(12). - P.35-43.

69. Cohen J. Apoptosis and its regulation/J. Cohen//Adv. Exp. Med Biol. -1996. Vol.406. -P.l 120.

70. Cortazzo M. Nerve growth factor (NGF)-mediated protection of neural crest cells from antimitotic agent-induced apoptosis: The role of the low-affinity NGF receptor / M Cortazzo et al. // J. Neurosci. -1996. Vol.16, -№ 12. - P.3895-3899.

71. Creange A Cytokines and peripheral neuropathies / A Creange et al. // Rev. Neurol. -1998. -Vol.154,-№3.-P.208-216.

72. Creedon D. Mitogen-activated protein kinase-independent pathways mediate the effects of nerve growth factor and cAMP on neuronal survival / D. Creedon, E. Johnson, J. Lawrence // J. Biol. Chem -1996. Vol.271. -P.20713-20718.

73. Crowley C. Mice lacking nerve growth factor display perinatal loss of sensory and sympathetic neurons yet develop basal forebrain cholinergic neurons / C. Crowley, S. Spencer, M. Nishimura // Cell. -1994. Vol.78. -P.1001-1011.

74. Crowder R. Phosphatidylinositol 3-kinase and Akt protein kinase are necessary and sufficient for the survival of nerve growth factor-dependent sympathetic neurons / R. Crowder, R. Freeman // J Neurosci. -1998. Vol. 18, - №8. - P.2933-2943.

75. Curtis R Retrograde axonal transport of LLF is increased by peripheral nerve injury: correlation with increased LIF expression in distal nerve / R Curtis, S. Scherer, R Somogyi // Neuron. -1994. -Vol.12.-P.191-204.

76. Davies A The role of neurotrophic in the developing nervous system/A Davies//J. Neurobiol. -1994.-Vol.25.-P.1334-1348.

77. Deckwerth T. Temporal analysis of events associated with programmed cell death (apoptosis) of sympathetic neurons deprived of nerve growth factor / T. Deckwerth, E. Johnson // J. Cell Biol. -1993. Vol.123,-№ 5.-P.1207-1222.

78. Delree P. Plasticity of developing and adult dorsal root ganglion neurons as revealed in vitro / P. Delree, C. Ribbens, D. Martin//Brain Res. Bull. -1993. Vol.30, -№34. -P.231-237.

79. Derby A Neive growth factor facilitates regeneration across nerve gpps: morphological and behavioral studies in rat sciatic nerve / A Derby, V. Engleman, G. Friendich // Exp. Neurol. 1993. -Vol.119.-P.176-191.

80. Dewulf. Distinct spatial and temporal expression patterns of two type I receptors for bone morpho-genetic proteim during mouse OTibyogenesis/N.Dev^ilfetal.//E^oainolo^.-1995.-Vol.136, №6. - P.2652-2663.

81. DevorM Proliferation of primary sensory neurons in adult rat dorsal root ganglion and the kinetics of retrograde cell loss after sciatic nerve section/М. Devoretal. // Somatosensory Research -1985. -Vol.3.-P.139-167.

82. Dodge M. Factors contributing to neurotrophin-independent survival of adult sensory neurons / M Dodge, M Rahimtula, K. Mearow//Brain Research. 2002. - Vol.953. - P.144-156.

83. Donnerer J. Regeneration of primary sensory neurons / J. Donnerer // Pharmacology. 2003. -Vol.67,-№4.-P.169-181.

84. Degn J. Effect of nave crush on perikaryal number and volume of neurons in adult rat dorsal root ganglion / J. Degn, T. Tandrnp, J. Jakobsen // J. Сотр. Neurol. 1999. - Vol.13, - №412(1). -P.186-192.

85. EdoflfK. Effects ofIL-1 p, IL-6 or LIF on rat sensory neurons co-cultured with fibroblast-like cells / K. Edoff; H. Jerregprd//J. Neurosci. Res. 2002. - Vol.67. - P.255-263.

86. Edstrom A Moderate elevation of extracellular potassium transiently inhibits regeneration of sensory axons in cultured adult sciatic nerves / A Edstrom, P. Ekstrom, P. Wiklund // Brain Res. -1995. Vol.693, - № 1-2. - P.148-154.

87. ElShamy W. A local action of neurotrophin-3 prevents the death of proliferating sensory neuron precursor cells/W.ElShamy, P. Emfors//Neuron.-1996. Vol.16,-P.963-972.

88. Enokido Y. Developmental changes in the response of trigeminal neurons to neurofcrophins: Influence ofbirthdate and the ganglion environment / Y. Enokido, S. Wyatt, A Davies // Development -1999. Vol.126. - P.43654373.

89. Emfors P. Mice lacking kain-derived neurotrophic factor develop with sensory deficits / P. Emfors, K. Lee, R Jaenisch //Nature. -1994. Vol.368. - P.147-150.

90. Farel P. Late differentiation contributes to the apparent increase in sensory neuron number in juvenile rat/P. Farel// BrainRes. Dev. Brain Res. 2003. - Vol.12, - №144(1). - P.91-98.

91. Farinas I. Severe sensory and sympathetic deficits in mice lacking neurotrophin-3 /1. Farinas et al. // Nature. -1994. Vol.369. - P.658-661.

92. Farinas I. Lack of neurotrophin-3 results in death of spinal sensory neurons and premature differentiation oftheir precursors/1. Farinas etal. //Neuron. -1996. Vol.17. - P.1065-1078.

93. Farinas I. Characterization of neurotrophin and trie receptor functions in developing sensory ganglia: Direct NT-3 activation of trkB neurons in vivo /1. Farinas et al. // Neuron. -1998. Vol.21. -P.325-334.

94. Farinas I. Regulation of neurogenesis by neurotrophins in developing spinal sensory ganglia / I. Farinas et al. // Brain Research Bulletin. 2002. - Vol.57, - №6. - P.809-816.

95. Finkbeiner S. CREB couples neurotrophin signals to survival messages / S. Finkbeiner // Neuron.-2000.-Vol.25.-P. 11-14.

96. Frade J. Nerve growth factor: Two receptors, multiple functions / J. Frade, Y. Baide // Bioes-says. -1998. Vol.2. - P.137-145. !• 104. Fujino M. Intestinal thrombotic microangiopathy induced by FK506 in rats / MFujino,

97. Y. Kim, M Ito // Bone Marrow Transplant 2007. - Vol.39, - №6. - P.367-372.

98. Gaese. Sensory ganglia require neurotrophin-3 early in development / F. Gaese, R. Kolbeck, * Y.Barde//Development-1994.-Vol.120,-№6.-P.1613-1619.

