Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов - этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов - этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи"

На правах рукописи

ОКСАНИЧ Алексей Сергеевич

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ В ВОДЕ И КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ ВИРУСОВ - ЭТИОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ФЕКАЛЬНО-ОРАЛЬНЫМ МЕХАНИЗМОМ ПЕРЕДАЧИ

03 00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ 164138

Москва - 2008

003164198

Работа выполнена в ГУ НИИ вакцин и сывороток имени И И Мечникова РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Зверев Виталий Васильевич

кандидат биологических наук Файзулоев Евгений Бахтиерович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Маркушин Станислав Георгиевич

доктор биологических наук, профессор Бойченко Марина Николаевна

Ведущая организация:

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М П Чумакова РАМН

Защита диссертации состоится 28 февраля 2008 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001 035 01 в ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН по адресу 105064, г Москва, Малый Казенный пер , д 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Автореферат разослан « м » г£нёарЛ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Яковлева И В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последние голы на территории России имели место многочисленные вспышки инфекционных заболеваний с водным путем передачи, в частности, гепатита А, ротавирусного гастроэнтерита, энтеровирусною менингита и др В то же время часто peí истрировались вспышки инфекционных кишечных заболевании с неясной этиолотией Затруднения при определении возбудителей этих заболеваний отчасти связаны с несорершенством используемых методов выявления кишечных вирусов

Наиболее сложным этапом вирусологическою контроля воды является процесс концентрирования вирусов В настоящее время в распоряжении санитарных вирусологов имеется ряд методов концентрирования вирусов из воды (Конторович В Б, 1996, Амвросьева ТВ, 1999), которые нуждаются в оптимизации, в основном за счет применения новых, доступных и высокоэффективных адсорбирующих материалов В этой связи поиск и изучение новых сорбентов на сегодняшний день является весьма актуальной задачей

Значимость кишечных вирусов в инфекциониои патологии человека опредеияет необходимость их своевременною выявления До настоящею времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации (РН) с типоспепифическими сыворотками в культуре чувствительных клеток В научных исследованиях эффективно применяют реакции прямой и непрямой иммунофлуорссценции, характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с РН Сложность, длительность и трудоемкость РН обусловлена ра ¡личной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода En tero virus и множеством их антигенных вариантов По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энгеровирусов Кроме

тою, ряд кишечных вирусов (например, калицивирусы и вирус гепатита А) с трудом поддаются культивированию Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как ПЦР с гибридизационной идентификацией продуктов амплификации, мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени (Голицына JI Н , 2002, Fout G S , 2003, Egger D , 1995, Li J W , 2002)

Цели и задачи исследования.

Целью настоящего исследования была разработка методов концентрирования энтеровирусов, аденовирусов и вируса гепаппа А из воды, а также их выявления в сточных водах и фекальных суспензиях методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Синтезировать на основе магнитных микрочастиц несколько вариантов сорбентов для концентрирования вирусов из воды

2 Отработать методы количественного учета ДНК и РНК кишечных вирусов для оценки эффективности концентрирования вирусов из воды

3 В модельных экспериментах оценить эффективность концентрирования вирусов из воды с применением синтезированных сорбентов

4 Подобрать праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Г1ЦР-РВ) для выявления аденовирусов (АВ), эшеровирусов (ЭВ) и вируса leiwiHra А (В1 А) в мультиплексном формате и тестировать их на лабораторных штаммах вирусов

5 Провести сравнительный анализ клинических образцов от пациентов с ОКИ методами мультиплексной ПЦР-РВ и культуры клеток

6 Проанализировать образцы элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из образцов сточных вод, на наличие АВ, ЭВ и ВГА

методами мультиплексной ПЦР-РВ и ПЦР интегрированной с культуральпым методом

Научная новизна работы.

1 Впервые показана возможность с высокой эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния

2 Впервые в России разработан метод для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля, основанный на мучьтигшексиой ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени

3 Для оценки эффективности конценгрирования кишечных вирусов из воды был предложен оригинальный метод, основанный па количественном определении вирусных нуклеиновых кислот с помощью ГЩР-РВ

Практическая значимость.

1 Сорбент на основе магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, может быть использован для высокоэффективного концентрирования кишечных вирусов из воды Магнитные свойства сорбента позволяют собирать его проточным методом с помощью сильных магнитов, описанным в настоящей работе, не прибег ая к центрифугированию больших объемов воды Метод может быть использован дт контроля за санитарным состоянием источников водоснабжения

2 Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекциеи в режиме реального времени для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А может использоваться в качестве тест-системы как для контроля за вирусной контаминациеи воды (после стадии концентрирования вирусов), так и

для анализа лизатов клеточных культур, зараженных вирусным материалом, а также в диагностике ОКИ

3 Разработанные методы количественного определения вирусных ДНК и РНК могут быть использованы для контроля за активностью вирусной репродукции и эффективностью противовирусной терапии у пациентов, а также в научных исследованиях при испытании противовирусных препаратов в культурах клеток и на лабораторных животных

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Магнитные микрочастицы, покрытые модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, позволяют с достаточно высокой степенью эффективности концентрировать кишечные вирусы из воды

2 Разработанная мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени позволяет выявлять аденовирусы, энтеровирусы и вирус гепатита А в клинических образцах, лизатах зараженных клеточных культур, и элюатах, полученных в результате концентрирования вирусов из воды

3 Применение метода выделения нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов нуклеиновых кислот (НК), свободных от ингибиторов обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР

4 Количественная ПЦР-РВ может быть использована как метод оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды

Апробация работы состоялась 9 ноября 2007 года на заседании Ученого совета ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН Результаты исследований представлены и обсуждены на Всероссийской научно-

практической конференции с международным участием «Актуальные проблгмы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья» (Самара, 2006 г), на IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г) и на II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоронье» (Рязань, 2007 г)

II убликации. По материалам диссертации в научных журналах («Вопросы вирусологии», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», «Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии») и сборниках опубликовано 4 статьи, а также тсзисы 3-х докладов на научных конференциях

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 150 источников отечественных и зарубежных авторов Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 22 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования. Для концентрирования вирусов из воды использовали две модификации сорбента магнитные микрочастицы (магнетит), покрытые полимером диоксида кремния (ММ) и ММ с положительным зарядом (ММ+) Дтя получения положительно заряженного сорбента ММ обрабатывали 3-аминопропилтриметоксисиланом Сорбенты были синтезированы в условиях лаборатории по методике, приведенной в патенте США US4554088, 1985 i (Whitehead R А с соавюрами, 1985)

