Разработка методов направленной модификации бактериальной хромосомы для метаболической инженерии облигатного метилотрофа Methylophilus methylotrophus AS1

Токмакова, Ирина Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов направленной модификации бактериальной хромосомы для метаболической инженерии облигатного метилотрофа Methylophilus methylotrophus AS1
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов направленной модификации бактериальной хромосомы для метаболической инженерии облигатного метилотрофа Methylophilus methylotrophus AS1"

У №

На правах рукописи

ТОКМАКОВА ИРИНА ЛЬВОВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ХРОМОСОМЫ ДЛЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ИЖЕНЕРИИ ОБЛИГАТНОГО МЕТИЛОТРОФА METHYLOPHILUS METHYLOTROPHUS ASI

03.01.03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

2 О МДП 20:3

004602331

Работа выполнена в лаборатории №3 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Научные руководители:

кандидат биологических наук ЗАО «АГРИ»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. ФГУП «ГосНИИгенетика»

кандидат биологических наук Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится мая 2010 года в 14— на заседании

Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат диссертации разослан апреля 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Е. Р. Гак

Ю. А. В. Йомантас

Ю. Д. Цыганков

Л. В. Генинг

Т. Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Забота об окружающей среде в условиях быстрого индустриального развития многих стран мира делает необходимым переход промышленных процессов на качественно новый технологический уровень, направленный на использование возобновляемых природных ресурсов и минимизацию потерь. Одним из направлений решения данной задачи является сочетание «мягких» в отношении окружающей среды микробиологических процессов с дешевыми и легкодоступными видами сырья. К таким видам сырья можно отнести метанол, получаемый из природного газа и имеющий сравнительно низкую стоимость. В последнее время в биотехнологической индустрии метанолу уделяется большое значение, как альтернативному источнику углерода широко используемым для этих целей сахарам.

Бактерии, способные расти на метаноле, широко распространены в природе и характеризуются большим разнообразием. Доступность сырья и его сравнительно невысокая стоимость позволяют рассматривать метилотрофы в качестве перспективных и выгодных объектов индустриальной биотехнологии. В настоящее время метилотрофные бактерии все шире используются в промышленности для производства таких важных биологически активных веществ, как: секретируемые природные и рекомбинантные белки {Belanger L. et al., 2004; Fitzgerald К. and Lidstrom M, 2003) витамины, ферменты, полисахариды, аминокислоты (Bourque D. et al., 1995; Korotkova N. et al., 2002; MotoyamaH. et al., 1993,2001; Tani Г., 1991).

Создание штаммов-продуцентов с заданными свойствами и высокой эффективностью продукции предполагает детальное знание генетики организма, его метаболитических путей, процессов регуляции клеточного метаболизма, а также наличия определенного набора генетических методов, необходимых для направленной модификации исследуемого объекта. Промышленное использование метилотрофов значительно увеличило интерес к изучению генетического контроля С-1 метаболизма у определенных видов этих бактерий {Anthony С., 1993). За последние 5 лет были секвенированы геномы некоторых метилотрофных микроорганизмов {Chistoserdova L. et al., 2007; GiovannoniS. et al, 2008; Hou S. et al., 2008; Капе S. étal, 2007; Vuilleumier S. et al., 2009; Ward N. et al., 2004), значительный прогресс достигнут в понимании их метаболизма {Growther G. et al., 2008) и существенно расширен набор полезных методов для генетической и метаболической инженерии {Сие D. et al, 1997; Gliesche С., 1997; Marx С. and Lidstrom M., 2001). К таким методам можно отнести, например, недавнее использование системы транспозона Тп7 для сайт-специфической интеграции в геном метилотрофов рекомбинантных ДНК {Choi У. et al., 2006). Однако и сейчас большинство метилотрофов плохо изучены и набор генетических инструментов для работы с ними сильно ограничен. По этой причине разработка новых подходов генетического анализа метилотрофрых бактерий с их последующим применением в конструировании штаммов-продуцентов представляется на данном этапе актуальной.

Melhylophilus methylotrophus AS1, являющийся объектом наших исследований, в 70-е годы прошлого века был широко использован в микробиологической индустрии для производства бактериальной биомассы {Senior P.. and Windass J., 1980, Vasey R. and Powell K., 1984). В связи с чем начальные стадии углеродного и энергетического метаболизма этого организма в этот период были всесторонне исследованы (Сох J. el а!., 1992; Hothi P. et al., 2003), однако мало что известно о метаболитических путях биосинтеза аминокислот в М. methylotrophus. Недавно специалистами Аджиномото (Ajinomoto Со, Inc.) было проведено изучение синтеза L-лизина у М methylotrophus, начиная с исследования путей биосинтеза (Gunji У. et al., 2004; Tsujimoto N. et al., 2006) и заканчивая конструированием и усовершенствованием продуцента L-лизина на метаноле (Gunji Y. et al., 2006; Gunji У. and Yasueda H., 2006; Ishikawa K. et al., 2008 (1-3)). Задачей наших исследований было создание методов, облегчающих создание на основе М. methylotrophus штаммов-продуцентов ароматических аминокислот. Как известно, на первом этапе конструирования продуцентов аминокислот необходимо отобрать мутанты с ослабленным ингибировакием ключевых ферментов конечным продуктом биосинтеза и блокировать возможные пути деградации целевого продукта и его предшественников созданием соответствующих ауксотрофных мутантов (Bongaerts J. et al., 2001; Ikeda M., 2006; Parekh S. et al., 2000). Для облигатных метилотрофов получение ауксотрофных мутантов является особой трудностью {de Vries G. et al., 1990). Причиной может быть неспособность некоторых соединений проникать внутрь и экспортироваться из клеток этих микроорганизмов. И хотя отдельные случаи получения ауксотрофных мутантов у М. methylotrophus AS1 все же были описаны (Bohanon М. et al., 1988; Gunji У. et al., 2004; Kim С. and Wood Т., 1997), их число сильно ограничено. Кроме того, применение различных подходов и разработка новых методов для получения мутантов не привели к созданию коллекции ауксотрофных мутантов М. methylotrophus AS1, которые могли быть полезными для исследования путей биосинтеза аминокислот. С другой стороны, имевшиеся в литературе (Tsujimoto N. et al., 2006; Gunji Y. and Yasueda H., 2006), а также и наши собственные экспериментальные данные свидетельствовали в пользу того, что многие клонированные гены Е. coli способны достаточно эффективно экспрессироваться в М. methylotrophus, что позволяло надеяться на возможное практическое использование уже хорошо разработанных генетических модулей и систем для функционирования в этих новых реципиентах.

В последнее время в молекулярной биологии большое внимание уделяется изучению транспортных систем клетки. Мы надеялись, что использование гетерологичных генов Е. coli, кодирующих специфические транспортные белки, поможет увеличить проницаемость цитоплазматической мембраны М. methylotrophus, и, возможно, облегчит процедуру получения ауксотрофных мутантов.

транспозонного мутагенеза (Marx С., and Lidstrom М., 2004; Koch В. et al., 2001). Поскольку из-за существующих законодательных ограничений использование плазмид нежелательно при создании промышленных продуцентов биологически активных веществ, то приоритетное значение имеет дальнейшее развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов. Нам представлялось, что и система транспозиции хорошо известного фага Mu (Symonds N. et al., 1987) также могла быть успешно адаптирована для интеграции фрагментов ДНК в геном М. methylotrophus.

Цель и задачи работы. Таким образом, целью настоящей диссертационной работы была разработка новых генно-инженерных подходов для направленной модификации бактериального генома М. methylotrophus при создании бесплазмидных рекомбинантных штаммов-продуцентов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. исследовать возможность адаптации системы транспозиции бактериофага Mu для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. methylotrophus ASI, в том числе:

• сконструировать интегративные плазмиды, содержащие mini-Mu транспозон с РЬР-^ЛГ-вырезаемым селективным маркером устойчивости к канамицину и способные к мобилизационному переносу из клеток Е. coli в клетки М. methylotrophus ASI;

• осуществить конструирование хелперных плазмид, содержащих термоиндуцибельные гены факторов транспозиции MuA, MuB и способных к репликации в клетках М. methylotrophus ASI;

• исследовать возможность интеграции и амплификации mini-Mu транспозона в хромосоме М. methylotrophus ASI;

• изучить влияние энхансерной последовательности (IAS) бактериофага Mu на амплификацию mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus ASI;

2. создать коллекцию ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот у М methylotrophus ASI, для чего:

• сконструировать специальный штамм М. methylotrophus AS\:\aroP^0 с повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны к ароматическим веществам;

• клонировать гены ароматического пути биосинтеза М. methylotrophus ASI;

• инактивать гены ароматического пути биосинтеза в хромосоме М methylotrophus AS 1 ::агоРЕсо.

Научная новизна и практическая ценность работы. Двухплазмидная система транспозиции бактериофага Mu успешно адаптирована для целей интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. methylotrophus ASI.

Установлено, что основным механизмом функционирования mini-Mu-транспозона в клетках метилотрофов в рамках данной системы является репликативная транспозиция, за счет которой может быть осуществлена амплификация интегрированных фрагментов ДНК в бактериальном геноме.

Показано, что наличие энхансерной последовательности фага в составе mini-Mu транспозона существенно увеличивает эффективность транспозиции в хромосоме М. methylotrophus ASI. Данная система представляет собой удобный генетический инструмент, прикладным значением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ.

Сконструирован штамм Methylophilus methylotrophus ASl::aroPEco с геном транспортера агоРесо, интегрированным в хромосому, и обладающий повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны к ароматическим веществам. На основе этого штамма создана коллекция ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот.

Разработанные генетические инструменты были успешно использованы в работах НИИ «Аджиномото-Генетика» при конструировании метанол утилизирующих штаммов-продуцентов L-фенилаланина.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 6 в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патентная заявка. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2004) и Международной научной конференции (Лиссабон, декабрь 2010 г). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре НТС ЗАО «АГРИ» и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 9 марта 2010 года.

Стуктура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на УЗЗ страницах, включая <2рисунков и таблиц. Список цитируемой литературы содержит*^Источника, в том числе ¿ на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Адаптация системы транспозиции бактериофага Mu для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. meíhylotrophus ASI.

Бактериофаг Mu на разных стадиях жизненного цикла использует два альтернативных механизма транспозиции: прямую интеграцию и репликативную транспозицию через образование коинтегратов. Оба эти механизма инициируется процессом формирования транспозосомы, а затем рекомбинационного комплекса, в которых помимо Mu-специфических белков (МиА и MuB) и участков ДНК фага (Mu-attL, Mu-attR) принимает участие большое число белков клетки-хозяина, как минимум, на этапе формирования транспозосомы, гистоноподобные белки HU и IHF. Что касается последних, то представители семейства таких ДНК-изгибающих белков достаточно часто встречаются в клетках различных прокариот (Swinger К. and Rice P., 2004). Поэтому можно было ожидать, что система транспозиции фага Mu будет также функционировать и в других бактериях.

Разработанная в АГРИ ранее (Ахвердян В. и др., 2007) Mu-зависимая система для интеграции рекомбинантных ДНК в геном К coli включает две совместимые плазмиды, имеющие относительно нестабильные репликоны. Первая из них, хелперная, содержит гены Mu-Л и Ми-5, экспрессия которых репрессирована вследствие присутствия на плазмиде гена термочувствительного репрессора - cts62 и может быть индуцирована повышением до 42°С температуры культивирования клеток. Вторая плазмида, интегративная, содержит mini-Mu-транспозон, фланкированный линейными фрагментами ДНК фага - Mu-attL и Mu-a«/?, с участками для встраивания селективного маркера и целевых генов.

Данную систему используют, как правило, следующим образом. В клетки, уже содержащие хелперную плазмиду, вводят интегративную плазмиду, параллельно проводя термоиндукцию синтеза факторов транспозиции, и отбирают клоны с интегрированным в бактериальный геном mini-Mu-транспозоном. При необходимости потомки клеток-интегрантов «излечивают» от автономно реплицирующихся плазмид.

В описанной системе обе плазмиды, содержащие компонентны Mu-зависимой транспозиции, были не способны к репликации в широком круге организмов, в частности, в М. meíhylotrophus. Поэтому для проверки функциональности и активности системы транспозиции фага Mu в новом организме, предстояло модифицировать обе группы рекомбинантных ДНК.

1.1. Конструирование хелперных плазмид с термоиндуцибельными генами факторов Mu-зависимой транспозиции.

Модификация хелперной плазмиды заключалась в замене ColE-подобного репликона ранее сконструированной в АГРИ плазмиды pUC-MuAB (Ахвердян В. и др., 2007) на репликоны векторов широкого круга хозяев - IncQ и IncP групп несовместимости (Рис. 1).

рТРЗЮ (24,7т.п.н)

рАЕТ7 (15,з т.п.н.)

ВдШ/ватЩ.

си пег Ми А Ми В

Рис. 1. Схема конструирования и физико-генетическая карта хелперных плазмид рТРЗЮ и рАЕТ7.

Первый из использованных для этих целей векторов, рАУС32, имел репликон плазмиды ЯБРЮЮ 1пср-группы (Сиеггу Р. е( а1, 1974). Полученная плазмида рАЕТ7 (Арк, 8тк) стабильно наследовалась в клетках М те1куШгоркиз (доля клеток, потерявших плазмиду при росте при 30°С в течение 20 генераций в неселективных условиях, не превышала 2%), но при необходимости эта плазмида могла быть элиминирована с частотой не менее 30%. С этой целью бактерии выращивали в течение 24-48 часов в среде с акридином оранжевым (25-30 мкг/мл) или повышали температуру культивирования с 30 °С до 37°С.

Вторая из полученных плазмид - рТРЗЮ (Рис. 1), была сконструирована на основе вектора рЮСЗЮ, делеционного производного плазмиды ЯР4/11К2 1псРа-группы (Pansegrau IV. е! а1, 1994). рТРЗЮ имела маркер устойчивости к тетрациклину (Тск) и обладала способностью к ЯР4-зависимой мобилизации. Однако в клетках М. теМуШгоркш рТРЗЮ можно было поддерживать только в строго селективных условиях - при аэробном культивировании в жидкой среде без антибиотика при 30°С плазмида утрачивалась из 70% клеток в течение 24 часов (и 100% клеток теряли плазмиду за 48 часов).

Таким образом, для исследования Ми-зависимой транспозиции в М. теЛуШгорИив было осуществлено конструирование двух вариантов мобилизуемых хелперных плазмид на основе стабильного (плазмида рАЕТ7), и нестабильного (плазмида рТРЗЮ) в клетках метилотрофов репликонов, что может значительно расширить экспериментальные возможности использования этой системы для генетических модификаций штаммов. В частности, хелперы со стабильными репликонами перспективны для проведения множественных последовательных интеграций различных гшт-Ми-транспозонов в один и тот же штамм. В то же время использование нестабильных хелперов удобно для

проведения одного цикла интеграции с получением в конечном итоге бесплазмидного варианта.

1,2. Конструирование mini-Mu-содержащих интегративных векторных плазмид, способных к мобилизационному переносу в М. methylotrophus.

Для создания мобилизуемого интегративного вектора была использована плазмида - pMIV5 {Абалакина Е. и др., 2008). Эта плазмида с репликоном pSCIOl была сконструирована в АГРИ ранее в результате интеграции mini-Mu MD4041 в pMWl (Саврасова Е. и др., 2007) с последующим удалением практически всей внутренней части исходного транспозона между Mu-attL и Mu-attR и встраиванием некоторых терминаторов транскрипции и последовательности полилинкера. Дальнейшая модификация этой плазмиды была связана с обеспечением возможности ее мобилизационного переноса в клетки М. methylotrophus.

