Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых чувствительных экспресс-методов определения и дифференциации микроорганизмов в пищевой и микробиологической промышленности

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых чувствительных экспресс-методов определения и дифференциации микроорганизмов в пищевой и микробиологической промышленности"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ГАЗЕНКО

Сергей Владимирович

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЭКСПРЕСС-МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПИЩЕВОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

03.00.23 — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Московском технологическом институте пищевой промышленности и Всесоюзном научно-исследовательском институте биологического приборостроения.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Грачева И. М.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Эль-Регистан Г. И. доктор технических наук, профессор Траубенберг С. Е.

Ведущая организация — Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинт " '",Т11И Синтезбелок).

циализированного совета Д 098.09.01 при Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии (125299, Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Защита состоится

заседании Спе-

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь специализированного созета, кандидат биологических наук

И. И. Гусева

ВВДДЕНИЗ

Актуальность работы. Актуальность работы подтверждается требования!.?!! Постановления Совета Министров СССР "О дальнейшем развитии коейгс направлений биологии и биотехнологии" (1985г.).

В качестве одного из важных направлений дальнейшего развития биологии и биотехнологии называется разработка и усовершенствование методов биохимического, иммуннохимического и биофизического анализа для использования в медицине, сельском хозяйстве, биотехнологии и для мониторинга онруяавщей среды.

Настоящая работа посвящена разработке методов биохимического и, в определенной степени, биофизического анзлиза микроорганизмов з бкотехнологических производствах, что соответствует одному из важных направлений в развитии биологии и биотехнологии.

Очень часто несовершенство мукробиологического контроля исходного сырья, посевного материала, технологических процессов и готовой продукции блует? причиной снижения" качества, уг.'снк:е . ния выхода продукции, а, в ряде случаев, и необходимости ее уничтожения. При этом ваяиейпши показателями дакробкологичзскогл ■ контроля являются зреет анализа и его чувствительность.

Большинство промышленных процессов, идущих с участием микроорганизмов проходят достаточно быстро-от 3-5 часов до суток. Характер исходного сырья и готовой продукции также часто не допускают длительного хранения. Поэтому загрязнение сырья, полупродуктов и оборудования в технологических процессах требует максимально быстрого определения. Кроме того, использование ассоциаций микроорганизмов в биотехнологических процессах, получавшее распространение в последние годы, нуждается в регулярном оперативном контроле состава этих ассоциаций. Бее это' указывает на то, что биотехнологические производства нуждаются в экспрессных, чувствительных, надежных и простых методах микробиологического контроля.

Существуют достаточно быстрые методы анализа, такие как хроматография, иммуннсфлуоресцентный и иммунноферментный анализы, электрофорез, бнолвминесценция, ыасс-спектрометрия, гибридизация нуклеиновых кислот. Однако часто они сложны в исполнении, требует дорогостоящего оборудования, редких реактивов, часто ограничены определенны?.! кругом задач и, поэтому, используются, кок правило, только в медицинской микробиологии, диагностике плл

научных исследованиях.

Вместе с тек, основным экспрессным методой микробиологического контроля в пищевой в микробиологической промасленности является, в настоящее время, микроскопировгние. Достаточно точным и чувствительна, но, как правило, чрезмерно длительным является высев анализируемого объекта на дифференциальных питательных средах. -.

Однако, первый метод не позволяет дифференцировать в поле, зрения микроскопа близкие по форме и морфологии клетки; посев на среды требует длительного, многочасового роста, т.е. це является быстрым.

Таким образом, разработка быстрых,простых и чувствительных методов мыкробиологического контроля в пищевой и микробиологической промышленности представляется вагной и актуальной проблемой.

Цель работы. Целью настоящей работы явилась разработка и. обоснование методов определения, индикации и дифференциации микроорганизмов с помощью рада искусственных субстратов на различные группы ферментов. .

Б соответствии с поставленной целью сформулированы кон-кратные задачи исследований: ; ; ,

- установить возможные отклонения в ферментативных профилях исследуемых микроорганизмов, выяснить их причины и характеру

- исследовать ферментативные профили микроорганизмов на основе хромогенных субстратов (соли тетразолия) и обосновать ы¿¡годику определения принадлежности микроорганизмов к определенным таксономическим группам;

- исследовать ферментативные профили микроорганизмов на основе флуорогенных субстратов и разработать методики иденти- . фикации л дифференциации микроорганизмов. ■■'',. •'

Научная новизна. Научная новизна , исследования заключается в следующем: / • •: -'; . '::''. " ■•.'•■.

- впервые установлена возможность экспресс-анализа таксономической принадлежности микроорганизмов с ■ помощью искусственных субстратов-солей тетразолия и бесцветных эфиров флуорес-цг.руювдх веществ {флуорогенных субстратов) на больше грушш ферментов; '.'•.•.' ■■..■> : --■ 7 ■';/.';.■- -• ";

- установлены граница устойчивости ферментативных профилей на основе больших групп ферментов;

- предложен и разработан экспресс-метод определения таксономической принадлежности микроорганизмов с поыоцы> солей тет-разолил;

- предложен в разработан чувствительный экспресс-метод определения таксономической принадлежности микроорганизмов с поысцы) фдуорогениях субстратов;

- предложен и разработан экспресс-метод примерного определения таксономической принадлежности микроорганизмов с поиощьо двойного флуоресцентного окрапивания.

