Разработка методологии многопрофильного выявления антител к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода на основе белковых матриц

Яковченко, Анна Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методологии многопрофильного выявления антител к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода на основе белковых матриц
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методологии многопрофильного выявления антител к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода на основе белковых матриц"

На правах рукописи

Яковченко Анна Михайловна

Разработка методологии многопрофильного выявления антител к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода на основе белковых матриц

03 00 23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольдово - 2007

003174460

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель

Кандидат биологических наук Полтавченко Александр Георгиевич

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук Малкова Елена Михайловна Кандидат химических наук Гришаев Михаил Петрович

Ведущая организация ГУ НИИ Биохимии СОР АМН

Защита состоится «9у, 2007 года в /Т^^час на заседании

диссертационного совета ФГУН НЦ/&Б «Вектор» Роспотребнадзора по адресу ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел (8-383) 336-74-28, Email chaldina@vectornscru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН НЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан « /» ¿хД// 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета Э Г Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одним из основных способов диагностики инфекционных заболеваний является серологическое обследование пациентов с целью выявления маркеров (антител классов IgG и IgM) к отдельным возбудителям При смешанных инфекциях, когда организм поражается сразу несколькими возбудителями, а также для дифференциации заболеваний, имеющих сходную клиническую картину, необходимо выполнение нескольких иммунологических тестов В настоящее время такое обследование проводится при помощи моноспецифических тест-систем.

Многопрофильная иммунодиагностика — новое направление, предполагающее использование устройств, так называемых «белковых матриц» (protem arrays), позволяющих одновременно определять в исследуемом образце множество различных антител. Часто такие матрицы называют «белковыми чипами» или «иммуночипами» Белковая матрица для многопрофильного анализа антител представляет собой плотную подложку с дискретно нанесенными в определенном порядке антигенами различных возбудителей инфекционных заболеваний Результаты после выполнения дот-иммуноанализа на матрицах расшифровываются по наличию сигнала в точно пространственно определенных зонах нанесения антигенов Белковые матрицы имеют большой потенциал, как универсальные инструменты в биомедицинских исследованиях и клинической медицине Однако большинство предлагаемых устройств подобного рода предполагает размещение больших белковых библиотек на миниатюрных подложках, роботизацию процесса изготовления и применения матриц Такой подход требует новых дорогостоящих технологий, материалов, оборудования и поэтому в широкой клинической практике пока не используется

Одним из факторов, тормозящих развитие многопрофильной иммунодиагностики, является разнообразие существующих антигенов, для работы с которыми часто требуется подбор индивидуальных условий Успехи последних лет в развитии иммунохимии, в частности получение рекомбинантных антигенов, а также разработка эффективных способов наработки, выделения и очистки натуральных белков, позволяют в значительной степени унифицировать их свойства и сделать возможным их совместное использование в многопрофильном анализе

Перспективной областью применения белковых матриц в практической медицине является комплексное обследование беременных женщин и новорожденных детей на наличие у них спектра сывороточных антител к инфекционным заболеваниям, негативно влияющим на здоровье матери и ребенка Большинство заболеваний перинатального периода характеризуются широким распространением среди населения, множественностью путей заражения, частым сочетанием двух и более возбудителей, а также скудностью и неспецифичностью клинической симптоматики Поэтому для достоверной диагностики таких заболеваний требуется дополнительное лабораторное обследование

доставка образцов из отдаленных населенных пунктов, особенно в условиях сибирского бездорожья, представляет большую трудность Поэтому, значительная часть населения фактически лишена возможности серологического обследования с целью выявления инфекционной угрозы и своевременной ее ликвидации

Таким образом, создание недорогого и простого в исполнении многопрофильного серологического теста, позволяющего оперативно проводить комплексное серологическое обследование беременных женщин, в том числе и в условиях слабо оснащенных сельских медицинских пунктов, позволит сделать такое обследование более доступным, массовым, своевременным и эффективным

Усовершенствование диагностики инфекций перинатального периода является важной социальной задачей, поскольку напрямую связано со здоровьем рождающихся детей и в перспективе определяет здоровье населения страны

В этой работе мы попытались реализовать подход, сочетающий многопрофильность с простотой изготовления и применения белковых матриц

Цель и задачи исследования

Цель исследования - разработка подходов и методических приемов для изготовления и применения многопрофильного теста, позволяющего осуществлять комплексное обследование беременных женщин и новорожденных детей на наличие у них спектра сывороточных антител класса ^О к возбудителям инфекций перинатального периода.

Поставленная цель подразумевает решение следующих задач

- выбор формата и общей стратегии выполнения многопрофильного теста,

- оценку целевых свойств материалов для изготовления подложки (твердой фазы),

- подбор антигенов по номенклатуре теста,

- отработку способа и условий иммобилизации антигенов на твердой фазе,

- создание прототипа белковой матрицы,

- оценку способов получения и усиления визуального сигнала,

- отработку схемы и условий проведения многопрофильного анализа,

- создание и лабораторные испытания прототипа многопрофильного теста.

Научная новизна и практическая ценность работы

- Обоснован выбор формата белковой матрицы и общей стратегии бесприборного многопрофильного анализа антител

- Проведена экспериментальная оценка целевых свойств материалов для изготовления подложки белковой матрицы

- Исследованы целевые свойства коммерчески доступных антигенов и произведен отбор антигенов, пригодных для использования в многопрофильном тесте

- Экспериментально подобраны условия подготовки поверхности твердой фазы и иммобилизации на ней антигенов

- Проведена сравнительная экспериментальная оценка наиболее перспективных вариантов хромогенной визуализации и усиления сигнала.

- Отработана общая схема и оптимизированы условия выполнения многопрофильного теста с использованием конъюгатов на основе коллоидного золота и усилением сигнала серебряным проявлением

- Сконструирован и испытан прототип белковой матрицы для одновременного выявления антител класса IgG к 8 возбудителям инфекций перинатального периода.

- Проведены лабораторные испытания прототипа многопрофильного теста.

- Разработана концепция набора для многопрофильного анализа, получен Патент РФ на "Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа"

Основные результаты, выносимые на защиту

1 Теоретическое и экспериментальное обоснование выбора формата белковой матрицы и общей стратегии бесприборного многопрофильного анализа антител

2 Экспериментальное обоснование выбора материала для изготовления подложки белковой матрицы

3 Методология изготовления белковой матрицы

4 Методология проведения многопрофильного дот-иммуноанализа с применением конъюгатов на основе коллоидного золота и усилением сигнала серебряным проявлением

5 Концепция набора для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям инфекций перинатального периода методом дот-иммуноанализа.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях Международная научная конференция «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» и Междисциплинарный семинар "Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций", (Санкт-Петербург, 2-5 ноября 2004 года), Научно-практическая конференция с международным участием "Серебро и висмут в медицине" (Новосибирск, 25-26 февраля 2005 года), Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 года), Ш Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск 27-29 сентября 2006 года)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах и получено 2 патента РФ

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 11 таблиц и 20 рисунков Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и списка литературы Список литературы включает в себя 167 источников, из них 108 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

При изготовлении белковых матриц использовали следующие антигены: рекомбинантный аналог белка с мол массой 17 кДа Treponema pallidum (pi 7), полученый в Е colt в виде химеры с глутатион-Б-трансферазой Shistosoma japomcum, рекомбинантный аналог белка с мол массой 41 кДа Т pallidum (р41), полученый в Е coh в виде химеры с fi-галактозидазой Е. coh, рекомбинантный аналог белка р150 Cytomegalovirus homim, рекомбинантный аналог белка D1 Herpes simplex virus - 1, рекомбинантный аналог основного белка наружной мембраны МОМР Chlamydia trachomatis, рекомбинантные антигены El, Е2 и С Rubella virus, рекомбинантный антиген Sag-1 Toxoplasma gondii, лизат натурального возбудителя Ureaplasma wealyticum, лизат натурального возбудителя Mycoplasma hominis, лизат натурального возбудителя Gardnerella vaginalis, иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита - положительный контроль ([IgG-Hum) Антигены 1-4 разработаны в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и экспериментальные партии антигенов предоставлены авторами разработок для оценки их применимости в белковых матрицах Все другие антигены предоставлены ЗАО «ИмДи» (Новосибирск)

Использовали рабочую панель из 150 сывороток крови человека, содержащих различные спектры антител к вышеуказанным антигенам Панель формировалась из образцов, полученных от пациентов с подозрением на сифилис (эти образцы получали из дерматовенерологического кабинета Новосибирской районной больницы № 1 в рамках научно-исследовательского проекта "Изучение динамики гуморального иммунитета при сифилитической инфекции и отработка новых методов иммуноанализа", утвержденного Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» 19 09.2002 г), а также из образцов донорских сывороток, предоставленных ЗАО «ИмДи» (Новосибирск) Эта панель была предварительно аттестована с использованием следующих тест-систем «Toxoplasma IgG» Sentinel СН (Италия), «Токсоплазмоз IgG-антитела» ИмДи-спектр (Новосибирск), «Rubella IgG - ELISA» F. Medac (Германия), «ВектоРубелла-IgG-CTpmi ФСП 42-0117-4696-03» Вектор-Бест (Новосибирск), «Chlamidia trachomatis IgG-pELISA» Medac GMB (Германия), «Хламидиоз-1§0-антитела» ИмДи (Новосибирск), «ЦМВ-]^-антитела» МБС (Бердск), «ЦМВ-1§0-антитела» ИмДи (Новосибирск), «ВектоВПГ-IgG-CTpim ФСП 42-0117-3179-02» Вектор Бест (Новосибирск), «repnec-IgG-антитвла» ИмДи (Новосибирск), «СИФ-^О-ДС-стрип (ФСП 42-0155-5191-04)» МБС (Бердск), «ИФА-Анти-трепонема» ИмДи (Новосибирск), «Уреаплазмоз-^О-ДС» МБС (Бердск), «Уреаплазмоз-^О-антитела» ИмДи (Новосибирск), «Микоплазма-^й-ДС» МБС (Бердск), «MHK0ima3M03-IgG-aHTHTena» ИмДи (Новосибирск), «Гарднереллез-IgG-антитела» ИмДи (Новосибирск)

