Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых иммуноферментных систем для диагностики туберкулеза

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых иммуноферментных систем для диагностики туберкулеза"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ТЕЖиЮГИЧЕСКИЙ ЙНЗТИТУТ

ВИШНЕВСКАЯ Елена Борисовна

РАЗРАБОТКА ГОВЫХ ИДОУВЗДЕРМЕ1ПШХ СИСТЕЫ ДЛЯ ДИАПЮСТШИ ТУБЕРКУЛЕЗА

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ ; диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1993

Ш правах рукописи

Работа выполнена на кафедре технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского технологического института Научный руководитель:

доктор технических наук, ЯКОВЛЕВ

профессор Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, 1ШОДЗЕЙ

профессор Крина Валентиновна

кандидат биологических КАШИН

наук Аркадий Павлович

Вздутая организация: Санкт-Пэтербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Залзгга состоится "£ * З^^срх 199 ^ г. В час., в ауд. на заседании Специализированного

Совета Д Оба 2.03 при Санкт-Петербургском технологическом институте. .

С диссертацией юяю ознакомиться в библиотеке инсти- ! тута.

Отзывы к гашчания по данной работе, заверенные гербо- ! вой печатью, в одном экаенптаре просим направлять по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Загородный г оспект, дом 49, С, -Петербургский технологический институт. Ученый Совет. >

Автореферат разослан' " % "_^^^ ^ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

к. т. я. Т. Б. Лиеицкая

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ

Актуальность темы.

Несмотря на успехи современной медицины, туберкулез и сегодня остается одним из самых социально значимых заболеваний во всем мире: своевременная диагностика и раннее выявление туберкулеза - важная задача органов здравоохранения любой страны. В последние, годы все Сольиее ьнимание уделяется проблемам серодиагностики туберкулеза, так как применяемые сегодня методы диагностики этого заболевания - флюорография. бактериологические исследования и туберкулиновые пробы имеют ряд существенных недостатков. Серологические методы,, особенно иммунофермэнтяый анализ, достаточно просты, доступны и хорошо воспроизводимы.

В то же время, несмотря ьа обилие выделенных и изученных туберкулезных антигенов и множество вариантов серологи. ческих тестов на туберкулез, непрерывно ведутся работы по совершенствованию методов серодиагностики туберкулеза, так как до сих пор ни одна из существующих методик не может полностью удовлетворить интересы врачей-фгиэиатров. Поскольку микобактерия туберкулеза представляет собой весьма сложную систему, при разработке тест-систем для диагностики туберкулеза возникает ряд проблем, связанных с выбором антигена или комплекса антигенов для .серологической реакции; при использовании серологических реакций для скривинговых ' методик необходимо решать задачи адаптации метода к массовым обследованиям и полевым условиям.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы является повышение эффективное-

ти инмуноферментного анализа для диагностики туберкулеза путем разработки методов, позволяющих исследовать стабилизированные образцы крови и определять антитела к комплексу туберкулезных антигенов.

При выполнении работы ставились следующие еадачк:

1. Разработка иммуноферменгиого диагностикума для одновременного определения антител к двум туберкулезным антигенам различной природы.

2. Выделение и очистка липидного антигена ив клеточных стенок микобактеркй.

3. Определение фракционного состава и активности полученного антигена

4. Разработка способа подготовки к иммуноферментному анализу высушенных обраацов капиллярной крови.

6. Стабилизация компонентов разработанной системы и проверка их стабильности.

Научная новивна работы.

В данной работе разработан способ выделения и очистки нового туберкулезного антигена, проведен анализ его фракционного состава к антигенной активности. Впервые получена имхуноферментная тест-систьма для одновременного определения антител к двум туберкулезным антигенам: белковому и ли-пидному и показано, что применение такой системы позволяет повысить эффективность. ИФА. Разработан метод определения * противотуберкулезных антител в стабилизированных образцах капиллярной крови, получен новый агент для блокирования

неспецифического связывания при анализе цельной крови. Неучена стабильность высушенных образцов капиллярной крови.

фактическая значимость.

Разработанный комплект для определения противотуберкулезных антител в высушенных образцах капиллярной крови внедрен в практику в Центральном городском противотуберкулезном диспансере С.-Петербурга и применяется в экспедиционной работе С.-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии. На этот комплект подготовлена документация (проекты лабораторного регламента и технических условий) для передачи в ГИСК им. Тарасовича. Выпущены опытные партии комплекта.

