Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома"
На правах рукописи УДК 639 3 091 577 2
Щелкунов Игорь Степанович
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ВЕСЕННЕЙ ВИРЕМИИ КАРПА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ГЕНОМА
03.00.06 - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Покров - 2005 г.
Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства» (ФГУП «ВНИИПРХ»), Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор») и Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ ВНИИВВиМ) Российской академии сельскохозяйственных наук.
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор
Цыбанов Содном Жамьянович
кандидат химических наук, ст науч. сотр. Орешкова Светлана Федоровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор Рыбаков Сергей Сергеевич
кандидат ветеринарных наук,
старший научный сотрудник Капустина Ольга Владимировна
Ведущее учреждение - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им Я Р. Коваленко» Россельхозакадемии (ГНУ «ВИЭВ»)
Защита диссертации состоится 23 декабря 2005 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институте ветеринарной вирусологии и микробиологии» Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу' 601120, г Покров Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Тел./факс: (09243) 62125
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан "/■/ " М-ОЛс^ТлЯ- 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук Савукова В Я
¿vete
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы. Весенняя виремия карпа (ВВК) — остропротекающая высококонтагиозная вирусная болезнь карпа, Cyprinus сагрю L , характеризующаяся развитием септического процесса и массовой гибелью рыб Заболевание проявляется в виде экссудативно-геморрагического синдрома («краснуха»), обусловленного поражением вирусом эндотелия кровеносных капилляров и почек, что приводит к нарушению водно-минерального баланса и выходу плазмы и форменных элементов крови в окружающие ткани и полости тела (Рудиков, 1988, Fijan et al, 1971, Wolf 1988) По классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) ВВК относится к категории особо опасных («декларируемых») болезней рыб (OIE, 2004)
В аквакультуре вспышки заболевания провоцируются техногенными стрессами и происходят обычно весной, вскоре после пересадки рыб из зимовальных в нагульные пруды Гибель рыб (преимущественно годовиков и двухлетков, реже - двухгодовиков и производителей) достигает 30-40%, а иногда и 70% (Fijan, 1999) При выращивании в поликультуре с карпом вирус выделяли также от белого амура, белого и пестрого толстолобиков, золотого карася, европейского сома и щуки (Инструкция , 1997)
ВВК установлена во всех европейских странах с развитым карповодством С 2002 г регистрируется в США (Goodwin, 2002), а в 2004 г была выявлена в Китае (Liu et al, 2004) В последние годы наблюдается тенденция к глобализации инфекции Основным путем распространения болезни являются межхозяйственные перевозки живой рыбы, в т ч декоративных карповых рыб (OIE, 2004)
В бывшем СССР возбудитель ВВК был впервые выделен от больных рыб Н.И Рудиковым (1972) Было обнаружено, что ВВК широко распространена в рыбхозах центральной и южной зон Европейской части страны (в т ч в Белгородской, Курской, Липецкой, Ростовской областях и Краснодарском крае России, а также в Украине, Молдове, Беларуси, Литве и Грузии), где она вызывала гибель до 30-57% карпа -главного объекта выращивания в отечественной аквакультуре (Мамыш и др , 1981, Надточий, Рудиков, 1975, Осадчая, 1977; Рудиков, 1975, 1980, 1988, Рудиков и др , 1986, Скурат и др , 1984 Щелкунов, Щелкунова, 1987, 1990, Щелкунов и др , 1984) В 1993-1995 и 2004 г г ВВК отмечали в рыбоводных хозяйствах Свердловской и Тверской областей, а с 2003 г болезнь регистрируют в Московской области (Пичугина и др, 2004) Существует реальная опасность дальнейшего
распространения ВВК по территории страны, создающая угрозу значительных материально-экономических потерь в будущем, когда отечественное рыбоводство вновь заработает в полную силу
В России диагноз на ВВК ставят на основании выполнения комплекса классических требований, включающих анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патологоанатомических изменений, подкрепленный результатами вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы Вместе с тем, оставаясь «золотым стандартом», традиционные вирусологические методы, в силу их трудоемкости и продолжительности, уже не в полной мере отвечают требованиям сегодняшнего дня Сегодня диагностика ВВК остро нуждается в экспрессных, чувствительных и специфичных методах детектирования возбудителя Коммерческие наборы для быстрого выявления вируса с помощью поли - и моноклональных антител производят фирмы Чехии, Германии и Бельгии, однако эти наборы недостаточно специфичны Разрабатываемые за рубежом молекулярно-генетические методы диагностики ВВК (зондовой антирибонуклеазной защиты, полугнездовой и гнездовой полимеразной цепной реакции, гибридизации in situ и обратной гибридизации) (Ahne et al, 1998, Dixon, 2003; Koutna et al, 2003, Liu et al, 1998, Sheppard et al, 2003, OIE, 2003), при всех их достоинствах, имеют ряд недостатков (необходимость использования культур клеток рыб, радиоизотопов и др ), ограничивающих их использование на практике
Исследования последних лет показали, что избирательная амплификация участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), дополняя серологические методы, способна значительно расширить возможности выявления вируса ВВК непосредственно в клинических образцах
Одним из перспективных направлений является применение метода ПЦР в сочетании с секвенированием ПЦР-продуктов и рестрикционным анализом Данный подход позволяет осуществлять тонкую генетическую дифференциацию штаммов и изолятов вируса Преимуществом этих методов является высокая чувствительность и специфичность, быстрота и уникальный дискриминативный потенциал Поэтому изучение генома вируса ВВК с целью совершенствования имеющихся и разработки новых эффективных средств диагностики болез^'Является актуальной научной проблемой.
1.2 Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является создание тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи
- сконструировать ДНК-зонды комплементарные различным участкам генома вируса ВВК и оптимизировать условия проведения гибридизации,
- определить специфичность и чувствительность метода гибридизации для идентификации РНК вируса ВВК на панели вирусных изолятов;
- подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома вируса и оптимизировать условия проведения полимеразной цепной реакции,
- определить специфичность и чувствительность метода ПЦР для идентификации РНК вируса ВВК в зараженной культуре клеток и клиническом материале от искусственно и естественно инфицированных рыб,
- провести дифференциацию различных штаммов и полевых изолятов вируса на основе анализа первичной последовательности участков гена нуклеопротеина и рестрикционного анализа ПЦР-продуктов
1.3. Научная новизна:
впервые клонированы последовательности генома отечественного референсного штамма ЗЛ4 вируса ВВК и получены фаговые ДНК-зонды, пригодные для выявления РНК вируса ВВК в зараженной культуре клеток методом дот-гибридизации;
- определены праймеры и отработаны условия постановки ПЦР, позволяющие идентифицировать вирус ВВК в зараженной культуре клеток и клиническом материале от рыб,
- впервые определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена нуклеопротеина 7 европейских и 12 отечественных изолятов вируса ВВК с целью установления их генетического родства,
- показано, что европейские изоляты вируса ВВК отличаются от изолятов из бывшего СССР более высоким уровнем консервативности гена нуклеопротеина, выявленные различия легли в основу разработки метода рестрикционного анализа для генетического типирования и дифференциации вирусных штаммов в зараженной культуре клеток и клиническом материале от рыб,
- обнаружен комплекс точечных мутаций в последовательности между генами нуклеопротеина и фосфопротеина, характерный для представителей отечественной мажорной геногруппы вируса, выявленная особенность использована при разработке штаммоспецифической ПЦР для быстрой идентификации агентов данной группы
1.4. Практическая значимость. Разработаны методы, наборы препаратов и инструкции по применению молекулярной гибридизации и ПЦР для выявления РНК вируса весенней виремии карпа, которые прошли комиссионные испытания, одобрены Ученым советом и утверждены заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ»
Разработаны методы рестрикционного анализа ПЦР-продуктов и штаммоспецифической ПЦР и на их основе предложена схема дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК
Разработанные методы и наборы препаратов рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
- наборы препаратов для выявления РНК вируса ВВК на основе методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции с использованием
праймеров комплементарных различным областям вирусного генома,
- способы молекулярно-генетической идентификации полевых изолятов и штаммов вируса ВВК в зараженной культуре клеток и пробах клинического материала,
- методы дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью штаммоспецифической ПЦР и рестрикционного анализа
1.6. Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях Ученого совета ФГУП «ВНИИПРХ» и совместных заседаниях Научно-консультативного совета по болезням рыб Межведомственной ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1999 - 2005 г г), Научно-практической конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре» (21-22 ноября 2000 г, г Москва), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб» (16-18 ию'йя"2003 г",~п""БЗраТГЯ|5осШвСКйй обл ^ Второй международной научной конференции «Биотехнология - охране
окружающей среды» (25-27 мая 2004, МГУ, г Москва) Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (26-27 мая 2005 г, г Щелково Московской обл), Всероссийской научно-практической конференции-семинаре «Эпизоотологический мониторинг в аквакультуре состояние и перспективы» (13-14 сентября 2005 г, г Москва), Четвертом Международном симпозиуме по вирусам низших позвоночных (12-15 мая 1998 г, г Веймут Великобритания), Первом и Втором российско-американских симпозиумах по охране здоровья рыб и других гидробионтов (12-19 июля 1998 г, п Рыбное Московской обл и 21-28 сентября 2003 г, г Шефердстаун, США), Девятой и Десятой международных конференциях Европейской ассоциации ихтиопатологов (19-24 сентября 1999 г, Родос, Греция и 9-14 сентября 2001 г, г Дублин, Ирландия), Семинаре референтных лабораторий Евросоюза по диагностике болезней карповых рыб (2-4 июня 2003 г, г Веймут, Великобритания) и 30-ой Восточной конференции по охране здоровья рыб (13-17 июня 2005 г, г Шефердстаун, США)
1.7. Публикация результатов. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ
1 8 Участие соискателя в получении научных результатов. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно Идентификацию вируса ВВК методом ПЦР и рестрикционного анализа продуктов амплификации проводили совместно с к х н Орешковой С Ф
1.9. Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены 97 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 149 отечественных и зарубежных источников, приложение Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками
2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Материалы и методы В работе было использовано 26 штаммов вируса ВВК, по два штамма рабдовируса мальков щуки (PFRV) и инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV, ия ФР 1/00 и ФР 2/00) и по одному штамму рабдовирусов угря Rhabclovirus anguilla (шт УФ) и вирусной геморрагической септицемии (VHSV, шт ЧФ - 1,2)
Вирусы ВВК, PFRV и VHSV накапливали на постоянной линии эпидермальных клеток карпа ЕРС (Fijan et al, 1983), вирус IHN - на линии клеток сердца кеты СНН-1(Lannan et al, 1984), а рабдовирус угря - на линии клеток черного толстоголова FHM (Gravell, Malsberger, 1965) или трансформированных клетках хвостового плавника карпа CTF/T (Щелкунов, Щелкунова, неопубл) Культуры клеток двух первых линий выращивали на среде Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов и 10% сыворотки крови эмбрионов коров (2МЕМ-10) соответственно при 25°С и 19,3°С, а клетки CTF/T - на среде 199 с 10% сыворотки крови эмбрионов коров (199-10) при 25°С Суточные культуры клеток инокулировали вирусами при замене ростовой среды на поддерживающую (2МЕМ-2 и 199-2, соответственно) и инкубировали далее при 21,5°С (ВВК и PFRV), 14°С (VHSV и IHNV) или 19,3°С {Rh anguilla) до полного разрушения клеточного монослоя вирусом, после чего культуральную жидкость использовали для приготовления препаратов для тестирования гибридизационными зондами и методом ПЦР Количество инфекционного вируса определяли методом титрования по Риду и Менчу Перечень использованных в работе вирусных штаммов и изолятов приведен в табл 1
Инфицированный материал от рыб получали, заражая карпов средней массой 25 - 30 г вирусом ВВК путем внутрибрюшинной инъекции или внесения вируса в воду Рыбу содержали при температуре воды 13-15°С От погибших особей отбирали пробы тканевого материала и экссудата из брюшной полости Аналогичные пробы отбирали от незараженных рыб Полевые клинические материалы от рыб отбирали в ходе комиссионных обследований рыбхозов Краснодарского края, Московской и Тверской областей
Суммарную РНК выделяли модифицированным методом Chomczynski-Sacchi (1987) с использованием 6М раствора гуанидинтиоцианата
При разработке ДНК-зондов синтез кДНК и клонирование выполняли с помощью набора фирмы «Сибэнзим» В качестве праймеров использовали «рассеянную затравку», а также олигонукпеотиды длиной 19-25 оснований, комплементарные опубликованным последовательностям генов матриксного белка (М-ген) и нуклеопротеина (N-ген) зарубежных штаммов вируса весенней виремии карпа Матрицей служила РНК российского референтного штамма 3J14 вируса ВВК
Трансформацию клеток Е coli вели по стандартной методике (Маниатис и др, 1984) Рекомбинантные клоны- идентифицировали рестрикционным анализом и гибридизацией
Таблица 1
Использованные в работе штаммы и изоляты рабдовирусов
№ п/п Штамм или изолят Хозяин Выделение
Регион Год
ввк
1 3J1 4 карп Краснодарский край 1991
2 Кр 1 -«- -«- 1984
3 Р 4 -«- Ростовская обл 1983
4 ККК -«- Курская обл 1986
5 ЛК/03 -«- Московская обл 2003
6 KL/0604 -«- -«- 2004
7 КВ7/0505 -«- 2005
8 Уд -«- Тверская обл 1994
9 KU/0204 -«- -«- 2004
10 1 4 -«- Свердловская обл 1993
11 FB1/03 радужная форель лабор-ные условия 2003
12 N 1 пестрый толстолобик Украина 1986
13 N 3 белый амур -«- 1986
14 N 5 карп -«- 1986
15 1/99 -«- 1999
16 М2 белый толстолобик Молдова 1983
17 2/90 карп -«- 1990
18 «Fijan» -«- Хорватия 1971
19* 435 Германия ?