В сравнительных экспериментах использовали сыворотку крови человека, содержащую антитела ко всем вышеуказанным антигенам, кроме антигена уреаплазмы Характеристики сыворотки были получены на соответствующих моноспецифических ИФА тест-системах, серийно выпускаемых ЗАО «ИмДи»

Оценку чувствительности и специфичности многопрофильного теста проводили при определении антител к ЦМВ - на стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к ЦМВ серии 001 (ОСО-42-28-360), при определении антител к ВПГ-1 - на стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к вирусу простого герпеса 1 и 2 типов серии 001 (ОСО-42-28-373);

при определении антител к Chlamydia trachomatis на стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к С trachomatis серии 003 (ОСО-42-28-313), а при определении антител к возбудителю сифилиса - на панели сывороток с нормированным содержанием IgG к антигенам р 17 и р41 Т pallidum, производства ЗАО «Медико-биологический союз» (г Бердск)

В работе проводилась сравнительная оценка работы конъюгатов золь золота (20 нм), конъюгированный с белком A Staphylococcus aureus (Au-SpA) (Sigma, США), конъюгат щелочной фосфатазы с белком A Staphylococcus aureus (ЩФ-SpA) (Sigma, США), конъюгат пероксидазы хрена с белком A Staphylococcus aureus (ПХ-SpA) (Sigma, США), конъюгат пероксидазы хрена с авидином (ПХ-Авидин) (Sigma, США)

Для проявления пероксидазных конъюгатов использовали «Peroxidase substrate kit DAB» (Vector lab Inc , Burlingame, США), «Peroxidase substrate kit DAB-Ni» (Vector lab Inc, Burlmgame, США), субстрат на основе хлорнафтола, композицию из тест-системы «Immuno-blot kit» (Sigma, США) Для проявления конъюгата ЩФ-SpA использовали субстрат NBT/BCIP из тест-системы «Immunocomb Chlamydia-IgG» (Orgenics, Израиль) Для проявления конъюгата на основе коллоидного золота (Au-SpA) использовали субстрат «Silver enhancer kit» (Sigma,CIUA), проявитель с гидрохиноном и проявитель на основе метола

Методы

Морфологические методы Структуру поверхности образцов материалов для подложки исследовали методами атомно-силовой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии Использовали атомно-силовой микроскоп Solver Р47 Вю с кремниевыми зондами NGS11 (ЗАО NT-MDT, Россия) в режиме прерывистого контакта Для сканирующей электронной микроскопии препараты готовились по стандартной методике напылением слоя золота толщиной 20 нм с помощью напылительной установки JFC-1100 (JEOL, Япония) Исследования проводились с использованием сканирующей приставки Н-6010А к электронному микроскопу Н-600 (Hitachi, Япония)

Изготовление белковых матриц В пробных и оценочных экспериментах рабочие разведения в сорбционном буфере антигенов и иммуноглобулинов человека (положительный контроль (К+)) по определенной схеме наносили на подложку пипеткой аликвотами по 2,5 мкл с интервалами 4-5 мм Автоматическую распечатку антигенов выполняли на синтетической бумаге "Polyhth" (фирма «Берег», С-Петербург) марки «GC-3» отдельными пятнами около 2-3 мм в диаметре с помощью модифицированного планшетного перьевого плоттера «Graphitée MP 4200» (Япония) в программе «Splan 50R» (Albacom, Германия) Перед распечатыванием все антигены разводили на 0,01 M боратном буфере (рН 7,5) до концентрации 20 мкг/мл и в течение 20-30 секунд обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе «УЗДН» при частоте 22 кГц и максимальной мощности Подложки с нанесенными антигенами высушивали в течение 10 часов под потоком теплого (35-40°С) воздуха Блокировку свободных участков поверхности матрицы осуществляли 0,2%-ным раствором казеина на 0,01 M фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 2 ч при комнатной температуре После блокировки подложки ополаскивали дистиллированной водой, тщательно просушивали феном, разрезали на отдельные матрицы, упаковывали в полиэтиленовые пакеты и хранили до использования при 4°С

Дот-иммуноанапиз Матрицы инкубировали 30 мин при 37°С с сывороткой в разведении 1/10 на растворе для разведения сывороток (0,02 М Tns-HCl, 0,15 М NaCl, 5% КБР, 0,05% казеина, 0,1% Tween-20 и 0,1% азида натрия, рН 9,6) По окончании инкубации матрицы дважды отмывали погружением в отмывочный раствор (0,02 М Трис-НС1, 0,15 М NaCl, 0,1% Tween-20, рН 7,2) Далее матрицы погружали в рабочее разведение одного из конъюгатов (Au-SpA, ПХ-SpA или ЩФ-SpA) на растворе для разведения конъюгата (0,02 М Tns-HCl, 0,15 М NaCl, 0,05% казеина, 0,1% Tween-20, 0,02% Thimerosal, рН 7,2) и инкубировали 30 мин при 37°С Отмывали дважды отмывочным раствором и один раз дистиллированной водой Проявляли связанные с подложкой конъюгаты при комнатной температуре в соответствующем субстрате Ополаскивали проявленные матрицы дистиллированной водой, высушивали и визуально учитывали результаты Иммунологический сигнал оценивали по интенсивности окраски мест нанесения антигенов и в представленных ниже таблицах пропорционально выражали числом крестов в соответствующих ячейках

Дот-иммуноанапиз "Super-CARD" Выполнение анализа осуществляли, как это описано в оригинальной статье R Bhattacharya (1999) В постановке использовали конъюгат - ПХ-Авидин и субстрат - «Peroxidase substrate kit DAB-Ni»

Иммуноферментный анализ ИФА на моноспецифических тест-системах проводили в соответствии с инструкциями производителей тест-систем

При оценке антигенов проводили адсорбцию антигенов в ячейках планшета из 0,025 М Na-карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9,6) при 4°С в течение ночи Блокировку осуществляли 0,2%-ным раствором казеина на 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,3) в течение 1 часа при 37°С Далее в ячейки планшета вносили исследуемые образцы сывороток в разведении 1/10 на растворе для разведения сывороток (0,01М ФСБ, 0,15 М NaCl, 5% КБР, 0,05% казеина, 0,1% Tween-20 и 0,1% азида натрия, рН 9,6) и инкубировали 30 мин при 37°С По окончании инкубации планшеты отмывали пятикратным внесением в ячейки отмывочного раствора (0,01 М ФСБ, 0,15 М NaCl, 0,05 Tween-20) Затем ячейки планшета заполняли рабочим разведением конъюгата антител против иммуноглобулинов G человека с пероксидазой хрена (ПХ-a/IgG) («Капель», Москва) на растворе для разведения конъюгата (0,01 М ФСБ, 0,15 М NaCl, 0,05% казеина, 0,1% Tween-20, 0,02% Thimerosal, рН 7,2) и инкубировали 30 мин при 37°С Отмывали пятикратно отмывочным раствором Проявление проводили в течение 15 мин при 37°С с использованием субстрата 0,1 мМ ТМБ и 10 мМ перекиси водорода на 0,1 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,5 Реакцию останавливали добавлением в каждую ячейку по 50 мкл 2 М серной кислоты Результаты учитывали на сканирующем спектрофотометре «Multiskan-ЗЮС» (Flow Lab, Финляндия) при длине волны 450 нм

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор формата белковой матрицы

Из многообразия существующих вариантов многопрофильного анализа, наиболее просто реализуемым представляется анализ на плоских белковых матрицах с низкой плотностью нанесения антигенов Такая матрица представляет собой небольшую плоскую подложку, с нанесенными в виде отдельных пятен антигенами нескольких возбудителей инфекционных заболеваний (рис 1) Пятна

имеют диаметр около 3 мм, а число анализируемых инфекций ограничено 10, что позволяет легко контролировать нанесение антигенов на подложку, а также учитывать результаты визуально. С другой стороны, это число обычно охватывает список дифференцируемых заболеваний и может быть и достаточным и удобным для практического применения. Кроме 9 антигенов, на матрице предусмотрено размещение встроенного контроля работы конъюгата (К+), представляющего собой точку нанесения иммуноглобулинов человека. Для детекции иммунологического связывания мы выбрали хромогенные маркеры, способные обеспечить высокую чувствительность и простой учет результатов невооруженным глазом.

8 мм

Маркировка матрицы

Рис.1. Схема конструкции белковой матрицы для многопрофильного анализа антител.

О- точка положительного контроля

Участки иммобилизации антигенов и контроля

Зона К-

Выбор и исследование целевых свойств материалов для подложки матрицы

При выборе материала для изготовления подложки рассматривались три группы листовых материалов: пористые матрицы (нитроцеллюлозные и поливинилхлоридные фильтры), непористые листовые органические полимеры (поливинилхлорид, полистирол и лавсан) и комбинированные пластики, сочетающие органические и минеральные компоненты (синтетическая бумага нескольких сортов). Всего исследовано более 60 образцов. При выборе материала исследовали три основных параметра:

1. эффективность адсорбции антигенов

2. способность к неспецифическому связыванию компонентов

3. способность материала самостоятельно провоцировать проявление

Кроме основных параметров при выборе материала учитывали равномерность структуры и окраски его поверхности, его механические свойства (прочность и эластичность), а также его стоимость.