Иммуноферментная тест-система для одновременного определения антител к двум анти*знам различной природы апробировала на баге С. -Петербургского НИИ фгиэиопульмонологии. Выпущены опытные партии тест-системы, которые в настояние время проходят клинические испытания.

Апробация работы:

Результаты исследований были представлены на Республиканском семинаре по проблемам Крайнего Севера (Красноярск), Всероссийском съезде МЭП (Москва), отчетной научной конференции Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии (Сгнкт-Петербург).

1|убликации:

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и построение работы:

I

Диссертация состоит из введения, 4 глав (об8ор литера-

туры, материалы и методы, экспериментальная часть с обсуждением результатов в двух главах), заключения, выводов и списка литературы, изложенных на 124 страница: машинописного текста Работа содержит 13 таблиц, 20 рисунков, список литературы включает 211 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

ОСНОБГОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ

Обзор литературы состоит из вводной части и двух разделов, в которых обобщены сведения о применении серологических реакций в диагностике туберкулеза, дан сравнительный анализ различных иммунологических методов, приведены характеристики основных групп антигенов микобактерий и освещено состояние проблем серодиагностики туберкулеза в нашей стране к за рубежом.

Материалы и методы.

В работе исследованы модификации иммуноферментНого i анализа для определения противотуберкулерчых антител Всего проанализировано более 600 образцов крови больных туберкулезом и вдоровых доноров.

Для обнаружения антител применяли метод непрямого не- ■' . конкурентного твердофазного иммуиоферыентно--> анализа (НТО Т., Лэнхофф Д., 1988). Носителем служили полистироловью планшеты отечественного производства, которые сенсибилизировали антигенами в соответствующих растворителях С карСо-натно-бикарбонатный буфер для белковых и органические растворители для лнпидных антигенов). Анализы проб проводили минимум в трех повторностях. Для обнаружения связавшихся с

антигеном антител применяли конъюгат белок А - пероксидава. хрена (йебрун А. Б., 1988). В качестве ферментного субстрата применяли о-фенилендиамин. Оптическую плотность продуктов реакции измеряли при 492 нм на спектрофотометре "Dombiplate" (.Рига).

Антигены для ИФА получали из биомассы М. tuberculosis, штамма H37Rv. Микобактерии выращивали лленочно на синтетической среде Сотона; антигены выделяли из убитой автоклави-ровшшеы трехнедельной культуры, которую фильтровали через бумажный фильтр. Из биомассы экстрагировали литады, а из фильтрата получали белковый антиген путем ультрафильтрации на нейлоновой мембране "Халипор - 4" с пределом пропускания 10000 D.

Состав дипидного антигена определяли методом тонкослойной хроматографии IDaffe М., Papa F., 1989) в различных • системах органических растворителей на силикагелевом носителе "Silufol". В пробах определяли наличие липопротеидов в реакции с нингидркном после кислотного гидролиза, а такта серы (Middlebrook а , 1959) и фосфора (Raheja R. , Singh А. . 1973).

В препаратах блокирующего агента определяли также содержание липидов (Кейтс Ы., 1975), истинного белка и сухих ведвств (Фейхман А.Е., 1976).

Результаты и обсуждение.

1. Исследование капиллярной крови: сравнение с титром антител в венозной крови и оптимизация отбора проб.

Сравнительный анализ 100 образцов капиллярной и веноэ-

ной крови методом ИФА позволил сделать заключение о том, что титры антител з сыворотках периферической и венозной крови одинаковы, и в одинаковой степени снижается при длительном хранении этих сывороток.

Для анализы капиллярной крови было решено применить известный для других антигенов метод высушивания капли цельной крови на бумажном фильтре. Был установлен оптимальный вариант отбора капиллярной крови - на бумажные фильтры марок "скняя лента" - отечественного производства или "желтая лента" производства Германии. Экспериментально доказано, что равная площадь фильтра с кровью содержит равное количество сыворотки, независимо от содержания сыворотки в крови.