Для проведения модельных экспериментов по концентрированию вирусов из воды, а также для оценки чувствительности и специфичности праймеров и зондов для ПЦР-РВ использовали лабораторные штаммы ЭВ, АВ и клинические образцы содержащие ВГА Использованные в исследованиях лабораторные штаммы ЭВ вирус Коксаки В (не типирован), вирусы ECHO (серотипы 3, 6, 7, 30), вакцинные штаммы Сэбина полиовирусов типов 1, 2 и 3, а также 30 клинических фекальных суспензий от здоровых детей и больных с различными диагнозами (острый вялый паралич, серозный менингит, энтеровирусная инфекция) и 66 образцов сточных вод были получены из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им M П Чумакова РАМН, Москва Лабораюрные штаммы АВ (серотипы 2, 3, 5, 7 и 8) и вирус парагриппа 2 типа (ВПГ-2) были любезно предоставлены Сомининой А А , ГУ НИИ гриппа РАМП, CaHKT-IIeiep6ypi Два клинических образца, содержащих ВГА, были получены из Инфекционной клинической больницы №1 города Москвы

АВ размножали в культуре клеток HeLa, вирус Коксаки В и полиовирусы -в культуре клеток НЕр-2, а вирусы ECHO - в клетках RD АВ и ЭВ получали из лизата зараженных культур клегок, ВГА экстрагировали из фекалий больных гепатитом А Диагноз «вирусный гепатит А» у этих пациентов был подтвержден методом ИФА Наличие вируса в культуральных и клинических образцах контролировали методом трансмиссивной электронной микроскопии

Выделение нуклеиновых кислот (НК) проводили с использованием коммерческого набора для выделения РНК из плазмы крови фирмы «Изоген» (Россия) либо по модифицированной методике Boom R с соавт орами (Boom R , 1990), используя в качестве сорбента не силикагель, как в вышеуказанной методике, а сорбент ММ

Для подбора праймеров и зондов для ПЦР-РВ проводили множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей ЭВ, АВ и ВГА Нуклеотидные последовательности были получены из электронной базы данных GenBank (NCBI) Для компьютерного анализа нуклеотидных

последовательностей использовали программы Vector NTI 9 0 0 (Infomax, США) и OMIGA 2 0 (Oxford Molecular, США) Праймеры и меченные фчуоресцснтными красителями зонды были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия)

Ргакцию обратной транскрипции проводили в амплификаторе «Тсрцик» («ДНК-Технология», Россия) Качественный и количественный анализ образцов вирусной ДНК и РНК методом ПЦР-РВ проводили на приборе ЛНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия) Параллельно с мультиплексной ПЦР-РВ выявление вирусов в фекальных суспензиях и образцах сточных вод проводили в культурах клеток НЕр-2 и RD по цитоилтогенному действию, а типирование - в реакции нейтрализации с типоснецифическими сыворотками (Manual for the virological investigation of poliomyelitis WHO, Geneva, 1990)

Для расчета концентрации HK АВ, ЭВ и ВГА в реакционной смеси строили калибровочные прямые, которые отражали зависимость числа копий в реакционной смеси от значения порогового цикла Для построения калибровочных прямых проводили ПЦР-РВ на 10-кратных разведениях стандартов ДНК (калибраторов) для АВ, ЭВ и ВГА и с использованием программного обеспечения к прибору АНК-32 строили калибровочные прямые Калибраторы представляли собой ПЦР-продукты АВ (3 серотип), ЭВ (эховирус 6 типа) и ВГА (клиническии образец), встроенные в плазмиду pGEM7Zf+ (Promega) по сайту рестрикции Smal

Разработка методов концентрирования вирусов из воды. Методы концентрирования вирусов из воды, используемые в мировои практике, в основном базируются на дорогосюящем методе ультрафильтрации, либо требуют центрифугирования больших объемов воды или использования ультра центрифуг Учитывая материально-техническое обеспечение российских лабораторий, применение таких методов в нашей стране ограничено Поэтому

было решено изучить эффективность альтернативных способов концентрирования вирусов. С этой целью были синтезированы мелкодисперсные сорбенты на основе полимера диоксида кремния, которые способны быстро распределяться по всему объему исследуемого образца, снижая, таким образом, время адсорбции (рис. 1).

Рис. 1. Микрофотография сорбентов ММ+ и ММ и их схематическое изображение. А - магнитные микрочастицы, покрытые полимером диоксида кремния и обработанные З-амииопропштриметоксисиланом. Б — магнитные микрочастицы, покрытые полимером диоксида кремния.

Для решения проблемы сбора частиц, сорбент был химически связан с магнетитом, который легко можно собрать с помощью магнита. Размер синтезированных частиц ММ и ММ+ неоднороден и варьирует от 2 до 10 мкм. Как показали эксперименты, такой размер является оптимальным, так как

обеспечивает распределение сорбента по всему объему воды и хорошо собирается магнитом ММ+ представляют собой разрозненные частицы, не склонные к образованию агрегатов, это обусловлено одноименным, поло» ительным зарядом частиц, что приводит к электростатическому отталкиванию ММ, напротив, в воде образуют скопления, которые при интенсивном встряхивании обратимо разрушаются (рис 1)

Согласно литературным данным, механизм адсорбции белков и вирусов на поверхности диоксида кремния представляет собой комплекс ра¡личных видов взаимодействий силанолов (оставшиеся после полимеризации на поверхности не прореагировавшие гидроксильные группы, -51-ОН) и доступных для взаимодействия полисилоксановых связей (31-0-50 с белками При рН выше 4,0 силанолы имеют ионизированную форм> (ЯЮ") и могут притягивать некоторые положительно заряженные ионы за счет электростатических взаимодействий С другой стороны, полисилоксановые связи обладают гидрофобными свойствами По всей видимости, данный тип связи играет наиботсс важную роль при концентрировании белков и вирусов из воды Третий тип взаимодействий диоксида кремния с белками - это водородные связи Однако в водных условиях водородное взаимодействие между аминными группами и диоксидом кремния случается не так часто, чаще аминная и силанольные группы гидратируются молекулами воды Поэтому есть основание полагсть, что взаимодеиствие белков и вирусов с полимером диоксида кремния, находящимся на поверхности ММ, в основном представлено комбинацией электростатических и гидрофобных связей Что касается сорбента ММ+, то его положительный заряд в водных условиях позволяет значительно усилить электростатическое взаимодействие с вирусными капсидными белками, это особенно важно при концентрировании вирусов из больших объемов воды

С целью определения механизмов сорбции и влияния внешних условий на сорбционные процессы был проведен ряд модетьных экспериментов по концентрированию белков из воды с помощью нейтрально заряженного

сорбента ММ и сорбента ММ с отрицательным зарядом (далее ММ-). Такой сорбент получали обрабатывая сорбент ММ гидроксидом натрия.

В качестве модельного белка был выбран бычий сывороточный альбумин (БСА), так как его изоэлектрическая точка (р1) близка к р1 капсидных белков исследуемых нами вирусов.

В ходе экспериментов были подобраны оптимальные условия сорбции и элгоции, определены динамика сорбции и ориентировочная емкость сорбентов (рис. 2). В экспериментах изучалось влияние рН и заряда частиц на сорбцию белка и влияние лизоцима на эффективность элюции. Лизоцим добавляли в элюирующий раствор в качестве белка, конкурирующего с БСА за поверхность сорбента.