Пористые мембраны, благодаря развитой поверхности, обладают высокой сорбционной емкостью, однако часто изготовлены из хрупкого и ломкого материала, пористая структура прочно удерживает несвязавшиеся компоненты реакции, особенно золи золота, которые провоцируют неспецифическое проявление, поэтому мембраны нуждаются в дополнительных отмывках, что

усложняет и удлиняет процедуру анализа. Еще одним недостатком мембран является их высокая стоимость

Исследованные образцы непористых листовых материалов показали хорошую сорбционную способность, но требовали предварительной обработки (очистки) поверхности

В качестве наиболее подходящего материала для адсорбционной иммобилизации антигенов была отобрана синтетическая бумага «Ро1у11Й1» марки «ОС» Этот материал имеет однородную поверхность, эффективно и наиболее воспроизводимо связывающую антигены после минимальной предварительной обработки Прочная иммобилизация белков на таком материале достигается методом физической сорбции при сушке нанесенных капель сорбционной смеси, что значительно упрощает технологию изготовления матриц Кроме того, такой материал технологичен при изготовлении матриц и удобен при выполнении анализа. При исследовании материала методом атомно-силовой микроскопии поверхность его выглядит однородной, основная её площадь представлена овальными структурами с размерами 1-2 мкм

Сравнительная оценка способов подготовки поверхности носителя

Поверхность пластика обычно несет на себе остатки компонентов, используемых при его производстве (минеральная смазка, пластификаторы), и банальные загрязнения (жир, белки) Кроме того, поверхностный слой пластика может содержать производственные примеси и участки с дефектами химического состава и полимеризации Эти загрязнения и дефекты поверхности могут с одной стороны снижать эффективность иммобилизации антигенов, а с другой - вызывать неспецифическое связывание биокомпонентов и спонтанное проявление В конечном итоге они влияют на уровни специфических и неспецифических сигналов, а также на воспроизводимость результатов анализа.

Для подготовки подложки в использовали разнообразные сочетания обработки с использованием детергентов, кислот, щелочей и органических растворителей (этанол, фреон 113 и хлороформ)

Исследования показали, что для органических полимеров лучшим способом обработки является удаление верхнего слоя пластика, однако этот способ нетехнологичен Для синтетической бумаги эффективным способом очистки может служить простая обработка его поверхности раствором додецилсульфата натрия с последующей отмывкой дистиллированной водой

Выбор номенклатуры матрицы (подбор антигенов)

Для конструирования белковой матрицы, из широкого спектра возбудителей инфекций перинатального периода необходимо было выбрать 8-10 В первую рчередь отбирались антигены самых распространённых возбудителей, представляющих наибольшую опасность для здоровья матери и плода. Кроме того, учитывалась их коммерческая доступность Большая часть белков была предоставлена ЗАО «ИмДи», кроме того, оценивались экспериментальные партии рекомбинантных антигенов, разрабатываемых специалистами ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Перечень исследованных в данной работе антигенов приведен в таблице 1

Оценку разных антигенов одного возбудителя проводили параллельно в ИФА и дот-анализе с использованием одинаковых наборов сывороток При оценке учитывали уровень максимальных сигналов, полученных при иммобилизации

оптимального разведения антигена, а также полноту и адекватность взаимодействия с образцами сыворток Данные сопоставлялись с картиной электрофореза исследуемых белков

По результатам исследования для изготовления белковой матрицы были отобраны 8 лучших вариантов изученных антигенов (в таблице 1 они выделены жирным шрифтом) Из них 6 рекомбинантных Sag-1 (Toxoplasma gondii), смесь El, Е2, С (Rubella virus), МОМП (Chlamydia trachomatis), pl50 (Cytomegalovirus), Herpes simplex virus-1, комбинация p41(TmpA)-ßGal и pl7- GST (Treponema pallidum) и 2 натуральных Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum

Таблица 1

Перечень исследованных антигенов (антигены, принятые к использованию на матрицах, выделены жирным шрифтом)

Chlamydia trachomatis Рекомбинантные белки МОМР, Hsp 60

Toxoplasma gondii Рекомбинантные белки В 10 и Sag 1, натуральный АГ

Rubella virus Смесь рекомбинантных белков Е 1, Е 2, С

Cytomegalovirus Рекомбинантные белки р 150, р 56, р 65, натуральный АГ

Virus herpes simplex I Рекомбинантный белок D 1, натуральный АГ

Treponema pallidum Рекомбинантные белки р 41-р-галактозидаза, р 41-GST, р 17-р-галактозидаза, р 17-GST

Mycoplasma hominis Рекомбинантный белок р 120, натуральный АГ

Ureaplasma urealyticum Рекомбинантные белки Ure D, МБА 1, натуральный АГ

Gardnerella vaginalis Натуральный АГ

Trichomonas vaginalis Рекомбинантный белок Adgesm р 65, натуральный АГ

Neisseria gonorhoeae Основной белок мембраны (порин) рекомбинантный, натуральный АГ

Candida albicans Натуральный АГ

Chlamidia pneumoniae Натуральный АГ

Trichomonas vaginalis Рекомбинантный белок Adgesm р 65, натуральный АГ

Virus herpes simplex 2 Рекомбинантный белок g 1, натуральный АГ

Исследование условий иммобилизации антигенов на подложке

Белки могут быть иммобилизованы на поверхности носителей путем физической адсорбции, опосредованного связывания через бифункциональные агенты или ковалентной «пришивки» посредством разнообразных химических взаимодействий Большинство методик ковалентного связывания или связывания через бифункциональные агенты многостадийные, длительные, дорогие и требуют специального опыта оператора Физическая адсорбция представляется наиболее простым и технологичным способом фиксации антигенов

В работе сравнивали сорбционное связывание с поверхностью подложки антигенов из буферных растворов разного состава и кислотности в двух режимах сушка капель (2,5 мкл) сорбционной смеси на воздухе при комнатной температуре и инкубация подложек с сорбционной смесью во влажной камере при 4°С в течение 12 ч Установлено, что эффективной иммобилизации на синтетической бумаге всех отобранных антигенов можно достигнуть при их физической сорбции из 0,01 М

боратного буфера при физиологических значениях рН (7-8) в режиме сушки капель сорбционной смеси. Последнее обстоятельство значительно упрощает технологию изготовления матриц. Кроме того, в лаборатории был отработан способ автоматического нанесения антигенов на подложку с использованием модифицированного перьевого планшетного плоттера Graphitée МР 4200 (Япония).

Выбор стратегии генерирования сигнала

В рамках настоящего исследования проводилась сравнительная оценка трех хромогенных маркеров (пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и коллоидного золота) и систем их проявления, в том числе и биотин-тирамидной системы амплификации «Super CARD», с целью подбора наиболее подходящей для разрабатываемой методики системы детекции: чувствительной, быстрой и простой в применении. Схемы выполнения анализов приведены на рис. 2.

Антиген^-_^™ВТ

Исследуемые ^^ Т

антитела '

Коньюгат -5"NJI

ПХ-SpA или LJ

ЩФ-SpA Субстрат

Антиген Исследуемые антитела

Конъюгат ПХ-SpA

Биотинилтирамид

В 1

Конъюгат ПХ-Авидин

Субстрат

Антиген w СУ Исследуемые ^^ антитела

Иммунозоль Au-SpA

Физический проявитель

Рис. 2. Принципиальные схемы генерирования хромогенного сигнала в дот-иммуноанализе антител с использованием: (А) ферментных конъюгатов, (В) системы амплификации сигнала «ЗирегСагсЬ и (С) золотого иммунозоля.

В дот-анализе с использованием разных конъюгатов и проявляющих систем сравнивали следующие параметры:

- интенсивность специфического сигнала в местах нанесения антигенов и положительного контроля;

- чувствительность и полноту выявления спектра антител, о которых судили по наличию сигнала в зонах нанесения всех антигенов, кроме антигена уреаплазмы;

- специфичность выявления спектра антител, о которой судили по наличию сигнала в месте нанесения антигена уреаплазмы;

- возможность неспецифического связывания конъюгатов с антигенами, о которой судили по наличию сигнала в местах нанесения антигенов на матрицах, не имевших контакта с сывороткой;

- возможность неспецифического связывания конъюгатов подложкой или спонтанного проявления свободными участками матрицы, о которых судили по наличию артефактов или диффузного фона на поверхности матрицы, свободной от иммобилизованных антигенов.

а О О f № m m л ■ • ilp # # * * ** • •

b О О g Ф • « :» » A

с О О h » • v # « « », « • mm

d О О i s # • * • it*

е О О k il m

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и

Рис. 3. Результаты анализа одного образца сыворотки в многопрофильном тесте с использованием конъюгатов: (1-5) ПХ-a/IgG-Hum, (6,7) ЩФ-SpA, (8-11) Аи-SpA и проявителей на основе: (1,2) диаминобензидина, (3) диаминобензидина + NiCh, (4) хлорнафтола, (5) системы «Super CARD», (6,7) NBT-BCIP, (8,9) Silver enhancer kit, (10) гидрохинона, (11) метола. Матрицы 1, 6 и 8 проявлены без инкубации с сывороткой. Схема нанесения антигенов, (a) IgG-Hum (К+), (b) Chlamydia trachomatis, (с) Cytomegalovirus hominis, (d) Mycoplasma hominis, (e) Ureaplasma urealytica, (f) Toxoplasma gondii, (g) Rubella virus, (h) Herpes simplex virus-1, (i) Treponema pallidum, (k) Gardnerella vaginalis.

Исследование показало, что относительно недорогая система детекции с j

использованием коллоидного золота и физического проявителя позволяет наиболее эффективно выявлять в образце весь спектр антител и за 8-10 мин генерирует контрастные сигналы, легко воспринимаемые визуально, как это видно на рисункеЗ.

Оптимизация состава и условий применения физического проявителя

Физический проявитель нестабилен и готовится непосредственно перед применением из трех запасных растворов: 0,5%-ной лимонной кислоты, 0,4%-ного метола и 10%-ного нитрата серебра, смешиваемых в соотношении 1:1:0,02 по объему, соответственно. Самым нестабильным из перечисленных компонентов является раствор метола, выступающий в роли восстановителя. Он может храниться в растворе не более 1-2 суток. Тест-система не может укомплектовываться таким раствором и метол должен входить в ее состав в сухом виде. Экспериментально установлено, что в виде сухой смеси с лимонной кислотой в темной упаковке метол может более года (срок наблюдения) храниться при комнатной температуре без потери активности. Для установления влияния ошибок дозирования сухих компонентов проводилась экспериментальная оценка активности и стабильности проявителя, при содержании в нем различных количеств метола, а также лимонной кислоты, определяющей рН раствора. Обнаружено, что наибольшее дестабилизирующее действие оказывает повышение рН. Сделан вывод, что в состав проявителя целесообразно включать не лимонную кислоту, а цитратный буфер, обеспечивающий стабильный рН 2,5. Таким образом, в тест-системах проявитель может использоваться в виде двух компонентов: сухого (смесь метола лимонной кислоты и цитрата натрия в соотношении 2:10:1, соответственно) и жидкого 0,04%-ного раствора азотнокислого серебра. Освоено изготовление тритурационных таблеток сухой смеси с массой 12 мг, пригодных для приготовления 1 мл проявителя. Таблетка растворяется в 0, 5 мл воды за 2,5 мин, затем в этот раствор добавляют 0,5 мл жидкого компонента.