Для этого в участок, несущественный для репликации pMIV5 и расположенный на плазмиде вне mini-Mu-транспозона, был клонирован фрагмент ДНК, содержащий orí Г сайт RP4 (Simon R. et al, 1983). (Рис. 2 А).

Рис. 2. Физико-генетическая карта интегративных плазмид.

Чтобы обеспечить селективность процесса интеграции целевого фрагмента, и в то же время получить возможность конструирования в конечном итоге штаммов, не содержащих маркеров устойчивости к антибиотикам, в состав mini-Mu-транспозона был введен также маркер устойчивости к канамицину, фланкированный сайтами РЬР-^ЛГ-зависимой рекомбинации из pKD4 (Datsenko К. and Wanner В., 2000) (Рис. 2 Б).

1.3. Mu-зависимая транспозиция маркера устойчивости к канамицину в хромосому М. methylotrophus.

Первые эксперименты по интеграции mini-Mu в хромосому М. methylotrophus ASI проводили с использованием стабильной хелперной плазмиды рАЕТ7. Хелперную и интегративную плазмиды последовательно

вводили в клетки М. methylotrophus путем ЮМ-зависимой мобилизации. При этом интегративная плазмида не обладала способностью к репликации в данном организме. Проведение мобилизации в условиях термоиндукции синтеза факторов транспозиции MuA, MuB, с последующей селекцией на среде с канамицином позволило отобрать варианты, стабильно наследовавшие KmR-маркер mini-Mu-транспозона. Частота образования интегрантов была 1(Г2-н1(Г3 относительно числа исходных клеток донорного штамма, что соответствовало эффективности плазмидной мобилизации, то есть практически в каждой клетке реципиентного штамма, получившей интегративную плазмиду, произошла транспозиция Кша-маркера. После излечивания Ктк-клеток от рАЕТ7 наличие в бактериальной хромосоме mini-Mu было подтверждено генетическим анализом (Aps) и с помощью PCR.

А. Прямая интеграция

"Суицидная"

KmR ApRSm" или Тс" ^ - - ^ плазмида ApRSmR или TcR

©+©+(б)Н8Кб>©

ApR ^ -" Ар"

Б. Репликативная транспозиция

Коинтеграт

клетках М. methylotrophus AS 1 интегративного вектора (И) в бактериальную хромосому (Б) в присутствии хелперных плазмид (X), имеющих в своем составе различные маркеры устойчивости к антибиотикам: ApR, SmR или TcR.

Использование в этих экспериментах стабильной хелперной плазмиды, рАЕТ7, не позволяло установить по какому из известных механизмов - прямой интеграции или репликативной транспозиции с образованием коинтегратов -осуществляется встраивание mini-Mu в геном М. methylotrophus. Поскольку, и

интегративная, и хелперная плазмиды имели Арк-маркер, то до излечивания от хелпера потенциально образующиеся ApR, Ктк-коинтеграты генетически были неотличимы от Кта-продуктов «простой инсерции» mini-Mu. В ходе длительной процедуры элиминации стабильной рАЕТ7 образовавшиеся на первых стадиях коинтеграты имели возможность разрешаться в результате гомологичной рекомбинации между двумя копиями mini-Mu транспозона (Рис. 3).

Для того чтобы попытаться зафиксировать существование коинтегратов, в качестве хелперной плазмиды использовали рТРЗЮ, имеющую селективный маркер TcR и не содержащую ApR. В результате лишь 30% клонов, отобранных в этом эксперименте имели фенотип KmR, Aps, то есть являлись следствием либо прямой интеграции, либо репликативной транспозиции, но с уже разрешенным коинтегратом. Тогда как 70% проверенных клонов имели фенотип KmR, ApR, а, значит, структура их хромосомы являлась коинтегратом, образовавшимся в результате репликативной транспозиции (Рис. 3 Б). Дальнейшее культивирование этих клонов на среде с канамицином, но без ампициллина достаточно быстро приводило к выщеплению KmR, Aps-вариантов - продуктов разрешения коинтеграта.

Таким образом, при использовании интегративных плазмид, не способных к автономной репликации в клетках метилотрофов, механизм репликативной транспозиции является, как минимум, значительно более вероятным, чем прямая интеграция mini-Mu-транспозона в бактериальную хромосому. Предположение о возможности адаптации системы транспозиции бактериофага Mu для клеток метилотрофов базировалось на известной функциональной гомологии ДНК-изгибающих белков различных бактерий. При этом реализация самой транспозиции по механизму прямой интеграции представлялась более вероятной, чем репликативная транспозициия, поскольку в первом случае осуществляется лишь репаративный, но не репликативный синтез ДНК при рекомбинации, а следовательно, в этом процессе принимает участие меньшее число специфичных белков клетки-хозяина. Тем не менее, именно репликативная транспозиция являлась в случае использованной системы основным путем интеграции mini-Mu в геном метилотрофов. Тем самым было экспериментально показано, что белки М. methylotrophus способны выполнять функцию своих аналогов из клеток Е. coli не только при формировании транспозосомы, но и обеспечивать репликативный синтез и все последующие стадии репликативной транспозиции mini-Mu.

1.4. FLP-ЛЙГ-зависимое удаление интегрированного Ктк-маркера из хромосомы метилотрофов.

В нашей работе в качестве селективного маркера искусственного mini-Mu-транспозона был использован ген KmR, фланкированный рекомбиногенными участками FRT. На заключительном этапе эксперимента по интеграции фрагментов целевой ДНК практически важный интерес представляло удаление маркера устойчивости к антибиотику с сохранением в геноме остальных элементов mini-Mu-транспозона.

pFLP31 (12,9 т.п.н.)

Для демонстрации такой возможности в клетках М. methylotrophus первоначально было осуществлено конструирование плазмиды pFLP31 (Рис. 4).

Фрагмент ДНК, содержащий ген FLP-рекомбиназы дрожжей S. cerevisiae, а также ген термочувствительного репрессора ¡U?/ts857 и способный обеспечить в бактериальных клетках регулируемую экспрессию гена FLP-рекомбиназы за счет транскрипции с промотора PR бактериофага X, был переклонирован из плазмиды рСР20 (Datsenko К. and Wanner В., 2000) в состав вектора широкого круга микроорганизмов

ггпВ

широкого pAYCTER3 (ApR, IncQ).

Рис. 4. Структура плазмиды pFLP31, способной обеспечить термоиндуцибельный синтез FLP-рекомбиназы S. cerevisiae в клетках Е. coli и М. methylotrophus.

С использованием полученной плазмиды удалось с высокой эффективностью, в 99%, удалить селективный маркер из хромосомы клонов-интегрантов М. methylotrophus ASl::FRT-¥LmR-FRT. Специфическое удаление Кшя-маркера в результате FLP-FÄr-зависимой сайт-специфической I рекомбинации при сохранении остальной части mini-Mu-транспозона в составе бактериальной хромосомы М. methylotrophus было подтверждено методом PCR.

1.5. Последовательная Mu-зависимая транспозиция нескольких генов в М. methylotrophus.

Возможность множественной модификации хромосомы с использованием Mu-зависимой транспозиции была продемонстрирована на примере последовательной интеграции в геном М. methylotrophus гетерологичных генов а-амилазы В. amyloliquefaciens и катехол-2,3-диоксигеназы Р. putida.

М.methylotrophus AS-1

М.methylotrophus AS-1 ■.\атуЕ+ху1Е+

М.methylotrophus AS-1 ::атуЕ+

Рис. 5. Качественное определение активности а-амилазы (зоны гидролиза крахмала) и С230 (желтое окрашивание) в клетках интегрантов М. теЛу1о1горЬи5 АБ1.

Первым в хромосому М. methylotrophus был итегрирован ген атуЕ В. amyloliquefaciens (Smirnova N. et al, 1988), экспрессия которого детектировалась по зонам гидролиза крахмалосодержащей среды вокруг соответствующих клонов (Рис. 5). Затем после FLP-зависимого удаления маркера KmR удалось с высокой эффективностью селективно интегрировать в Ашу+-варианты М. methylotrophus ASI::атуЕ mini-Mu транспозон, содержащий xylE ген Р. putida mt-2 (Inouye, S. et al, 1981). Катехол 2,3-диоксигеназа (C230) катализирует расщепление катехола до полуальдегида мукановой кислоты, раствор которой имеет интенсивно желтый цвет. Поэтому экспрессия в бактериальных клетках гена xylE легко регистрируется (Zukowski, М. et al, 1983). Экспрессия обоих генов в двойном мутанте М. methylotrophus ASI ::amyE+xylE+ была подтверждена экспериментально (Рис. 5).

1.6. Амплификация mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus.

Поскольку в нашей работе мы показали, что интеграция mini-Mu в геном М. methylotrophus происходит преимущественно по механизму репликативной транспозиции, за счет этого механизма могла быть осуществлена амплификация интегрированных фрагментов ДНК в бактериальной хромосоме. В качестве селективного маркера для регистрации амплификации mini-Mu мы использовали гены устойчивости к стрептомицину. Для этого был сконструирован mini-Mu транспозон, содержащий гены strAB под транскрипционным контролем метилотрофного промотора Р17 (Abalakina Е. et al., 2008), и копия mini-Mu транспозона {[FRT-KmR-FRT)-SmR\ была интегрирована в хромосому М. methylotrophus по маркеру устойчивости к канамицину. Было показано, что одна копия генов strAB обеспечивает устойчивость клеток М. methylotrophus к 500 мкг/мл стрептомицина, тогда как амлификация на плазмиде средней копийности - свыше 10 мг/мл. Следовательно, можно было ожидать, что при амплификации интегрированной в хромосому копии mini-Mu {[FRT-KmR-FRT\-SmR), клетки также приобретут способность расти на повышенных концентрациях антибиотика. В соответствии с этим клоны, содержащие амплифицированный mini-Mu транспозон, отбирали на концентрациях Sm 2 мг/мл. Амплификацию проводили следующим образом. В клетки, содержащие интегрированный в хромосому mini-Mu транспозон {[/r/?r-KjnR-F^7]-SmR}, вводили нестабильную хелперную плазмиду рТРЗЮ. Затем проводили термоиндукцию синтеза факторов транспозиции и отбирали клоны, устойчивые к высоким концентрациям Sm. Наличие амплификации mini-Mu транспозона в хромосоме подтверждали гибридизацией по Саузерну (Рис. 6).

Как видно из рисунка 6 отобранные клоны имели, как минимум, две копии mini-Mu в своем геноме, и, следовательно, принципиальная возможность внутрихромосомальной амплификации mini-Mu за счет репликативной транспозиции с образованием коинтегратов была показана. Однако частота возникновения устойчивых к высокой концентрации стрептомицина (2 мг/мл) клонов по отношению к общему количеству клеток, взятых для индукции транспозиции устойчивых к низкой концентрации Sm (500 мкг/мл), т.е. частота амплификации, была достаточно низкой 2x10"4. Это не только делало

практически невозможным отбор вариантов с большим уровнем амплификации в неселективных условиях, но и сильно ограничивало само применение этой системы по сравнению с Е. coli, где обнаружение множественных интеграции и амплификация первично интегрированной mini-Mu единицы являлись рутинной процедурой (Саврасова Е. и др., 2007; Ахвердян В. и др., 2007).

А. Б.

12345678 12345678

■i « ts =¿ ¿5 — —

и mini

Рнс. 6. Результаты ДНК-гибридизации по Саузерну клонов М. methylotrophus ASI, содержащих в хромосоме копии mini-Mu транспозона {[FRT-Km-FRT]-SmK}. Изолированная из клеток хромосомная ДНК была гидролизована нуклеазой £coRV, полученные в результате фрагменты ДНК разделены с помощью электрофореза в агарозном геле (Б) и гибридизованы с меченым зондом (А): дорожка 1 - маркер, дорожка 2 - контроль - клон М. methylotrophus ASI::{[F^7'-KmR-F^7]-SmR}, отобранный в результате первичной интеграции mini-Mu в хромосому (устойчивость к SmR - 500 мг/л), дорожки 3 - 7 - клоны М. methylotrophus ASI::{[FRT-KmR-FRT]-SmR}, отобранные после процедуры амплификации mini-Mu в хромосоме (устойчивость к SmR - 2 г/л), дорожка 8 - отрицательный контроль -М. methylotrophus ASI (дикий тип).

1.7. Исследование влияния энхансерной последовательности бактериофага Mu (IAS) на амплификацию интегрированных фрагментов ДНК в бактериальном геноме.

Возможный путь модификации системы был выбран в соответствии с современными представлениями о механизмах транспозиции бактериофага Mu. Как известно в настоящее время, на ранней стадии реакции транспозиции ■ сложный цикл взаимодействий между субъединицами МиА, связывающими правый конец (R), энхансер (Е), а затем и левый конец (L), активизирует образование временного синаптического комплекса LER. После образования нестабильного короткоживущего LER-комплекса транспозиция Mu проходит через серию стабильных высокоупорядоченных нуклеопротеиновых комплексов, называемых транспозосомами. Присутствие Mu энхансера является важным фактором правильной сборки транспозосомы (Yin et al., 2007).

В созданной ранее Mu-производной двухплазмидной системе энхансер был расположен лишь в составе хелперной плазмиды (энхансерная область фага Mu или IAS (internal activation sequence) перекрывается с 01 и 02 операторами для с-репрессора), и, следовательно, E-элемент мог участвовать в процессе сборки Mu транспозосомы, только находясь в положении in trans относительно mini-Mu единицы.

Было решено исследовать процесс Mu-зависимой транспозиции в М. methylotrophus в случае, когда энхансер расположен между левым и правым att

сайтами mini-Mu. Для этого были созданы новые интегративные векторы на основе плазмиды рАН162 с у-репликоном R6K {Kolter R., 1981) (Рис. 7).

А.

Б.

Mu attR

orí R6K

MuattL

strA

Рис. 7. Физико-генетическая карта интегративных плазмид: (A) pl7AenhSm, (Б) pl7enhSm.

Структура генетического элемента mini-Mu одного из вновь сконструированных векторов pl7AenhSm была аналогична ранее используемым интегративным векторам (Рис. 7 А), а в состав mini-Mu транспозона второго pl7enhSm был клонирован фрагмент ДНК размером 350 пар нуклеотидов, содержащий энхансерную последовательность бактериофага Mu (IAS) (Рис. 7 Б). В качестве внутренних селективных маркеров mini-Mu как и в предыдущих экспериментах были использованы: ген устойчивости к Km, по которому проводили отбор первичной интеграции, и гены strAB, позволяющие регистрировать амплификацию mini-Mu в хромосоме.

Поскольку в данной работе было показано, что на этапе первичной интеграции транспозиция mini-Mu в хромосому М. methylotrophus происходит с высокой эффективностью, способность интегративных плазмид к мобилизационному переносу теперь не являлась обязательным условием. Поэтому новые интегративные векторы вводили в клетки М. methylotrophus, содержащие хелперную плазмиду с генами транспозазы, с помощью электропорации. Интеграцию и амплификацию проводили с использованием нестабильной хелперной плазмиды рТРЗЮ в условиях термоиндукции синтеза факторов транспозиции. Частота амплификации (относительно общего количества клеток, взятых для индукции транспозиции) составила для контрольного mini-Mu транспозона {[F/?r-KmR-F7?7]-SmR} - 10~4, тогда как для транспозона содержащего энхансерную

последовательность, была на два порядка выше - 2 х 10"". Гибридизация по Саузерну (Рис. 8) показала, что в результате амплификации количество копий транспозона {[F/?r-KmR-Fi?7]-IAS-SmR}, содержащего энхансер, увеличилось до 3-5 на хромосому, в то время как в контрольном штамме была зарегистрирована лишь одна дополнительная копия mini-Mu.

