Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии композиционных магноиммуносорбентов и конструирование на их основе диагностических тест-систем для иммуноанализа возбудителей чумы и туляремии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии композиционных магноиммуносорбентов и конструирование на их основе диагностических тест-систем для иммуноанализа возбудителей чумы и туляремии"

На правах рукописи

ЖАРНИКОВЛ ИРИНА ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ КОМПОЗИЦИОННЫХ МАГНОИММУНОСОРБЕНТОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИММУНОАНАЛИЗА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 1995

Работа выполнена в Ставропольской научно-исследовательском противочумном институте

{

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Брыкалов Анатолий Валерьевич, ^ кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Тшенцева Ирина Степановна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Чижова Лод-ыила Николаевна

Ведунья организация - Научно- производственное объединение "Аллерген", г.Ставрополь.

Защита состоится "гЗ'* Ш 1995 г. в часов на заседании диссертационного Совета К 120.53.06. Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии по адресу: 355017, Ставрополь, пер.Зоотехнический, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного ^ ^ Совета, доцент

В.А.Погодаев

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Основные направления современной биотехнологии предусматривают препаративное выделение высокоочищенных биопрепаратов, а также получение высокоэффективных, специфических тест-систем для диагностики особо опасных инфекций, что является актуальной проблемой для медицины и ветеринарии, позволяющей расширить возможности эпиднадзора.

В настоящее время применяют различные методы иммуноанализа: радиоиммунологический анализ (РИА), реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и иммуноферментный анализ (ИФА). Данные методы имеют некоторые недостатки, что приводит к поиску новых подходов их совершенствования. В этой связи определенный интерес представляет возможность повышения чувствительности, , специфичности и достоверности иммуноферментной и иммунофлуоресцентной диагностики особо опасных инфекций с использованием иммуносорбентов.

Среди иммуносорбционных методов известны способы избирательного концентрирования микроорганизмов с помощь» твердых носителей с магнитными свойствами, получивших название магноимму-носорбентоз. В результате использования этих сорбентов упрощается проведение анализа и ускоряются манипуляции на всех этапах исследования. Однако известные магносорбенты на основе полиакри-ламидных гелей обладают рядом недостатков: сложность, длительность технологии получения, использование дорогостоящих и токсических веществ.

В настоящее время перспективно направление получения композиционных сорбентов на основе модифицированных кремнеземов, характеризующихся комплексом положительных свойств неорганических и органических матриц, исключающих их отрицательные характеристики (неспецифическую сорбцию, подверженность микробиологической атаке, нестандартность состава).

Преимущества иммуносорбентов в большей степени проявляются при конструировании и использовании диагностических тест-систем, что открывает широкие, перспективы для решения практических задач диагностики чумной и туляремийной инфекции.

Цель работы. Получение новых биотехнологических композиционных магноиммуносорбентов и конструирование на их основе диагностических тест-систем для методов иммуноанализа микроорганизмов чумы и туляремии.

Задачи:

- на основе направленного синтеза органокремиез емных сорбентов - создание прочных матриц, легко поддающихся модифицирование, обладавших минимальной неспецифической сорбцией, оптимальным составом и структурными характеристиками;

- разработка методов новалентной иммобилизации лиганда (1еС чумы и туляремии) при минимальном изменении его структуры и биологической активности, повышение стабильности полученных композиционных магноиммуносорбентов (КМИС);

- получение чумных,туляремийных КМИС и оптимизация параметров при постановке количественной РИФ;

- оптимизация параметров при постановке ИФА с использованием чумных, туляремийных КМИС;

- конструирование диагностических тест-систем для экспресс-диагностики возбудителей чумы и туляремии.

Настоящие исследования по созданию тест-систем на основе КМИС выполнены для диагностики возбудителей чумы и туляремии, однако перспективны для разработки методов твердофазного иммуноанализа других инфекций.

Научная новизна.

Впервые проведены исследования по разработке композиционных магносорбентов методом формирования пористой структуры кремне-земноорганической матрицы в присутствии полимеров, обладающих ¡:ысокой адсорбционной активностью и стандартностью структурных характеристик.

Разработана технология получения КМИС, включающая ковалент-ную иммобилиг_цн> специфических иммуноглобулинов с емкостью 65-70 мг/г носителя. Повышение специфичности, чувствительности ¡5-,'ЯС чумных и туляремийных определяется стандартностью структурных характеристик, способом иммобилизации лиганда.

Препараты КМИС стабилизированы методом лиофилиэации без потери специфической активности и чувствительности в течение 1 го-

да (срок наблюдения).