Отработка схемы и условии многопрофильного анализа

В ходе исследования были подобраны оптимальные составы рабочих и отмывочных растворов, которые приведены в таблице 2.

Таблица 2

Составы аналитических и отмывочных растворов для многопрофильного анализа

Компоненты Содержание компонента

Наименование Квалификация, производитель РБР-С РБР-К Отмывочный раствор

Трис-НС1 Sigma, США 0,02 M 0,02 M 0,02 M

Натрий хлористый ч 0,15 M 0,15 M 0,15 M

Твин-20 Sigma, США 0,1% 0,1 % 0,1 %

Казеин Sigma, США 0,05% 0,05%

Концентрат блокирующего раствора (КБР) ЗАО "ИмДи" 5%

Натрия азид Sigma, США 0,1% 0,1% 0,1%

РН 9,5-9,8 7,2-7,4 7,2-7,4

В целях повышения оперативности методики, Отрабатывались условия анализа с укороченными режимами инкубации в условиях комнатной температуры (20°С) Экспериментально установлено, что многопрофильный анализ может эффективно выполняться при комнатной температуре с экспозициями матрицы в образце и конъюгате в течение 20 мин Кроме того, были подобраны кратность рабочих разведений образца и конъюгата и режимы отмывок Проведенные эксперименты позволили составить хронологическую схему выполнения многопрофильного анализа(таб 3)

Таблица 3

X зонологическая схема многопрофильного анализа

№ Этап Раствор Кратность Время

1 Инкубация с образцом Сыворотка на РБРС 1/10 1 20 мин

2 Отмывка №1 ТСБ-Т 2 2 мин

3 Инкубация с конъюгатом Конъюгат Аи-8рА на РБРК 1 20 мин

4 Отмывка №2 ТСБ-Т 2 2 мин

5 Дополнительная отмывка Дистиллированная вода 1 2 мин

6 Усиление сигнала Проявитель с метолом 1 8 мин

7 Отмывка №3 Дистиллированная вода 1 2 мин

8 Учет результатов

Таким образом, многопрофильный анализ выполняется в 10 шагов и занимает по продолжительности 60 мин

Лабораторные испытания прототипа теста

Оценку чувствительности и специфичности многопрофильного теста при определении антител к ЦМВ, ВПГ-1, Chlamydia trachomatis и возбудителю сифилиса проводили на соответствующих панелях сывороток, производства ЗАО «Медико-биологический союз» (г Бердск) Результаты приведены в таблице 4

Таблица 4

Оценка чувствительности и специфичности многопрофильного теста при определении антител класса IgG к ЦМВ, ВПГ-1, С trachomatis и Т pallidum на коммерческих панелях сывороток

Инфекция ЦМВ Герпес Хламидиоз Сифилис

Панель Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих IgG к ЦМВ ОСО-42-28- 360 серия 001 Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих ^О к вирусу простого герпеса 1 и 2 типов ОСО-42-28-373 серия 001 Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих IgG к С trachomatis ОСО-42-28-313 серия 003 Панель сывороток с нормировали ым содержанием IgG к белкам р17и р41Т pallidum серия 001

Положительных образцов (всего /определено) 20/19 20/19 16/15 12/12

Отрицательных образцов (всего /определено) 16/15 14/13 20/19 6/6

Диагностическая чувствительность 95% 95% 94% 100%

Диагностическая специфичность 94% 93% 95% 100 %

Чувствительность теста при выявлении антител к возбудителям сифилиса составила 100 %, хламидиоза - 94 %, а к ВПГ и ЦМВ — 95 % При анализе отрицательных сывороток получены слабые сигналы в 1 образце панелей на хламидиоз, ЦМВ и ВПГ Таким образом, специфичность теста составила 94 % для ЦМВ, 93 % для ВПГ, 95 % для хламидиоза и 100 % для сифилиса.

Для других инфекций, используемых в многопрофильном тесте, доступных коммерческих панелей сывороток найти не удалось Поэтому оценка чувствительности и специфичности теста при определении антител к вирусу краснухи и Т gondii осуществлялась на выборках из образцов рабочей панели сывороток Результаты оценки представлены в таблице 5

При выявлении антител к токсоплазмозу данные референс-тестов и многопрофильного анализа полностью совпадают, а при выявлении антител к краснухе многопрофильный тест определяет меньше позитивных сывороток, чем тест-системы «Medac» и «Вектор-Бест» Возможно, это связано с особенностями антигенов, используемых в разных тестах, поскольку результаты

многопрофильного анализа и тест-системы «ИмДи-спектр», изготовленных с использованием одинаковых антигенов, совпадают полностью

Таблица 5

Результаты оценки показателей многопрофильного теста при выявлении к возбудителям токсоплазмоза и краснухи относительно референс тест-систем различных производителей ___

Инфекция (число образцов) Референс тест-система Образцы Определено образцов Относительные диагностические показатели

референ с- тестом многопр 0- фильным тестом Чувствител ь-ность, % Специфи ч-ность, %

Токсоплазмоз (32) Toxoplasma gondii IgG «Sentinel CH», Италия полож 12 12 100

отриц 20 20 100

Токсоплазмоз IgG-антитела «ИмДи-спектр» Новосибирск полож 12 12 100

отриц 20 20 100

Краснуха (34) Rubella IgG-ELISA f. Medac, Германия полож 26 25 96

отриц 8 9 89

ВектоРубелла-IgG-стрип «Векгор-Бест» Новосибиоск полож 27 25 92

отриц 7 9 78

Краснуха IgG- антитела «ИмДи-спектр» Новосибирск полож 25 25 100

отриц 9 9 100

Общая картина результатов сравнительного анализа всех образцов рабочей панели сывороток, с использованием многопрофильного теста и моноспецифических тест-систем, производства ООО «ИмДи-спектр», изготовленных с применением идентичных антигенов, представлена в таблице 6

Результаты, полученные с использованием рекомбинантных антигенов (6 верхних строк) в ИФА и многопрофильном анализе совпадают на 97-100%

При использовании натуральных антигенов многопрофильный анализ выявляет большее количество положительных образцов Это можно связать с высоким уровнем фона натуральных антигенов В данном случае фоновые сигналы в ИФА антител к мико- и уреаплазмам определялись в диапазоне 0,2-0,3 ОЕ В варианте многопрофильного анализа такие сигналы визуализируются в виде слабо окрашенных, но отчетливо различимых пятен, которые учитываются как положительный результат.

Таблица 6

Число совпадений результатов сравнительного анализа рабочей панели сывороток (150 образцов) с использованием многопрофильного дот-анализа и моноспецифических ИФА тест-систем, производства ООО «ИмДи-спектр»_

Патоген Совпадений результатов

Число Процент

Chlamydia trachomatis 150 100

Toxoplasma gondii 147 98

Rubella virus 149 99

Cytomegalovirus hominis 145 97

Herpes simplex virus-1 149 99

Treponema pallidum 149 99

Mycoplasma hominis 133 98

Ureaplasma urealytica 138 92

Сходная картина наблюдается и при сравнительной оценке аналитической чувствительности этих тестов Для оценки аналитической чувствительности готовили серию двукратных разведений контрольной сыворотки на фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2) Титры специфических антител параллельно определяли в многопрофильном дот-иммуноанализе и на соответствующих моноспецифических иммунопероксидазных тест-системах (ООО "ИмДи-спектр") Белковые матрицы и ИФА тест-системы были изготовлены с применением идентичных антигенов Результаты сравнительной оценки приведены на рис 4

IgG Human (К+) С trachomatis {1/320) СШ{МШ) М hominis (1/40) U urealyticum (0)

00 оо оо оо оо

(1/160) Т gondii (1/40) Rubella virus (1/320) HSV-1 (1/640) T pallidum (1/40) G vaginalis

• - *

iini

• »

о о 00

Рис 4 Результаты многопрофильного дот-иммуноанализа серии разведений контрольной сыворотки (под матрицами указаны соответствующие разведения контрольной сыворотки) Слева приведена схема нанесения антигенов на белковой матрице (в скобках указаны титры соответствующих антител в контрольной сыворотке, определенные с использованием моноспецифических ИФА тест-систем)

Результаты, полученные с использованием рекомбинантных антигенов (С trachomatis, Т gondn, Rubella virus, CMV, HSV-1 и T pallidum) в ИФА и многопрофильном анализе совпадают (1/320, 1/160, 1/160, 1/320 и 1/640, соответственно), тогда как на антигенах, представленных лизатами натуральных возбудителей (М hominis и G vaginalis) матрицы выявляют антитела в большем разведении (1/80), чем ИФА (1/40)

Таким образом, испытания показали, что матрицы по чувствительности и специфичности могут не уступать моноспецифическим ИФА тест-системам Фактором, определяющим эти показатели, является качество используемых антигенов

Проводились эксперименты, подтвердившие хорошую воспроизводимость результатов при серийном изготовлении матриц. При оценке стабильности получены данные, показывающие, что матрицы не теряют чувствительности, как минимум, в течение 12 месяцев хранения при 4°С и 30 дней при температуре 40°С (срок наблюдения).

Концепция набора для многопрофильного анализа

Проведенные исследования позволяют сформулировать общие представления о том, как должна выглядеть тест-система для многопрофильного иммуноанализа. Комплектация многопрофильной тест-системы предполагает: набор белковых матриц, многоячеечную аналитическую ванну, заполненную готовыми рабочими и отмывочными растворами, и компоненты (жидкий и сухой) проявителя. Общий вид макета тест-системы для многопрофильного анализа представлен на рисунке 5.