2. Элюция высушенных образцов крови,' изучение их стабильности и оптимизация услов!й консервации нового элшруга-шэго буфера

Для исследований были отобраны группы сероположитель-ных больных туберкулезом легких и эдорозг' доноров с отрицательными реакциями; параллельно анализировали сыворотку и сушеные образцы крови. В качестве элюэнтов были опробованы: фосфатно-солевой буфер с Тгмном-20 и, так как при его применении наблюдался высокий фон, болыкЗе кол: .ество ложнопо-лозютельньк реакций, ряд блокирующих добавок. В качестве агентов, препятствующих иеспецифическому связыванию, применяли бычий сывороточный альбумин, сухое молоко, яичный альбумин к другие белки. Ни один из указанных агентов не дал удовлетворительного эффекта (рис. 1). Применение сывороток млекопитаоиих (лошадиной, коровьей, кроличьей) также ока-

залось неприемлемым, так как иммуноглобулины этих сывороток сами связывались с антигеном. Несколько лучше результаты были получены при использовании сыворотки кур (. коэффициент корреляции со стандартным методом анализа составил 0. 82), но и в этом случае часто наблюдали расхождение между ре-" аультатами анализов сывороток и "сушеных капель". Кроме того, высокая стоимость куриной сыворотки в сочетании с необходимостью применять ее в больших количествах не позволяла использовать этот метод для массовых анализов.

Результаты ИФА "сушеных капель"

Рисунок 1.

с различными элюэнтами.

, КОЭФФИЦИЕНТ КОРРЕЛЯЦИИ 1 - - —

0.3

о.п пл

D.5 0.5

0.4

^ Злакцвцю-

е aff-аЬкы

i - твин-20, г - sea, з - сукое молоко,

ц - ЯИЧНЫЙ БЕЛОК, 5 - КУРИНДД СЫВОРОТКА, б - ПРЕПДРДТ И1 ЖЕгИКЙ

В связи с этим бия разработан способ предотвращения неспецифического связывания с помощью блокирующего агента на основе жлтка куриного яйца

Рисунок 2 .

Результаты параллельного анализа сывороток и "сушеных капель" крови с оптимизированным вариантом блокирующего буфера.

&=0.973

Ь=0„006

р.г1

" 0.2 П.Н 0.Е П.В 1.0 ОВЧЗЕ ;

ЭЛЮДТОВ. С ФИЛЬТРОВ

Выбор куриного желтка был обусловлен несколькими причинами: во-первых, он содержит практически все компоненты, присущие сыворотке крови, при этом получение его гораздо дешевле; во-вторых, применяя птичий белок мы молем избедать

случайного е аимодействия с белком А в ИФА, которое возможно при работе с белками животных. Исследовали блокирующую способность водных суспензий цельного мэлтка и его фракций с различным содержанием липопротеидов. Результаты оценивали по количеству расхождений между ИФА сывороток и "сушеных капель". Показано, что оптимальный эффект (отсутствие расхождений) достигается при использовании суспензии, полученной при частичном осаждении липопротеидов при рН 7.5 (рис. 2).

Технология получения блокирующего агента из яичного аоелиса проста и не требует применения дорогостоящих и дефицитных материалов и оборудования (рис. 3).

Рисунок 3.

Схема под>чения блокирующего буфера ' на основе яичного желтка.

- 12 -

Определены основные физико-химические параметры яичного блокирующего агента (таблица 1), изучено влияние на его свойства различных условий консервации.

Таблица 1.

Основные параметры яичного блокирующего агента

Наименование параметра Норма

Внешний вид Запах Наличие осадка Массовая доля сухих веществ, % Содержание истинного белка, X Содержание липидов, % РН желтая суспензия слабый яичный отсутствует 4 + 0.3 0.45 + 0.05 0.6 + 0.1 7. 5 ±0.1

Взскольку разработанный препарат содержит яичный желток, возникает проблема его хранения, так как он представляет coÖoL хорошую питательную среду для роста микрофлоры. Увеличить срок хранения можно введением консерванта или с помощью лиофильной сушки. Проверена возможность использова-

J * ■ .

ния обоих методов и показано, что после сублимационной сушки или , законсервированный азидом натрия в оптимальной (0.05Z) концентрации, препарат- сохраняет свои свойства в течение как минимум полугода

Определена также стабндьностг высушенных образцов крови в реакциях с туберкулезными антигенами и установлен гарантированный срок хранения обраэцов: 10 дней для антигена - сониката микобактерий и 20 - для фильтрата.

Использование яичного желтка оказалось значительно экономичнее, чем куриной сыворотки. Стоимость куриной сыворотки (Диа-плюс, Мэсква) в мае 1993 года составляла 2500 руб/10 мл, или 250 руб. на один анализ, а ориентировочная

стоимость б "жирующего агента из яичного лелтка с учетом всех затрат не превышала 50 руб. /10 мл. , то есть в 50 раз дешевле куриной сыворотки.

3. Получение липидяого антигена из Ы tuberculosis и применение его в ИФА.