На основе КМИС сконструированы тест-системы диагностические для экспресс-диагностики возбудителей чумы и туляремии в им-муноферментнон аналиае с чувствительностью 1х102 мк/мл по корпускулярным антигенам и 0,1-1,0 нг/мл по водорастворимым антигенам, что превышает чувствительность ИФА с применением полистироловых планшет более, чем в 1000 рае. Время постановки ИФА по равработолному способу сокращается в 7 рае. Лиофиливироваинке препараты КШС стабильны без потери активности в течение 12 месяцев (срок наблюдения), тогда как хранение сенсибилизированных полистироловых планшет ограничено 4-7 сутками.

Сконструированы тест-системы диагностические магносорбент-ные для экопресс-диагностики возбудителей чумы и туляремии в твердофазной реакции иммунофлуоресценции (РИФ) с чувствительностью,' в 1000 раз превышающей общепринятые методы РИФ и, в 100 раэ чувствительность МИС чумных на основе полиакриламидной матрицы.

Практическая ценность.

На основе новых биотехнслогических композиционных магноим-муносорбентов сконструированы тест-системы диагностические для экспресс-диагностики воэбудитёлей чумы и туляремии в имиунофлуо-ресцентном и иммуноферментнсм анализах, на которые составлена нормативно-техническая документация (регламент производства, временная фармакопейная статья к шструкцкя по пршокёшш), одобренная Ученым Советом Ставропольского НИПЧИ и утвержденная директором института (протокол N7 от 16.06.1995).

Оформлены методические рекомендации "Использование магноим-муносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологически!, *иммуноферментный, иммунофдуорес-центный)", одобренные Ученым Советом Ставропольского НИПЧИ и утвержденные директором института (протокол N10 от 23.12.1994.)

Сконструированные тест-системы магноиммуносорбентные успешно апробированы в лабораторных и полевых условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях (Ставропольский НИПЧИ, 1994, 1995),

на научных конференциях (Ставропольская государственная сельскохозяйственная академия, 1994, 1995) и ва 1-й конференции Северо-Кавказского региона по биотехнологии (Академия технологических наук ГО, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, получено одно авторское свидетельство на изобретение .

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, 2 глав обвора литературы, 3 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 138 работ отечественных и 62 работы зарубежных авторов. Работа изложена на 149 страницах машинописи, иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материалов были использованы обеззараженные культуры возбудителей У.реэиз (3 штамма), Рг.Шагегшз (8 штаммов) и по 15 типичных гетерологичных штаммов. Для иммунизации использовали 50 кроликов породы "Шиншилла".

Исследования проведены в Ставропольском НИПЧИ. В процессе выполнения работы использовались специальные стандартные методики. Активность антигенов, сывороток, иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони, в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Очистку иммунопераксидаано-го и иммунофлуоресцентного коныогатов проводили хроматогрзфичес-жы методом на приборе ШВ-2137. Контроль иммунопероксидазного коиыогата проводили неконкурентным методом двойного анти?ельного "сэндвича". Контроль имыунофлуоресцирукщих препаратов осуществляли в реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Микроструктуру композиционных магносорбентов исследовали по методу Д. Фрзйфелдера (1.880) на электронном мифоскопе 1М2-Т3000. Удельную поверхность ^орбентов определяли по методу А.А.Клячко-Гурвича (1961), радиус объем пор - в соответствии с методикой, изложенной в работе О.В.Ворошиловой, А.В.Киселева (1980). Обработка результатов эксперимента осуществлялась на основе общепринятых математических годик ва персональном компьютере ЭВМ А 386.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Одним из направлений, способствующих повышению экспресснос-■ги и чувствительности метода количественного твердофазного имму-

нохимического анализа микроорганизмов и биологически активных веществ, является оптимизация состава и структуры твердого носителя'. Для решения этой, проблемы нами впервые разработана технология получения биотехкологических композиционных магносорбентов (KMC). Получение стандартных по составу и строенио композиционных магносорбентов осуществлено путем формирования пористой ^структуры кремнеземноорганичесного сорбента в присутствии полимеров и лигандов.

8 качестве структурных единиц, формирующих остов кремнеземного сорбента, использован непористый кремнезем ааросид A-SSO (пирогенная форма двуокиси кремния о удельной поверхностью 380 мг/г) и окись железа (Feg03). В качестве органических компонентов синтеза использован подисахаридный полимер-декстран, а "также j -аминопропилтриэтонсисилан (АГМ-9). Схема получения композиционных органокремнеэемных магноиммунооорбентов включает 8 стадий и приведена ниже. Стадии технологии 1-5 характеризует ч процесс получения композиционного магносорбента, а стадии 6-8 N отражают зав'ертаадий процесс технологии получег-- г^ятозициояных .магноиммунооорбентов (этапы иммобилизации лиганда, стабилизации -КМИС).