Рис. 5. Общий вид макета тест-системы для многопрофильного анализа антител.

Набор белковых матриц может быть выполнен в виде плоского гребня с 10 зубцами, изготовленного из синтетической бумаги, каждый зубец которого представляет собой белковую матрицу с нанесенными в определенном порядке антигенами, и положительным контролем. Порядок нанесения антигенов маркируется на нерабочей части гребня и приводится в инструкции по применению. Перед началом анализа вскрывают ячейки первого ряда, вносят в них по 100 мкл исследуемых образцов сыворотки крови и погружают белковые матрицы. Далее анализ проводят шаг за шагом, перемещая гребень из одного ряда в другой. Проявитель готовят непосредственно перед использованием. После выемки матрицы из последней ячейки визуально учитывают результаты. Проявленные

матрицы, по существу, являются серебряными фотографиями и не теряют контрастности длительное время (годы) Они могут подклеиваться к протоколу исследования и архивироваться Другой путь документирования результатов -получение отцифрованного изображения матрицы Такое изображение может быть подвергнуто компьютерной обработке с выдачей протокола установленной формы и храниться в базе данных

Предлагаемый набор имеет следующие достоинства

- позволяет одновременно выявлять весь спектр антител к 8 возбудителям перинатальных инфекций и значительно сократить время на обследование пациента,

- по чувствительности, специфичности и воспроизводимости не уступает серийно выпускаемым планшетным моноспецифическим иммунопероксидазным тестам,

- содержит полный комплект компонентов для выполнения анализа,

- имеет встроенный контроль работы конъюгата,

- обеспечивает визуальный учет результатов,

- выполняется в течение 1 часа при комнатной температуре,

- прост в исполнении и не требует особой квалификации оператора,

- может использоваться как для серийного скрининга сывороток, так и для индивидуальных анализов,

- может использоваться не только в крупных, но и в слабо оснащенных лабораториях, в кабинете врача и в полевых условиях,

- себестоимость одного многопрофильного анализа (на 9 инфекций) близка к себестоимости одного моноспецифического анализа, таким образом, комплексное обследование пациентов с использованием многопрофильного теста будет в несколько раз дешевле, чем эквивалентное обследование с применением моноспецифических ИФА тест-систем

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа направлена на реализацию нового подхода к диагностике, основанного на применении белковых матриц, позволяющих одновременно выявлять в крови пациента специфические антитела к нескольким патогенным микроорганизмам Основное достоинство такого подхода в том, что пациент в одном анализе может быть обследован на 'наличие нескольких инфекций, вызывающих сходные симптомы заболевания Принципиально возможно создание матриц, которые могут позволять одновременно проводить анализ на десятки или сотни различных патогенов, однако обычно такой необходимости нет Более актуально создание матриц по конкретным областям медицинской диагностики Например, для анализа крови доноров на станциях переливания, определения этиологических факторов аллергических и паразитарных заболеваний, дифференцирования сходных хронических инфекций, эпидемиологического скрининга по определенным группам заболеваний Перечень нозологических форм обычно укладывается в 8-10 наименований

Целью настоящей работы являлось создание методологии изготовления и применения белковых матриц для многопрофильного серологического обследования беременных женщин на наличие инфекционных заболеваний, негативно влияющих на здоровье матери и плода. Основаниями для выбора такой номенклатуры белковой матрицы послужили

- высокая социальная значимость качественной и широкой диагностики перинатальных инфекций, во многом определяющей здоровье детей нашей страны,

- потребность медицинских учреждений в такой тест-системе,

- доступность антигенов приемлемого качества для изготовления матриц,

- доступность моноспецифических ИФ тест-систем для сравнительного анализа показателей многопрофильного теста,

- доступность стандартных или рабочих панелей сывороток для первичной аттестации тест-системы

При выборе формата и общей стратегии многопрофильного теста наиболее простым и перспективным для быстрого внедрения в клиническую практику нами признан анализ антител на плоских белковых матрицах с низкой плотностью нанесения антигенов и хромогенной детекцией иммунологического сигнала

Изучены целевые свойства большого перечня листовых материалов, потенциально пригодных для изготовления белковой матрицы Установлено, что приемлемым вариантом материала подложки может служить листовой белый полистирол, однако для улучшения его сорбционных свойств необходимо удаление поверхностного слоя материала, что значительно усложняет технологию изготовления матриц В качестве лучшего материала для адсорбционной иммобилизации антигенов отобрана синтетическая бумага «Polyhth» марки «GC» Этот носитель имеет однородную поверхность, эффективно связывающую антигены после минимальной предварительной обработки — отмывка раствором детергента (SDS) с последующим ополаскиванием дистиллированной водой Прочная иммобилизация белков на таком материале достигается методом физической адсорбции при сушке нанесенных капель сорбционной смеси, что значительно упрощает технологию изготовления матриц Наиболее эффективное связывание (около 20 нг белка на пятно диаметром 2-3 мм) на синтетической бумаге достигается при сорбции антигенов из 0,01 М боратного буфера, рН 7,3-8,0 Автоматизированное нанесение антигенов на подложку матрицы с удовлетворительным качеством и скоростью может быть достигнуто при использовании перьевого планшетного плоттера, управляемого компьютером

Проведено сравнительное исследование доступных хромогенных систем генерирования иммунологического сигнала Наиболее пригодной для визуализации результатов многопрофильного анализа признана система с использованием в качестве метки конъюгата - коллоидного золота и в качестве субстрата -серебряного проявителя с метолом Эта относительно недорогая система позволяет эффективно выявлять в образце весь спектр антител и генерирует контрастные сигйалы, легко оцениваемые визуально Отработана схема комплектации тест-систем проявителем, предусматривающая наличие двух компонентов жидкого - 10 %-ного раствора нитрата серебра и сухого — смеси цитратного буфера и метола Дозировка сухого компонента с погрешностью не более 8 % может быть осуществлена путем получения тритурационных таблеток с массой 12 мг, достаточных для приготовления 1 мл физического проявителя

Проведена сравнительная оценка целевых свойств коммерчески доступных вариантов антигенов возбудителей перинатальных инфекций Для изготовления прототипа матрицы отобраны 6 рекомбинантных (Toxoplasma gondii, Chlamydia trachomatis, Rubella virus, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1) и 2 натуральных (Mycoplasma homims, Ureaplasma urealytica) антигенов С

использованием для автоматической распечатки антигенов перьевого планшетного плоттера изготовлены прототипы белковых матриц, несущие на себе 8 вышеуказанных антигенов, а также положительный контроль (^й-Нит)

Отработана общая схема и условия проведения многопрофильного теста. Создан прототип тест-системы, включающий белковые матрицы и необходимые рабочие и отмывочные растворы

Лабораторные испытания прототипа с использованием доступных панелей сывороток и иммунопероксвдазных моноспецифических тест-систем отечественных и зарубежных производителей показали, что многопрофильный анализ антител на основе белковых матриц может обеспечивать высокие показатели чувствительности, специфичности и воспроизводимости, не уступающие показателям моноспецифических иммуноферментных тест-систем Основным условием обеспечения хорошего качества многопрофильного теста является использование при изготовлении белковых матриц высокоспецифичных и высокоочищенных антигенов

Описанная методология изготовления белковых матриц проста, позволяет получать воспроизводимые результаты -и обеспечивает стабильность характеристик матриц при длительном хранении, в том числе и при повышенных температурах

Разработана концепция набора для многопрофильного выявления перинатальных инфекций, предусматривающая выполнение серийных и индивидуальных анализов Такой набор должен включать гребенку с десятью зубцами, каждый из которых является белковой матрицей, а также многоячеечную ванну, заполненную готовыми рабочими и отмывочными растворами и запаянную фольгой Выполнение анализа в таком наборе заключается во внесении исследуемых образцов в ячейки первого ряда и, затем, последовательную инкубацию зубцов гребенки (или ее части по числу образцов) в ячейках После выемки из последнего ряда результаты учитываются визуально по наличию на матрицах темных пятен в местах нанесения соответствующих антигенов

Внедрение такого теста в практику позволит сделать обследование пациентов существенно более дешевым, простым, быстрым, а, следовательно, более доступным и массовым Один анализ в многопрофильной тест-системе эквивалентен нескольким анализам в современных моноспецифических диагностических наборах В то же время, по предварительным оценкам, себестоимость этих анализов близка. Таким образом, внедрение теста на белковых матрицах в широкую практику может дать значительный экономический эффект, складывающийся за счет низкой себестоимости систем, сокращения трудозатрат на выполнение анализа и снижения затрат на приборное обеспечение Простота выполнения анализа, полная комплектация набора и возможность визуального учета результатов позволят использовать такие тест-системы в скудно оснащенных лабораториях низшего звена здравоохранения (районные и сельские лечебные учреждения) и во внелабораторных условиях

На основе описанных в настоящей работе методических решений могут быть созданы белковые матрицы с различным набором специфичности (для выявления паразитарных заболеваний, для дифференциации аллергических состояний, для контроля переливаемой крови и т п )

имеющих сходную или скудную симптоматику Такие системы могут найти применение не только в медицине, но и в ветеринарии, в экологических исследованиях и научных экспериментах

ВЫВОДЫ

1 Для реализации многопрофильного иммуноанализа разработан формат теста на плоских белковых матрицах с низкой плотностью нанесения антигенов и хромогенной системой детекции, позволяющий легко контролировать нанесение антигенов на подложку и учитывать результаты визуально

2. По результатам испытания различных материалов для изготовления подложки белковой матрицы отобрана синтетическая бумага «Ро1уЬШ» марки «ОС», имеющая однородную поверхность и эффективно связывающая антигены после минимальной предварительной обработки

3 Разработаны способ и условия иммобилизации антигенов на твердой фазе -физическая адсорбция в режиме сушки капель (2,5 мкл) сорбционной смеси на поверхности подложки (рН 7,3-8,0, концентрация антигенов 10-20 мкг/мл)