Следовательно, в результате проведенной модификации не только частота, но и множественность внутримолекулярной транспозиции mini-Mu в геноме М. methylotrophus существенно возросла и по эффективности стала

сравнима с известными системами интеграции на основе бактериофага Ми в Е. coli (Саврасова Е. и др., 2007; Ахвердян В. и др., 2007). Это позволяет использовать модифицированную нами систему, как для интеграции, так и для последующей амплификации целевых генов в хромосоме этих бактерий.

А. Б.

123456789 123456789

Рис. 8 Результаты ДНК-гибридизации по Саузерну клонов М. methylotrophus ASI, содержащих в хромосоме копии mini-Mu транспозона: А - {[F/?r-KmR-F/í7]-SmR}, Б -{[/7/?r-KmR-/;7?7]-IAS-SmR} Изолированная из клеток хромосомная ДНК была гидролизована нуклеазой EcoRV, полученные в результате фрагменты ДНК разделены с помощью электрофореза в агарозном геле и гибридизованы с меченым зондом: дорожка 1 - контроль -результат первичной интеграции mini-Mu в хромосому (устойчивость к SmR - 500 мг/л), дорожки 2 - 8 - результат амплификации mini-Mu в хромосоме (устойчивость к SmR - 2 г/л), дорожка 9 - отрицательный контроль - М. methylotrophus ASI.

1.8. Использование гена ZsGreen Zoanthus sp. в качестве селективного маркера для амплификации mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus.

К сожалению, вторая копия транспозона уже

обеспечивает устойчивость штамма к высоким концентрациям Sm (до 10 мг/ мл), что не позволяет использовать селекцию на стрептомицине, чтобы различать варианты с высоким и низким уровнем амплификации mini-Mu. Кроме того, как показали результаты гибридизации (Рис. 8, дорожки 4 А и 4 Б), на используемой в наших экспериментах концентрации стрептомицина 2 г/л, могут образовываться мутанты, обладающие высокой устойчивостью к антибиотику, что, в свою очередь, является неудобным с точки зрения практического применения стрептомицина в качестве селективного маркера. Поэтому, как возможный дополнительный маркер для селекции вариантов с большим уровнем амплификации, был выбран ген ZsGreen морского полипа рода Zoanthus sp., кодирующий зеленый флуоресцентный белок GFP (green fluorescent protein). Уровень экспрессии ZsGreen может быть измерен количественно, с помощью метода спектрофлуорофотометрии (Реппа V. et al., 2004). Уже на этапе первичной интеграции, как для контрольного {[.РЯГ-Кт11-га7]-8тк-ОРР}, так и для транспозона, содержащего энхансер {[.И?Г-Ктк-í7?7]-IAS-SmR-GFP}, были отобраны клоны, различающиеся по удельной флуоресценции приблизительно в 2 - 3 раза. Корреляция между количеством интегрированных в хромосому копий mini-Mu и удельной флуоресценцией GFP была подтверждена гибридизацией по Саузерну (Таблица 1, Рис. 9). Как видно из результатов гибридизации, действительно, клоны, содержащие две интегрированные единицы транспозона в составе генома (Таблица 1, Рис 9 №2

и №5), имели уровень удельной флуоресценции GFP в 2-3 раза превышающий уровень удельной флуоресценции вариантов с единственной копией mini-Mu в хромосоме.

Таблица 1. Значения удельной флуоресценции GFP клонов М. methylotrophus ASI, отобранных в результате первичной интеграции mini-Mu транспозонов: {[FRТ-К mR-F/?7]-SmR-GFP} или {[F/í7-KjnR-F/¿7]-lAS-SmR-GFP¡ в хромосому.

№ Штамм ОП 600 Удельная флуоресценция GFP

1 М. methylotrophus ASI 0,431 0

2 М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (1) 0,412 6194

3 М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (2) 0,447 3045

4 M. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6) 0,421 3401

5 M. methylotrophus ASl::IAS-SmR-GFP (4) 0,412 11019

6 M. methylotrophus ASI ::IAS-SmR-GFP (2) 0,588 3673

7 M. methylotrophus ASl::IAS-SmK-GFP (3) 0,327 3624

1 2 3 4 5 6 7

__ —. Рис. 9. Результаты ДНК-гибридизации по Саузерну клонов

М. methylotrophus ASI, отобранных в результате первичной интеграции mini-Mu транспозонов: {[F7?7,-KmR-F/?7]-SmR-GFP} или {[F/?r-KmR-F/í7]-IAS-Stn -GFP} в хромосому. Изолированная из клеток хромосомная ДНК была гидролизована нуклеазой Mph 11031, полученные в результате фрагменты ДНК разделены с помощью электрофореза в агарозном геле и гибридизованы с меченым зондом: дорожка 1 - контроль -М. methylotrophus ASI, дорожка 2 - М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (1), дорожка 3 - М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (2), дорожка 4 - М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6), дорожка 5 - М. methylotrophus AS1::LAS-SmR-GFP (4), дорожка 6 - М. methylotrophus ASl::IAS-SmR-GFP (2), дорожка 7 - М. methylotrophus ASl::IAS-SmR-GFP (3).

Эксперименты по амлификации {[FRT-KmR-FRT\-$mK-G¥V} и {[FRT-KmR-F7?7] -1A S - S mR-GFP} в хромосоме подтвердили наши предыдущие результаты относительно позитивного влияния энхансера, расположенного в составе mini-Mu, на эффективность репликативной транспозиции в М. methylotrophus. Частота амплификации транспозона {[F7?F-KmR-F7?7]-IAS-SmR-GFP}, содержащего энхансерную последовательность, была на два порядка выше, чем контрольного, а об уровне внутрихромосомальной транспозиции каждого из исследуемых mini-Mu можно было судить по уровню удельной флуоресценции (Таблица 2).

Из таблицы 2 видно, что удельная флуоресценция клонов, отобранных после процедуры амплификации mini-Mu, возросла для обоих вариантов транспозонов. Однако, как и следовало ожидать, для транспозона {[FRT-KmR-значения удельной флуоресценции GFP превышали уровень контрольного клона только в два - три раза, тогда как для транспозона {[FRT-

Ктк-^7]-1АБ-5тк-ОРР}, в некоторых случаях - больше чем на порядок, что соответствует множественной хромосомапьной амплификации транспозона.

Таблица 2. Значения удельной флуоресценции GFP клонов М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6) и М. methylotrophus AS1::IAS-Sm -GFP (2), отобранных после процедуры амплификации mini-Mu в хромосоме.

№ Штамм ОП 600 Удельная флуоресценция GFP

1 М. methylotrophus ASI 0,227 0

2 М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6) 0,276 3837

3 М. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6/1) 0,239 5552

4 M. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6/2) 0,311 11820

5 M. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6/3) 0,213 9542

6 M. methylotrophus ASl::SmR-GFP (6/4) 0,218 10001

7 M. methylotrophus ASl::IAS-SmR-GFP (2) 0,327 3821

8 M. methylotrophus ASl::IAS-SmK-GFP (2/1) 0,347 35516

9 M. methylotrophus AS 1 ::IAS-SmR-GFP (2/2) 0,234 52605

10 M. methylotrophus ASl::IAS-SmK-GFP (2/3) 0,254 32919

11 M. methylotrophus ASl::IAS-SmR-GFP (2/4) 0,221 52482

Последующая гибридизация подтвердила корреляцию между количеством интегрированных копий mini-Mu и удельной флуоресценцией GFP и, хотя четкой линейной зависимости, позволяющей с точностью до одной копии определять уровень внутримолекулярной амплификации транспозона выявлено не было, однако возможность достоверно различать варианты с высоким (более 5) и низким (2 копии) уровнем транспозиции была показана. Это означает, что ген ZsGreen может быть успешно использован в качестве селективного маркера для отбора вариантов с большим уровнем амплификации целевых фрагментов ДНК в хромосоме М. methylotrophus. Следует также отметить, что высокая эффективность разработанной и усовершенствованной в этой работе системы позволяет использовать теперь транспозицию фага Mu для коструирования бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов на основе М. methylotrophus, в том числе и без применения вырезаемых маркеров для селекции генетических модификаций.

Безусловно, исследование фундаментальных аспектов Mu-зависимой транспозиции в клетках метилотрофов требует дальнейших экспериментов, но разработанная система уже в настоящее время может и реально используется для направленной модификации штаммов М. methylotrophus, проведения с этими бактериями различных экспериментов по метаболической инженерии (Tokmakova I. et al., 2007) с целью создания новых продуцентов биологически активных соединений, пригодных для биотехнологического производства. В частности, разработанная и усовершенствованная в этой работе система интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому была успешно использована в АГРИ при конструировании на основе облигатного метилотрофа М.

methylotrophus ASI бесплазмидного и безмаркерного штамма-продуцента L-фенилаланина.

2. Создание коллекции ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот у Methylophilus methylotrophus XSV.-.aroPЕС0.

Следующей нашей задачей было отобрать мутантные варианты М. methylotrophus ASI, дефектные по синтезу ароматических соединений. Для этого мы использовали различные формы мутагенеза с помощью М-метил-N'-нитро-Ы-нитрозогуанидина (МННГ), применяя как стандартные, описанные для штаммов Е. coli протоколы (Miller J., 1972), так и специально модифицированные для M. methylotrophus ASI (Gunji Y. et al., 2004; Kim С. and Wood T., 1997) и M. flagellars KT методы (Tsygankov Y. and Kasakova S., 1987), известные в настоящее время в литературе. Несмотря на то, что было проанализировано более чем 200000 отобранных после мутагенеза клонов, ни одного мутанта с нарушенным синтезом ароматических соединений обнаружить не удалось. В то же время, мутанты устойчивые к высоким концентрациям L-фенилаланина (Phe) или к его неметаболизируемым аналогам DL-фторофенилаланину и мета-фторофенилаланину возникали и могли быть изолированы в результате метода химического мутагенеза с частотой, характерной для штаммов £ coli. Кроме того, в ходе нашей работы мы обнаружили, что базальный уровень устойчивости М. methylotrophus ASI к некоторым токсичным для роста клетки соединениям, в частности 5-метилтриптофану и L-валину более чем в 100 раз выше, чем клеток E.coli. Одним из объяснений наших неудачных попыток в селекции ауксотрофов могла быть низкая проницаемость некоторых метаболитов (аминокислот и витаминов, в частности) через цитоплазматическую мембрану из селективной среды и, как следствие, гибель потенциальных ауксотрофов.

2.Í. Влияние амплификации генов агоР и brnQ £1 coli на чувствительность М. methylotrophus ASI к аналогам ароматических аминокислот и вали ну.

С целью увеличить проницаемость мембраны М. methylotrophus для ароматических аминокислот было решено ввести в клетки M. methylotrophus рекомбинантную плазмиду, содержащую ген агоР Е. coli (aroPEm). Пермеаза AroPgco принадлежит к АРС (amino acidJpolyamine-organic cation) суперсемейству белков-транспортеров (Young G. et al., 1999) и обеспечивает протон-зависимый транспорт ароматических аминокислот Phe, Туг и Тгр через внутреннюю мембрану Е. coli из периплазмы в цитоплазму. (Cosgriff A. et а!., 2000; Cosgriff A. and Pittard А., 1997) В качестве контрольного для демонстрации субстратной специфичности выбранного нами транспортера был использован другой ген £ coli brnQ {brnQLco). Белковый продукт гена brnQEca имеет высокую гомологию с ортологом S. typhimurium, который принадлежит к LIVCS (branched chain amino acid.cation symporter) семейству транспортных белков и функционирует как Ка+-зависимый симпортер разветвленных аминокислот (sodium / branched-chain amino acid (ВСАА)) (Ohnishi К. et al., 1988).

Как можно видеть из результатов, представленных в таблице 3, присутствие агоРЕсо существенно увеличило чувствительность М теЖуШгоркш к аналогу ароматических аминокислот 5-метилтриптофану, но совсем не повлияло на высокую устойчивость к Ь-валину. В отличие от этого амплификация гена Ьгпнаоборот сообщала метилотрофным клеткам в сравнении с контрольным штаммом высокую чувствительность к Ь-Уа1 и не меняла их устойчивости к 5-метилтриптофану.

Таблица 3. Устойчивость штаммов М. methylotrophus ASI, содержащих плазмиды pAYCTER3 (контроль), pAVCTER3-aroPEco и pAYCTER3-Ar«£>Eco, к 5-метилтриптофану и L-валину на минимальной агаризованной среде SEIIa с добавлением 1% метанола.

Штамм Рост в присутствии

5-метилтрипто< >ан L-Val

0 5 мг/л 10 мг/л 50 мг/л 0 1 г/л 2,5 г/л 5 г/л

М methylotrophus ASI pAYCTER3 + + + + + + + +

М. methylotrophus AS 1 pAYCTER-aroP^ + - - - + + + +

M. methylotrophus ASI:: агоРвп + - - - + + + +

M. methylotrophus ASI pAYCTER-6m0Eco + + + + - - -

Вероятнее всего введение транспортеров аминокислот Е. coli специфически увеличивает проницаемость внутренней цитоплазматической мембраны М. methylotrophus для соответствующих аминокислот и их аналогов. Можно было ожидать, что использование метилотрофного штамма с экспрессий гетерологичного белка АгоР^ позволит нам получить группу ауксотрофных мутантов по биосинтезу ароматических соединений. Для этого на первом этапе ген агоРЕсо был интегрирован в бактериальную хромосому М. methylotrophus ASI с помощью разработанной нами интегративной системы на основе транспозиции бактериофага Mu. Полученный таким образом бесплазмидный безмаркерный штамм М. methylotrophus ASl::öro/'Eco имел уровень чувствительности к 5-метилтриптофану такой же как штамм, содержащий плазмиду рАУСТЕЯЗ-агоРнсо (Таблица 3) и, следовательно, мог быть использован в дальнейших экспериментах по созданию ауксотрофных мутантов.

2.2. Клонирование генов trpEGDMme через функциональную комплементацию trpE мутанта Е. coli и инактивация trpE в хромосоме М. Methylotrophus ASI.

На следующем этапе нашей работы гены, кодирующие ферменты ароматического пути биосинтеза, были клонированы из хромосомы М. methylotrophus ASI методом «shotgun» по комлементации соответствующих ауксотрофных мутантов E.coli К-12 из Кео коллекции (Baba et al., 2006) и секвенированы методом Сенгера (Рис. 11, 12).

В результате анализа нуклеотидной последовательности фрагмента хромосомы М. methylotrophus (5227 п.н.), который комплементировал trpE мутацию Е. coli JW1256-A/rp£, в его составе было обнаружено пять

транскрибирющихся в одном направлении открытых рамок считывания (ORFs) (Рис. 10 А). Сравнение аминокислотной последовательности предполагаемых белковых продуктов с белками М. fagellatus КТ с использованием программы BLAST выявил высокий уровень гомологии трех первых ORFs с известными TrpEGD субъединицами антранилат синтазы, глутамин-амидотрансферазы, антранилат фосфорибозил трансферазы (ЕС 4.1.3.27/2.4.2.18), а последней - с индол-3-глицерол фосфат синтазой/ N-5-фосфорибозил антранилат изомеразой (ЕС 5.3.1.24/4.1.1.48) М. flagellatus КТ (77.3% идентичных аминокислот для ТгрЕ, 83.3% для TrpG, 85,5% для TrpD и 74,9% для ТгрС) (Рис. 10 Б).