Механизм образования пористого кремнийорганического магно-сорбента в присутствии полимера декстрана и других органических соединений можно представить, как сложный процесс, сопровождающийся формированием корпускулярной структуры кремнеземного скелета из непористых частиц азросила и включение в данный остов полимера (декстрана) за счет многоточечной адсорбции на катионо-обменных центрах поверхности кремнеземного носителя.

Для.оптимизации структурных характеристик композиционных магносорбентов проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (деистран, FegOa), а также изучение влияния времени гелеобразования и pH среды на величину удельной поверхности сорбентов, объем и размер пор.

При увеличении количества декстрана в 1,5-2 раза при синтезе декотранокошгазиционного магносорбента (ДКМС) наблюдается ■ ешкьяие . величины удельной поверхности на 10-15 X и .увеличение суммарного объема пор. Установленная закономерность может быть

- а -Схема

получения композиционных магноиммуносорбентов

Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3: Стадия 4, Стадия 5, стадия 6.

Стадия 7

Стадия 8

Получение гидрогеля из аэросила А-380 и компонентов синтеза (Рефз, декотран и др.) Созревание и синереэис композиционного гидрогеля_

Термообработка гидрогеля и образование ксерогеля _

объяснена влиянием природы интермицеллярной жидкости на формирование структуры гидрогеля. Наиболее крупнопористые сорбенты получаются при частичной замене воды раствором поверхностно активного вещества, в данном случае декстрана. В результате исследований установлено, что увеличение количества РегОз не

приводит к резкому изменению структурных характеристик, удельной поверхности, сорбционному объему пор. Некоторое увеличение размера радиуса пор, уменьшение удельной поверхности композиционных сорбентов, вероятно, обусловлено стабилизирующим действием окиси железа, проявляющимся в противодействии процессу, связанному с укрупнением корпускулярных частиц в структуре композиционного сорбентз.

Исследовано влияние продолжительности времени гелеобразова-ния на структурные характеристики органокремнеэемных композиционных магносорбентов. Установлено,что оптимальным значением времени гелеобразования при синтезе сорбентов является 1-Е часа, так как при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магнс-сорбента, уменьшается рззмер его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда при ковалентном связывании в порах сорбента, стерическим препятствиям образования специфического комплекса антиген-антитело.

В результате проведенных исследований и применения метода математического планирования эксперимента оптимизирована технология получения магносорбентов со стандартными структурными характеристиками. Сановными факторами оптимизации выбраны такие, как удельная поверхность и размеры пор твердофазных адсорбционных материалов. Для одновременного изучения воздействия нескольких факторов на процесс направленного регулирования структурных характеристик сорбентов проведена серия экспериментальных исследований по методу Уилсона-Бокса (Дилер, Макарова, 1976). На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения декстранокремнеземных магносорбентов (ДКМС): соотношение компонентов синтеза 1:2:5, соответственно РегОз, декстран, азросил А-380; время гелеобразования 1 час, значение рН гелеобразования 7,0. Данные сорбенты имеют удельную поверхность 66 м2/г, объем пор 1,24 см3/г и размер пор 38 нм.

На сканирующем электронном микроскопе 1М2-Т3000 исследовали микроструктуру поверхности ДКМС по методу, описанному в работе (Фрайфелдер,1980). Топография поверхности ДКМС представлена в виде обширных участков сплошной непористой массы с губчатой структурой. Дополнительный компонент синтеза ДКМС- магнитный по-

рошок способствует срастанию глобул в участки сплошной непористой массы аа счет дегидратационных процессов о участием сида-нольных групп -^Si-QH.

Для получения композиционных магноиммуносорбентов, содержащих аминопропильные группы (АМКМС), нами разработана технология на основе формирования пористой структуры'Матрицы кремнезема в присутствии кремнвйорганического соединения J -аминопропилтри-этоксисилан (АГМ-9), которая включает 8 стадии, представленных выше. Исследование удельной поверхности показало, что данные магносорбенты имеют Syg-83 ifi/г, объем пор-1,23 сь^/г, радиус пор 30 нм. В соответствии с методикой, изложенной в работе О.И.Ворошиловой, A.B. Киселева (1980), определена концентрация аминогрупп, значение которой равно 0,54 мг-экв/г.

Композиционные магносорбенты ДКМС и АМКМС использованы далее для химического модифицирования активными группами, применяемыми для ковалентной иммобилизации лигандов.