Практическая значимость. Практическая значимость заключается з том, что разработанные экспрессные и чувствительные методы ьщхробиологического контроля позволяет проводить анализ микрофлоры на различных стадиях производственного цикла. Кетсды пригодны в уелоелях заводских и научно-практическшс лабораторий. Время анализа составляет 20-30 минут. Чувствительность при использовании флуоресцентных вариантов до Ю4 - Ю5 кл/ил. По результатам анализов, в зависимости от метода, характера производства или цикла, опрзд?дяется таксономическая принадлен-ность колоннЗ, уровень и характер загрязнения ¿остаровней микрофлорой, кияроколичества живых клеток. Результаты могут быть определены как на оптических приборах (ОЗК, спектрофотометр, флуориметр, проточный МЕкрсцектрофлуориь!етр', световой или люминесцентный микроскоп), так и, в ряде случаев, визуально. Методы просты в исполнении, дешевы, могут, быть выполнены на приборах и реактивах отечественного и зарубежного производства.

; Подученные результаты внедрены во ШИИ биологического приборостроения и апробирована на Кипкпском биохимическом заводе.

В практику ЕНЙ! биологического приборостроения внедрена методика двойного флуоресцентного окрашивания культур микроорганизмов. Достигаемый эффект заключается в быстром и чувствительном контроле ¿агробиологической чистоты используемых препаратов - отклонения в профиле яультури указывает нз ее загряз-неяие посторопнеЗ микрсфлороЗ.

На Кириаскоы БХЗ апробирована ыетодз определения кикро-колпчеств живых клеток дрожжей в готовой продукции и экспрессной дифференциации дрожгей рода Са.пЖ<4а после подрапдаания

на плотных питательных средах. Первая методика разработана в результате изученья флуоресцентных ферментативных профыей клеток вкживаэвдх после стадии термолиза ферментируемого продукта: выбраны флуорогенные субстраты дающие максимальную чувствительность определения микроколичеств живых клеток - до 103 клДи при I часе инкубирования клеток с субстратом. Вторая методика основана на различном восстановлении видами .рода Candida солей тетразолия до формазанов. Выбранные соли тетразолия позволяет дифференцировать C.MaetosafC.t-mpicaûis ,C.uti ßis, С, tug о sa визуально по интенсивности окраски суспензий клеток после предварительного 24-х часового подращивания на сусло-агаре.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференциях молодых учёных и специалистов БНИИбкологического приборостроения (1983 г. и 1986 г.) и Всесоюзном совещании "Повыиение технического уровня основного технологического оборудования и приборов в медицинских и микробиологических производствах" ( Йошкар-Ола, 19Ъ9г.).

Публикации. По материалам диссертации получено 4 авторских свидетельства на изобретения. Результаты исследований вошли в 2 отчёта о НИР ШИИбиологического приборостроения. На основании исследования научно-технической литературы по тематике диссертации написаны два обзора.

Объекты и методы исследования.

В работе использованы бактерии: £. сове M-I7, ß.ibutimjien-SiS др(Рег<'ауВ.сегеи$, btriegathetiu», р3.амгап£(са,5ег.Л'«'*с«-ceny, Saicina -fiEava из коллекции микроорганизмов ВНИИбиоло-гического приборостроения;$.сегег"5'ае,9.саг6?6ег.^е»г5'5, С. %u.\jttztimor\dtaL (различные штампы), Wiciocccc tuteus 1234 из коллекции кафедры "Биотехнологии микробного синтеза" ЫЖПП; С. wo 2t osa, C.tiopita£is , С. uti t>S и С, tugûSa были получены на Кириыскоы БХЗ. -

Питательные среды - ыясо-пептонный агар (ЫПА), ыясо-пептон-ный бульон (МПБ) получали из НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Сусло-агар получали на кафедре "Биотехнологии микробного синтеза" МГИПП.

Использованные искусственные субстраты представлены в 1 таблице I.

Таолтз I

'Искусстзеннче субстраты и юс условные обозначения

гш. j Наименование !Услонное !Химическая '.обозна- ! формула ! ченлз ! '.Страна и ¡фирма производитель

I ! • 2 ! 3 ! 4 ! 5

■ I. Ыетилтиазолилтетразолий бромид

2. Тетразелий фиолетовый бромид

3. Нестетрззолий хлорид

4. 4-Нитроспний тетразолий хлорид

5. Тетразолий синий хлорид

6. Тетразолий фиолетовый

7. .'Л-китронеотетразолий

8. Тетранитротетразолий синий

9. Тиазолиловый синий

10. 2,3,5-трнфенилтетразелий хлорид

11. п-Нитротетразолзй фиолетовый

12. Тетразолий жёлтый

13. Иодкнтротетразолий хлорид

I4*. йлуоресцеиндиацетат

15. СлуорессеппдиБутардт

16. 4-метлдумбеллп$ерилацетат

17. 4-иетилуыбеллгферялбутират

1ГГТ 13 с25н17 ü^ Se ггчг США ChmnapuC 4CCP

ктх Sezva • C Iii А

кст CuiA

CT C4 foiWi OictChtmci ЧССР

тох с23н17^сг dfcT-C/tK rnci ЧСС^

HHQ CSSH26 ^сА^З Reanti С ВНР

шс Chf/na/зоС ЧССР

тс CI8!II6N5SBr betx-a СыА

то CisHi5^QL

НТЗ V^VWA Chimctpot? ЧССР '