Hi ndlll Psrt

Sau3A фрагмент генома М. methylotrophus AS1 5227 п. н.

trpE

CDS1

Фрагмент генома М. flagellatus КТ 7301 п. н.

trpE

Mfla 2469

Mfla 2470

trpD

trpC

Mfla 2466

trpG

o 301 'T.C •< ■"■■"У у ■ Ж "5

§ Ш .

' : -i? i

1 77 153 229 305 381 457502

TrpE M. methylotrophus AS1

31 61 91 121 151 181194

TrpG M. methylotrophus AS1

1 " * ' - =; ЧМ

1 53 105 157 209 261313336

TrpD M. methylotrophus AS1

Рис. 10. (А) Генетическая организация клонированного в этой работе ЗА (5^1431) фрагмента ДНК хромосомы М. те1куШгорки.ч АЭ! и фрагмента хромосомы М /1а%е11аШ5 КТ, содержащих гены пути биосинтеза триптофана. (Б) Сравнение аминокислотной последовательности предполагаемых белковых продуктов с белками M.flаgellаtus КТ.

Для того, чтобы сконструировать штамм М. methylotrophus ASI, мутантный по биосинтезу Тгр, предполагаемый ген trpEMme в составе клонированного фрагмента был нарушен в результате встраивания в структурную часть гена, ПЦР фрагмента, содержащего вырезаемый маркер [FRT-Km^-FRT]. Для предотвращения возможного «полярного эффекта» при транскрипции дистально расположенных генов конструирование и встраивание Ктк-маркера в trpEume проводили таким образом, чтобы после интеграции в хромосому М. methylotrophus ASI и FLP-зависимого удаления канамицина, оставшаяся в хромосоме «scar» последовательность, содержащая FRT, не приводила к сдвигу рамки считывания «downstream» области хромосомальной ДНК (Рис. 11А).

Линейный фрагмент ДНК, содержащий trpEMme::[FRT-KmK-FRT], был введен электропорацией в штамм М. methylotrophus ASI::агоР^со с целью

получения KmR колоний. Длина гомологии участков ДНК, фланкирующих с двух сторон маркер KmR, с хромосомой М. methylotrophus в этом случае составляла более 2000 пар нуклеотидов. Селективный отбор целевых клонов проводили на минимальной среде SEII с добавлением 2 % метанола и 100 мг/л L-триптофана. В качесте контроля дикий тип М. methylotrophus ASI был использован как реципиент в аналогичных экспериментах по электропорации фрагмента trpEUmt'-'-[ERT-Krí^-FRT\. Приблизительно 100 KmR рекомбинантных колоний, не способных расти без добавления L-триптофана в питательную среду, были изолированы в случае, когда мы использовали в качестве реципиена штамм М. methylotrophus ASI:: агоРв», но ни одного ауксотрофного мутанта нам не удалось отобрать в тех же условиях, когда реципиентом являлся контрольный штамм М. methylotrophus ASI. Наличие KmR маркера в геноме М methylotrophus ASI^úvoPeco и инактивация írpE^me в результате гомологичной рекомбинации между линейным фрагментом ДНК, содержащим trpEumt-'[FRT-Кш K-FRT], и бактериальной хромосомой были подтверждены с помощью ПЦР (Рис. 11 В).

Р1 FRT

Kanamycln resistance^}

рз Р1 FRT

IKanamycin resistance

I trpE

Am —

12 3 4

trpE ü IrpG >

я- Т',Д '

^ +FLP recombinase

РЗ FRT

I trpE ] trpG > T 4-тп .......................'

,_- ■ - — TG/C " -------

In-frame peptide

Priming site P1

'scar' sequence 75 bp (25aa)

M (408aa) A M

ATG(1221nt)GCCATC ÜASGCTGGAGCTGCTTC 3AAGTTCCTA?ACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC JGAATAGGAACTAAGGAGGA IATGGAA (291nt) TGR

TAC(1221nt)CGGTAC ÍTCCGACCTCGACGAAC 2TTCAAGGATATGAAAGATCTCT5ATCCTTGAAC XTTATCCTTGATTCCTCC1

I S T К E

' 3"! n

iTACCTT (291nt) AC1

N-terminal part of trpE

34-bp FRT site

Priming site P2

C-terminal part of trpE

Рис. 11. (А) Схема конструирования «in frame» инсерционных мутантов и структура остаточной после FLP-зависимого удаления маркера KmR «scar» последовательности на примере инактивации гена trpE М. methylotrophus. Праймеры PI и Р2 использованы для ПЦР-амплификации маркера Km из pKD4, праймеры РЗ и Р4 - для подтверждения целевой инсерции в хромосоме. (В) Подтверждение инсерционной мутации гена trpE в хромосоме М. methylotrophus - электрофорез в агарозном геле: дорожка 1 - маркер, дорожка 2 - ПЦР продукт хромосомы М. methylotrophus AS\::aroP^0 с праймеров РЗ и Р4, дорожка 3 - ПЦР продукт хромосомы М methylotrophus AS\::aroPEcc-trpEMmc'[FRT-KmR-FRT] с праймеров РЗ и Р4, дорожка 4 - ПЦР продукт хромосомы М. methylotrophus AS\::aroPEco-trpEMmc.:FRT с праймеров PI и Р4.

Далее было проведено вырезание селективного маркера из хромосомы двух отделено взятых колоний М. methylolrophus AS 1 ::aroPEm-trpE\{mt::[FRT-KmK-FRT. Приблизительно 90% полученных в результате клонов имели фенотип Kms. Удаление маркера из хромосомы с сохранением 75 нуклеотидов, содержащих сайт узнавания FLP-рекомбиназы FRT, в виде «scar» последовательности, локализованной в структурной части гена trpEume, было подтверждено методом ПЦР (Рис. 11 В). Как и следовало ожидать, все Kms клоны сохраняли Тгр~ фенотип.

Таким образом, мы смогли получить стабильный безмаркерный ауксотрофный штамм М. methylotrophus AS\::aroPEco-trpEMmt::FRT, используя (1) специально сконструированный реципиентный штамм с геном транспортера огоРесоj интегрированным в хромосому; (2) линейный фрагмент ДНК, содержащий ген trpEumc инактивированный вырезаемым маркером KmR; (3) метод обмена маркером между линейным фрагментом ДНК и бактериальной хромосомой с использованием механизма общей рекомбинации и (4) систему FLP-F/гГ-зависимой рекомбинации для удаления селективного маркера.

2.3. Клонирование и инактивация генов М. methylotrophus ASI, вовлеченных в пути биосинтеза ароматических соединений, оптимизация экспериментальной процедуры.

Аналогичный подход был использован при конструировании других ауксотрофных мутантов с нарушенным синтетезом ароматических соединений на основе М. methylotrophus KS\v.aroPím.

0 1000 2000 3000 4000 5000 п. н.

1_i_i_i_i_i

'serC k pqqB1

fN pheA hisH ----ämG----^=1 % 4689 П. H.

Swal (1441)

N .aroA[

> 2445 п. h.

Рис. 12. Генетическая организация клонированных в этой работе Sau ЗА (Bsp 1431) фрагментов ДНК хромосомы М. methylolrophus ASI, содержащих гены ароматического пути биосинтеза.

Полная открытая рамка считывания, обнаруженная в составе фрагмента хромосомы М. methylotrophus, который комплементировал AtyrA мутацию Е. coli Ш2581-А1угА, имела высокий уровень гомологии с хоризмат мутазой / префенат дегидрогеназой (ЕС 1.3.1.12/5.4.99.5) М ßagellatus KT (60,4% идентичных аминокислот) (Рис. 12). Чтобы оптимизировать процедуру конструирования ауксотрофных мутантов и определить минимальный размер гомологии небходимый для рекомбинации в А/, methylotrophus, при конструировании tyrA ауксотрофов мы использовали линейные фрагменты ДНК, содержащие tyrAMmc::[FRT-KmK-P'RT\ с различной длиной фланговой гомологии селективного маркера. С этой целью были получены ПЦР фрагменты tyrAume"[FRT-Yjx^-FRT] с маркером, фланкированным участками

хромосомальной ДНК, размером 100, 250, 500 и 1000 пар нуклеотидов. Несколько KmR Туг" колоний было изолировано уже в случае, когда область гомологии фрагментов ДНК, окружающих маркер, с хромосомой была протяженностью не менее 500 пар нуклеотидов, и более 20 клонов ауксотрофных мутантов могли быть отобраны в каждом эксперименте, когда длина фланговой гомологии составляла >1000 пар нуклеотидов. Согласно полученным результатам при создании ауксотрофных мутантов достаточно использовать линейные фрагменты ДНК с заданными плечами гомологии к целевому гену размером >1000 пар нуклеотидов, что позволяет конструировать их in vitro методом ПЦР с перекрывающимися праймерами («overlap extention»). Этот подход был использован нами при создании PheA" и AroG-мутантов М. methylotrophus AS\::aroPEm.

Гены pheAume, кодирующий хоризмат мутазу / префенат дегидратазу (ЕС 1.3.1.12/5.4.99.5), и aroGMm« кодирующий 3-деокси-0-арабино-гептулозонат-7-фосфат синтазу (ДАГФ) (ЕС 2.5.1.54), были клонированы из хромосомы М. methylotrophus ASI в составе достаточно большого (4689 п.н.) фрагмента ДНК (Рис.12). В результате анализа нуклеотидной последовательности в составе этого фрагмента были обнаружены три сонаправленные и транскрипционно перекрывающиеся ORFs, которые имели высокий уровень гомологии с PheA, HisH и AroG М. flagellatus KT (63,4%, 71,9% и 73,5% идентичных аминокислот соответственно). Для штаммов Е. coli, известны три изофермента ДАГФ синтазы, кодируемые генами aroG^, aroF^0 и агоН^0. Тогда как для родственного М. methylotrophus ASI микроорганизма М. flagellatus KT был аннотирован в бактериальном геноме лишь один ген ДАГФ синтазы - aroG.

Два линейных фрагмента ДНК, содержащие маркированные делеции ApheA^me::[FRT-KmR-FRT] и AaroGMme::[FRT-KmK-FRT], были сконструированы с помощью метода ПЦР с перекрывающимися праймерами и гены pheAM^t и aroGumt были инактивированы в хромосоме М. methylotrophus ASl::arofEco. При инактивации pheAHme устойчивые к канамицину колонии были получены только на селективной среде с добавлением всех трех ароматических аминокислот (AroAs): L-Phe, L-Tyr, L-Trp и пара-аминобензойной кислоты (ПАБК), и ни одного KmR клона мы не смогли отобрать, когда L-Phe был добавлен в минимальную среду в качестве единственного компонента для селекции ауксотрофных мутантов. Мы предполагаем, что «полярный эффект» при нарушении pheAMrr¡e гена в результате инсерции [FÄ7,-KmR-/r/?7] мог привести к преждевременной терминации транскрипции обозначенного оперона, содержащего öroGMme как дистально расположенный цистрон. Когда маркер KmR был удален из хромосомы, оставшаяся «scar» последовательность восстанавливала исходную рамку считывания в ApheAMme::FRT и мутантный штамм М. methylotrophus AS \ ::aroPEco-ApheAMm¡.\:FRT мог расти на минимальной среде с метанолом, содержащей 100 мг/л L-фенилаланина.

Фрагмент ДНК с AaroG\ime::[FRT-KmK-FRT\ был использован для создания ауксотрофного мутанта, который также мог расти только, когда все основные ароматические компоненты (AroAs и ПАБК) присутствовали в селективной среде. При этом удаление маркера KmR из хромосомы не привело к изменению потребностей безмаркерного штамма М. methylotrophus

AS l::aroPEC0-AaroGMmi.::FRT в питательных составляющих среды. Эти результаты однозначно указывают на то, что, также как и ранее было показано для Л/ flagellatus КТ, только один ген, кодирующий ДАГФ синтазу, присутствует в геноме М. methylotrophus AS1.

Подводя итоги этой части нашей работы, следует отметить, что достаточно большое число генов Е. coli экспрессируются в М. methylotrophus AS1 под контролем своих регуляторных областей (Abalakina et al., 2008), поэтому сам факт транскрипции генов aroP^, brnQ^0 в клетках этого метилотрофа был в достаточной степени предсказуем. Именно поэтому и не была проведена предварительная замена промоторов у этих генов, как, по-видимому, следовало бы сделать в случае другого реципиентного организма. Однако функционирование их белковых продуктов в качестве специфических транспортеров в составе гетерологичной бактериальной мембраны, безусловно, можно отнести к экспериментальным удачам. Тем не менее, уже при наличии прецедента, можно рекомендовать введение генов транспортеров аминокислот при создании ауксотрофов и на базе других метилотрофных бактерий. Можно думать, что функционирование специфического транспортера в гетерологичном хозяине можно будет экспериментально зарегистрировать по снижению устойчивости рекомбинантных штаммов к структурным аналогам соответствующих аминокислот. Таким образом, использованный в данной работе подход, возможно, будет иметь практическое значение и для получения мутантов на основе различных организмов.

Сам по себе метод получения инсерционных мутантов в результате обмена маркером с использованием механизма общей рекомбинации (recombination-mediated marker exchange) не является оригинальным для клеток метилотрофных бактерий и, в частности, для М. methylotrophus AS1 (Bohanon et al., 1988). Однако использование этого подхода подразумевало введение в реципиентные клетки кольцевой молекулы ДНК, не способной к автономной репликации в данном хозяине, и последующий обмен содержащегося на ней фрагмента с селективным маркером на участок бактериальной хромосомы. Использование в данной работе для «marker-exchange» линейной ДНК, значительно повышает селективность отбора целевых рекомбинантов, поскольку маркер может оказаться в составе хромосомы лишь в результате рекомбинации по обоим флангам, а не по одному, как это может быть в случае введения в клетки кольцевой плазмиды.

Сочетание этих двух элементов - (1) создание специализированного реципиента и (2) оптимизация процедуры конструирования фрагмента для инсерционного мутагенеза позволило создать удобные мутанты М methylotrophus AS1 с нарушенными путями биосинтеза ароматических соединений, которые ранее у этого организма получены не были. Эти ауксотрофные мутанты, а также методы их конструирования в дальнейшем были использованы нами для создания штамма-продуцента L-фенилаланина на метаноле (Yomantas Y. and Abalakina Е., 2002; Tokmakova I. et al, 2007).

выводы

1. Система транспозиции бактериофага Mu адаптирована для интеграции рекомбинантной ДНК в геном М methylotrophus ASI. Эта система включает две плазмиды: первая, хелперная, с репликоном широкого круга хозяев и термоиндуцибельными генами Mu-А и Ми-В; вторая, интегративная, с mini-Mu транспозоном, содержащим L- и R-концевые участки ДНК Mu. Для селекции интегрантов использовали ген устойчивости к канамицину (KmR), фланкированный сайтами FRT, а для последующего удаления маркера -FLP-рекомбиназу S. cerevisiae.

2. Показана высокая эффективность транспозиции с использованием данной системы на этапе первичной интеграции mini-Mu в хромосому М. methylotrophus, осуществляющейся, в основном, по механизму репликативной транспозиции через образование коинтегратов с их последующим разрешением. Возможность последовательной интеграции нескольких различных фрагментов ДНК продемонстрирована с использованием генов а-амилазы В. amyloliquefaciens и катехол-2,3-диоксигеназы Р. pulida.

3. Введение в состав интегрируемого mini-Mu транспозона энхансерного элемента (IAS) обеспечивало возможность высокоэффективной (с частотой 2xlO"J) амплификации mini-Mu в бактериальной хромосоме в присутствии факторов транспозиции.