. Для химического активирования данных композиционных магно-сорбентов нами разработаны три варианта методов модифицирования . твердофазных носителей: окислением, бензохиноном, глутаровым альдегидом.

При активировании твердофазного носителя методом окисления образуются альдегидные группы, концентрация которых составила 0,68 мг-экв/г.

, В результате активирования KMC бензохиноновым методом образуются активные центры сорбента , способные к ковалентному связыванию с остатками таких аминокислот как гистидин, тирозин, цистеин, лизин, которые входят в состав белкового лиганда.

Исследован третий вариант получения активных центров сорбента- синтез композиционного альдегидосорбента. Для химического превращения аминогрупп, находящихся в поверхностном слое АМКМС в альдегидные, сорбенты обрабатывали глутаровым альдегидом. Данный способ основан на способности аминогрупп образовывать с карбонильными соединениями азометиновые связи.

Применение глутарового альдегида для активирования амино-пропилсодержащего композиционного магносорбента осуществлено для сравнительной оценки с разработанным методом получения

альдегидосодержащих твердых сорбционных материалов на основе окисления декотраноаэросилогеля (ДКМС). Процесс активирования носителя глутаровым альдегидом длительный, осуществляется в течение 18-20 часов.

Разработанный синтез альдегидосодержащих композиционных магносорбентов методом окисления ДКМС отличается простотой и технологичностью, активирование носителя осуществляется в течение 1 часа. Содержание альдегидных групп на единицу поверхности носителя обеспечивает высокую концентрацию иммобилизованного ли-гаяда. Представлена схема получения КМИС на альдегидодекстрано-азросилогеле.

S102

(Ре203)

NaClO* SiOg

-ОН

(Ре20з)

-С^ + H2N-AT

Si02

Н

-н2о

(Ре203)

-CH-N-AT

Ковалентное связывание чумных и туляремилных иммуноглобулинов о твердой матрицей осуществляется через альдегидную группу с образованием азометиновой связи.

Для оптимизации условий иммобилизации специфического имму-ноглоб» тина на поверхности носителя (КМС) исследовали ряд параметров: концентрацию белка при иммобилизации, время и температуру инкубации, влияние рН раствора иммуноглобулинов на иммобилизацию.

В результате исследований установлено, что оптимальными факторами, способствующими получению КМИС с высокими значениями специфической активности и специфичности являются: время иммобилизации 1 час при значении рН растворов иммуноглобулинов 6-7 и температуры в интервале 4-22 °С.

При определении практической ценности каждого конкретного препарата важным является длительное сохранение его основных свойств. В результате исследований установлено, что срок хранения жидких КМИС чумных и туляремийных ограничен, т.е. не более 6 месяцев. Разработан способ стабилизации КМИС методом лнофилиза-ции и оптимизированы его параметры. Препараты высушивали в лио-фильной установке ТГ-5, предварительно устанавливая температуру

конденсатора минус 40 °С, в камере высушивания минус 20° С, рабочее давление в камере-30 Па. Через 6-8 часов включали подогрев и досушивали препарат до 25 °С, выдерживая при этой температуре 2-3 часа, что позволило достичь величину остаточной влажности препарата 2-4 X.

После лиофилиаации активность КМИС чумных, туляремийных исследовали в реакции количественной иммунофлуоресцекции в зависимости от температуры хранения препаратов. Установлено, что после лиофилизации препараты стабильны без потери активности в течение 12 месяцев (срок наблюдения).

На основе разработанных КМИС сконструированы ди&гностикумы магноиымуносорбентные для иммунсанализа чумы и туляремии в РИФ и ИФА. Оптимизированы параметры постановки знализов. Сх>" ма постановки модифицированного "сэндвич" варианта ИФА включает 5 стадий.

Схема

постановки модифицированного варианта ИФА

Стадия 1.

Стадия 2.

Стадия 3.

Стадия 4.

Стадия 5.

Иммобилизация им, луноглобулинсз с КМС

Адсорбцю антигенов

Адсорбция имму! КО! гапероксидазного гыогата

Выявление актив! специфического гасти после фермент-зубстрата

Количественный учет ферментативной реакции

иммуноглобулинов с твердым носителем ис-

пользованы полученные нами пористые композиционные ыагносорбен-ты, которые по сравнению с непористыми матрицами имеют большую величину сорбционной емкости, позволяют регулировать процесс заполнения поверхности молекулами специфических антител sa счет молекулярного ситового эффекта, тем самым стандартизируется про-ц-" .-с сенсибилизации твердой фазы, что повышает чувствительность метода. В качестве антигенного материала использовали обеззараженные культуры Y.pestis и Fr.tular&nsis. Контроль специфичности проводили с типичными гетерологичными штаммами.