Т2 ИНТ с^сад CIA^A® va США Set га ША

«ДА C24HIS°7 Sigmct США

C28H24°7 Sic/*» СDA

m CJ2HI0°4 "PeaxEj", СССР

1ДБ CI4HI4°4 "Реэхззл", СССР

Брододеекие таблицы I

I ! 2 ! S 1 4 ! 5

16. ¿-ь-етьтзтбэлл^фердлпаль- /СсеЬ-У*^'^

кгтат ШП CI7IÎ2P04 %04с1г«Гсие$

CLiA

I&. 4-глетгд^гбелсщ)есйЛфосфгт КУО С К С Pifcu Feu к а дкаатр;:евал соль • 10 9 6 " ЙТ

2Q. Безазурик ?33 Стс>Н7 Сь "FeEES."" ,

< ъ исР

Измерение, оптических характеристик пропусканы; (£Т) к ¿;сс4фкц".:ентов процускааия (£% ) цроводопсь на спектрофохо-i.■¿■içe'Li VID6C-2" ж фотеэлектроколорпыетре СЗЕ-56 'Л соответственно, по стандартным метсд»:н£1! (¡«еньлх'ков, 1Э57). 'Лгксренке г'елютн флуоресценции {% %Jçj\. проводилось на спектрсфяуори-i.^pe"Petcktn-SCmei iOQO" (ШекЗтрекд, IS£5).

Ст-згксг,:ческую обработку эксперкментальнш: дакяых осуществлял:; известными методами (Кассандрсза, Лебедев, 1Э7С),

РаСота выполнена нз кафедре "Биотехнологии микробного синтеза" часть работы выполнена во Всесовзксы научко-ис-слеловзтельскоы институте биологического приборостроения Linn-г.едпрока CGC?.

Стгтттурз к обт>ем диссертации. Диссертация изложена ка f 62 страницах, включает /)7 таблиц и 30 рисунков. Библиография ссдернит 2И наименования.

Результаты s обсуждение.

Известные в настоящее время способы использования искуо-стаешшх субстратов в гакробиологии и биотехнологии сводятся к быстрому определешш' количества живых микроорганизмов в раздач:îhx процессах ели средах с помощи) специфического искусственного субстрата(5*г vitj 1986, Hcthn. 1987 и др.) или ис-следовакии ампнопептидазных ферментативных профилей (Vestfc^ 1957, Coèuin IS85 и др.). Однако один хромо- или флуороген-tiiiii субстрат ке ыожег дать информацию об однородности исследуемых клеток или их таксономической принадлежности, а определение с помощью аманопептидазных прафклеп требует длитель-

:;ого (до 24-х часов) инкубирования исследуемых хлетск с яенус-ствсипигя субстратами экикопептидаз- уЗ-нафти-дачядгга! ага*о-хнслот. Ярсмс того, агаяопептйдзза яЕЛявгся типичны:.:;: экзсфгр-ментамз и, следовательно, значительно подЕерт.'.зни влиянии условий роста 1 окрузасшей среды, т.е. требувт чрезвычайно точного выполнения всех зтзпсз анзлиза. Вез э~с ограничивает возможности их юрского применения.

В настоящей работе была вндвинутз гипотеза о зозкокностл использования нескольких искусственных субстратов специфичных применительно к бсльсаа группам прегзлудествеяпо эндоф-^рмелтов -дег'/дрсгейаз, сссфатаз, эстераз, лппзз. Предлагалось, что, з этом случае, участие з реакциях болюэго яплхчестм ахедгшх по своету действию фермектоз пртводит к более быстрому преобразс-зашэ субстратов до окрааенных или флуоресцирующих соединен:^!, создает устойчивость определения и мекыгуз зависимость ст условий роста и окруивсэЗ: средн.

Проверка выдвинутой гипотеза проводилась при иоцолъзова-гл р.та солей тетразолия - шютатсров дегидрогеназной активное::! .и бесцветных эфиров флуоресценнз, 4-метилумбеллиферона, а тзк;:.о резазурина - в качестве индикаторов фосфатазкой, эстеразной, липазной и дегадрогеназной активностей.

В результате были определены границы устойчивости получаемых ферментативных профилей-и разработана тр1 метода индикаиил и идентификации микроорганизмов с помощь» исхусствешшх субстратов.

Метод определения таксономической принадлежности микроорганизмов' с использованием солей тетразолия

Сущность методз заключается в восстановлена различных солей тетразолия дегидрогеназами гивых клеток до ярко-окразешшх чер-мазснов. В виду тоге, что виды :жкрооргакизмов различается по структуре и составу дегидрогеназного комплекса, а токге по проницаемости солей тетразолия з клетки и доступности молекул солей к дегидрогеназам, количество образовавшегося формазана различается у разных видов. Последнее было установлено экспериментально з процессе разработки методики экспрессного исслсдоваш*л таксономической принадлежности микроорганизмов.

\ 3.

