Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества"



На правах рукописи

Белов Алексей Алексеевич

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВОЛОКНООБРАЗУЮЩИХ ПОЛИМЕРОВ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

МОСКВА - 2009

003472860

Работа выполнена в отделе биотехнологии ОЛО Научно-исследовательского института текстильных материалов, г. Москва.

Научные консультанты:

доктор химических наук,

Казанская Новелла Федоровна !

доктор технических наук, профессор

Филатов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор

Штильман Михаил Исаакович

доктор биологических наук, профессор

Максименко Александр Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Донова Марина Викторовна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится « 23 » июня 2009 г. в 10 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл., д. 9) в аудитории 443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан « // » «^¿¿¿У 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета * ^//у* У

ДМ 212.204.13 ШакирИ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Полимерные системы с иммобилизованными белками и другими разнообразными биологически активными веществами (БАВ) находят все более широкое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Уникальные свойства ферментов, такие как высокая специфическая активность, непревзойденная субстратная специфичность и другие, предопределили перспективность их практического применения. Несмотря на высокую эффективность использования различных ферментов в медицине и промышленности, следует учитывать их лабильность, антигенные и пирогенные свойства. Нативные ферментные препараты дороги и многие из них дефицитны, они быстро выводятся из организма, либо утилизируются им, что ограничивает их широкое применение. Преодолеть эти недостатки удается иммобилизацией ферментов на различных природных и синтетических носителях. Важной предпосылкой к интенсивному внедрению энзимологии в медицину и фармацевтику явилось решение теоретических и практических вопросов модификации ферментов с приданием им новых свойств, причем именно таких, которые имеют практическое значение для терапии человека. При этом возникает необходимость изучения методов иммобилизации, свойств носителя и его влияния на свойства иммобилизованного биологически активного вещества, а также исследования полученных иммобилизованных препаратов в модельных эксплуатационных условиях.

Известно, что с древнейших времен и до настоящего времени для изготовления медицинских перевязочных средств во всем мире используются материалы из природной целлюлозы. Изделия из целлюлозы обладают прекрасными санитарно-гигиеническими свойствами, но при этом целлюлоза не взаимодействует химически с биологическими субстанциями, она пассивно участвует в процессе очищения раны: всасывает раневое отделяемое, защищает рану от аэрогенной контаминации и сохраняет термальный режим в раневой среде. Модифицированные текстильные материалы, даже не содержащие лекарственные

вещества, взаимодействуют с раневым отделяемым, т.е. принимают участие в активном очищении раны. Наличие же лекарственного препарата в материале способствует заживлению раны. Ферменты, иммобилизованные на перевязочных материалах, активно участвуют в процессе заживления ран, не вызывая побочных эффектов. Необходимо учитывать, что перевязочные материалы - одноразовые средства с небольшим сроком эксплуатации (до 72 часов), поэтому их биологическая активность должна максимально реализоваться при наложении на рану. Введение в очаг поражения лекарственных средств, иммобилизованных на текстильных носителях, не вызывает побочных эффектов и позволяет одновременно решить несколько задач: повысить действенность препарата, снизить его расход, устранить нежелательное воздействие препарата на здоровые органы и ткани.

Работа выполнялась по планам и научно-техническим программам: Мин-легпром СССР (1986-1989 гг.), ГКНТ и Министерства науки и технической политики РФ (1990-1993 гг.), Минпром РФ (1993 г), Миннауки РФ (1997-1998 гг.), Минпромнауки РФ (1999-2002 гг.), Минпромэнерго РФ (2004-2006), АО "Московский комитет по науке и технике" при правительстве г. Москвы (19931994 г., 2000-2002 г.), в рамках ФЦНТП на 1996-2001 и 2002-2006 гг. «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», в рамках государственной научно-технической программы России «Новейшие методы биоинженерии», в рамках исследовательских программ НИИ текстильных материалов (1986-2008 гг.).

Цель и задачи исследования. Цель работы - создание высокоэффективных раневых покрытий нового поколения, создание и разработка промышленной технологии их получения. Кроме того, нами были проведены многоплановые исследования полученных иммобилизованных БАВ на модифицированных текстильных носителях.

В связи с этим решались следующие задачи:

1. Разработка промышленных технологий получения иммобилизованных лекарственных препаратов.

2. Получение иммобилизованных биологически активных препаратов на текстильных носителях, которые сохраняют лечебные свойства, и стерильность после высушивания на протяжении необходимого времени хранения (не менее 3-х лет) в стандартных условиях.

3. Разработка удобных и достоверных методов опенки содержания биологически активных веществ на нерастворимых текстильных носителях и методов определения биологической активности ферментных препаратов, иммобилизованных на этих носителях.

4. Исследование физико-химических свойств полученных препаратов.

5. Выявление связи между потерей протеолитической активности у моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения. Установление максимально допустимого срока, в течение которого сохраняются достаточные лечебные свойства иммобилизованных препаратов.

6. Экспериментальное обоснование возможности эффективного биомедицинского использования иммобилизованных на текстильных носителях лекарственных препаратов.

7. Проведение токсикологических и санитарно-гигиенических испытаний разработанных материалов.

Научная новизна работы. Разработаны лабораторные и промышленные технологии получения текстильных материалов с иммобилизованными биологически активными веществами (протеиназами, ингибиторами и лекарственными препаратами) различного спектра действия.

Впервые получено новое поколение перевязочных средств - текстильных материалов комплексного действия, в состав которых входят хитозан и протео-литический комплекс из гепатопанкреаса краба (Патент RU № 2 323 748 С2).

Разработаны методы оценки содержания различных биологически активных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях и

методы оценки биологической активности иммобилизованных препаратов.

Впервые установлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения в стандартных условиях.

Установлены радиопротекторные свойства диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) высокой степени окисления (более 1,5 мгЭкв/г) и полиамидного текстильного материала в случае гамма-стерилизации.

Впервые проведено токсикологическое изучение текстильных материалов медицинского назначения (ДАЦ-коллитин, ДАЦ-ингибитор, "Мультиферм"). Доказано, что изученные материалы не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксическим эффектом и мутагенной активностью.

Практическая значимость работы. Разработанные технологии получения текстильных материалов медицинского назначения с иммобилизованными БАВ позволяют получить новое поколение перевязочных средств и покрытий для лечения гнойно-некротических ран.

Разработана технология производства полиферментных препаратов (на основе протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и модифицированных текстильных носителей). Для полученных препаратов проведены пред-клинические испытания и разработан необходимый комплект нормативно-технической документации. Получены разрешающие документы на серийный выпуск медицинских изделий.

Организовано серийное производство и промышленный выпуск иммобилизованных форм различных биологически активных веществ на модифицированных текстильных носителях. Осуществляются поставки разработанных изделий в лечебно-профилактические учреждения Миндравсоцразвития РФ и клиники Минобороны РФ.

Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получено более 10 авторских свидетельств СССР и патентов РФ; результаты работы были отмечены дипломами и медалями ВВЦ и других российских и международных выставок.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в формировании направления исследований, разработке экспериментальных и теоретических подходов, проведении исследований и обобщении полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на 3-ей Всес. науч.-техн. конф. "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапев-тических препаратов" (Москва, 1987); Всес. совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988); 5-ои Моск. конф. по органической химии и технологии (Москва, 1989); 1 -пм Всес. Радиобиол. съезде (Москва, 1989); 1-ой Всес. конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" (Москва, 1989); 20-th FEBS Meet. (Budapest, 1990); 2-й Нац. конф. "Биоматериа-ли" (Варна,1990); Всес. конф."Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990); VII Всес. симп. "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); Всес. научной конф. "Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров (Москва, 1991); 1 Рос. нац. конг. "Человек и лекарство", (Москва, 1992); 1, 2, 3~£" Межд.конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов" (Москва, 1992, 1995, 1998); 3, 4, 5, 6"th Int. Cong. on Wounds, Burns and Dressings, (Tel-Aviv, 1994, 1996, 1998, 2000); IV, V, VI симп. "Химия протеоли-тических ферментов" (Москва, 1997, 2002, 2007); Int. conf. BIOCATALYSIS-98, 2000, 2002, 2005, Fundamentals & applications (Puschino on the Oka 1998, Moscow 2000, 2002, St. Petersburg 2005); Всерос. науч.-техн. конф. "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва 1998, 2002,

2006); Моск. конф. «Иммобилизация лекарственных средств на текстильные носители - современный подход к снижению лекарственной нагрузки (Москва, 2001); II Межд. науч.-техн. конф."Текстильная химия -2004"; 1"м, 2"м, 3"м, 4'м, 5"м Межд. конгрессах «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005,2007,2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 111 печатных работы, из них 12 авторских свидетельств СССР и патентов РФ, и 25 статей.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Текст изложен на 428 стр., включает 116 таблиц, 38 рис. и 27 приложений. Библиография содержит 368 публикаций.

Список использованных сокращений: БАВ - биологически активное вещество, ДАЦ - диальдегидцеллюлоза, ДМСО - диметилсульфоксид, Кл - колли-тин, ЛВ - лекарственные вещества, ПА - протеолитическая активность, ПИП -поливалентный ингибитор протеиназ, ПК - протеолитический комплекс из ге-патопанкреаса краба, ПКА - поликапроамид; ПКА-ГА - частично гидролизо-ванный поликапроамид, модифицированный глутаровым альдегидом; Тр -трипсин, Хт - хитозан, ВгА^ЫА - паранитроанилид №бензоил-0,Ь-аргинина, ВгА^ОЕ! - этиловый эфир 1Ч-бензоил-0,Ь-аргинина, а2М - а2- макроглобулин, а1ПИ - аг ингибитор протеиназ.

Работа выполнена в отделе биотехнологии ОАО НИИ текстильных материалов в рамках совместных исследований с Российским химико-технологическим университетом им. Д.И.Менделеева (каф. биотехнологии), МГУ им. М.В.Ломоносова (Химический факультет, каф. химической энзимоло-гии), Институтом экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ, НИИ лазерной медицины, Московской медицинской академией им. И.М.Сеченова, Московским государственным медико-стоматологическим университетом, Московской государственной текстильной академией им. А.Н.Косыгина, Всероссийским НИИ мясной

промышленности, Государственным институтом кровезаменителей и медицинских препаратов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе I обобщены и проанализированы данные литературы по методам активации и свойствам некоторых волокнообразующих текстильных носителей на основе целлюлозы и поликапроамида для иммобилизации БАВ. Проведен анализ способов получения и свойств ферментов, иммобилизованных на альдегидсодержащих производных целлюлозы и поликапроамида. Рассмотрены результаты использования нативных и иммобилизованных ферментов для лечения ран различной этиологии.

В главе II описаны использованные материалы и методы.

Глава III посвящена разработке методов оценки функциональных свойств созданных материалов. Установление качества лекарственных средств регламентируемым нормам предполагает применение различных аналитических методов. При этом окончательный вывод о качестве лекарственного средства в значительной степени зависит от качества самого метода, который должен отвечать определенным требованиям. Общие принятые в мире рекомендации по производству лекарств в виде ОМР - правил содержат требования к методам испытаний, которые используются для оценки соответствия медицинской продукции установленным спецификациям в отношении точности и достоверности. Поэтому необходимо оценить пригодность тех или иных аналитических методов для предполагаемого их применения в оценке качества лекарственных средств.

При работе с иммобилизованными на текстильных носителях БАВ необходимо большое внимание уделять правильному и точному определению как функциональных групп на носителе после его модификации и количеству иммобилизованного БАВ, так и методам определения ферментативной активности иммобилизованных препаратов. Модифицированные текстильные носители активно взаимодействуют с различными ионогенными веществами, и

могут частично, а иногда и полностью деструктировать под действием окружающей среды (например, в ходе опыта или в условиях раны).

Нами были проанализированы и сравнены результаты 6 методов (по Ло-ури, Брэдфорду, Гурвичу (в разных модификациях), элементный анализ, аминокислотный анализ) определения количества белка, иммобилизованного на текстильных носителях. Особенностью работы с нашими перевязочными материалами является то, часто приходится иметь дело с образцами, содержащими менее 0,1 масс.% (менее 1 мг/г) биоактивного компонента. Как было показано (табл.1), определению количества иммобилизованного белка с помощью общепринятых методов определения белка (по Лоури, Брэдфорду и т.д.), мешают "свободные" альдегидные и различные ионогенные группы, кроме того методы с использованием красителей из-за значительного взаимодействия (сорбции) красителя и матрицы могут привести к получению заниженных результатов. Следствием этого может быть кажущаяся "активация" биологически активного вещества после иммобилизации.

Таблица 1.

Сравнение методов определения белка на иммобилизованных текстильных носителях (мг белка/г носителя).___

Метод Носитель""1--- Лоури-Гартри Бредфорда Гурвич Гурвич отражение нсы анализ**

ДАЦ-Тр * (0,75) 3,05+0,30 3,18+0,90 3,15±1,15 3,25±1,20 2,35±1,90

ПКА-А-Тр * (0,151) 0,88+0,20 0,72±0,40 - - 7

ПКА-А-Тр * (0,083) 0,72+0,20 1,06±0,50 - - 9

* в скобках дано содержание карбонильных групп в мгЭкв/г; ? - метод нельзя использовать;

** расчет проводили, исходя из содержания азота в образцах.

Для рассматриваемых текстильных носителей (целлюлоза и поликапроамид) наиболее подходящим и дающим точное значение количества иммобилизованного белка был признан метод Лоури в модификации Гартри.

При измерении ферментативной активности иммобилизованного на

текстильном носителе белка определение ее истинного значения также затруднено, т.к. выделяющийся в результате протеолиза хромофор сорбируется носителем как за счет ионогенных групп, так и за счет физической сорбции. При определении активности с измерением в ультрафиолетовой области (например, при 280 нм) анализ осложняется не только из-за взаимодействия выделенных аминокислот с носителем, но и за счет влияния "осколков" матрицы, образующихся в результате гидролитической деструкции (рис.1) на измеряемую величину оптической плотности.

Д - оптическая плотность

Рис. 1 УФ-спектрраствора, полученный после инкубации (37"С, 24 ч) образца ДАЦ (навеска ДАЦ 0.15 г, в 5 мл в 1/15 ФБ (рН 7.8), степень окисления ДАЦ 0,75 мгЭкв/г).

Погрешность определения контрольного образца может в несколько раз превосходить значение изменения оптической плотности в ходе реакции, особенно при повышенных температурах (выше 37°С). Нами показано, что не существует универсального метода, позволяющего определять ферментативную активность для всех типов носителя.

Для модифицированных текстильных носителей - ДАЦ и ПКА - нами разработаны такие методики, в которых используются доступные реактивы и приборы.

В главе IV подробно описана разработка технологии иммобилизации

Длина волны.X

препаратов трипсина на модифицированных текстильных носителях (ДАЦ, ПКА-ГА и ПКА-А) и исследование свойств полученных препаратов.

На рис.2 приведена технологическая схема производства, которая типична для всех получаемых в настоящей работе изделий. Отличия заключаются в выборе носителя, методе и степени модификации матрицы, концентрации БАВ и составе раствора для иммобилизации. Все выпускаемые нами изделия должны сохранять стерильность и величину ПА (по казеину) не менее 0,1 ПЕ/г в конце срока хранения (3 или 5 лет).

При подготовке текстильного материала его разрезают на куски требуемого размера и в случае необходимости отмывают от замасливателей. В зависимости от типа используемого носителя проводили его химическую модификацию перйодатом (при использовании целлюлозы - рис.3) или глутаровым альдегидом (в случае поликапроамида - рис.4).

После химической модификации носителя и отмывки его от продуктов реакции, модифицированный текстильный носитель высушивается на воздухе до остаточной влажности не более 10%.

Иммобилизацию БАВ на модифицированном текстильном носителе проводили (если это не оговорено) путем взаимодействия альдегидных групп модифицированного текстильного носителя с аминогруппами боковой цепи белка с образованием ковалентной азометиновой связи (рис.5).

После иммобилизации и высушивания, материал разрезают на салфетки требуемого размера. Формируют изделие. Каждое готовое изделие запаивают герметично в полиэтиленовый пакет. Затем запаивают в пакет из ламинированной бумаги и укладывают в картонные коробки по ГОСТ 7333-89. Упакованные в картонные коробки салфетки стерилизуют гамма-облучением на установке МРХ-25 с использованием в качестве источника излучения 60Со.

Рис. 2. Технологическая схема производства.

[ю4Г

целлюлоза

диальдегидцеллюлоза (ДАЦ)

Рис. 3. Получение диальдегидцеллюлозы.

'Ч —-(СНг )5—

н

II

о

поликапроамид (ПКА)

а. гидролиз ПКА

[Н] или

Л,—Ш—СО—Я2 -* К,—С ООН + Яг—ЫН2

[ОН]"

б. активация ПКА

Яг-Ш-, + ОНС-СН2-СН2-СН2-СНО -глутаровый альдегид (ГА)

Из—ЫНС-СН2-СН2-СН2-СНО +Н20 ПКА-ГА

Рис. 4. Получение активированного поликапроамида.

Ро1-

-н

N11,

.Ро1-

-Ы—Е -Н

Н20

Рис. 5. Схема получения препаратов иммобилизованных ферментов.

Нами оформлена необходимая нормативно-техническая документация на промышленно выпускаемые модифицированные текстильные носители и полученные материалы на их основе. В Институте химической физики РАН РФ д.б.н. И.И.Пелевиной и во Всероссийском научно-исследовательском и испытательном институте медицинской техники были проведены токсикологические и санитарно-химические исследования наших материалов. В остром и хроническом опытах изучено токсическое действие текстильных материалов на животных. При этом оценивалось их влияние на

жизнеспособность клеток в культуре ткани и мутагенная активность по тесту Эймса. Проведённые исследования показали, что исследованные материалы обладают достаточными механическими, гигиеническими свойствами и по показателям нетоксичности могут быть с успехом использованы в клинике.

Одной из важнейшая характеристик качества лекарственных форм, важной для производства медицинских материалов, является их стабильность. Как известно, стабильность активного ингредиента лекарственной формы (в случае фермента — это активность) зависит не только от его физико-химических свойств, но и от свойств вспомогательных веществ, а также от технологических процессов получения лекарственной формы.

Функции белков, также как и их стабильность, определяются аминокислотной последовательностью, которая в свою очередь обусловливает коллективные взаимодействия, приводящие к формированию специфической конфор-мации фермента. Химическая модификация приводит к структурным изменениям белка (иногда очень небольшим), которые обусловливают значительные изменения его стабильности. Модификация е-аминогрупп в молекуле Тр приводит к разрыву ряда чувствительных (нековалентных) связей и изменению свойств иммобилизованного препарата.

Можно условно выделить три основных стадии изменения ПА иммобилизованного препарата: вследствие иммобилизации, в процессе высушивания и при хранении. В процессе иммобилизации на модифицированном текстильном носителе относительная ПА БАВ (отношение ПА БАВ, используемого для иммобилизации, к удельной ПА препарата, полученной в процессе иммобилизации) может, достигнув 100%, начать уменьшаться (за счет автолиза, денатурации, термоинактивации, связывания носителя с активным центром фермента или переход в раствор иммобилизованных конгломератов). Нами показано, что ПА полученных нами ферментов, иммобилизованных на модифицированных текстильных материалах, во влажном состоянии после иммобилизации, не меняется при подобранных оптимальных условиях иммобилизации в течении, как

минимум, 70 часов при температуре 5^7°С. Снижение ПА начинается при высушивании препаратов на воздухе при комнатной температуре (стадия 1). После высушивания иммобилизованных образцов остается от 30 до 90 % первоначального значения ПА, в зависимости от условий иммобилизации, использованных белков или носителей. Причем данное явление не связано с попаданием молекул белка в поры матрицы, т.к. типично как для целлюлозных, так и ПКА носителей (несмотря на отсутствие пор у последних), а является следствием потери воды во время высушивания (изменение микроокружения фермента). Как известно, дегидратация белка даже в процессе лиофилизации может приводить к его частичной денатурации. Таким образом, снижение ПА связано в основном с уменьшением влажности иммобилизованного препарата от 100 % до 2 -ь 6%.

Нами были найдены оптимальные условия, метод модификации и степень модификации текстильного носителя, при которых практически не происходит инактивации Тр в процессе иммобилизации. Показано, что для использования в качестве перевязочных средств наиболее пригодной является ДАЦ со степенью окисления до 1.5 мгЭкв/г (в виде аппликаций), 2.5~5 мгЭкв/г (в виде корпии) и более 7.5 мгЭкв/г (в виде порошка). Выбор оптимальных условий иммобилизации (рН раствора, температура, состав раствора для иммобилизации и т. п.) заключался в выборе таких параметров, при которых относительная ПА в процессе иммобилизации была максимальна и не изменялась до начала высушивания образцов, а падение ПА в процессе хранения оказывалось минимальным. На технологии получения иммобилизованного Тр, Кл, ПК, ПИП нами получены авторские свидетельства и патенты, в которых приведены эти оптимальные условия.

На рис. 6 и 7 представлены зависимости изменения протеолитической активности (оптимальные условия получения) иммобилизованных препаратов Тр в процессе иммобилизации, высушивания и хранения (при комнатной температуре 20±5°С, в темноте). Происходящая дегидратация фермента при высушивании иммобилизованных препаратов Тр может приводить к изменению

структуры белка. Как известно, инактивация фермента может происходить даже при хранении сухого препарата (например, из-за агрегации или окисления белка). Вторая стадия инактивации иммобилизованных препаратов характери-

Ьп(А/Ао)

Время хранения, мес.

Время хранения, мес.

Рис.6. Изменение ПА трипсина, иммоби- Рис. 7. Кинетика изменения ПА лизованного на модифицированные трипсина, иммобилизованного на

текстильные носители, при хранении. модифицированные текстильные

носители, при хранении.

зуется также относительно быстрой потерей ПА Тр. Для наших образцов эта стадия продолжается в течение 2-6-ти месяцев хранения в вышеприведенных условиях. Данная стадия характеризует лабильную фракцию образца. Третья, медленная стадия инактивации, происходит в течение последующего времени наблюдения. Полученные данные могут быть объяснены не только наличием "лабильной" и "стабильной" фракций иммобилизованного фермента, хорошо известными для иммобилизованных протеолитических ферментов. Вследствие высокой гигроскопичности носителя (влажность исследуемых целлюлозных препаратов ~ 5%, а полиамидных ~ 2%) и неустойчивости азометиновой связи, инактивация иммобилизованных препаратов в процессе хранения может быть вызвана, по-видимому, теми же причинами, что и в растворе фермента, но процесс протекает с меньшей скоростью. Иммобилизация фермента, как известно, ведет к изменению его конформационной подвижности, а ее снижение, в свою

очередь понижает активность. С другой стороны, снижение конформационной подвижности препятствует процессам денатурации и автолиза и позволяет иммобилизованному ферменту сохранять работоспособность в экстремальных (для нативного фермента) условиях. Поэтому должна существовать некоторая оптимальная жесткость связывания, которая регулируется характером присоединения фермента к носителю, природой, длиной и жесткостью линкера, связывающего фермент с полимерным носителем, и природа самого носителя. Набухающий носитель при многоточечном связывании может вызывать денатурацию фермента, что наблюдается и для препаратов иммобилизованного Тр при хранении в стандартных условиях. На рис. 7 приведены кинетические данные изменения ПА Тр, иммобилизованного на модифицированных текстильных носителях, полученные в оптимальных условиях и представленные в полулогарифмических координатах. Кинетика инактивации иммобилизованных ферментов, в процессе хранения, описывается характерной для гидролаз сложной экспоненциальной (Ат/Ао=а|*е V + а2*е"к2х) зависимостью. В полулогарифмических координатах установленные зависимости имеют вид ломаной линии, каждая из которых описывается уравнением первого порядка. Значения эффективных констант скорости инактивации (кин) для препаратов ДАЦ-Тр, ПКА-ГА-Тр, ПКА-А-Тр полученных в оптимальных условиях соответственно равны 0,19 и 0,005; 0,15 и 0,005; 0,25 и 0,05 мес"1. Кинетические закономерности такого рода могут быть объяснены общим механизмом инактивации, включающим существование двух форм фермента, различающихся активностью и устойчивостью к денатурирующим воздействиям. То есть, вне зависимости от конкретных деталей механизма и соотношения элементарных констант, двухэкспоненциальный характер инактивации показывает, что механизм инактивации включает, по крайней мере, две различающиеся по активности или устойчивости формы фермента.

Облучение является общепринятым методом стерилизации медицинской продукции, который используется в промышленном масштабе. Как показывает

многолетняя практика использования излучений для стерилизации, доза 25 кГр обеспечивает достаточный для безопасного применения уровень микробиологической чистоты, и, именно эта доза является достаточной для стерилизации изделий самого разного состава и медицинского назначения, хотя в ряде случаев допустимы меньшие, а иногда требуются большие дозы.

Стерилизацию ^модифицированных ферментов и иммобилизованных препаратов, запаянных в полиэтиленовые пакеты, осуществляли на гамма-установке МРХ-у-25М (с источником Со60, мощность 1,1 Гр/с) при 293 К в дозе 25 кГр. На рис.8 и в табл.2 приведены данные о действии гамма - облучения в дозе 25 кГр на ферментативную активность трипсина (измеренную с использованием различных белковых и синтетических субстратов). За 100% принято значение ПА данного образца до облучения.

, Аобл/Ао

-»—ДАЦ-Тр — — Немод. Тр - ПКА-ГА Ж ПКА-А Ж ПКА-А

2 4 6 8 10

Степень модиф. носителя, мгЭкв/г

Субстрат Ау/А0

Казеин 0,80±0,05

Азоколл 0,8/±0,10

ВгА^ЫА 0,84±0,10

ВгА^ОЕ1 0,84±0,15

Рис.8. Действие гамма- облучения в дозе 25кГрей на ПА немодифицированного и иммобилизованного на текстильные носители Тр.

Таблица 2. Действие галша-облучения в дозе 25 кГрей на ферментативные активности немодифицированного Тр.

Согласно экспериментальным данным доза излучения, допустимая для полимеров, сильно зависит от их структуры, но поглощенная доза » 25 кГр обычно еще не вызывает значительного изменения их свойств, определяющих пригодность соответствующих изделий для медицинского применения.

Как видно из данных, приведенных на рис. 8, при степени окисления ДАЦ более 1 мгЭкв/г текстильный носитель оказывает на фермент защитное

действие. Защитное действие модифицированного текстильного носителя при увеличении содержания альдегидных групп на матрице связано, на наш взгляд, не только с увеличением количества связей между альдегидными группами и белком, но и с радиопротекторными свойствами альдегид содержащего полимера. При увеличении степени модификации носителя остается большое количество свободных альдегидных групп, которые могут взаимодействовать с радикалами.

Анализ представленных в настоящем разделе данных свидетельствует о том, что процесс изменения ферментативной активности Тр, иммобилизованного на различных модифицированных текстильных носителях, - очень сложный и не до конца изучен. К тому же наличие различных ионов на текстильной матрице (которые могут остаться в ферментных препаратах после «осаждения» белковой фракции или иммобилизации) может оказывать в процессе хранения разрушающее действие не только на ферментативную активность белка, но и на модифицированный текстильный носитель. Кинетика инактивации иммобилизованного трипсина для препаратов белка, полученного после полного удаления солей (препараты для медицинских целей) приведена на рис. 6-7.

В системах иммобилизованных ферментов часто наблюдается смещение оптимума рН (по отношению к немодифицированному ферменту). Как следует из полученных нами данных, ДАЦ не сдвигает рН оптимум иммобилизованного трипсина (аналогичные данные были получены нами и для других исследованных ферментов: ПК, Кл, Кр и др.). Поликапроамидный носитель, обработанный глутаровым диальдегидом, сдвигает рН оптимум протеолитической активности в щелочную область рН. Сдвиг рН-оптимума иммобилизованного на ПКА Тр связан с отрицательным зарядом модифицированной полиамидной матрицы. ДАЦ также имеет небольшой отрицательный заряд за счет карбоксильных групп, но их количество очень мало и они не оказывают существенного влияния на положение рН-оптимума

иммобилизованных препаратов (см. рис.9).

Для перевязочных средств с иммобилизованными ферментами важно, чтобы фермент сохранял активность в течение времени лечения. Полученные в ходе выполнения данной работы данные для нативных и иммобилизованных ферментов показывают, что всегда существует две температурные области, где стабильнее или нативный фермент или модифицированный (рис.10).

Рис.9. рН-зависшюсти ПА по казеину Рис.10. Изменение ПА модифицирован-немодифицированного Тр и Тр, иммо- ного и немодифицированного трипсина бшизованного на текстильные носи- (1/15 М ФБ, рН=7,8) в зависимости

ДАЦ-трипсин сохраняет при 37°С до 20 % от первоначальной активности в течение 3-х суток, что очень важно при обработке ран.

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов на модифицированных текстильных носителях способствует значительному сохранению ПА Тр по сравнению с растворами фермента используемым в медицинских целях (лечебная концентрация Тр более 1 мг/мл).

Нами также было исследовано влияние ряда физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях. Целесообразность совместного применения ферментов и различных ЛВ обоснована способностью

рН

тели.

от времени (при 37 °С).

ферментов увеличивать проницаемость тканей, вследствие чего облегчается проникновение лекарственных препаратов в очаг воспаления, тогда как при отсутствии антибактериальных препаратов это свойство ферментов может привести к распространению воспалительного процесса.

Мочевина - одно из наиболее доступных и часто используемых веществ, действующих на струп для его разрыхления и последующего отторжения некротических тканей. Полученные нами данные о действии растворов мочевины на ПА ДАЦ-трипсина (рис. 11) показывают, что при использовании концентрированных растворов мочевины целлюлозный носитель защищает фермент. Это может происходить благодаря действию нескольких факторов: присутствие как таковых углеводородов, модификация некоторых аминогрупп реакцией связывания, наличие большого количества связей белок-носитель.

В наших работах (совместно с проф. П.И.Толстых) было показано ускорение лечения гнойных ран препаратами иммобилизованного трипсина, обработанных 20% раствором мочевины по сравнению с трипсином, иммобилизованным на ДАЦ. Полученные данные приведены в таблице 3.

А/А о

Кониентряцня, мочевины М

Рис. 11. Влияние раствора мочевины (1/15МФБ, рН 7,8) на ПА различных форм трипсина.

Средние сроки.

Раневое покрытие, ис- сутки

пользуемое для лече- Очище- Полное

ния ран ние ра- зажив-

ны ление

Медицинская марля 11,6±0,7 23,7±

0,5

Дальцекс-трипсин 7,1± 19,1±

0,5 0,5

Дальцекс-трипсин 6,2± 16,3±

20% раствор мочевины 0,2 0.5

Местное применение 8,5± 21,6±

0,1% раствора натив- 0,4 0,4

ного трипсина

Таблица 3. Результаты лечения гнойных ран в эксперименте in vivo (на крысах).

Получено разрешение МЗ РФ на промышленное производство волокнистых раневых покрытий, содержащих трипсин и мочевину, разработанных ПИИ текстильных материалов совместно с МГТУ им. А.Н.Косыгина.

Одна из проблем, возникающих при использовании текстильных аппликаций, это их травматичность. К тому же, высыхая на воздухе или под повязкой, поверхность раны обезвоживается, и на ней образуется твердая корочка (струп). Подобный высохший слой представляет собой естественное препятствие для мигрирующих эпидермицитов, что значительно удлиняет время заживления. Нами было установлено, что 10%-ный раствор ДМСО не испаряется полностью с поверхности текстильного материала через 72 часа при 37°С, что способствует сохранению атравматичных свойств аппликации.

Показано, что ДМСО и его водные растворы способствуют гидролитической деструкции ДАЦ, а это в свою очередь будет способствовать более легкому снятию салфетки с раны (повышение атравматичности текстильных препаратов). При изучении закономерностей воздействия растворов ДМСО на исследованные препараты выявлено, что изменение ПА наших образцов имеет пороговый вид аналогично данным других авторов. Увеличение температуры ускоряет снижение ПА иммобилизованных препаратов. ДМСО может быть использован в качестве растворителя на конечной стадии заживления раны, когда необходимо создание условий, благоприятных для восстановления кожного покрова.

Нами установлено, что растворы таких JIB, как мексидол (З-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат), фурагин, фурацилин, суперлимф, 20-гидроксиэкдизон не оказывают влияния (в лечебной дозе) на протеолитическую активность как немодифицированного, так и иммобилизованного на текстильных носителях Тр.

Таким образом, проведённые физические, биофизические, микробиологические исследования показали, что раневые покрытия, в состав которых входит трипсин, обладают достаточными для раневого покрытия механическими, ги-

гиеническими, свойствами и по показателям нетоксичности могут быть с успехом использованы в клинике для лечения гнойных ран.

Результаты исследований, полученных в настоящей главе, легли в основу опытно-промышленного регламента на получение медицинского (лекарственного средства) препарата «Дальцекс-трипсин» ПР 007891-01-2002 и салфетка с трипсином ТУ 9393-011-05824192-2003, а также ФС и ВФС на препараты «Дальцекс-трипсин» и «Пакс-трипсин», на салфетки «Протеокс-ТМ» - соиммо-билизованный трипсин и мексидол ТУ 9393-010-05824192-2003, выпускаемых в настоящее время для нужд медицины на опытном производстве НИИТМ. Приказом Минздравсоцразвития России № 296 от 2.12.04 Дальцекс-трипсин (пункт 16) включен в перечень жизненно необходимых лекарственных средств.

В главе V описана разработка технологии получения препаратов проте-олитических комплексов из отходов переработки пищевого сырья, иммобилизованных на модифицированных текстильных носителях, и исследование свойств полученных иммобилизованных композитов. Повышенное внимание к полиферментным препаратам объясняется их большей доступностью, простотой получения и выделения, более низкой стоимостью, а также тем, что смесь ферментов дает лучший результат при лечении ран. Протеолитические полиферментные препараты в настоящее время производятся из различного сырья. В данной работе были использованы: Коллитин (Кл), Криллаза (Крз) - полиферментный препарат из отходов производства криля «Bio Phausia» (Uppsala, Швеция), протеолитический комплекс, получаемый из гепатопанкреаса краба (ПК).

Полиферментный препарат коллитин получают из поджелудочной железы свиней (ВФС 42-2483-95). Кл применяется в качестве лекарственного средства для наружного применения и может найти широкое применение в медицине благодаря комплексному действию. Для более полной характеристики Кл нами были определены его элементный и аминокислотный составы. Определение молекулярных масс белков, входящих в состав Кл, проводили методами электрофореза и гель-хроматографии. Полученные данные подтверждают полифер-

ментный состав Кл, выделенные белки имеют молекулярную массу в пределах 20-30 кДа. С использованием различных белковых и синтетических субстратов были определены ферментативные активности. Как нами установлено, Кл обладает трипсино-, химотрипсино- и эластазоподобной активностями.

Наибольшее распространение среди полиферментных протеолитических препаратов получил протеолитический комплекс, получаемый из гепатопан-креаса краба (ПК). Его физико-химические и биологические свойства изучены довольно хорошо. ПК содержит в своем составе помимо истинной коллагеназы другие сериновые протеиназы (как минимум 9), что и объясняет его широкую субстратную специфичность и уникальные терапевтические свойства. Характерным признаком ПК является его низкая изоэлектрическая точка (р1 ниже 3,5). Для более полной характеристики ПК мы определяли ферментативные активности с использованием различных белковых и синтетических субстратов (табл.4).

Таблица 4.

Ферментативные активности коллитина и ПК.__

Субстрат, активность

Казеин, ПЕ/мг Азоколл, Ед/мг ВгА^ЫА, кМаль/мг/мин ВгАг§ОЕ1, мк-Моль/мг/мин ВосА1аОЫр, нМодь/мг/мин ВгТугСЖ, мкМоль/мг/мин

Кл 1,2±0,3 0,053±0,003 60 3,6 280 7,7

ПК 3,2±0,3 0,016±0,004 43 3,3 164 0,54

Кл был иммобилизован на ДАД, а ПК - на различные целлюлозные носители (Ц, ДАЦ разной степени модификации, Ц-Хт, ДАЦ-Хт). Полученные образцы высушивались на воздухе либо без отмывки, либо в случае необходимости отмывались водой и фосфатным буфером до отсутствия в промывных водах белка, либо сначала восстанавливались в кислых условиях бисульфитом натрия, затем отмывались водой и фосфатным буфером от продуктов реакции. Кинетика изменения ферментативной активности образцов иммобилизованных полиферментных препаратов аналогична изменению ПА Тр, иммобилизованного на модифицированные текстильные носители.

При отмывке сорбированного белка после иммобилизации ПК на Ц или ДАЦ, из-за низкой р1 протеиназ ПК, на матрице остается малое количество иммобилизованного белка. В связи с этим нами был синтезирован носитель, имеющий положительный заряд (Ц-Хт, ДАЦ-Хт). Для этого целлюлозная матрица (немодифицированная или окисленная перйодатом) была сначала обработана раствором хитозана, и на нее затем был иммобилизован ПК. К тому же хи-тозан (точнее - продукты его деградации) обладает ранозаживляющими и био-цидными свойствами.

На рис. 12 представлены полученные в настоящей работе зависимости изменения ПА ПК при иммобилизации на различные текстильные носители и изменение ПА иммобилизованных препаратов в процессе иммобилизации и хранения (при комнатной температуре, в темноте). Для всех рассматриваемых

Время хранения, мес.

Рис. 12. Изменение ПА ПК, иммобилизованного на целлюлозных матрицах, в процессе хранения (в скобках дано содержание альдегидных групп мгЭкв/г). типов носителей (как и для иммобилизованного Тр) можно выделить три стадии инактивации ПК, иммобилизованного на текстильные носители (подробно обсуждено в разделе о Тр). Значения кин для препаратов ДАЦ-Кл, ДАЦ-Кр, ДАЦ-ПК, ДАЦ-Хт-ПК полученных в оптимальных условиях соответственно равны 0,39 и 0,07; 0,20 и 0,013; 0,28 и 0,06; 0,11 и 0,04 мес'1: В процессе хране-

ния иммобилизованных препаратов происходит деструкция текстильного носителя возможно из-за того, что коммерческие препараты полиферментных комплексов содержат разнообразные соединения, разрушающие текстильный носитель в процессе хранения и эксплуатации, поэтому скорость инактивации иммобилизованных комплексов выше скорости инактивации иммобилизованного Тр.

Нами показано, что гамма-облучение в меньшей степени (~ на 25^35%), влияет на амидазную активность ДАЦ-Кл (по ВгА^рИА), чем на общую протеолитическую активность (субстрата казеин); аналогичные данные были получены и для ДАЦ-Тр. Это может быть связано с различным действием гамма-облучения на иммобилизованные ферменты, входящие в состав полиферментной композиции Кл. Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что действие гамма облучения (доза 25 кГрей) практически одинаково на исследованные немодифицированные протеолитические препараты.

Таблица 5.

Действие гамма облучения в дозе 25 кГрей на ферментативные активности (Ау/Ар) Кл, панкреатической эластазы и Тр.__

_____ Фермент Субстрат Кл Эластаза тР

Казеин 0.83±0,10 0,87±0,10 0,80±0,05

Азоколл 0,86±0,10 0,86±0,10 0,87±0,Ю

Денатурированный коллаген 0,89±0,10 — —

ВгА^рИА 0,87±0,10 0,88±0,12 0,84±0,10

ВгА^СЖ 0,78±0,15 — 0,84-Ь0,15

ВгТугОЕ! 0,98±0,20 — —

ВосА1а(Жр 0,83±0,15 0,79±0,Ю —

— измерения не проводились.

Образцы Кл обладают большей термостабильностью в растворе по сравнению с панкреатическим Тр. Особенно это касается щелочных значений рН и концентраций ферментов, используемых для медицинских целей.

рН оптимум ПА Кл сдвинут в щелочную сторону по сравнению с Тр (аналогично панкреатической эластазе). Иммобилизация Кл на ДАЦ, как и в случае с Тр, не сдвигает профиль рН оптимума ферментативной активности.

На рис. 13 приведены рН-зависимости протеолитической активности растворов ПК и иммобилизованного ПК (субстраты казеин по Гаммерстену и азо-колл). Ни ДАЦ, ни Ц не сдвигают рН-оптимума иммобилизованного ПК (аналогично Тр). Как следует из полученных нами данных, рН-оптимум действия про-теиназ, входящих в состав ПК, лежит либо в нейтральной, либо в слабощелочной области рН, что согласуется с данными других авторов. Для хитозансодер-жащих матриц с иммобилизованным ПК отсутствует сдвиг рН-оптимума ферментативной активности в кислую область значений рН, т.к. положительный заряд матрицы (за счет хитозана) при иммобилизации нейтрализуется за счет отрицательно заряженного комплекса.

рН рн

Рис.13. рН-зависимость протеолитической активности ПК и ПК, иммобилизованного на хитозансодержащих целлюлозных матрицах. А - субстрат казеин по Гаммерстену Б - субстрат азоколл.

При щелочных значениях рН (более 8,5) и модификации ДАЦ более 0,5 мгЭкв/г происходит частичное или полное растворение препарата, и раствор после совместной инкубации, приобретает желтый цвет (от светло-желтого до-

ярко-оранжевого). Увеличение относительной ПА при этом может быть связано с образованием комплексов казеина, хитозана и (или) раствора ДАЦ, которые легче протеолизируются ПК. Изменение рН-оптимума может быть связано с изменением структуры белка (казеина) в зависимости от значения рН и с экспонированием ранее погруженных вглубь молекулы пептидных связей. При использовании азоколла профиль рН-зависимости ПК не меняется, что может быть связано с тем, что азоколл является суспензией. В целом иммобилизация ПК (и всех исследованных ферментов) на различные целлюлозные матрицы (независимо от их заряда) сужает профиль рН ферментативной активности в изученных диапазонах рН.

На рис.14 и 15 представлены данные о термоинактивации нативного и модифицированного ПК в растворе. ПК является более стабильным препаратом чем панкреатический Тр, особенно при рН 7,8 и лечебных концентрациях (более 1 мг/мл). Из данных, полученных нами, следует, что изменение ПА ПК не зависит от концентрации комплекса, состава буферного раствора (ФБ, TRIS) или инактивационной среды (NaCl). Иммобилизация ПК на текстильных носителях также (как и в случае с Тр) не приводит ни к стабилизации, ни к дестабилизации фермента за исключением образцов с высокой степенью модификации ДАЦ (более 0,75 мгЭкв/г) и длительных экспозиций образцов (более 24 часов). При высокой степени модификации ДАЦ носитель легче подвергается гидролитической деструкции, что может приводить к образованию стабильных конгломератов ПК, либо облегчать выход активного фермента в раствор.

Мы исследовали поведение ПК и иммобилизованного на текстильные носители ПК в присутствии различных JIB и изучили проявление защитных или деструктурирующих свойств текстильного носителя.

-♦-р-р ПК (37С) -Э-р-р ПК (45С)

-в-р-рПК25С —р-р ПК37С —Л—р-р ПК 45С -А-Ц-Хт-ПК (37С) -*-Ц-Хт-ПК (45С)

-*-ДАЦ(0,44)-Хт-ПК (37С) -•-ДАЦ(0.44)-Хт-ПК (45С)

--р-рПК55С —А—Ц-ПК 25С -0-Ц-ПК37С -Ч-ДАЦ(0.75)-Хт-ПК(37С) -ДАЦ(0.75)-Хт-ПК(45С)

-0-ДАЦ(2.«.)-Хт-ПК (37С) -♦-ДАЦ(2.9).Хт-ГЖ (45С)

Рис.14. Термоинактивация иммобилизо- Рис.15. Термоинактивация иммован-ного и немодифицированного ПК в билизованного на хитозансодер-

растворе 1/15М ФБ (рН 7,8). жащие целлюлозные носители и

немодифицированного ПК в 1/15Мрастворе ФБ (рН 7,8).

Показано, что мексидол (до конечной концентрации в пробе ~ 1 мас.%),

фурагни, фурацилин, 20-гидроксиэкдизон, суперлимф (до 60 мкг/мл), три-лон Б (до 500 мг/мл) не оказывают заметного влияния на протеолитическую активность как модифицированного, так и немодифицированного ПК.

Важнейшей характеристикой ферментов, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, является их устойчивость к действию ингибиторов, содержащихся в организме человека, и в особенности ингибиторов крови. При изучении взаимодействия иммобилизованного фермента с белками плазмы крови необходимо учитывать, что фермент, содержащийся на носителе после иммобилизации (в промышленно выпускаемых препаратах), мож-

но условно разделить на три составляющие: 1-механически включенный, 2-сорбированный и 3-ковалентно связанный.

1 - механически включенный фермент остается после удаления влаги с носителя, он образуется за счет пропиточного раствора. Это тот фермент, который образует «ударную дозу» и выходит с носителя первым. Большая часть включенного фермента взаимодействует с тканевыми ингибиторами протеиназ, а оставшиеся свободными (не образовавшие комплекс с ингибиторами) ферменты начинают процесс протеолиза гнойного отделяемого.

2 - сорбированный фермент, связанный с носителем за счет ионных, водородных, вандер-ваальсовых связей и за счет неспецифической сорбции (как молекулами диальдегидцеллюлозы, так и немодифицированной целлюлозы или другого носителя).

3 - ковалентно связанный фермент: это фермент, связанный азометиновой связью с альдегидными группами матрицы. Причем следует иметь в виду, что часть ковалентно связанного фермента может переходить в раствор вследствие гидролитической деструкции носителя, как в виде растворимых, так и нерастворимых высокомолекулярных конгломератов. Например, чем выше степень окисления ДАЦ и чем более щелочное значение рН среды, тем легче и быстрее идет процесс гидролитической деструкции. Также следует иметь в виду, что в процессе хранения модифицированный целлюлозный носитель деструктуриру-ет.

Для изучения взаимодействия текстильных материалов и ингибиторов плазмы крови образцы носителей инкубировали с плазмой крови (соотношение носитель: плазма (вес/объем) = 1:6; 1:10; 1:18; 1:20) при комнатной температуре. Нами установлено, что изучаемые ингибиторы плазмы крови не подвергаются значительному протеолизу (с потерей ингибиторной активности) самим ПК.

- Таблица 6.

Взаимодействие аШИ и а2М с целлюлозными носителями, не содержащими ПК.

Время взаимодействия, ч Целлюлоза ДАЦ (2,5 мгЭкв/г)

Носитель : плазма (вес/объем) 1:10 1:20 1:6 1:10 1:18

Сорбция а1ПИ,% 0,25 5±5 6±4 35±10 12±7 7±7

1 5±5 8±3 48±5 18±7 25±6

24 0 - - 20±8 -

Сорбция сх2М,°/о 0,25 0 0 25±5 7±3 10±5

1 8±3 0 42±8 11±5 10±8

24 9±6 - - 37±7 -

- измерения не проводились.

Как видно из данных табл.6, сорбция ингибиторов на целлюлозных носителях зависит от соотношения концентраций плазмы и целлюлозного носителя. Немодйфицированная целлюлоза, в отличие от ДАЦ, в незначительной степени неспецифически сорбирует белковые молекулы. Процесс взаимодействия эндогенных ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным ПК растянут во времени, что связано, с защитным действием текстильного носителя (табл.7).

Таблица 7.

Взаимодействие иммобилизованного ПК с а]ПИ и а2М в плазме крови , (соотношение матрица : плазма крови = 1:10 (вес/объем))_

Время контакта, ч ДАЦ ДАЦ-ПК ДАЦ-ПК+ 0,1 MNaCl

Сорбция аШИ,% 1 17.5±5.0 28±5 15±10

24 20±5 60±6 35±8

Сорбция 1 И ±5 15±5 11±5

а2М,% 24 37±5 72±8 49±5

ДАЦ-ПК - образцы ПК, иммобилизованные на ДАЦ и содержащие 5.2 ± 2.0мг белка/г, ДЛЦ-ПК + 0,1 М ЫаСЧ - образцы ПК, иммобилизованные на ДАЦ и отмытые от сорбированного белка водой и 0.1 МШС! и содержащие 2.5±1.2 мг белка/г.

Аналогично панкреатическому Тр, иммобилизация ПК на

модифицированные текстильные носители предохраняет его от инактивирующего действия JIB, особенно высокомолекулярных и белковой природы (ОПИТ, соевый ингибитор и др.).

Для ДАЦ-Кл и ДАЦ-Хт-ПК были проведены токсикологические, медико-биологические и клинические исследования. Иммобилизованный на модифицированных текстильных носителях Кл был разрешен к клиническому применению Комитетом по новой медицинской технике. ПК, иммобилизованный на хи-тозансодержащей матрице ("Мультиферм", ТУ-9393-025-05824192-2006) разрешен к промышленному выпуску и применению в лечебных учреждениях РФ для лечения гнойно-некротических и ожоговых ран, пролежней и т.п.

Медико-биологические исследования наших препаратов иммобилизованного на модифицированные текстильные носители Кл и ПК были проведены в Институте лазерной медицины (отделение проф. П.И. Толстых). Изучение влияния раневых покрытий на течение раневого процесса и скорость очищения и заживления ран проведено на белых крысах самцах линии "Вистар" массой 190±10 г, которым наносили плоскостную кожно-мышечную инфицированную рану. Полученные данные приведены в табл. 8. Получены положительные результаты клинических испытаний ДАЦ-Кл на ожоговых ранах в Московском НИИ скорой помощи им. Склифосовского и на гнойных ранах в Московской медицинской академии им. Сеченова.

Таблица 8.

Сравнение результатов лечения гнойных рану крыс с использованием _иммобилизованных ферментов.____

Материал и метод лечения Количество животных, п Время, сутки Ускорение заживления

Очищение раны Полное заживление %

Без лечения (контроль) 20 14,9±0,8 27,2±0,2 -

Медицинская марля 20 13,3±0,6 24,2±0,5 11,3

Диальдегидцеллюлоза 20 11,6±0,7 23,7±0,5 12,9

ДАЦ-трипсин 20 7,1±0,5 19,1 ±0,5 29,8

ДАЦ-коллитин 20 4,9±0,5 15,1±1,3 44,5

Аппликация «Мультиферм» 20 3,0±0,2 12,1±0,1 55,5

Местное применение 0,1% раствора трипсина 20 8,5±0,4 21,6±0,4 20,6

Местное применение 0,1% раствора коллитина 20 7,8±0,5 21,2±0,3 22.1

Анализ сроков очищения ран от гнойно-некротических масс и полного заживления показал, что иммобилизованные формы ферментов значительно эффективнее, чем соответствующие нативные препараты. Это объясняется тем, что нативные (немодифипированные) ферменты быстро инактивируются и смываются в раневом отделяемом, в то время как иммобилизованные препараты более стабильны и обладают пролонгированным действием. Кроме того, лечебный эффект материалов, содержащих комплекс ферментов (Кл или Ж), выше по сравнению с моноферментными препаратами (например Тр).

Таким образом нами доказано, что замена моноферментного препарата трипсина на комплексный полиферментный препарат позволит не только снизить цену единицы изделия, но и сократит сроки лечения и расширит возможности терапии иммобилизованными ферментами.

В главе VI описана разработка технологии получения препаратов иммобилизованного поливалентного ингибитора протеиназ на модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных препаратов иммобилизованного ингибитора.

Среди большого числа биологически активных веществ в ране особое место занимают системы протеаз и их ингибиторов. Протеолитические ферменты, вызывая расщепление белковых веществ, образовавшихся при распаде клеток, способствуют очищению раны и обеспечивают реутилизацию аминокислот. В то же время повышенная активность протеолитических ферментов может оказывать неблагоприятное действие на процессы регенерации. Можно ожидать, что ингибиторы протеолитических ферментов будут весьма эффективны в стимуляции репаративных процессов в ране.

Нами получены препараты поливалентного ингибитора протеиназ (ПИП), иммобилизованного на нерастворимых текстильных носителях (целлюлоза, ДАЦ и ПКА-ГА). Следует особо отметить, что ингибиторная активность полученных материалов на текстильных носителях в отличие от препаратов протео-

литических ферментов не изменяются в течение наблюдаемого срока (5 лет и более) при хранении в стандартных условиях.

Для терапевтических целей необходимо знать кинетику выхода иммобилизованного вещества в рану. Благодаря стабильности ПИП в растворе можно оценить кинетику выхода биологически активных веществ с аналогичных текстильных носителей.

Нами показано, что препараты ДАЦ-ПИП обладают значительно большим пролонгированным действием по сравнению с полиамидным носителем, особенно в кислой области рН (рис. 16,17). Время выхода заданного количества лекарственного препарата можно изменять, варьируя степень модификации носителя (содержание альдегидных групп указано в скобках, мыт - образцы, отмытые от сорбированного белка).

—♦—ДАЦ(0.2)-Инг(мыт.) 7.8 —в»— ДАЦ(0.2)-Инг(не мыт.) 7.8 —*— ДАЦ(0.2)-ИнИмыт) 6.0 —ДАи(0.2)-Ин1'(не мыт.) 6.0 —*- ДАЦ(3.1УИппмыт) 7.8 -•— ДАЦ(3.1 )-Инг( немыт) 7.8 —У— ДАЦ(3,!)-Инг(мыт) 6.0 -ДАЦ(3,1 )-Инг(немыт) 6,0

-Ц-Ииг(мыт) 7 8

- Ц-Инг(ымт) 6.0 -ПКА-ГА-Инг<иыт)Т8

— ПКА-ГА-Инг (мытй.О

— Ц-Инг (не мыт) 7.8 -Ц-Инг (че чит)ъО

— ПКА-ГА-Инг (не иыг) 7 8

— ПКА-ГА-Инг (пс мы г) 6 0

Рис. 16. Кинетика выхода активного Рис.17. Кинетика выхода активного выхода ПИП с препаратов ПИП с препаратов Ц-ПИП и

ДАЦ-ПИП (П/о!). ПКА-ГА-ПИП (Мо).

Из данных литературы следует, что в первые дни после вскрытия гнойника в раневом экссудате наблюдается высокая активность про-

теолитических ферментов. По мере очищения' раны от гнойно-некротическогосодержимого (с переходом раневого процесса в фазу регенерации) активность протеиназ значительно снижается, однако она не исчезает полностью до полного заживления раны. И, как было установлено в эксперименте, ингибиторы протеолитических ферментов не оказывают положительного влияния на течение раневого процесса в первой его фазе. Во второй фазе раневого процесса- регенерации - ингибиторы протеаз оказывали стимулирующее влияние на процессы регенерации. Аналогичные данные были получены при клинических испытаниях иммобилизованного нами на модифицированные текстильные носители ПИП (отделение лечения ожогов Института хирургии им. А.В.Вишневского). Лечебный эффект иммобилизованного ПИП был испытан на больных с ожогами от 15 до 65 % поверхности тела, препарат накладывали на гранулирующие раны. При применении иммобилизованного ингибитора в раневом экссудате к моменту готовности раны к дермопластике снижалась концентрация белка и активность катепсинов, в то время как в экссудате из контрольных участков эти показатели были повышены. Клинико-лабораторные испытания показали, что иммобилизованный ПИП оказывает благоприятное действие на течение раневого процесса, купирует воспалительную реакцию в ране и стимулирует рост грануляций.

Таким образом, если в первой фазе раневого процесса патогенетически обосновано применение тех или иных протеолитических ферментов, которые ускоряют очищение раны от гнойно-некротического содержимого и способствуют более раннему появлению грануляций и эпителизации (о чем подробно нами доложено в главах 4 и 5), то во второй фазе этого процесса угнетение активности протеолитических ферментов в ране с помощью ингибиторов является патогенетически обоснованным, стимулирующим процессы регенерации в ране, в несколько раз сокращает сроки заживления.

В главе VII приводится технико-экономическое обоснование использования препаратов иммобилизованных ферментов.

Оценка эффективности использования терапевтических систем на примере использования иммобилизованного Тр, которая базировалась на анализе лечения больных с различными гнойными воспалительными хирургическими заболеваниями приведена в табл.10.

Как видно из данных табл.10, иммобилизованный Тр эффективнее, чем нативный фермент или антисептики по всем показателям в 1,5-4 раза.

Таблица 10.

Клиническая эффективность применения иммобилизованного трипсина для лечения гнойно-некротических ран.__

Показатели Эффективность метода лечения, сутки

Иммобилизованный трипсин Нативный трипсин Гипертонический раствор, антисептики

Полное очищение ран 4,5 7,6 8,8

Койко-день 3,0 10,3 11,9

Заживление от начала лечения 15,0 19,3 25,9

Выводы.

В результате выполненных исследований:

1. Решена важная народнохозяйственная и социальная задача по созданию нового ассортимента текстильных материалов медицинского назначения с заданными лечебными свойствами.

2. Разработаны технологические режимы получения новых раневых покрытий с заданными свойствами, в том числе соиммобилизацией лекарственных веществ разных классов на один носитель с учетом их совместимости и предполагаемого синергизма действия. Получены новые медицинские материалы на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащие биологически активные вещества, и определены их области применения. Создана гибкая универсальная технологическая линия, позволяющая выпускать медицинские изделия на стандартном технологическом оборудовании.

3. Разработаны удобные и достоверные методы определения содержания и активности биологически активных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях.

4. Впервые выявлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком хранения в стандартных условиях.

5. Установлено, что разработанные иммобилизованные препараты не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксиче-ским эффектом и мутагенной активностью.

6. Показано, что в условиях человеческого организма наиболее целесообразно для стабилизации иммобилизованных ферментов использовать комбинацию методов химической модификации и физической сорбции. Такой подход позволяет получать препараты с широким спектром действия.

7. Показано, что лечебный эффект материалов с полиферментными препаратами выше, чем у моноферментных препаратов (при сравнении сроков очищения и полного заживления ран). Кроме того, изделия, полученные на основе полиферментных препаратов, имеют меньшую себестоимость.

8. Иммобилизованные на нерастворимых текстильных носителях ферменты медицинского назначения демонстрируют в медико-биологических испытаниях высокую эффективность действия, применяются (иммобилизованные белки) в малых дозах, не вызывают токсико-алергических реакций, удобны для повседневного использования, как в быту, так и в стационарах или военно-полевых условиях.

9. В экспериментах на животных показано, что модификация ферментов (иммобилизация на альдегидсодержащие текстильные материалы) не влияет существенно на их каталитические свойства, повышает стабильность в биологических системах. Модифицированные БАВ оказываются более эффективными те-

рапевтическими средствами по сравнению с нативными препаратами при лечении различных заболеваний.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Белов A.A. Влияние у-облучения на ферментативную активность коллалитина в процессе хранения / А.А.Белов, Л.А.Белова, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, В.Н.Филатов // Радиобиология,- 1990.- Т.30, №-4,- С, 519-521.

2. Белов A.A. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина / А.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, В.Н.Филатов //Хим. волокна.-1992.-Ж4.-С.ЗЗ-34.

3. Белов A.A. Методы определения протеолитической активности в промышленных образцах препаратов иммобилизованных протеиназ / А.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк //Химико-фармацевтический журнал,- 1992. -№.11-12,- С.101-103.

4 . Белов A.A. Влияние количества связанного с диальдегидцеллюлозой фермента на активность иммобилизованного трипсина после гамма-облучения и в процессе хранения /

A.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, В.Н.Филатов //Радиационная биология Радиоэкология.- 1994.- Т. 34, вып. г.- С. 306-310.

5. Апосталиди К.Г. Использование трипсина и лизоцима, иммобилизованных на целлюлозном носителе, при лечении наружных отитов / К.Г.Апосталиди, В.К.Ильин, А.А.Белов,

B.В. Рыльцев //' Вестник оториноларингологии,- 1994.- №-2 (март-апрель).- С. 42-43.

6. Белов A.A. Взаимодействие ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным на диальдегидцеллюлозе протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба / A.A. Белов, Л.А.Белова, В.Н.Филатов, Е.Н.Белова, Г.Н.Донских, М.Н.Горбунова // Вести. МГУ, сер.2. Химия.- 2003,- Т.44,№ 1.- С. 16-19.

7. Белов A.A. Влияние водных растворов диметилсульфоксида на немодифицированные и иммобилизованные ферменты / A.A. Белов //Химическая технология .- 2004.-№ 12.- С. 3540.

8 . Белов A.A. Изменение протеолитической активности трипсина иммобилизованного на альдегидсодержащие текстильные носители в процессе иммобилизации и хранения / A.A. Белов, В.Н.Филатов, Е.Н.Белова, Н.Ф. Казанская // Веста. МГУ, сер.2. Химия,- 2006,- Т.47, № 2,- С. 87-90

9. Белов A.A. Разработка целлюлозных текстильных материалов, содержащих хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, исследование их свойств / А.А.Белов, И.В.Кузьмина, Е.Н.Белова, Н.С.Марквичев, В.Н.Филатов //Хим. волокна,- 2007,- № 4.- С.3-6. 10 . Белов A.A. Разработка и исследование свойств текстильных материалов, содержащих протеолитические ферменты / А.А.Белов, Е.Н.Белова, В.Н.Филатов, А.Н. Лебедева //Хим. волокна.- 2008,- № 5.- С.52-54.

11. Белов A.A. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей / А.А.Белов, Е.Н.Белова, В.Н. Филатов//Биомедицинская химия.- 2009.-Т. 55,№ 1.-С.61-67.

12. Белов A.A. Кинетика инактивации трипсина иммобилизованного на альдегидсодер-жащих текстильных носителях в жидкой среде / A.A. Белов //Химическая технология.- 2009.-№ 3,- С.154-160.

Авторские свидетельства и патенты

13.' A.C. № 1598269 СССР, МКИ3 А 61 N 5/06. Способ лечения трофических язв / П.И.Толстых, А.В.Герцен, В.В.Рыльцев, В.Н.Филатов, A.A. Белов, Б.Н.Арутюнян, Р.З.Хусаинов.- №4426785; Заявл. 13.05.88; зарегистр. 08.06.90.

14 . A.C. № 4635886/14 СССР, МКИ3 А 61 N 5/06. Способ получения средства для лечения эрозивно-язвенных образований внутренних органов / В.И.Пронин, В.В.Рыльцев, Л.З.Вельшер, В.Н.Филатов, А.А.Белов, Ю.Т.Шапошников, Т.Е.Игнатюк, Ю.А.Розанов, В.М.Шаборов, Р.Б.Вирник; Заявл. 24.01.89; зарегистр. 24.08.90. Не подлежит публикации.

15. A.C. № 1773067 СССР, МКИ3 А 61 LI5/38. Способ получения перевязочных целлюлозных материалов, содержащих иммобилизованный трипсин / А.А.Белов, Т.Е.Игнатюк, В.В.Рыльцев, В.Н.Филатов; № 4774863/05; заявл. 24.11.89; зарегистр. 01.07.92. Не подлежит публикации.

16. A.C. №1683323 СССР, МКИ3 А 1. Способ получения перевязочного материала, содержащего фермент / В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, В.Н.Филатов, Л.И.Стекольников, В.И.Пронин, П.И.Толстых, В.К.Гостищев, Б.Н.Арутюнян, Л.З.Вельшер, А.А.Белов; № 4721644/13; заявл. 20.06.89; зарегистр. 08.06.91. Не подлежит публикации.

17 . A.C. №-4855929/05/083643 СССР, МКИ3 А 1. Способ получения текстильного поли-капроамидного носителя для иммобилизации биологически активных веществ / В.В.Рыльцев,

A.А.Белов, С.И.Гриценко, В.Н.Филатов; заявл. 31.07.90; зарегистр. 26.06.91. Не подлежит публикации.

18. A.C. №94004263/14/004399 СССР, МКИ3 А 1. Способ получения материала обладающего биологической активностью / А.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е. Игнатюк, Н.Ф.К'азанская, Н.И.Ларионова, И.Л.Донецкий; заявл. 09.02.94; зарегистр. 21.12.95. Не подлежит публикации.

19. Пат. 2108077 РФ, МКИ3 С2. Способ получения перевязочного материала / С.В.Грачев,

B.Ю.Кассин, В.М.Воробьева, Л.А.Павлова, А.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, В.Н.Филатов // Заявитель и патентообладатель Моск. мед. акад. им. И.М.Сеченова.- № 93033732; заявл. 30.06.93; опубл. 10.04.98

2 0. Пат. 2203684 РФ, МКИ3 С2. Способ получения перевязочного материала / В.К. Про-моненков, В.В.Бурмака, В.В.Рыльцев, В.Н.Филатов, Е.О.Медушева, А.А.Белов, Н.В.Филатов, П.И.Толстых, М.П.Толстых, В.И.Мельниченко, Д.В.Петушков // Заявители и патентообладатели ГУП НИИ текстильных материалов, ГНЦ лазерной медицины, ООО Тринити фарма.- № 2000128812; заявл. 20.11.2000; опубл. 10.05. 2003.

21. Пат. 2 268 751 РФ, МКИ3 С2. Медицинская повязка, содержащая комплекс протеоли-тических ферментов, включая коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса краба / А.А.Белов, В.Н.Филатов, Е.Н.Белова, Н.В.Филатов // Заявители и патентообладатели авторы.- № 200311 ¡997; заявл. 25.04.03; опубл. 27.01.06.

2 2. Пат. 2 323 748 РФ, МКИ3 С2. Медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, и способ ее получения / А.А.Белов, В.Н.Филатов, E.H. Белова // Заявители и патентообладатели авторы.- № 2006105155; заявл. 21.02.06; опубл. 10.05.08. Статьи в сборниках трудов, периодических изданиях, тезисы докладов (избранные)

23. Белов A.A. Действие гамма облучения на ферментативную активность коллалитина и коллагеназы краба / А.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, Л.И.Стекольников // Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотера-певтических препаратов: тез. докл. 3-й Всесоюз. научно-технической конференции.- Москва, 1987.- С. 208.

24. Белов A.A. Сравнительная оценка методов определения количества трипсина, иммобилизованного на текстильных материалах / Белов А.А, Плеханова Н.Ю., Вирник Р.Б., Игнатюк Т.Е. // Разработка новых видов текстильных изделий мед. назначения: сб. науч. тр. ВНИ-ИТГП. -М.: ЦНИИТЭИ Легпром, 1988,- С. 25-29.

25. Белов A.A. Инактивация у-облученного трипсина / А.А.Белов, В.В.Рыльцев, Т.Е.Игнатюк, С.И. Гриценко // Тез. докл. 1-ого Всесоюз. Радиобиологического съезда.- М., 1989,-т.1,-С. 17-18.

2 6 . Белов A.A. Оценка специфических свойств перевязочного материала на основе ди-альдегидцеллюлозы с иммобилизованным трипсином / А.А.Белов, Т.Е.Игнатюк // Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов: Тез. докл. 1-ой Всесоюзной конференции.-Москва, 1989,-С. 135-137.

2 7 . Белов A.A. Прогнозирование изменил протеолитической активности иммобилизованного трипсина в процессе хранения / А.А.Белов, Б.Е.Рушайло, С.И.Гриценко, В.В. Рыльцев //' Сб. науч. тр. ВНИИТГП,- М.: ЦНИИТЭИ Легпром, 1990,- С. 21-22

28 . Ignatyuk Т.Е. The characteristics of the textile cellulose wound dressings with immobilized enzymes / T.E.Ignatyuk, A.A.Belov, V.V.Ryltsev, V.N.Filatov //Proc. 20-th FEBS Meeting, Budapest, Hungary, 1990.- P.240.

2 9. Belov A.A. The use of Bredford method for the analysis of textile biomaterials / A.A.Belov, T.E.Ignatyuk, V.V.Ryltsev // "Биоматериали": Тез. докл. 2 Национальная конференция.- Варна, НРБ. 1990,- S.102-103,176-177.

30. Белов A.A. Взаимодействие растворов трипсина с текстильными материалами, содержащими поливалентный ингибитор протеиназ / А.А.Белов, Т.Е.Игнатюк, Н.И.Ларионова, Н.Ф. Казанская //Сб. науч. тр. ВНИИТГП. - М. :ЦНИИТЭИлегпром, 1991,- С. 36-41

31. Белов A.A. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина / А.А.Белов, Т.Е. Игнатюк, В.Н.Филатов // Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров: труды, Всесоюзной научной конф.- Москва. 1991.-С. 85-86.

32. Белов A.A. Применение простых аналитических реакций в контроле производства трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях / А.А.Белов, С.И.Гриценко, E.H. Белова // Сб. науч. тр. ВНИИТГП,- М.: ЦНИИТЭИ Летром.- 1991.- С.42-48.

33. Белов A.A. Определение количества белка на текстильных носителях / А.А.Белов, С.И.Гриценко, Д.Л.Таршиц, В.В. Рыльцев //Сб. науч. тр. НИИТМ.- М.: ЦНИИТЭИ Легпром.-1992.- С.22-27.

34. Белов A.A. Кинетика инактивации трипсина иммобилизованного на диальдегидцел-люлозе / А.А.Белов, С.И.Гриценко, В.В.Рыльцев, Б.Е. Рушайло //Сб. науч. тр. НИИТМ,- М.: ЦНИИТЭИ Легпром., 1992,-С.27-30.

35. Белов A.A. Использование азоколла для характеристики перевязочного материала, содержащего полиферментный препарат "Коллитин" / А.А.Белов, Т.Е.Игнатюк, П.И.Толстых, А.В.Герцен Ü Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов: тез. докл., 1-ая Международная конф,- Москва, 1992.-С. 105-107.

36. Белов A.A. Кинетика выхода поливалентного ингибитора протеиназ с текстильного носителя / A.A. Белов, Т.Е. Игнатюк, Н.И.Ларионова, Н.Ф.Казанская, В.В. Рыльцев //Сб. науч. тр. НИИТМ - М. :ЦНИИТЭИлегпром, 1993. - С. 22-27.

37. Белов A.A. Исследование некоторых свойств коллитина / Белов A.A., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. //Сб. науч. тр. НИИТМ,- М.:ЦНИИТЭИ Легпром, 1993,- С.34-37.

38. Ignatyuk Т.Е. The immobilized proteinase inhibitors in burn treatment / T.E.Ignatyuk, N.I.Larionova, A.A.Belov, V.V.Ryltsev, I.L.Zaets // Data Medica J., (Israel).- 1994,- V.2, № 1.- P. 61.

39. Belov A.A. Antiproteinase and polyenzyme wound dressing / A.A.Belov, V.V.Ryltsev, T.E.Ignatyuk, V.N.Filatov // Proc. 3-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings, Tel-Aviv.- 1994.- P.-22, 111.

40 . Белов A.A. Изучение свойств и иммобилизация на текстильных носителях полиферментных препаратов / А.А.Белов, В.В.Рыльцев, В.Н.Филатов // Химия протеолитических ферментов: Тез. докл., IV симпозиум .-Москва, 1997.- С. 147.

41. Белов A.A. Влияние текстильного носителя на свойства иммобилизованных биологически активных веществ / А.А.Белов //Юбилейный сб. трудов, посвященный 10-летию Международной и Российской инженерных академий.- Москва, 2000.- С. 68-77.

4 2 . Belov A.A. Crillase immobilization on textile carriers / A.A.Belov, V.V.Ryltsev, Y.O.Me-dusheva, N.V. Filatov //" Proc. 6-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings", Tel-Aviv,

4 3. Belov A.A. Preparation and properties of krillase immobilized on dialdehidecellulose /

A.A.Belov, V.V.Ryltsev, V.N.Filatov, N.V.Filatov, G.N. Donskikh //"Proc. Intern, conf. BIO-CATALYSIS- 2000: fundamentals & applications".- Moscow, 2000,- P.72.

4 4 . Белов A.A. Создание промышленной технологии и организация производства раневых покрытий на основе биологически активных текстильных материалов с учетом требований международных стандартов / А.А Белов, В.Н.Филатов, В.В.Рыльцев, Е.О. Медушева. отчет о НИР/ НИИ текстильных материалов,- № госрегистрации 01.200.2 05951; Инв. № 02.200.304026,- М„ 2002. Госконтракт № 16.802.11.0005 от 18.03.2002. 45. Belov A.A. Effects of blood plasma inhibitors on the activity of proteases immobilized on dialdehydecellulose / A.A.Belov, L.A.Belova, V.N.Filatov, V.A.Lagunov, N.V.Filatov, G. N.Donskikh, Ye.N. Byelova //Proc. Internationa] conference BIOCATALYS1S - 2002: fundamentals & applications .- Moscow, 2002.-P.71-72.

4 6. Белов A.A. Иммобилизация и исследование свойств протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба / А.А.Белов, Л.А.Белова, В.Н.Филатов, Е.Н.Белова, Н.В.Филатов, М.Н.Горбунова // "Биотехнология состояние и перспективы развития". Тез. докл., 1-й международный конгресс.- Москва, 2002,- С.72.

4 7 . Филатов В.Н. Разработка промышленной технологии получения нового класса медицинской продукции / В.Н.Филатов, В.В.Рыльцев, А.А. Белов, Е.О. Медушева // Наука и промышленность,- 2003.- № 2-3 (70-71), февр.-март,- С. 40-48.

4 8. Толстых П.И. Лечение гнойных ран и язв различного генезиса с использованием терапевтических систем иммобилизованного трипсина /П.И.Толстых, В.А.Дербенев, Е.О. Медушева, В.Н.Филатов, А.А.Белов, Н.В.Филатов, В.В.Рыльцев, В.В.Денисов, В.К.Гостищев, К. В.Липатов, Т.С. Овчарова // Пособие для врачей. Москва, 2004,2005,2008.- 14 С.

4 9. Belov А.А. The change of proteolytic activity of trypsin immobilized on aldehyde -containing textile matrix during storage and under model conditions of inactivation / A.A. Belov, N.F.Kazanskaja, V.N.Filatov, Ye.N. Belova //Proc. International conference BIOCATALYSIS -2005: fundamentals & applications.- St. Petersburg, 2005,- P. 68.

50. Белов A.A. Влияние физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильные носители / А.А.Белов //Сб. науч. тр. ФГУП НИИТМ.- М.: Дипак, 2006.- С. 12-28.

51. Белов А.А. Протеолитические ферменты, иммобилизованные на текстильных носителях для оказания помощи в чрезвычайных ситуациях / А.А.Белов //Медицинский алфавит. Скорая помощь и реанимация,- 2007, №10 (IV).- С. 25-28.

52. Белов А.А. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба для медицинских целей / АА.Белов, И.В.Кузьмина, Е.Н.Белова, Н.С.Марквичев, В.Н. Филатов //Химия протеолитических ферментов: Тез. докл., VI симпозиум,- Москва, 2007,- С. 147.

5 3. Белов А.А. Синтез и исследование свойств полиферментных препаратов на основе протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба, целлюлозы и хитозана / А.А.Белов,

B.Н.Филатов, Е.Н.Белова, И.В.Кузьмина, Н.С. Марквичев //Биотехнология состояние и перспективы развития: Тез. докл., IV-й международный конгресс.-Москва, 2007.- С. 220-221. 54. Белов А.А. Синтез и исследование свойств альдегидсодержащих текстильных материалов с иммобилизованными протеиназами. Процессы старения альдегидсодержащих текстильных материалов / А.А.Белов //Сб. науч. трудов НИИТМ,- М.: Дипак,- 2008,- С. 40-48.

2000.

КОПИ-ЦЕНТР св. 7:07:10429 Тираж 100 экз. г. Москва, ул. Енисейская, д.36 тел.: 8-499-185-7954. 8-906-787-7086

Содержание диссертации, доктора технических наук, Белов, Алексей Алексеевич

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ В ТЕКСТЕ ДИССЕРТАЦИИ Введение

Глава I. Волокнообразующие текстильные материалы на основе целлюлозы и поликапроамнда содержащие биологически активные вещества, используемые для лечения ран различной этиологии (обзор литературы)

1.1. Активация и свойства некоторых волокнообразующих текстильных носителей на основе целлюлозы и поликапроамнда для иммобилизации биологически активных веществ

1.1.1. Получение и свойства диальдегидцеллюлозы

1.1.2. Получение и свойства поликапроамидного носителя активированного глутаровым диальдегидом

1.1.3. Получение поликапроамидного носителя с собственными альдегидными группами

1.2. Получение и свойства ферментов, иммобилизованных на производных целлюлозы и поликапроамида

1.3. Использование нативных и иммобилизованных ферментов для лечения ран различной этиологии

Глава II. Методы и материалы

II. 1. Материалы

II. 2. Методы модификации текстильных носителей. Определение степени модификации носителя

11.3. Определение протеолитической активности по казеину

11.4. Определение ферментативной активности по азоколу

11.5. Определение ферментативной активности по паранит-роанилиду N-бензоил-О, L-аргинина (BzArgNA)

11.6. Определение ферментативной активности по коллагену

Глава HI. Разработка методов оценки функциональных свойств созданных материалов

III. 1. Особенности при работе с иммобилизованными на модифицированных текстильных носителях биологически активными веществами

111.2. Методы определения количества иммобилизованного вещества

111.2.1. Определение количества иммобилизованного белка методом Лоури-Гартри

111.2.2. Определение количества иммобилизованного белка гистохимическим методом Гурвича

111.2.3. Определение количества иммобилизованного белка по спектрам отражения

111.2.4. Определение количества иммобилизованного белка с помощью метода Брэдфорда

111.3. Методы определения ферментативной активности иммобилизованных препаратов

111.3.1. Определение протеолитической активности иммобилизованных препаратов по казеину

111.3.2. Определение ферментативной активности иммобилизован-ных препаратов по азоколлу

111.3.3. Определение амидазной активности иммобилизованных препаратов по BzArgNA

Глава IV. Технологии иммобилизации трипсина на модифицированных текстильных - носителях и исследование свойств полученных иммобилизованных препаратов

IV.1.1. Иммобилизация трипсина на текстильные носители.

Изменение протеолитической активности иммобилизованных препаратов трипсина в процессе хранения

IV.1.2. Действие гамма облучения на препараты иммобилизованного трипсина

IV.2. рН-зависимость протеолитической активности иммобилизованных препаратов трипсина

IV.3. Инактивация иммобилизованного трипсина в модельных растворах,

IV.4. Влияние некоторых физиологически-активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях

IV.5. Токсикологические и фармакологические исследования

IV.6. Технологическая схема производства препаратов 230 иммобилизованного трипсина

Глава V. Разработка технологии.1 получения препаратов иммобилизованных протеолитических комплексов из отходов переработки пищевого сырья на. модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных иммобилизованных композитов

V.I. Иммобилизация на диальдегидцеллюлозе коллитина и исследование свойств полученных иммобилизованных препаратов

V.2. Иммобилизация на различных текстильных носителях протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК) и исследование свойств полученных иммобилизованных препаратов

V.2.1. Иммобилизация ПК на различные текстильные носители.4 Изменение протеолитической активности иммобилизованных препаратовв процессе хранения V.2.2. рН-зависимость протеолитической активности немодифицированного ПК иПК, иммобилизованного на модифицированных текстильных носителях V.2.3. Инактивация ПК и иммобилизованного на текстильных носителях ПК в модельных растворах V.24.4. Влияние некоторых физиологически-активных веществ на протеолитическую активность .немодифицированного ПК и ПК, иммобилизованного на текстильных носителях V.2.5. Влияние белковых ингибиторов, на ферментативную активность немодифицированного ПК и ПК, иммобилизованного' на текстильных носителях

V.2.6. Медико-биологические исследования препаратов 299 иммобилизованного ПК

Глава VI. Разработка технологии получения препаратов иммобилизованного поливалентного • ингибитора протеиназ (ПИП) на модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных препаратов иммобилизованного ингибитора

VI. 1. Взаимодействие трипсина с раствором ПИП 308 VI. 2. Иммобилизация ПИП на текстильных носителях.

Исследование свойств полученных композиций ^ ^

VI. 2.1. .Иммобилизация ПИП на целлюлозе и диальдегидцеллюлозе

VI. 2. 2. Иммобилизация ПИП на поликапроамидном текстильном материале

VI. 3. Определение ингибиторных свойств иммобилизованного

VI. 4. Кинетика взаимодействия раствора трипсина с текстильными носителями, содержащими ПИП VI. 5. Действие у-излучения в стерилизующей дозе на иммобилизованный и кристаллический ПИП

Глава Технико-экономическое обоснование использования

VII. 328 препаратов иммобилизованых ферментов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества"

Попытки использования ферментов в клинической практике предпринимались давно. Еще в VIII веке пытались ускорить заживление кожных язв при помощи желудочного сока. Сок дынного: дерева (содержит такие протео-литические ферменты, как химопапаин, папаин, пептидазу А) использовали в древности для ускорения заживления ран, ожогов, ушибов, а также в качестве косметического средства [1]1 С первой трети 20-гоv столетия началось широкое и целенаправленное, медицинское использование ферментов для терапевтических целей. Однако на пути ферментной терапии выявились серьезные трудности; Дело в том, что вх живом организме ферменты и; физиологически-активные белки часто содержатся внутри клетки; При этом фермент находится в окружении, способствующем поддержанию его нативной структуры, и часто локализован в. непосредственной близости от, других ферментов, перерабатывающих продукт реакции, первого. Ферментные системы взаимодействуют с субстратами через мембрану клетки с помощью различных транспортных механизмов. Если фермент введен непосредственно в организм пациента, он может оказаться в условиях, способствующих его денатурации, и активность фермента будет стремительно снижаться сразу после инъекции или местного применения* раствора фермента [2].

В медицинском, плане можно выделить три основных направления ис-' пользования ферментов: 1) патофизиологическая ферментология, 2) лекарственная ферментология и 3) диагностическая ферментология [3]. Для данной работы наибольший интерес представляют лекарственные ферменты. С учетом основных показаний для их клинического применения они могут быть условно разделены на следующие основные группы [3-6].

1. Ферменты для заместительной терапии. В настоящее время их в основном применяют при дефиците ферментов желудочно-кишечного тракта. Эта группа включает: пепсин, панкреатин, солизим (микробная липаза), со-милаза (микробные амилаза и липаза), панзинорм, фестал,(смесь ферментов поджелудочной железы и желчи) и многие другие [1]. Ведутся работы, по получению лекарственных форм ферментов для терапии наследственных эн-зимопатий.

2. Гидролитические ферменты для терапии заболеваний, требующих лизиса и эвакуации нежизнеспособных или патологически! измененных тканей, экссудата, сгустков крови. С этой целью широко используют протеина-зы (трипсин, химотрипсин, папаин, террилитин, коллагеназу), нуклеазы (ри-бонуклеазу, дезоксирибонуклеазу).

3. Противовоспалительные ферменты. К этой несколько условно выделенной группе принадлежат протеазы, в частности трипсин и химотрипсин,, вводимые внутримышечно, коллазаза и др. Противовоспалительным действием обладает лизоцим. Механизм противовоспалительного действия гидролитических ферментов установлен недостаточно. По мнению Вереме-енко К.Н. [6] парентерально вводимые протеиназы действуют на вазоактив-ные полипептиды типа брадикинина. Химотрипсин, в частности, обладает способностью расщеплять брадикинин с потерей его биологической активности. Можно допустить, что инактивация брадикинина и его аналогов является одним из механизмов, ответственных за противовоспалительное действие протеолитических ферментов. В целом, на основании клинического опыта применение ряда ферментов, особенно протеиназ, в качестве противовоспалительных средств, считается оправданным [2,3].

4. Тромболитические и фибринолитические препараты прямого и опо-средственного действия. К первым принадлежит фибринолизин (плазмин). Другие, например урокиназа, являются активаторами плазминогена крови больного, в результате чего образуется плазмин, оказывающий лечебный эффект [4].

5. Ферменты этиотропного действия: пенициллиназа, лизоцим, нуклеа-зы. Первый используют при возникновении аллергических реакций на пенициллин с целью инактивации антибиотика: Считается, что нуклеазы (ДНК-аза, РНК-аза)-оказывают этиотропное действие при вирусной патологии, а лизоцим - при бактериальной инфекции.

6. Противоопухолевые препараты. Клиническое применение нашла ас-парагиназа, нарушающая метаболизм определенных опухолевых клеток. Аналогичным действием обладают некоторые другие ферменты, целесообразность применения которых, в том числе в сочетании с аспарагиназой сейчас интенсивно исследуется [5].

7. Особую группу составляют "ферменты распространения", среди которых широкое клиническое применение нашла гиалуронидаза (лидаза или ронидаза). Гиалуронидаза вызывает расщепление гиалуроновой кислоты, которая является «цементирующим» веществом соединительной" ткани, до глю-козамина и глюкуроновой кислоты и тем самым уменьшает ее вязкость. Таким образом, гиалуронидаза вызывает увеличение проницаемости тканей и облегчает движение жидкостей в межтканевом пространстве. Действие гиа-луронидазы носит обратимый характер. При уменьшении ее концентрации вязкость гиалуроновой кислоты восстанавливается. Гиалуронидазу применяют при лечении рубцов (ожоговых, послеоперационных, келоидных и др.), при длительно незаживающих ранах и тому подобное. Есть показания для включения гиалуронидазы в комплексную терапию инфаркта миокарда [4].

Различными авторами показано, что смесь ферментов дает лучший результат, чем каждый фермент в отдельности. Синергизм действия смеси ферментов был отмечен* при лечении ожогов, обморожений, воспалительных заболеваний, закупорках сосудов и при онкологических заболеваниях [3-6].

Механизм терапевтического действия* протеолитических ферментов, используемых при лечении гнойно-воспалительных заболеваний, сложен и многосторонен. Он определяется- неполитическим действием (протеиназы являются своеобразным «химическим скальпелем», расплавляют девитали-зированные ткани, и способствуют их отторжению, не повреждая здоровых тканей); способностью сокращать экссудативную фазу воспаления (проникая в воспалительный очаг, они активизируют фибринолиз путем перевода неактивного плазминогена в активный плазмин, который, расплавляя интрака-пиллярные тромбы, восстанавливает микроциркуляцию в стенках раны, улучшает обменные процессы, , что клинически проявляется уменьшением местного воспаления) и снижает, а в ряде случаев и предупреждает аутоток-сические реакции. Кроме того, чрезвычайно важным свойством протеиназ, применяемых в гнойной хирургии, является их способность снижать анти-биотикорезистентность гноеродной флоры и повышать концентрацию антибиотиков в крови и тканях, а таюке их прямое антитоксическое действие. Энзимо- и антибиотикотерапия сочетают в себе патогенетическую и этио-тропную направленности комплексного лечения гнойной хирургической инфекции [3,7].

Однако, несмотря на высокую эффективность применения протеиназ в медицине и других областях, их использование ограничивают следующие факторы: инактивация при« изменении рН и температуры, под действием ингибиторов тканей и крови, антигенные и пирогенные свойства. Нативные ферментные препараты дороги и многие из них дефицитны, что ограничивает / /' их широкое применение. Преодолеть эти недостатки удалось путем использования протеолитических комплексов, а также иммобилизацией ферментов (или комплексов) на различных природных и синтетических носителях [24,7-8].

Иммобилизованные биологически-активные вещества (БАВ) (а среди них и ферменты) на практике в настоящее время используются в основном для следующих целей: аналитические, препаративные или лечебные. Иммобилизованные БАВ являются перспективными средствами медикаментозного лечения вследствие их чрезвычайно высокой биологической активности и специфичности, они не обладают аллергенностью и часто являются более высокоэффективными'средствами по сравнению с традиционными методами лечения [2-4,8].

В настоящее время чрезвычайно большое количество полимерных носителей как на основе природных, так и синтетических полимеров используется для получения иммобилизованных БАВ. Из-за значительного разнообразия используемых БАВ необходимо учитывать взаимное влияние , носителей и БАВ для возможного прогнозирования изменения эксплуатационных характеристик препаратов.

Основной целью данного исследования является разработка методов промышленного получения иммобилизованных биологически-активных веществ (в основном ферментов) для их биомедицинского использования. Главные направления поиска в достижении этой цели - создание модифицированных ферментных производных комбинированного действия т.е. обладающих несколькими видами терапевтической активности) и повышение сродства препаратов к участку поражения (т.е. увеличение селективности их биологического действия). Создание иммобилизованных форм БАВ позволяет существенно продлить время активного функционирования лекарственных веществ в организме за счет их стабилизации, сократить расход применяемых препаратов и облегчить курс терапии. Кроме того, химическая модификация БАВ является удобным и информативным приемом для изучения взаимодействия структуры и функции БАВ.

Работа выполнена в отделе биотехнологии НИИ текстильных материалов в рамках совместных исследований с Российским химико-технологическим университетом им. Д.И.Менделеева, МГУ им. М.В.Ломоносова (Химический факультет, каф. химической энзимологии), Институтом экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ, ГНЦ НИИ лазерной медицины, Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, Московским государственным медико-стоматологическим университетом, Московской государственной текстильной академией им. А.Н.Косыгина, Всероссийским НИИ мясной промышленности, Государственным институтом кровезаменителей и медицинских препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Белов, Алексей Алексеевич

Выводы.

1. Решена важная народнохозяйственная и социальная задача по созданию нового ассортимента текстильных материалов медицинского назначения с заданными лечебными свойствами.

2. Разработаны технологические режимы получения новых раневых покрытий с заданными свойствами, в том числе соиммобилизацией лекарственных веществ разных классов на один носитель с учетом их совместимости и предполагаемого синергизма действия. Получены новые медицинские материалы на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащие биологически активные вещества, и определены их области применения. Создана гибкая универсальная технологическая линия, позволяющая выпускать медицинские изделия на стандартном технологическом оборудовании.

3. Разработаны удобные и достоверные методы определения содержания и активности^ биологически активных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях.

4. Впервые выявлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком хранения в стандартных условиях.

5. Установлено, что разработанные иммобилизованные препараты не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цито-токсическим эффектом и мутагенной активностью.

6. Показано, что в условиях человеческого организма наиболее целесообразно для стабилизации иммобилизованных ферментов использовать комбинацию методов химической модификации и физической сорбции. Такой подход позволяет получать препараты с широким спектром действия.

7. Показано, что лечебный эффект материалов с полиферментными препаратами выше, чем у моноферментных препаратов (при сравнении сроков очищения и полного заживления ран). Кроме того, изделия, полученные на основе полиферментных препаратов, имеют меньшую себестоимость.

8. Иммобилизованные на нерастворимых текстильных носителях ферменты медицинского назначения демонстрируют в медико-биологических испытаниях высокую эффективность действия; применяются (иммобилизованные белки) в малых дозах, не вызывают токсико-алергических реакций, удобны для повседневного использования, как в быту, так и в стационарах или воен-но-полевыхусловиях.

9. В экспериментах на животных показано, что модификация ферментов (иммобилизация на альдегидсодержащие текстильные материалы) не влияет существенно на их каталитические свойства; повышает стабильность в биологических системах. Модифицированные БАВ оказываются более эффективными терапевтическими средствами по сравнению с нативными препаратами при лечении различных заболеваний.

Заключение и выводы.

Одним из наиболее перспективных методов лечения гнойнонекротических процессов является применение иммобилизованных ферментов и лекарственных веществ других классов. Применение иммобилизованного трипсина в клинической практике показало ряд преимуществ перед традиционными методами лечения. Применение трипсина (обычно используют раствор с концентрацией 5-10 мг/мл) в чистом виде ограничивается в связи с его высокой стоимостью, аллергическими реакциями, быстрой инактивацией и др. При применении иммобилизованного на текстильных носителях трипсина потребность в дорогом и дефицитном ферменте сокращается в 50-100 раз. Иммобилизация ферментов и белковых ингибиторов на модифицированные текстильные носители способствует увеличению времени пребывания лекарственного вещества в ране, отсуствию аллергических реакций.

Нами выполнен широкий спектр работ по созданию и исследованию свойств принципиально нового класса медицинских материалов на основе волокнообразующих полимеров, который позволяет сформировать группу новых раневых покрытий и перевязочных материалов в форме аппликаций (салфеток и повязок), бандажей, содержащих целлюлозные волокна с иммобилизованными на них лекарственными препаратами.

Отличительной особенностью таких материалов является то, что биологически активные компоненты химически присоединены к текстильному носителю, имеющему форму перевязочного материала.

Научная оригинальность и практическая ценность выполненных работ подтверждается наличием патентов; которые дают техническую и правовую основу организации5 производства новой группы изделий для оказания медицинской помощи в организациях здравоохранения, оказания само- ^ взаимопомощи при ликвидации последствий аварий и катастроф; формирования аптечек и медицинских комплектов всех уровней. Разработана необходимая НТД на созданные процессы: и полученные препараты. Все изделия разрешены Минздравсоцразвития РФ для использования в клинической практике.

Новые раневые покрытия способны без хирургического вмешательства очищать рану, т. е. лизировать и удалять в прилегающий слой, покрытия нек-ротизированные белки. Вгкачестве активных компонентов в них использованы ферменты и ферментные комплексы (трипсин, иротеолити чески й комплекс из гепатопанкреаса краба), хитозан, антиоксиданты, ингибитор.

На опытном производстве НИИ; Текстильных Материалов освоен в промышленном масштабе выпуск для: нужд; медицины препаратов иммобилизованного трипсина и других; препаратов, с: мощностью 200000 салфеток в месяц. Заявленная потребность 0;5 млн. штук салфеток Дальцекс-трипсина размером 10x10 см в год.

На основании данных, полученных автором и сотрудниками НИИТМ, налажено производство иммобилизованных ферментов на текстильных носителях, на основе модифицированных целлюлозы и поликапроамида.

Библиография Диссертация по биологии, доктора технических наук, Белов, Алексей Алексеевич, Москва

1. Клиническая ферментология. /Под ред. Э. Щеклика. -Варшава, 1966.-467 с.

2. Биотехнологии, кн.8 Инженерная энзимология /И.В.Березин, А.А.Клесов, Н.Ф.Казанская и др. /Под ред. Н.С Егорова, В.Д. Самуилова.- М., 1987. С. 113,123-134,143.

3. Москвичев Б.В., Поляк М.С. Иммобилизованные ферменты. М.-Серпухов, 1992.- 112 с.

4. Максименко А.В. Модифицированные ферменты медицинского назначения с повышенной эффективностью действия: Дис. . д-ра биол. наук. М., 1989— 274 с.

5. Вольф М., Рансбергер К. Лечение ферментами. М.: Мир, 1976.-С. 46-47.

6. Веремеенко К.Н. Ферменты в оториноларингологии.- Киев: Здоровья, 1980. 185 с.

7. Волокна с особыми свойствами. /Под. ред. Л.А.Вольфа.- М.: Химия, 1980.-С. 142-207.

8. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Принципы иммобилизации и новые подходы к использованию ферментов и других физиологически активных соединений в медицине. /Сб. Химическая энзимология / Под ред. И.В. Березина, К. Мар-тинека. -М.: МГУ, 1983. С. 115-153.

9. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. / Под ред. Дж. Вудворда. М.: Мир, 1988.-215 с.

10. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы. /Под ред. И.В.Березина, В.К.Антонова, К.Мартинека. М.: МГУ, 1976. Т.1.—296 с.

11. Кудрявцев Г.И., Носов М.П., Волошина А.В. Полиамидные волокна. -М.:Химия, 1976. С. 63-73.

12. Роговин З.А. Химия целлюлозы. М.: Химия, 1972. - С. 125-244.

13. Malaprade L. Compt. Rend.- 1928 .-Vol. 186.- P. 382.

14. Кричевский Г.Е. Химическая технология текстильных материалов. М, 2000. - С.27-216.

15. Иванов В.И., Леншина Н.Я., Иванова B.C. Об особенностях окисления целлюлозы перйодатом натрия и хлоритом натрия // Изв. АН СССР отд. хим. наук.-1958. №5. С.115-111.

16. Maninder S., Vasudevan P., Ray A.R., Guha S.K. Kinetics of degradation of biosoluble matrix by 14C tagging //Proc. Symp. Ing. Polym. And Radiat., Vallabh Vidyanagar Gujarat. -1979. P.385-390.

17. Rutherford H.A., Minor F.W., Martin A.R. and Harris M. Oxidation of cellulose: the reaction of cellulose with periodic acid //J. of res. of the N. B. S.-1942. -Vol. 29. -P. 131-143.

18. Иванов В.И., Леншин И .Я., Иванова B.C. Влияние пиранозного цикла на кислый гидролиз целлюлозы //Изв. АН СССР, сер. отд. хим. наук. 1960. №6.- С.1136-1138.

19. Кузнецова З.И., Иванов В.И. О влиянии СНО-групп в молекуле целлюлозы на устойчивость ацетальной связи в кислой среде на модельных соединениях // Изв. АН СССР, сер. отд. хим. наук. -1960. №8. С. 2044-2045.

20. Pacsu E. Cellulose studies I. Reaction of oxycellulose with aqueous-acids and alkalizes //Text. Res. J.- 1945. №10. P. 354-361.

21. Яшунская А.Г., Шорыгина H.H., Роговин З.А. Получение препаратов диаль-дегидцеллюлозы и ее эфиров //ЖПХ. 1949. №. - .Т. XXII.- С. 866-873.

22. Reeves R.E. Stabilization of oxidized cotton fiber // Ind. and eng. chem.- 1943. № 1.-V.35. -P. 1281-1283.

23. Reeves R.E., Darby F.F. Stabilization of periodate-oxidized cottonV/Text. Res. J.-1950. №3.- P. 172-174.

24. Димов К.Д., Лалева B.H. Изменение функциональных групп при окислении целлюлозы йодной кислотой //ВМС.- 1967. Т.(А) IX. №8. - С. 1646-1653.

25. Власов Л.Г., Вирник Р.Б. Изучение рассасывающихся текстильных материалов, содержащих иммобилизованные ферменты //Прикл. биохим. и микроб. — 1988. Т. XXIV.- Вып.2. С.264-268.

26. Рыльцев В.В., Вирник Р.Б. Исследование кинетики выделения трипсина, иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе, при гидролитической деструкции // Антибиотики и химиотерапия. — 1989. Т. 34. №3. - С.202-205.

27. Котельникова Н.Е., Петропавловский Г.А. Сравнительное изучение окисления- микрокристаллической и хлопковой целлюлоз надйодной кислотой //Cell. Chem. and techn. 1974. № 8. - P. 203-214.

28. Петропавловский Г.А., Чернова З.Д., Котельникова Н.Е. Полярографическое изучение кинетики частичного окисления микрокристаллической целлюлозы* надйодной кислотой и свойства диальдегидцеллюлозы //ЖПХ. — 1977. №6. -Т.50. С. 1348-1352.

29. Терентьева Э.И., Лебедева Л.Ф., Гусев В.А. и др. О структуре и свойствах микрокристаллической диальдегидцеллюлозы //В сб. Химия и технология древесной целлюлозы. Л. 1983. С. 102-108.

30. Ершов Б.Г., Климентов А.С. Радиационная химия целлюлозы //Успехи хи-мии.-1984. T.LIII. - Вып. 12. - С. 2056-2077.

31. Белов А.А., Гриценко С.И., Рыльцев В.В. Изменение содержания альдегидных групп в образцах диальдегидцеллюлозы после гамма облучения и в процессе хранения: Сб. научн. тр. /ВНИИТГП/.- М.: ЦНИИТЭИ Легпром. 1990.-С. 36-39.

32. Bhatt G., Sundaram V., Iyer V. et. al. Effect of gamma-ray radiation on cellulose with introduction of aromatic nuclei on cellulose molecule. Part II: Benzylated cellulose //Colourage.- 1987.- V. 34.- №6. P. 23-26.

33. Dziedziela W.M., Kotynska D.J. Functional group in y-irradiated cellulose //Radiat. Phys. Chem.- 1984.- V.19. № 3. - P. 723-725

34. Рахманбердыев Г., Мирнигматова Ш., Гафуров Т., Усманов Х.У. Исследование взаимодействия диальдегидцеллюлозы с гидразидом изоникотиновой кислоты//Доклады АН Уз.ССР. 1970. №7.- С. 36-37.

35. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. М.: Академия, 2005.- 472 с.

36. Коршак В.В. и Штильман М.И; Полимеры в процессах иммобилизации- имодификации природных соединений. М.: Наука, 1984. - 261 с.

37. Шагов B.C., Шелих А.Ф., Тихомиров Б.И. Синтез и химические превращения полимерных шиффовых оснований //В кн. Синтез и химические превращения полимеров, JL: ЛГУ. — 1977. Вып. 1.- С. 5-21.

38. Сюткин В.Н., Николаев А.Г., Сажин С.А. и др. Азотсодержащие производные диальдегидцеллюлозы. 1. Диальдегидцеллюлоза высокой степени окисления// Химия растительного сырья. 1999. №2. — С. 91-102.

39. Сюткин В.Н., Николаев А.Г., Сажин С.А. и др. Азотсодержащие производные диальдегидцеллюлозы. 2. Синтез производных диальдегидцеллюлозы с азотистыми гетероциклами // Химия растительного сырья.-2000.№1 — С. 5-25.

40. Децина А.Н. Теория мягких косметологических воздействий. Современная косметология. Новосибирск: ГУЛ ред.-полиграф.объединение СО РАСХН, 2001.- С.

41. Дамберг Б.Э. Реакция меланоидинообразования и ее биологическое значение //Изв. АН Латв. ССР. -1976.№1. -С. 97-105.

42. Cavalcante А.Н.М., Carvalho L.B., Cameiro-da-Cunha M.G. Cellulosic exopoly-saccharide produced by Zoogloea sp. as film suppot for trypsin immobilization //Biochem. Eng. Join. 2006.- V. 29.-P. 258-261.

43. Старкова А.Н. Модификация полиамидного волокна капрон моно и бифункциональными альдегидами и придание ему специальных свойств: Дис. . .канд. техн. наук. Л.:ЛИТЛП, 1972. - 200 с.

44. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты. /Под редакцией И.В. Березина и К. Мартинека. М.: МГУ, 1982. 385 с.

45. Скут Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. / Т.1, 1979. М.: Мир. - С. 392-395.

46. Белов А.А., Рыльцев В.В., Гриценко С.И., Филатов В.Н. Способ получения текстильного поликапроамидного носителя для иммобилизации биологически активных веществ. Положительное решение по заявке 4855929/05/083643 от 31.07.90 г.

47. Толстых П.И., Гостищев В.К., Арутюнян Б.Н., Вирник А.Д. и др., Протеолитические ферменты, иммобилизованные на волокнистых материалах, в хирургии. — Ереван: Айстан, 1990. 137 с.

48. Вольф Л.А. Принцип создания волокнистых материалов с биологической активностью Тез. докл. 3-й симпозиум по физиологически активным синтетическим полимерам и макромолекулярным моделям биополимеров. Рига: Зинатне. 1971. С.63-64.

49. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты /В кн. Биотехнология под ред. А.А.Баева. М.: Наука.-1984.- С. 93-103.

50. Филатов В.Н., Рыльцев В.В. Биологически активные текстильные материалы. -М., 2002.-248 с.

51. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика (практический курс).- М., 1999.- С. 230-235.

52. Лаш Ю., Козлов Л.В., Бессмертная Л.Я., Антонов В.К. Исследования иммобилизованных ферментов физическими методами //Сб. Химическая энзимология. Под редакцией И.В. Березина и К. Мартинека, М.:МГУ, 1983. С. 250-260.

53. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями//Биохимия. 1998.- Т. 63. - Вып. 3. - С. 408421.

54. Константино Г.Р., Швендеман С.Р., Лангер Р., Клибанов A.M. Повреждение препаратов лиофилизированных белков // Биохимия. 1998. - Т.63. - Вып.З. -С. 422-429

55. Миргородская О.А., Полетаева Л.В., Евшичиева Т.А. Оценка реакционной способности аминогрупп белков // Хим.фарм. ж. 1987. - №1. - С. 12-17.

56. Srere P.A. and Uyeda К. Functional group on enzymes suitable for binding to matrices //Methods in enzymology.- N.Y., 1976.- V. XLIV.- part 1. P. 11-19.

57. Flemming Ch., Gabert A., Roth P. Synthese und eigenschaften tragerfixierter enzyme 1. Kovalente bindung von trypsin und dialdehydzelluloze //Acta biol. med. germ.- 1973.- B.30.-S.177-182.

58. Любич Л. С., Власов Г. П., Вольф Л. А. Влияние медиаторов на свойства препаратов трипсина и пепсина, иммобилизованных на вискозном волокне //Прикл. биохим. и микробиол:- 1980. Том XVI.- Вып. 2.- С. 218-221.

59. Хорунжина С. И., Хохлова Б. А., Шамолина И.И., Вольф JI. А. Иммобилизация трипсина на полимерных носителях волокнистой структуры //ЖПХ. — 1978. №3.- С.651-654.

60. Вольф JI. А., Шамолина И.И., Гончарова Н.А. и др. Иммобилизация ферментов на волокнистых носителях //Прикл. биохим. и микробиол.- 1986. Том XXII.- Вып. 5.- С.664-668.

61. Казанская Н.Ф., Айсина Р.Б. Диффузионные эффекты в кинетике действия микрокапсулированных ферментов //Итоги науки и техники, сер. Биологическая химия, т.12, Инженерная энзимология и биоорганический катализ М., 1978.- С.115-139.

62. Назаренко Г.И., Сугурова И.Ю., Глянцев С.П. Рана, повязка, больной. М.: Медицина. 2002. 469 с.

63. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна. 15-е изд. 2006. 1206 с.

64. Толстых Г.П. Новые перевязочные материалы антиоксидантной активностью в лечении гнойных ран: Автореф. дисс. . канд. мед. наук, М., 1995. С. 3-8.

65. Глянцев С.П. Лечение гнойных ран иммобилизованным на текстильной целлюлозной матрице трипсином:.- Автореф. дисс. . канд. мед. наук, Ярославль, 1987. С. 3-8.

66. Туркова Я., Козлов Л.В., Бессмертная Л.Я. и др. Исследование влияния нейтральных матриц на термостабильность иммобилизованных трипсина и хи-мотрипсина //Биоорг. химия. 1980. №1. - Т.6.- С. 108-115.

67. Turkova J., Vajcner J., Vancura D. and Stamberg J. Immobilization on- cellulose in bead form after periodate oxidation and reductive alkylation's //Coll. Czech. Chem. Comm.- 1979.-V.44.- №11.- P. 3411-3417.

68. Вирник А.Д., Скокова И.Ф., Иванова M.B., Юданова Т.Н. Интерполиэлек-тролитная реакция — метод получения ферментсодержащих волокнистых материалов с регулируемым составом и свойствами //Текстильная химия.-1994. №1(5). С. 5-20.

69. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Дронова М:В., Гальбрайх JI.C. Текстильные материалы медицинского назначения с комбинированным биологическим действием: получение и свойства // Текстильная химия. — 1998. №1(13).- С. 96-102.

70. Юданова1 Т.Н. Полимерные раневые покрытия с ферментативным и антимикробным действием // Дис. . д-ра хим. наук, М., 2004.- 329 с.

71. Торчилин В.П., Бобкова А.С., Смирнов В.Н. и др. Иммобилизация ферментов на биосовместимых носителях. I. Иммобилизация а-химотрипсина на модифицированных сефадексах//Биоорг. химия- 1976. №1.- Т. 2.- С. 116-124.

72. Торчилин В.П., Рейзер И.Л., Смирнов В.Н. и др. Иммобилизация ферментов на биосовместимых носителях. III. Иммобилизация а-химотрипсина на растворимых декстранах //Биоорг. химия- 1976. №9.- Т. 2.- С. 1252-1258.

73. Аффинная хроматография. Методы. / Под ред. П.Дин, У. Джонсон, Ф. Мидл, М.: Мир, 1988.-278 с.

74. Epton R., McLaren J.V., Thomas.T.H. // Biochem. J., 1971.- V.123.- p.21.

75. Алиновская B.A. Иммобилизация протеолитических ферментов на модифицированных целлюлозах //Рукопись деп. в ВИНИТИ. № 7308. В88. 1988.-С.155-158.

76. Habeeb A.F.S.A. Preparation of enzymicaly active, water — insoluble derivates of trypsin //Arc. of bioch. bioph. -1967.- Vol. 119. P.264-268.

77. Казанская Н.Ф., Кост O.A., Березин.И.В. Свойства трипсина, модифицированного глутаровым альдегидом //Биоорг. Химия. 1975. №9.- Т.1.- С. 13371344.

78. Habeeb A.F.S.A., Hiramoto R. Reaction of proteins with glutaraldehyde //Arc. of bioch. bioph. 1968. - Vol. 126.- P.16-26.

79. Glassmeyer C.K. and Ogle J.D. Properties of an insoluble form of trypsin //Biochemistry. 1971.- Vol.10.- №5.- P.786-792.

80. Иммобилизованные протеолитические ферменты в лечении гнойно-некротических процессов. /Под ред. Р.И.Салганика и А.С.Когана. Новосибирск: СО АН СССР, Институт цитологии и генетики. 1981.- 139 с.

81. Иммобилизованные протеолитические ферменты и раневой процесс. /Под ред. Р.И.Салганика, А.С.Когана, А.М.Гончара, Л.А.Семеновой. Новосибирск: Наука. 1983.- 265 с.

82. Коваленко Г.А. Иммобилизованные протеолитические ферменты для наружного применения //Хим.-фарм. Ж.- 1998-№4-С. 41-44:

83. Биологически активные перевязочные средства в комплексном лечении гнойно-некротических ран: Методические рекомендации /№ 2000/156. Мин. Здрав. РФ. М., 2000.- 37с.

84. Адамян А.А., Глянцев С.П., Сахаров И.Ю., Саввина Т.В. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica на раневой процесс в эксперименте // Бюлл. эксп. биологии и медицины.-1992. №12.- Т.94.- С.660-663.

85. Сахаров И.Ю., Адамян А.А., Глянцев С.П. и др. Средство для удаления некротических тканей: Патент РФ № 2014086.- 1994.- Бюлл. №11.

86. Glyantcev S.P., Adamyan А.А., Sakharov I. Yu. Crab collagenase in wound debridement // J. Wound Care. 1997. - №1. - P. 13-16.

87. Steven F.S., Al-Habib A. Inhibition of trypsin and chymotrypsin by thiols. Bi-phasic kinetics of reactivation and inhibition induced by sodium periodate addition //BBA.- 1979.- V. 568. №2.- P. 408-415.

88. Мардашев C.P. Биохимические проблемы медицины.- М., Медицина, 1975. -288с.

89. Стручков В.И, Григорян А.В:, Гостищев В.К. и др. Протеолитические ферменты в гнойной хирургии.- М.: Медицина, 1970. — 408 с.

90. Лечение гнойных ран иммобилизованными на текстильной целлюлозной матрице трипсином: Методические рекомендации/ Архангельский государственный медицинский институт, Архангельск, 1985.- 7 с.

91. Рана и раневая инфекция инфекция. Руководство для врачей /Под. ред. М.И. Кузина, Б.М Костюченок.- Ml: Медицина, 1990.- 592 с.

92. Reiser H.G., Patton R., Roetting L.C. //Arch. Surg. (Chicago), 1951.- V. 63.- P. 568.

93. Луцевич Э.В., Иванян А.А., Толстых Г.П., Олтаржевская Н.Д., Рыльцев В.В. Современные раневые покрытия.- Москва-Смоленск, 1996. С. 27-33.

94. Теория и практика лечения ожогов /Под ред. В. Рудовского.- М.: Медицина, 1980.- С. 90-92.

95. Полиферментные препараты в гнойной хирургии: Методические рекомендации / Под ред. член-корр. РАМН Н.А.Ефименко.- М., 2005.- 32 с.

96. Литвин Ф.Е. Коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса камчатского краба; выделение и свойства//Дисс. . канд. биол. наук. М., 1993.- 136 с.

97. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. — М.: Иностранная литература, 1950.- 346 с.

98. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты,- М.: Наука, 1971.- 414 с.

99. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.- М.: Мир, 1983.- 1120 с.

100. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия,- М.: Высшая школа, 1992.416 с.

101. Ленинджер А. Основы биохимии,- М.: Мир, 1985.- С.228-230.

102. Бернхард С. Структура и функция ферментов.- М.: Мир, 1971. С. 162-171.

103. Франклин Т., Сноу Дж. Биохимия антимикробного действия.- М.: Мир, 1984.- С.60-65.

104. Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И., Филиппова Н.Ю и др. Активные формы бычьего трипсина. N-концевой анализ и реакционная способность // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. Химия.- 1977. №3.- Т. 18.- С. 299-304.

105. Соловьева Н. И. Коллагеназы различного происхождения и их роль в деструкции коллагена в норме и патологии: Автореф. дисс. . докт. биол. наук, М., 1991.- 37 с.

106. Белова Л.А. Специфическая плазмосорбция протеиназ на иммобилизованном, на сефарозе кислотостабильным ингибиторе из мочи человека при остром панкреатите в эксперименте и клинике// Дисс. . канд. биол. наук. М., 1988.- 145 с.

107. Mandl I. //Adv. Enzymol. 1961.- V. 23.- p. 103.

108. Mandl I., MacLennan J.D., Howes E.L. et.al. Isolation and characterization of proteinase and collagenase from CI. Histolyticum //J. Clin. Invest.- 1953.- Vol.32.-P. 1323-1329.

109. Keil-Dluha V. Chemical characterization and study of the autodigestion of rure collagenase from Achromobacter iophagus //Biochem. Biophis. Acta. 1976.-V.429.- P. 239-251.

110. Веремеенко K.H. Применение протеолитических ферментов в медицине //Врач, дело.- 1959.-№12.- С. 1269-1276.

111. Queen D., Evans J.H., Gaylor J.D.S. et. al. Burn wound dressing a review //Burns.- 1987.- Vol.13.- №3.- P.218-228.

112. Brennan S.S., Leaper D.J. The search for an ideal wound dressing //Bristol med.-chir. J.- 1984.- № 7.- P.77-79.

113. Плате H.A., Васильев A.E. Физиологически активные полимеры М.: Химия, 1987. - С. 296.

114. Толстых П.И., Дербенев В.А., Белов А.А. и др. Лечение гнойных ран и язв различного генезиса с использованием терапевтических систем иммобилизованного трипсина./Пособие для врачей. М., 2005.- 14 с.

115. Atiyeh B.S., Ioannovich J., Al-Amm C.A., El-Musa K.A. Management of acute and chronic open wounds: the importance of moist environment in optimal wound healing //Cur. Pharm. Biotech.- 2002.- Vol.3.- № 3.- P. 179-195.

116. Росс P. Заживление ран / Молекулы и клетки. М.: Мир.- 1970.- Вып.5.- С. 134-152.

117. Писаренко Л.В., Игнатов Г.Г., Анфилов В.В. О некоторых медико-биологических свойствах хитозана Тез. докл. 7-ой Межд. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». СПб. 2003. С. 187-189.

118. Штильман М.И. Полимеры в биологически активных* системах. //Соросовский образовательный ж.- 1998, №5.- с. 48-53.

119. Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., Савилова Л.Б. Текстиль и медицина. Перевязочные материалы с пролонгированным лечебным действием. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева).- 2002.- т. XLVI.- №1.-с. 133-141.

120. Белов А.А. Влияние-текстильного носителя на свойства иммобилизованных биологически активных веществ // В сб. Трудов посвященному 10-летию Международной и Российской инженерных академий, М., 2000. С. 68-77.

121. Возможности ферментативного очищения и лечения ран.// В кн: Доклады, представленные на* симпозиуме, проходившем в г. Москве 7 июня 1977 г., Плива, Загреб, СФРЮ, 1978. 92 с.

122. Воронкова О.С. Некоторые закономерности разрушения поликапроамида в живом организме: Дисс. канд. мед. наук. М., 1971. — 121 с.

123. Применение косметического средства ФЕРМЕНКОЛ для профилактики и коррекции рубцов кожи: Методические рекомендации практикующим косметологам. / Под ред. Д.м.н. Парамонова Б.А. С. Петербург.-2005.- 24 с.

124. Eriksson Е. Research directions in wound healing //Contemp. Surg. Suppl.- 2000.-Sept.- P. 28-30.

125. Feldman L. Which dressing for split-thickness skin graft donor sites? //Ann. Plast. Surg.- 1991.- Vol.27.-P. 288-291.

126. Московская международная конференция «Биотехнология и медицина»: Материалы конф. М., 2005.- 344 с.

127. Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов: Тез. докл. IV Междун. конф. М., 2001 .- 256 с.

128. Muzzarelli R.A.A. Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone // Carbohyd. Pol. -2009.-V.76.-P. 167-182.

129. Филатов H.B. Новые раневые покрытия с антиоксидантной и протеолитической активностью в лечении гнойных ран: Дисс. канд. мед. наук, М., 2004. — 134 с.

130. Бурмако В.В. Новые раневые покрытия с протеолитической и бинарной антиоксидантной активностью в лечении гнойных ран: Дисс. канд. мед. наук, М., 2003.-165 с.

131. Толстых М.П., Луцевич О.Э., Медушева Е.О. и др. Теоретические и практические аспекты заживления ран.- М.: Дипак, 2007. 96 с.

132. Справочник по аналитическому контролю в производстве искусственных и синтетических волокон.- М. 1957.-С.42-49.

133. Белов А.А., Гриценко С.И., Белова Е.Н. Применение простых аналитических реакций в контроле производства трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях Сб. научн. тр. /ВНИИТГП М.: ЦНИИТЭИ Легпром, 1991.- С.42-48.

134. Кузнецова З.И. Определение функциональных групп в целлюлозе // в сб. Методы исследования целлюлозы.- Рига.: Зинатне, 1981.- С. 212-221.

135. Каверзнева Е.Д., Салова А.С. Специфический метод определения карбонильных групп в оксицеллюлозах //Ж. Анал. Химии.- 1953. №6.- Т.8.- С.365-369

136. Kunitz М. Crystalline soybean trypsin inhibitor // J.Gen.Physiol.- 1947.- Vol.30.-№-1.- P.291-310.

137. Белов А.А., Рыльцев В.В. рН-зависимость активности трипсина, иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе Сб. научн. тр. / ВНИИТГП "Новые разработки в области производства текстильных изделий медицинского назначения", М.:ЦНИИТЭИ Легпром, 1989.- С. 50-54.

138. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Методы определения протеолитической активности в промышленных образцах препаратов иммобилизованных протеиназ //Хим.-фармацевт. журн.- 1992. №.11-12. С.101-103.

139. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The* preparation and4 properties of two new chromomeric substrates of trypsin //Arch. Biochem. Biophys.- 1961.- №2.-Vol.95-P. 271-278.

140. Шатерников B.A. Методы определения активности трипсина в сыворотке крови /Биохимические методы исследования в клинике./ Под ред. Покровского А.А.- М.: Медицина, 1969.- С. 206-209.

141. Moore S., Stein W.H. Photometric nynhydrin method for use in the chromatography of amino acids//J. Biol. Ghem.- 1948.- Vol. 176.- P. 367-388.

142. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П.,, Харитонов Ю.Я. Валидация аналитических методов // Ж. Фармация.- 2006.- №4.- С.7-10.

143. Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В. Хроматография биополимеров на макропористых кремнеземах.- Ленинград: Наука ЛО. — 1986.- С. 63.

144. Тривен М.-Иммобилизованные ферменты.-М.: Мир.- 1983.- 216 с.

145. Белов А.А., Плеханова Н.Ю., Вирник Р.Б., Игнатюк Т.Е. Сравнительная оценка методов определения количества трипсина, иммобилизованного на текстильных материалах : Сб. научн. тр. /ВНИИТГП М.: ЦНИИТЭИ Лег-пром, 1988.- С.25-29.

146. Белов А.А., Гриценко С.И., Таршиц Д.Л., Рыльцев В.В. Определение количества белка на текстильных носителях. // Сб. научн. тр. НИИТМ М.: ЦНИИТЭИ Легпром, 1992.- С.22-27.

147. Lowry Н.О., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem.- 1951.- Vol.193.- № 1.- P.265-275.

148. Hartree E. F. Determination of protein: A modification of the method that gives a linear photometric response //Analyt. Biochem. 1972.- Vol. 48.- №2.- P. 422427.

149. Дичювене А.А., Песлякас И.И., Дагене М.И. и др. Определение количества белка, иммобилизованного на нерастворимом носителе //в Методы в биохимии (материалы ко второму съезду биохимиков Литовской ССР) Вильнюс 1975.- С. 13-17.

150. Загребельный С.Н., Пупкова В.И. Количественные методы определения белка // Рукопись, депонирована от 1.02.84 N174 МБ-Д84. Новосибирск, 1983.- 90 с.

151. Гурвич А.Е. Количественное определение содержания антител при помощи белковых антигенов, фиксированных на бумаге //Биохимия.- 1957. Т. 22.-Вып. 6.- С. 1028-1034.

152. Bradford М. М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem.- 1976. Vol.72.- №1.- P. 248-254.

153. Protein-assay reagent and method. Patent USA 4.023.933.1.structions for the BIO-RAD protein assay. W. Germany, 1990, p. 1-18.

154. Гаспаров B.C., Дегтярь В.Г. Определение белка по связыванию с красителем Кумасси бриллиантовым голубым G-250 //Биохимия.- 1994.- Т.59.- вып. 6.-С.763-777.

155. Кондакова Н.В., Бошко Г.В., Коржова Л.П. и др. Оценка различных количественных методов определения белков, нативных и обработанных формальдегидом // Вопр. мед. химии.- 1983.- Т.29,- Вып.2.- G. 134-140.

156. Belov A.A., Ignatyuk Т.Е., Ryltsev V.V. The use of Bredford method for the analysis of textile biomaterials. Тез. докл. 2 Национальная конференция "Био-материали", Варна, НРБ.- 1990.- S.102-103,176-177.

157. Шишкин^ С.С. Использование связывания красителей для количественного определения содержания* белка в растворах (обзор) // Вопр. мед. химии.-1982.- Т.28.- Вып. 5.- С. 134-141.

158. Гайда А.В., Монастырский В.А., Магеровский Ю.В., Даныш Т.В. Способ определения фибринолитической активности А.с. 1255641 А1 СССР, (От-крытия.-1986.- N 37).

159. Раменский Е.В. Роль анилидов в изучении протеиназ //Успехи биологической химии, М.: Наука. 1972.- Т. XIII.- С. 28-48.

160. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Способ получения целлюлозных материалов содержащих иммобилизованный трипсин. А.С. СССР от 24.11.89, №-1773067, Решение от 01.07.92.

161. Белов А.А., Гриценко С.И., Рыльцев B.B., Рушайло Б.Е. Кинетика инактивации трипсина иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе Сб. научн. тр. /НИИТМ М.: ЦНИИТЭИ Легпром, 1992.- С.27-30.

162. Белов А.А., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Исследование некоторых свойств коллитина Сб. научн. тр./ НИИТМ М.: ЦНИИТЭИ Легпром,-1993.- С.34-37.

163. Белова А.Б., Можаев В.В., Левашов А.В. и др. Взаимосвязь физико-химических характеристик органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам // Биохимия.- 1991.- Т.56. -Вып. 11.- С. 1923-1945.

164. Хургин Ю.И., Максарева Е.Ю. Изучение твердофазных ферментативных реакций. III. Необратимая инактивация а-химотрипсина бензилсульфонил-фторидом. // Биоорганическая химия. -1991.-Т. 17.- №1.- С.76-80.

165. Хургин Ю.И., Максарева Е.Ю. Твердофазные ферментативные реакции. IV. Гидролиз Р-индолилакрилоил-а-химотрипсина // Биоорганическая химия. 1993.-Т. 19.- №10.- С.961 -967.

166. Максарева Е.Ю., Хургин Ю.И. Твердофазные ферментативные реакции. V. Сравнение каталитических свойств субтилизина и а-химотрипсина в отсутствие растворителя // Биоорганическая химия. 1995.-Т.21.- №1.- С.24-27.

167. Государственная * фармакопея СССР. XI. Выпуски 1,2. Репринтное издание Министерство здравоохранения Российской федерации, М.- Медицина, 1998.

168. Андерсон А.А., Гладких С.П., Лебеденко В.Я. Прогнозирование сроков годности лекарственных форм. Под ред. проф. А.И.Тенцовой. М.- Мин.Здрав. СССР, I Мед. ин-т, 1977.- 52 с.

169. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре И-42-2-82, М. МинЗдрав СССР Мин. Мед. пром., 1983.- 13 с.

170. Сапежинский И.И. Биополимеры: кинетика радиационных и фотохимических превращений. М.: Наука, 1988.- 215 с.

171. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов.- М.: Высшая школа, 1989.- 199 с.

172. Тяги Р., Гупта М.Н. Использование химической модификации и химического сшивания для стабилизации белков (ферментов) //Биохимия.- 1998.- Т.63, Вып.З.- С. 395-407.

173. Sluyterman L.A.E., De Graaf M.J.M. The activity of papain in the crystalline state // Biochim. bioph. acta.- 1969.- Vol.171.- P. 277-287.

174. Игнатюк Т.Е., Белов А.А., Рыльцев B.B. Исследование свойств трипсина, иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе различной степени окисления Сб. научн. тр./ВНИИТГП. М.: ЦНИИТЭИ Легпром.- 1989.- С. 46-50.

175. Любич Л.С., Власов Г.П., Вольф Л.А. Иммобилизация папаина на вискозных и капроновых волокнах //Хим. волокна.- 1979. №5.- С. 32-33.

176. Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н., Березин И.В. Общие закономерности изменения термо стабильности белков и ферментов после модификации их функциональных групп // Успехи химии.- 1984.- Т. LIIL- вып. 11.- С. 1852-1890.

177. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.- М.: МГУ, 1976.- С. 65-70, 249-252.

178. Trantshold I, Werle E Spectrophotometrishe bestimmung des kallikreins und seiner inaktivatoren // Hoppe-Seyler's Z.physiol.Chem.- 1961. B.325. - № 1-2. -S.48-59.

179. Grunwald P., Hansen K., Murr T. et. al. The effect of additional protein on enzymethimmobilization //Тез. Докл. 20 Meeting of the FEBS.- Budapest, Hungary.-1990.- P. 354.

180. Осипов Б., Ракитская Г.А., Трофимов В.И. Актуальные вопросы радиационной стерилизации (практика применения в медицинской промышленности) //Химико-фармацевтическая пром-ть обзорная информация.- М. 1984,- Вып. 9.-С. 2-9, 12-13,18-23.

181. Burczak К., Pekala W. Radiation sterilization of cellulose dressing materials //Polymers in medicine.- 1979. №1.- Vol. XI.- P.3-17.

182. Угарова H.H. Стабилизация растворимых и иммобилизованных ферментов путем химической модификации фермента или носителя Сб. /Итоги науки и техники/ под ред. B.JI. Кретовича и И.В. Березина сер. биологическая химия М.- 1978.- Т.12.- С. 92-114.

183. Рыльцев В.В., Вирник Р.Б., Добвий Е.Б., Филатов В.Н. Превращения свободных радикалов в у-облученных ферментах при длительном хранении // Радиобиология. 1988. Т. XXVIII.- вып.5. - С. 584-587.

184. Вирник Р.Б., Рыльцев В.В., Власов Л.Г. и др. Влияние длительного хранения на иммобилизованный трипсин, подвергнутый действию у-стерилизации // там же. 1985.- Т. XXV. вып.1-. С 106-108.

185. Рыльцев В.В., Власов Л.Г., Самойлова Т.Н. и др. Влияние гамма-облучения на иммобилизованный трипсин // Прикладная биохимия и микробиология. 1984.- Т. XX.- вып.5. -С. 694-698.

186. Вирник Р.Б., Рыльцев В.В., Власов Л.Г. и др. Действие у-облучения на трипсин, иммобилизованный на диальдегидцеллюлозе // там же. 1983. Т. XIX. -вып.4. - С. 533-536.

187. Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Медушева Е.О. и др. Свойства лизоцима, иммобилизованного на целлюлозном и поликапроамидном носителе //Хим.-фарм. Журнал.- 1989. № 7.- С. 868-870.

188. Белов А.А. Влияние физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильные носители: Сб. научн. тр. /ФГУП НИИТМ М.: Дипак, 2006.- С.12-28.

189. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Кузьмина И.В. Новый текстильный ранозаживляющий материал с полиферментной активностью: Сб. научн. тр./ ФГУП НИИТМ М.: Дипак, 2006.- С.34-42.

190. Кольцова С.В. Влияние электростатических взаимодействий на формирование и свойства растворимых гетеробелковых коньюгатов на основе протео-литичеких ферментов //Биоорг. химия 1995.- Т. 21.- №6,- С.408-420.

191. Панова А.А., Левицкий В.Ю., Можаев В.В. Нативный, модифицированный и иммобилизованный химотрипсин в хаотропных средах. Пределы стабилизации //Биоорг. химия.- 1994.- Т. 20.- №7.- С.809-816.

192. Козлов Л.В. Термодинамические основы стабилизации иммобилизованных ферментов // Биоорг. химия.- 1980. № 8.- Т.6.- С. 1243-1254.

193. Грунин Ю.Б., Гордеев М.Е. Возможность изучения микроструктуры целлюлозы модифицированными физико-химическими методами: Тез. докл. «Ме- . тоды исследования целлюлозы».- Рига, 1988,- С. 267-268.

194. Толстых П.И., Герцен А.В., Белов А.А. и др. Способ лечения трофических язв. А.С. № 1598269 от 13.05.88. Решение от 08.06.90.

195. Пронин В.И., Рыльцев В В., Белов А.А. и др. Способ получения средства» для лечения эрозивно-язвенных образований внутренних органов. А.С. № 4635886/14 от 24.01.89. Решение от 24.08.90.

196. Толстых М.П., Дербенев В.А., Бехер Ю.В. и др. Стимуляция изаживления и профилактика нагноений после операционных ран М.: Дипак, 2007, 92 с.

197. Заец Т.Л., Завьялов С.К. Влияние лизирующих веществ на отторжение некротических участков тканей при глубоких ожогах // Вестн. АМН СССР.-1961.- Т.16.- Вып. 6. С.- 12-16.

198. Бернхард С. Структура и функция ферментов.- М.: Мир, 1971. С. 162-171.

199. Мосолов B.B. Влияние жирных кислот и мочевины на эстеразную активность и структуру трипсина //Биохимия.- 1965.- Т. 30.- Вып. 3.- С. 597-604.

200. Delaage М., Lazdunski М. Trypsinogen, trypsin, tiypsin-substrate and tiypsin-inhibitor complex in urea solutions // European J. Biochem.- 1968.- Vol.4.- № 3.- P. 378-384.

201. Gabel D. The denaturation by urea and guanidine chloride of trypsin and N-acetylated-tiypsin derivatives bound to sephadex and agarose //European J. Biochem.- 1973.- Vol.33.- № 2.- P. 348-356.

202. Новиков В.Е., Ковалева J1.A., Лосенкова С.О., Климкин Е.И. Фармакология антиоксидантов на основе 3-оксипиридина //Вестн. Смоленской Гос. Мед. академии, 2004.

203. Промоненков В.К., Бурмак В.В., Медушева Е.О., Белов А.А. и др. Способ получения перевязочного материала Патент РФ №2203684.- Бюлл. № 13 от 10 мая 2003г.

204. Толстых П.И., Клебанов Г.И., Шехтер А.Б. и др. Антиоксиданты и лазерное излучение в терапии ран и трофических.- М. 2002 .- 239 с.

205. Даниленко М.В., Павловский М.П., Бойко Н.И. и др. Лечение гнойных ран димексидом //Хирургия.- 1980. №.11,-С.8-17.

206. Методические рекомендации по приготовлению, анализу и использованию лекарственных препаратов. М.: Всесоюзное информационное бюро.- Вып. 5, 1986.- С. 8-10.

207. Ереемев Н.Л. Регуляция активности иммобилизованных ферментов фазовым переходом полимерной матрицы-носителя // Автореф. дис. . д-ра хим. наук. М., 2003.-54 с.

208. Белов А.А Действие водных растворов диметилсульфоксида на ^модифицированные и иммобилизованные ферменты // Хим. Технология.- 2004. №12.- С.35-40.

209. Клячко Н.Л., Богданова Н.Г., Мартинек К., Левашов А.В. Замена воды на водно-органическую смесь в системах обращеных мицелл — путь к повышению эффективности ферментативного катализа // Биоорг. химия.- 1990. № 5.-Т.16.- С. 581-589.

210. Кришталик Л.И., Титова Г.Е., Тополев В.В. Влияние диэлектрических свойств растворителя на скорость триптического гидролиза // Биоорг. химия.-1991. № 1.- Т.17.- С. 66-75.

211. Тимченко А.А., Киркитадзе М.Д., Потехин С.А. и др. Частично развернутое состояние лизоцима с развитой вторичной структурой в диметилсульфоксиде // Биоорг. химия.- 1996. № 6.- Т.22,- С.420-424.

212. Бычихин Н.П., Власов Л.Г., Глянцев С.П. и др. Лечение гнойных ран трипсином, иммобилизованным на текстильном целлюлозном носителе //Клиническая хирургия.-1986.-№1.- С. 51-54.

213. Гриншпан Д.Д. Неводные растворители целлюлозы. Минск.: Университетское .- 1991.- С.191-195.

214. Дербенев В.А. Первичный шов гнойной раны, обработанный углекислот-ным лазером (клиническое исследование): Автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 1983.- 24 с.

215. Kaplan J., Sharon U., Ger R. The carbon-dioxide laser in clinical surgery /Laser applications in Med. of Biol.- N.Y.-London, 1974.- P. 295-308.

216. Гостищев B.K., Вертьянов B.A., Новоченко A.H. и др. Низкоинтенсивное лазерное излучение при лечении гнойных ран //Советская медицина.- 1986, №12.- С. 102-103.

217. Стекольников Л.И., Рыльцев В.В. // Препараты из животного сырья для использования в медицинской практике и их иммобилизация на текстильных носителях.- М.: ЦНИИТЭИ ЛегПром, 1992.- С.-48.

218. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н и др., Способ получения перевязочного материала, содержащего фермент.- А.С. №-1683323 от 20.06.89 . Решение от 08.06.92.

219. Белов А.А., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Исследование некоторых свойств коллитина: Сб. научн. тр. /НИИТМ М.: ЦНИИТЭИ Легпром.-1993.- С.34-37.

220. Белов А.А., Белова JI.A., Рыльцев В.В. и др. Влияние у-облучения на ферментативную активность коллалитина в процессе хранения // Радиобиология.- 1990, №-4.- Т.ЗО.- С. 519-521.

221. Belov A.A., Filatov N.V., Filatov V.N., Ryltsev V.V., Medusheva E.O. Crillase immobilization on textile carriers // Тез. докл. 6-th Internal. Congress on Wounds, Burns and Dressings, IWA Tel-Aviv, 2000.

222. Belov A.A., Filatov N.V., Filatov V.N., Ryltsev V.V., Donskikh GN Preparation and properties of krillase immobilized on dialdehidecellulose //Тез. докл. In-ternat. conf. BIOCATALYSIS-2000 : fundamentals & applications.- Moscow, Russia.- 2000.- P 72.

223. Белов А.А. Текстильные материалы, содержащие различные протеолитические комплексы : Тез. докл. V симпозиум "Химия протеолитических ферментов",-М., 2002 .- С. 132.

224. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н. и др. Иммобилизация и исследование свойств протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба: Тез. докл. 1-й межд. Конгресс "Биотехнология — состояние и перспективы развития".-М.,2002.- С.72.

225. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н. Медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, и способ ее получения. Патент РФ №2323748 от 21.02.06 положительное решение от 10.05.08.

226. Неклюдов А.Д., Бабурина М.И., Куликова Е.Ю и др. Коллагеназная активность ферментного препарата из поджелудочной железы свиней // Хим.-фарм. ж.-1991.- Вып. 4.- С. 65-68.

227. Яровая Н.Ф. Влияние коллагеназных препаратов на стареющую кожу: //Автореф. дис. канд.мед.наук М., 1986.- 14 с.

228. Толстых П.И., Игнатюк Т.Е., Гостищев1 В.К. Морфологическое изучение действия на экспериментальную гнойную рану ферментов, иммобилизованных на текстильных материалах //Бюлл. эксп. биол. и медицины.- 1994. № 9.Т. LXVIII.- С. 323-325.

229. Cawston Т.Е., Tyler J.A. Purification of pig sinovial collagenase to high specific , activity//Biochem. J.- 1979.- V. 183.-№3.-P.-647-656.

230. Kang S.-H. An improvement in the Hummel chymotrypsin assay //Anal. Biochim.-1973.-Vol. 54. №1. - P. 262-265.

231. Vesser L., Blout E.R. The use of p-nitrophenyl-N-tretbutil-oxycarbonyl-L-alaninate as substrate for elastase // Biochem. Biophys. Acta. 1972,- Vol.268. -№ 1. - P. 257-260.

232. Eizen A.Z., Henderson K.O., Jeffrey J.J., Bradshaw R.A. A collagenolytic protease from the hepatopancreas of the fiddler crab, Uca pugilator. Purification and properties//Biochemistry.- 1973.-Vol.12.- №9.- P. 1814-1822.

233. Eizen A.Z., Grant G.A., Bradshaw R.A. Collagenolytic protease from Fiddler Crab (Uca pugilator) / Methods in Enzymology.- 1981.- Vol. 80.- P. 722-734.

234. Климова О.А., Чеботарев В.Ю. Коллагенолитический комплекс протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба: разделение на индивидуальные компоненты // Бюлл. эксп. биологии и медицины.- 1999. № 9.- Т 128.- С. 308-313.

235. Климова О.А., Чеботарев В.Ю. Коллагенолитический комплекс протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба: энзимологические свойства индивидуальных компонентов //Бюлл. экспер. биологии и медицины.- 1999. №10.- Т. 128.- С. 391-396.

236. Руденская Г.Н., Исаев В.А, Степанов, В.М. и др., Выделение и свойства сериновой протеиназы PC камчатского краба Paralithodes Camtschatica про-теолитического фермента широкой специфичности // Биохимия.- 1996. №6.-Т. 61.- С. 1119-1132.

237. Сахаров И.Ю., Джунковская А.В. Эластаза из гепатопанкреаса камчатского краба//Биохимия.- 1993. №9.- Т. 58.- С. 1445-1452.

238. Рыльцев В.В., Белов А.А., Игнатюк Т.Е. и др. Влияние радиационной стерилизации на активность коллагеназы краба //Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов. Тез. Докл. Всесоюз. совещания. -Владивосток, 1988.- С.13-15.

239. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина // Хим. волокна.-1992., №4.- С. 33-34.

240. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н. и др. Использование хитозана для придания текстильным носителям специальных свойств // II Межд. научно-техн. конф. "Текстильная химия-2004", г. Иваново 7-9 сент. 2004, С.-131.

241. Белов А.А.,Филатов В.Н., Белова Е.Н. Новый текстильный ранозаживляю-щий материал с мультиферментной активностью — "Мультиферм" //Московск. межд. конференция "Биотехнология и медицина", Москва 14-17 марта, 2006, С. 209-210.

242. Белов А.А., Кузьмина И.В., Белова Е.Н. и др. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба для медицинских целей. //Тез. докл., VI симпозиум "Химия протеолитических ферментов" М. 2007- С. -147.

243. Ильина А.В., Варламов В.П. Энзимология синтеза и деградации хитина и хитозана / В кн. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение.- М.: Наука, 2002.- С. 79-90.

244. Марквичева Е.А. Хитозан И! его производные в биоинкапсулировании /там же.-С. 315-326.

245. Сливкин А.И., Лапенко В.Л., Арзамасцев А.П., Болгов А.А. Аминоглюканы в качестве биологически активных компонентов лекарственных средств (Обзор за период 2000-2004 г.). //Вестник ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация. 2005.-№2.-С. 73-87.

246. Прохоренков В.И., Большаков И.Н., Борголкова М.Г. //сб. тез. Материалы 6"ои Международной конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Москва-Щелково. 25-27 октября 2001. Изд. ВНИРО.- С.223-225.

247. Гороховцева Н., Макушка Р. Синтез и исследование О-полиэтилен-гликолированого хитозана // В сб. Материалы 7"ои Международной конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». С-Пб-Репино. 15-18 сентября 2003. Изд. ВНИРО. С. 301-303.

248. Sugimoto M. et. al. Carbohydrate Polymers, 1998, 36, P. 49-59.

249. Сливкин A.M., Лапенко В.Л., Болгов A.A. Синтез лекарственных аналогов хитозана. //Вестник ВГУ. Сер. Химия, биология. Фармация. 2005.-№2.-С. 205-208.

250. Цыган В.Н., Жоголев К.Н., Никитин В.Ю. Хитозан как фармацевтик //Рынок Б АД, №2(4) апрель (май),2002.

251. Материалы 6"ои Международной конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Москва-Щелково. 25-27 октября 2001. Изд. ВНИРО. 399 с.

252. Материалы 7"ои Международной конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». С-Пб-Репино. 15-18 сентября 2003. Изд. ВНИРО. 446 с.

253. Материалы 8~оп Международной конф. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Казань. 14-19 июня 2006. Изд. ВНИРО. С.

254. Грядских Д.А. Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлениичумных иммунобиологических препаратов. //Дисс. к.б.н, Ставрополь,2004, С. 153.

255. Нестеренко Е.А., Казанская Н.Ф., Кост О.А. и др. Гидролиз азоальбумина субтилизином Bacillus Subtilis. 7Т //Приют, биох. и микробиол. 1981.- Т. XVII,- Вып. 6.- С. 870-874.

256. Новиков В.Ю., Мухин В.А. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопанкреаса камчатского краба- Paralithodes camtschaticus //Прикл. биох. и микроб.- 2003;-Т.39.- № 5.- С. 530-535.

257. Рысакова К С., Новиков В JO:, Мухин В.А., Овчинникова С.И: Обнаружение хитинолитической активности в пищеварительных органах гидробионтов Баренцева моря //Вестник МГТУ.- 2006.- Т.9.- № 5.- С. 785-790.

258. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е. Влияние денатурирующих факторов на стабильность коллагенолитической протеазы А краба // Биохимия.- 1989. №11.-Т. 54.- С. 1913-1918.

259. СахаровИЮ., Литвин Ф.Е. Стабильность изофермента С коллагенолитической протеазы краба Paralithodes Camtschatica//Биохимия.- 1994. №2.- Т. 59.-С. 246-250.

260. Андреенко Г.В., Лютова Л.В., Руденская Г.Н. и др., Фибринолитические и тромболитические свойства препарата морикразы // Вопросы мед. химии.-1994.- Т. 40.- ВыпЗ.- С. 43-46.

261. Инсарова И.Д., Замараева Т.В., Мазуров В.И. Коллагеназы животного происхождения//Вопр. мед. химии.- 1979.-В.1.- Т. XXIV.- С. 3-15.

262. Метелица Д.И., Еревин А.Н. Кинетические аспекты необратимой термической инактивации ферментами //Успехи химии 1987.-тХУ1.-вып.11 С. 1921-1948.

263. Мухин В.В., Новиков В.Ю., Рысакова К.С. Свойства хитинолитических ферментов гепатопанкреаса краба Paralithodes Camtschatica //Прикл. бихим. и микробиол. 2007.-Т.43 .-№2.- С. 178-183.

264. Мухин В.В., Новиков В.Ю. Протеолиз и протеолититческие ферменты в тканях морских безпозвоночных животных / Мурманск: ПИНРО.-2002.- с.118.

265. Сахаров И.Ю. Выделение и исследование ферментов из морских организмов и некоторые аспекты их применения // Автореф. дис. докт.хим.наук М., 1992. с. 47.

266. Chen Y.L., Lu P.J., Tsoi I. //Сотр. Biochem. Physiol. 1991.- V. 100B.- №4. -P. 763-768.

267. Руденская Г.Н. Коллагенолитические протеиназы членистоногих //в сб. тез. док. VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов», М., 2007.- С. 29.

268. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей //Биомед. химия 2009.-Т.55, №1. С — 61-67.

269. Ларионова Н.И. Нативные и иммобилизованные беловые ингибиторы протеиназ для биомедицинского использования: Автор, дисс. . докт. хим. наук. М., 1991.- 57 с.

270. Казанская Н.Ф. Ингибиторы — факторы регуляции протеолиза // Биоорг. хим. 1994.- Т. 20.- №5.- С. 485-491.

271. Линденбаум Г.М., Терешин И.М. Изучение взаимодействия ингибиторов сыворотки крови человека с нативными и модифицированными декстранами протеиназами — террилитином и трипсином // Биохимия.- 1978.- Т. 43.- Вып. 12.-С. 2143-2149.

272. Линденбаум Г.М., Богачева Т.И., Миргородская О.А. и др. Изучение некоторых физико-химических и энзиматических свойств полимерных производных трипсина на основе декстрана //Прикл. биохим. и микробиология.- 1977.-T.XIII.- Вып.5.- С.685-692.

273. Адамян А.А., Глянцев С.П., Сахаров И.Ю., Саввина Т.В. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica на раневой процесс в эксперименте // Бюлл. эксп. биологии и медицины.-1992. №12.- Т.94.- С.660-663.

274. Веремеенко К.Н. Ингибиторы протеолиза — защитные белки крови // Врачебное дело.- 1987. № 5.- С. 45-48.

275. Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. Метод определения агАТ и 0С2-МГ в сыворотке крови человека в норме и при некоторых патологических состояниях //Вопр.мед.химии.-1979. №4.- Т .25.- С.494-498.

276. Werle Е., Zickgraf-Rtidel G. Natural proteinase inhibitors. Distribution, specificity, mode of action, and physiological significance.// Z.klin.Chem.und klin Biochem.-1972.- B.10. №1,- S.139-151.

277. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии.- Киев: Здоровья, 1988.- 199 с.

278. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors //Annu. Rev. Biochem.- 1983.- Vol.52.- P.655-709.

279. Fuchs H.E., Shifman M.A., Pizzo S.V. In vivo catabolism of a 1-proteinase inhibitor trypsin, antithrombin III - thrombin and a2-macroglobulin - methylamin // Biochem.Biophys.Acta.- 1982.- Vol.716.- №2.- P.151-157.

280. Дубровин C.M., Муромцев A.B., Новикова Л.И. аг-Макроглобулин: современное состояние вопроса (обзор литературы) // Клин. лаб. диагностика.-2000. №6,- С.3-7.

281. Laskowski М., Kato J.I. Protein inhibitors of proteases //Ann. Rev. Biochem. -1980.- Vol. 49.- P. 593-626.

282. Клиническая оценка лабораторных тестов /Ред. Тиц Н.У.-М.: «Медицина».-1986.- 480 с.

283. Fritz Н., Jochum М., Duswald К.Н. et al. // In: Proteinases in inflammation and tumor invasion .- "Walter de Gruyter & Co", Berlin-New York.-1986.- P. 1-23.

284. Hachulla E., Laine A., Blaringhem T. et al. // Presse Med.- 1996. Vol.25.- №14.-P.661-664.

285. Исаев B.A., Лютова Л.В., Руденская Г.Н.,Карабасова М.А. Фибринолитиче-ская активность морикразы- комплекса протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба //в сб. тез. док. VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов», М., 2007.- С. 153.

286. Семенова С.А., ЛютоваЛ.В., Руденская Г.Н. и др. Взаимодействие протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба с белками плазмы крови //в сб. тез. док. VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов», М., 2007.- С. 156.

287. Халили А.С., Домогатский С.П., Близнюков О.П., Ругге Э.К. Обработка протеиназами поверхности ожоговых ран: математическое описание распределения фермента//Биофизика.- 2003.- Т. 48.-Вып. 1.- С. 76-83.

288. Глянцев С.П., Саввина Т.В., Заец.Т.Л. Сравнительное изучение активности протеолитических ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран // Бюлл. эксп. биологии и медицины.- 1996. №6.- Т. 123.- С. 716-720.

289. Сахаров И.Ю., Глянцев С.П., Литвин Ф.Е., Гордеев В.Ф. Фармакокинетиче-ское изучение коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica // Вопросы мед. химии.- 1994.- Т. 40.- ВыпЗ.- С. 18-20.

290. Исаев В.А., Лютова Л.В., Руденская Г.Н. и др. Ранозаживляющее действие мази с морикразой//Вопросы мед. химии.- 1994.- Т. 40.- Вып. 3.- С. 46-48.

291. Сандахчиев Л.С., Ставский Е.А., Зиновьев В.В и др. Оценка воздействия мази, содержащей коллагеназу камчатского краба, на инфицированную рану в эксперименте // Бюлл. эксп. биологии и медицины.- 1997. №10.- Т. 124.-С.421-424.

292. Маркович Н. А., Омигов В.В., Балахнин С.М. и др. Морфологическая оценка воздействия коллагеназы камчатского краба Paralithodes Camtschatica на термический ожог в эксперименте //Бюлл. эксп. биологии и медицины.-1996. №7.- Т. 122.- С.97-100.

293. Сандахчиев JI.C., Ставский Е.А., Зиновьев В.В и др. Экспериментальное изучение лечебных свойств и токсичности мази, содержащей коллагеназу камчатского краба //Вестн. Росс. Акад. Мед. наук.- 1998. №4.- С.50-55.

294. Белов А.А., Белова Е.Н., Филатов В.Н., Лебедева А.Н. Разработка и исследование свойств текстильных материалов, содержащих протеолитические ферменты //Хим. волокна.- 2008. № 5,- С. 52-54.

295. Белов А.А. Протеолитические ферменты, иммобилизованные на текстильных носителях для оказания помощи в чрезвычайных ситуациях // Медицинский алфавит. Скорая помощь и реанимация.- 2007.№10 (IV).- С. 25-28.

296. Мензорова Н.И., Маркова А.В., Рассказов В.А. Высокостабильная Са, Mg-зависимая ДНКаза из гепатопанкреаса краба. // Биохимия. — 1994.- Т.59, вып. 3. С. 449-456.

297. Мензорова Н.И., Ивлева А.Д., Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Фосфатазы и фосфодиэстеразы из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes Camtschatica//Прикл. бихим. и микробиол. -2008.-Т.48.-№1.- С. 106-110 .

298. Нечипуренко О. Н. Современные косметические средства и их составляющие //Провизор.- 2005.- № 12.

299. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е., Митькевич О.В. Гидролиз белков протеиназа-ми камчатского краба//Биорг. химия.- 1994.- Т. 20.- №2,- С. 190-195.

300. Yagi M., Kato S., Nishitoba T. Effects of chitosan-coated' dialdehyde cellulose, a newly developed oral adsorbent, on glomerulonephritis indused by anti-Thy-1 antibody in rats //Nephrology.- 1998.-V. 78.-P. 433-439.

301. Liang Z.P., Feng Y.Q., Liang Z.Y., Meng S.X. Adsorption of urea nitrogen onto chitosan coated dialdehyde cellulose under biocatalysis of immobilized urease: equilibrium and kinetic //Biochem. Eng. J. -2005.-V.24.- P.65-72.

302. Белов A.A., Филатов B.H., Белова E.H., Лебедева А.Н. Полиферментные текстильные материалы // Сб. научн. тр. НИИТМ М.: Дипак, 2008.- С.26-31.

303. Медушева Е. О., Филатов Н.В. Применение повязки «Мультиферм» в лечении больных с трофическими язвами венозного генеза: Сб. научн. тр. / НИИТМ М.: Дипак, 2008- С.38-40.

304. Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Митюшина Г.В. Модифицированные и иммобилизованные препараты основного поливалентного ингибитора проте-наз для потенциального медицинского использования // Вопросы мед. химии.- 1985. №4.- С. 25-30.

305. Донецкий И.А. Исследование процессов выделения биопрепаратов из поджелудочной железы животных и разработка промышленной технологии : Дисс. . докт. хим. наук. М., 1990.- С. 79, 82-99.

306. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике.- Киев: Здоровья, 1971.- 215 с.

307. Fritz Н., Winderer G. Biochemistry and application of aprotinin, the kallikrein inhibitor from bovine organs //Arzneimittelforcsh.- 1983. № 4.-Vol.33.-P.479-494.

308. Гостищев B.K., Рыльцев B.B., Ларионова Н.И. и др. Опыт экспериментального и химического использования в медицине различных форм иммобилизованных протеиназ и их ингибиторов // Вопросы мед. химии.-1985. №4.- С. 21-24.

309. Сыновец А.С., Левицкий А.П. Ингибиторы протеолитических ферментов в медицине,- Киев: Здоровья, 1985.- 71 с.

310. Проценко В.А., Шпак С.И. Ингибиторы протеолитических ферментов -протекторы клеточных повреждений //Усп. совр. биол.- 1988.- Т. 106.- Вып. 2.- С. 255-263.

311. Steven F.S., Griffin М.М. A comparison of the inhibition kinetics of trypsin in free solution and trypsin coupled to Sefarose-4B //Biochem. Soc.Trans.- 1981,- № 1.-Vol.9.- P.145-147.

312. Григорян A.B., Левицкий А.П., Синовец A.C., Литвинов П.Г. // Вестник хирургии.- 1981. №8.- Т. 127.- С. 3-7.

313. Белов А.А, Рыльцев В.В., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф. и др. Способ получения материала обладающего биологической активностью. Заявка от 09.02.94 № 94004263/14/004399 положительное решение от 21.12.95.

314. Белов А.А., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. и др. Взаимодействие растворов трипсина с текстильными материалами, содержащими поливалентный ингибитор протеиназ //Сб. науч. тр. ВНИИТГП.- М.: ЦНИИТЭИлегпром. 1991.-С. 36-41.

315. Белов А.А., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. и др. Кинетика выхода поливалентного ингибитора протеиназ с текстильного носителя //Сб. науч. тр. НИИТМ М.: ЦНИИТЭИлегпром. - 1993.- С. 22-27.

316. Belov А.А., Kazanskaya N.F., Ignatyuk Т.Е., Filatov V.N., Larionova N.I. The properties of the polyvalent proteinase ingibitor modified by textile cellulose materials //Тез. докл. 20-th FEBS Meeting, Budaest.- 1990.- P. 201.

317. Белов A.A., Филатов B.H., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. и др. Свойства поливалентного ингибитора протеиназ, модифицированного текстильными целлюлозными материалами // Тез. докл. 2-Нац. конфер. "Биоматериали" Варна.: НРБ. 1990.- С. 94, 167.

318. Белов А.А., Филатов В.Н., Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И. и др. Иммобилизация поливалентного ингибитора протеиназ на поликапроамидном и целлюлозном текстильных носителях //Тез. докл. VII Всесоюз. симпозиум "Инженерная энзимология".-М. 1991 .- С.-91.

319. Belov A.A., Kazanskaya N.F., Filatov V.N., Larionova N.I. et. al. Antiproteinase and polyenzyme wound dressing. //3-th Internal. Congress on Wounds, Burns and Dressings.- Tel-Aviv.- 1994.- P. 22, 111.

320. Ларионова Н.И., Мороз H.A., Балабушевич Н.Г. и др. Инженерно-энзимологические подходы к дизайну полимерных форм апротинина //Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2, Химия.- 1995.-Т.36.-№2.- С.139-143.

321. Belov А.А., Larionova N.I., Zaets I.L., Ignatyuk Т.Е. The immobilized proteinase inhibitors in burn treatment // Тез. докл. 3-th Internal. Congress on Wounds, Burns and Dressings.- Tel-Aviv.- 1994.- P. 44,140.

322. Раневые покрытия пролонгированного действия. Нормативная документация, пособие для врачей, отзывы.- М.: Дипак, 2008.- 130 с.

323. Самойлова Т.И. Разработка хлопчатобумажного перевязочного материала сферментативной активностью и оценка его качества. //Дисс. на соиск.канд. техн. наук М., 1987. — 189 с.