4. Для клеток М. methylotrophus разработан метод получения ауксотрофных мутантов по биосинтезу ароматических соединений. Он основан на (а) использовании специально сконструированного реципиентного штамма с геном транспортера агоР^, (б) конструировании линейных фрагментов ДНК, содержащих целевые гены, инактивированные вырезаемым маркером KmR; (в) обмене in vivo маркером между линейным фрагментом ДНК и бактериальной хромосомой в ходе общей рекомбинации и (г) использовании системы FLP-Fiír-рекомбинации для удаления маркера.

5. С помощью разработанного метода создана коллекция ауксотрофных мутантов М. methylotrophus по генам trpE, tyrA, pheA, aroG с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Zakataeva N. P., Aleshin V. V., Tokmakova I. L., Troshin P. V. and Livshits V.A. The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved in the amino acid efflux. //FEBS Lettes 452(3):228-32,1999

2. Kutukova E. A., Livshits V. A., Altman I. P., Ptitsyn L. R., Zyiatdinov M. H., Tokmakova I. L., Zakataeva N. P. The yeaS (leu E) gene of Escherichia coli encodes an exporter of leucine, and the Lrp protein regulates its expression // FEBS Lettes 579(21):4629-34,2005

3. Токмакова И. JI., Абалакина Е. Г., Горшкова Н. В., Иомантас Ю. В. Способ придания бактерии, принадлежащей к роду Methylophilus, ауксотрофности по L-аминокислоте. // Патентная заявка РФ №2007111371, 2007

4. Katashkina J. I., Kuvaeva Т. М., Andreeva I. G., Skorokhodova A. Y„ Biryukova I. V., Tokmakova I. L., Golubeva L. I., Mashko S. V. Construction of stably maintained non-mobilizable derivatives of RSF1010 lacking all known elements essential for mobilization. // BMC biotechnology 7:80,2007

5. Абалакина E. Г., Токмакова И. JI., Горшкова H. В., Смирнов С. В., Ахвердян В. 3., Машко С. В., Иомантас Ю. В. Использование системы транспозиции бактериофага Ми для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому Methylophilus methylotrophus. Н Биотехнология №3,2008

6. Abalakina Е. G., Tokmakova I. L., Gorshkova N. V., Gak Е. R., Akhverdyan V. Z., Mashko S. V., Yomantas Y. V. Phage Mu-driven two-plasmid system for integration of recombinant DNA in the Methylophilus methylotrophus genome. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 81(l):191-200,2008

7. Yomantas Y. V., Tokmakova I. L., Gorshkova N. V., Abalakina E. G., Kazakova S. M., Gak E. R., Mashko S. V. Aromatic amino acid auxotrophs constructed by recombinant marker exchange in Methylophilus methylotrophus AS1 cells expressing the aroP-Qncoded transporter of Escherichia coli. // Appl. Environ. Microbiol. 76(l):75-83, 2010

Подписано в печать: 19.04.2010

Заказ № 3579 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.nj

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Токмакова, Ирина Львовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий.

1.1.1. Общая характеристика метилотрофных бактерий.

1.1.2. Ростовые характеристики и основные продукты, получаемые с использованием метилотрофных бактерий.

1.1.3. Экономический аспект применения метилотрофных организмов в биотехнологии.

1.1.4. Генетические методы, используемые для метаболической инженерии метилотрофных бактерий.

1.2. Бактериофаг Ми: вирус и транспозон.

1.2.1. Последовательности ДНК, необходимые для Ми-транспозиции.

1.2.2. Белки, принимающие участие в репликативной транспозиции бактериофага Ми.

1.2.3. Этапы транспозиции фага Ми.

1.2.4. Бактериофаг Ми как инструмент для генной иженерии.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования.

2.2 Олигонуклеотиды.

2.3. Стандартные генно-инженерные методики.

2.4. Межродовая конъюгация.

2.5. Электротрансформация клеток М. methylotrophus.

2.6. Интеграция mini-Mu транспозона в хромосому М. methylotrophus.

2.7. Удаление маркера [FRT-KmR-FRТ\ из хромосомы.

2.8. Тестирование синтеза амилазы и С230 в клетках метилотрофов.

2.9. Амплификация mini-Mu транспозона в хромосоме метилотрофов.

2.10. Конструирование рекомбинантных плазмид.

2.10.1. Конструирование интегративных плазмид на основе pMIV5-[/^r-KmR-7^7]-Mob.

2.10.2. Конструирование интегративных плазмид на основе плазмиды рАН162.

2.10.3. Конструирование плазмид pAYCTER-агоРнсо и pAYCTER-^rw^Eco

2.10.4. Клонирование генов ароматического пути биосинтезам methylotrophus AS 1.

2.10.5. Конструирование плазмид и линейных фрагментов для мутагенеза.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Адаптация системы транспозиции бактериофага Ми для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. methylotrophus AS 1.

3.1.1. Конструирование хелперных плазмид с термоиндуцибельными генами факторов Mu-зависимой танспозиции.

3.1.2. Конструирование интегративных векторных плазмид, способных к мобилизационному переносу в М. methylotrophus.

3.1.3. Mu-зависимая транспозиция маркера устойчивости к канамицину в геном М. methylotrophus.

3.1.4. FLP-Т^Г-зависимое удаление интегрированного Кшк-маркера из хромосомы метилотрофов.

3.1.5. Последовательная Mu-зависимая транспозиция нескольких генов в М. methylotrophus.

3.1.6. Амплификация mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus.

3.1.7. Исследование влияния энхансерной последовательности бактериофага Ми на амплификацию интегрированных фрагментов ДНК в бактериальном геноме.

3.1.8. Использование гена ZsGreen Zoanthus sp. в качестве селективного маркера для амплификации mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus.

3.2. Создание коллекции ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот у Methylophilus methylotrophus ASl-aroPEco.

3.2.1. Влияние амплификации генов агоР и brnQE. coli на чувствительность М. methylotrophus AS 1 к аналогам ароматических аминокислот и валину.

3.2.2. Клонирование генов trpEGDMmc через функциональную комплементацию trpE мутанта Е. coli и инактивация trpE в хромосоме М. Methylotrophus AS 1.

3.2.3. Клонирование и инактивация генов М. methylotrophus AS1, вовлеченных в пути биосинтеза ароматических соединений, оптимизация экспериментальной процедуры. 104 ВЫВОДЫ 114 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ п.н. - пара нуклеотидов т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов ПЦР - полимеразная цепная реакция АТФ - аденозин-5- трифосфат КоА - коэнзим А

Km, KmR- канамицин, маркер устойчивости к канамицину Ар, Арк — ампициллин, маркер устойчивости к ампициллину Тс, TcR— тетрациклин, маркер устойчивости к тетрациклину Cm — хлорамфеникол

Sm, SmR - стрептомицин, маркер устойчивости к стрептомицину

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МННГ - ТЧ-метил-ТчР-нитро-Ы-нитрозогуанидин

L-Val — L-валин

L-Phe — L-фенилаланин

L-Туг - L-тирозин

L-Trp - L-триптофан

AroAs — ароматические аминокислоты

ПАЕК — парааминобензойная кислота

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов направленной модификации бактериальной хромосомы для метаболической инженерии облигатного метилотрофа Methylophilus methylotrophus AS1"

АКТУЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Забота об окружающей среде в условиях быстрого индустриального развития многих стран мира делает необходимым переход промышленных процессов на качественно новый технологический уровень, направленный на использование возобновляемых природных ресурсов и минимизацию потерь. Одним из направлений решения данной задачи является сочетание «мягких» в отношении окружающей среды микробиологических процессов с дешевыми и легкодоступными видами сырья. К таким видам сырья можно отнести метанол, получаемый из природного газа и имеющий сравнительно низкую стоимость. В последнее время в биотехнологической индустрии метанолу уделяется большое значение, как альтернативному источнику углерода широко используемым для этих целей сахарам.

Бактерии, способные расти на метаноле, широко распространены в природе и характеризуются большим разнообразием. Доступность сырья и его сравнительно невысокая стоимость позволяют рассматривать метилотрофы в качестве перспективных и выгодных объектов индустриальной биотехнологии. В настоящее время метилотрофные бактерии все шире используются в промышленности для производства таких важных биологически активных веществ, как: секретируемые природные и рекомбинантные белки (Belanger L. et al., 2004; Fitzgerald К. and Lidstrom M., 2003) витамины, ферменты, полисахариды, аминокислоты (Bourque D. et al., 1995; Korotkova N. et al., 2002; Motoyama H. et al., 1993, 2001; Tani Y., 1991).

Создание штаммов-продуцентов с заданными свойствами и высокой эффективностью продукции предполагает детальное знание генетики организма, его метаболитических путей, процессов регуляции клеточного метаболизма, а также наличия определенного набора генетических методов, необходимых для направленной модификации исследуемого объекта. Промышленное использование метилотрофов значительно увеличило интерес к изучению генетического контроля Ci метаболизма у определенных видов этих бактерий {Anthony С., 1993). За последние 5 лет были секвенированы геномы некоторых метилотрофных микроорганизмов {Chistoserdova L. et al., 2007; Giovannoni S. et al., 2008; Hou S. et al., 2008; 2007; Vuilleumier S. et al., 2009; Ward N. et al., 2004), значительный прогресс достигнут в понимании их метаболизма {Crowther G. et al., 2008), и существенно расширен набор полезных методов для генетической и метаболической инженерии {CueD. etal., 1997; Gliesche С., 1997; Marx С. and Lidstrom M., 2001, 2002). К таким методам можно отнести, например, недавнее использование системы транспозона Тп7 для сайт-специфической интеграции в геном метилотрофов рекомбинантных ДНК {Choi Y. et al., 2006а). Однако и сейчас большинство метилотрофов плохо изучены и набор генетических инструментов для работы с ними сильно ограничен. По этой причине разработка новых подходов генетического анализа метилотрофрых бактерий с их последующим применением в конструировании штаммов-продуцентов представляется на данном этапе актуальной.

Methylophilus methylotrophus AS1, являющийся объектом наших исследований, в 70-е годы прошлого века был широко использован в микробиологической индустрии для производства бактериальной биомассы {Senior P. and Windass J., 1980, Vasey R. and Powell K., 1984). В связи с чем, начальные стадии углеродного и энергетического метаболизма этого организма в этот период были всесторонне исследованы {Сох J. et al., 1992; Hothi P. et al., 2003), однако мало что известно о метаболитических путях биосинтеза аминокислот в М. methylotrophus. Недавно специалистами Аджиномото (Ajinomoto Со, Inc.) было проведено изучение синтеза L-лизина у М. methylotrophus, начиная с исследования путей биосинтеза {Gunji Y. et al., 2004; Tsujimoto N. et al., 2006) и заканчивая конструированием и усовершенствованием продуцента L-лизина на метаноле {Gunji Y. et al., 2006; Gunji Y. and Yasueda H., 2006; Ishikawa K. et al., 2008 (a-c)). Задачей наших исследований было создание методов, облегчающих создание на основе М. methylotrophus штаммов-продуцентов ароматических аминокислот. Как известно, на первом этапе конструирования продуцентов аминокислот необходимо отобрать мутанты с ослабленным ингибированием ключевых ферментов конечным продуктом биосинтеза и блокировать возможные пути деградации целевого продукта и его предшественников созданием соответствующих ауксотрофных мутантов (Bongaerts J. et al., 2001; Ikeda M., 2006; Parekh S. et al., 2000). Для облигатных метилотрофов получение ауксотрофных мутантов является особой трудностью (de Vries G. et al., 1990). Причиной может быть неспособность некоторых соединений проникать внутрь и экспортироваться из клеток этих микроорганизмов. И хотя отдельные случаи получения ауксотрофных мутантов у М. methylotrophus AS1 все же были описаны (Bohanon М. et al., 1988; Gunji Y. et al., 2004; Kim C. and Wood Т., 1997), их число сильно ограничено. Кроме того, применение различных подходов и разработка новых методов для получения мутантов не привели к созданию коллекции ауксотрофных мутантов М. methylotrophus AS1, которые могли быть полезными для исследования путей биосинтеза аминокислот. С другой стороны, имевшиеся в литературе (Tsujimoto N. et al., 2006; Gunji Y. and Yasueda H., 2006), а также и наши собственные экспериментальные данные свидетельствовали в пользу того, что многие клонированные гены Е. coli способны достаточно эффективно экспрессироваться в М. methylotrophus, что позволяло надеяться на возможное практическое использование уже хорошо разработанных генетических модулей и систем для функционирования в этих новых реципиентах.

В настоящее время развитие генетических инструментов для изучения метилотрофов включает в себя создание плазмидных векторов для клонирования и экспрессии генов, а также совершенствование методов транспозонного мутагенеза {Marx С., and Lidstrom М., 2004; Koch В. et al., 2001). Поскольку из-за существующих законодательных ограничений использование плазмид нежелательно при создании промышленных продуцентов биологически активных веществ, то приоритетное значение имеет дальнейшее развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов. Нам представлялось, что и система транспозиции хорошо известного фага Mu (Symonds N. et al., 1987) также могла быть успешно адаптирована для интеграции фрагментов ДНК в геном М. methylotrophus.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Таким образом, целью настоящей диссертационной работы была разработка новых генно-инженерных подходов для направленной модификации бактериального генома М. methylotrophus при создании бесплазмидных рекомбинантных штаммов-продуцентов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи: 1. исследовать возможность адаптации системы транспозиции бактериофага Ми для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. methylotrophus AS1, в том числе:

• сконструировать интегративные плазмиды с FLP-Fi?Г-вырезаемым селективным маркером устойчивости к канамицину, способные к мобилизационному переносу из клеток Е. coli в клетки М. methylotrophus AS 1;

• исследовать возможность интеграции и амплификации mini-Mu транспозона в хромосоме М. methylotrophus AS 1;

• изучить влияние энхансерной последовательности (IAS) бактериофага Ми на амплификацию mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus AS 1;

2. создать коллекцию ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот у М methylotrophus AS1, для чего:

• сконструировать специальный штамм М. methylotrophus AS1 ::агоРЕсо с повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны к ароматическим веществам;

• клонировать гены ароматического пути биосинтеза М. methylotrophus AS 1;

• инактивать гены ароматического пути биосинтеза в хромосоме М. methylotrophus AS \waroPEc0

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Двух плазмидная система транспозиции бактериофага Ми успешно адаптирована для целей интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. methylotrophus AS 1.

Показано, что наличие энхансерной последовательности фага (IAS) в составе mini-Mu транспозона существенно увеличивает эффективность транспозиции в хромосоме М. methylotrophus AS1. Данная система представляет собой удобный генетический инструмент, прикладным значением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ.

Сконструирован штамм М. methylotrophus AS1 ::агоРЕсо с геном транспортера агоРЕсо, интегрированным в хромосому, и обладающий повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны к ароматическим веществам. На основе этого штамма создана коллекция ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Токмакова, Ирина Львовна

выводы

1. Система транспозиции бактериофага Ми адаптирована для интеграции рекомбинантной ДНК в геном М. methylotrophus AS1. Эта система включает две плазмиды: первая, хелперная, с репликоном широкого круга хозяев и термоиндуцибельными генами Mu-v4 и Mu-Б; вторая, интегративная, с mini-Mu транспозоном, содержащим L- и R-концевые участки ДНК Ми. Для селекции интегрантов использовали ген устойчивости к канамицину (KmR), фланкированный сайтами FRT, а для последующего удаления маркера — FLP-рекомбиназу S. cerevisiae.

2. Показана высокая эффективность транспозиции с использованием данной системы на этапе первичной интеграции mini-Mu в хромосому М. methylotrophus, осуществляющейся, в основном, по механизму репликативной транспозиции через образование коинтегратов, с их последующим разрешением. Возможность последовательной интеграции нескольких различных фрагментов ДНК продемонстрирована с использованием генов а-амилазы В. amyloliquefaciens и катехол-2,3-диоксигеназы P. putida.