Разраоотка включала ь себя выяснение ряда оптимальных физических, химических и оптических параметров. Так,были установлены оптимальные концентрации солей тетразолия (I мг/мл этанола) и установлен необходимый объем кх внесения в исследуемую суспензии микроорганизмов (0,2 мг/мл суспензии). Квйден иаилучпий раствор для инкубирования клеток (фосфатный буфер) и установлена величина его рН (Б,2). Определены температура 140 С) и время инкубирования (10 мин.) клеток с солями тетразолия. Установлена необходимость ингибирования реакции и условия его проведения. Выора:-: наилучиий реактив быстро тормозящий жизнедеятельность клеток и работу дегидрогеназ (формалин) и оптимальная концентрацм формалина (5£) в суспензии клеток.

При работе с различными видами микроорганизмов было установлено, что целесообразно проводить стандартизацию исследуемых суспензий по мутности. Б качестве стандарта установлена оптимальная мутность - 10 единиц мутности ( х 1С® кл/мл Ь^сЬеъ^с 1и'а соЦ 1Л-17 е дистиллированной воде).

Установлено, что спектрофотометры^ окрапенных клеток удобно и целесообразно проводить при длине волны пропускания 575.ны. Пои этом количественные характеристики образовавпегося форма-зана (#Тф) удобнее всего определять путем вычитания из величины пропускания контрольной пробы • (убитые фориалиноы клетки с добавленным к ним раствором соли тетразолия) величины пропускания окрашенной за счет -восстановления солей тетразолия пробы (£Т2):

Методика осуществлялась в трех вариантах: на спектрофотометре, не фотоэлектроколоринетре и визуально.

фотоэлектрсколориметрическкй вариант отличался тем, что ферментативный профиль микроорганизмов устанавливается го коэффициентам пропускания {X %). Оптическая плотность (О ) вв-т1шной суспензии плеток устанавливались = 18. В качестве контрольных проб (кюветы сравнения) готовились 2 кюветы с предварительно убитыми формалином клетками. Длина оптического пути кювет - 5 ш. '

При Еизуальном дифференцирования микроорганизмов реакции восстановления микроорганизмов проводились в планшетах дая иммунологических реакций. В этом случае к 12 суспензиям с объемом

ю.

0,15 глл какая и оптической плотностью 0 =13 добавляется по 0,03 ил раствора соответствующей соли тетразолля. Планшет инкубируется 10 кинут при 40°С, затем в какдув лунку добазля-ется по 0,07 мл Южного формальдегида. Планшет помешается на лист белой бумага и проводится визуальный учет результатов по 1С-балльпой системе. За 10 баллов принималась напоолее интенсивно окрашенная формазонсм суспензия.

Ферментативные профили могут быть представлены в графическом и цифровом выражении.

Так профиль £$сЬег1'¿(ио со С^ М—17. кемеренный с псмощьз спектрофотометра в графическом выракекин принимает следуюцпй еид (рис. I).

Щ

■

42 Ю

3 .

б

■ ! I ill_L_L__I__,

НТТ Тф МТХ нет СТ ТФ1 НН9 ГНС ТС ТТл ИТФ ТХ И.'ГГ соли

гггр-я

Рис. I. Оерментаглзный профиль £. со^ M-I7.

Анализ полученных результатов пояазыззет, что вез исследованные микроорганизмы-обладат специфическими дегвдрогеназшил профилями. Незначительные величины верхнего и низшего отклонения каждого элемента про-;лля объясняются тем, что дегидрогепззы являются типичными конститутивными ферментами.

Ыетодпка апробирована на КириЕСкоы Б X 3 для идентификации, видов рода Candida. ■

Варианты разработанной методики могут быть полезны в тех случаях, где требуется быстрое определение видовой прпнздлег:-кссгп клеток, анализ однородности используемых суспензий,.конт-осль состава смеш-энныг. популяций, Бместе с ген, чувстЕительнсст; ие-годг огрзкичигзется концентрасглгли маток в сусп=г.эпи 10 -- м7 хл/нл, что несколько ограничивает ecsmoxho'ct:: его поэтического при:.:епегая.

Таблица 2

Дегидрогеназные профили микроорганизмов полученные с использованием

фотоэлектроколориметра

Наименование

Коэффициенты 'пропускания (Т %) формазанов соответствующих солей тетразолия

• культуры 1 МТТ 1 ■ ТФ ! НТХ 1 нет ! СТ 1 ТФХ ! ННФ ! ТНС! ТС 1 ! ТТХ! НТФ; ТЖ 1 1 ИНТ

£?скеыс>иа со?1 М-17 63,2 96,0 71,5 55,3 62,2 96,5 49,1 53,4 67,2 98,7 78,0 83,5 68,1

5, 4 5.7 $.5 5,3 5,4 5,8 + 0,2 0,4 5,6 5,7 + 0,5 + 0,6 5,8

6ас;С6и5 сегеиз 92,5 101,9 87,3 77,5 82,0 98,5 58,2 63,5 92,2 98,5 82,1 79,2 92,7

0,7 0,8 0.6 5,4 5,5 5,7 0,4 5,3 5,6 5,6 + 0,4 0,3 5,8

Вас. (.Ыъ 1п$еси$ 91,1 98,1 78,4 68,9 77,8 98,5 52,0 60,1 87,2 98,8 75,3 81,0 85,5