4 Создан прототип белковой матрицы, представляющий собой подложку с дискретно нанесенными в виде пятен (2-3 мм) антигенами возбудителей перинатальных инфекций (6 рекомбинантных и 2 в виде лизатов натуральных микроорганизмов) и положительным контролем (иммуноглобулины человека) Матрицы сохраняют исходные характеристики при температуре 3-8°С в течение 12 месяцев

5 Для визуализации иммунологического связывания подобрана хромогенная система с использованием конъюгата на основе коллоидного золота и серебряного проявителя с метолом, обеспечивающая наибольшую чувствительность и контрастность проявления

6. Отработана общая схема и условия проведения многопрофильного теста. Тест выполняется в 10 шагов при комнатной температуре в течение 60 минут

7 Разработан прототип теста для многопрофильного анализа, включающий белковые матрицы и все готовые растворы Лабораторные испытания показали, что многопрофильный анализ на основе белковых матриц может обеспечить чувствительность, специфичность и воспроизводимость, не уступающую серийно выпускаемым моноспецифическим иммуноферментным тестам, при условии подбора качественных антигенов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Полтавченко А Г, Яковченко А М, Кривенчук Н А Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителей инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика — 2006 - № 5 - С 39-42 2. Полтавченко АГ, Яковченко АМ, Кривенчук НА, Зайцев БН Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 1 Выбор формата белковых чипов и материала для изготовления подложки // Биотехнология.-2006 -№5 - С 77-87 3 Полтавченко А Г, Яковченко А М, Кривенчук Н А Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний 2 Иммобилизация антигенов на подложке белкового чипа. - Биотехнология // 2007. - № 1 - С 86-94

4 Полтавченко А Г, Яковченко А М, Кривенчук Н А, Карпышев Н Н Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний 3 Визуализация результатов анализа - Биотехнология // 2007 - №2 - С 63-71

5 Полтавченко А Г, Яковченко А М Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний 4 Лабораторные испытания многопрофильного теста // Биотехнология -2007 - № 3 - С 88-94

6 Полтавченко А Г, Яковченко А М, Кривенчук Н А , Рыбаков А Н Разработка панели с нормированным содержанием IgG к Treponema pallidum // Вестн. дерматологии и венерологии - №3 - С 5-13

7 Патент РФ № 2298795 / Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа // Полтавченко А Г, Яковченко А М, Кривенчук Н А , Серпинский О И, Лунев М А - приоритет от 29 03 2004, опубл 10 05 2007, Бюл № 13

8 Патент РФ № 2275635 / Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и p41 Treponema pallidum и способ ее получения // Полтавченко А Г, Кривенчук Н А , Рыбаков А Н, Филатов П В , Яковченко AM- приоритет от 03 06 2004, опубл 27 04 2006, Бюл № 12

Яковченко Анна Михайловна

Автореф дисс на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 20 09 2007 Заказ № 83 Формат 60x90/16 Усл. печ л. 1 Т1фаж100экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковченко, Анна Михайловна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ИНФЕКЦИИ ПЕРИНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА И ПОДХОДЫ К ИХ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ (Литературный обзор).

1.1. Особенности инфекционных заболеваний перинатального периода и j ^ их диагностики.

1.1.1. Токсоплазмоз.

1.1.2. Краснуха.

1.1.3. Инфекция, вызванная вирусами простого герпеса.

1.1.4. Цитомегаловирусная инфекция.

1.1.5. Хламидиоз.

1.1.6. Микоплазмоз.

1.1.7. Сифилис.

1.2. Многопрофильный иммуноанализ, как альтернативный подход к диагностике инфекционных заболеваний.

1.3. Виды, форматы и дизайн белковых микроматриц.

1.4. Материалы, используемые в качестве твёрдой фазы.

1.5. Методы иммобилизации биомолекул на поверхности твёрдой фазы.

1.6. Методы регистрации иммунологического связывания.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ.

3.1. Выбор формата белковой матрицы.

3.2. Выбор и исследование целевых свойств материалов для подложки матрицы.

3.3. Сравнительная оценка способов подготовки поверхности носителя.

3.4. Выбор номенклатуры матрицы (подбор антигенов).

3.5. Выбор способа и условий иммобилизации антигенов на подложке.

3.6. Выбор стратегии генерирования сигнала.

3.7. Оптимизация состава и условий применения физического проявителя.

3.8. Отработка схемы и условий многопрофильного анализа.

3.9.Лабораторные испытания прототипа тест-системы для многопрофильного анализа.

3.10. Концепция набора для многопрофильного анализа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методологии многопрофильного выявления антител к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода на основе белковых матриц"

Актуальность темы.

Одним из основных способов диагностики и дифференциации инфекционных заболеваний является серологическое обследование пациентов с целью выявления маркеров (антител классов IgG и IgM) к отдельным возбудителям. При смешанных инфекциях, когда организм поражается сразу несколькими возбудителями, а также для дифференциации заболеваний, имеющих сходную клиническую картину, часто необходимо выполнение нескольких иммунологических тестов. В настоящее время такое обследование проводится при помощи моноспецифических тест-систем.

Многопрофильная иммунодиагностика - новое направление, предполагающее использование устройств, так называемых «белковых матриц» (protein arrays), позволяющих одновременно определять в исследуемом образце множество различных антител. Часто такие матрицы называют «белковыми чипами» или «иммуночипами». Одним из факторов, тормозящим развитие многопрофильной иммунодиагностики, является разнообразие существующих антигенов, для работы с которыми часто требуется подбор индивидуальных условий. Успехи последних лет в развитии иммунохимии, в частности получение рекомбинантных антигенов, а также разработка эффективных способов наработки, выделения и очистки натуральных белков, позволяют в значительной степени унифицировать их свойства и сделать возможным их совместное использование в многопрофильном анализе.

Белковая матрица для многопрофильного анализа антител представляет собой плотную подложку, на поверхности которой дискретно нанесены в определенном порядке антигены различных возбудителей инфекционных заболеваний. Результаты после выполнения дот-иммуноанализа на матрицах расшифровываются по наличию сигнала в точно пространственно определенных зонах нанесения антигенов. Белковые матрицы имеют большой потенциал, как универсальные инструменты в биомедицинских исследованиях и клинической медицине (Cahill D.J., 2001). Большинство предлагаемых устройств подобного рода предполагают размещение больших библиотек различных антигенов на миниатюрных подложках, роботизацию процесса изготовления и применения матриц (Ekins R.P., 1998; Kodadek Т., 2001; Nielsen U. et all., 2004; Templin M. et all., 2002). Такой подход требует новых дорогостоящих технологий, материалов, оборудования и поэтому в широкой клинической практике пока не используется. По мнению D.J.Cahill (2001), применение этих новых технологий в академических исследованиях должно возрасти в ближайшие 3-5 лет, однако, их внедрение в клиническую диагностику и лечение произойдёт в более отдаленном будущем.

Одной из наиболее перспективных областей применения белковых матриц в практической медицине является комплексное обследование беременных женщин и новорождённых детей на наличие у них спектра сывороточных антител к инфекционным заболеваниям, негативно влияющим на здоровье матери и ребенка. Большинство заболеваний перинатального периода характеризуются широким распространением среди населения разных регионов мира, множественностью путей заражения, частым сочетанием двух и более возбудителей, взаимно усиливающих патогенность, а также скудностью и неспецифичностью клинической симптоматики (Boyer S.G., 2004; Vivarelli R., 2001). Поэтому для достоверной диагностики таких заболеваний требуется дополнительное лабораторное обследование. Одним из наиболее оправданных подходов является проведение комплексного серологического обследования.

Для проведения такого обследования необходима постановка ряда анализов на моноспецифических тест-системах, поэтому оно представляет собой длительную, трудоёмкую и дорогостоящую процедуру. Следует отметить, что для выполнения иммунофермеитных анализов требуется специальная дорогая аппаратура и высокая квалификация персонала. В настоящее время такое обследование проводится только в крупных, как правило, городских учреждениях здравоохранения. Оперативная доставка образцов из отдаленных населенных пунктов, особенно в условиях сибирского бездорожья, представляет большую трудность. Поэтому, значительная часть населения фактически лишена возможности серологического обследования с целью выявления инфекционной угрозы и своевременной ее ликвидации.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является разработка подходов и методических приёмов для изготовления и применения многопрофильного теста, позволяющего осуществлять комплексное обследование беременных женщин и новорожденных детей на наличие у них спектра сывороточных антител класса IgG к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода.

Поставленная цель подразумевает решение следующих задач:

- выбор формата и общей стратегии многопрофильного теста;

- оценку целевых свойств материалов для изготовления подложки (твердой фазы);

- подбор антигенов по номенклатуре теста и создание прототипа белковой матрицы;

- отработку способа и условий иммобилизации антигенов на твердой фазе;

- оценку способов получения и усиления визуального сигнала;

- отработку схемы и условий проведения многопрофильного анализа;

- создание и лабораторные испытания прототипа многопрофильного теста.

Научная новизна и практическая ценность работы

- Обоснован выбор формата белковой матрицы и общей стратегии бесприборного многопрофильного анализа антител.

- Проведена экспериментальная оценка целевых свойств материалов для изготовления подложки белковой матрицы.

- Из числа коммерчески доступных антигенов отобраны антигены пригодные для использования в многопрофильном тесте. Создан прототип белковой матрицы

- Экспериментально подобраны условия подготовки поверхности твердой фазы и иммобилизации на ней антигенов.

- Проведены лабораторные испытания прототипа многопрофильного теста.

Работа выполнена в течение 2002-2006 гг. В 2005 г работа проводилась при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Проект № 5028 "Разработка технологии автоматизированного производства биочипов и создание прототипа тест-системы ").

Все экспериментальные работы осуществлялись в рамках научно-исследовательского проекта "Изучение динамики гуморального иммунитета при сифилитической инфекции и отработка новых методов иммуноанализа", утвержденного Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» 19.09.2002 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование выбора формата белковой матрицы и общей стратегии бесприборного многопрофильного анализа антител.

2. Экспериментальное обоснование выбора материала для изготовления подложки белковой матрицы.

3. Методология изготовления белковой матрицы.

4. Методология проведения многопрофильного дот-иммуноанализа с применением конъюгатов на основе коллоидного золота и усилением сигнала серебряным проявлением.

5. Концепция набора для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител класса IgG к 9 возбудителям инфекций перинатального периода методом дот-иммуноанализа.

Конкретное участие автора в получении результатов

Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Все работы выполнены под руководством и в соавторстве с А.Г. Полтавченко. Часть исследований выполнена в соавторстве с О.И. Серпинским, Б.Н. Зайцевым, II.H. Карпышевым, З.А. Акименко, Н.А. Кривенчуком, П.В. Филатовым и А.Н. Рыбаковым. Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность. За помощь в оформлении работы автор благодарит Е.М. Малкову, П.А Белавина, М.А. Суслопарова, 3. А. Акименко.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях:

1. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И. «Иммуночипы для диагностики TORCH - инфекций» // Междисциплинарный семинар: "Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций", и международная научная конференция «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2-5 ноября 2004 года).

2. Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко A.M. «Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum» // Междисциплинарный семинар: "Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций", и международная научная конференция «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2-5 ноября 2004 года).

3. Яковченко A.M., Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А, Серпинский О.И. «Использование серебра в многопрофильной иммунодиагностике инфекционных заболеваний» // Научно-практическая конференция с международным участием

Серебро и висмут в медицине" (Новосибирск, 25-26 февраля 2005 года).

4. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M. «Многопрофильная иммунодиагностика инфекционных заболеваний" // Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21 -23 июня 2006 года).

5. Яковченко A.M., Полтавченко А.Г. «Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний» // III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск 27-29 сентября 2006 года).

По материалам исследований опубликованы статьи:

1. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителей инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 5. - С. 39-42

2. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А., Зайцев Б.Н. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 1. Выбор формата белковых чипов и материала для изготовления подложки // Биотехнология. - 2006. - № 5. - С. 77-87

3. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 2. Иммобилизация антигенов на подложке белкового чипа. - Биотехнология // 2007. - № 1. - С. 86-94

4. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А., Карпышев Н.Н. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 3. Визуализация результатов анализа. - Биотехнология // 2007. - № 2. - С. 63-71

5. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 4. Лабораторные испытания многопрофильного теста // Биотехнология. - 2007. - № 3. - С. 88-94

6. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н. Разработка панели с нормированным содержанием IgG к Treponema pallidum // Вестн. дерматологии и венерологии. - № 3. - С. 5-13

Получены Патенты РФ:

1. Патент РФ № 2298795 / Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа // Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А., Серпинский О.И., Лунев М.А. - приоритет от 29.03.2004, опубл. 10.05.2007, Бюл. № 13.

2. . Патент РФ № 2275635 / Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum и способ ее получения // Полтавченко А.Г., Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко A.M. - приоритет от 03.06.2004, опубл. 27.04.2006, Бюл. № 12.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 11 таблиц и 20 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и списка литературы. Список литературы включает в себя 167 источников, из них 108 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Яковченко, Анна Михайловна

выводы

1. Для реализации многопрофильного иммуноанализа разработан формат теста на плоских белковых матрицах с низкой плотностью нанесения антигенов и хромогенной системой детекции, позволяющий легко контролировать нанесение антигенов на подложку и учитывать результаты визуально.

2. По результатам испытания различных материалов для изготовления подложки белковой матрицы отобрана синтетическая бумага «Polylith» марки «GC», имеющая однородную поверхность и эффективно связывающая антигены после минимальной предварительной обработки.

3. Разработаны способ и условия иммобилизации антигенов на твердой фазе -физическая адсорбция в режиме сушки капель (2,5 мкл) сорбционной смеси на поверхности подложки (рН 7,3-8,0, концентрация антигенов 10-20 мкг/мл).

4. Создан прототип белковой матрицы, представляющий собой подложку с дискретно нанесёнными в виде пятен (2-3 мм) антигенами возбудителей перинатальных инфекций (6 рекомбинантных и 2 в виде лизатов натуральных микроорганизмов) и положительным контролем (иммуноглобулины человека). Матрицы сохраняют исходные характеристики при температуре 3-8°С в течение 12 месяцев.

5. Для визуализации иммунологического связывания подобрана хромогенная система с использованием конъюгата на основе коллоидного золота и серебряного проявителя с метолом, обеспечивающая наибольшую чувствительность и контрастность проявления.

6. Отработана общая схема и условия проведения многопрофильного теста. Тест выполняется в 10 шагов при комнатной температуре в течение 60 минут.

7. Разработан прототип теста для многопрофильного анализа, включающий белковые матрицы и все готовые растворы. Лабораторные испытания показали, что многопрофильный анализ на основе белковых матриц может обеспечить чувствительность, специфичность и воспроизводимость, не уступающую серийно выпускаемым моноспецифическим иммуноферментным тестам, при условии подбора качественных антигенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хронические инфекционные заболевания широко распространены. Для большинства из них характерны скудная, неспецифичная клиническая манифестация и частое сочетание нескольких возбудителей ("микст-инфекции"), делающие невозможной постановку диагноза без дополнительных лабораторных исследований и диктующие необходимость проведения исследований на несколько различных инфекционных агентов. Основным подходом современной медицинской диагностики хронических инфекционных заболеваний человека является серологическое обследование при помощи иммуноферментного анализа (ИФА).

Настоящая работа направлена на реализацию нового подхода к диагностике, основанного на применении белковых матриц, позволяющих одновременно выявлять в крови пациента специфические антитела к нескольким патогенным микроорганизмам. Основное достоинство такого подхода в том, что пациент в одном анализе может быть обследован на наличие нескольких инфекций, вызывающих сходные симптомы заболевания. Принципиально возможно создание матриц, которые могут позволять одновременно проводить анализ на десятки или сотни различных патогенов, однако обычно такой необходимости нет. Более актуально создание матриц по конкретным областям медицинской диагностики. Например, для анализа крови доноров на станциях переливания, определения этиологических факторов аллергических и паразитарных заболеваний, дифференцирования сходных хронических инфекций, эпидемиологического скрининга по определенным группам заболеваний. Перечень нозологических форм обычно укладывается в 8-10 наименований.

В настоящее время диагностических тест-систем на основе белковых матриц нет ни в России, ни за рубежом. Но не возникает сомнений в том, что в ближайшем будущем ситуация изменится. Так в 2006 г. фирма Bio-Rad (США) предприняла попытку внедрения на рынок медицинских услуг тест-системы на основе суспензионной белковой матрицы для дифференциации 6 аутоиммунных заболеваний. Этой и другими иностранными фирмами интенсивно разрабатываются многопрофильные тест-системы для контроля инфекционных заболеваний.

- высокая социальная значимость качественной и широкой диагностики перинатальных инфекций, во многом определяющей здоровье детей нашей страны;

- потребность медицинских учреждений в такой тест-системе;

- доступность антигенов приемлемого качества для изготовления матриц;

- доступность моноспецифических ИФ тест-систем для сравнительного анализа показателей многопрофильного теста;

- доступность стандартных или рабочих панелей сывороток для первичной аттестации тест-системы.

При выборе формата и общей стратегии многопрофильного теста наиболее простым и перспективным для быстрого внедрения в клиническую практику нами признан анализ антител на плоских белковых матрицах с низкой плотностью нанесеиия антигенов и хромогенной детекцией иммунологического сигнала.

Изучены целевые свойства большого перечня листовых материалов, потенциально пригодных для изготовления белковой матрицы. Установлено, что приемлемым вариантом материала подложки может служить листовой белый полистирол, однако для улучшения его сорбционных свойств необходимо удаление поверхностного слоя материала, что значительно усложняет технологию изготовления матриц. В качестве лучшего материала для адсорбционной иммобилизации антигенов отобрана синтетическая бумага «Polylith» марки «GC». Этот носитель имеет однородную поверхность, эффективно связывающую антигены после минимальной предварительной обработки - отмывка раствором детергента (SDS) с последующим ополаскиванием дистиллированной водой. Прочная иммобилизация белков на таком материале достигается методом физической адсорбции при сушке нанесенных капель сорбционной смеси, что значительно упрощает технологию изготовления матриц. Наиболее эффективное связывание около 20 нг белка на пятно диаметром 2-3 мм) на синтетической бумаге достигается при сорбции антигенов из 0,01 М боратного буфера, рН 7,3-8,0. Автоматизированное нанесение антигенов на подложку матрицы с удовлетворительным качеством и скоростью может быть достигнуто при использовании перьевого планшетного плоттера, управляемого компьютером.

Проведено сравнительное исследование доступных хромогенных систем генерирования иммунологического сигнала. Наиболее пригодной для визуализации результатов многопрофильного анализа признана система с использованием в качестве метки конъюгата - коллоидного золота и в качестве субстрата - физического проявителя на основе метола. Эта относительно недорогая система позволяет эффективно выявлять в образце весь спектр антител и генерирует контрастные сигналы, легко оцениваемые визуально. Отработана схема комплектации тест-систем проявителем, предусматривающая наличие двух компонентов: жидкого - 10 %-ного раствора нитрата серебра и сухого - смеси цитратного буфера и метола. Дозировка сухого компонента с погрешностью не более 8 % может быть осуществлена путем получения тритурационных таблеток с массой 12 мг, достаточных для приготовления 1 мл физического проявителя.

Проведена сравнительная оценка целевых свойств коммерчески доступных вариантов антигенов возбудителей перинатальных инфекций. Для изготовления прототипа матрицы отобраны 6 рекомбинантных (Toxoplasma gondii, Chlamydia trachomatis, Rubella virus, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1) и 2 натуральных {Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica) антигенов. С использованием для автоматической распечатки антигенов перьевого планшетного плоттера изготовлены прототипы белковых матриц, несущие на себе 8 вышеуказанных антигенов, а также положительный контроль (IgG-Hum).