Другим важным фактором, оказывающим влияние на чувствительность ИФА, яздзлетоя качество иммуноферментного конъюгата. Для получения конъягатов чумных, туляремийных с пероксидазой хрена нами использован метод перйодатного окисления P.K.Nakane и А.Ка-waoi (1974). Получены иммунопероксидазные кониогзты чумные и ту-ляремийные с рабочим титром 1:200-1:400.

Учет результатов ИФА проводили визуально и с помощью анализатора колориметрического иммуноферментного АКИ-Ц-01 при длине вслны 405 нм.

Чувствительность исследуемых серий Y.pestis и Fr.tularsnsis в иммуноферментнок .анализе с использованием КШС чумных, туляремийных яа основе аяьдегидодекптраноиммуносорбентов со-^авила 1x10й м.к./мл по корпускулярным антигенам и 0,1-1,0 нг.'мл но водорастворимым ->:.глгенам (рис.1-. Исследуемые препараты Скан спе-ц;тфичиь т.е. при учете результатов ИФА показания оптичэомй iuothoctr опытны:-- гранул (с гомологичными мифоорганигмамк^ е 1,5 раза превышал/, показания контрольных (с гетерологичными микроорганизмами) .

Носители '-га основе композиционных альдегкдодекстраноимму-носорбентов по чувствительности и специфичности в методах РИФ и ИФА превосходили носители, полученные глутарзльдегидным методом.

Для получения сравнительной характеристики предложенного нами модифицированного ИФА с другими методами постановки данного анализа в зависимости от твердой фазы, была проведена постановка ИФА с теми же компонентами, только в качестве твегдс:": фа?а использовали полистироловы1? плэнше'-'к. В результате исследований определена чувствительность ИФА. Она составила 2х105-8х105 мк/мл

- u -

по корпускулярным антигенам чумы и туляремии и 10-20 нг/мл по водорастворимым антигенам чумы и туляремии соответственно, время постановки ^ИФА с учетом сенсибилизации планшета составляет 21

J.

час (табл. Е 405 нм 1,5

1.8

0,9 , 0,6

Рис.1.

10 102 103 104 10® 106 107 10е 109 Се мк/мл Кинетика адсорбции корпускулярных антигенов чумы и туляремии на КМИС. 1-антиген возбудителя чумы,2-антиген возбудителя туляремии ; пунктирные линии -контроль сорбции гетерологичных штаммов на КМИС; 3-адсорбция чумного антигена на сенсибилизированных полистироловых планшетах.

Сравнительная характеристика зуемой твердой фазы

Таблица 1. ИФА в зависимости от исполь-

Тест-сисI Твердая I Метод сенIАнтителаIСрок хра-1Чувстви- IВремя тема ИФА1 фаза Iсибилиза-1для твер!нения сен I тельность Iпоста , для обна! 1ции 1дой <Ьааы1сибидизи-1 1новки

руления! I I (рованной 1нг/мл1мк/мл1 ИФА,

возбуди-I I I (твердой -| 1 1 час.

телеи I I I 1фазы I I I

чумы ПС-планшет Адсорбция Поликло-нальные 4 сут. 10 2x10® 21

*ПС-планшет Адсорбция монокло-нальные 7 сут. 50 3x10е 21

KMC Ковалент-ная иммо- пилиаятшя Поликло-нальные 12 мес. 0,1 lxlO2 3

туляремии ПС-планшет Адсорбция Поликло-нальные 4 сут. 20 8х105 21

KMC Ковалент-ная иммобилизация Поликло-нальные 12 мес. 1 lxlO2 3

* Данные взяты из инструкции до применению тест-системы диагностической чумной иммуноферментной моноклональной Средне-Азиатского НИПЧИ

Из таблицы следует, что использо-^г'" в качестве твердой фазы разработанных КМС в ИФА по сравнению с полистироловыми планшетами имеет ряд преимуществ, связанных о повышением чувствительности метода в 1000 рая по корпускулярным антигенам, время проведения ИФА сокращается в 7 раз. Лиофилиэированные препараты КМИС стабильны в течение 12 месяцев (срок наблюдения) тогда как хранение сенсибилизированных иумуноглобулинами полистироловых планшетов ограничено 4-7 сутками.

Другим наиболее перспективным ся. лпбом вг-,г™эккя микроорганизмов является реакция иммунофлуорее- - н^т . Схема постановки модифицированного варианта -1 пг вменением КМС включает 4 стадии.

Схема

постановки модифицированного варианта РИФ

Иммобилизация иммуноглобулинов с КМС

Взаимодействие КМИС с антигеном

Взаимодействие с иммуноглобулинами флуоресцирующими

Количественный учет реакции в л*»..

неси нтнс; микроскопе

При постановке реакции иммунофлуоресценции в качестве КМС и антигенов использовали материалы, аналогичные при постановке ИФА. Иммуноглобулины флуооБШхирующие чумные и туляремийные получены нами с рабочим разве, заием в РИФ 1:16-1:32, концентрацией белка 10 мг/мл, молярным отношением краситель/белок-3-4. В качестве прибора, регистрирующего флуоресценцию, использовали люминесцентный микроскоп Люмам ИУФ-3 с микрофлуоресцирущей приставкой СШЛ-1.

Стадия 1.

Стадия 2. Стадия 3.

Стадия 4.

Результаты наших исследовании показали, что интенсивность свечения гранул КМИС зависит от разведения йШуНиГЛибуЛкков флуоресцирующих чумных, туляремияных; времени инкубации гранул КМИС с исследуемым материалом и флуоресцирующими иммуноглобулинами. В результате устачсЕлег:, что 10 мин инкубации КМИС с исследуемым материалом и флуоресцирующими иммуноглобулинами чумными, туляре-реммйными в их рабочем разведении является оптимальным.

Чувствительность КМИС чумных и туляремийных в резкции имму-нофлуоресиениии вс всех опытах была не ниже, чем 1.-102 мк./мл (рис.2), что в 1000 раз превышает чувствительность общепринятого метода иммунофлуоресценцин и в 100 раз превышает чувствительность МИО чумных полиакриламидных.

О 10 Ю2 103 104 105 10б 107 1О0 109 Сб мк/мл Рис.2. Кинетика адсорбции антигенов чумы и туляремии на КМИС. 1-антиген возбудителя чумы; 2-антиген возбудителя туляремии, пунктирные линии - контроль сорбции гетерологичнда штаммов на КМИС; 3 - адсорбция чумного антигена на полиакриламидной матрице Установлено, что при контроле специфичности с гетерологич-нымл микроорганизмами, частицы имели слабую интенсивность свечения (2-6 усл.ед), аналогично контролю без антигена, а гомологичные штаммы давали яркое свечение порядка 12-25 усл.ед, что свидетельствует о специфичности полученных препаратов.

При исследовании влияния температуры на постановку реакции яммунофлусресценцш установлено, что интенсивность свечения КМИС чумных и туляремийных при увеличении температуры до 37 °С не увеличивается, и критерии достоверности не изменяется по сравне-

- 17 -

нига с данными, полученными при температуре (22+4) °С.

При исследовании влияния рН растворов на постановку РИ® установлено, что значения рН от 5 до 9,5 не оказывают отрицательного воздействия на качество готового препарата, тогда как в кислой среде критерий достоверности реакции имеет значение менее 2, что является отрицательным результатом.

На основе композиционных магнаиммуносорбентов нами сконструированы тест-системы диагностические для обнаружения возбудителей чумы и туляремии (по 50 экспериментально-производственных серий). Сконструированы тест-системы двух комплектов: для ИФА и РКФ. Все препараты в лиофилизированном виде. Каждый комплект рассчитан для проведения 20-30 анализов. Схема проведения иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализов с использованием композиционных магноиммуносорбентов представлена на рис.3. На вше описанные тест-системы диагностические составлена нормативно-техническая документация (регламент производства, временная фармакопейная статья и инструкция по применению). Тест-системы диагностические магносорбентные для ИФА и РИФ испытаны как в лабораторных, так и в полевых условиях. В частности, апробация указанных препаратов прошла на учебно-тренировочных занятиях в полевых условиях специальной противоэпидемической бригады (СПЭБ) Ставропольского НИПЧИ с участием посредника (сотрудника краевого ■ тзба ГО Министерства РФ по делам гражданской обороны, чреэвы-• ..иным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий) в --гоне 1994 г. Задачей СПЭБ являлась индикация возбудителей особо '/.ласних инфекций в трех зашифрованных пробах (смывы из внешней среды). Общепринятые методы экспресс-диагностики (реакция прямой гемагглотинации (РПГА) и РИФ) дали отрицательные результаты на первом этапе исследования нативного материала в связи с низкой концетрацией инфекта в пробах (ниже чувствительности методов). Результаты исследований с использованием КМИС показали достоверные дачные. Дальнейший ход исследований серологическими, люми-несценгпс-серологическими и бактериологическими методами подтвердили полученные результаты. Таким образом, результаты полевых испытаний показали высокую специфичность и способность избирательного концентрирования композиционных магноиммуносорбентов.

Рис.3.

Схема проведения шмунофлусресцектного, ге.аг/асферментного анализов с использованием композиционны;-; магноиммунооорбентов

мис

^ По 0.2 мл

Суспензия исследуемого материале <от 3 до 30 мл). Эксповиния 1 час, й <22+41=

1Со«ратьГкмЙС~магнит-1 Промыть в 3,9 У. 1 мой палочкой в стек-(растэоре МаС1 С1ЛЯММОМ чехле 1(5-7 раз)

Учет реакции на л»м.микро- 1 Отмыть 5-7 раз IЭкспозиция (Учет реакш-и на анализа- (Экспозиция!Отмыть (Экспо-скопе с »отометрической (в 0,9 7, раство-110-10 мин, (торе АКИ - Ц 11-5 мим 13-5 раз(зиция '

насадкой |ре ИаС1 II (22+4)" С1 I (в ФСБ-Т139 мим

- 19 -ВЫВОДЫ

1. Впервые проведены исследования по разработке композиционных ыагнооорбентов методом формирования пористой структуры крем-неэемноорганической матрицы в присутствии полимеров, обладающих высокой адсорбционной активностью и стандартностью структурных характеристик - удельная поверхность 66 м2/г, объем пор 1,24 см3/.' и размер пор 38 км. Пористая структура носителя оптимальна для образования иммунохимического комплекса антиген-антитело, исключает внутридиффузионное торможение при проведении твердофазных реакций ИФА и РИФ.

2. Оптимизация структурных характеристик, адсорбционной активности и специфичности композиционных ыагнооорбентов достигнута варьированием соотношения компонентов синтеза, способам новзг лентной иммобилизации лиганда. Микроструктура KMC по данным электронной микроскопии "представлена сочетанием поверхностных участков аморфной массы о губчатой структурой. Исследованы закономерности активирования KMC методами окисления, гдутаральдегид-ным и бензохиноновым.

3. Композиционные магносорбенты механически прочны, химически стабильны в условиях активирования органическими функциональными группами и присоединения лигандов, устойчивы к действию микроорганизмов, не набухают в различных растворителях и обладают г.осокой проницаемостью для элюатов. Наличие магнитного порошка в составе KMC обеспечивает упрощение манипуляций с сорбентами.

4. При получении композиционных магноиммуносорбентов на основе ДКМС методом окисления установлено, что оптимальной концентрацией иммуноглобулинов чумных и туляремийных является 1,6 мг/мл при времени иммобилизации лигандов 60 мин, значениях рН раствора иммуноглобулинов 6-7 и температуры в интервале 4-22 °С. Факторы оптимизации синтеза КМИС в совокупности со стандартными структурными характеристиками способствовали повышению адсорбционной активности матриц и чувствительности методов РИФ и ИФА.

5. Разработана технология стабилизации композиционных магноиммуносорбентов методом лиофилизации препаратов в режиме: тем-

- so -

пература конденсатора минус 40 °С', рабочее давление в камере 30 Па, максимальная температура высушивания препарата 25 °С. Лиофи-лиаированные КМИС стабильны в течение 1 года (срок наблюдения) без потери адсорС ционной активности и чувствительности.

6. Впервые на основе КМИС сконструированы тест-системы диагностические ыагноиммуносорбентные для • экспресс-диагностики возбудителей чумы и туляремии в ИФА. Установлено, что факторами повышения чувствительности метода является пористая твердая фаза, качество иммуноферментного конъюгата, температурный режим анализа. Использование КМИС в ИФА по сравнению с полистироловыми планшетами имеет преимущества, связанные с повышением чувствительности метода в 1000 раз по корпускулярным антигенам. Еремя постановки ИФА по разработанному способу сокращается в 7 раз. Лиофилизированные препараты КМИС стабильны в течение 1 годз (срок наблюдения) тогда как хранение сенсибилизированных иммуноглобулинами полистироловых планшет ограничен 4-7 сутками.

7. Сконструированы тест-системы диагностические для экспресс-диагностики чумы и туляремии для твердофазного анализа в методе РИФ. Применение композиционных магноиммуносорбентов в данном методе повышает чувствительность в 1000 раз по сравнению с общепринятым методом иммунофлуоресценции и в 100 раз чувствительности МИС чумных на основе полиакриламидной матрицы.