кДа 1234 56789 10

116,0

66,2 шрш«*«*

45,0 ш

35,0 'ШР

25,0 тт

18,4+14,4

Рис 2. Адсорбция БСА на магнитном сорбенте. 1-белковый весовой маркер; 2-исходный раствор БСА; 3-сорбция в нейтральном рН, сорбент ММ; 4-то же, элюция с добавлением лизоцима; 5-сорбция в нейтральном рН, сорбент, ММ-; 6-то же, элюция с добавлением лизоцима; 7-рН раствора 3,5, сорбент ММ-; 8-то лее, элюция с добавлением лизоцима; 9-рН раствора 3,5, сорбент ММ; 10-то же, элюция с добавлением лизоцима. Электрофорез в 8% ПААГ по Лэммли (Остерман Л.А., 1981).

На рисунке 2 представлены результаты электрофорстического анализа препаратов БСА, полученных в результате элюции с сорбентов ММ и ММ-Эксперименты с БСА показали, что максимальная емкость сорбента ММ набчюдалась при нейтральном значении рН, а сорбента ММ- при рН 3,5, и составила око по 20 мг белка на 1 мл взвеси сорбента Для полной адсорбции БСА из воды в этих условиях требовалось примерно 30 минут

Как известно, капсидные белки кишечных вирусов в воде имеют отрицательный заряд Это связано с тем, что pi поверхностных белков всех кишечных вирусов ниже рН воды Например значения pi гексона и пентона аденовирусов составляют 4,55 и 4,69 соответственно (Adam Е , 1977) Поэтому в случае, когда сорбент несет одноименный с вирусом заряд, эффективность концентрирования может заметно снижаться за счет электростатического отталкивания или усиливаться при разноименных зарядах

Основным методом для определения эффективности концентрирования вирусов из воды на сорбентах ММ и ММ+ была количественная ПЦР-РВ с внутренним положительным контролем (ВПК) Применение внутреннего положительного контроля позволило контролировать все этапы анализа выделение нуклеиновых кислот, стадию обратной транскрипции и ПЦР, и избежать неправильной интерпретации результатов из-за возможного присутствия ингибиторов в исследуемых образцах, низкой активности ферментов или ошибочных действий исследователя Методы количественного определения вирусных НК были протестированы на серийных разведениях лабораторных штаммов АВ, ЭВ и ВГА и показали высокую эффективность Количественная оценка вирусных НК дает возможность оценивать степень вирусной контаминации образцов воды и избегать в некоторых случаях, использования более трудоемкого и длительного культурального метода ПЦР-РВ занимает не более 1 дня, в отличие от культурального метода, который может занимать более недели

В серии модельных экспериментов была определена эффективность концентрирования кишечных вирусов из воды с помощью сорбентов ММ и ММ+ Под эффективностью концентрирования подразумевали отношение количества копий НК в элюате к количеству копий в исходном образце, выраженное в процентах При концентрировании полиовируса 1 типа (ПВ1) и аденовируса 3 серотила (АВЗ) из 50 мл водопроводной воды эффективность концентрирования на сорбеше ММ была несколько выше, чем на ММ+ и составляла 90,1 и 87,3%, соответственно дчя ПВ1 и АВЗ (табл 1) Использование ММ в небольших объемах исследуемого образца давало возможность после концентрирования вирусов проводить выделение вирусных НК на этом же сорбенте Это позволило увеличить чувствительность метода и добиться высокого выхода вирусных НК в элюате по отношению к исходному количеству Для ВГА лучшие результаты при концентрировании вируса из 50 мл воды были получены с использованием ММ+ - эффективность концентрирования сосгавила 82,1% (табл 1)

Результаты, полученные при концентрировании вирусов из 50 мл воды и достигающие более 90%, при степени концентрирования в 500 раз (вирус концентрируется с 50 мл до 100 мкл), обратили наше внимание на методы, используемые в настоящее время в РФ, для концентрирования вирусов из воды Было решено испытать метод концентрирования вирусов на ММ и ММ+ в качестве 2-го этапа при 2-х этапном методе (Методические указания №4 2 2029-05), заменив, таким образом, переосаждение сульфатом аммония Двухэтапный метод концентрирования вирусов из воды предпола1 ает на первом этапе концентрирование вирусов на ионообменной смоле и элюцию в 100 мл глицинового буфера рН 11,5, а на втором - осаждение вирусов насыщенным рас!вором сульфаы аммония Применение магнитных сорбентов для концентрирования вирусов из глицинового буфера позволило сократить время анализа, снизить его трудоемкость и повысить чувствительность метода за счет уменьшения объема элюам с 1-2 мл, как при двухэтапном меюде, до

100-150 мкл Малый объем элюата дает возможность повысить чувствительность дальнейшего анализа образцов методом ПЦР-РВ Эффективность концентрирования вирусов из 150 мл 25 мМ глицинового буфера на ММ составила для АВЗ - 91,9%, а для ПВ1 - 36,6%, для сорбента ММ+ эти показатели составили 26,8 и 7,2%, соответственно (табл 1) Возможно, глицин, который часто используют в качестве элюента для белков, снижает эффективность сорбции вирусов на сорбенте ММ+

Одной из задач настоящей работы было испытание сорбентов для концентрирования вирусов из больших объемов воды Для решения этой задачи были проведены модельные эксперименты по концентрированию АВЗ, IIB1 и ВГА из 1 л водопроводной воды В результате выход вируса на сорбенте ММ+ составил 76,9, 81,9 и 88,5%, а на сорбенте ММ - 8,4, 13,8 и 12,0% для АВЗ, ПВ1 и ВГ'А, соответственно (табл 1) Степень концентрирования во всех экспериментах составила 1000 раз

Таким образом, при концентрировании вирусов из 1 литра воды более высокий выход обеспечивал сорбент ММ+ Это можно объяснить тем, что аминсгруппы сорбента в слабокислых условиях воды (рН 6,0-6,5) имеют положительный заряд, обеспечивающий высокую эффективность концентрирования вируса за счет электростатических взаимодействий сорбента с вирионами, отрицательно заряженными при значениях рН выше 5,0

Одна из сложностей метода — это нробчема полного сбора магнитных микрочастиц из больших объемов воды Первоначально магнитные микрочастицы концентрировали в стеклянных бутылях, используя сильные редко¡емельные магниты, но при этом неизбежно возникали потери сорбента (до 20%) Для решения этой проблемы был отработан проточный метод концентрирования магнитных микрочастиц из больших объемов воды, позволяющий собирать сорбент с потерями менее 3%

Таблица 1

Эффективность концентрирования кишечных вирусов из воды и глицинового буфера (рН=7,0) на

сорбентах ММ и ММ+.

Вирус Выход вируса из 50 мл воды, в %±sx Выход вируса из 150 мл 25 чМ глицинового буфера (рН=7,0), в %±sx Выход вируса из 1 л воды, %±sx

ММ ММ+ ММ ММ+ ММ ММ+

Аденовирус 3 серотипа 87,3±7,4 67,5±4,7 91,9±3,8*** 26,8±5,0 8,4±2,0 76,9±10,5**

Полиовирус 1 типа 90Д±1,7 79,0±8,0 36,6±9,4* 7,2±4,5 13,8±5,4 81,9±5,0***

Вирус гепатита А (клинический образец) 23,4±6,2 82,1±8,3** - - 12,0±б,4 88,5±4,9***

Примечание Значимость различии при сравнении эффективности концентрирования АВЗ, ПВ1 и ВГА на сорбентах ММ и ММ+ составила * - Р<0,05, ** - Р<0,01 и***- Р<0,001

Разработка метода мультиплексной Г1ЦР-РВ с внутренним положительным контролем для выявления ДНК и РНК кишечных вирусов. В ходе работы были проанализированы нуклеотидные последовательности гена гексона 51 серотипа AB (Файзулоев Е.Б., 2005), 116 полиоразмерных геномов ЭВ, а также 72 геномных последовательностей ВГА, из которых 27 - полноразмерные геномы, а 45 - фрагменты, кодирующие вирусный белок 2С. К консервативным участкам геномов были подобраны праймеры и меченные различными флуоресцентными красителями зонды для ПЦР-РВ, что позволило в одной пробирке проводить и детектировать до 4-х независимых реакций.

Специфичность праймеров оценивали в мультиплексной ПЦР-РВ с использованием 8 штаммов ЭВ, 5 штаммов AB и 2 клинических образцов, содержащих ВГА. В результате была показана высокая специфичность праймеров (рис. 3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 3. Оценка специфичности праймеров к АВ, ЭВ и ВГА в мультиплексной реакции. 1 - весовой ДНК-маркер; 2-6 - АВ 2, 3, 5, 7 и 8-го серотипов, соответственно; 8-15 ЭВ: ECHO 3 и 6, Коксаки В ( не типирован), полиовирусы 1, 2 и 3 (вакцинные штаммы Сэбина), ECHO 7 и 30, соответственно; 17, 18 - клинические образцы с ВГА; 7, 16 и 19 - «минус»-контроли.

Далее сравнивали эффективность ПЦР-РВ в мультиплексной и моноспецифическои реакции Было исследовано влияние неспецифических праймеров на реакцию ОТ, а также неспецифических праймеров и зондов на ПЦР-РВ Для этого на одном вирусном материале проводили моноспецифическую и мультиплексную ОТ-ИЦР-РВ, сравнивая пороговые циклы (Ct) НК выделяли из 10-кратных разведений вирусного материала Для контроля выделения НК, а 1акже реакций ОТ и ПЦР, и влияния на них условий реакции или ингибиторов использовали внутренний положительный контроль, который представлял собой лизат культуры клегок Vero, зараженной ВПГ-2 Внутренний положительный контроль добавляли к исследуемому образцу непосредственно перед выделением НК

Таблица 2

Сравнение эффективности ПЦР при амплификации ЭВ, ВГА и АВ в мультиплексной и моноспецифической реакциях.

ХРсакция Развел c-n. ние вируса N. Мультиплексная реакция, Ct±sx Моноспецифическая реакция, C,±sy Внутренний положительный контроль, Ct±sx

Энтеровирус (полиовирус 3)

10' 26,54+0,09 26 99±0,02 34,64±0,24

10' 30,18±0,26 30,12±0 50 34,11+0,06

10J 33,45±0,14 33,93±0,И 34,70±0,45

Вирус гепатита А (клинический образец)

10 1 29,01 ±0,24 30,07±0,27 34 34±0,18

10 2 32,42±0,30 34,17±0,22 34,66±0,05

10' 35,46±0,39 37,22±0,26 34,99±0,35

Аденовирус (3 серотип)

10 30 13±0 03 30,28±0,39 34,21 ±0,09

ю-4 33,01+0 20 33,37+0,75 34,43±0,27

10 = 36,39±0 44 36 89±0,84 34,48+0,24

В сравнительном анализе моноспецифической и мультиплексной реакций было показано, что в мультиплексной реакции эффективность ПЦР-РВ для АВЗ и ПВЗ достоверно не отличалась от моноспецифической, а для ВГА разница была в высокой степени достоверна Для разведения 10"' значение 1=2,9 Р<0,05, для 10 2 -1=4,8, Р<0,01, а для 10'31=3,7 и Р<0,05 (табл 2)

В ходе работы были оптимизированы условия ОТ с целью сокращения времени анализа Для этого проводили ОТ в течение 1, 5, 10, 30 и 60 минут Было показано, что проведение ОТ в течение бочее чем 5 минут нецепссообразно, так как дальнейшее увеличение времени реакции не ведет к повышению чувствительности ОТ-11ЦР-РВ

Была определена чувствшельность выявления нолиовирусов 1ипов 1 (титр 1,4 10' ТЦД50/0,1 мл), 2 (титр 6,3 106 ТЩЫ0,1 мл) и 3 (титр 1,4 107 ТЦЦ50/0,1 мл) Для этого делали 10-кратные разведения нолиовирусов от 10"2 до 10"6, выделяли вирусную РНК и проводили мультиплексную ОТ-ПЦР-РВ В итоге положительные результаты были получены во всех разведениях до 104 включительно, что соответствовало 0,5-1 ТЦД50 на реакционную смесь

Промежуточным результатом настоящей работы явилась разработка методов количественной оценки НК АВ, ЭВ и ВГА Для этого на основе результатов ПЦР-анализа 10-кратных разведений стандартов ДНК (кДНК) АВ, ЭВ и ВГА (калибраторов), с использованием программного обеспечения к прибору АНК-32, были построены калибровочные прямые, на основании которых проводился расчет числа копий вирусных ДНК (кДНК) в исследуемом образце Методы количественного определения вирусных НК были протестированы на серийных разведениях лабораторных штаммов соответствующих вирусов и показали высокую эффективность

Исследование клинических образцов и образцов сточных вод методом ПЦР-РВ

Анализ клинических образцов методом ПЦР-РВ. С помощью мультиплексной ПЦР-РВ было проанализировано 32 клинических образца (20% фекальные суспензии) от здоровых детей и больных с различными диагнозами энтеровирусная инфекция, серозный менингит, синдром острого вялого паралича, гепатит А Параллельно образцы исследовали культуральным методом по ЦПД в культурах клеток НЕр-2 и ГШ и в реакции нейтрализации (РН) с применением типоспецифичсских сывороток Образцы сывороток от больных с гепатитом исследовали методом ИФА на наличие ^М к ВГА При исследовании образцов методом РН, в 20 были выявлены ЭВ, в 6 - АВ и 4 были определены как отрицательные При исследовании сывороток методом ИФА в обеих сыворотках были обнаружены ^М к ВГА, что свидетельствовало об острой фазе инфекции ВГА

Клинические образцы анализировали, используя два варианта концентрации праймеров, - 12,5 пмоль и 3,125 пмоль каждого праймера на реакционную смесь объемом 25 мкл Для моноспецифической ПЦР-РВ применение 12,5 пмоль каждого праймера обеспечивало высокую чувствительность и специфичность реакции Применение такого же количества праймеров в мультиплексной реакции обеспечило высокую чувствительность только при анализе культуральных штаммов вирусов В ходе исследования клинических образцов чувствительность мультиплексной ПЦР-РВ с ВПК и 12,5 пмоль каждого праймера на реакционную смесь составила 81,3% (из 32 образцов 6 не совпали с результатами, полученными в РН) Причиной этому было образование большого количества неспецифичсских продуктов и димеров праймеров, которые не образовывались в случае моноспецифической ПЦР-РВ После оптимизации концентрации праймеров и снижения их количества до 3,125 пмоль каждого праймера на реакционную смесь были получены результаты, имеющие 100% совпадений с методами РН и ИФА Кроме того, в

одном из образцов, в котором методом РН был выявлен только ЭВ, в моноспецифической ПЦР-РВ и мультиплексной ПЦР-РВ с ВПК, помимо ЭВ, был выявлен и АВ, то есть, скорее всего, у этого пациента имела место смешанная инфекция

Преимущества метода мультиплексной ПЦР-РВ при анализе клинических образцов перед часто используемыми КМ и ИФА заключаются в меньшей длительности и трудоемкости анализа Также этот метод дает возможность одновременно проводить анализ образцов сразу на три группы патогенов в одной пробирке, что экономически более эффективно

Анализ сточных вод методом ИКМ-ПЦР-РВ Использование метода ПЦР-РВ для выявления кишечных вирусов в клинических образцах позволяет опред1 лить возбудителя ОКИ в большом проценте случаев Когда требуется исследовать этюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из образцов сточных вод, или воду из других источников, зачастую невозможно применить данный метод из-за низкой концентрации вируса в образце и высокого содержания ингибиторов ПЦР Для решения подобных задач можно использовать метод ПЦР, интегрированный с КМ (ИКМ-ПЦР)

Метод ИКМ-ПЦР позволяет объединить сильные стороны КМ и ПЦР, и справиться с недостатками присущими этим методам Использование КМ обеспечивает снижение концентрации ингибиторов ПЦР за счет их разведения в куль гуральной среде, но при этом снижается и концентрация вируса В то же время, в культуре клеток происходит репродукция вируса (при условии, что исполь зуемая культура пермиссивна для данного вируса), что повышает чувствительность метода и позволяет выявить инфекционный вирус в образце (Reynclds KA, 2004) Кроме того, ИКМ-ПЦР дает возможность повысить эффективность выявления кишечных вирусов в сравнении с классической ПЦР или KM (Chapron С D , 2000, Jiang Y J , 2004, Lee Н К , 2004, Lee S Н , 2005)

Одной из задач диссертации была оценка возможности применения разработанного метода мультиплексной ПЦР-РВ в ИКМ-ПЦР Для испытания

метода ИКМ-ПЦР элюатами, полученными при концентрировании вирусов из сточных вод с использованием флизелиновых пакетов с МПС, заражали культуры клеток НЕр-2 и RD Объем злюата инокулированпого в культуры клеток, составлял в среднем 300 мкл на флакон (25 см2) После 7 дней инкубации культуральную жидкость во флаконах трижды замораживали-оттаивали с целью разрушения клеток и отбирали по 100 мкл среды для выделения вирусных НК на сорбенте ММ и дальнейшей ПЦР-РВ Всего было исследовано 12 образцов Анализ проводили КМ и мультиплексной ПЦР-РВ с ВПК

В результате исследований КМ энтеровирусы были выявлены в 10 образцах из 12, а 2 были отрицательными Методом ПЦР-РВ были получены такие же результаты, что и в КМ При этом значения пороговых циклов свидетельствовали о том, что концентрация НК ЭВ в реакционной смеси составляла 105-107 копий на пробирку, что соответствует, примерно, 5' 10 копии/мл Эти данные говорят о том, что для снижения временных затрат на анализ можно значительно сократить время инкубации зараженной культуры клеток с 7 до 1-2 дней (Reynolds К А , 2001) Необходимо также отметить, что использование метода ИКМ-ПЦР снизило влияние ингибиторов на реакцию, которое мы наблюдали при анализе сточной воды методом ПЦР-РВ без использования КМ Наличие ингибиторов ПЦР в реакционной смеси контролировали с помощью ВПК с известной концентрацией НК Отклонение значения Ct от стандартного более чем на 2,5-3 цикла или отсутствие флуоресценции на канале ВПК, свидетельствовало об ингибировании ОТ-ПЦР-РВ Вместе с тем, метод ИКМ-ПЦР может значительно понизить эффективность выявления в образцах вирусов, не размножающихся в культуре клеток, или имеющих длительный цикл репродукции Поэтому перед заражением культуры клеток образец необходимо аликвотировать с цслыо его прямого анализа методом ПЦР на вирусы, не размножающиеся в культуре клеток

Анализ образцов сточных вод методом ПЦР-РВ. Для испытания разработанного нами метода мультиплексной ПЦР-РВ на образцах сточных вод из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им M П Чумакова были получены 66 образцов воды с очистных сооружений Москвы и Московской области Образцы представляли собой элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов на флизелиновых пакетах с МПС

Одной из основных сложностей, возникающих при выявлении кишечных вирусов из образцов сточных вод, является большое количество ингибиторов ОТ и ПЦР, которые могут содержаться в образцах сконцентрированных вирусов В связи с эгим возникает необходимость эффективного удаления ингибиторов на стадии выделения вирусных НК В настоящее время для выделения вирусных НК из биологических образцов широко применяются модификации методики Boom R с соавторами, основанной на сорбции НК на силикагеле по гидрофобному механизму в условиях высокой ионной силы и в присутствии хаотропного агента, как правило, гуанидин изотиоционата (Boom R, 1990) Данный метод не только прост в исполнении, но и занимает относительно немного времени В настоящей работе в качестве основного метода выделения суммарной НК из биологических образцов также применялась методика, предложенная Boom R с соавторами, принципиально отличающаяся от оригинальной применением в качестве сорбента ММ

С использованием ММ из образцов сточных вод выделяли суммарную НК, которая была проанализирована методом мультиплексной ПЦР-РВ на наличие АВ, ЭВ и ВГА (рис 4)

Результаты ПЦР-РВ показали, что 29 образцов содержали ДНК АВ, что составило 43,9% от общего количества, 4 образца - РНК ЭВ (6,1%) и 1 образец содержал РНК ВГА (1,5%) Кроме того, 2 образца (ОС Южное Бутово) содержали НК как АВ, так и ЭВ (3,0%), а в одном образце, полученном с Люберецких ОС, содержались НК всех трех групп патогенов (1,5%) В 29 образцах вирусных НК выявлено не было (43,9%) Выявить в образце с

помощью КМ сразу несколько вирусов одновременно довольно проблематично, что в очередной раз подтверждает ценность метода мультиплексной ПЦР-РВ для эпидемиологических исследований.

.^•ШМ« *::!!!::: :;:!:==,,... И АВ

■ ЭВ □ ВГА

■ АВ+ЭВ

Ш АВ+ЭВ + ВГА H Отрицательные

Рис. 4. Результаты анализа образцов сточных вод методом мультиплексной ПЦР-РВ.

Важными критериями при анализе образцов сточных вод методом ПЦР-РВ были значения пороговых циклов (Ci) и характер изменения интенсивности флуоресценции для ВПК, как показатель отсутствия или наличия ингибиторов ОТ и ПЦР в препаратах НК. Нужно отметить, что во всех 66 образцах, выделенных модифицированным методом Boom R. на сорбенте ММ, значения С, для ВПК разных образцов варьировали в пределах 3 циклов относительно среднего значения. Характерные признаки ингибирования ПЦР, такие как отсутствие роста флуоресценции или пологий характер роста кривых для ВПК, отсутствовали.

Таким образом, была показана принципиальная возможность выявлять кишечные вирусы в воде из образцов сточных вод методом мультиплексной ПЦР-РВ с ВПК. Метод выделения НК на сорбенте ММ можно рекомендовать для анализа методом ОТ-ПЦР образцов, содержащих большое количество ингибирующих ОТ-ПЦР агентов, таких как элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из воды, или фекальные суспензии.

выводы.

1 Впервые показана возможность с высокой эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния

2 Разработан метод мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для одновременного выявления в клинических образцах и образцах сточных вод аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля

3 Установлено, что выделение нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов НК, свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР

4 Разработаны оригинальные методы оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды с использованием количественном ПЦР-РВ

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Фаизулоев Е Б , Никонова А А , Океания A.C., Борисенко А С , Зверев В В Разработка ПЦР тест-системы для выявления аденовирусной инфекции у человека Вопросы вирусологии, 2005, №6 44-47

2 Пиконова А А , Фаизулоев Е Б , Оксаиич A.C., Кривцов Г Г , Борисенко А С , Соминина А А , Зверев В В Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (выпуск 8), 2006 737-741

3 Оксанич A.C., Файзулоев Е Б , Кривцов Г Г , Никонова А А , Лотте В Д , Зверев В В Разработка комплекса методов для выявления кишечных вирусов в воде 2006 265-267 Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья», г Самара

4 Оксанич A.C., Файзулоев Е Б , Никонова А А , Каширин В И , Лотте В Д, Иванова О Е, Зверев В В Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени для быстрого выявления энтеровирусов, аденовирусов и вируса гепатита А в клинических образцах ЖМЭИ, 2007, №5 65-70

5 Оксанич A.C., Файзулоев Е Б , Иванова О Е , Никонова А А , Зверев В В Разработка метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для одновременной детекции аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А 2007, т 3 69 Материалы IX Съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, г Москва

6 Оксанич A.C. Файзулоев Е Б , Никонова А А , Иванова О Е , Зверев В В Выявление аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А в клинических образцах методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени 2007 256-257 Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», г Рязань

7 Оксанич A.C., Файзулоев Е Б , Никонова А А , Кривцов Г Г , Зверев В В Концентрирование кишечных вирусов из воды на магнитных микрочастицах, покрытых полимером диоксида кремния Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2008, №1 4750

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Оксанич, Алексей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткая характеристика клинически значимых кишечных вирусов.

1.1.1. Общая характеристика семейства Picornaviridae.

1.1.2. Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae.

1.1.2.1. Полиовирусы.

1.1.2.2. Вирусы Коксаки, ECHO и Энтеровирусы 68-71.

1.1.2.3. Парэховирусы.

1.1.2.4. Вирус гепатита А.

1.1.3. Устойчивость энтеровирусов к воздействию физических и химических факторов.

1.1.4. Общая характеристика семейства Adenoviridae.

1.1.5. Ротавирусы, астровирусы, коронавирусы и калицивирусы.

1.2. Методы выявления кишечных вирусов в воде.

1.2.1. Методы концентрирования вирусов из воды.

1.2.2. Диоксид кремния. Принципы адсорбции белков и вирусов на силикагелях.

1.2.3. Методы выявления кишечных вирусов.

1.2.4. Молекулярные методы исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Культуральные штаммы вирусов.

2.1.2. Клинические образцы и образцы сточных вод.

2.1.3. Клеточные линии.

2.1.4. Реактивы.

2.2. Методы.

2.2.1. Молекулярно-биологические методы.

2.2.2. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды.

2.2.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды.

2.2.4. Пробоподготовка.

2.2.4.1. Приготовление фекальных суспензий.

2.2.4.2. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из биологического материала.

2.2.5. Реакция обратной транскрипции (ОТ).

2.2.6. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени О^-Мап).

2.2.7. Количественная ПЦР-РВ.

2.2.7.1. Приготовление калибраторов.

2.2.7.2. Построение калибровочных прямых.

2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.2.9. Метод трансмиссивной электронной микроскопии.

2.2.10. Методы выявления и идентификации кишечных вирусов.

2.2.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.2.12. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

ВИРУСОВ ИЗ ВОДЫ.

3.1. Синтез сорбента для концентрирования безобол очечных вирусов из воды.

3.2. Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот.

3.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды на сорбентах

ММ и ММ+.

Глава 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-РВ

С ВПК ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК

КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ.

4.1. Подбор праймеров и зондов.

4.2. Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов.

4.3. Оптимизация условий ОТ и ПЦР.

4.4. Оценка чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ.

4.5. Разработка методов количественной оценки ДНК и РНК кишечных вирусов.

Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И

ОБРАЗЦОВ СТОЧНЫХ ВОД МЕТОДОМ ПЦР-РВ.

5.1. Анализ клинических образцов методом ПЦР-РВ.

5.2. Анализ сточных вод методом ИКМ-ПЦР-РВ.

5.3. Анализ образцов сточных вод методом ПЦР-РВ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов - этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи"

Актуальность проблемы.

В начале 70-х годов была доказана вирусная этиология небактериальных гастроэнтеритов. С тех пор стало известно, что возбудителями кишечных заболеваний человека могут быть энтеровирусы (ЭВ), ротавирусы, аденовирусы (АВ), калицивирусы, астровирусы, коронавирусы и другие. Все эти вирусы, за исключением коронавирусов, являются безоболочечными, что обусловливает их высокую устойчивость к факторам внешней среды и способность сохранять инфекционность вне организма (например, в воде или на пищевых продуктах) до нескольких месяцев, тс есть дольше, чем колибактерии [55]. Кишечные вирусы имеют фекально-оральный механизм передачи. Порядка 35% от всех острых кишечных инфекций (ОКИ) в РФ имеют водный путь передачи [16]. Вирусы выделяются в очень больших количествах с фекалиями инфицированного человека - больной гастроэнтеритом или гепатитом может экскретировать от 105 до 10'12 вирионов с каждым граммом фекалий [18, 34]. Энтеровирусы выделяются из водопроводной воды даже после дезинфекции-[56, 78]. При оптимальных условиях вирусы способны проникать через почву на глубину более 100 метров [55].

Энтеровирусы оказывают самое различное воздействие на организм. Известно

66 серотипов энтеровирусов способных вызывать более 20 различных синдромов: полиомиелит, миокардит, перикардит, плевралгия, респираторные заболевания, конъюнктивит, гепатит, асептический менингит, энцефалит, ящур, диабет и др.

111]. Около 90-95% случаев полиовирусной инфекции и примерно 50% случаев

ECHO и коксакивирусной инфекции протекают бессимптомно [55]. Ротавирусы высококонтагиозны и являются главной причиной детских заболеваний, которые заканчиваются госпитализацией, в очень редких случаях летальным исходом. Более чем у 90% детей антитела к ротавирусам появляются до трехлетнего возраста. Вирус Норволк и другие калицивирусы являются частой причиной вспышек гастроэнтеритов в школах, семьях, больницах, лагерях отдыха [11, 110, 115]. Большинство подростков имеют антитела к энтеральным калицивирусам. Аденовирусы и астровирусы чаще вызывают гастроэнтериты у детей и ограниченно патогенны для взрослых.

В- настоящее время известно более 100 патогенных для человека вирусов, циркулирующих в водных объектах, 37 из них обнаруживаются; непосредственно е питьевой воде [57].

В этих условиях необходимость постоянного контроля; за степенью контаминации кишечными вирусами вод поверхностных водоемов, грунтовых вод, сточной и питьевой воды не вызывает сомнений. Данные мероприятия; необходимо проводить также в связи; с тем, что во многих регионах России-качество питьевой водьь не соответствует показателям, регламентируемым санитарными^ правилами и нормами №2.1.4.1074-01 «Питьевая; вода: Гигиенические требования к качеству воды- централизованных систем питьевого*' водоснабжения: Контроль качества» [14]. Зачастую причиной? возникновения вспышек ОКИ является? загрязнение водопроводной воды сточными водами:

В последние; годы на территории России, имели место многочисленные вспышки инфекционных заболеваний с водным путем; передачи,! в частности; гепатита А, ротавирусного гастроэнтерита, энтеровирусного менингита й др. В то же время: часто регистрировались/ вспышки: инфекционных; кишечных-заболеваний с неясной этиологией. Затруднения при определении возбудителей этих заболеваний отчасти связаньь с: несовершенством используемых методов выявления кишечных вирусов.

Наиболее, сложным и несовершенным этапом вирусологического контроля» воды является процесс концентрирования вирусов; В настоящее время- в: распоряжении санитарных вирусологов,имеется ряд методов концентрирования вирусов из воды |1, 6], которые нуждаются в оптимизации, в. основном за счет применения новых,, доступных и высокоэффективных адсорбирующих материалов. В этой связи - поиск и изучение новых сорбентов на сегодняшний? день является весьма актуальной задачей.

Значимость кишечных вирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления. До настоящего времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками в культуре, чувствительных клеток. В 8 научных исследованиях эффективно применяют реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции (ИФ), характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с РН. Сложность, длительность и трудоемкость РН обусловлена различной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода Enterovirus и множеством их антигенных вариантов. По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энтеровирусов. Кроме того, ряд кишечных вирусов (например, калицивирусы и вирус гепатита А) с трудом поддаются культивированию. Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как ПЦР с гибридизационной идентификацией^ продуктов амплификации,1 мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени [3, 48, 53, 97].

Цели.и задачи исследования.

Целью настоящего исследования была разработка методов концентрирования энтеровирусов (ЭВ), аденовирусов (АВ) и вируса гепатита А (ВГА) из воды, а также их выявления в сточных водах и фекальных суспензиях методом мультиплексной* ПЦР в режиме реального времени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить- следующие задачи:

1. Синтезировать несколько вариантов сорбентов для концентрирования вирусов из воды.

2. Отработать методы количественного учета ДНК и РНК вирусов для оценки эффективности концентрирования вирусов из воды.

3. В модельных экспериментах оценить эффективность концентрирования вирусов из воды с применением синтезированных сорбентов.

4. Подобрать праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной- детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А в мультиплексном формате и тестировать их на лабораторных штаммах вирусов.

5. Провести сравнительный анализ клинических образцов от пациентов с ОКИ методами мультиплексной ПЦР-РВ и культуры клеток. 9

6. Проанализировать образцы элюатов, полученных в результате концентрированйя.вирусов из образцов сточных вод; на. наличие АВ, ЭВ и ВРА методами мультиплексной ПЦР-РВ и ПЦР интегрированной с культуральным методом.

Научная новизна работы.

Г. Впервые показана возможность с высокой- эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.

2. Впервые в- России; разработан метод для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля, основанный < на мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

3. Для;оценки-эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды был предложен оригинальный метод, основанный' на' количественном определении вирусных нуклеиновых кислот с помощью ПЦЕ-РВ;,

Практическая значимость.

1. Сорбент на основе магнитных микрочастиц; покрытых модифицированным? аминогруппами; полимером диоксида кремния; может быть использован для высокоэффективного концентрирования кишечных вирусов из воды. Магнитные свойства сорбента позволяют собирать его проточным методом» с помощью сильных магнитов, описанным в настоящей работе, не прибегая к центрифугированию больших объемов воды. Метод может быть использован для контроля за санитарным состоянием источников водоснабжения.

2. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией; в режиме реального времени для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А может использоваться в качестве тест-системы как для контроля, за вирусной контаминацией воды (после стадии концентрирования вирусов), так и для анализа лизатов клеточных культур, зараженных вирусным материалом, а также в диагностике ОКИ.

3. Разработанные методы количественного определения вирусных ДНК и РНК могут быть использованы для контроля за активностью вирусной репродукции и эффективностью противовирусной терапии у пациентов, а также в научных исследованиях при испытании противовирусных препаратов в культурах клеток и на лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Магнитные микрочастицы, покрытые модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, позволяют с достаточно высокой степенью эффективности концентрировать кишечные вирусы из воды.

2. Разработанная мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени позволяет выявлять аденовирусы, энтеровирусы и вирус гепатита А в клинических образцах, лизатах зараженных клеточных культур, и элюатах, полученных в результате концентрирования вирусов из воды.

3. Применение метода выделения нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов нуклеиновых кислот (НК), свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.

4. Количественная ПЦР-РВ может быть использована как метод оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Оксанич, Алексей Сергеевич

выводы.

1. Впервые показана возможность с высокой эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.

2. Разработан метод мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для одновременного выявления в клинических образцах и образцах сточных вод аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего положительного контроля.

3. Установлено, что выделение нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов НК свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.