0,6 5, 7 5,5 + 0,6 5,3 Ь. 9 5,4 + 0,5 5,8 5,7 + 0,5 5,5 + 0,6

77,5 98,7 74,2 57,5 6Ь,7 98,5 44,8 56,1 87,0 98,9 81,1 84,3 77,2

д / е и 51 $ 5,з 5,6 + 0,4 5,4 $,6 + 0,7 + 0,5 + 0,3 5,6 5,7 5,3 5,4 + 0,5

^ес^отстаЗ ом- 67,5 96,0 71,3 51,8 66,9 96,1 52,7 55,6 62,0 98,4 72,3 81,8 61,1

Ъаи^'са 0,3 5,5 5,6 + 0,4 5,3 ^ 0,5 + 0,4 5,2 5,6 5,3 + 0,5 + 0,4 5,4

Рэечс1отопа5 ^ -81,5 92,5 69,3 50,2 64,5 94,8 47,5 46,5 78,9 98,8 81,5 81,2 72,5

о теБССп ? + 0,6 ь 5,5 5,5 5,6 5,8 5,3 5,5 + 0,5 + 0,6 5,8 5,4 5.4

$ассЬаюкм(ус«$ 68,5 100,2 72,3 48,7 67,5 100,1 52,5 54,3 71,8 100,7 68,5 88,0 55,2

V 1 гн + 0,5 + 0,7 5,4 5,4 + 0,6 + 0,3 + 0,2 5,4 + 0,6 0,8 + 0,4 5,7 5,3

При визуальном наблюдении степени окраски профили принимают следующий вид (табл.3).

Таблица 3

Визуальные наблюдения степени окраски микроорганизмов (10-ти балльная система)

Название культуры

! Интенсивность окраски формазанами по 10-ти бальной системе

МЯТ ! ТФ I НТХ ! НОТ I СТ Г ТФХ I Ш1Ф ! НЮ 1 ТС ! НЮ ! ТЕ! 1ШТ

£$сЬег<'с1п'а со1с М-{7 $агс1па ¿бауа ЧТНегососсиз ¿и^еиэ В*аМи5 сегеи5 зтг 6 о с•£ £ ч я ¿иэге"^ Согсме&а^тмю ^¡трбех Сог^е&ас^есшт теоЬ'обап"»,. Засс^аю^сг? сггЫз'кяе 597 5асс\\а1оъуа$ сагибе гуе»^ И С<хнс1:с1а мон<-(1л£

СаггсЬс/а ^ I £ * 2

4 ' 0 I I 0 0 I 1 5 0 I 0

6 I 2 2 I 0 "2 3 ' 6 2 I 3

6 0 0 4 0 0 3 4 8 3 I 9

10 0 ь. 4 0 I 2 4 10 3 2 5

8 0 . I 3 0 I 1 4 Э 3 г 4

7 I 0 5 0 0 4 6 7 5 I 4

^ 7 0 0 I 0 0 I 7 7 5 I 4

4 Р 0 0 I . 0 1 I 0 0 0 5

. 4 0 0 I 0 0 I I I 0 0 6

5 0 0 4 0 0 I 2 2 I 0 7

5 0 0 3 0 0 0 I I 0 о. 5

5 0 0 ' 3 0 0 0 0 I I 0 5

6 0 I 5 I I I 2 2 I 0 5

5 0 0 ■ 4 0 0 0 I 0 0 0 7

Ю 0 I 4 0 . I 2 4 10 3 8 5

метод определен»! микроорганизмов с шкяцн» флуорогекнах субстратов-

Использование флуоресцснцт тлеет существенное преимущество по сравнению с фотометрией заключающееся в высокой чувствительности анализа. Б зависимости от величины возбуЕдающего света флуоресцентный анализ мозг.ет быть чувствительнее фотометрии в I00-IGÛ0 и более раз (Едекфренд, 1965).

Б разработках использовались вещества - индикатора ферментативной активности - флуорогеиные субстраты. Ка фосфатазы-4-.метчиумбеллифорцлфосфат (;ЛУ*) на ботеразн-флуоресцеивдиацетат (ФдА) к 4-меткдумбеллзферилацетат (ЫУА) ; ка лишзы-фйуоресцекндк-буп:рат (ФДо), 4-кетш1уцбеллгферилбутпрат (ЗБ) и 4-меТллу:.:йзл-лпфсриллальмитат (ЮТ); на дегпдрогеназы-резазурин (РЗЗ). Ггс,-ролпзуяеь или восстанавливаясь соответствующими группа ж ферментов фдуорогенаые вещества es бесцветных (за исключением РЗЗ) превратится в ярко флуоресцирующие соединения: флуоресцеин ( Л б. .¡Ющ( «Д<рл. 515нм), 4-уешлумб№1-:фсрон 220^, Лфл. 452^), резоруфин сЯб- 2S0, бЗО^Яфя. 5'75ру).

Более быстрое расцепление большими группа:® ферментов указанных флуорогенных субстратов значительно ускоряет получение ответа.

Еыдвинутое предположение о возможности дифференцирования микроорганизмов по активностям определенных ферментов исследовалось с помощью флуорогенных субстратов.

Разработка методики дифференцирования и идентификации клеток г.с профилям активности групп ферментов включала в себя отработку параметров подготовки пробы и порядка.учета величин флуоресценции.