20* 450 -«- -«- ?
21* 17314/5 -«- Венгрия ■?
22* 17417/3 европейский сом -«-
23* 3587 золотая рыбка ? ?
24 V 500 карп Чехия 1996
25 V 539 -«- -«- 1997
26 V 541 -«- 1998
27* RVC 1 ? •7 ?
PFRV
28* Ref. str. щука Нидерланды 1973
29* "Hecht" -«- ? ?
Rhabdovirus
апаиШа
30 УФ европейский угорь Германия 1985
VHSV
31 ЧФ 1,2 радужная форель Грузия 1981
IHNV
32 ФР 1/00 Московская обл 2000
33 ФР 2/00 -«- -«- -«-
Примечание штаммы вирусов были любезно предоставлены «Fijan»
- д-ром Н Bjorklund (Финляндия), * - д-ром N Lorenzen (Дания), V500, V539 и V541
- д-ром Т Vesely (Чехия), ЛК/03 - с н с, к б н Т Д Пичугиной (ВИЭВ) Остальные выделены в лаборатории ихтиопатологии Ф^УГТ «ЁН И И П РХ »
Биотинилирование ДНК-зондов выполняли по Адаричеву и др (1987) Дот-гибридизацию вели на нейлоновых фильтрах (Sigma) Биотиновые группы на фильтрах выявляли с помощью конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза и красителей 5-бром-З-индолилфосфата и нитротетразолевого синего Величину сигналов гибридизации оценивали визуально или на денситометре ДО-1
При разработке ПЦР-методов для выявления и дифференциации вируса в реакции обратной транскрипции использовали праймер N3 и M-MuLV - обратную транскриптазу (СибЭнзим) В полимеразной цепной реакции использовали термофильную ДНК-полимеразу, олигонуклеотиды-праймеры N3 и N5 в первом раунде и пару N3-N4 во втором (полугнездовая ПЦР) Праймеры были подобраны на консервативные участки гена нуклеопротеина с учетом опубликованной последовательности гена для европейского референтного штамма "Fijan" вируса ВВК Размеры ПЦР-продуктов определяли электрофорезом в 1%-ном агарозном или 6%-ном полиакриламидном гелях В качестве альтернативного варианта реакции испытывали вариант с использованием праймера N17 в обратной транскрипции и пар N17 - N2 и N1 - N2, соответственно, в первом и втором раундах ПЦР. Специфичность получаемых ПЦР-продуктов проверяли их гидролизом рестриктазами Rsal и Fokl (СибЭнзим), соответственно
Рестрикционный анализ ПЦР-продуктов N1-N2 проводили соответствующими подобранными ферментами (СибЭнзим) и разделяли с помощью электрофореза в 6%-ном полиакридамидном геле
Эксперименты проводили не менее чем в трехкратных повторностях Статистическую обработку результатов исследований осуществляли принятыми в биологии методами (Лакин, 1990)
Компьютерный анализ и сравнение первичных последовательностей нуклеиновых кислот проводили с использованием прикладной программы ClustalX (Thompson et al, 1997)
2.2. Результаты собственных исследований 22 1 Клонирование фрагментов генома вируса ВВК и получение ДНК-зондов Для получения фрагментов генома вируса весенней виремии карпа и конструирования на их основе специфичных ДНК-зондов были использованы методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции Амплифицированные ДНК-копии фрагментов М- и N-генов после обработки эндонуклеазами рестрикции Pstl—Clal были встроены в полилинкерную область
плазмиды pUC18, а затем переклонированы в однонитевой фаговый вектор М13тр8 по соответствующим сайтам рестрикции Таким образом были получены и затем помечены биотином два ДНК-зонда зонд M13-SVCV-M8 (на геномную РНК вируса) содержал вставку М-гена размером 248 н о из средней части гена (позиции 134 -381), а зонд M13-SVCV-N8 (на вирусную мРНК) содержал вставку N-гена, размером 405 н о из второй половины гена (позиции 979 - 1383)
122 Разработка тест-системы для идентификации вируса ВВК методом дот-гибридизации Отработку состава реакционной смеси и режима проведения дот-гибридизации (температура гибридизации от 45°С до 70°С, продолжительность гибридизации от Зч до 24ч) вели на матрице РНК вирусного штамма ЗЛ4 Оптимальные для обоих зондов результаты были получены при 16-часовой гибридизации при температуре 65°С в гибридизационном растворе, состоящем из 6xSSC, 5х Denhardt, 0,5% SDS, 0,05 мг/мл денатурированной ДНК лосося и ДНК-зонда в концентрации 100 нг/мл.
Результаты сравнительного анализа специфичности выявления РНК вируса ВВК ДНК-зондами в инфицированной культуре клеток показали, что получаемые с их помощью данные хорошо согласовывались между собой Из 19 испытанных штаммов вируса ВВК зондами четко выявлялись 16 Для трех штаммов (№1, 3597 и М2) реакция была пониженной Один ("Hecht") из двух испытанных штаммов PFRV дал слабую реакцию с зондами Зонды практически не гибридизовались с пробами других рабдовирусов рыб (Rhabdovirus anguilla, IHNV и VHSV) и препаратами нуклеиновых кислот контрольных культур клеток Гибридизации не было также с РНК вирусов гепатита А, классической чумы свиней, диареи крупного рогатого скота, а также с ДНК бычьего герпесвируса типа 1, которые были взяты в качестве отрицательных контролей Это свидетельствовало о специфичности работы зондов на препаратах культуральных вирусов Интересно, что зонды распознавали европейские штаммы вируса ВВК, которые не нейтрализовались отечественными гипериммунными антисыворотками на вирус ВВК (штамм М2) (табл 2)
Анализ чувствительности выявления вирусной РНК в инфицированной культуре клеток показал, что оба биотинилированных ДНК-зонда выявляли связанный с клетками вирус ВВК с титром не ниже Ю^ТЦДбо в пятне (примерно 10^ЦДбо/см3), тогда как свободный вирус можно было выявить при титрах не менее 108 ТЦД50/СМ3
Таблица 2
Репрезентативные результаты гибридизации ДНК-зондов на вирус ВВК с различными вирусными штаммами и контрольными препаратами
_ _ _ _ п = 3
Тестируемый материал Нейтрализация антисыворотко й на вирус ВВК Гибридизация с зондами Титр вируса, ТЦД50/мл
M13-SVCV-M8 M13-SVCV-N8
ВВК
ЗЛ4 (Россия) + + + 7,85
Кр1 (-"-) + + + 8,1
Р4 (-"-) + + + 7,85
ККК (-"-) + + + 8,32
14 (-"-) + + + 7,85
Уд (-"-) + + + 7,35
М2 (Молдова) + + + 7,32
2/90 (-"-) + + + 8,1
N1 (Украина) + + + 8,27
N3 (-"-) + + + 9,35
N5 (-"-) + + + 8,1
1/99 (-"-) + + + 7,85
V 539 (Чехия) - + + 7,1
435 (Германия) + + + 8,1
450 (-"-) - + + 8,1
"Fijan" (Хорватия) - + + 8,1
17314/5 (Венгрия) - + + 8,35
17417/3 (-"-) - + + 8,1
3587 (?) - + + 8,85
PFRV
Ref. str.(HwepnaHAbi) - - - 7,1
"Hecht" (?) - + + 8,1
Rhabdovirus
anquilla
УФ (Германия) - - - 7,35
VHSV - ;
ЧФ 1,2 (Грузия) - - - 7,57
IHNV
ФР2/00 (Россия) - - - 7,32
Культуры клеток
ЕРС - - -
СНН-1 - - -
CHSE-214 - - -
FHM - - -
Примечание «+» - положительный результат, «-» - отрицательный «+» - сомнительный результат При сравнении эффективности выявления вируса ВВК в клинических
материалах от экспериментально инфицированных карпов (153 пробы) методами выделения на культуре клеток и гибридизации было установлено, что оба зонда в
целом работали согласованно, хотя и уступали методу выделения вируса Зонд М13-Э\/С\/-М8 несколько превосходил зонд М13-8\/С\/-М8 по величине гибридизационного сигнала и частоте выявления вируса Зонды одинаково хорошо выявляли вирусы обоих испытанных штаммов (М2 и ЗЛ4) Вирусная РНК выявлялась во всех видах исследованного материала, но наибольшей диагностической ценностью обладали пробы экссудата, мозга и кожи Все 40 проб от контрольных рыб в реакции с зондами дали отрицательный результат Чувствительность детектирования составила примерно 10^ЦДбо/см3
Была оптимизирована процедура пробоподготовки (объем образца, режим депротеинизации) и проведения анализа (термоденатурация РНК и зонда, блокирование фальш-позитивных реакций), что позволило повысить величину сигнала и специфичность работы зондов при тестировании материалов от рыб
Таким образом, в ходе проведенной работы были созданы биотинилированные ДНК-зонды, позволяющие методом дот-гибридизации быстро (1-2 суток) идентифицировать вирус весенней виремии карпа в зараженной культуре клеток Зонды могут быть использованы и для выявления вируса в пробах от инфицированных рыб, хотя и с меньшей эффективностью
Оптимизирован режим и условия проведения реакции, создан «Набор препаратов по выявлению РНК вируса ВВК методом дот-гибридизации» Разработана, одобрена Ученым советом и утверждена заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ» «Инструкция по применению тест-системы для идентификации вируса весенней виремии карпа методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот» Успешно проведены ее комиссионные испытания (Заключения от 22 08 01 и 27.08 01)
2 2.3 Разработка тест-системы для выявления вируса ВВК методом полимеразной цепной реакции»
Основными задачами данного этапа исследований являлись подбор специфических лраймеров и оптимизация условий постановки ПЦР, оценка специфичности и чувствительности выявления РНК вируса ВВК методом полимеразной цепной реакции в зараженной культуре клеток и клиническом материале от искусственно и естественно инфицированных рыб
2 2 3 1 Подбор праймеров и оптимизация условий постановки ПЦР Оценивали возможность применения для идентификации вируса ВВК
«наружных» праймеров N3 и N5, комплементарных гену нуклеопротеина (табл 3) Эти праймеры направляют синтез ПЦР-продукта размером 418 п н С целью повышения чувствительности метода применяли методику полугнездовой ПЦР, которая заключалась в использовании в первом цикле реакции «наружных» праймеров N3 и N5, а во втором - «внутреннего» праймера N4 в паре с праймером N3 (ПЦР-продукт размером 388 п н )
Таблица 3
Использованные в работе последовательности праймеров, комплементарных гену нуклеопротеина вируса ВВК
Праймер Ориентация Последовательность Положение на гене