4. Разработаны оригинальные методы оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды с использованием количественной ПЦР-РВ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы: академику РАМН, профессору, доктору биологических наук Звереву Виталию Васильевичу и кандидату биологических наук Файзулоеву Евгению Бахтиёровичу за построение логики работы и помощь в интерпретации результатов.

Автор выражает особую благодарность кандидату биологических наук Кривцову Георгию Георгиевичу за помощь в подборе и синтезе сорбентов для концентрирования вирусов из воды.

Кроме того, автор выражает благодарность руководителю лаборатории вирусологии полиомиелита и других энтеровирусных инфекций Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, кандидату медицинских наук Ивановой Ольге Евгеньевне за предоставление лабораторных штаммов энтеровирусов и клинических образцов для исследований, а также за содействие в проведении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оксанич, Алексей Сергеевич, Москва

1. Амвросьева Т.В., Дьяконова О.В., Гудков В.Г. и др. Активный оксид алюминия новый адсорбент для концентрирования кишечных вирусов из воды. Вопр. вирусол., 1999, 2: 92-95.

2. Вирусология. Методы: Пер. с англ./Под ред. Б. Мэйхи. М.: Мир, 1988. -344 е., ил.

3. Голицына Л.Н., Новикова H.A., Домбровская Л.К. и др. Оценка разработанного «nestec^-варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных. Вопр. вирусол. 2002, 5: 41-43.

4. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир, 1988. 446 е., ил.

5. Карякин Ю. В., Ангелов И. И. Чистые химические реактивы: М., Госхимиздат, 1955, 141-142.

6. Конторович В.Б., Иванова O.E., Еремеева Т.П., Ширман Г.А.,,Казанцева

7. B.А. Метод концентрирования вирусов в водных объектам окружающей среды. Вопр. вирусол., 1996, 1: 40-42.

8. Круглов И.В., Сабанин Ю.В., Кузин С.Н. Вирусные гепатиты: характеристика возбудителей, исходы заболеваний и перспективы исследований. Эпидемиология и вакцинопрофилакгика. 2006, 5": 31-34.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 е.: ил.

10. Методические указания №4.2.2029-05 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./Под ред.

12. C. Херрингтона, Д. Макги. М.: Мир, 1999, 558 е., ил.

13. Мухина А.А, Шипулин Г.А., Боковой А.Г., Яцышина С.Б. Первый опыт изучения калицивирусной инфекции у детей в Москве. Вопр. вирусол., 2002,6: 33-37.

14. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981,288 с.

15. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ., М.: Мир, 2000, 592 е., ил.

16. СанПиН №2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

17. Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Оксанич А.С. и др. Разработка ПЦР тест-системы для выявления аденовирусной инфекции у человека. Вопр. вирусол. 2005, 6: 44-47.

18. Фролочкина Т.И., Марков В.Ю. Водные вспышки кишечных инфекций. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья. Самара 2006. Сб. тезисов в 1 т, 316-318.

19. Abbaszadegan М., Stewart P., Le Chevallier М. A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(2): 444449.

20. Abd el-Galil K., Sokkary M. A., Kheira S. M. Real-time nucleic acid sequence-based amplification assay for detection of hepatitis A virus. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(11): 7113-7116.

21. Adam E., Nasz I., Medveczky P. Comparative studies on the soluble proteins of adenovirus type 1. Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1977, 24(3):181-187.

22. Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy ./edited by Prem Seth. 1999.

23. Agrez M.V., Shafren D.R., Gu X., et al. Integrin alpha V beta 6 enhances coxackievirus B1 lytic infection of human colon cancer cells. Virology, 1997, 239: 71-77.

24. Alexander L., Lu H.H., Wimmer E. Polioviruses containing picornavirus type 1 and/or type 2 internal ribosomal entry site elements: Genetic hybrids and the expression of a foreign gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 14061410.

25. Allard A., Albinsson B., Wadell G. Detection of adenoviruses in stools from healthy persons and patients with diarrhea by two-step polymerase chain reaction. J. Med. Virol., 1992, 37: 149-157.

26. A-Z of quantitative PGR./edited by Bustin S.A., 2004;

27. Baltimore D., Girard M., Darnell J.E. Aspects of the synthesis of poliovirus RNA and the formation of virus particles, Virology, 1966, 29: 179-189.

28. Bass D.M., Upadhyayula U. Characterization of human serotype 1 astrovirus-neutralizing epitopes. J. Virol., 1997, 71: 8666-8671.

29. Benko M., Harrach B., Russell W. C. Family Adenoviridae. In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of

30. Viruses; Van Regenmortel M.H.V., Bishop C.M.F., Carstens E.B^.Estes M.K.,.:' Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R.B: Eds. Academic Press Inc.: New York, 1999, 227-238.

31. Bock H.G., Skene P., Fleischer S., Cassidy P., Harshman S. Protein purification: adsorption chromatography on controlled pore glass with the use of chaotropic buffers. Scince, 1976, 191: 380-383.

32. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. Rapid» and; simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990,' 28: 495-503.

33. Borodina T.A., Lehrach H., Soldatov A.V. DNA purification on homemade silica spin-columns. Anal. Biochem., 2003, 321(1): 135-137.

34. Bosch A. Human enteric viruses in the water environment: a minireview. Internatl. Microbiol. 1998 1:191-196.

35. Brown M., Grydsuk J.D., Fortsas E., Petric M: Structural features unique to enteric adenoviruses. Arch;.Virol; Suppl., 1996, 12: 301-307.

36. Brundage S.C., Fitzpatrick A.N. Hepatitis A. Am. Fam. Physician., 2006, 73(12): 2162-2170.

37. Bustin S.A., Mueller R. Real-time revers transcription PGR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin. Sci., 2005, 109: 365-379.

38. Carter: M.J., Willcocks M.M. The molecular biology of asrtoviruses. Arch. Virol. Suppli, 1996, 12: 277-285.

39. Chow M., Newman J.F., Filman D., et al. Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. Nature, 1987, 327:482^486.

40. Cuthbcrt J.A. Hepatitis A: old and new. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14(1): 3858.f

41. Desselberger U. Genome rearrangements of rotaviruses. Arch. Virol. Suppl;.1996; 12: 37-51.

42. Donaldson; K.A., Griffin D;W., Paul J.II. Detection, quantitation and; identification of<enteroviruses* from surface waters and sponge tissue from the Florida Keys using real-time RT-PCR. Water Res:, 2002, 36: 2505-2514.

43. Dorsey S.G., Rogers, S.D. Review: chromatographic silanol; activity test procedures: the quest for a universal test. J; Chrom. A., 2000; 892: 57-65.

44. Duke G.M., Osorio J.E., Palmenberg A.G. Attenuation of Mengo virus through genetic engineering ofthe 5: noncoding poly(C) tract. Nature, 1990, 343: 474476.

45. Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PGR. An essential^ guide. London, 2004;

46. Edy V.G., Braude I.A., De Clercq E., Billiau A., De Somer P: Purification of interferon by adsorption chromatography on controlled pore glass. J. Gen. Virol. 1976, 33: 517-521.48