В результате были установлены длины волн возбуждения и флуоресценции флуорофоров непосредственно в клеточной суспензии без окстрагирования - 325нм и 450нм для 4-ыетилумбеллиферона, 480ны к 515 нм флуоресцеина, 295, 520 ны возбуждения и-575 вы флуоресценции для резоруфина. Установлены верхние предельные концентрации клеток в объеме пробы не создающие эффекта экранирования флуоресценции, что соответствует 10 ед.мутности по стандарту мутности. Нижние предельные концентрации зависят, как выяснено, от ферментативной активности клеток, чувствительности прибора

к времена пнзубцрзгггдтя с' субстрате«. При этс.ч длительное инкубирование хлетоя с суАстрат&УЕ (до I часа и болг?е) дозволяет, в ряде случаев, анализировать млнроколичества клеток вплоть до л/мл.

Наилучсиы раствором для суспендироззния клеток является физиологический раствор. Он не вступает в реакции ни с одн:^.! из исследованных флуорогенных субстратов и обладает белее пла менее стабильным значением рН (около 7,0).

Работа по выяснении оптимальных концентрации флуорогенных субстратов добавляемых к единице объема суспензии показала, что оптимальным является добавление 0,2 мл раствора субстрата с концентрацией 0,1 мг/мл растворителя к I мл суспензии.

Установлена необходимость фиксации фермент-субстратных реакций и определено, что наилучшим является погружение инкубированных с:,;есей в Еоду с температурой 5-7°С (вода со льдом).

Проведены исследования фоновой флуоресценции.. Установлены ее причины и порядок учета путем постановки контроля - параллельное инкубирование субстратов с аналогичными .исследуемыми пробами отличающиеся тем, что- ¡слетки убиты нагреванием 3 жну?и при Ю0°С. '

Выяснено, что исследуемую ферментативную активность удобно рассчитывать -путем вычитания фоновой флуоресценции из общего сигнала флуоресценции:, ,

С/флуоресценции .= (/общей флуор. - <У фоновой флуор.

$ флуоресценции целесообразно рассчитывать относительно максимальной ферментативной активности.и выражать в процентах.

На основании разработанной методики были построены и проанализированы флуоресцентные ферментативные профили ряда микроорганизмов. Они могут быть выражены в графической и пкфровей форме (рис.2, та ВЯЛ}-

Полученные данные указывают на заметные отличия в ферментативных профилях микроорганизмов: все исследованные микроорганизмы обладают специфическими и достоверными величинами ферментативных активностей. Ферментативные профили могут быть получены с помощью большого спектра флуорогенных субстратов, как на основе одного флуоресцирующего вещества, так и различных флуоресцирующих веществ. Важнейшими преимуществами разработанной методика являются экспрессность анализа (10-20 минут) и возможность работы с малыми

С,

до-8о • по

60 so-АО-30 20 40

90-1 SO 70 «0-| 50 40 30 20 •fO

МУФ HYfl HY6 НУП

ИУФ МУА ИУ6 Н/П

"¿V

до

ео

70 н

60 5040 Z0

40

15.

МУФ МУЛ М/Б НУП

Е. coli M-ÍT B.triecjatheiium Sacch. ca^CsSci-

gensis ii

Рис. 2. Флуоресцентные профили микроорганизмов.

Таблица 4

Флуоресцентные профили микроорганизмов

Наименование микроорганизма

1 Флуорогенные субстраты. Флуоресценция f£fcnV ! внпаженя в % к максимуму v tji

1Ш

ЫУА | ЫУБ j ШП

64±Z,I 31 t 1,0 . 0

100 76 t 2¿2 33 t 1.5

8I±2,2 100 18 + 1,0

35tl;2 100 31 ± 1,5.

91+2,4 100. 0

74+2,1 100 0

100 62 t 2,3 II ± 1,1

39*1,2 100 5 ± 0,2

Í.CoCi M-I7 100

Settat.a wateescens ю ± о,5

&xc.an~tUtac.o(des 26 + 1,2 Bac.we^aüietium 6 t 0.3 Saícmft O

fteuc^ awiantica o Sactlicát&Eeqemistí 5 ± о.з

Candida spet ¡e$ io ± 1,0

концентрецияни клеток. Рассчитанные относительные величины флуоресценции получены на основании 30-50 изменений кандого профиля при коэффициенте Стьвдента ( t ) = 2,0.

Анализ ферментативного флуоресцентного профиля микроорганизма указывает на субстраты, даваие наибольший выход флуоресцирующего вещества. Эти субстраты могут быть использованы для определения микроколичеств данных клеток. Такой подход позволил разработать метод определения микроколичеств живых клеток рода Candida, остающихся после стадии термолиза биомассы на Киршпском биохимическом заводе. Достоверно определяется до Ю3 кл/мл после I ч. инкубирования биомассы со смесью МУА и МУБ. Результаты проведенной проверки разработанного метода подтвервдены актом испытаний, приложенным к диссертации.

Метод двойного флуоресцентного окрашивания клеток микроорганизмов

Существующие фсу^рогенные субстраты на группы ферментов дают вещества флуоресцирующие в различных областях спектра (450нм, 515нм, 575км и др.). lía этом основании было выдвинуто предположение о возмолшг-ти окрашивания клеток в пробе одновременно двумя флуоресцирующими веществами с разными спектральными максимумами. В этом случае каждая клетка в суспензии должна приобрести определенный цвет флуоресценции вхзависимости от количества этих веществ, а соотношения величин флуоресценция может служить характеристикой таксономической принадлежности клеток.