99. Garcia-Valenzuela E. Apoptosis in adult retinal ganglion cells after axotomy / E. Garcia-Valenzuela et al. //Journal ofNeurobiology. -1994. Vol.25. - P.431 -438.

100. Gertrud L. Uber die Beeinflussing do- Nerven feser regeneration in Nerven gewebe kulturen durch Wirkstoffe/L. Geriiud, G. Gisela//Z. mikrosk. anaL forsch. 1980.-Vol.94,-№6.-P.l 1051113.

101. Gerschenson L. Apoptosis: a different type of cell death / L. Gerschenson, R Rotello // J. FASEB. -1992. Vol.6. - P.2450-2455.

102. Gbson S. A novel substance P pathway linking the dorsal and ventral hom in the upper lumbar segments of the rat spinal cord / S. Gibson, S. Bloom, J. Polak // Brain Res. 1984. - Vol.3, -№301(2).-P243-251.

103. Gillardon F. Expression pattern of candidate cell death effector proteins Bax, Bcl-2, Bcl-X, and c-Jun in sensory and motor neurons Mowing sciatic nerve transection in the rat / F. Gillardon et al. //BrainRes. -1996. Vol.739, -№1-2. -P.244-250.

104. Gold B. The immunosuppressant FK506 increases the rate of axonal regeneration in rat sciatic nerve / B. Gold, K. Katah, T. Storm-Dickerson // J. Neurosci. -1995. Vol.15, - №11. - P.7509-7516.

105. Gold B. FK506 and the role of immunophilins in nerve regeneration / B. Gold // Mol. Neurobiol. -1997. Vol.15, - №3. - P.285-306.

106. Gold B. The immunosuppressant FK506 increases GAP-43 мРНК levels in axotomized sensory neurons / B. Gold, J. Yew, M Zeleny-Pooley //Neurosci. Lett. -1998. Vol.23, -№241(1). -P.25-28.

107. Gold B. FK506 requires stimulation of the extracellular signal-regulated kinase 1/2 and the steroid receptor chaperone protein p23 for neurite elongation / B. Gold, Y. Zhong // Neurosignals.2004. Vol.l3,-№3. - P.122-129.

108. Goldberg J. The relationship between neuronal survival and regeneration / J. Goldberg,

109. B. Barnes //Ann. Rev. Neurosci. 2000. - Vol.23. - P.579-612.

110. Goldman P. Functional recovery after lesions of the nervous systems. 3. Developmental processes in neural plasticity. Recovery of function after CNS lesions in infant monkeys/P. Goldman// Neurosci. Res. Program Bull. -1974. Vol. 12, - №2. - P.217-222.

111. Golstein P. Cell death: TRAIL and its receptors / P. Golstein // Curr. Biol. 1997. - Vol.l, -№7(12). - P.750-753.

112. Green D. Apoptosis. Death deceiver / D. Green // Nature. 1998. - Vol.17, -№396(6712). -P.629-630.

113. Green D. Mitochondria and apoptosis / D. Green, J. Reed // Science. 1998. - Vol.28, -№281(5381).-P.1309-1312.

114. Griffin C. Ontogenic expression of renal and hepatic angiotensin П receptor genes in the rat /

115. C. Griffin etal. //Nephron. -1997. Vol.76, -№1. -P. 103-110.

116. Gross A Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis / A Gross, J. McDonnell, S. Korsmeyer//Genes Dev. -1999. Vol.13. -P.1899-1911.

117. Grosskreutz C. FK506 blocks activation of the intrinsic caspase cascade after optic nerve crush / C. Grosskreutz et al. // Exp. Eye Res. 2005. - Vol.80,-№5. -P.681-686.

118. Groves M. Axotomy-induced apoptosis in adult rat primary sensory neurons / M Groves etal.// J. Neurocytol. -1997. Vol.26, - №9. - P.615-624.

119. Gupta S. Apoptosis/prograrnmed cell death. A historical perspective / S. Gupta // Adv. Exp. Med Biol. -1996. Vol.406. -P. 1-9.

120. Hall A Skin cell induction of calcitonin gene-related peptide in embryonic sensory neurons in vitro involves activin developmental / A Hall, K. Dinsio, J. Cappuzzello // Biology. 2001. -Vol.229.-P.263-270.

121. Hammarberg H GDNF mRNA in Schwann cells and DRG satellite cells after chronic sciatic nerve injury / H Hammarberg et al. /Neuroreport. -1996. Vol.7. - P.857-860.

122. Harper S. Analysis of the neurotrophic effects of GPI-1046on neuron survival and regeneration in culture and in vivo / S. Harper et al. //Neuroscience. -1999. Vol.88, - №1. - P.257-267.

123. Hayes N. Exploiting the dynamics of S-phase tracers in developing brain: interkinetic nuclear migration for cells entering versus leaving the S-phase / N. Hayes, R. Nowakowski // Dev Neurosci.- 2000. Vol.22, - №1-2. - P.44-55.

124. Hendry I. Binding and retrograde transport of leukemia inhibitory factor by the sensory nervous system /1. Hendry, M Murphy, D. Hilton// J. Neurosci. -1996. Vol. 12. - P.3427-3434.

125. Heng^rtner M. Programmed cell death in the nematode C. elegans / M. Hengartner // Recent Prog. Horm. Res. -1998. Vol.54. - P213-224.

126. Henken D. Exspression ofbbpn^rotachykinin mRNA and tachykinins in rat dorsal root ganglion cells following peripheral or central axotomy / D. Henken, W. Battisti, M Chesselet//Neun> science. -1990. Vol.39, -№3. - P.733-742.

127. Hetman M Role of glycogen synthase kinase-3beta in neuronal apoptosis induced by trophic withdrawal /М Hetman etal. //J. Neurosci. 2000. - Vol20. - P.2567-2574.

128. Himes B. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats / B. Himes, A Tessler// J. Сотр. Neurol. -1989. Vol284,- №2.-P.215-230.

129. Hockenbery D. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis / D. Hockenbery, Z. Oltvai, X.Yin//Cell. -1993. Vol.75. - P.241-251.

130. Holzer P. Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve ending^: involvement of tachykinins, calcitonin gene-related peptide and other neuropeptides / P. Holzer // Neuroscience. -1988. Vol.24,-№3. -P.739-768.