3. Введение в состав интегрируемого mini-Mu транспозона энхансерного элемента (Е) обеспечивало возможность высокоэффективной (с частотой 2x10" ) амплификации mini-Mu в бактериальной хромосоме в присутствии факторов транспозиции.

4. Для клеток М. methylotrophus разработан метод получения ауксотрофных мутантов по биосинтезу ароматических соединений. Он основан на (а) использовании специально сконструированного реципиентного штамма с геном транспортера агоРЕсо; (б) получении линейных фрагментов ДНК, содержащих целевые гены, инактивированные вырезаемым маркером KmR; (в) обмене in vivo маркером между линейным фрагментом ДНК и бактериальной хромосомой в ходе общей рекомбинации и (г) использовании системы FLP-i^r-рекомбинации для удаления маркера.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Токмакова, Ирина Львовна, Москва

1. Abalakina Е. G., Tokmakova I. L., Gorshkova N. V., Gak Е. R.,

2. Akhverdyan V. Z., Mashko S. V., Yomantas Y. A. V. (2008) Phage Mu-driven two-plasmid system for integration of recombinant DNA in the Methylophilus methylotrphus genome. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:1912008.

3. Adzuma K., Mizuuchi K. (1988) Target immunity of Mu transposition reflectsa differential distribution of Mu В protein. Cell. 53:257-266.

4. Adzuma K., Mizuuchi K. (1989) Interaction of proteins located at a distancealong DNA: mechanism of target immunity in the Mu DNA strand-transfer reaction. Cell. 57:41-47.

5. Akroyd J. E., Symonds N. (1983) Evidence for a conservative pathway oftransposition of bacteriophage Mu. Nature. 303:84-86.

6. Aldaz H., Schuster E., Baker, T. A. (1996) The interwoven architecture of the

7. Mu transposase couples DNA synapsis to catalysis. Cell. 85:257-269.

8. Aldridge S. (2006) Downstream processing needs a boost. Biomanufacturingtrends and opportunities are meeting highlights. Gen. Eng. Biotech. News. 26: January 1st.

9. Amaratunga K., P. Goodwin M., O'Connor C. D., and Anthony C. (1997)

10. The methanol oxidation genes mxaFJGIR{S)ACKLD in Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiol. Lett. 146:31-38.

11. Anderson J. J., Oxender D. L. (1978) Genetic separation of high- and lowaffinity transport systems for branched-chain amino acids in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 136:168-174.

12. Anderson D. J., Morris C. J., Nunn D. N., Anthony C., and Lidstrom M. E.1990) Nucleotide sequence of the Methylobacterium extorquens AMI moxF and moxJ genes involved in methanol oxidation. Gene. 90:173-176.

13. Anthony C. (1982) The commercial exploitation of methylotrophs. pp. 328348. In The Biochemistry of Methylotrophs, Academic. Press, London.

14. Anthony C. (1993) Methanol dehydrogenase in Gram-negative bacteria. In: Davison V(ed.) Principles and applications of quinoproteins. Dekker, New York, pp. 17-45.

15. Anthony C. and Ghosh M. (1998) The structure and function of the PQQ-containing quinoprotein dehydrogenases. Prog. Biophys. Mol. Biol. 69:1-21.

16. Arps P. J., Fulton G. F., Minnich E. C., and Lidstrom M. E. (1993) Genetics of serine pathway enzymes in Methylobacterium extorquens AMI: phosphoenolpyruvate carboxylase and malyl coenzyme A lyase. J. Bacteriol. 175:3776-3783.

17. Au Т. K., Agrawal P., Harshey R. M. (2006). Chromosomal integration mechanism of infecting mu virion DNA. J Bacteriol. 188:1829-34.

18. Baba Т., Ara Т., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Baba M., Datsenko

19. K., Tomita M., Wanner B. L., Mori H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molec. Sys. Biol. 2:2006.0008.

20. Baker T. A., Mizuuchi M., Mizuuchi К (1991) MuB protein allosterically activates strand transfer by the transposase of phage Mu. Cell 65:1003-13.

21. Baker T.A., Mizuuchi K. (1992) DNApromoted assembly of the active tetramer of the Mu transposase. Genes Dev. 6:2221-2232.

22. Baker T. A., Luo L. (1994). Identifi cation of residues in the Mu transposaseessential for catalysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:6654-58.

23. Beardsmore A. J. Aperghis P. N. G. and Quayle J. R. (1982) Characterization of the assimilatory and dissimilatory pathways of carbon metabolism during growth of Methylophilus methylotrophus on methanol. J. Gen. Microbiol. 128:1423-1439.

24. Belanger L., Figueira M. M., Bourque D., Morel L., Beland M., Laramee1., Groleau D., Miguez С. B. (2004) Production of heterologous protein by Methylobacterium extorquens in high cell density fermentation. FEMS Microbiol. Lett. 231:197-204.

25. Bhagwat A. Person S. (1981) Structure and properties of the region of homology between plasmids pMBl and ColEl. Mol. Gen. Genet. 182: 505507.

26. Bohanon M., Bastien C., Yoshida R., Hanson R. (1988) Isolation of auxotrophic mutants of Methylophilus methylotrophus by modified-marker exchange. Appl. Environ. Microbiol. 54:271-273.

27. Bongaerts J., Kramer M., Muller U., Raeven L., Wubbolts M. (2001) Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metabol. Engineer. 3:289-300.

28. Bormann E. J., Leissner M., Beer B. (1997) Growth and formation of polyhydroxybutyric acid) by Methylobacterium rhodesianum at methanol concentrations of above 25 g/I. Acta. Biotechnol. 17:279-289.

29. Bosch G. et al. (2008) Comprehensive proteomics of Methylobacterium extorquens AMI metabolism under single carbon and nonmethylotrophic conditions. Proteomics. 8:3494-3505.

30. Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D. (1995) High cell density productionof poly-beta-hydrobutyrate (PHB) from methanol by Methylbacterium extorquens: production of high-molecular-mass PHB. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:367-376.

31. Bukhari A. I., Froshauer S., Botchan M. (1976). Ends of bacteriophage Mu1. DNA. Nature. 264:580-583.

32. Bukhari A. I. and Taylor A. L. (1975) Influence of incertions on packagingof host sequences covalently linked to bacteriophage Mu DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:4399-4403.

33. Byrom D. and Carver M. (1991) ICI Pic, Great Britain. Process for the production of acylamide amidohydrolase by Methylophilus methylotrophus. US patent 5077212

34. Burton В. M., Baker T. A. (2003) Mutranspososome architecture ensures thatunfolding by ClpX or proteolysis by ClpXP remodels but does not destroy the complex. Chem. Biol. 10:463-472.

35. Burton В. M., Williams T. L., Baker T. A. (2001) ClpX-mediated remodeling of Mu transpososomes: selective unfolding of subunits destabilizes the entire complex. Mo I Cell. 8:449-454.

36. Casadaban M. (1975) Fusion of the Escherichia coli lac genes to the ara promoter: a general technique using bacteriophage Mu-1 insertions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:809-813.

37. Casadaban M., and Cohen S. N. (1979) Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-/ac bacteriophage: in vivo probe for transcriptional control sequences. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 76:4530-4533.

38. Casadaban M., and Chou J. (1984) In Oivo formation of hybrid P-galactosidase gene fusions in one step with a new transposable Mu-lac transducing phage. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81:535-539.

39. Castilho B. A., Olfson P., and Casadaban M. J. (1984) Plasmid insertion mutagenesis and lac gene fusion with mini-Mu bacteriophage transposons. J. Bacteriol. 158:488-495.

40. Castilho B. A., Casadaban M. J. (1991) Specifity of mini-Mu bacteriophage insertions in a small plasmid. J. Bacteriology. 173:1339-1343.

41. Chaconas G., Harshey R. M., Sarvetnick N., Bukhari A. I. (1981). Predominant end-products of prophage Mu DNA transposition during the lytic cycle are replicon fusions. J. Mo I Biol 150:341-59.

42. Chaconas G., Kennedy D. L., Evans D. (1983) Predominant integration end products of infecting bacteriophage Mu DNA are simple insertions with no preference for integration of either Mu DNA strand. Virology. 128:48-59.

43. Chaconas G., Lavoie B. D., Watson M. A. (1996). DNA transposition: Jumping gene machine, some assembly required. Current Biology 6:817-20.

44. Chaconas G., Harshey R. M. (2002). Transposition of phage Mu DNA. In Craig N. L., Craigie R., Gellert M., Lambowitz A. M. (eds.), Mobile DNA II. American Society for Microbiology, Washington DC, pp. 384-402.

45. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W., Prasher D. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263:802-5.

46. Chistoserdova L. V., and Lidstrom M. E. (1992) Cloning, mutagenesis, and physiological effect of a hydroxypyruvate reductase gene from Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. 174:71-77.

47. Chistoserdova L. V., and Lidstrom M. E. (1994a) Genetics of the serine cycle in Methylobacterium extorquens AMI: identification of sgaA and mtdA and sequences of sgaA, hprA, and mtdA. J. Bacteriol. 176:1957-1968.

48. Chistoserdova L. V., and Lidstrom M. E. (1994b) Genetics of the serine cycle in Methylobacterium extorquens AMI: identification, sequence, and mutation of three new genes involved in CI assimilation, orf4, mtkA, and mtkB. J. Bacteriol. 176:7398-7404.

49. Chistoserdova L. V., and Lidstrom M. E. (1994c) Genetics of the serine cycle in Methylobacterium extorquens AMI: cloning, sequence, mutation, and physiological effect of glyA, the gene for serine hydroxymethyltransferase. J. Bacteriol 176:6759-6763.

50. Chistoserdova L. V., and Lidstrom M. E. (1997a) Molecular and mutationalanalysis of a DNA region separating two methylotrophy gene clusters in Methylobacterium extorquens AMI. Microbiology. 143:1729-1736.

51. Chistoserdova L. V., and Lidstrom M. E. (1997b) Identification and mutation of a gene required for glycerate kinase activity from a facultative methylotroph, Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol 179:49464948.

52. Chistoserdova L. Vorholt J., Thauer R., Lidstrom M. E. (1998) CI transferenzymes and coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic Archaea. Science. 281:99-102.

53. Chistoserdova L., Gomelsky L., Vorholt J., Gomelsky M., Tsygankov Y. and Lidstrom M. E. (2000) Analysis of two formaldehyde oxidation pathways in Methylobacillus flagellatus KT, a ribulose monophosphate cycle methylotroph. Microbiology. 146:233-238.

54. Chistoserdova L., Chen S. W., Lapidus A., Lidstrom M. E. (2003) Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AMI from a genomic point of view. J. Bacteriol 185:2980-2987.

55. Chistoserdova L., Vorholt J. A., Thauer R. K., and Lidstrom M. E. (2004) The enigmatic planctomycetes may hold a key to the origins of methanogenesis and methylotrophy. Mol. Biol Evol. 21:1234-1241.

56. Chistorerdov A Y, Tsygankov Y D (1986) Broad host range vectors derivedfrom an RSF1010::Tnl plasmid. Plasmid. 16: 161-167.

57. Chistoserdov A. Y., Chistoserdova L. V., Mclntire W. S., and Lidstrom M.

58. E. (1994) Genetic organization of the таи cluster in Methylobacteriumextorquens AMI: complete nucleotide sequence and generation and characteristics of таи mutants. J. Bacteriol. 176:4052-4065.

59. Choi J. H. et al. (1989) Optimization of growth medium in polyhydroxybutyric acid fermentation from methanol. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:392-396.

60. Choi Y. J. Miguez C. and Lee B. (2004) Characterization and heterologous gene expression of a novel esterase from Lactobacillus casei CL96. Appl. Environ. Microbiol. 70:3213-3221.

61. Choi Y. J., Bourque D., Morel L., Groleau D., Miguez С. B. (2006a) Multicopy integration and expression of heterologous genes in Methylobacterium extorquens ATCC 55366. Appl. and Environ. Microbiol. 72:753-759.

62. Choi Y. J., Morel L., Bourque D., Mullick A., Massie В.,2 and Miguez C.

63. B. (2006b) Bestowing Inducibility on the Cloned Methanol Dehydrogenase Promoter (P^f) of Methylobacterium extorquens by Applying Regulatory Elements ofPseudomonasputida YX.Appl. Env. Microbiol. 72:7723-7729.

64. Choi К. H., Gaynor J. В., White K. G., Lopez C., Bosio С. M., Karkhoff

65. Schweizer R. R., and Schweizer H. P. (2005) A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat. Methods. 2:443-448.

66. Clubb R. Т., Omichinsk J. G., Savilahti H., Mizuuchi K., Gronenborn A. M., Clore G. M. (1994). A novel class of winged helix-turnhelix protein: the DNA-binding domain of Mu transposase. Structure. 2:1041-1048.

67. Clubb R. Т., Schumacher S., Mizuuchi K., Gronenborn A. M., Clore G. M.1997). Solution structure of the I gamma subdomain of the Mu end DNA-binding domain of phage Mu transposase. J. Mol. Biol. 273:19-25.

68. Cohen S. and Chang A. (1977) Revised interpretation of the origin of the pSClOl plasmid. J. Bacteriology. 132:734-737.

69. Coros C. J., Chaconas G. (2001). Effect of mutations in the Mu-host junctionregion on transpososome assembly. J. Mol. Biol. 310:299-309.

70. Cosgriff A. J., Brasier G., Pi J., Dogovski C., Sarsero J. P., Pittard A.J. (2000) A study of AroP-PheP chimeric proteins and identification of a residue involved in tryptophan transport. J. Bacteriol. 182:2207-2217.

71. Cosgriff A. J., Pittard A. J. (1997) A topological model for the general aromatic amino acid permease, AroP, of Escherichia coli. J. Bacteriol. 179:3317-3323.

72. Court D. L., Sawitzke J. A., Thomason L. C. (2002) Genetic engineering using homologous recombination. Annu. Rev. Genet. 36:361-388.

73. Cox J. М., Day D. J., Anthony C. (1992) The interaction of methanol degydrogenase and its electron acceptor, cytochrome cL in methylotrophic bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1119:97-106.

74. Craig N. (1989) Transposon Tn7, p. 211-225. In D. E. Berg and M. M. Howeed.), Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, DC.

75. Craigie R., Mizuuchi K. (1985) Mechanism of transposition of bacteriophage Mu: structure of a transposition intermediate. Cell. 41:867-876.

76. Craigie R., Arndt-Jovin D. J., Mizuuchi K. (1985). A defined system for the

77. DNA strand-transfer reaction at the initiation of bacteriophage Mu transposition: protein and DNA substrate requirements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7570-7574.

78. Craigie R., Mizuuchi K. (1986). Role of DNA topology in Mu transposition: mechanism of sensing the relative orientation of two DNA segments. Cell. 45:793-800.

79. Craigie R., Mizuuchi K. (1987) Transposition of Mu DNA: joining of Mu to target DNA can be uncoupled from cleavage at the ends of Mu. Cell. 51:493501.

80. Crowther G. J., Kosaly G., Lidstrom M. E. (2008) Formate as the main branch point for methylotrophic metabolism in Methylobacterium extorquens AMI./. Bacteriol. 190:5057-5062.

81. Cue D., Lam H., Dillingham R. L., Hanson R. S., Flickinger M. C. (1997) Genetic manipulation of Bacillus methanolicus, a gram-positive, thermotolerant methylotroph. Appl. Environ. Microbiol. 63:1406-1420.