Известно, что для наиболее полного выявления противотуберкулезных антител целесообразно применять в серологических реакциях несколько антигенов.

На первом этапе работы была исследована эффективность применения в иммуноферментном анализе двух промышленно выпускаемых антигенов различной природы: белкового - полуочи-щзгаюго туберкулина (фильтрата микобактерий) и липидного фосфатидного антигена. Проанализировано ИЗ сывороток крови бодьных туберкулезом и здоровых доноров. Показано, что при--, меняя различные антигены можно определять в ИФД различные антитела,. но фрсфатидный антиген оказался непригодным к использованию в ИФА из-за низкой специфичности. Фракционированием фосфатидного антигена удалось добиться снижения числа' положительных реакций у здоровых доноров, но это привело к заметному уменьшению.чувствительности. В свя8И с этим бы-, ла предпринята попытка ввделения ив минобакгерий более под- '• ходящего .липидного антигена. ; '

Решепие выделять липидную 'фракцию из внешней части' ' оболочки микобактерий основывалось на том, что такой антиген доллен был бы хорошо дополнять сущгстртошкй белковый, выделяемый а основном из цитоплазмы/ Был пол» 1ен гексановый экстракт клеточных стенок шкобактерий, обладающий высокой

антигенной активностью, но низкий специфичностью: число положительных реакций у.Сольных туберкулезом доходило до 94%, но 35% здоровых доноров также давали полодагельную реакцию.

Методом тонкослойной хроматографии был определен состав гексанового экстракта, в котором обнаружены фракции ли-пидов различной полярности. Двумя способами осаждения на холоду гексановый экстракт разделили на слабо- и сильнопо-' лярную фракции, каадую фракцию также исследовали методом тонкослойной хроматографии и проверили их активности в ША с гипериммунными кроличьими сыворотками и набором сывороток больных туберкулезом и здоровых доноров. Сильнополярная фракция, содержащая фосфор, оказалась весьма неспецифичной, а специфичность и активность слабополярной фракции были сравнимы таковыми у стандартного белкового антигена -фильтрата микобактерий. После определения оптимального способа фракционирования липидного антигена был ' проведен ряд опытов с параллельной постановкой ЙФА с двумя антигенами. В' случае постановки ИФА с сыворотками здоровых доноров число положительных, реакций по сумме двух антигенов лишь на 1 -27. превышало- количество положительных ответов для каждого антигена в отдельности, однако при анализе 92 сывороток больных туберкулезом учет результатов ИФА по сумме двух антигенов дал возрастание чувствительности .минимум на 14%. Далее была отработана методика ИФА с двумя антигенами в одной лунке и по -этой методике проанализировано 100 сывороток больных туберкулезом различной степени тяжести и локализаций и 75 сывороток здоровых доноров.

Полученные данные свидетельствовали о значительном по-

вышении эффективности иммуноферментного анализа при использовании двух антигенов: на 14 - 17% для больных туберкулезом в целом, а для группы впервые выявленных больных - до 22л, в основном за счет липидного антигена. Специфичность теста с двумя антигенами находилась при этом в допустимых пределах. Применние очищенной фракции фосфатидного антигена позволяло повысить чувствительность теста в меньшей степени, при этом заметно снижалась специфичность (рис.4).

Рисунок 4.

Эффективность ИФА с различными антигенами. ^ ___

х-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫ«

I а з ьн ьэ

АНТИГЕНЫ: 1 - БЕЛКОВЫЙ, В - ЛИПИДНЫЙ, 3 - ФООФДТИДНЫЙ \

. БОЛЬНЫЕ ТУБЕРКУЛЕЬОМ, О - 1Д0Р0ВЫЕ

- 16 -

Таким образом, полученный лшшдньй антиген значительно превосходит фосфатиднъй в реакции ИЗД. Следует ответить, что технология получения этого антигена достаточно проста (рис. 5):

Рисунок б. Схема получения лшшдного антигена'

Посевной материал

Стадия

Д.

Синтетическая среда Сотона

Пленочный рост шко-бактерий на матрасах

| Авт оклавирование] [Фильтрация |

Фильтрат"

X

Ацетон

Тромывка и |высушивание

Ацетон

_Г

Осадок

I "

йштрашш и промывка

I

■инкубирование при -18"С

Гексан

X

Осадок.