8. Сконструированные тест-системы диагностические ыагнаиы-муносорбентные успешно апробированы в лабораторных и полевых условиях. Составлена нормативно-техническая документация (регламент производства, временная фармакопейная статья и инструкция по применению), которая одобрена на Ученом Совете Ставропольского НИПЧИ и утверждена директором института (протокол N 7 от 16.06.1995).

9. Оформлены методические рекомендации "Использование магноиммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологических, иммуноферментных, иммунофлуорес-центных)", ' которые одобрены на Ученом Совете Ставропольского НИПЧИ и утверждены директором института (протокол N 10 от 23.12.1994).

- 21 -

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А.С. 1425910 ДСП Россия, МПК А61 KS9/02 ДСП. Способ получения туляремийного антигена.' Н.Ф.Василенко, И.В.Кронгауэ, О.Н.Лспаткин и др. (Россия); Ставрополь. Научно-исследовательский противочумный институт - 409176S; Заявлено "* 86; Опубл.

. 05.38 " Изобретение. -1988.

?.. Индикация возбудителей ОСИ с помощью композиционных мзг-нснммукссорбентов 'И.С.Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, И.Б.Жарникова и др. /.■ Актуальные Еспросы профилактики чумы и других : Секционных заболеваний: Мэтер. межгос. нзуч.-практ. конф., посвящ.100-летию сткркткя возбудятеля чумы.- Ставрополь, 1994. - С.89-90.

2. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью композиционных магноикмуносорбентов / И.С.Тюменцева, В.И.Ефремен-ко, E.H. Афанасьев и др.// Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний: Матер, межгос. науч. - практ. кснф., посвящ, iOO-летяю открытия возбудителя чумы.- Ставрополь, 1994. Дег.. в ВИНИТИ 25.01.95 г., N221-B95.

4. Использование композиционных иммунеюорбентов в реакции {^•исфлугре-цекции (РИФ) для экспресс-диагностики возбуди*..лей ОСИ 'И.Е. ларникоьа, A.B. Брыкалов, И.С.Тюменцева // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний: Матер. ме-кгос.науч.-практ. конф., посвященной 100-летию гткрытия возбудителя чумы.- Ставрополь, 1994. - С.40-41.

5. Использование композиционных иммуноссрбенточ / ¡уно-ферыентном анализе (ИФА) для ?.«г.пресо--диагностшм гоабуд^елеч СОИ 'И.В. Жарннкогз, А.З.Брькалог, .С.Ть,л'_-нц£.ггуальные вопросы профилактики чумы и других кяфекционшл зд&а^.'ваяий: Kt тер. межгсс. нзуч. -прач;. .сс»ф., г. ьг.с. i -ыхил возбудителя ЧУМЫ." СТаврОПОЛ' , - К - C.41--I-:

6. Метод получения магнокмкуиосорбеитов ¿ля ^готических тест-систем /A.B. Брыкалов, И.В.Жарикова, К.С.Тк 'нцева г др..'/ Совершенствование учебного процесса и применен/-? •технических средств обучения: Об. тр. 58-й науч.-метедич. ,-сснф. - Ставрополь, 1995. - С.19-20.

Опыт конструирования композиционных магноиммуносорбектов для диагностических теот-систем / И.В.Жарникова, А.В.Брыкалов,

И.С.Тшенцева // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний: Матер, межгос. науч.- практ. конф., посвящ. 100 - детию открытия возбудителя чумы.- Ставрополь, 1994. - С.224-225. в

9. Разработка твердофазной реакции иммунофлуоресценции (РИФ) на основе композиционных магноиммуносорбентов /И.В.Еарни-ксвз, А.В.Брыкалов, И.О.Тюм^нцева и др.// Современные ¿реткжения бжотехнэлогаи: Мятер. Пергой конф. Северо-Кавказского региона. -Ставрополь, 1995. - С.87-88.

9. Сравнительная характеристика результатов иммунофермент-ногс анализа СИФА) в зависимости от твердой фазы / И.В. Жарни-кова, Л.Н.Брыкалов, И.С.Тюменцева и др.// Современные достижения биотехнологии: Матер. Первой конф. Северо-Кавказского региона.-С"ЛВР0П0ЛЬ, 1995. - С.88-99.

10.Стабилизация композиционных магноиммуносорбентов (КМИС) методом лкофилизации/И.В. Жарникова, А.И. Мирошниченко, А.В.Брыкалов др.// Современные достижения биотехнологии: Матер. Пер-во;: конф. Северо-Кавказского региона. - Ставрополь, 1995.- С.89.

в" №3/<У__Поди. » веч.2О,и £лТщ>.Щ»хя.

Роталрюгг ВНИИОК, Ставрополь, оер.Зоотвмиче«яй, 15