131. Honda T. Co-localization of the glial cell-line derived neurotrophic factor and its functional receptor c-RET in a subpopulalion of rat dorsal root ganglion neurons / T. Honda, M Takahashi, Y. Sugiura //Neuroscience Letters. -1999. Vol.8. - P.45^8.

132. Honma Y. Induction of differentiation of human myeloid leukemia cells by novel synthetic neurotrophic pyrimidine derivatives / Y. Honma et al. // Exp. Hematol. 2001. - Vol.29, - №2. -Р.19Ф-201.

133. Hone H1L-1 beta enhances neurite regeneration from transected-nerve terminals of adult rat DRG/H. Heme et al. //Neuroreport -1997. Vol.27, - №8(8). - P. 1955-1959.

134. Houenou L. Exogenous heat shock cognate protein Hsc 70 prevents axotomy-induced death of spinal sensory neurons / L. Houenou, L. Li, M Lei // Cell Stress Chaperones. -1996. Vol. 1, - №3. -P.161-166.

135. Houenou L. Administration ofHsp70 in vivo inhibits motor and sensory neuron degeneration / L. Houenou, J. Tidwell, M. Tytell // Cell Stress Chaperones. 2004. - Vol.9, - № 1. - P.88-98.

136. Huang E. Expression of Trk receptors in the developing mouse trigeminal ganglion: In vivo evidence for NT-3 activation of TrkA and TikB in addition to TrkC / E. Huang et al. // Development -1999. Vol.126. -P.2191-2203.

137. Huang E. Neurotrophins: Roles in neuronal development and function / E. Huang, L. Reichardt // Armu. Rev. Neurosci. -2001. Vol.24. - P.677-736.

138. Huppertz B. The apoptosis cascade —morphological and immunohistochemical methods for its visualization / B. Huppertz, H. Frank, P. Kaufrnann // Anat Embryol. (Beri). -1999. Vol.200, -№1.-P. 1-18.

139. Ikeuchi T. MS-430, a synthetic pyrimidine derivative, influences the intracellular signal transduction pathway leading to neuronal differentiation ofPC12h cells/Т. Ikeuchi et al. //J. Biochem. -1998. Vol.123, - №3. - P.423430.

140. Isomoto S. Rapamycin as an inhibitor of osteogenic differentiation in bone marrow-derived mesenchymal stem cells / S. Isomoto et al. // J. Qrlhop. Sci. 2007. - Vol. 12, - № 1. - P.83-88.

141. Itoh S. Ню effect of neurotrophic pyrimidine heterocyclic compounds, MS-818 and MS-430, on the regeneration of injured peripheral nerves / S. Itoh et al. // Restor. Neurol. Neurosci. -1999. -Vol.14,-№4.-P.265-273.

142. Jackman A. Development of peripheral hindlimb and central spinal cord innervation by sub-populations of dorsal root ganglion cells in the embryonic rat / A. Jackman, M. Fitzgerald //л J. Сотр. Neurol. 2000. - Vol.13, -№418(3). - P.281-298.

143. Jiang X. The effect ofMS-818,a pyrimidine compound, on the regeneration ofperipheral nerve 5» fibers of mice after a crush injury / X Jiang, A Qhnishi, T. Yamamoto // Acta. Neuropathol. -1995.- Vol.90.-P.130-134.

144. Jin K. Directed migration of neuronal precursors into the ischemic cerebral cortex and striatum / K. Jin etal. //МЫ Cell Neurosci. 2003. - Vol.24. -P.l71-189.

145. Johnson E. Jr. Dorsal root ganglion neurons are destroyed by exposure in utero to maternal antibody to nerve growth fector / E. Johnson Jr et al. // Science. 1980. - Vol.21, - №210(4472). -P.916-918.

146. Jones L. Proline at position 36: a new transthyretin mutation associated with familial amyloi-dotic polyneuropathy / L. Jones, J. Skare, J. Harding // Am. J. Hum. Genet 2001. - Vol.48. -P.979-982.

147. Jones K. Targeted disruption of the BDNF gene perturbs brain and sensory neuron development but not motor neuron development / K. Jones et al. // Cell and function. Annu. Rev. Neurosci. -1994,-Vol.24.-P.677-736.

148. Kaechi K. Methylcatechol, an inducer of nerve growth factor synthesis, enhances peripheral nerve regeneration across nerve gaps /К. Kaechi et al. //J. Pharmacol. Exp. Ther. -1995. Vol.272, -J4o3.-P.130(M304.

149. Kahane N. Expression of trkC receptor mRNA during development of the avian nervous system /N. Kahane, C. Kalcheim//J. Neurobiol. -1994. Vol.25,-№5. - P.571-584.

150. Kalcheim C. Neurotrophin 3 is a mitogen for cultured neural crest cells / C. Kalcheim, C. Carmeli, A Rosenthal //Proc. Natl. Acad Sci. USA -1992. Vol.89. - P.1661-1665.

151. Kaplan D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system / D. Kaplan, F. Miller// Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - Vol.3. - P.381-391.

152. Kashiba H. Glial cell line-derived neurotrophic factor and nerve growth fktor receptor mRNAs are expressed in distinct subgroups of dorsal root ganglion neurons and are differentially regulated

153. M by peripheral axotomy in the rat/H. Kashiba, B.Hyon,E. Senba // Neuroscience Letters. -1998.1. Vol.4.-P.107-110.

154. Katoh S. The rescuing effect of nerve growth fktor is the result ofup-regulation ofbcl-2 in hy-peroxia-induced apoptosis of a subclone of pheochromocytoma cells, PC12h / S. Katoh et al. // Neuroscience Letters. -1997.-Vol.232.-P.71-74.

155. Kawasaki Y. Identification of myelinated motor and sensory axons in a regenerating mixed * nerve/Y. Kawasaki etal.//J.Hand Surg. Am.-2000.-Vol.25,-№1.-P.104-111.

156. Ke Y. Early response of endogenous adult neural progenitor cells to acute spinal cord injury in mice ГY. Ke et al. // Stem Cells. 2006. - Vol.24, - №4. - P.l011-1019.

157. Kerr J. Apoptosis: A basik biologucal phenomen with wide-ranging implications in tissue kinetics / J. Kerr, A. Wyllie, A. Cunie //Br. J. Cancer. -1972. Vol.26. - P239-257.

158. Kinnman E. Collateral remnervation and expansive regenerative reinnervation by sensory axons into 'foreign' denervated skin: An immunohistochemical study in the rat / E. Kinnman et al. // Exp. Brain. Res. -1992.-Vol.91, -№1.- P.61-72.