1УГИРО-

вание 3000 в ]--

|Вакуум-выпарка| '

Розлив во флаконы, укупорка

Продукт

Биомасса микобаетерий

Биомасса

Биомасса 52 влажности

Гексановый экстракт

Экстракт с осадком

Разбавленный антиген

Концентрат антигена

Готовый

препарат

антигена

- 17 -

Предварите. л>ные расчеты показали, что несмотря на относительно невысокое содержание в микобактериальной клетке слабополярных липидов (5 - 7 7. по сравнению с 15 - 20 X фосфолипидов), стоимость липидного антигена, благодаря простоте и доступности его получения, не будет превышать стоимость фосфатидного антигена.

Все это позволило рекомендовать выделенный антиген к использованию в ИФА на противотуберкулезные антитела й сформировать тест-систему для ИФА на основе двух антигенов. Липидный антиген входит в систему в виде гексанового раствора в ампуле, которую-следует хранить при -18"С. Показано, что при хранении в морозильной камере липидный антиген сохраняет свои свойства в течение как минимум 4 месяцев. :

Тесг-сисгьш с. двумя антигенами" апробирована в экспедиционных условиях при массовых обследованиях населения в поселках на Крайнем Севере и внедрена в практику экспедиционной работы Санкт-Петербургского НИИ фгизиопульмонологии. Шжазано, что применение этой тест-системы позволяет повысить выявляемость туберкулеза серологическими методами.

Ь Ы ВО Л Ь1 '

1. Разработан способ постановки ИФА о двумя туберку- ; лееними антигенами одновременно; на его основе создана новая тест-система для определения противотуберкулезных антител к липидноыу и белковому антигенам в одной реакции. Показано, что совместное применение в ИФА двух различных антигенов позволяет на 17 - 22% повысить выявляемость ' Противотуберкулезных антител.

- 18 -

2. Исследована возможность применения в ИФА фэефатид-ного туберкулезного антигена и показано, что чувствительность и специфичность анализа с этим антигеном не удовлет- , воряют требованиям, предъявляемым к диагностическому тесту.

3. Из клеточных стенок М tuberculosis выделен новый лилидный антиген. Проведено разделение полученного липидно-го экстракта на специфичную и неспецифичную антигенные фракции. Шказано, что наибольшей специфичностью обладает слабополярная фракция, а содержащая фосфор сильнополярная фракция отличается низкой специфичностью.

4 Показано, что результаты иммуноферментного анализа не зависят от типа исследуемой крови (венозная или капиллярная) .

Б. Разработан специальный блокирующий агент на основе яичного желтка для предотвращения неспецифического связывания при анализе высушенных образцов капиллярной"крови, оп-. ределены оптимальные условия его консервации "и хранения и показано, что буфер сохраняет свои блокирующие свойства в течение как минимум полугода.

6. Исследована стабильность высушенных образцов капиллярной крови и определены сроки сохранения титров противотуберкулезных антител к различным туберкулезным антигенам: для ИФА с соникатом м"кобактерий - 10 дней, для ИФА с фильтратом - 20 дней.

7. На основе разработанного блокирующего агента создан комплект для анализа капиллярной крови "Сухая капля", на который разработан лабораторный регламент.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Вишневская Е.Б. Определение противотуберкулезных антител методом ИФА в сухих образцах капиллярной крови // Лаб. дело. - 1991. - N 6. - С. 32 - 35.

2. Вишневская Е. Б., Галкин К Б., Абрамсон Е. 3., Степанова Г. Я. Оптимизация массовых осмотров населения в сельских районах Крайнего Севера//Респ. семинар: Тез. докл. -Красноярск, 1990. - С. 11.

3. Вишневская Е. Б., Галкин Е Б., Исаева Е Ю. Проблемы раннего выявления туберкулеза на Крайнем Севере// Респ. , конф.: Гез.докл. - Якутск, 1992. - С. 173.

А. Вишневская Е.В., Шюканов АЕ Выделение иммуноглобулинов из згелтка куриных яиц и анализ гаяечного продукта// Клин. лаб. диагн.' - 1992. - И 1 - 2. - .С. 30 - 32.

5. Вишневская Е. К, Клюк^нов А. Е Комбинированное применение аятигеков различных классов в икмуноферментной анализе на противотуберкулезные антитела// Клия. лаб. диагн. -1993. - N б. - С. 18 - 20.

6. Вишневская Е К , Клюкажь А. В. Ъвый диагностику*!

на прогивотуберкулезгше антитез/ Рёсп. конф. молодых медиков: Гез. докл. Мэсква, 1993. - С. 131- 135.

3.11.93 Зак.229-50 РТЛ Ж СШГЕЗ, Московский пр.25