82. Datsenko K. A., Wanner B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:6640-6645.

83. Ditta G., Schmidhauser Т., Yakobson E., Lu P., Liang X. W., Finlay D. R.,

84. Guiney D., Helinski D. R. (1985) Plasmid related to the broad host range vector, pRK290, useful for gene cloning and for monitoring gene expression. Plasmid. 13: 149-153.

85. Eaton R. W. (1996) p-Cumate catabolic pathway in Pseudomonas putida Fl:cloning and characterization of DNA carrying the cmt operon. J. Bacteriol. 178:1351-1362

86. Eaton R. W. (1997) /ьСутепе catabolic pathway in Pseudomonas putida Fl:cloning and characterization of DNA encoding conversion of /?-cymene to p-cumate. J. Bacteriol. 179:3171-3180.

87. Erb T. J., Berg I., Brecht V., Miiller M., Fuchs G. and Alber B. (2007) Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoAcarboxylase/reductase: the ethylmalonyl-CoA pathway. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 104: 10631-10636.

88. Faust U. et al. (1977) Continuous biomass production from methanol by Methylomanas clara. J. Ferment. Technol. 55:609-614.

89. Figueira M. M. et al. (2003) National Research Council, Canada. Methylotrophic bacterium for the production of recombinant proteins and other products, US patent 20030104527.

90. Fitzgerald K. A., Lindstrom M. E. (2003) Overexpression of a heterologous protein, haloalkane dehalogenase, in a poly-p-hydroxybutyrate-deficient strain of the facultative methylotroph Methylobacterium extorquens AMI. Biotechnol. Bioeng. 81:263-268.

91. Fiirste J., Pansegrau W., Ziegelin G. Kroger M., Lanka A. (1989) Conjugative transfer of promiscuous IncP plasmids: Interaction of plasmid-encoded products with the transfer origin. Biochemistry. 85:1771-1775.

92. Gay P., Le Coq D., Steinmetz M., Ferrari E., Hoch J. A. (1983) Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucurase of Bacillus subtilis: expression of the gene in Escherichia coli. J. Bacteriol. 153:14241431.

93. Giovannoni S. J., Hayakawa D. H., Tripp H. J., Stingl U., Givan S. A., etal. (2008) The small genome of an abundant coastal ocean methylotroph. Environ. Microbiol. 10:1771 -1782.

94. Gliesche C. G. (1997) Transformation of methylotrophic bacteria by electroporation. Can. J. Microbiol. 43:197-201.

95. Goldhaber-Gordon I., Early M. H., Baker T. A. (2003) The terminal nucleotide of the Mu genome controls catalysis of DNA strand transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:7509-7514.

96. Groisman E. A., Castilho B. A., and Casadaban M. C. (1984) In vivo DNAcloning and adjacent gene fusing with a mini-Mu-lac bacteriophage containing a plasmid replicon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:1480-1483.

97. Groisman E. A., Casadaban M. J. (1986) Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. J. Bacteriol. 168:357-364.

98. Groisman E. A., Casadaban M. J. (1987) Cloning of genes from members ofthe family Enterobacteriaceae with mini-Mu bacteriophage containing plasmid replicons. J. Bacteriol. 169:687-693.

99. Gueguen E., Rousseau P., Duval-Valentin G., Chandler M. (2005) The transpososome: control of transposition at the level of catalysis. TRENDS Microbiol. 13:543-549.

100. Guerry P., van Embden J., Falkow S. (1974) Molecular nature of two nonconjugative plasmids carrying drug resistance genes. J. Bacteriol. 117:619-630.

101. Gulevich A. Y., Biryukova I. V., Zimenkov D. V., Skorokhodova A. Y., Kivero A. D., Belareva A. V., Mashko S. V. (2006) Method for producing an L-amino acid using a bacterium having enhanced expression of the pckA gene. United States Patent 20060035348

102. Gunji Y., Tsujimoto N., Shimaoka M., Ogawa-Miyata Y., Sugimoto S., Yasueda H (2004) Characterization of the L-lysine biosynthetic pathway in an obligate methylotroph, Methylophilus methylotrophus. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68:1449-1460.

103. Gunji Y., Yasueda H. (2006) Enhancement of L-lysine production in methylotroph Methylophilus methylotrophus by introducing a mutant LysE exporter. J. Biotechnol. 127:1-13.

104. Guo X. and Lidstrom M. E. (2008) Metabolite profiling analysis of Methylobacterium extorquens AMI by comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry. Biotechnol. Bioeng. 99:929-940.

105. Haapa S., Taira S., Heikkinen E., Savilahti H. (1999) An efficient and accurate integration of mini-Mu transposons in vitro: a general methodology for functional genetic analysis and molecular biology applications. Nucl. Acids. Res. 27:2777-2784.

106. Haber C. L., Allen L. N., Zhao S., Hanson R. S. (1983) Methylotrophic bacteria: biochemical diversity and genetics. Science. 221:1147-1153.

107. Haldimann A., Wanner B. L. (2001) Conditional-replication, integration, excision, and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria. J. Bacteriol. 183:6384-6393.

108. Harshey R. M., Bukhari A. I. (1983) Infecting bacteriophage Mu DNA forms a circular DNA protein complex. J. Mol. Biol. 167:427-41.

109. Harshey R. M. (1984). Transposition without duplication of infecting bacteriophage Mu DNA. Nature (London). 311:580-81.

110. Harshey R. M. (1987) Integration of Infecting Mu DNA// Phage Mu/ Eds Symonds M., Toussaint A., Van de Putte P., Howe M. M. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., pp 111-135.

111. Herring C. D. Glasner J. D., Blattner F. R. (2003) Gene replacement without selection: regulated suppression of amber mutations in Escheria coli. Gene. 311:151-163.

112. Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., PuIIen J. K., Pease L. R. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 15:51-59.

113. Holloway B. W., Kearny P. P., Lyon B. R. (1987) The molecular genetics of Ci utilizing microorganisms. Antonie van Leeuwenhoek. 53:47-53.

114. Hothi P., Basran J., Sutcliffe M. J., and Scrutton N. S. (2003) Effects of multiple ligand binding on kinetic isotope effects in PQQ-dependent methanoldehydrogenase. Biochemistry. 42:3966-3978.

115. Howe M. M. (1973) Prophage deletion mapping of bacteriophage Mu-1. Virology. 54:93-101.

116. Howe M. M., Bade E. G. (1975). Molecular biology of bacteriophage Mu. Science. 190:624-32.

117. Inouye S., Nakazawa A., Nakazawa T. (1981) Molecular cloning of TOL genes xylB and xylE in Escherichia coli. J. Bacteriol. 145: 1137-1143.

118. Ikeda M., Katsumata R. (1994) Transport of aromatic amino acids and its influence on overproduction of the amino acids in Cotynebacterium glutamicum. J. Ferment. Bioeng. 78:420-425.

119. Ikeda M. (2006) Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and other aromatics by metabolic engineering. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69:615-626.

120. Ishikawa K., Asahara Т., Gunji Y., Yasueda H., Asano K. (2008a) Disruption of metF increased L-lysine production by Methylophilus methylotrophus from methanol. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72:1317-1324.

121. Ishikawa K., Gunji Y., Yasueda H., Asano K. (2008b) Improvement of L-Lysine production by Methylophilus methylotrophus from methanol via the Entner-Doudoroff pathway, originating in Escherichia coli. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72:2535-2542.

122. Ishikawa K., Toda-Murakoshi Y., Ohnishi F., Kondo K., Osumi Т., Asano K. (2008c) Medium composition suitable for L-lysine production by Methylophilus methylotrophus in fed-batch cultivation. J. Biosci. Bioeng. 106:574-579.

123. Izumi Y., Yoshida Т., Miyazaki S., Mitsunaga Т., Ohshiro Т., Shimao M., Miyata A. and Tanabe T. (1993) L-Serine production by a methylotroph and its related enzymes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:427-432.

124. Kalyuzhnaya M. G. and Lidstrom M. E. (2005) QscR-mediated transcriptional activation of serine cycle genes in Methylobacterium extorquens AMI. J. Bacteriol. 187:7511-7517.

125. Katashkina J. I., Hara Y., Golubeva L. I., Andreeva I. G., Kuvaeva T. M., Mashko S. V. (2009) Use of the A, Red-recombineering method for genetic engineering of Pantoea ananatis. BMCMol. Biol. 10:34.

126. Keasling J. D., Palsson В. O., and Cooper S. (1992) Replication of the R6K plasmid during the Escherichia coli cell cycle. J. Bacteriol. 174:1060-1062.

127. Kiefer P. Portais J. C., Vorholt J. A. (2008) Quantitative metabolome analysis using liquid chromatography high resolution mass spectrometry. Anal. Biochem. 382:94-100.

128. Kilbane J. J. 2nd, Bielaga B. A. (1991) Instantaneous gene transfer from donor to recipient microorganism via electroporation. Biotechniques. 10:354365.

129. Kim K., Namgoong S. Y., Jayaram M., Harshey R. M. (1995) Step-arrest mutants of phage Mu transposase. Implications in DNA-protein assembly, Mu end cleavage, and strand transfer. J. Biol. Chem. 270:1472-1479.

130. Kim S. W., Kim P., Lee H. S. and Kim J. H.(1996) High production of PHB from Methylobacterium organophilum under potassium limitation. Biotechnol. Lett. 18:25-30.

131. Kim C. S., Wood Т. K. (1997) Creating auxotrophic mutants in Methylophilus methylotrophus AS1 by combining electroporation and chemical mutagenesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:105-108.

132. Kim P. et al. (2003) Improvement in cell yield of Methylobacterium sp. by reducing the inhibition of medium components for poly-bhydroxybutyrate production. World J. Microbiol. Biotechnol. 19:357-361.

133. Knauf V. C. and Nester E. W. (1982) Wide host range cloning vectors: cosmide clone bank of Agrobacterium Ti plasmids. Plasmid. 8:45-54.

134. Koch В., Jensen L. E., Nybroe O. (2001) A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. J. Microbiol. Methods. 45:187-195.

135. Kojima H., Ogawa M., Kawamura K., Sano K. (1996) Process for producing L-lysine by fermentation. International Patent Cooperation Treaty Patent WO 9516042.

136. Korotkova N., Chistoserdova L., Lidstrom M. E. (2002) Poly-beta-hydroxybutyrate biosynthesis in the facultative methylotroph Methylobacterium extorquens AMI: identification and mutation of gapll, gap20, and phaR. J. Bacteriol. 184:6174-6181.

137. Kramer R. (1994) Systems and mechanisms of amino acid uptake and excretion in prokaryotes. Arch. Microbiol. 162:1-13.

138. Kruklitis R., Nakai H. (1994) Participation of the bacteriophage Mu A protein and host factors in the initiation of Mu DNA synthesis in vitro. J Biol Chem 269:16469-16477.

139. Kruklitis R., Welty D. J., Nakai H. (1996) ClpX protein of Escherichia coli activates bacteriophage Mu transposase in the strand transfer complex for initiation of Mu DNA synthesis. EMBO J. 15:935-944.

140. Kuo C-F., Zou A., Jayaram M., Getzoff E., Harshey R. (1991) DNA-protein complexes during attachment-site synapsis in Mu DNA transposition. EMBOJ. 10:1585-1591.

141. Lamberg A., Nieminen S., Qiao M., and Savilahti H. (2001) Efficient Insertion Mutagenesis Strategy for Bacterial Genomes Involving Electroporation of In Vitro-Assembled DNA Transposition Complexes of Bacteriophage Mu. Appl. Env. Microbiol. 68:705-712.

142. Lambertsen L., Sternberg C., and Molin S. (2004) Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6:726-732.

143. Large P. J., Peel D., Quayle J. R. (1961) Microbial growth on CI compounds. II. Synthesis of cell constituents by methanol- and formate-grown Pseudomonas AMI, and methanol-grown Hyphomicrobium vulgare. Biochem. J. 81:470-480.

144. Laukel M., Rossignol M., Borderies G., Volker U., and Vorholt J. A. (2004) Comparison of the proteome of Methylobacterium extorquens AMI grown under methylotrophic and nonmethylotrophic conditions. Proteomics. 4:1247-1264.

145. Lavoie B. D. and Chaconas G. (1990) Immunoelectroni microscopic analysis of the A, B, and HU protein content of bacteriophage Mu transpososomes. J. Biol. Chem. 265:1623-1627.

146. Lavoie B. D., Chan B. S., Allison R. G., Chaconas G. (1991). Structural aspects of a higher order nucleoprotein complex: induction of an altered DNA structure at the Mu-host junction of the Mu type 1 transpososome. EMBO J. 10:3051-3059.

147. Lawes M., Maloy S. (1995) Мш/Sacl, a transposon with strong selectable and counterselectable markers: use for rapid mapping of chromosomal mutations in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 177:1383-1387.

148. Leak D. J. (1999) Methylotrophs, industrial applications. In Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation (Flickinger, M.C. and Drew, S.W., eds), pp.1742-1753, John Wiley & Sons.

149. Lee I., Harshey R. M. (2001) Importance of the conserved CA dinucleotide at Mu termini. J. Mol Biol. 314:433-44.

150. Lee I., Harshey R. M. (2003) The conserved CA/TG motif at Mu termini: T specifi es stable transpososome assembly. J. Mol. Biol. 330:261-275.

151. Leung P. C., Teplow D. В., Harshey R. M. (1989). Interaction of distinct domains in Mu transposase with Mu DNA ends and an internal transpositional enhancer. Nature. 338:656-8.

152. Leung P. C., Harshey R. M. (1991) Two mutations of phage Mu transposase that affect strand transfer or interactions with В protein lie in distinct polypeptide domains. J. Mol. Biol. 219:189-99.

153. Levchenko I., Yamauchi M., Baker T. A. (1997) ClpX and MuB interact with overlapping regions of Mu transposase: implications for control of the transposition pathway. Genes. Dev. 11:1561-72.

154. Lidstrom M. E., Chistoserdova L., Stoliar S., and Springer A. L. (1998) Genetics and regulation of CI metabolism in methylotrophs, pp. 121-134. In E. Vijgenboom and G. Canters (ed.), NATO Symposium on Electron Transfer Chains.

155. Lidstrom M. E. (2006) Aerobic methylotrophic prokaryotes. In Prokariotes — V.2 Ecophysiology and biochemistry. 618-634.

156. Lidstrom M. E. and Chistoserdova L. (2002) Plants in the pink: cytokinin production by methylobacterium. J. Bacteriol. 184:1818

157. MacLennan D. G. et al. (1973) The ICI methanol-bacterium process for the production of single-cell protein. Proc. Roy. Aust. Chem. Inst. 40:54-61.

158. Mantsala P., Zalkin H. (1979) Membrane-bound and soluble extracellular a-amylase from Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 254:8540-8547.

159. Mariconda S., Namgoong S. Y., Yoon К. H., Jiang H., Harshey R. M. (2000) Domain III function of Mu transposase analysed by directed placement of subunits within the transpososome. J. Biosci. 25:347-360.

160. Marx C. J., Lindstrom M. E. (2004) Development of an insertional expression vector system for Methylobacterium extorquens AMI and generation of null mutants lacking mtdA and/or fch. Microbiology. 150:9-19.

161. Marx C. J., Lindstrom M. E. (2001) Development of improved versatile broad host-range vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria. Microbiology. 147:2065-2075.

162. Marx C. J., Lidstrom M. E. (2002) Broad-host-range Cre-lox system for antibiotic marker recycling in gram-negative bacteria. Biotechniques. 33:1062-1067.

163. Marx C. J. (2008) Development of a brod-host-range sacB-based vector for unmarked allelic exchange. BMC Research Notes 1:1.

164. Maxwell A., Craigie R., Mizuuchi K. (1987) В protein of bacteriophage Muis an ATPase that preferentially stimulates intermolecular DNA strand transfer.

165. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:699-703.

166. Mhammedi-Alaoui A., Pato M., Gama M. J., Toussaint A. (1994) A new component of bacteriophage Mu replicative transposition machinery: the Escherichia coli ClpX protein. Mol. Microbiol. 11:1109-1116.

167. Miller J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

168. Minagawa S. et al. (1997) Mitsubishi Gas Chemical Co., Japan. Process for production of bacterial cells containing poly-3-hydroxy butyric acid, US patent 5667996.

169. Mizuuchi K. (1983) In vitro transposition of bacteriophage Mu: a biochemical approach to a novel replication reaction. Cell. 35:785-794.

170. Mizuuchi K. (1992) Transpositional recombination: Mechanistic insights from studies of Mu and other elements. Annu. Rev. Biochem. 61:1011-1051.

171. Mizuuchi K., Adzuma K. (1991) Inversion of the phosphate chirality at the target site of Mu DNA strand transfer: evidence for a one-step transesterifi cation mechanism. Cell. 66:129-140.

172. Mizuuchi M., Mizuuchi К. (1989) Efficient Mu transposition requires interaction of transposase with a DNA sequence at the Mu operator: implications for regulation. Cell. 58:399-408.

173. Mizuuchi M., Mizuuchi K. (1993) Target site selection in transposition of phage Mu. Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 58:515-23.

174. Mizuuchi M., Baker T. A., Mizuuchi K. (1991) DNase protection analysis of the stable synaptic complexes involved in Mu transposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9031-9035.

175. Mizuuchi M., Baker T. A., Mizuuchi K. (1992) Assembly of the active form of the transposase- Mu DNA complex: a critical control point in Mu transposition. Cell. 70:303-311.

176. Mogren H. (1979) SCP from methanol the norprotein process. Process Biochem. 14: 2-7.

177. Moore A.T., Nayudu M., Holloway B. W. (1983) Genetic mapping in Methylophilus methylotrophus AS 1. J. Gen. Microbiol. 129:785-799.

178. Motoyama H., Yano H., Terasaki Y., Anazawa H. (2001) Overproduction of L-lysine from methanol by Methylobacillus glycogens derivatives carrying a plasmid with a mutated dapA gene. Appl. Environ. Microbiol. 67:30643070.

179. Naigamwalla D. Z., Chaconas G. (1997). A new set of Mu DNAtransposition intermediates: alternate pathways of target capture preceding strand transfer. EMBOJ. 16:5227-5234.

180. Nakai H., Doseeva V., Jones J. M. (2001) Handoff from recombinase to replisome: insights from transposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:82478254

181. Namgoong S. Y., Harshey R. M. (1998) The same two monomers within a MuA tetramer provide the DDE domains for the strand cleavage and strand transfer steps of transposition. EMBOJ. 17:3775-3785.

182. Nunn D. N. and Lidstrom M. E. (1986a) Isolation and complementation analysis of 10 methanol oxidation mutant classes and identification of the methanol dehydrogenase structural gene of Methylobacterium sp. strain AMI. J. Bacteriol. 166:581-590.

183. Nunn D. N., and Lidstrom M. E. (1986b) Phenotypic characterization of 10 methanol oxidation mutant classes in Methylobacterium sp. strain AMI. J. Bacteriol. 166:591-597.

184. Nunn D. N. Bergman S. and Lory S. (1990) Products of three accessory genes, pilB, pilC, pilD, are required for biogenis of Pseudomonas aureginosa pili. J. Bacteriol. 172: 2911-2919.

185. Olah G. A. (2005) Beyond oil and gas: the methanol economy. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44:2636-2639.

186. Omer Z. S. TomboliniR., BrobergA. and GerhardsonB. (2004) Indole-3-acetic acid production by pinkpigmented facultative methylotrophic bacteria. Plant. Growth. Regul. 43:93-96.

187. Palazzolo A., Suquet C., Konkel M., Hurst J. (2005) Green Fluorescent Protein-Expressing Escherichia coli as a Selective Probe for HOC1 Generation within Neutrophils Biochemistry. 44:6910-6919.

188. Pansegrau W., Balzer D., Kruft V., Lurz R., Lanka E. (1990) In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6555-6559.

189. Parekh S., Vinci V. A., Strobel R. J. (2000) Improvement of microbial strains and fermentation processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:287-301.

190. Pato M. L., Banerjee M. (1996) The Mu strong gyrase-binding site promotes efficient synapsis of the prophage termini. Mol. Microbiol. 22:283-292.

191. Pato M. L., Howe M. M., Higgins N. P. (1990) A DNA gyrase-binding site at the center of the bacteriophage Mu genome is required for efficient replicative transposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:8716-20.

192. Phillips G. (2001). Green fluorescent protein a bright idea for the study of bacterial protein localization. FEMSMicrobiol. Lett. 204:9-18.

193. Puta F., Wambutt R. (1992) Construction of a new Escherichia coli-Saccharomyces cerevisiae shuttle plasmid cloning vector allowing positive selection for cloned fragments. Folia. Microbiol. 37:193-198.

194. Roldan L. A., Baker T. A. (2001). Differential role of the Mu В protein in phage Mu integration vs. replication: mechanistic insights into two transposition pathways. Mol. Microbiol. 40:141-155.

195. Rice P., Mizuuchi K. (1995). Structure of the bacteriophage Mu transposase core: A common structural motif for DNA transposition. Cell. 82:209-220.

196. Saade G. (2007) Marketing research methanol. In Chemical Economics Handbook SRI Consulting

197. Sambrook J., Russell D. W. (2001) Molecular Cloning: Laboratory Mannual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York

198. Sawitzke J. A., Thomason L. C., Costantino N., Bubunenko M., Datta S., Court D. L. (2007) Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods Enzymol. 421:171-199.

199. Schendel F. J., Bremmon С. E., Flickinger M. C., Guettler M. and Hanson R. S. (1990) L-Lysine production at 50 degrees С by mutants of a newly isolated and characterized methylotrophic Bacillus sp. Appl. Environ. Microbiol. 56:963-970.

200. Schendel F. J. et al. (1997) University of Minnesota, USA. Production of glutamate using wild type Bacillus methanolicus, US patent 6083728.

201. Schrader J., Schilling M., Holtmann D., Sell D., Filho M. V., Marx A., Vorholt J. A. (2009) Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of methylotrophic bacteria. Trends Biotechnol. 27:107-115.

202. Schweizer H. P. (1993) Two plasmids, XI918 and Z1918, for easy recovery of the xylE and lacZ reporter genes. Gene. 134: 89-91.

203. Senecoff J. F., Bruckner R. С., Cox M. M. (1985) The FLP recombinase of the yeast 2-p.m plasmid: characterization of its recombination site. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7270-7274.

204. Senior P. J., Windass J. (1980) The ICI single cell protein process. Biotech. Lett. 2:205-210.

205. Shay L. K. Hunt H. R., Wegner G. H. (1987) High-productivity fermentation process for cultivating industrial microorganisms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2:79-85.

206. Shapiro J. A. (1979). Molecular model for the transposition and replication of bacteriophage Mu and other transposable elements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:1933-1937.

207. Simon R., Priefer U., Puhler A. (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/Technology. 1:784-791.

208. Sirirote P. Yamane Т., Shimizu S. (1988) L-Serine production from methanol and glycine with an immobilized methylotroph. J. Fermen. Technol. 66:291-297.

209. Smirnova N. A., Sorokin A. V., Iomantas Y. V., Abalakuna E. G., Kozlov

210. Y. I. (1988) Mutations in the alpha-amylase gene of Bacillus amyloliquefaciens, leading to a decrease in the temperature of protein inactivation. Mol. Biol. (Mosk) 22:1257-1264.

211. Sokolsky T. D., Baker T. A. (2003) DNA gyrase requirements distinguish the alternate pathways of Mu transposition. Mol. Microbiol. 47:397-409.

212. Stirling D. I. (1991) Celgene Corp., USA. Novel heteropolysaccharide, US patent 5071976.

213. Surette M. G., Buch S. J., Chaconas G. (1987). Transpososomes: stable protein-DNA complexes involved in the in vitro transposition of bacteriophage Mu DNA. Cell. 49:253-262.

214. Surette M. G., Lavoie B. D., Chaconas G. (1989) Action at a distance in Mu DNA transposition: an enhancer-like element is the site of action ofsupercoiling relief activity by integration host factor (IHF). EMBO J. 8:34833489.

215. Surette M. G., Chaconas G. (1991). Stimulation of the Mu DNA strand cleavage and intramolecular strand transfer reactions by the Mu В protein is independent of stable binding of the Mu В protein to DNA. J. Biol. Chem. 266:17306-17313.

216. Surette M.G., Chaconas G. (1992) The Mu transpositional enhancer can function in trans: requirement of the enhancer for synapsis but not strand cleavage. Cell. 68:1101-1108.

217. Suzuki T. et al. (1986a) Mass production of poly-b-hydroxybutyric acid by fed-batch culture with controlled carbon/nitrogen feeding. Appl. Microbiol. Biotechnol. 24:370-374.

218. Suzuki T. et al. (1986b) Mass production of poly-P-hydroxybutyric acid by fully automatic fed-batch culture of methylotroph. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23:322-329.

219. Swinger К. K. and Rice P. A. (2004) IHF and HU: flexible architects of bent DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 14:28-35.

220. Symonds N., Toussaint A., Putte P., Howe M. (1987) Phage Mu.—New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

221. Tani Y. (1991) Production of useful chemicals by methylotrophs, pp. 253267. In I. Goldberg, and J. S. Rokem (ed.), Biology of Methylotroph, Butterworth-Heinemann, Cambridge, Mass.

222. Tatra P. K., Goodwin P. M. (1985) Mapping of some genes involved in C-l metabolism in the facultative methylotroph Methylobacterium sp. Strain AMI (Pseudomonas AMI). Arch. Microbiol. 143:169-177.

223. Taylor L (1963). Bacteriophage-induced mutation in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 50:1043-51.

224. Tokmakova I. L., Abalakina E. G., Gorshkova N. V., Jomantas Y. V. (2007) Method for inducing L-amino acid auxotrophy to a bacterium belonging to the genus Methylophilus. Patent application RU2007111371 IPC C12N15/63.

225. Tsujimoto N., Gunji Y., Ogawa-Miyata Y., Shimaoka M., Yasueda H.2006) L-lysine biosynthetic pathway of Methylophilus methylotrophus and construction of an L-lysine producer. J. Biotechnol. 124:327-337.

226. Tsygankov Y. D., Kazakova S. M. (1987) Development of gene transfer systems in Methylobaccillus flagellatus KT: isolation of auxotrophic mutants. Arch. Microbiol. 149:112-119.

227. Van Gijsegem F., Toussaint A., Casadaban M. (1987) Mu as genetic tool. Phage Mu. Edited by Symonds N. chapter 14:215-250.

228. Van Ophem P. W. et al. (1993) Nicotinoprotein NAD(P)-containing. alcohol/aldehyde oxidoreductases. Purification and characterization of a novel type from Amy со latopsis methanolica. Eur. J. Biochem. 212:819-826.

229. Vasey R. В., Powell K. A. (1984) Single-cell protein. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2:285-310.

230. Vorholt J. A. (2002) Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotrophic bacteria. Arch. Microbiol. 178:239-249.

231. Wang В., Liu L., Groisman E.A., Casadaban M.J., Berg C.M. (1987) High frequency generalized transduction by miniMu plasmid phage. Genetics. 116:201-206.

232. Wang Z., Harshey R. M. (1994). Crucial role for DNA supercoiling in Mu transposition: a kinetic study. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:699-703.

233. Ward N., Larsen Q., Sakwa J., Bruseth L., Khouri H., et al. 2004. Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath). PloS. Biol. 2:1616-1628.

234. Watson M. A., Chaconas G. (1996) Three-site synapsis during Mu DNA transposition: a critical intermediate preceding engagement of the active site. Cell. 85:435-445.

235. Williams T. L., Jackson E. L., Carritte A., Baker T. A. (1999) Organization and dynamics of the Mu transpososome: recombination by communication between two active sites. Genes Dev. 13:2725-2737.

236. Windass J. D., Worsey M. J., Pioli E. M., Pioli D., Barth P. Т., Atherton К. Т., Dart E.C., Byrom D., Powell K., Senior P. J. (1980) Improved conversion of methanol to single-cell protein by Methylophilus methylotrophus. Nature. 287:396-401.

237. Wu Z., Chaconas G. (1995) A novel DNA binding and nuclease activity in domain III of Mu transposase: evidence for a catalytic region involved in donor cleavage. EMBO J. 14:3835-43.

238. Wyatt K. N. (2002) Watergem Ltd, Great Britain. Catalytic production of methanol from biogas, GB patent 2375353.

239. Xiu Z. L. and Zeng A. P. (2008) Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:917-926.

240. Yanagihara K., Mizuuchi K. (2003). Progressive structural transitions within Mu transpositional complexes. Mol. Cell. 11:215-24.

241. Yang J. Y., Kim K.^ Jayaram M., Harshey R. M. (1995) A domain sharing model for active site assembly within the Mu A tetramer during transposition:the enhancer may specify domain contributions. EMBO J. 14:2374-84.

242. Yin X., Leung D.' (2005) Characteristics of the synthesis of methanol using biomass-derived syngas. Energy Fuels. 19:305-310.

243. Yin Z., Suzuki A., Lou Z., Jayaram M., Harshey R. M. (2007) Interactions of phage Mu enhancer and termini that specify the assembly of a topologically unique interwrapped transpososome. J. Mol. Biol. 372:382-396.

244. Yomantas Y. V., Abalakina E. G. (2002) Method for producing L-phenylalanine. U.S. patent 6350596.

245. Young G. В., Jack D. L., Smith D. W., Saier M. H. (1999) The amino acid/auxin:proton symport permease family. Biochim. Biophys. Acta. 1415:306-322.

246. Yuan J. F., Beniac D. R., Chaconas G., Ottensmeyer F. P. (2005) 3D reconstruction of the Mu transposase and the Type 1 transpososome: a structural framework for Mu DNA transposition. Genes Dev. 19:840-852.

247. Zabeau M. and Stanley K. (1982) Enhanced expression of cro-/?-galactosidase fusion proteins under the control of the PR promoter of bacteriophage X. EMBO J. 1:1217-1224.

248. Zhang M. and. Lidstrom M. E. (2003) Promoters and transcripts for genes involved in methanol oxidation in Methylobacterium extorquens AMI. Microbiology 149:1033-1040.

249. Zhao S., Fan С., Ни X., Chen J. and Feng H. (1993) The microbial production of polyhydroxybutyrate from methanol. Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40:191-199.

250. Ziegelin G., Fiirste J., and Lanka E. TraJ protein of plasmid RP4 binds to a 19-base pair invert sequence repetition within the transfer origin. J. Biol. Chemistry. 264:11989-11994.

251. Мочульская Н. А., Миронов А. С., Машко С. В. (1SJ94) Снижение уровня DeoR-зависимой репрессии ^/ео-оперона в результате интеграции чужеродных фрагментов ДНК в межоператорный район deo01-deo02 хромосомы Escherichia coli. Генетика 30:1175-1183. i

252. Саврасова Е. А., Ахвердян В.З., Лобанов А. О., Каплан А. М., Козлов Ю. И. (2007) Создание mini-Mu системы, лишенной селективных маркеров, для интеграции генов в хромосому бактерии Escherichia coli. Биотехнология. 4:3-17. 1

Информация о работе

Токмакова, Ирина Львовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Разработка методов направленной модификации бактериальной хромосомы для метаболической инженерии облигатного метилотрофа Methylophilus methylotrophus AS1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы