Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакции пептидогликана золотистого стафилококка с лимфоцитами человека

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Реакции пептидогликана золотистого стафилококка с лимфоцитами человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НИЖЕГОРОДСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ОСИПОВ Олег Анатольевич

ад: 612.112.94:612.017:576.851.252

РЕАКЦИИ ПЕПЩ0Г/1ИША ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА С ЛИМФОЦИТАМИ -ЧЕЛОВЕКА.

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации.на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород - 1992

Работа выполнена на кафедре микробиологии Нижегородского государственного медицинского института ■

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор А.Н.Маянский •

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Г.К. Дегтева

Кандидат медицинских наук В.М. Лукашков

Ведущее учреждение - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится "33.." ___'1992г.'

вАА,- час. на заседании зонального специализированного Ученого Совета ( ^-.б&А. .02 . ) Нимегородского медицинского института (г.Лишний Новгород, пл. Минина, 10/1).

■ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "______" ______________ 1992г.

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета, кандидат медицинских наук Й.В. Леонов.

* С ' ? Ч Г f'A "

'/• -С- ■ : Общая характеристика работы.

"V" Актуальность темы. Золотистый стафилококк считается одним из ведущих факторов в клинике гнойно-воспалительных заболеваний "человека ( А.К.Акатов, В.С.Зуева, 1983; Е.Н. Левина, 1985). К настоящему времени достаточно полно изучено влияние большинства компонентов стафилококка на развитие и реализацию иммунного' ответа. Но.особое значение имеит поверхностные антигены возбудителя, с которыми макроорганизм сталкивается, в первую очередь. Одной из таких структур является пептидогли-кан, который представляет собой основной компонент клеточной стенки грамлоложительнух бактерий и обладает широким спектром биологической активности. На различных моделях показано, что пептидогликаны способны вызывать адъювантный [Kotani étal., 1974; Adam et al., 1975; Nauciel, Fleck,1975; Dziarski R., 19863, нитогенный эффект [Damais С. et al., 1975, 1977; Dziarski R., Dziarski A., 1979; Dziarski R., 1980, 1986; Bessler H. et al,, 1986; Zeiger fi., 1986], активировать комплемент [Бояринова '/I.В.,1984; Азов H.А., 1985; Лебедева О., 1989; Uerbrugh H. et al.,. 1980; Fleer fi. et al., 1986; Stimpson S. et al., 1986; Akinori K. et al., 1987; Janusz H. et al., 1987], вызывать реакции гиперчувствительности замедленного типа [Останина /1.Н. и соавт., 1987;* G.- Grassi Ê., Grassi С., 1985; Finger H. et al., 1985; Dziarski R., 1986; Kasachika T. et al., 1986; Ichiro fi. et al., 1988; Neeraj K. et al., 1988], индуцировать выработку специфических антител [Астафьев Д.Г., 1987; Uerbrugh et al.,1983; Christenson et al., 1983; 1986; Jacob E., 1987]. Однако, несмотря на активное участие пептидогликанов в реакциях гуморального иммунитета, вопрос об их специфическом взаимодействии с лимфоцитами до сих пор дискутируется, хотя принципиальная возможность такого рода реакций отмечена рядом авторов. Показано, что в культуре in vitro пептидогликан и его синтетический

дериват Сглюкозаыилыураиилдилептид) стимулируют лимфоциты только сенсибилизированных гивотных [Манько В.И. и соавт.. 1989; Тагеоизк!, Вегшап, 1975], а несенсибилизированные лимфоциты пуповинной крови ареактивны по отношению к определенным дозировкам пептидогликана Е.соН-М17, в то время как лимфоциты взрослых доноров отвечают на пептидогликан продукцией нейтрофилстимулирувщих лиыфокинов [Маянский А.Н. и соавт., 1987], В связи с этим, изучение уровня специфической реактивности лимфоцитов к пептидогликанам монет быть использовано в клинике для диагностики внутриутробного инфицирования новороаденных, а индекс реактивности лимфоцитов здоровых доноров могут служить условной нормой при исследовании того не показателя у инфекционных больных. С этой точки зрения несомненный интерес представляют сведения о специфических реакциях бактериальных пептидогликанов с лимфоцитами человека и о взаимодействии лимфоцитов с пептидогликанами в системе межклеточной и опсонической кооперации, об индивидуальных колебаниях реактивности лимфоцитов у здоровых людей и воз-моаность использования пептидогликанов в качестве аналитических препаратов в клиника-иммунологических иммледованиях.

Ц ель работы -на основе определения закономерностей взаимодействия бактериальных пептидогликанов с лимфоцитами человека разработать новые методические подходы к изучению механизмов противоинфекционного иммунитета.

Задачи работы:

1. Исследовать феномен активации люминолзависимой хемилюми-несцекции лимфоцитов человека в системе с пептидогликаном золотистого стафилококка. Дать сравнительную характеристику лимфоцитсимулируюцей активности золотистого стафилококка в спектре чувствительности лимфоцитов к бактериальным пепти-

догликанам.

2. Исследовать феномен образования нейтрофил-стимулирущих лимфокинов при стимуляции лимфоцитов пелтидогликаном золотистого стафилококка.

3. Изучить субпопуляциокные особенности активации лимфоцитов пептидогликаном золотистого стафилококка.

4. Дать сравнительную характеристику реакций пептидоглика-на золотистого стафилококка с сенсибилизированными и не-сенсибилизированными лимфоцитами человека.

5. Изучить характер взаимодействия пелгидогликана"золотис-того стафилококка с лимфоцитами в системе опсонической кооперации.

Научная новизна. Впервые разработана высокочувствительная тест-система для изучения взаимодействия бактериальных пептидогликанов с лимфоцитами человека по люминол-зависимой хемилиминесценции. Предлоаен новый диагностический препарат (пептидогликан золотистого стафилококка) в качестве • стимулятора хемилиминесценции лимфоцитов. Изучены субпопуля-ционные особенности активации лимфоцитов пептидогликаном золотистого стафилококка, установлено, что индукция хемилиминесценции смешанной популяции лимфоцитов связана преимущественно с В-лимфоцитаыи, хотя нельзя исключить участия в этом . процессе и Т-клеток. Проведено сравнение реактивности сенсибилизированных и несенсибилизированных лимфоцитов человека к пептидогликану золотистого стафилококка, показано, что сенсибилизация к пептидогликану является универсальным признаком иммунологического статуса человека и характеризует широкую распространенность зтого агента. Изучены механизмы реактивности лимфоцитов к пептидогликану золотистого стафилококка в системе опсонической кооперации. Проанализирован вклад различных опсонических факторов нормальной сыворотки человека в реакции пептидогликанов с лимфоцитами. Дана сравнитель-

нал характеристика лимфоцитстимулируюцей активности пепти-догликана золотистого стафилококка в спектре чувствительности лимфоцитов к бактериальным пептидогликанам. Установлено, что пептидогликан золотистого стафилококка занимает лидирующее место по степени активации лимфоцитов как внутри рода Staphylococcus, так и среди пептидогликанов бактерий отдаленных таксонов,

«

I

Те о р етическая «практическая з н а-ч и м о с т ь. Материалы исследований содеряат новую информацию о характере взаимодействия бактериальных пептидогликанов с лимфоцитами человека. Экспериментально обосновано по-ломение о специфичности взаимодействия пептидогликанов с лимфоцитами и возмоаности сенсибилизации организма к этим бактериальным продуктам. Дана характеристика прямых и опсо-нинопосредованных реакций лимфоцитов с пептидогликаном золотистого стафилококка. Разработана доступная и воспроизводимая методика для определения повышенной чувствительности лимфоцитов человека к бактериальным пептидогликанам. которая монет быть использована для функционального зондирования лимфоцитов и их рецепторов. Данная методика позволяет оценивать уровень сенсибилизации организма к бактериальным пептидогликанам. Результаты наших исследований, полученные при исследовании реактивности лимфоцитов взрослых здоровых доноров к пептидогликану S.aureus, могут служить показателями относительной нормы при изучении того se показателя в условиях патологии ассоциированной с золотистым стафилококком.

Внедрение результатов. Метод диагностики внутриутробной стафилококковой инфекции у новорожденных применяется в лаборатории иммунологии Ни-кегородского НИИ педиатрии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых "Актуальные вопросы медицины" (Нивний Новгород. 1989 г.); на X межинститутской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1990 г.); на Всесоюзном, совещании "Хемилшминесцентные методы в клинической диагностике" (Юрмала. 1990 г.).

П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано б работ. список приведен в конце автореферата.

Объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 30 отечественных и 90 иностранных источников. Работа изложена на 123 листах машинописного текста и содержит 32 рисунка и 5 таблиц.

Содержание работа. Материалы и методы исследования.

Объем исследований-

Получено 18 серий препаратов пептидогликана из клеточных стенок бактерий родов Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia и Bifidobacterium. Использованы штаммы бактерий из коллекций ИИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Нияегородского и Казанского НИИЗМ, кафедры микробиологии внегородского медицинского института.

В работе использованы лимфоциты 157 доноров, 7 новорожденных (пуповинная кровь), нейтрофилы 10 доноров. Проанализировано 17 культур лимфоцитов (продукция нейтрофилстимули-рующих лимфокинов), проведено 1083 реакции люминолопосредо-ванной хемилвминесценции лимфоцитов и их субпопуляций, 10 опытов лвминолопосредованной хемилвминесценции нейтрофилов, 12 гистохимических тестов. Получено 1? серий препарата нейт-рофилстимулируюцих лимфокинов (НСТ-/1), 36 серий препарата СЗЬ-зимозана, проанализировано (определение антипептидогли-канових антител) 31 сывороток крови взрослых доноров и 3 серии коммерческого иммуноглобулина человека.

Пептидогликаны получали из клеточных стенок бактерий по методу Peterson et al.,(i978). Бактериальную массу разрушали в гомогенизаторе Л-17 КЗЗМИ стеклянными бусами диаметром. 0,7мм (20 мин,-0°С, 1000 об/мин). После трехкратного отмывания дистилированной водой и удаления неразрушенных клеток из супернатанта осавдали клеточные стенки при 8000 д, осадок последовательно обрабатывали II раствором додецилсульфата натрия, РНК-азой, ДНК-азой, трипсином, фенолом и трихлорук-сусной кислотой. Чистоту препаратов контролировали по их аминокислотному составу и содержанию остаточного фосфо-

ра. Пептидогликаны стандартизовали по сухому весу, хранили при -10°С, перед опытом гомогенизировали ультразвуком на гомогенизаторе УЗДН-2Т (22 кГц, 15 с). Пептидогликаны использовали в корпускулярной и солюбилизированной формах. Для получения солвбилизированного препарата корпускулярный пепти-догликан обрабатывали ультразвуком (22 кГц, 20 мА, 30 мин), центрифугировали, осадок отбрасывали, супернатант стандартизовали по оптической плотности (Е-280, длина оптического пути 10 мм ), показатели доводили до 1,0 внесением забуферен-ного физиологического раствора (рН-7,2).

Для опсонизации субстратов использовали сыворотки здоровых доноров и фракцию IgG, изолированную из коммерческого препарата иммуноглобулина человека методом ДЗАЗ-хроматогра-фии на тояполе 650М ("Toyo Soda", Япония). Чистоту препаратов IgG контролировали имнунозлектрофоретически с антителами против сывороточных белков человека (Нижегородский НИИЭМ). Антитела определяли в РЭМА.

Для постановки реакции использовали полистироловые планшеты (Ленинградский завод медицинских полимеров). Реакцию выполняли по следующей схеме (Астафьев Д.Г., 1987 3:i -сорбция пептидогликана; 2 - обработка 1 У. раствором бычьего сывороточного альбумина; 3 - реакция с исследуемым субстратом; 4 - проявление мечеными антителами против иммуноглобулинов человека; 5 - внесение субстрата для пероксидазы -смесь растворов 5-аминосалициловой кислоты (0,082) и 0.05Х перикиси водорода в соотношении 9:1 (30 мин, 20°С). Реакцию останавливали добавлением метабисульфита натрия (0.25Л и оценивали на сканере "Hultiscan", (Hest Gerraany). Контролем служили пробы, в которых этап обработки исследуемым субстра-. том (сыворотка) был опущен. Каждую пробу ставили в трех пов-торностях и вычисляли средний результат. Показатели контроля вычитали.

СЗЬ-зимозан получали из препарата зимозана ("Реахим",

СССР) путем его опсонизации пулом нормальных сывороток человека с последующей десорбцией нековалентно связанных компонентов [Stossel Т.P. et al., 19753.

Мононуклеарн выделяли на градиенте плотности фиколл-ве-рографин (Боуив fl.,1968]: в центрифужные пробирки вносили градиент плотности и наслаивали на него 5 мл крови, стабилизированной гепарином (25 М.Е./мл). После центрифугирования слой мононуклеаров в интерфазе снимали и дважды отмывали центрифугированием. После этого клетки взвешивали в 1 мл раствора Хенкса в концентрации 3 млн/мл. Моноциты из взвеси мононуклеаров удаляли путем их прилипания на полистироловые чашки Петри.

Освобождение лимфоцитов от нейтрофилов контролировали морфологически в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Освобождение лимфоцитов от моноцитов контролировали по гистохимическому тесту на неспецифическую зстеразу tGomori, 19521. Жизнеспособность полученных лимфоцитов проверяли три-пановнм тестом. Яизнеспособность по трипановоыу тесту составляла 96-97 У. . Яизнеспособность полученных клеток оценивали такае по способности лимфоцитов отвечать повышением уровня лшшолзависимой. хемилюминесценции (ХЛ 3 на внесение СЗЬ-зимозана. Использовали клетки, которые реагировали повышением ХЛ не и'енее, чем в 8 раз по сравнению с негативным контролем.

Субпопуляционный состав суспензий выделенных лимфоцитов оценивали с помощью моноклональннх антител к поверхностным маркерам лимфоцитов (Ш-90, ИКО-12, ИКО-86, ИКО-31, Нижегородский НИИЗЛ). Суспензии лимфоцитов (3 млн/мл) вносили в лунки из парафильма на обезжиренных предметных стеклах и инкубировали во влажной камере. После инкубации в лунки (без промывания) вносили моноклональные антитела к соответствующих маркерам в рабочем разведении. После инкубации во влажной камере моноклональные метки проявляли антисывороткой,

меченной флюорохромом (Нижегородский НИИЗМ). Результата проб учитывали на люминесцентном микроскопе "Люмам-2". Подсчитывали по 100 клеток в каждой пробе и вычисляли процент светящихся клеток. Пробы выполняли в трех повторах и вычисляли средний результат.

В-лимфоцитоы очищали при помощи анти-Г-глобулина (ЙТГ) [Ниловский H.H. и соавт., 19831 (ШИЗК им. Габричевского). После тестирования полученной популяции B-лимфоцитов на жизнеспособность (по трипановому тесту - более 987., функциональный тест - усиление ХЛ в 12 раз) и чистоту популяции (примесь Т-линфоцитов менее 0,ЗИ по метке моноклональными антителами) концентрацию клеток доводили до 1 млн/мл раствором Хенкса. Параллельную обработку в том же режиме (исключая инкубацию с ЙТГ) проходила и смешанная популяция лимфоцитов.