Анализ оптимальной пары флуоресцирующих веществ показал, что наиболее удобной парой являются флуоресцеин - резоруфин. Оба вещества обладают сравнимым квантовым выходом, не обладают переносом энергии с одного вещества на другое, а максимумы флуоресценций (515кы - флуоресцеин и 575км - резоруфин)' отстоят друг от друга на бОны.

Расстояние в бОнм не всегда обеспечивает хорошее разделение двух пиков, особенно когда один из них намного болыке другого. Поэтому, с целы> лучшей дифференциации пиков, после анализа спектральных характеристик цветного оптического стекла и различных комбинаций фильтров была установлена целесообразность использования фильтра ЭС-7. йшьтр ЭС-7 обладает специфическим спектром пропускания и имеет два пика пропускания совпадающих с

флуоресценцией флуоресцеина к розсруфана - 520 и 580км.

Еис.З. Спектра флуоресценции микроорганизмов окрашенных флуоресцеиноы (515нм) и резоруфЕнсм (575км).

Величины отношения ( и.) характеризующие отношения дегкд-рогеназной активности к эстеразной по разработанной методике представлены на табл. 5.

Таблица 5

Отношения двух ферментативных активностей некоторых ьшкрооргашвызв

Наименование ! п ! Наименование ! „

микроорганизм . ! ' ! микроорганизмов !

сов: 1<;-17 о,1+о,сь У)Ьс1сеоееи$ Ыеиз 1234 2,0+0,1

(кис/ошиавситЛса 3,8+0,3 5агс('иа ■ 0,2±0,05

Йеис/омонаа {^иотсап 4,о7о,3 Со^шИа^Ши*» з'нър^ы 1.4+0,06

Рае^М ЬкиИнС]1ег191$ 3,4^0,2 вйсе-Ьаю^сгз сешШаеШ 1,8+0,:

Вас^ сльеиз 2,7±0,2 §аес1иСаг^8е^дгй$1'5 Н 3,0+0,1

Вас»Сбив 1,1+0,1 Саиг/.^а ¿¿Кмспг?7«еV/ 1,5+0,2

ВааМиЭ ъи^ЪЪз 2,3+0,1 Цв//и1й са^ргШсц 2,8*0,2 Вас^ ¿^есПв 6,6+0,2

гесчет откопений ПО проводился :е> фоомуле: /ч _ M

_ Si 5" JSib'y

/и *, О515 ~~Уb'Tb'ç

где J 5j5 н J С75 - макскмуьш флуоресценции исследуемых проб,

С/ Ы5ф :: 0 575ф " Флуоресценция проб с кпактиБкрсвви-ккми нагреванием клетками.

¡¿етод рекомендуется для индикации гомогенности исследуемых суспензий - отклонения от отнесения (и) указывает ка загрязнение исследуемой суспензии. Наблюдение клеток на флуоресцентном ш:кроскспе позволяет визуально дифференцировать клетки по цвету ис флуоресценции. Использование проточных микрофлусркметрггческкх систем может дать возможности дифференциации смесей клетск или определение единичных искомых клеток на фоне примесей биологической и минеральной природы. Ыетод внедрен во HillK биологического приборостроения для анализа гомогенности культур. Справка о" внедрении прилагается к диссертации.

Исследования надежности и воспроизводимости ферментативных профилей

.Ферментативная активность зависит fcaK от генетических особенностей вида микроорганизм, так и от условий роста, возраста и состава питательной среды. Поэтому, для установления грашщ применимости разработанных методик исследовалась стабильность и воспроизводимость ферментативных профилей при различных условиях роста, состава среды и возраста клеток.

Исследовалось влияние консистенции и состава питательных сред на ферментативные флуоресцентные и дегидрогеназные профили. В результате этих исследований было установлено, что консистенция питательной среды (ыясо-пептонный агар - ША и ыясо-пептонный бульон - ШБ) не влияет на дегвдрогеназные пробили микроорганизмов. Исключение составляет ИНТ заметно активнее восстанавливающийся клетками выроссими на ША. Отношения ферментативных активностей, изучаемых с помощью флуорогекных субстратов, сохраняются у клетск выросшх на ША и ШБ. Однако заметны различия в абсолютных величинах флуоресценции - у клеток выроссих sa ifflA они несколько высе. Ввиду того, что расчет флуоресцентных профилей

ведется по процентном отнозекиян одних флуоресцекцпй другим -эти изменения не сшзл практической ценности ыетоддк.

Влияние состава питательней с роды изучалось на примере сред Гисса с различными углеводами (глюкоза, сахароза. лахтезз, мель-то за и манпкт), Установлено, что как дггпдрогеказнкз, так и флу-сросаэчткыо г.ргфдлл клеток выросши на различных средах Гиссз имеют стклске;:ил ъ пределах допустимых отклонений для клеток вь-рсс:^цх на Следовательно, состав питательной среды практически не влияет ¡¿а ферментативные ирефлли.

Лсследования зависимости ферментативного профиля от длительно с тд роста микроорганизма показал;;, что догпдрогеказные л флуоресцентные прожгли практически не зависят от фазы роста гультурн (см. табл. 6).

Таблица 5

Зависимость дегндрогекэзпых профилей от стадии роста клеток

ч ¡Стадии рсстз ьотсроергапизмев (чзе.).

ЬсьаьйиВоЬле соли {Коэффициент пропускана { Г %) Фср-азан;

д

тетразолкя !■ 4 : 1С! 17 ! 24 ! 48

iscbetidiia coii м-17

LITT 64 63 64 63 ■ 65

тне 54 53 53 53 ■ 55

ПНТ 68 • 68 67 68 69

ßaciCfus ihuxin^iensis

CT 76 77 77 73 .02

THC 57 • 56 56 57 62

ШТ 75 77 77 78 63

Характерным является достаточно высокая стабильность проблей и отношений (и). При этом спорообразуюте виды (ßaci CCuS "¿tiU-tMjjienS/S и5.с£гб"3) в фазах отирания характеризуются заметными феpu е нтативш&ш изменениями связанными со спорообразованием.

Установлено также, что абсолютные величины флуоресценции заметно меняются от возраста культуры. Так культуры, Еырссппе за 24 ч. на ША сравнивались с такай ze культурами, но после их 6-ти суточного хранения в холодильнике при 4°С. Csesne культуры £ со@< ы-17 даат абсолютные величина фдуоресценцет з 1,3 раза

ТаСлзша 7

Ззвпспкость отнозенгй фер'ентг'лгдных ахгсзностей клеток от стэдг,-; роста .

7Г

название

культуры

!Отношение ( n ) ¡периоды роста (часы)

, ~н5 б разные

! 8 ! 24 ! 43 ! 72

tschezichiu cod ;.:_17 6 5 7 6

?S4udcmonas Quiahtita 54 57 56 eo

Sa tLiiia Cava 0,2 0,3 0,2 0,2

Bac.^uS cetews 15 1-3 16 24

мечьце чей старые; у б, cct2mS флуоресценция cseie^ :<ультуры г 1,2 раза акзе, а у Satc<па {lava флуоресценция стагой культуры только б 1,1 раза высе свежей.

Исследования температуры выращивания различных еидсз (2о"С, и 40сС) показали полную независимость дэгялроггкззкых и флуоресцентных профилей и" отношений от температуры роете клеток.

Таким образом разработанные методики дрг^йкнмы для хлеток выросших на разных питательных средах,-при различных тгмпгрзтурах и находящихся в различных фазах роста. Установленные отклонения б профилях практически (при их учёте) не скижзет зозмс-ностей внедрения методов в микробиологической и пищевой проиыщленностн.

Заключение

1. Впервые предложены, исследованы и разработаны скспресс- методы определения з дифференцирования микроорганизмов с помещьв ряда искусственных субстратов за блльлае группы фергэнтов - дегндро-геназ, фосфатаз, эстераз д дгпаз. Установлено, что определяемые величины пропускания или флуоресценции продуктов восстановления или гидредвза искусственных субстратов могут слухать характеристиками таксономической принадлежности зсследуемых микроорганизмов.

2. Предложен и разработан метод экспрессного фотометрического определения и идентификации микроорганизмов па основа восстановлена.-: дегидрогеназамя рада бесцветкях солей тетразолия до ярко скрашенных форказаяов. Проведен анализ специфичности получаемых профилей ферментативных антазнсстей. Показано, что микроорганизмы надежно

а достоверно идентлфзцируЕтся по специфическим профилям фергентативко{ ной алгявностз, вплоть до вала.

3. Лредлогеа 2 разработан новый метод экспрессного и чувствительного определения п идентификации микроорганизмов с помогал ряда фдуорогешых субстратов ка основа их гидролиза 2x2 Еоссга-ноыгекия до фяуорасцирувцвх соединен» группами ферментов -фатаза^с!, эстеразолш, ¿линзами а дегддрогеназами. Показана возможность определения ж идентификации шкрооргакизаов по профили флуоресценции с гаоокоЗ достоверность*).

4. Предложен и разработан метод дифференцирования микрсоргандз мов по откопекилм двух ферментативных активностей, определяемых

с помощью фдуорогеЕных субстратоз, дасщгх флуоресцеыдаз в разных частях спектра.

5. Лссдедокаа"та дегидрогепазк^с я глуоресцентные ферментативные профили «акроорганззма, а. такзо отна&спя двух ферментативных активностей услсЕиЙ роста культура, .возраста микроорганизмез и состава питательней среды. Установлена степень надежности предлагаемое методов а их воспроизводимость.

6. Даны рекомендации по практическому испсльзсьаяиз разработок в шалевой и микробиологической прьащлгкдостп.

Список опубликовагшпх ргЗст

I. Ал?. сад. СССР И246601 "ДЯ CI2CÍ I/C4 / Всробвсз С.А., Газс-кко C.B., Земляков B.I., Хухласв К.К. Способ слреде-лъзал бактерий в ;лпцк1:х средах Заяв. .'.'3741382, приор, о? 2I.C5.84, зарегпст. 22.C3.oG - Eai:. :.":3

2. Авт. с в;: д. СССР Ш440917, ïl-Cl CI2S, I/C4 /Газснко C.B. Cr.ccoí опредслегая таксоно.таческоЛ принадлежности г.гикро-организков - Задв. .','4244258, приор, от 12.05.87., зароглст.

01.08.80.- Бхшг.Ш

3. Авт. свпд. СССР JH564I93, Î.KI CI2Q, 1/04 / Газешсо C.B., Кормов Н.Н. Способ контроля процесса культивирования микроорганизмов - Занв. М453230, приор, от СТ.07.СО., зарегпстр. 15.01.90. - Ешл. JSI8