159. Kishi M. Morphometry of dorsal root ganglion in chronic experimental diabetic neuropathy / M. Kishi et al. //Diabetes. 2002. - Vol.51. - P.819-824.

160. Klein R Targeted disruption of the trkB neurotrophin receptor gene results in nervous system lesions and neonatal death/R Klein etal.// Cell. -1993.-Vol.75.-P.l 13-122.

161. Klein R Disruption ofthe neurotrophin-3 receptor genetrkC eliminates la muscle afferents and results in abnormal movements/R Klein, I. Silos-Santiago, R Smeyne//Nature. -1994. Vol.368. -P.249-251.

162. Kluck R The release of cytochrome с from mitochondria: A primary site for bcl-2 regulation of apoptosis / R. Kluck, E. Bossy-Wetzel, D. Green// Science. -1997. Vol.275. - P.l 132-1136.

163. Kotani Y. Prosaposin facilitates sciatic nerve regeneration in vivo / Y. Kotani, S.Matsuda, M Sakanaka//J. Neurochem -1996. Vol.66, - №5. - P2019-2025.

164. Kotulska К Impaired regeneration ofbcl-2-lacking peripheral nerves / K. Kotulska, et al. // Neurol Res. 2005. - Vol.27, -№8. - P.843-849.

165. Koyama Y. Neurotropic pyrimidine heterocyclic compounds. П. Effects of novel neurotropic pyrrolidine derivatives on astrocytic morphological differentiation / Y. Koyama, etal. // Biol. Pharm. Bull. -1997.-VoL20,-№2.-P.138-141.

166. Krajewski S. Release of caspase-9 from mitochondria during neuronal apoptosis and cerebral * ischemia/ S. Krajewski et al. //Proc. Natl. Acad Sci. USA. -1999. -Vol.96, №10. -P.5752-5757.

167. Kroemer G. The pnoto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis // Nature Medicine. -1997.-Vol.3.-P.614-620.

168. Kroemer G. Mitochondrial control of apoptosis / G. Kroemer, N. Zamzani, S. Susin // Immunol Today. -1997. Vol. 18. - P.44-51.

169. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis / G. Kroemer // Nat Med -1997. Vol3. - P.614-620.

170. Kroemer G. Mitochondrial control of cell death / G. Kroemer, J. Reed // Nat Med. 2000. -Vol.6.-P.513-519.

171. Kujawa K. Testosterone regulation of the regenerative properties of injured rat sciatic motor neurons/K Kujawa, J. Jacob, К Jones//J. Neurosci. Res. -1995. Vol.35, -№3. - P.268-273.

172. Kuo L. Effects of systemically administered NT-3 on sensory neuron loss andnestin expression following axotomy / L. Kuo et al. // J. Comp Neurol. 2005. - Vol.21. - №482(4): - P320-332.

173. Kurek J. Upregulation of leukemia inhibitoiy factor and interleukin-6 in transected sciatic nerve and muscle following denervation/J. Kurek, L. Austin, S. Cheema//Neuromuscul. Disord -1996. -Vol.6. -P.105-114.

174. La Forte R. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells / R. La Fate et al. // SomatosensMot Res. -1991. Vol.8, - №1. - P.3-7.

175. Lawson S. Development of mouse dorsal root ganglia: an autoradiographic and quantitative study / S. Lawson, T. Biscoe // J. Neurocytol. -1979. Vol.8, - №3. - P.265-274.

176. Lawson S. Morphological and biochemical cell types of sensory neurons / S. Lawson // Sensory Neurons: Diversity, Development, Plasticity, Oxford Univ. Press, New York. -1992. P27-59.

177. Le Douarin N. Cell Lineage analysis in neural crest ontogeny / N. Le Douarin, E. Dupin // J.Neurobiol. -1992. Vol.24. -P.146-161.

178. Leclere P. Effects of glial cell line-derived neurotrophic factor on axonal growth and apoptosis in adult mammalian sensory neurons in vitro / P. Leclere et al. //Neuroscience. -1997. Vol.5, - №82.-P.545-558.

179. Lee Y. Distribution of calcitonin gene related peptide in the rat peripheral nervous system with reference to its coexistence with substance P / Y. Lee et al. // Neuroscience. -1985. Vol.15. -P.1227-1237.

180. Lee M. FK506 promotes functional recovery in crushed rat sciatic nerve / M. Lee et al. // Mus-cleNerve. 2000. - Vol.23, - №4. - P.633-640.

181. Lekan H. Loss of dorsal root ganglion cells concomitant with dorsal root axon spouting following segmental rove lesions / H. Lekan et al. //Neuroscience. -1997. Vol.81, - №2. - P.527-534.

182. Levi G. Models of cell migration in the vertebrate embryo / G. Levi, J.-L. Duband, J. Thiery // Intern. Rev. Cytol. -1990. Vol.123. - P.201-252.

183. Levi-MontaJcini R The nerve growth factor 35 years later / R Levi-Montalcini // Science. -1987.-Vol.237. -P.l 154-1162.

184. Lewis C. Coexpressim of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated currents in sensory neurons / C. Lewis, S. Neidhait, C. Holy // Nature. -1995. Vol377. - P.432-435.

185. Lewis S. A role for HSP27 in sensory neuron survival / S. Lewis et al. // J. Neurosci. -1999. -Vol.15, №19(20). - P.8945-8953.

186. Li L. Rescue of adult mouse motoneurons from injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic fectar/L. Li, W. Wu, L. Lin//Proc. Nail. Acad. Sci. USA. -1995. Vol.92. -P.9771-9775.

187. Li P. Cytochrom с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade/P. Li etal. //Cell. -1997. Vol.91. - P.479-489.

188. Li С. Distinct ATP-activaled currents in different types of neurons dissociated firm rat dorsal root ganglion/С. Li et al. //Neurosci. Lett. -1999. Vol.263, - №1. - P.57-60.

189. Liebl D. Absence of sensory neurons before target innervation in brain derived neurotrophicfactor-, neurotrophic-, and trkC-deficient embryonic mice / D. Liebl, et al. // J. Neurosci. -1997. -Vol.17.-P.9113-9121.

190. Liebl D. Loss ofbrain-derived neurotrophic fktor-dependent neural crest-derived sensory neurons in neurotrophin-4 mutant mice / D. Liebl et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. - Vol.97. -P.2297-2302.

191. Liebl D. Loss ofbrain-derived neurotrophic factor-dependent neural crest-derived sensory neurons in neurotrophin-4 mutant mice / D. Liebl et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. - Vol.97. -P.2297-2302.