N17 Прямой 5'- CAGCTTGTTGCTGCATTATG 898-917
N1 Прямой 5'- AATGCAAGCTTGCTGATGGCT 979-999
N2 Обратный 5'- AACTGCAGCATACGCTTTGAGGCTT 1364-1383
N3 Прямой 5'- AGTCTAGATTGTAGCCTGTGTGGACA 573-593
N4 Обратный 5'- ATAGATCTCGTCAGGCTGTCTTGC 940-960
N5 Обратный 5"- CCCAAGCTTGCATTTGAGATCGAC 969-990
Nrosl 1rev Прямой 5'- CAGCCCTGATATTGAGCAG 1014-1032
Nros2 Обратный 5'- CTTCTATTATCACTTAAAATTGTC 1278-1301
Нумерация нуклеотидов дана от 5 - конца N-гена европейского референсного шт "Fijan" вируса ВВК
В ходе оптимизации условий постановки обратной транскрипции и ПЦР были испытаны различные объемы реакционной смеси, буферные системы, количество вносимой РНК и кДНК, праймеров, ферментов, концентрации ионов Мд*2 и дНТФ, режимы амплификации Оптимальный результат ревертазной реакции был получен при синтезе кДНК в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл РНК, буфер ЯЕУх1 (50 мМ трис-НС1, рН 8,3, 3 мМ МдС12, 75 мМ КС1, ЮмМ ДТТ), 0,5 мМ смесь дНТФ, 100 мкг/мл праймера N3 и 800 ед/мл М-Ми1_\/ - обратной транскриптазы (Сибэнзим) После инкубации при 42°С в течение 2 часов полученную кДНК прогревали при 95°С в течение 3 мин и использовали в ПЦР
Оптимальный результат амплификации РНК вируса ВВК в первом раунде ПЦР был получен при использовании реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 1 мкл кДНК, буфер ТАОх1 (60 мМ трис-НС1, рН 8,5, 1,5 мМ МдС12, 25 мМ КС1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% тритон Х-100), 0,2 мМ смесь дНТФ, по 0,2 мкг праймеров N3 и N5 и 2 ед Тад-полимеразы (Сибэнзим) Амплификация состояла из 30 циклов 95°С, 1 мин, 60°С, 1 мин и 72°С, 1,5 мин В конце реакции - завершающий синтез при 72°С в течение 3 мин Условия постановки второго раунда были такими же, как и в первом, за исключением температуры отжига праймеров, равной 62°С
В результате проведенных исследований с этими парами праймеров в первом и втором раундах ПЦР на матрице РНК вируса ВВК (шт "Fijan") были получены четкие ПЦР-продукты ожидаемых размеров (соответственно 418 и 388 п н ) ВВК-специфичность продукта N3-N4 подтверждена гидролизом эндонуклеазой рестрикции Rsal на фрагменты ожидаемого размера (172 и 216 п н )
2232 Определение специфичности и чувствительности выявления РНК вируса ВВК методом ПЦР
При проверке специфичности полимеразной цепной реакции с вышеуказанными праймерами в качестве матриц были использованы препараты РНК десяти отечественных и европейских штаммов и изолятов вируса ВВК, РНК, выделенная из патматериала от зараженных вирусом рыб, а также нуклеиновые кислоты различных РНК- и ДНК-геномных гетерологичных вирусов PFRV, Rhabdovirus anguilla, VHSV, IHNV, вируса бешенства (шт «ТС-80») и вируса болезни Ауески (шт «БУК»)
В результате РНК вируса ВВК была выявлена во всех инфицированных им пробах культурального материала и пробах органов зараженных рыб Культуральный вирус без труда выявлялся в обоих раундах ПЦР, тогда как при тестировании клинических материалов от рыб имевших признаки острой формы заболевания, вирусоспецифические продукты в первом и даже втором раунде выявлялись не всегда, что, вероятно, было обусловлено присутствием ингибиторов ПЦР в тканях рыб Специфичность полученных продуктов N3-N4 была подтверждена их гидролизом на фрагменты ожидаемого размера эндонуклеазой рестрикции Rsal При использовании в качестве матриц препаратов РНК и ДНК других вирусов, а также РНК, экстрагированной из проб неинфицированных культур клеток и органов здоровых карпов, специфичные для вируса ВВК ампликоны обнаружены не были (табл 4)
Чувствительность выявления вируса ВВК в культуре клеток определяли тестированием серийных 10-кратных разведений вирусной РНК В первом раунде ПЦР (праймеры N3 и N5) для трех испытанных вирусных изолятов (N1, М2 и 1 4) она была примерно одинаковой и для осветленных образцов культурального вируса составила около 1037 ТЦД^/пробу или примерно 1064 ТЦД50/мл После второго раунда (праймеры N3 и N4) возросла примерно до 10"47 TI4flSo/npo6a (около Ю"09 ТЦДбо/мл)
Чувствительность выявления вируса ВВК в патологическом материале определяли тестированием в ПЦР серийных 10-кратных разведений РНК выделенной из разных тканей и выделений двух зараженных вирусным штаммом ЗЛ4 рыб имевших признаки острой формы заболевания Учитывая, что в материалах от рыб могут присутствовать ингибиторы ПЦР, для создания одинаковых условий микросреды в тестируемых препаратах разведения готовили на РНК, выделенной из этих же тканей контрольных рыб
Таблица 4
Репрезентативные результаты определения специфичности ПЦР с праймерами N3, N4 и N5, комплементарными гену нуклеопротеина
л = 5
Образцы тестируемого материала Наружные праймеры N3 + N5 Внутренние праймеры N3 + N4 Рестрикция Rsal Титр вируса, lg ТЦДао/см3
Культуральный вирус ВВК
шт ЗЛ4, исходная суспензия + + + 8,85
шт ЗЛ4, осветл супернатант + + + 8,85
шт ЗЛ4, 10х концентрат + + + 9,1
шт "Fijan", исходная суспензия + + + 7,6
шт "Fijan", осветл супернатант + + + 7,25
шт 'Fijan", 10х концентрат + + + 8,36
Патматериал от больных карпов, зараженных штаммом КВ7/0505 вируса ВВК
Жабры - + + 6,35
Селезенка + + + 6,1
Кожа - - н д 6,35
Контрольные образцы
Жабры здорового карпа - - н. д. -
Селезенка здорового карпа - - Н д -
Кожа здорового карпа - - н Д -
Rhabdovirus anguilla, шт УФ - - Н д. -
VHSV, шт. ЧФ 1,2 - - н Д -
Вирус бешенства, шт ТС-80 - - Н д -
Вирус болезни Ауески, шт БУК - - н д -
Культура клеток СНН -1 - - н д -
Культура клеток ЕРС - - н д -
Примечание «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат
«н д» - не делали
Установлено, что чувствительность метода была аналогичной для материалов от обеих рыб и зависела от вида тестируемого клинического материала После первого раунда она составила мозг - >105 ТЦД50/г, экссудат <102 ТЦД5о/г, кожа - ~ 105 ТЦД50/г, плавники - < 104 ТЦД50/г и почка > 106ТЦД50/г Чувствительность
после второго раунда мозг - <101 ТЦД50/г, экссудат - <102 ТЦД50/г, кожа - - 103 ТЦД5о/г, плавники - < 104 ТЦД50/г и почка ~ 104 ТЦД50/Г Следовательно, диагностически наиболее ценными для ПЦР-диагностики ВВК-инфекции являются образцы мозга и экссудата больных рыб, тогда как в пробах почки имела место выраженная ингибиция реакции Феномен ингибиции удалось в значительной мере устранить простым разведением РНК в 10 - 100 раз При этом существенно возрастала как частота выявления вируса, так и величина специфического ПЦР-сигнала
Таким образом, подобранные пары праймеров позволяют специфически идентифицировать вирус ВВК в зараженной культуре клеток и клиническом материале от рыб В результате проведенных исследований был разработан «Набор препаратов для выявления РНК вируса ВВК методом ПЦР» Специфичность набора подтверждена комиссионными испытаниями (Акт от 02 12 2003) Разработана и утверждена заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ» «Инструкция по выявлению РНК вируса весенней виремии карпа методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции»
22 3 3 Сравнительная эффективность выявления вируса ВВК в материалах от рыб методом ПЦР
Полевые материалы от карпов отбирали в четырех рыбхозах Тверской и Московской областей (табл 5) в связи с подозрением на ВВК или в ходе мониторинга хозяйств, проводимого по распоряжению Департамента ветеринарии Минсельхоза России (№ 13-3-18/2096 от 03 11 03) Работу проводили совместно с представителями органов местной ветеринарной службы и документировали соответствующими актами
Для выделения вируса ВВК доставленный материал (12 проб по 5 рыб/проба) был исследован в соответствии с требованиями национальных и международных нормативных документов по вирусологическому исследованию рыб («Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб», № 13-4-2/1054, утв Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 10 10 97, OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 41h ed , 2003) Пробами материала инокулировали перевиваемую культуру клеток ЕРС и инкубировали при температуре +21,5°С
Таблица 5
Данные обследования рыбоводных хозяйств
Хозяйство Срок Темпера- Возраст Клиничес- Отобранный
отбора тура рыбы кая картина материал
воды, °С вид кол-во проб
НЦ "Селекцентр" 28 02 04 8-10 годовик норма пч+пн+сел* 12
Рыбхоз
"Клинский" 20 04 04 6 годовик норма пч+пн+сел 12
"Бисеровский рыбокомбинат" 26 04 04 4-6 годовик норма пч+пн+сел 12
"Рыбокомбинат Лотошинский" 04 06 04 15 двухлетки и трехлетки хроническая форма ВВК ж+жк+сел** 12
Примечание 'объединенные пробы почки, печени и селезенки
** объединенные пробы жабр, жаберных крышек и селезенки
Идентификацию выделенных цитопатогенных агентов проводили в реакции нейтрализации с гипериммунной кроличьей антисывороткой на штамм М2 вируса ВВК Параллельно в отобранных пробах материала вели поиск вируса методом ПЦР
В результате проведенных исследований вирусные агенты были выделены из пробы 7 от годовика карпа из ООО «НЦ Селекцентр» и пробы 1 от трехлетков карпа из ЗАО «Рыбокомбинат Лотошинский» В реакции нейтрализации, выделенные агенты были идентифицированы как вирус ВВК Индексы нейтрализации составили 105 75 и 1045 при разведении антисыворотки в реакционной смеси 1 20 и 140, соответственно Идентификация изолятов была также подтверждена методом ПЦР путем выявления во втором раунде' вирусоспецифических ампликонов №-N4 размером 388 п н
ПЦР-тестирование клинических проб показало присутствие вирусоспецифических продуктов размером 388 п н в материалах из всех четырех хозяйств Специфичность выявленных ПЦР-продуктов была доказана их гидролизом рестриктазой Рва! с образованием фрагментов ожидаемой длины - 172 и 216 п н (табл 6)
Таким образом, результаты исследования показали, что по эффективности выявления вируса ВВК на стадиях скрытого и хронического течения болезни метод ПЦР значительно (в 12 и более раз) превосходит традиционный метод вирусовыделения в культуре клеток Эта закономерность не всегда проявляется при-остром течении заболевания, что обусловлено присутствием ингибиторов ПЦР в
тканях рыб, приводящих к появлению фальш-негативных реакций Для устранения феномена ингибиции анализируемые пробы РНК следует разводить в 10-100 раз 2 2 4 Дифференциация изолятов вируса ВВК на основе анализа вирусного генома Для дифференциации различных штаммов и изолятов вируса ВВК были использованы два подхода рестрикционный анализ ПЦР-продуктов и штаммоспецифическая ПЦР на основе праймеров, комплементарных вариабельному участку гена нуклеопротеина вируса
22 4 1 Дифференциация изолятов вируса ВВК методом рестрикционного
анализа
Целью данного этапа исследований была разработка метода дифференциации штаммов и изолятов вируса посредством рестрикционного анализа ампликонов N^N2 Амплификацию проводили в полугнездовой ПЦР с использованием наружных праймеров N17 и N2 и внутренних N1 и N2 Указанные праймеры направляли синтез продуктов длиной 486 и 405 п н , соответственно
Таблица 6
Сравнительная эффективность выявления вируса ВВК в полевых материалах от рыб методами выделения в культуре клеток и ПЦР
Результат выявления вируса в отобранных пробах %
Хозяйство Метод выяв-
выявления 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ления
к-ра клеток + 8,3
ООО "НЦ ОТ-ПЦР - - - - - - + _ - - - - 8,3
Селекцентр" ОТ-пгПЦР + + + + + + + + + + + + 100
к-ра клеток + 8,3
ЗАО "Р/к-т ОТ-ПЦР - + - - - - - + + + - 33,3
Лотошинский" ОТ-пгПЦР + + + + + + + + + + + + 100
к-ра клеток 0
ЗАО "Рыбхоз ОТ-ПЦР 0
Клинский" ОТ-пгПЦР нд + нд + НД + нд + нд + нд + 100 (6/6)
ОАО к-ра клеток 0
"Бисеровский ОТ-ПЦР 0
р/к-т" ОТ-пгПЦР нд + нд + нд + НД + "А + нд + 100 (6/6)
Примечание- нд - не делали; ОТ-пгПЦР - обратная транскрипция - полугнездовая полимеразная цепная реакция
Отбор ферментов рестрикции проводили на основании выравнивания и компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента N1 -N2 гена нуклеопротеина для 8 европейских и 10 отечественных штаммов и изолятов вируса ВВК Была установлена высокая степень гомологии последовательности референсного европейского штамма "р1]ап"'®чР^таковыми у других европейских штаммов В отличие от них, штаммы вируса из бывшего СССР имели
множественные закономерные замещения нуклеотидов на этом промежутке как в области N-гена, так и в области перехода между генами нуклеопротеина и фосфопротеина, что говорило о возможности осуществления на этой основе их генетической дифференциации В результате было отобрано 6 эндонуклеаз рестрикции (Rsal, Clal, BsoMAI, Tru9l, Psil и Fokl), имеющих сайты связывания в области N1-N2, которые были использованы для разработки метода рестрикционной дифференциации вирусных изолятов
Полученные результы позволили разделить 24 исследованных штамма вируса ВВК на пять генетических групп Мажорная группа 1 (п=7) образована европейскими штаммами Мажорная группа 5 (п=7) и три минорных группы - 2 (п=2), 3 (п=2) и 4 (п=3) - состоят из штаммов, выделенных на территории бывшего СССР Один отечественный и два европейских изолята вируса образуют группу агентов с уникальными рестрикционными профилями (табл 7)
В целом, европейские штаммы вируса ВВК оказались генетически более однородными, в отличие от изолятов из бывшего СССР, что совпадает с данными Stone et al (2003) В частности, представители трех минорных групп имеют рестрикционные сайты, характерные для мажорных групп 1 и 5, что позволяет рассматривать данные группы как переходные между группами 1 и 5.
Разработанный метод рестрикционного анализа дает возможность с высокой точностью отличать европейские штаммы и изоляты вируса от изолятов из бывшего СССР Факт генетического различия двух данных вирусных кластеров подкрепляет сделанный нами ранее вывод об их серологическом (антигеном) различии Следовательно, различия между данными кластерами вируса проявляются не только на уровне ответственного за нейтрализацию поверхностного гликопротеина (а, значит, и его гена), но и на уровне более консервативного внутреннего нуклеопротеинового гена В то же время, рестрикционный анализ, в отличие от реакции нейтрализации, позволил выделить среди отечественных изолятов три промежуточных минорных группы, что еще раз показывает, что молекулярно-генетические методы типирования вирусов превосходят по своему дискриминативному потенциалу серологические
Наиболее близко к европейской геногруппе 1 располагается геногруппа 2, представленная молдавскими изоляты М2 и 2/90 Очевидно, это объясняется тем, что Молдова находится на западном рубеже бывшего СССР и р а сп о л а гаФ^я^в" бассейне Дуная, приносящего воды с водосбора, занимающего значительную часть
территории южной Европы где распространена данная инфекция
Таблица 7
Генотипирование вируса ВВК методом рестрикционного анализа ампликона
Изолят (место выделения) Эндонуклеаза рестрикции
Rsal Clal BsoMAl Tru9l Psil Fokl
Группа 1
"Fijan" (Хорватия) + - - - + +
450 (Германия) + - - - + +
500 (Чехия) + - - - + +
541 (Чехия) + - - - + +
3587 (Австрия ?) + - - - + +
17314/5 (Венгрия) + - - - + +
17417/3 (Венфия) + - - - + +
Группа 2
М 2 (Молдова) + - - - - +
2/90 (Молдова) + - - - - +
Группа 3
Уд (Россия) - + - - + +
Р4 (Россия) - + - - + +
Группа 4
ЛК/03 (Россия) + + - + + +
Ки/0204 (Россия) + + - + + +
К1_/0604 (Россия) + + - + + +
Группа 5
ЗЛ 4 (Россия) - + + + - +
Кр 1 (Россия) - + + + - +
ККК (Россия) - + + + - +
1.4 (Россия) - + + + - +
N 1 (Россия) - + + + - +
N 3 (Украина) - + + + - +
N 5 (Украина) - + + + - +
Изоляты с уникальными рестрикционными профилями
435 (Германия) + - - + + +
1/99 (Украина) + + - - - +
RVC-1 (Зап. Европа - - + + - +
Примечание' «+» - ампликон гидролизуется, «-» - ампликон не гидролизуется
Геногруппа 4 состоит из изолятов, выделенных в подмосковном регионе ( ЗАО «Рыбокомбинат Лотошинский» и ООО «НЦ Селекцентр», г Удомпя) Интересно, что выделенный нами в 2004 г в г Удомля изолят К11/0204 по своему рестрикционному профилю отличается от штамма Уд (геногруппа 3), изолированного там же в 1994 г Разработанный метод был успешно апробирован для типирования вирусных
штаммов непосредственно в клинических материалах (in situ) из ЗАО «Рыбокомбинат Лотошинский» ЗАО «Рыбхоз Клинский» и ОАО «Бисеровский р/к-т» без выделения вируса от рыб
Таким образом, предложенный метод типирования вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа фрагмента N1-N2 гена нуклеопротеина дает возможность производить тонкую дифференциацию вирусных изолятов, тем самым, позволяя оперативно отслеживать перемещение вирусных штаммов по территории страны 22 4 2 Разработка метода штаммоспецифической ПЦР Для типирования вируса ВВК методом штаммоспецифической ПЦР использовали праймеры Nros11Rev и Nros2 (табл 3) Структура праймеров была определена исходя из последовательности N-гена европейского референсного штамма "Fijan" Последовательность прямого праймера Nros11Rev полностью соответствовала участку 1014 - 1032 N-гена данного штамма, а последовательность обратного праймера Nros2, соответствующая участку 1278 -1301 N-гена, учитывала замены нуклеотидов, характерные для большинства российских и некоторых европейских изолятов Так, были учтены следующие замены Т->С в позиции 1280 и T->G в позиции 1291 для российских штаммов ЗЛ4, 14 N1, N3 N5 Кр1 ККК и европейского RVC1 G—>А в позиции 1288 для российских штаммов ЗЛ4 1 4 N1 N3, N5 Кр1 ККК и европейских RVC1 и 435 А-^Т в позиции 1296 для российских штаммов ЗЛ4, 1 4, N1, N3, N5, Кр1, ККК, Уд, Р4 и европейского RVC1 Таким образом, праймеры должны направлять синтез фрагмента размером 288 п н лишь в случае тех штаммов, для которых при выборе обратного праймера „ было учтено наибольшее количество замен Такими штаммами являются ЗЛ4, 1 4, N1, N3, N5, Кр1, ККК и RVC1 Реакция проводилась в тех же условиях, что указаны выше, и состояла из 30 циклов 95°С, 1 мин; 64°С, 1 мин и 72°С, 1 мин Заключительный этап 3-минутный прогрев смеси при 72°С
Для проверки метода были выбраны 5 российских (Уд, ЗЛ4, Р4, 1 4 и N3) и 5 европейских изолятов (3587, "Fijan", V 500, 450 и 17314/5) При проведении ПЦР продукт 288 п н синтезировался в случае российских изолятов ЗЛ4, 1 4 и N3, входящих в мажорную генетическую группу 5, и не синтезировался в случае всех пяти исследованных европейских изолятов и российских изолятов Уд и Р4, представляющих другие генетически^ группы (табл 8)
Таким образом, разработанный метод штаммоспецифической ПЦР позволяет быстро выявлять представителей основной генетической группы вируса ВВК,
циркулирующей на территории бывшего СССР (мажорная группа 5)
Таблица 8
Результаты дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК методом штаммоспецифической ПЦР
п=5
Штаммы и изоляты Результаты ПЦР
Отечественные штаммы
УД -
ЗЛ4 +
Р4 -
1 4 +
N3 +
Европейские штаммы
3587 -
Тцап" -
500 -
450 -
17314/5 -
Примечание «+» - положительный результат;
«-» - отрицательный результат.