Для получения нейтрофилстимулирущих лимфокинов лимфоциты инкубировали со стимулятором в течение 40 мин (в случае пептидогликана - в течение всего срока культивирования). После отмывания от стимуляторов, лимфоциты взвешивали в среде 199, забуференной бикарбонатом натрия и содержащей пенициллин и стрептомицин. После инкубации культуры лимфоцитов центрифугировали, осадок отбрасывали, а супернатанты испытывали в тесте на нейтрофилстимулируюцув активность. В качестве контроля использовали супернатанты нестимулированных культур. Реакцию восстановления HCT нейтрофилами цельной крови проводили в микромодификации Виксмана М.Е. и Маянского А.Н. (1979).

К/1 изучали на жидкостно-стинцилляционном счетчике "Бе-та-1" (Киевское производственное об'единение "Недаппарату-ра"). В силиконированные флаконы вносили 0,8 мл клеточной взвеси, регистрировали фон и добавляли 100 мкл 0,01 мН раствора лиминола ("Реахим", СССР). После стабилизации фона во флаконы вносили по 100 мкл стимулятора. ХЛ регистрировали в течение 90 мин (время обсчета б с) через 10-минутные интер-

валы. Каждую пробу дублировали и учитывали средний результат. В промелутках мекду обсчетами пробы термостатировали. Контролем служили пробы, куда вместо стимулятора вносили раствор Хенкса.

Статистическую обработку результатов производили на персональном компьютере типа IBM PC AT с использованием пакетов статистических программ: "Statgraf" и "Lotus". Вычисляли следующие показатели: 1. Среднее арифметическое. 2. Стандартная ошибка средней арифметической. 3. Квадратичное отклонение средней арифметической. 4. Достоверность различия средних (по критерию Вилкоксо-на-Ианна-Уитни).

5. Коэффициент вариации.

6. Коэффициент корелляции.

Результаты работы.

Результаты предварительных экспериментов показали принципиальную возмоаность регистрации лиминолзависимой XЛ и выработки нейтрофилстимулируюрх лимфокинов в высокоочищенной фракции лимфоцитов человека при стимуляции пептидогликаном S.aureus ССН В85. При добавлении к лимфоцитам пептидогликана (10 мкг/мл) происходило усиление уровня ХЛ в 1,5 - 9,6 раз (3,2+0,4) и выработки лимфокинов в 3,8 - 5,4 раз (4,6+0,9). Пик ХЛ регистрировался на 25 - 30-й мин с момента внесения, стимулятора. В серии сравнительных экспериментов показан ряд преимуществ реакции лиминолзависимой ХЛ лимфоцитов перед тестом лимфокинообразования. Вследствие этого в дальнейших исследованиях мы оценивали реакции ПГ с лимфоцитами, в основном, по ХЛ.

При изучении условий стимуляции лимфоцитов пептидогликаном золотистого стафилококка анализировали зависимость реакций лимфоцитов от дозы пептидогликана. Показано, что пеп-тидогликан в дозе 10 мкг/мл и выше вызывал достоверное уси-

ление Х/1 лимфоцитов, при этом, указанная доза являлась насыщающей и ее увеличение (30, 100мкг/мл) незначительно влияло на интенсивность Х/1 . Во всех случаях, независимо от дозы, кинетика ответа была одинаковой.

Литературные данные о метаболизации ПГ в организме и о возможности секреции их растворимых субкомпонентов самими бактериями [P.Zuerenz, F.Hagen, G.Leitherer ,1980] послужили основой для изучения реакций лимфоцитов на солюбилизирован-ный ПГ. После солюбилизации ПГ сохранял способность стимулировать лимфоциты, кинетика ответа не менялась. Следовательно, растворимые дериваты могут принимать участие в формировании и реализации повыагенной чувствительности организма к ПГ. Во многих работах делается вывод о том, что при взаимодействии с лимфоцитами ПГ способны вызывать лишь поликло-нальный митогеный эффект. Однако, хорошо известна возможность воспроизведения с ПГ специфических иммунологических феноменов - образование антител и гиперчувствительности замедленного типа. Это говорит о том, что ПГ способны выступать в роли специфических антигенов, а, следовательно, вызывать антигензависимые реакции лимфоцитов. Специфичность взаимодействия лимфоцитов с пептидогликаном золотистого стафилококка доказана нами в опытах с лимфоцитами новорожденных (пуповинная кровь). В определенных дозах (10, ЗОмкг/мл) пеп-тидогликан не стимулировал несенсибилизированн:ые лимфоциты; в тоже время, лимфоциты взрослых доноров реагировали на эти дозировки достоверным усилением ХЛ и продукции лимфокинов. Уровень ответа на неспецифическую стимуляцию (фитогемагглю- ■ тинин, ЗОмкг/мл) был соизмерим в том и другом случае.

В литературе имеется ограниченное число работ по изучению лимфоцитарных популяций, реагирующих с ПГ. Большинство авторов считают, что ПГ являются В-митогенами (Dziarsky R., 1981]. Однако, имеются сообщения о стимулирующем действии ПГ на Т-лимфоциты [Rasanen L. et al.,1986; Levinson fl.I. et

al., 1983J. Неясен также вопрос о значении кооперации клеток в реакциях с ПГ, в частности, о зависимости ответа В-лимфо-цитов от Т-лимфоцитов. В серии экспериментов по изучению реактивности субпопуляций лимфоцитов человека к пептидогликану золотистого стафилококка нами отмечен более высокий уровень стимуляции B-клеток (коэффициент стимуляции-17,7 + 3,68) по сравнению со смешанной популяцией лимфоцитов (6,6+1,35, (р<0,05)). Т-лимфоц'иты, вероятно, выполняют регуляторную (супрессорную) функцию в реакции на пептидогликан.

Опираясь на результаты собственных наблюдений о специфической активности определенных дозировок ПГ золотистого стафилококка, мы изучили реактивность к нему лимфоцитов 75 здоровых людей, в возрасте от 18 до 35 лет. Профиль индивидуальной реактивности лимфоцитов к пептидогликану золотистого стафилококка характеризуется достаточно широким разбросом показателей коэффициента стимуляции лимфоцитов (КСЛ),' от 1,5 до 9,0 (Н+н=3,2+0,4, коэффициент вариации - 58,0+5,ЗЛ. Лимфоциты всех 75 обследованных реагировали на внесение пепти-догликана повышением уровня ХЛ. По реактивности среди доноров выделено три подгруппы: с низким (HCiI<3), средним (КС/1 от 3 до 6), высоким (Ш>6) уровнями. 53 человека (69,У/.) имели низкий уровень реактивности, 17 (22,32) - средний и 5 (8У.) - высокий.

Имеются данные о том, что в сыворотках больных стафилококковыми инфекциями содераится повышенное количество ан-ти-ПГ-антител, уровень которых коррелирует с тяжестью инфекционного процесса {Kuchenbauer Т., Tppner K.-D., et al.,1986; Seidl Р.Н., Schleifer K.H.,1986 ], а их лимфоциты отвечают на ПГ более высокой пролиферативной активностью по сравнению с лимфоцитами здоровых людей [Feucht Н.Е., O'Neil GJ., et al.,1986]. В наших экспериментах показатели реактивности лимфоцитов к ПГ не коррелировали с содержанием ан-ти-ПГ-антител в сыворотках тех ве доноров.Логично предполо-

вить, что в данном случае мы имеем дело с двумя взаимосвязанными, но независимыми формами иммунного ответа организма: (клеточной и гуморальной), либо отсутствие корреляции между ними связано с неодинаковым подклачением разных ПГ-эпитопов.

В настоящее время мояно считать доказанным факт присутствия в сыворотках здоровых доноров и больных стафилококковыми инфекциями специфических анти-ПГ-антител, а такае способность ПГ актиировать классический и альтернативный каскад системы комплемента. В связи с этим возникает закономерный вопрос о функциональном значении'гуморальных факторов в реакциях ИГ с лимфоцитами. Решении этой проблемы был посвящен следующий этап нашей работы. Обычно об опсонинах упоминают в связи с реакциями фагоцитов, однако способностью реагировать с опсоническими факторами обладают не только поли- и мононуклеарные фагоциты, но и другие клетки, в частности лимфоциты [Наянский А.Н., Наянский Д.Н.,1989]. Для этого лимфоциты располагают достаточно мощным рекогносцировочным аппаратом, позволяющим включаться в реакции системы гуморально-клеточной кооперации [Fearon D.T.,Hong H.П.,1983; Fornusek L., (Jetvicka U.,1984; Lydyard P.M., Fanger H.H.,1982; Ross G.D.,-Nedoft M.E..,1985]. Ранее , в экспериментах, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что обработка ПГ E.coli Ml?, иммуноглобулином IgG приводит к достоверному усилению образования нейтрофил-стимулирукщих лимфокинов [Наянский Й.Н. и соавг.,198?]. Эти данные послу-зили основой для исследования влияния опсонизации на реакцию ПГ золотистого стафилококка с лимфоцитами . В предварительных экспериментах возмоаность регистрации IgG- и СЗЬ-опосредованннх реакций лимфоцитов исследовали на моделях с ПГ, опсонизированным IgG фракцией иммуноглобулина человека и зимозаном, опсонизированным СЗЬ компонентом системы комплемента. Во всех опытах опсонизация субстратов приводила к-значительному повышению уровня X/I. В последующих опытах была

изучена опсоническая активность нормальной сыворотки человека. Опсонизация ПГ пулом-нормальных сывороток человека приводила к усилении ХЛ-ответа лимфоцитов в 5 раз по сравнении с неопсонизированным ПГ, кроме того, опсонизация вызывала ускорение реакции на ПГ (пик на 10-й - 15-й мин). В опытах с дифференцированным удалением опсонинов изучен вклад различных факторов сыворотки в ее общую опсоническую активность. Среди сывороточных факторов опсонический антипептидогликано-вый потенциал определяли, главным образом, "классические" антибактериальные опсонины: антитела и комплемент (соответственно 302 и 402 от общего уровня опсонической активности). Кроне антител и комплемента обнарунены опсонины, не имеющие к ним отношения; они составляли около ЗОХ опсонической активности сыворотки. Антитело- и комплементнезависи-мую опсоническуи активность сыворотки в реакциях ПГ с лимфоцитами удалось частично связать с фибронектином. Таким образом, сывороточные факторы потенциируют взаимодействие между пептидогликаном и лимфоцитами, что выражается в количественном и .качественном изменении ответа лимфоцитов на раздражитель. В целом, констатируя активную позицию лимфоцитов в системе опсонической кооперации, пока трудно говорить о ее реальном значении в реакциях с ПГ. Это иохет быть рудиментом функции, которая имеет решающее значение только для фагоцитов, либо дополнительным эффекторным механизмом в системе клеточно-гуморальных взаимодействий. По данным, полученным ранее в нашей лаборатории (Астафьев Д.Г., 1986], сыворотки здоровых доноров содержат неодинаковое количество антител к различным ПГ, причем, максимальное их количество направлено против ПГ золотистого стафилококка. На основе этих данных нами проведено исследование чувствительности лимфоцитов к пептидогликану золотистого стафилококка в спектре реактивности к бактериальным пептидогликанан. Была изучена реактивность лимфоцитов к различным представителям рода

Staphylococcus и к бактериям отдаленных таксонов. По лимфо-цитстиыулирующей активности стафилококки распределились следующим образом: максимальный уровень стимуляции отмечен при использовании пептидогликана S.aureus (коэффициент стимуляции лимфоцитов - 4,5±0,3), минимальный - у S.epideraidis-(3,3+0,13), промежуточное место занимали пептидогликана S.simulans (4,3+0,26) и S.intenaedius.(3,8+0,18). При сравнении золотистого стафилококка с представителями отдаленных таксонов (S.faecalis; B.bifidum; E.coli) обнаружена следующая закономерность:- максимальные показатели отмечены у S.aureus (3,0+0,4), минимальный - у E.coli (1,5+0,09); для ПГ S.faecalis и B.bifidum показатели лимфоцитстимулирущей активности были, соответственно 2,6+0,38 и 1,7+0,2. Во всех случаях пик X/I наступал на 25 - 30-й мин. На основании более высокой лимфоцитстимулирующей активности ПГ золотистого стафилококка по сравнении с другими бактериями (как внутри рода Staphylococcus, так и с отдаленными таксонами)., можно высказать предположение о том, что в формировании реактивности к ПГ принимают участие не только общие антигенные детерминанты, но и индивидуальные зпитопн, специфичные для ПГ разных групп бактерий.

выводы.

1. Взаимодействие пептидогликана S.aureus с лимфоцитами человека сопровождается стимуляцией люминолзависимой хемилюки-несценции и продукцией лимфокинов (факторов, активирующих кислородзависиный метаболизм нейтрофилов). Лимфоцитстимули-рующие свойства пептидогликана не утрачиваются после его солюбилизации (обработка ультразвуком).

н

2. Сенсибилизация к пептидогликану S.aureus является универсальным признаком иммунного статуса человека и отражает постоянный контакт с бактериальными пептидогликанами и их дериватами. Несенсибилизированнне лимфоциты (лимфоциты пуповин-ной крови) ареактивны к пептидогликану, что подтверждает возможность специфического (антигензависимого) взаимодействия пептидогликанов с лимфоцитами.

3. Характер ответа на пептидогликан S.aureus в смешанной популяции лимфоцитов определяется В-лимфоцитами и не зависит от присутствия Т-клегок .

4. Обработка пептидогликана S.aureus нормальной сывороткой ведет к количественному усилению и ускорению X/1-ответа лимфоцитов. Основная роль в опсоническом эффекте принадлежит

г

антителам и комплементу.

5. При анализе показателей клеточного и гуморального иммунитета у одних и тех ае доноров уровень специфической реактивности лимфоцитов к пептидогликану золотистого стафилококка не коррелирует с содержанием антипептидогликановых антител.

6. В спектре реактивности лимфоцитов к бактериальным пепти-догликанам золотистый стафилококк занимает лидирующее место как внутри рода Staphylococcus, так и по сравнению с представителями- других таксонов.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. СЗЬ-опосредованная хемилюминесценция лимфоцитов человека, бюл. экспер. биол.,1989, N 11, с. 587-589 (соавторы А.Н.На-янский, С.П.Рассанов).

2. Лимфоцитзависимая реактивность нейтрофилов человека к бактериальным пептидогликанам. В сб.: Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. Горький, 1989, с. 92 - 98 (соавторы Д.Г.Астафьев, С.П.Рассанов).

3. Хемилюминесценция лимфоцитов человека в реакциях с пепти-догликаном Staphylococcus aureus. Журн. микробиол.,1990,N 3, с.65-68 (соавторы А.Н.Маянский, С.П.Рассанов, Д.Г.Астафьев).

4. Реактивность лимфоцитов в системе опсонической кооперации. В сб. Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях. Тез. докл. к X межинститутской научной конф. Челябинск, 1990, с. 92-93 (соавторы А.Н.Маянский, С.П.Рассанов).

5. Характеристика пептидогликана Staphylococcus aureus в спектре реактивности лимфоцитов человека к бактериальным пептидогликанам. Зурн. микробиол., 1991, И 9, с. 60-62 (соавторы Н.И.Сибирякова, Д.Г.Астафьев, С.П.Рассанов, А.Н.Маянский).

6. Ответ лимфоцитов человека на пептидогликан Staphylococcus aureus в системе опсонимеской кооперации. Шурн. микробиол., 1991, N 12, с. 46-48 (соавторы А.Н.Маянский, Д.Г.Астафьев).