192. Lindholm D. Interleukin-1 regulates synthesis of nerve growth factor in non-neuronal cells ofrat sciatic nerve/D. Lindholm et al. //Nature. -1987. Vol330. - P.123-132.

193. Lindwall C. The Janus role of c-Jun: cell death versus survival and regeneration of neonatal sympathetic and sensory neurons / C. Lindwall, M. Kanje//Exp. Neurol. -2005. Vol.196, -№1. -P.184-194.

194. Lindwall C. The role of p-oJun in survival and outgrowth of developing sensory neurons / C. Lindwall, M. Kanje //Neuroreport 2005. - Vol.16, - №15. - P.l 655-1659.

195. Linseman D. Insulin-like growth factor-I blocks Bcl-2 interacting mediator of cell death (Bim) induction and intrinsic death signaling in cerebellar granule neurons / D. Linseman et al. // J. Neurosci. 2002. - Vol.22. - P.9287-9297.

196. Lisak R. Antibodies to interleukin-1 inhibit cytokine-induced proliferation of neonatal rat Schwann cells in vitro/R. Lisak, B. Bealmear//J. Neuroimmunol. -1991. Vol.31. - P.123-132.

197. Lisak R. The role of cytokines in Schwann cells damage, protection and repair / R. Lisak et al. // J. Infect Dis. -1997. Vol.176.-P.173-179.

198. Lisak R. Inflammatory cytokines inhibit upregulation of glycolipid expression by Schwann cells in vitro / R. Lisak et al. //Neurology. -1998. Vol.51, - №6. - P.1661-1665.

199. Liu X. Sensory but not motor neuron deficits in mice lacking NT4 and BDNF / X Liu et al. // Nature. -1995. Vol.375. - P.238-241.

200. Liu R Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth/R. Liu, W. Snider//J. Neurosci. 2001.-Vol.1.-P21.

201. Lledo P.-M Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits / P.-M. Lledo,

202. M. Alonso, M. Grnbb //Nature Neurosci. 2006. - Vol.7. -P.179-193.

203. Lo A. Apoptosis in die nervous system: morphological features, methods, pathology, and prevention/A. Lo, L. Houenou, R Oppenheim // Arch. Histol. Cytol. -1995. Vol.58. - P.139-149.

204. Lonze B. Apoptosis, axonal growth defects, and degeneration of peripheral neurons in mice lacking CREB /В. Lonze etal. //Neuron. 2002. - Vol.34. - P.371-385.

205. LoPresti P. Target specificity and size of avian sensory neurons supported in vitro by nervegrowth facta", brain-derived neurotrophic facto, and neurotrophin-3 / P. LoPresti, S. Scott // J.Neurobiol. -1994. Vol.25, - №12. - P.1613-1624.

206. Lozeron P. Regeneration of unmyelinated and myelinated sensory nerve fibres studied by a retrograde tracer method / P. Lozeron, C. Krarup, H Schmalbmch // J. Neurosci Methods. 2004. -Vol30, - №138(1-2). - P225-232.

207. Lyons W. Immunosuppressant FK506 promotes neurite outgrowth in cultures of PC 12 cells and sensory ganglia / W. Lyons, E. George, T. Dawson // Proc. Natl. Acad Sci. USA -1994. -Vol.12, №91(8). -P3191-3195.

208. Ma Q. Vanilloid receptor homologue, VRL1, is expressed by both A- and C-fiber sensoiy neurons/Q. Ma//Neuroreport. 2001. - Vol.12, - №17. - P.3693-3695.

209. Macdonald R Mechanisms of action of new antiepileptic drugs / R. Macdonald, L. Greenfield Jr. //CutrOpinNeurol. -1997. Vol.10, -№2. -P.121-128.

210. Macewan D. Elevated cPLA(2) levels as a mechanism by which the p70 TNF and p75 NGF receptors enhance apoptosis /D. Macewan // FEBS Lett. -19%. Vol.379, - №1. - P.77-81.

211. Mackinnon S. A study of nerve regeneration across synthetic (Maxon) and biologic (collagen) nerve conduits for nerve gaps up to 5 cm in the primate / S. Mackinnon, A Dellon // Reconstr. Mi-crosurg.- 1990.-Vol.6.-P.117-121.

212. Madsen J. Tacrolimus (FK506) increases neuronal expression of GAP-43 and improves functional recovery after spinal cord injury in rats / J. Madsen, P. MacDonald, N. Irwin // Exp. Neurol. -1998. Vol.154, - №2. - P.673-683.

213. Maione S. Apoptotic genes expression in the lumbar dorsal hem in amodel neuropathic pain in rat/ S. Maione et al.//Neurareport 2002. - Vol.21, -№13(1). - P.101-106.

214. Matsumoto K. Possible involvement of induction of brain-derived neurotrophic factor in the neuroprotective effect of a 5-phenylpyrimidine derivative / K. Matsumoto et al. // Biochem Pharmacol. 2003. - Vol.66, -№6. - P.1019-1023.

215. McKay R Primary sensoiy neurons and satellite cells after peripheral axotamy in the adult rat: timecourse of cell death and elimination / H. McKay et al. // Exp. Brain. Res. 2002. - Vol.142. -P.308-318.

216. McMahon S. Expression and coexpression of Trie receptors in subpopulations of adult primaiy sensoiy neurons projecting to identified peripheral targets / S. McMahon, et al. // Neuron. -1994. -Vol.12.-P.1161-1171.

217. McQuarrie I. Transport of cytoskeletal elements from parent axons into regenerating daughter axons /1. McQuarrie, R Lasek//J. Neurosci. -1985. Vol.9. - P.436446.

218. Meeker M Neuron addition during growth of the postmetamorphic bullfrog: sensoiy neuron and axon number / M Meeker, P. Farel // J. Сотр. Neurol. -1997. Vol.29, - №389(4). - P.569-576.

219. Miki S. Antinociceptive effect of the novel compound OT-7100 in a diabetic neuropathy model / S. Miki et al. //Eur. J. Pharmacol. 2001. - Vol.430, - №2-3. - P.22^-234.

220. Mills J. Differentiation to an NGF-dependent state and apoptosis following NGF removal both occur asynchronously in cultures of PC12 cells / J. Mills, L. Kim, R Pittman // Exp. Cell. Res. -1997. Vol.231. -P.337-345.

221. Mimics K. Prenatal development of rat primaiy afferent fibers. I. Peripheral projections / K. Mimics, R Koetber // J. Сотр. Neurol. -1995. Vol.355. - P.589-600.

222. Mohammed H. Total neuronal numbers of rat lumbosacral primary afferent neurons do not change with age / H. Mohammed, R Santer// Neurosci. Lett. 2001. - Vol.25. - №304(3). - P. 149152.

223. Molliver D. IB4-binding DRG neurons switch from NGF to GDNF dependence in early postnatal life/D. Molliver etal.//Neuron. -1997. Vol.19, -№4. -P.849-861.

224. Mosconi T. Fixed-diameter polyethylene cuffs applied to the rat sciatic nerve induce a painfiil neuropathy: ultrastructural morphometric analysis of axonal alterations / T. Mosconi, L. Kruger // Pain. -19%. Vol.64, - №1. - P.37-57.

225. Murinson B. C-fiber (Remak) bundles contain both isolectin B4-binding and calcitonin gene-related peptide-positive axons / B. Murinson et al. // J. Сотр. Neurol. 2005. - Vol.484, - №4. -P.392-402.

226. Mu X. Neurotrophin receptor genes are expressed in distinct patterns in developing dorsal root ganglia/XMu etal. //J. Neurosci. -1993.-Vol.13.-P.4029-4041.

227. Najarian T. Prolonged hypereapnia-evoked cerebral hyperemia via K(+) channel- and prostaglandin E(2)-dependent endothelial nitric oxide synthase induction//T. Najarian et al. //Cine Res. -2000. Vol.8, - №87(12). - P.1149-1156.

228. Nguyen M Cycling at the interface between neurodevelopment and neurodegeneration / M. Nguyen, W. Mushynski, J. Julien//Cell Death Differ. 2002. - Vol.9, - №12. - P.1294-1306.

229. Noda M Increase of nerve regeneration capacity by new neurotrophic pyrimidine derivative MS-430 / M. Noda et al. // Gen. Pharmacol. -1998. Vol.31, - №5. -P.821-824.

230. O'Brien C. Differences in the chemical expression of rat primary afferent neurons which innervate skin, muscle orjoint/C. O'Brien et al. // Neuroscience. -1989. Vol.32. - P.493-502.

231. Oliveira A. Neonatal sciatic nerve transaction induces TUNEL labeling of neurons in the rat spinal cord and DRG/A. Oliveira etal. //NeuroReport -1997. Vol.8. - P.2637-2640.

232. Oppenheim R. Cell death during development of the nervous system / R. Oppenheim // Annu. Rev. Neurosci. -1991. Vol.14. -P.453-501.

233. Orike N. Role ofPI 3-kinase, Akt, and Bcl-2-related proteins in sustaining the survival ofneurotrophic fector-independent adult sympathetic neurons / N. Orike et al. // J. Cell Biol. 2001. -Vol.154. -P.995-1005.

234. Peter S. Polypropylene fumarate) / S. Peter et al. // In: Handbook ofBiodegradable Polymers. -1997. Harwood Academic Publishers, Amsterdam - P.87-98.

235. Peny V. Macrophage responses to central and peripheral nerve injury / V. Peny, M Brown, P. Andersson // Advances in Neurology, Neural Injury and Regeneration (Seil F. J., ed). Raven, New York. -1991.-Vol.59.-P.309-314.

236. Pestronk A. Effects of aging on nerve sprouting and regeneration / A. Pestronk, D. Drachman, J. Griffen // Exp. Neurol. -1980. Vol.70. - P.65-80.

237. Petruska J. Subclassified acutely dissociated cells of rat DRG: histochemistry and pattens of capsaicin-, proton-, and ATP-activated currents / J. Petruska et al. // J. Neurophysiol. 2000. -Vol.84, - №5. - P.2365-2379.

238. Pinco O. Neurotrophin-3 affects proliferation and differentiation of distinct neural crest cells and is present in the early neural tube of avian embryos / O. Pinco et al. // J. Neurobiol. -1993. Vol24. -P.1626-1641.

239. Popken G. Sensoiy neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods /G. Popken, P. Farel // J. Coup. Neurol. 1997 - Vol.15, - №386(1).1. Л P8-15.

240. Pover C. Do primary afferent cell numbers change in relation to increasing weight and surface area in adult rats? / C. Pover, M. Barnes, R Coggeshall // Somatosens Mot Res. -1994. Vol. 11,-№2.-P. 163-167.

241. Putcha G. Induction ofBIM, a proapoptotic ВНЗ-only BCL-2 family member, is critical for neuronal apoptosis / G. Putcha et al. /Neuron. 2001. - Vol.29. - P.615-628.

242. Ramer M Functional regeneration of sensory axons into adult spinal cord / MRamer, J. Priestley, S. McMahon // Nature. 2000. - Vol.403. - P.312-316.

243. Ranson S. Alterations in the spinal ganglion cells following neurotomy / S. Ranson //Journal of Comparative Neurology. -1990. Vol.19. -P.125-153.

244. Reed J. Double identity for proteins of the Bcl-2 family / J. Reed // Nature. -1997. Vol.387. -P.773-776.

245. ReichardtL. Neurotrophic factors and their receptors: Roles in neuronal development and function/L. Reichardt, I. Farinas//New York: Oxford University Press. -1997. -P220-263.

246. Rice A Proliferation and neuronal differentiation of mitotically active cells following traumatic brain injury / A Rice et al. //Exp Neurol. 2003. - Vol.183. - P.406417.

247. Risling M. Effects of sciatic nerve crush on the L7 spinal roots and dorsal root ganglia in kittens / MRisling, H. Aldskogius, C. Hndebrand//Experimental Neurology. -1983. Vol.79.-P.176-187.

248. Roberts V. Expression of messenger ribonucleic acids encoding the inhibin/activin system during mid- and late-gestation rat embryogenesis / V. Roberts, S. Barth // Endocrinology. -1994. -Vol.134.-P.914-923.

249. Register B. Transforming growth factor beta as a neuroglial signal during peripheral nervous system response to injury /В. Register, P. Delree, P. Leprince // J. Neurosci. Res. -1993. Vol.34. -P.32-43.

250. Rotshenker S. Interleukin-I activity in lesioned peripheral nerve / S.Rotshenker, S. Aamar, V. Barak //J. Neuroimmunol. -1992. Vol.39. - P.75-80.

251. Ruigt G. SR 57746A attenuates cytostatic drug-induced reduction of neurite outgrowth in co-cultures of rat dorsal root ganglia and Schwann cells / G. Ruigt, W. Makkink, R Konings // Neuroл sci. Lett. -1996. Vol.12, - №203(1). - P.9-12.

252. Sahenk Z. NT-3 promotes nerve regeneration and sensory improvement in CMT1A mouse models and in patients/Z. Sahenk et al. //Neurology. 2005. - Vol.13, - №65(5). - P.681-689.

253. Sahenk Z. Neurotrophins and peripheral neuropathies / Z. Sahenk // Brain Pathol. 2006. -Vol.16, - №4. - P311-319.

254. Sano A Protectiontyprosaposm against ischerma-i^^ loss / A. Sano, S. Matsuda, T. Wen // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994. Vol.204. - P.994-1000.

255. Santos P. Trifluoperazine protects brain plasma membrane Ca(2+)-ATPase from oxidative damaging/ P. Santos et al. // Exp. Brain Res. 2006. - Vol. 6. - P.l36-142.

256. Schecterson L. Novel roles for neurotrophins are suggested by BDNF and NT-3 mRNA expression in developing neurons / L. Schecterson, M Bothwell // Neuron. -1992. Vol.9. - P.449-466.

257. Schionning J. Selective degeneration of dorsal root ganglia and dorsal nerve roots in methyl mercury-intoxicated rats: a stereological study / J. Schionning et al. // Acta Neuropathol (Bed). -1998. Vol.96, - №2. - P.191 -201.

258. Schmalbruch R Motoneuron death after sciatic nerve section in newborn rats / R Schmalbruch //J. Сотр. Neurol. -1984. Vol.224. - P.252-258.

259. Schmalbruch H. Loss of sensory neurons after sciatic nerve section in the rat / H. Schmalbruch// Anatomical Record -1987. Vol.219. - P.323-329.

260. Scott S. In: Sensory neurons: diversity, development and plasticity / S. Scott // New Yak Oxford UP.-1992.

261. Sendtner M. Endogenous ciliary neurotrophic factor is a lesion factor for axotomized motoneurons in adult mice/M Sendtneretal. //J. Neurosci. -1997. Vol.17,-№18. - P.6999-7006.

262. Shamash S. The Cytokine Network ofWallerian Degeneration: Tumor Necrosis Factor-a, In-terleukin-la, and Interleukin-1 (3/S. Shamash, F. Reichert, S. Rotshenker// J. Neuroscience. -2002. -Vol.22,-№8.-P.3052-3060.

263. Silos-Santiago A. Non-tricA-expnessing small DRG neurons are lost in trkA deficient mice / A. Silos-Santiago et al. // J. Neurosci. -1995. Vol. 15. - P.5929-5942.

264. Silos-Santiago I. Severe sensory deficits but normal CNS development in newborn mice lacking tikB and trkCtyrosireprotem kinase re^ Silos-Santiago et al. // Eur. J. Neurosci. -1997. Vol.9.-P.2045-2056.

265. Silverman J. Selective neuronal glycoconjugpte expression in sensory and autonomic ganglia: relation of lectin reactivity to peptide and enzyme markers / J. Silverman, L. Kruger // J. Neurocytol. -1990.-Vol.19.-P.789-801.

266. Sjoberg J. The initial period of peripheral nerve regeneration and the importance of the local enviroment for the conditioning lesion effect / J. Sjoberg, M. Kanje // Brain Res. -1990.-Vol.529.-P.79-84.

267. Skoff A. TNF-a and TGF-b act synergistically to kill Schwann cells / A. Skoff; et al. // J. Neurosci. Res. -1998. Vol.53. - P.747-756.

268. Skulachev V. Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide-producing mitochondria and cell / V. Skulachev//FEBS Lett-19%.-Vol397,-№l.-P.7-10.

269. Skundric D. Induced upnegulation of IL-1, IL-1RA and IL-1R type I gene expression by Schwann cells/D. Skundric, B. Bealmear, R Lisak // J. Neuroimmunol. -1997. Vol .74. - № 1 -2. -P.9-18.

270. Skundric D. Schwann cell-specific regulation of IL-1 and IL-IRa during EAN: possible relevance for immune regulation at paranodal regions / D. Skundric et al. // J. Neuroimmunology. -2001. Vol. 116, - № 1. - P.74-82.

271. Smeyne R Severe sensory and sympathetic neuropathies in mice carrying a disrupted Trk/NGF receptor gene/R Smeyne, R Klein, A. Schnapp//Nature. -1994. Vol.368. - P246-249.

272. Snider W. Neurotrophins cause a new sensation / W. Snider//Neuron. -1992. Vol.16. -P229-232.

273. Spector J. Rabbit facial nerve regeneration in NGF-containing silastic tubes / J. Spector et al. // Laryngoscope. -1993. Vol.103. - P.548-558.

274. StWecker P. Hindlimb sensory neuron number increases with body size / P. StWecker, P. Farel //J. Сотр. Neurol. -1994. Vol.15, - №342(3). - P.430438.

275. Stefani A Differential inhibition by riluzole, lamotrigine, and phenytoin of sodium and calcium currents in cortical neurons: implications for neuroprotective strategies / A Stefani et al. //Experim. Neurol. -1997. Vol.147. - P.l 15-122.

276. Stefanis L. Caspase-dependent and -independent neuronal death: two distinct pathways to neuronal injury /L. Stefanis//NeuroscientisL 2005. - Vol.11,-№1.-P.5062.

277. Susin S. Molecular characterization ofmitochondrial apoptosis-inducing factor/ S. Susin etal.// Nature. -1999. Vol.397. -P.441-446.

278. Swett J. Most dorsal root ganglion neurons of the adult rat survive nerve crush injury / J. Swett, C. Hong, P. Miller// Somatosens. Motor Res. -1995. Vol.12, - №34. - P.l77-189.

279. TaglialatelaG. Inhibition of nuclear fktor kappa В (NF kappa B) activity induces nerve growth factor-resistant apoptosis in PC12 cells / G. Taglialatela, R. Robinson, J. Perezpolo // J. Neurosci. Res. -1997. Vol.47, -№2. -P.155-162.

280. Tandrup T. Delayed loss of small dorsal root ganglion cells after transection of the rat sciatic nerve/T. Tandrup, C. Wool£ R. Coggeshall //J. Сотр. Neurol. 2000. - Vol.422. -P.172-180.

281. Tang H. Effects of exogenous triiodothyronine on fast axonal transport during tadpole metamorphosis/Н. Tang, R Hammerschlag // Neurochem. Res. -1996. Vol.21. - №4. -P.489494.

282. Tessarollo L. trkC, a receptor for neurotrophin-3, is widely expressed in the developing nervous system and in non-neuronal tissues / L. Tessarollo et al. // Development -1993. Vol. 118. - P.463-475.

283. Tessarollo L. Targeted mutation in the neurotrophin-3 gene results in loss of muscle sensoiy neurons/L. Tessarollo etal. //Proc. Nad. Acad Sci. USA -1994. Vol.91. - P.l 1844-11848.

284. Tessler A Sciatic nerve transaction produces death of dorsal root ganglion cells and reversible loss of substanceP in spinal cord/A Tessler etal. //Brian Research. -1985. Vol.332. -P.209-218.

285. Thombery N. Caspases: enemies within / N. Thombeiy, Y. Lazebnik // Science. 1998. -Vol.28, - №281(5381). - P. 1312-1316.

286. Toker A Protein kinases as mediators ofphosphoinositide 3-kinase signaling/A Toker//Mol. ri Pharmacol. 2000. - Vol.57. - P.652-658.

287. Tong J. Radiation-induced apoptosis in dorsal root ganglion neurons / J. Tong, et al. // J. Neurocytol. -1997. Vol.26, -№11. - P.771-777.

288. Torigoe K. A newly synthesized neurotropic pyrimidine compound, MS-818, may activate migratory Schwann cells in peripheral nerve regeneration / K. Torigoe, A Awaya // Brain Res. -1998. Vol.787, - №2. - P337-340.

289. Ure D., Campenot R Leukemia inhibitory factor and nerve growth factor are retrogradely transported and processed by cultured rat sympathetic neurons / D. Ure // Dev. Biol. 1994. -Vol.162.-P339-347.

290. UrenjakJ. Pharmacological modulation of voltage-gated Na+- channels: a rational and effective strategy against ischemic brain damage / J. Urenjak, T. Obrenovitch // Pharmacol Rev. 1996. -Vol.48,-№l.-P.21-67.

291. Van der Zee C. Putative neurotrophic factors and functional recovery from peripheral nerve damage in the rat / C. Van der Zee, J. Brakkee, W. Gispen // Br. J. Pharmacol. -1991.-Vol. 103, -№1.-P.1041-1046.

292. VauxD. Cell death in development/D. Vaux, S. Korsmeyer// Cell.-1999.-Vol.96.-P.245-254.

293. Verdi J. Neurotrophins regulate sequential changes in neurotrophin receptor expression by sympathetic neuroblasts/J. Verdi, D. Anderson//Neuron. -1994. Vol.13. -P.1359-1372.

294. Vestergaard S. Effect of permanent axotomy on number and volume of dorsal root ganglion bodies / S. Vestergaand, T. Tandrup, J. Jakobsen // Journal of Comparative Neurology. -1997. -Vol.388.-P.307-312.

295. Walton M. Is CREB a key to neuronal survival? / M. Walton, M. Dragunow // Trends Neurosci.-2000.-Vol.23.-P.48-53.

296. Walton M CREB phosphorylation promotes nerve cell survival / M Walton et al. // J. Neurochem. -1999.-Vol.73. P.1836-1842.

297. W 320. Wang S. Presynaptic inhibition of excitatory neurotransmission by lamotrigjne in the rat amygdalar neurons/S. Wang etal.//Synapse.-1996.-Vol.24.-P.24&-255.

298. Wang X. Rapid elevation of neuronal cytoplasmic calcium by apolipoprotein E peptide / X Wang, E. Gmenstein// J. Cell Physiol. -1997. Vol.173. -P.73-83.

299. Watkins L. Beyond neurons: evidence that immune and glial cells contribute to pathological pain states / L. Watkins, S. Maier// Physiol. Rev. 2002. - Vol.82, - №4. - P.981-1011.

300. Watson F. Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response / F. Watson etal. //Nature Neurosci. -2001. Vol.4. -P.981-988.

301. Williams K. Rethinking immunological privilege: implications for corneal and limbal stem cell transplantation/К. Williams, D. Coster//Molecular Medicine Today. -1997. Vol3. - P.495-501.

302. Wilson A. Delayed acetyl-L-camitine administration and its effect on sensory neuronal rescue after peripheral nave injury / A. Wilson et al. // J. Plast Reconstr. Aesthet Surg. 2007. - Vol.60, -№2. -P.l 14-118.

303. Winnier G. Bone morphogenetic protein 4 is required for mesoderm formation and patterning inthemouse/G. Winnier etal.//Genes Dev. -1995. Vol.9. -P2105-2116.

304. Winter R., Tickle C. Syndactylies and Polydactylies: embryological overview and suggested classification / R. Winter, C. Tickle // Europ. J. Hum. Genet -1993. Vol. 1. - P.96-104.

305. Winter С. MAP kinase phosphatase 1 is expressed and enhanced by FK506 in surviving mamillary, but not degenerating nigral neurons following axotomy / C. Winter, et al. // Brain Res.1998. Vol.801, - №1-2. - P.198-205.

306. Wu D. Interaction and regulation of subcellular localization of CED-4 by CED-9 / D. Wu, i HWaUen, G.Nunez//Science.-1997.-Vol.275.-P.1126-1129.

307. Xiong G. Effects of immunosuppressants on cytokine expressions after repair for nerve injury in a rat model / G. Xiong, Y. Wang, D. Tang // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai KeZaZhi.- 2006. -Vol.20,-№12.-P.l 163-1167.

308. V 332. Yagita Y. Neurogenesis by progenitor cells in the ischemic adult rat hippocampus / Y. Yagitaet al. // Stroke. 2001. - Vol.32. - P.1890-1896.

309. Yardin C. FK506 antagonizes apoptosis and c-jun protein expression in neuronal cultures / C. Yardin, F. Terro, M Lesort // Neuroreport -1998. Vol.9, - №9. - P2077-2080.

310. Yip H. The effects of the nerve growth factor and its anti-serum on the postnatal development and survival after injury of sensory neurons in rat dorsal root ganglia / H. Yip, etal. // Journal of Neuroscience. -1984. Vol.4. - P2986-2992.

311. Zamzami N. Subcellular and submhochondrial mode of action of Bcl-2-like oncoproteins / N. Zamzami et al. // Oncogene. -1998. Vol.16. - P2265-2282.

312. Zhu W. Bcl-2 mutants with restricted subcellular location reveal spatially distinct pathways for apoptosis in different cell types / W. Zhu et al. //EMBOJ. -1996. Vol.15. - P.41304141.