2. ВЫВОДЫ
1 Путем клонирования в однонитевой фаговый вектор М13тр8 фрагментов размером 248 но М-гена вируса ВВК (позиции 134 - 381) и 405 но М-гена (позиции 979 - 1383) получены и помечены биотином два ДНК-зонда зонд М13-Э\/С\/-М8 (на геномную РНК вируса) и зонд М13-3\/СУ-М8 (на вирусную мРНК) Оптимальные результаты при использовании обоих зондов были получены после 16-часовой гибридизации при температуре 65°С в гибридизационном растворе, состоящем из бхББС, 5хОеп11агсИ, 0,5% БОБ, денатурированная ДНК лосося в концентрации 0,05 мг/мл, ДНК-зонд в концентрации 100 нг/ см3
2 Методом дот-гибридизации оба зонда специфически выявляли РНК 10-и испытанных штаммов вируса ВВК и не реагировали с образцами нуклеиновых кислот других вирусов, контрольных культур клеток и тканей здоровых рыб ДНК-зонды выявляли вирус ВВК с титром не ниже Ю^ЦДбо в пятне (примерно Ю'ТЦДбо/см3)
3 В результате анализа первичных последовательностей генома вируса весенней- виремии карпа подобран набор из 8 специфичных праймеров для амплификации различных участков гена вирусного нуклеопротеина (М-гена) и
оптимизированы условия проведения ПЦР-анализа
4 Использование в первом раунде ПЦР праймеров N3 и N5 (отжиг при 60°С, продукт 418 п н) и во втором раунде праймеров N3 и N4 (отжиг при 62°С, продукт 388 пн) позволяло в обоих раундах специфически выявлять РНК всех 10-и испытанных изолятов вируса ВВК Специфичность получаемых продуктов была подтверждена их гидролизом эндонуклеазой рестрикции Ява! на фрагменты ожидаемого размера Образования аналогичных продуктов с образцами нуклеиновых кислот других вирусов, контрольных культур клеток и тканей здоровых рыб не наблюдали
5 Чувствительность выявления вируса ВВК методом ПЦР в зараженной культуре клеток составила 1064 ТЦД50/мл в первом раунде и достигала 10'°9 ТЦДбо/мл во втором Чувствительность выявления вируса в клинических материалах от больных рыб варьировала в зависимости от вида материала и достигала 10 ТЦД50/см3 По частоте выявления вируса у рыб со скрытым и хроническим течением ВВК-инфекции метод полугнездовой ПЦР в 12 и более раз превосходил традиционный метод выделения вируса на культуре клеток (соответственно 100% и 8,3%), тогда как при тестировании клинических образцов от рыб с острой формой ВВК уступал ему примерно в 2 раза
6 Предложен метод генетического типирования вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа с использованием набора из 6 эндонуклеаз рестрикции (Рва1, С1а1, ВвоМА!, Тги91, РвИ и Рок!) фрагмента N^N2 гена вирусного нуклеопротеина Метод позволил разделить 24 исследованных штамма вируса ВВК на пять генетических групп две мажорные (соответственно, европейские и отечественные изоляты) и три переходные минорные (отечественные изоляты) группы Установлено, что европейские и отечественные изоляты вируса образуют два самостоятельных генетических кластера, что подкрепляет имеющиеся литературные данные и сделанный нами ранее вывод об их антигеном различии При этом европейские изоляты вируса отличает более высокий уровень взаимной гомологии М-гена (около 95%) Выявлена географо-генетическая корреляция для групп 2 и 4, представленных изолятами из бывшего СССР
7 Предложенная штаммоспецифическая ПЦР позволяет дифференцировать российские изоляты ЗЛ4, 1 4 и N3, входящие в мажорную генетическую группу 5, от пяти исследованных европейских изолятов и российских изолятов Уд и Р4, относящихся к другим генетическим группам Это создает возможность для быстрого
выявления представителей основной генетической группы вируса ВВК, циркулирующих на территории бывшего СССР
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
4 1 Разработаны и утверждены заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ» «Инструкция по применению тест-системы для идентификации вируса весенней виремии карпа методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот» и «Инструкция по выявлению РНК вируса весенней виремии карпа методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции» и наборы препаратов к ним
4 2 Разработанные тест-системы на основе дот-гибридизации и полимеразной цепной реакции могут быть использованы для идентификации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК и рекомендованы для включения в схему и порядок лабораторных исследований при диагностике болезни
4 3 Предложенные методы штаммоспецифической ПЦР и рестрикционного анализа вариабельного участка N1-N2 гена нуклеопротеина могут быть использованы для тонкой дифференциации и генетического типирования вируса, в том числе без выделения его от рыб Это позволит оперативно отслеживать перемещение вирусных штаммов по территории страны и своевременно принимать необходимые меры профилактики и борьбы с болезнью
5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1 Щелкунов, И С , Щелкунова, Т И Rhabdovirus сагрю у растительноядных рыб (выделение, идентификация, патогенность) // Сборник науч тр / ВНИИПРХ - 1987-Т.50.-СЗ-11.
2 Shchelkunov, I S , Shchelkunova, Т I Rhabdovirus carpio in herbivorous fishes isolation, pathology and comparative susceptibility of fishes // Viruses of Lower Vertebrates / W Ahne, E Kurstak (Eds ) - Berlin, Heidelberg Springer-Verlag, 1989 - P 333-348.
3 Oreshkova, S F , Tikunova, N V , Shchelkunov, I S , llyichev, A.A Detection of spring viraemia of carp virus isolates by hybridization with biotinylated DNA-probes // Vet Res -1995 - Vol 26 -P 533-537
4 Орешкова, С Ф , Тикунова, Н В , Щелкунов, И С , Щелкунова, Т И , Ильичев, А А Обнаружение вируса весенней виремии карпа гибридизацией с нерадиоактивными ДНК-зондами // Мол генетика, микробиол , вирусол - 1996, №2 - С 22-25
5 Oreshkova, S F , Shchelkunov, I S , Tikunova, N V , Shchelkunova, TI, Puzyrev, A T , llyichev, A A Detection of spring viraemia of саф virus isolates by hybridization with nonradioactive probes and amplification with PCR // Virus Res -1999 - Vol 63 - P 3-10
6 Oreshkova, S F , Shchelkunov, I S , Nikolenko, G N , Tikunova, N V, Shchelkunova,
T I, Zherakovskaya E V , llyichev, A A Detection and characterization of spring viraemia of carp virus isolates using PCR technique // Diseases of Fish and Shellfish Asbstract book of the 10th Int Conference of the EAFP, Dublin, Ireland, 9-14 Sept 2001 - Dublin, 2001 - P-173
7 Щелкунов, И С , Щелкунова, Т И , Купинская, О А , Орешкова, С Ф , Тикунова, Н В , Ильичев, А А Гибридизационная тест-система для экспресс-диагностики весенней виремии карпа // Избранные труды ВНИИПРХ - М , 2002 - Кн 1 -Т 2 - С 471-473
8 Einer-Jensen, К , Bjorklund, Н , Oreshkova, S F , Shchetkunov, I S , Vesely, T , Lorenzen, N Detection and typing of fish viruses//Bull Eur Ass Fish Pathol - 2002-Vol 22, N2 -P 158-165
9 Oreshkova, S F , Shchelkunov, I S , Voronova, О S , Popova, A G , Nikolenko, G N , Shchelkunova, T I , llyichev, A A Diagnosis and specific prevention of spring viraemia of carp // Aquatic & Marine Animal Health Second USA-Russia Bilateral Conference, Shepherdstown, West Virginia, 21-28 Sept 2003 - Shepherdstown, 2003 - P 19
10 Pichugina, T D , Borisova, M N , Shchelkunova, T I, Shchelkunov, I S , Zavialova, E A First report on spring viraemia of carp virus at a fish farm in Moscow province, Russia // Aquatic & Marine Animal Health Second USA-Russia Bilateral Conference, Shepherdstown, West Virginia, 21-28 Sept 2003 - Shepherdstown, 2003 - P 20
11 Пичугина, T Д , Борисова, M H , Завьялова, E A , Щелкунов, И С , Щелкунова, Т И Весенняя виремия карпов // Ветеринария - 2004 - № 5 - С 28-30
12 Щелкунов, И С , Орешкова, С Ф., Попова, А Г .Щелкунова, Т И , Блинова, Н Н , Ильичев, А А Выявление вируса весенней виремии карпа в материалах от рыб путем выделения на культуре клеток и методом ПЦР // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов' материалы Междунар научно- практич конф , поев 35-летию института, Щелково, 26-27 мая 2005 - Щелково 2005 - С 243247
13 Shchelkunov, IS, Oreshkova, SF, Popova, AG, Nikolenko, G.N, Shchelkunova, Tl, llyichev, A A Development of PCR-based techniques for routine detection and grouping of spring viremia of carp virus // Health and Diseases of Aquatic Organisms. Bilateral Perspectives / R С Cipriano, I S Shchelkunov, M Faisal (Eds) - East Lansing, Michigan Michigan State University, 2005 - P 260-284
Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ, г Покров, Владимирской обл Тираж - 75 экз.
»23735
РНБ Русский фонд
2006-4 24966
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щелкунов, Игорь Степанович
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Аквакультура: состояние и перспективы развития.
2.2. Общая характеристика возбудителя болезни. ф 2.2.1. География распространения болезни.
2.2.2. Эпизоотическая обстановка по болезни в России.
2.2.3. Клинические признаки и патолого-анатомические изменения.
2.2.4. Строение вириона
2.2.5 Антигенные свойства вируса.
2.3. Диагностика болезни.
2.3.1. Идентификация возбудителя серологическими методами.
2.3.2. Идентификация рабдовирусов рыб на основе анализа генома.
2.4. Филогенетический анализ генома рабдовирусов рыб.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома"
Весенняя виремия карпа (ВВК) — остропротекающая высоко контагиозная вирусная болезнь карпа, Cyprinus carpio L., характеризующаяся развитием септического процесса и массовой гибелью рыб. Заболевание проявляется в виде экссудативно-геморрагического синдрома («краснуха»), обусловленного размножением вируса в эндотелии кровеносных капилляров и почках, что приводит к нарушению водно-минерального баланса и выходу плазмы и форменных элементов крови в окружающие ткани и полости тела [ 66, 145 ]. По классификации Международного эпизоотического бюро (МЭБ) ВВК относится к категории особо опасных («декларируемых») болезней рыб [ 113 ].
В аквакультуре вспышки заболевания у карпа обычно происходят весной, спустя 2-3 недели после пересадки рыб из зимовальных в нагульные пруды. Они провоцируются техногенными стрессами и сопровождаются массовой гибелью рыб (преимущественно годовиков и двухлетков, реже -двухгодовиков и производителей), достигающей 30-40, а иногда и 70% [ 69 ]. При совместном выращивании в поликультуре с карпом возбудитель заболевания выделяли также от белого амура, белого и пестрого толстолобиков, золотого карася, европейского сома и щуки.
Болезнь широко распространена в европейских странах с развитым карповодством, с 2002 г. регистрируется в США [ 73 ], а в 2004 г. была выявлена в Китае [ 101 ]. В последние годы наблюдается тенденция к глобализации ВВК. Основным путем распространения болезни являются межхозяйственные перевозки живой рыбы, в т.ч. декоративных карповых рыб [113].
В бывшем СССР возбудитель ВВК был впервые выделен от больных рыб Н.И. Рудиковым (1972). Позднее было установлено, что ВВК широко распространена в рыбоводных хозяйствах центральной и южной зон Европейской части страны (в т.ч. в Белгородской, Курской, Липецкой, Ростовской областях и Краснодарском крае России, а также в Украине,
Молдове, Беларуси, Литве и Грузии), где она вызывала гибель до 30-57% карпа - основного объекта выращивания в отечественной аквакультуре [ 19 ]. В 1993-1995 и 2004 г.г. ВВК отмечали в рыбоводных хозяйствах Свердловской и Тверской областей, а с 2003 г. болезнь регистрируется в Московской области [ 11 ] . В современных условиях существует реальная опасность дальнейшего распространения ВВК по стране, что создает угрозу больших материально-экономических потерь в будущем, когда отечественное рыбоводство вновь заработает в полную силу.
В настоящее время диагноз на ВВК в России ставят на основании выполнения комплекса классических требований, включающих анализ эпизоотологических данных, клинических признаков заболевания и патолого-анатомических изменений, подкрепленный результатами вирусологических исследований по выделению и серологической идентификации вируса с последующей постановкой биопробы. Однако, оставаясь «золотым стандартом», традиционные вирусологические методы уже не в полной мере отвечают требованиям сегодняшнего дня. Хотя диагностика ВВК за последние годы была значительно усовершенствована, сегодня она остро нуждается в новых более быстрых, чувствительных и специфичных методах индикации и идентификации возбудителя. Коммерческие наборы реагентов для быстрого выявления вируса с помощью поликлональных и моноклональных антител производят фирмы в Чехии, Германии и Бельгии, однако эти наборы недостаточно специфичны. Разрабатываемые за рубежом молекулярно-генетические методы диагностики ВВК (зондовой антирибонуклеазной защиты, полугнездовой и гнездовой полимеразной цепной реакции, гибридизации in situ и обратной гибридизации) [ 25, 55, 94, 101, 124 ], обладая набором важных достоинств, имеют ряд недостатков, ограничивающих их использование на практике. Среди них такие как необходимость использования культур клеток рыб, радиоактивных изотопов и другие.
Выполненные в последние годы научные разработки отечественных и зарубежных авторов показали, что использование для диагностики ВВК избирательной амплификация участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), дополняя серологические методы, значительно расширяет возможности обнаружения вируса непосредственно в клинических образцах.
Одним из перспективных направлений является применение метода ^ ПЦР с последующим рестрикционным анализом и секвенированием продуктов ПЦР. Сопоставление первичных структур аналогичных участков генома различных изолятов позволяет провести дифференциацию штаммов и изолятов вируса ВВК. Преимуществом этих методов является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота и безопасность. Поэтому изучение генома возбудителя с целью совершенствования имеющихся и разработки новых более эффективных средств диагностики и профилактики данного заболевания является актуальной научной проблемой.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка тест-систем для идентификации возбудителя весенней виремии карпа на основе методов анализа генома.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
- сконструировать ДНК-зонды, комплементарные различным участкам £ генома вируса ВВК, и оптимизировать условия проведения гибридизации;
- определить специфичность и чувствительность метода молекулярной гибридизации для идентификации РНК вируса весенней виремии карпа на панели вирусных изолятов;
- подобрать специфичные праймеры для амплификации различных участков генома вируса весенней виремии карпа и оптимизировать условия проведения ПЦР;
- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации РНК вируса весенней виремии карпа в зараженной культуре клеток и клиническом материале от экспериментально зараженных и естественно больных рыб;
- провести дифференциацию различных штаммов и полевых изолятов вируса ВВК на основе анализа первичной последовательности гена нуютеопротеина и рестрикционного анализа ПЦР-продуктов.
Ф Научная новизна:
- впервые клонированы последовательности генома отечественного референсного штамма 3JI4 вируса ВВК и получены фаговые ДНК-зонды, пригодные для выявления РНК вируса ВВК в зараженной культуре клеток и патматериале от больных рыб методом дот-гибридизации;
- определены праймеры и отработаны условия постановки ПЦР, позволяющие идентифицировать вирус ВВК в зараженной культуре клеток и клиническом материале от рыб;
- впервые определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена нуютеопротеина 7 европейских и 12 отечественных изолятов вируса ВВК с целью установления их генетического родства;
- при дифференциации изолятов вируса ВВК разного географического происхождения методом рестрикционного анализа продуктов ПЦР установлена высокая однородность нуклеотидных последовательностей генома европейских изолятов, отличающая их от изолятов, выделенных в ф бывшем СССР;
- на основе анализа вариабельной части гена вирусного нуклеопротеина разработана штаммоспецифическая ПЦР, позволяющая быстро выявлять представителей отечественной мажорной геногруппы вируса
Практическая значимость. На основании полученных экспериментальных данных разработаны инструкции по применению методов молекулярной гибридизации и ПЦР для выявления РНК вируса весенней виремии карпа, которые прошли комиссионные испытания, одобрены Ученым советом и утверждены заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ».
Разработанные методы и наборы препаратов рекомендованы для включения в схему лабораторных исследований при диагностике болезни.
Предложен способ дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа ПЦР-продукта и штаммоспецифической ПЦР.
Основные положения, выносимые на защиту:
- наборы препаратов для выявления РНК вируса ВВК на основе методов молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных различным областям вирусного генома;
- способы идентификации полевых изолятов вируса ВВК в зараженной культуре клеток и пробах патологического материала, полученных от экспериментально зараженных рыб, из различных регионов Российской Федерации и зарубежья;
- методы дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК с помощью ПЦР и рестрикционного анализа.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГУП «ВНИИПРХ» и совместных заседаниях Научно-консультативного совета Межведомственной ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1999 - 2005 г.г.), Научно-практической конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре» (21-22 ноября 2000 г., г. Москва), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб» (16-18 июля 2003 г., пос. Борок Ярославской обл.); Второй международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (25-27 мая 2004, МГУ, г. Москва); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (26-27 мая 2005 г., г. Щелково Московской обл.); Всероссийской научно-практической конференции-семинаре «Эпизоотологический мониторинг в аквакультуре: состояние и перспективы» (13-14 сентября 2005 г., г. Москва); Четвертом Международном симпозиуме по вирусам низших позвоночных (12-15 мая 1998 г., г. Веймут, Великобритания); Первом и Втором российско-американском симпозиумах по охране здоровья рыб и других гидробионтов (12-19 июля 1998 г., п. Рыбное Московской обл. и 21-28 сентября 2003 г., г. Шефердстаун, США); Девятой и Десятой международных конференциях Европейской ассоциации ихтиопатологов (19-24 сентября 1999 г., Родос, Греция и 9-14 сентября 2001 г., г. Дублин, Ирландия); Семинаре референтных лабораторий Евросоюза по диагностике болезней карповых рыб (2-4 июня 2003 г., г. Веймут, Великобритания) и 30-ой Восточной конференции по охране здоровья рыб (13-17 июня 2005 г., г. Шефердстаун, США).
Публикация результатов. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Участие соискателя в получении научных результатов.
Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Конструирование плазмидных и фаговых ДНК-зондов, синтез нерадиоактивной метки, подбор и синтез олигонуклеотидов, отработку метода ПЦР и рестрикционного анализа продуктов амплификации проводили совместно с к.х.н. Орешковой С.Ф.
В выполнении отдельных разделов работы оказали помощь: старший научный сотрудник Т.И. Щелкунова, кандидат биологических наук Тикунова Н.В. и доктор биологических наук Ильичев А.А., которым автор выражает искреннюю признательность.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Щелкунов, Игорь Степанович
6. ВЫВОДЫ
6.1. Путем клонирования в однонитевой фаговый вектор М13шр8 фрагментов размером 248 н.о. М-гена вируса ВВК (позиции 134 - 381) и 405 н.о. N-гена (позиции 979 - 1383) получены и помечены биотином два ДНК-зонда: зонд M13-SVCV-M8 (на геномную РНК вируса) и зонд M13-SVCV-N8 (на вирусную мРНК). Оптимальные результаты выявления РНК вируса ВВК при использовании обоих зондов были достигнуты после 16-часовой гибридизации при температуре 65°С в гибридизационном растворе, состоящем из 6xSSC, 5xDenhardt, 0,5% SDS, 0,05 мг/мл денатурированной ДНК лосося и ДНК-зонда в концентрации 100 нг/мл.
6.2. Оба зонда согласованно работали на панели вирусных изолятов и клиническом материале от рыб. Методом дот-гибридизации зонды специфически выявляли РНК 19-и испытанных штаммов вируса ВВК и не реагировали с образцами нуклеиновых кислот других вирусов, контрольных культур клеток и тканей здоровых рыб. ДНК-зонды выявляли вирус ВВК с г с1 титром не ниже 10 ТЦД50 в пятне (примерно 10 ТЦД5о/см ).
6.3. В результате анализа первичных последовательностей генома вируса весенней виремии карпа подобран набор из 8 специфичных праймеров для амплификации различных участков гена вирусного нуклеопротеина (N-гена) и оптимизированы условия проведения ПЦР-анализа.
6.4. Использование в первом раунде ПЦР праймеров N3 и N5 (отжиг при 60°С, продукт 418 п.н.) и во втором раунде праймеров N3 и N4 (отжиг при 62°С, продукт 388 п.н.) позволяло в обоих раундах специфически выявлять РНК всех 10-и испытанных изолятов вируса ВВК. Специфичность получаемых продуктов была подтверждена их гидролизом эндонуклеазой рестрикции Rsal на фрагменты ожидаемого размера. Образования аналогичных продуктов с образцами нуклеиновых кислот других вирусов, контрольных культур клеток и тканей здоровых рыб не наблюдали.
6.5. Чувствительность выявления вируса ВВК методом ПЦР в зараженной культуре клеток составила 1064 ТЦДзо/мл в первом раунде и достигала 10"0'9 ТЦД50/мл. во втором. Чувствительность выявления вируса в клинических материалах от больных рыб варьировала в зависимости от вида л материала и достигала 10 ТЦД5о/см . По частоте выявления вируса у рыб со скрытым и хроническим течением ВВК-инфекции метод полугнездовой ПЦР в 12 и более раз превосходил традиционный метод выделения вируса на культуре клеток (соответственно 100% и 8,3%), тогда как при тестировании клинических образцов от рыб с острой формой ВВК уступал ему примерно в 2 раза.
6.6. Предложен метод генетического типирования вируса ВВК с помощью рестрикционного анализа с использованием набора из 6 эндонуклеаз рестрикции (Rsal, Clal, BsoMAI, Tru9I, Psil и Fokl) фрагмента N1-N2 гена вирусного нуклеопротеина. Метод позволил разделить 24 исследованных штамма вируса ВВК на пять генетических групп: две мажорные (соответственно, европейские и отечественные изоляты) и три переходные минорные (отечественные изоляты) группы. Установлено, что европейские и отечественные изоляты вируса образуют два самостоятельных генетических кластера, что подкрепляет имеющиеся литературные данные и сделанный нами ранее вывод об их антигеном различии. При этом европейские изоляты вируса отличает более высокий уровень взаимной гомологии N-гена (около 95%). Выявлена географо-генетическая корреляция для групп 2 и 4, представленных изолятами из бывшего СССР.
6.7. Предложенная штаммоспецифическая ПЦР позволяет дифференцировать российские изоляты 3JI4, 1.4 и N3, входящие в мажорную генетическую группу 5, от пяти исследованных европейских изолятов и российских изолятов Уд и Р4, относящихся к другим генетическим группам. Это создает возможность для быстрого выявления представителей основной генетической группы вируса ВВК, циркулирующих на территории бывшего СССР.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7.1. Разработаны и утверждены заместителем генерального директора ФГУП «ВНИИПРХ» «Инструкция по применению тест-системы для идентификации вируса весенней виремии карпа методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот» и «Инструкция по выявлению РНК вируса весенней виремии карпа методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции» и наборы препаратов к ним.
7.2. Разработанные тест-системы на основе дот-гибридизации и полимеразной цепной реакции могут быть использованы для идентификации штаммов и полевых изолятов вируса ВВК и рекомендованы для включения в схему и порядок лабораторных исследований при диагностике болезни.
7.3. Предложенные методы штаммоспецифической ПЦР и рестрикционного анализа вариабельного участка N1-N2 гена нуклеопротеина могут быть использованы для тонкой дифференциации и генетического типирования вируса, в том числе без выделения его от рыб. Это позволит оперативно отслеживать перемещение вирусных штаммов по территории страны и своевременно принимать необходимые меры профилактики и борьбы с болезнью.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щелкунов, Игорь Степанович, Покров
1. Гончаров, Г.Д. Серологическая диагностика, как новое доказательство вирусной природы "краснухи" карповых / Г.Д. Гончаров // Рыбное хозяйство. -1949.- №4.- С. 45-47.
2. Гончаров, Г.Д. Вирусная краснуха рыб в СССР и за рубежом / Г.Д. Гончаров // Совещ. по болез. рыб. 22-27 марта 1957. Тез. докл. М., Л., 1957.-С. 28.
3. Грищенко, Л.И. Патоморфологические изменения при естественном течении весенней вирусной болезни карпов / Л.И. Грищенко // II Всесоюз. симпоз./ Новые методы леч. инф. бол. рыб. Тез. докл. М., 1975.-С. 26-27.
4. Литвиненко, В.В. Выявление антител против Rhabdovirus carpio в сыворотке крови рыб при помощи люминесцентной микроскопии / В.В. Литвиненко, Ю.Д. Тимниханов // Рыбное хозяйство. 1989. -Вып. 43.-С. 62-64.
5. Надточей, Г.А. Морфология возбудителя весенней вирусной болезни рыб / Г.А. Надточей, Н.И. Рудаков // Бюллетень ВИЭВ. М., 1975.- Вып. 20.- С. 20-21.
6. Осадчая, Е.Ф. Выделение цитопатогенных агентов от карпов при острой форме краснухи / Е.Ф.Осадчая // Ветеринария.- 1964.- №9.- С. 29.
7. Осадчая, Е.Ф. Рабдовирусы, выделенные от больных краснухой карпов, и некоторые их свойства / Е.Ф.Осадчая // Рыбное хозяйство. -1977.-№5.- С. 36-39.
8. Осадчая, Е.Ф. Патогенность вирусов, выделенных при краснухе (весенней виремии) карпов, и клинико-морфологическая характеристика естественного течения болезни и в эксперименте / Е.Ф.Осадчая, А.П. Руденко // Рыбное хозяйство.- 1981,- Вып. 32.- С. 66-70.
9. Осадчая, Е.Ф. Выделение рабдовирусов при хроническом течении краснухи карпов / Е.Ф.Осадчая, В.В. Литвиненко, Ю.Д. Тимниханов // Тез. докл. Республ. научн.-практ. конф. Киев, 1982. - С. 63-64.
10. Пичугина, Т. Д. Сравнительное изучение изолятов возбудителя весенней вирусной болезни рыб в реакции нейтрализации / Т. Д. Пичугина // Труды ВИЭВ / Проблемы ветеринарной иммунологии.-М., 1983.-С. 141-143.
11. Пичугина, Т. Д. Весенняя виремия карпов / Т. Д. Пичугина, М. Н. Борисова, Е. А. Завьялова, И. С. Щелкунов, Т. И. Щелкунова // Ветеринария. 2004.- №5.- С. 28-30.
12. Рудаков, Н.И. Выделение вируса от карпа / Н.И. Рудаков // I Всес. симп. по инфекц. болезням рыб / Профилактика, лечение и диагностика инфекционных болезней рыб. Тез. докл. М., 1972.- С. 62-65.
13. Рудаков, Н.И. Весенняя вирусная болезнь рыб / Н.И. Рудаков // Ветеринария. 1975.- №6.- С. 64-66.
14. Рудаков, Н.И. Диагностика весенней вирусной болезни рыб / Н.И. Рудаков // II Всесоюз. симпоз./ Новые методы леч. инф. бол. рыб. Тез. докл. М., 1975.-С. 93-95.
15. Рудаков, Н.И. Свойства возбудителя весенней вирусной болезни / Н.И. Рудаков, Т.Д. Пичугина, М.К. Анисимов // II Всесоюз. симпоз./ Новые методы леч. инф. бол. рыб. Тез. докл. М., 1975 С. 96-97.
16. Рудаков, Н.И. Особенности течения вспышек весенней вирусной болезни в зависимости от погодных условий / Н.И. Рудаков, Т.Д. Пичугина // Тез. докл. V Всес. симп. по инфекц. болезням рыб. М., 1986. - С. 86-87.
17. Факгорович, К.А. Гистологические изменения в печени, почках, коже и головном мозгу больных краснухой рыб / К.А. Факгорович // Известия ГосНИИОРХ. JT., 1969.-Т. 69.-С. 83-102.
18. Щелкунов, И.С. О выделении вируса от белого толстолобика с синдромом краснухи / И.С. Щелкунов, JI.H. Юхименко, И.Д. Тромбицкий, Т.И. Щелкунова, А.П.Манчу // Экспресс-информ. ЦНИИТЭИРХ. 1984. - Вып. 4. - С. 3-7.
19. Щелкунов, И. С., Необычный случай осеннего выделения Rhabdovirus carpio от карпа/ Щелкунов И.С., Т.И. Щелкунова // Тез. докл. IX Всес. сов. по паразитам и болезням рыб. Д., 1990. -С. 149-150.
20. Ahne, W. A rhabdovirus isolated from grass carp (Cteno-pharyngodon idella Val) / W. Ahne //Archives of Virology.- 1975.-Vol. 48-P. 181-185.
21. Ahne, W. Fruhlingsviramie der Karpfen. Atiologie,Vorkom-men und Bekampfung. Tagungsbericht des Seminars der DVG/ W. Ahne // Diagnose und Behandlungen von Fischkrankheiten, Munchen- 1978. -112 S.
22. Ahne, W. Untersuchungen uber die akute Form der infekti-osen Bauchwassersucht bei Cypriniden (Cyprinus carpio, Cte-nophaiyngodon idella) /W. Ahne //Munchen.-1979.-Vol. 19.-P. 1-112.
23. Ahne, W. Egtved virus: occurrence of strains not clearly identifiable by means of virus neutralization tests / W. Ahne, P.E.V. Jorgensen, NJ. Olesen, W. Schafer, P. Steinhagen// J. Appl. Ichthyol. -1986. Vol. 2. - P. 187-189.
24. Ahne, W. A ribonuclease protection assay can distinguish spring viraemia of carp virus from pike fry rhabdovirus / W. Ahne , G. Kurath, J.R. Winton // Eur. Ass. Fish Pathol.- 1998. -Vol.18.- P. 220224.
25. Ahne, W. Spring viraemia of carp / W. Ahne, H.V. Bjorklund, S. Essbauer, N. Fijan, G. Kurath, J.R. Winton //Dis. Aquat. Org.- 2002. -Vol. 52. -P. 261-272.
26. Alonso, M. Nested PCR improves detection of infectious hematopoietic necrosis virus in cells coinfected with infectiouspancreatic necrosis virus / M. Alonso, S. Rodriguez, S.I.J. Perez-Prieto // Virol. Methods. 1999. P. 1-9.
27. Ariel, E. Assessment of a commercial kit collection for diagnosis of the fish viruses: IHNV, 1PNV, SVCV and VHSV. / E. Ariel, N. J. Oleson // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. -2001.Vol 21. -P. 6-11.
28. Basurco, B. Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus / B. Basurco, P. Vende, A.F. Monnier, J.R.Winton, P.de Kinkelin, A. Benmansour // Vet. Res. -1995. -Vol. 26.- P. 460-463.
29. Bearzotti, M. The glycoprotein of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV): antigenicity and role in virulence / M. Bearzotti, A.F. Monnier, P. Vcnde, J. Grosclaude, P. de Kinkelin, A. Benmansour // Vet. Ded.- 1995. -Vol. 26.-P. 413-422.
30. Bernard, J. Nucleocapsid gene sequence of a North American isolate of viral haemorrhagic septicaemia virus, a fish rhabdovirus / J. Bernard, M. Bremont, J. Winton//J Gen. Viral.- 1992.- Vol. 73.- P. 1011-1014.
31. Bernard, J. Cloning and sequencing the messenger RNA of the N gene of viral haemorrhagic septicaemia virus / J. Bernard, F. Lecocq-Xhonneux, M. Rossius, M.E. Thiry, P. de Kinkelin, J.// Gen. Virol.-I990.-Vol. 71.-P. 1669-1674.
32. Betts, A.M. Nucleotide sequence analysis of the entire coding regions of virulent and avirulent strains of viral haemorrhagic septicaemia virus
33. A.M. Betts, D.M. Stone // Virus Genes.- 2000.-Vol. 20.- P. 259-262.
34. Bjorklund, H.V. Comparison of the polymerases (L genes) of spring viraemia of carp virus and infectious hematopoietic necrosis virus / H.V. Bjorklund, E.J. Emmenegger, G. Kurath // Virus Res.- 1995.-Vol. 26.- P. 394-398.
35. Bjorklund, H. Diagnostic methods and reference panel of reagents for detection and typing of fish viruses / H. Bjorklund, N. Lorenzen, T. Vesely, I. Shchelkunov, S. Oreshkova // Consolidated Report 19992001.
36. Bovo, G. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / G. Bovo, G. Giorgetti, P.E.V. Jorgensen, N.J. Olesen // Anal. Biochem. -1987. -Vol. 162.- P. 156-159.
37. Bruchhof, B. Differential diagnosis offish pathogenic rhabdoviruses by reverse transcriptase-dependent polymerase chain reaction / B. Bruchhof, O. Marquardt, P.J. J. Enzmann // Viral. Methods.- 1995.-Vol.55.-P. 111-119.
38. Chiou, P.P. Polymerase chain amplification of infectious hematopoietic necrosis virus RNA extracted from fixed and embedded fish tissue / P.P. Chiou, B.S. Drolet, J.C. Leong // J. Aqual. Anim. -1995.-Vol.7.- P. 9-15.
39. Chomczynski, P. Single method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 162. - P. 156-159.
40. Clerx J. Comparative protein analysis of nonsalmonid fish rhabdoviruses / J. Clerx, M. J. Horzinek// Gen. Virology.-1978. -Vol. 40.- P. 287-295.
41. Dixon, P.P. Rapid detection of fish rhabdoviruses by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / P.P Dixon, B.J. Hill // Aquaculture.- 1984.- Vol. 42.- P. 1-12.
42. Einer-Jensen, K. Evolution of the fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus / K. Einer-Jensen, P. Ahrens, R. Forsberg, N. Lorenzen // J. Gen. Virol.- 2004. Vol. 85.- P. 1167-1179.
43. Einer-Jensen, K. Detection and typing of fish viruses / K. Einer-Jensen, H. Bjorklund, S. Oreshkova, I. Shchelkunov, T. Vesely, N. Lorenzen / Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.- 2002. -Vol. 22. -P. 158-165.
44. Emmenegger, E.J. Genetic diversity and epidemiology of theinfectious hematopoietic necrosis vims in Alaska / E.J. Emmenegger,
45. T.R. Meyers, Т.О. Burton, G. Kurath // Ris Aquat. Org.- 2000. -Vol.40.-P. 163-176.
46. Emmenegger, E.J. Genetic characterization of infectious hematopoietic necrosis virus of coastal salmonids stocks in Washington state/ E.J. Emmenegger, G.Kurath//J. Aquat. Anim. Health.-2002.-Vol.14.- P.25-34.
47. Estepa, A. Detection of trout haemorrhagic septicaemia rhabdovirus by capture with monoclonal antibodies and amplification with PCR / A. Estepa, C.D., De Bias, F. Ponz, J.M. Coil // Vet. Res.- 1995.-Vol.26.1. P. 530- 532.
48. Fellmann, F. Simplified protocol of solid-phase cDNA libraries for multiple PCR amplification / F. Fellmann, J-L. Pretet, D. Fellmann // Biotechniques.- 1996.- Vol. 21.- P. 766-770.
49. Fichtner, D. Characterisation of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) virus isolates / D. Fichtner, S. Bergmann, P. Enzmann, F. Weiland, H.
50. Г Granzow // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol.- 1998.- Vol.18. P. 56-61.
51. Fijan, N. Isolation of the viral causative agent from the acute form of infectious dropsy of carp/ N. Fijan, Z. Petrinic, D. Sulimanovic, L.O. Zwillenberg// Vet. Arh- 1971.-Vol.-P. 125-138.
52. Fijan, N. Isolation of Rhabdovirus carpio from sheatfish, Silurus glanis, fry / N. Fijan, Z. Matasin, Z.s. Jeney, J. Olah, L.O. Zwillenberg // Proc. Int. Seminar "Fish, Pathogens and Environment in European Polyculture".- 1981.- P. 48-58.
53. Garver, K.A. Two distinct Phylogenetic clades of infectious hematopoietic necrosis overlap within the Columbia river basin / K.A Garver, R.M. Troyer, G. Kurath // Dis. Aquat. Org. 2003. - Vol. 55. -P. 187-203.
54. Goncharov G.D. Rubella, a viral fish disease / G.D. Goncharov // Ann. of the N.Y. Acad, of Sci. / 1965. Vol. 126. - P. 521-523.
55. Goodwin, A.E. First report of spring viraemia of carp virus (SVCV) in North America / Goodwin A.E. //J. Aquat. Anim Health. 2002 - Vol. 14. - P. 161164.
56. Gravell, M. A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas) / M. Gravell, R. Malsberger, N.Y. Ann // Acad. Sci.- 1965. -Vol. 126.-P. 555-565.
57. Gupta, K.C. 5X terminal sequences of spring viraemia of carp virus RNA synthesized in vitro / K.C.Gupta, D.H.L. Bishop, P.Roy // J. Virol. -1979.-Vol. 30. -P. 735-745.
58. Hattenberger-Baudouy, A.M. Serum neutralization test for epidemiological studies of salmonid rhabdoviruses in France / A.M. Hattenberger-Baudouy, M. Danton, G. Merle, P. de Kinkelin // Vet. Res.- 1995.-Vol. 26.-P. 512-520.
59. Hedrick, R.P. Host and geographic range extensions of the North American strain of viral hemorrhagic septicemia virus / R.P. Hedrick, W.N. Batts, S. Yun, G.S. Traxler, J. Kaufman, J.R. Winton // Dis. Aquat. Org.- 2003. Vol. 55. -P. 211-220.
60. Hill, B. Procedures for the isolation and identification of IPN, VHS, IHN and SVC viruses from diseased fish / B. Hill // Fisheries research technical report, Lowestoft. -1976-Vol.- 27.:P. 1-16.
61. Hoffmann, B. Determination of the complete genomic sequence and analysis of the gene products of the virus of spring viremia of carp, a fish rhabdovirus/ B. Hoffmann, H.Schutz, T.Mettenleiter// Virus Res. -2002.- Vol. 84.-P. 89-100.
62. Holland, J. Rapid evolution of RNA genomes/ J. Holland, K. Spindler, F. Horodyski, E. Grabau, S. Nichol, S.VandePol // Science.- 1982.- Vol. 215.-P. 1577-1585.
63. Hsu, Y.L. A comparison of detection methods for infectious hematopoietic necrosis virus / Y.L. Hsu, J.C. Leong // J. Fish Dis.-1985.- Vol. 8.-P. 1-12.
64. Huang, C. Characterization of the infectious hematopoietic necrosis virus glycoprotein using neutralizing monoclonal antibodies / C. Huang, M.S. Chien, M. Landolt, J. Winton, // Dis. Aqual. Org.- 1994.-Vol. 18. P. 29-35.
65. Huang, С. Mapping the neutralizing epitopes on the glycoprotein of * infectious haematopoietic necrosis virus, a fish rhabdovirus / C. Huang,
66. M.S. Chien, M. Landolt, W. Batts, J. Winton // J. Gen. Virol.- 1996.-Vol. 77.- P. 3033-3040.
67. Ke, L.D. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards / L.D. Ke, Z. Chen, W.K. Yung // Mol. Cell. Probes.- 2000. -Vol.14. P. 127-135.
68. Kim C.H. Neutralization resistant variants of infectious hematopoietic necrosis virus have altered virulence and tissue tropism/ C.H. Kim, J.R Winton, J.C.Leong//J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 8447-8453.
69. Kim, S.J. Detection of fish virus by using immunomagnetic separation and polymerase chain reaction (IMS-PCR) / S.J. Kim, H.K. Oh, T-J. Choi //J. Korean Fish. Soc.- 1997.- Vol.30.-P. 948-955.
70. Kiuchi, A. Comparison of the primary sequence of spring viraemia of carp virus M protein with that of vesicular stomatitis virus / A. Kiuchi, P. Roy// Virology.- 1984. -Vol.134. -P. 238-243.
71. Kocan, R. North American strain of viral hemorrhagic septicemia virus is highly pathogenic for laboratory-reared Pacific herring / R. Kocan, M. Bradley, N. Elder, T. Meyers, W. Bans, J. Winton // J. Aquat. Anim. 1997.Vol.9.-P. 279-290.
72. Koutna, M. Identification of spring viraemia of carp virus (SVCV) by combined RT-PCR and nested PCR / M. Koutna, T. Vesely, I. Psikal, J. Hulova // Dis. Aquat. Org. 2003. -Vol.55.- P. 229-235.
73. Kurath, G. The NV genes of fish rabdoviruses: development of RNase protection assays for rapid assessment of genetic variation / G. Kurath, K.H. Higman, H.V. Bjorklund // Vet. Res.- 1995. Vol.26.- P. 477485.
74. Kurath, G. Phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus in North America / G. Kurath, R.M. Troyer, E.J. Emmenegger, K. Einer-Jensen, E.D. Anderson//J. Gen.Virol.-2003.- Vol.84.- P.803-814.
75. Lannan, C.N. Fish cell lines: establishment and characterization of nine cell lines from salmonids/ C.N. Lannan, J.R. Winton, J.L. Fryer // In vitro. 1984.- Vol. 20. - P. 671-676.
76. Lannan, C.N. Fish cell culture: A protocol for quality control / C.N. Lannan//J. Tiss. Cull. Methods.- 1994.- Vol.16.- P.95-98.
77. Leong, J. Strains of infectious hematopoietic necrosis (1HN) virus may be identified by structural protein differences / J. Leong, Y.L. Hsu, H.M. Engelking, D. Mulcahym // Dev. Biol. Stand.- 1981.-Vol.49.-P. 43-55.
78. Leong, J.C. Molecular biological tools to detect fish pathogens / J.C. Leong // J. Fish Biol.- 1995.- Vol.47.-P. 61-75.
79. Liu, C.T.-Y. Detectionof spring viraemia of carp virus (SVCV) in fish tissues by semi-nested RT-PCR/ C.T.-Y. Liu, N.T. Schmidt, D.M. Stone// The Forth Intern. Symp. on Viruses of Lower Vertebrates. Book of Abstracts.- Weymouth, UK, 1998.- PP-05.
80. Lorenzen. N. Affinity purification of the structural proteins of a fish rhabdovirus by the use of monoclonal antibodies / N. Lorenzen // J. Virol. Methods.- 1992.-Vol. 38.-P. 297-303.
81. McAllister, P.E. Identification of the three serotypes of viral hemorrhagic septicemia virus by immunoblot assay using antiserum to serotype F1 / P.E. McAllister, W.J. Owens // Bull. Eur. Ass. Fish Palhol.- 1987.-Vol. 7.- P. 90-92.
82. McAllister, P.E. Immunoblot assay: A rapid and sensitive method for identification of salmonid viruses / P.E. McAllister, W.B. Schill // J. Wildl. Dis.- 1986.-Vol.22. -P. 468-74.
83. McCain, B.B. Antigenic relationships in a group of three viruses of salrnonid fish by cross neutralization / B.B. McCain, J.L. Fryer, K.S. Pilcher // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1971.-Vol. 137.-P. 1042-1046.
84. Morzunov, S.P. The complete genome structure and phylogenetic relationship of infectious hematopoietic necrosis virus/ S.P. Morzunov, J.R. Winton, S.T. Nichol // Vir. Res.- 1995.-Vol. 38.-P. 175-192.
85. Oshima, K.H. The genetic diversity and epizootiology of infectious hematopoietic necrosis virus / K.H. Oshima, K.H. Higman, C.K. Arakawa et.al. // Vir. Res.- 1995.-Vol. 35.-P. 123-141.
86. Roy, P. Characterization of spring viraemia of carp virus mRNA species and the 3' sequence of the viral RNA / P. Roy, K.C. Gupta, A. Kiuchi // Virus Res.- 1984.- Vol.l.-P. 189-202.
87. Sanger, F. DNA sequencing with the chain-terminating inhibitors/ F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson// Pros. Natl. Acad. Sci. USA.- 1977.1. Vol. 75.- P. 5453-5467.
88. Sanz, F. A. Techniques for diagnosing viral diseases of salmonid fish / F. A. Sanz, J. M. Coil // Dis. Aquat. Org.- 1992.-Vol. 13.-P. 211-223.
89. Sanz, F. Monoclonal antibodies against the structural proteins of viral haemorrhagic septicaemia virus isolates / F. Sanz, B. Basurco, M. Babin // J. Fish Dis.- 1993.-Vol. 16.-P. 53-63.
90. Shutze, H. Complete genomic sequence of viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus / H. Shutze, E. Mundt, T.C. Mettenleiter//Virus Genes.- 1999.-Vol. 19. -P. 59-65.
91. Snow, M. Analysis of the nucleoprotein gene identifies distinct lineages of viral haemorrhagic septicaemia virus within the European marine environment/ M. Snow, C.O. Gunningham, W.T. Melvin, G. Kurath // Vims Res.- 1999.-Vol. 63.-P. 35-44.
92. Steinhauer, D.A. Rapid evolution of RNA viruses/ D.A. Steinhauer, J.J. Holland// Ann. Rev. Microbiol. 1987. - Vol. 41. - P. 409-433.
93. Strommen, H.K. Detection of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) virus in fish tissues by semi-nested polymerase chain reaction (PCR) / H.K. Strommen, D.M. Stone // Methodology in Fish Disease Res.-1998.- P.203-209.
94. Takano, R. Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from wild Japanese flounder, Paralichthys olivaceus/ R. Takano, T. Nishizawa, M. Arimoto, K. Muroga // Bull. Eur, Ass. Fish Pathoi.-2000.-Vol. 20. P. 186-192.
95. Thiery, R. Phylogenetic analysis of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) isolates from France (1971-1999)/ R.Thiery, C. de
96. Boisseson, J. Jeffroy, J. Castric, P. de Kinkelin, A. Benmansour// Dis. Aquat. Org. 2002. - Vol. 52.- P. 29-37.
97. Troyer, R.M. Genetic analyses reveal unusually high diversity of infectious hematopoietic necrosis virus in rainbow trout aquaculture/ R.M. Troyer, S.E. La Patra, G. Kurath // J. Gen. Virol.- 2000.-Vol.81.-P.2823-2832.
98. Troyer, R.M. Molecular epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus reveals complex virus traffic and evolution within southern Idaho aquaculture / R.M. Troyer, G. Kurath// Dis. Aquat. Org. -2003. Vol. 55.- P. 175-185.
99. Vestergaard Jorgensen, P.E. Egtved virus: antigenic variation in 76 isolates examined in neutralization tests and by mean of fluorescent antibody technique / P.E. Vestergaard Jorgensen // Diseases of Fish. Academic Press.- 1972.- P. 333-339.
100. Williams, K. Multiplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection of three fish viruses/ K. Williams, S. Blake, A. Sweeney, J.T. Singer, B.L. Nicholson//J. din. Microbiol. 1999. -Vol. 37.-P. 4139-4141.
101. Winton, J.R. Neutralizing monoclonal antibodies recognize antigenic variants among isolates of infectious hematopoietic necrosis virus/ J.R. Winton, C.K.Arakawa, C.N. Lannan, J.L. Fryer // Dis. Aquut. Org.-1988.-Vol.4.-P. 199-204.
102. Winton, J.R. Evolution of fish rhabdoviruses/ J.R. Winton//In: Proceedings of the OJI International Symposium on Salmonid Diseases.
103. Hokkaido University Press.- Sapporo, Japan, 1992,- P. 88-95.
104. Wolf, K. Fish Viruses and Fish Viral Diseases/ K. Wolf// Cornell University Press, Ithaca,-NY, 1988. 476 p.
105. Yoshinaka, T. Detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) using RT-PCR combined with tissue culture / T. Yoshinaka, Y. Hori, A. Motonishi, K. Kasai // Bull. Nail. Salmon Res. Cent.- 1998.-Vol.l.- P. 29-34.
106. Yoshinaka, T. Detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) by using polymerase chain reaction (PCR) combined with the most probable number (MPN) method / T. Yoshinaka, M. Yoshimizu, Y. Ezura//Aquat. Anim. 1999.-Vol. 11.-P. 154-157.
107. Yoshinaka, T. Detection and identification of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) by reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR) / T. Yoshinaka, M. Yoshimizu, T. Sawabe, Y. Ezura // Fish.Sci.- 1997.-Vol. 63.- P. 592-595.it
-
Щелкунов, Игорь Степанович
-
кандидата биологических наук
-
Покров, 2005
-
ВАК 03.00.06
- Изучение генетического разнообразия рабдовирусов низших позвоночных и разработка методов их диагностики с помощью полимеразной цепной реакции и гибридизации нуклеиновых кислот
- Идентификация возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб методом полимеразной цепной реакции
- Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса
- Разработка рекомбинантных вакцин-кандидатов против весенней виремии карпа и исследование их иммуногенных и протективных свойств
- Разработка тест-систем для идентификации вируса миксомы кроликов на основе анализа генома