Лабораторные испытания прототипа с использованием доступных панелей сывороток и иммунопероксидазных моноспецифических тест-систем отечественных и зарубежных производителей показали, что многопрофильный анализ антител на основе белковых матриц может обеспечивать высокие показатели чувствительности, специфичности и воспроизводимости, не уступающие показателям моноспецифических иммуноферментных тест-систем. Основным условием обеспечения хорошего качества многопрофильного теста является использование при изготовлении белковых матриц высокоспецифичных и высокоочищеиных антигенов.

Описанная методология изготовления белковых матриц проста, позволяет получать воспроизводимые результаты и обеспечивает стабильность характеристик матриц при длительном хранении, в том числе и при повышенных температурах.

Разработана концепция набора для многопрофильного выявления перинатальных инфекций, предусматривающая выполнение серийных и индивидуальных анализов. Такой набор должен включать гребенку с десятью зубцами, каждый из которых является белковой матрицей, а также многоячеечную ванну, заполненную готовыми рабочими и отмывочными растворами и запаянную фольгой. Выполнение анализа в таком наборе заключается во внесении исследуемых образцов в ячейки первого ряда и, затем, последовательную инкубацию зубцов гребенки (или ее части по числу образцов) в ячейках. После выемки из последнего ряда результаты учитываются визуально по наличию на матрицах темных пятен в местах нанесения соответствующих антигенов.

Внедрение такого теста в практику позволит сделать обследование пациентов существенно более дешевым, простым, быстрым, а, следовательно, более доступным и массовым. Один анализ в многопрофильной тест-системе эквивалентен нескольким анализам в современных моноспецифических диагностических наборах. В то же время, по предварительным оценкам, себестоимость этих анализов близка. Таким образом, внедрение теста па белковых матрицах в широкую практику может дать значительный экономический эффект, складывающийся за счет низкой себестоимости систем, сокращения трудозатрат на выполнение анализа и снижения затрат на приборное обеспечение. Простота выполнения анализа, полная комплектация набора и возможность визуального учета результатов позволят использовать такие тест-системы в скудно оснащенных лабораториях низшего звена здравоохранения (районные и сельские лечебные учреждения) и во внелабораторных условиях.

Таким образом, настоящая работа направлена на отработку методологии нового поколения диагностических систем, позволяющих одновременно, просто и дешево выявлять и дифференцировать большое число инфекционных заболеваний, имеющих сходную или скудную симптоматику. Такие системы могут найти применение не только в медицине, но и в ветеринарии, в экологических исследованиях и научных экспериментах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковченко, Анна Михайловна, Кольцово

1. Адаскевич В.П. Заболевания, передаваемые половым путем. Витебск 1996.- 145 с.

2. Анохин В.А. Проблемы и новые направления в диагностике инфекционных заболеваний у детей / В.А. Анохин, Г.Р. Хасапова // Росс, педиатр, журнал. 2000. -№4.-С. 32-38.

3. Атаева Г.Б. Особенности течения беременности и родов у женщин с генитальным герпесом: Дис. канд. мед. наук. М, 1992.

4. Васильев В.В. Токсоплазмоз: современные научно-практические подходы // Вестник инфектологии и паразитологии. 2001 // http://www.infectologv.spb.ru.

5. Васильев В.В. Приобретенный токсоплазмоз у лиц молодого возраста: патогенез, диагностика, лечение и военно-врачебная экспертиза: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. СПб., 2002.

6. Володин Н.Н., Антонов А.Г., Базарова М.В. Протоколы диагностики, лечения и профилактики внутриутробных инфекций у новорождённых детей. -М., 2001.

7. Гайдамовичене J1.M., Йоцявичене А.П. Поражение нервной системы при токсоплазмозе. Вильнюс: Мокслас, 1989. - 123 с.

8. Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Урманов И.Х. Клонирование и экспрессия в E.coli основных антигенов Treponema pallidum и исследование их иммунохимических свойств // Иммунология.- 1998. № 4.- С. 7-11.

9. Гуртовой Б.Л., Анкирская Л.С., Ванько Л.В. Бубнова Н.И. Внутриутробные бактериальные и вирусные инфекции плода и новорожденного // Акушерство и гинекология. 1994. - № 4. - С. 20-26.

10. Джеймс Т.Х. Теория фотографического процесса: Пер. с англ. / Под ред. А.Л. Картужанского. Л.: Химия, 1980. - С. 384-392.

11. Диагностика и лечение внутриутробных инфекций // Метод, рекоменд. для врачей-неонатологов / Под. ред. Володина Н.Н., Дегтярева Д.Н. М., 1998.

12. Долгих Т.Н., Черешнев В.А., Долгих Д.В., Гашина Е.А. Клинико-лабораторные аспекты цитомегаловирусной инфекции у детей раннего возраста // Педиатрия. -2001.-№5.-С. 43-46.

13. Долгих Т.Н. Клинико-лабораторные аспекты инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 2-го типа, у детей первого года жизни // Педиатрия. 2003. - № 3.1. С. 14-18.

14. Дурова А.А., Симакова Н.Г., Смирнова B.C. Этиология и патогенез внутриутробной инфекции // Акушерство и гинекология. 1995. - № 6. - С. 9-12.

15. Евсюкова И.И., Кошелева Н.Г., Башлякова М.М. Хламидийная инфекция в акушерстве и перинатологии. С-Петербург., 1995.

16. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая Школа, 1991.

17. Казанцев А.П. Токсоплазмоз. JL: Медицина, 1985. - 168 с.

18. Каражас Н.В. Цитомегаловирусная инфекция— типичный представитель оппортунистических инфекций // Рос. мед. Вести. 1997. - № 2. - С. 34-38.

19. Козлова J1.B., Иванян А.Н., Грибко Т.В. и др. Диагностика, профилактика и лечение внутриутробных инфекционных заболеваний. Смоленск, 1997.

20. Королева J1.M. Роль факторов гуморального иммунитета в развитии перинатальной патологии при беременности, осложненной генитальным хламидиозом // Росс, вестн. перинатол. педиатр. 2000. - № 5. - С. 15-19.

21. Краснопольский В.Г. Инфекция в акушерстве // Сборник научных трудов.- М., 1995.

22. Кудашов Н.И., Зубков В.В., Помелова В.Г., Ванько J1.B. Клинико-диагностическая характеристика пневмонии у новорожденных при герпетических инфекциях//Педиатрия.-2001. -№3.-С. 8-13.

23. Кузьмин В.Н. Влияние цитомегаловирусной инфекции на течение беременности и здоровье новорожденных // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. -2003. № 2. - С. 30-32.

24. Лобзин Ю.В. Токсоплазмоз человека: достижения, проблемы и перспективы // Инфекционные болезни. 2003. - № 1. - С. 52-57.

25. Манухин И.Б. Оптимизация тактики лечения беременных с рецидивирующей герпетической инфекцией и клинико-иммунологическая характеристика новорожденных // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2003. - № 1.-С. 36-39.

26. Марченко Jl.A. Materia Medica // Бюллетень для врачей и фармацевтов. 1996. - № 10.-С. 53-73.

27. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине 20го века. Выступление на научной сессии общего собрания РАН // Вестник российской академии наук. 2003. -№5.-С. 412.

28. Миронов В. JI. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород, 2004.

29. Михайличенко ВВ, Есипов АС. Дискуссия: диагностика и лечение хламидиоза // Terra Medica nova. 2000. - № 2. - С. 1-10.

30. Неонатология / под ред. Е.П.Сушко, В.И.Новикова, Л.М.Тупкова и др. Минск: Выш.шк., 1998.-416 с.

31. Никонов А.П., Асцатурова О.Р. Генитальный герпес и беременность // Акушерство и гинекология. 1997. -№ 1.- С. 11-13.

32. Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н. Значение различных вирусных инфекций в невынашивании, мертворождении, перинатальной и младенческой смерти // Педиатрия. 1999. -№ 1. - С. 1-10.

33. Нисевич Л.Л. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети // Вопросы современной педиатрии. 2002. - № 4. - С. 9-13.

34. Новые методы иммуноанализа / Под ред. W.P. Collins. М.: Мир, 1991. - 280 с.

35. Обрядина А.П., Чепурченко Н.В, Фриго Н.В., Никулин Н.К., Комарова В.Д Сифилис: лабораторная диагностика и материалы. Нижний Новгород, 2003.

36. Овсянников Д.Ю. Бронхолегочная дисплазия у детей // Педиатрия. 2004. - № 1. -С. 91-94.

37. Парфит Г., Рочестер К. Адсорбция из растворов на поверхностях твердых тел: Пер. с англ. / Под ред. В.И. Лыгина.- М.: Мир. 1986. - 488 с.

38. Патент РФ N 2133469 МПК 6 G 01N 33/553 Маркер для поверхностного блот-иммунологического и гибридизационного анализов на пористых носителях / Полтавченко А.Г., Серпинский О.И. // Бюл. изобретений. 1999. - № 20.

39. Патент РФ № 202129206 Изделие и способ для многопараметрическогоиммуноанализа сывороток / Полтавченко А.Г., Серпинский О.И., Карпышев H.II. // Бюл. изобретений. 2004. - № 35.

40. Петроченкова Н.А., Нефедова Н.К., Федоров Г.Н., Тихонов В.Г. Клинические особенности течения хламидийной инфекции у детей 1-го года жизни // Росс, педиатр, журнал. 2001. - № 3. - С. 49-50.

41. Покровский В.И., Позднев O.K. Медицинская микробиология. М., 1998. - с. 659667.

42. Полтавченко А.Г., Караваев B.C., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // ЖМЭИ. 1998.- № 2. -С. 108-111.

43. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах // Сибирь-Восток. 2002. - т. 9. - № 57. - С. 7-9.

44. Полтавченко А.Г., Рыбаков А. Н., Надточий О.И. Изучение гуморального иммунного ответа на белки р17, р41 и р47 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса //ЖМЭИ. 2004. - № 3. - С. 52-57.

45. Протоколы диагностики, лечения и профилактики внутриутробных инфекций у новорожденных детей. МЗ РФ, 2001. - 94 с.

46. Самсыгина Г.А., Буслаева Г.Н., Монхе П.С., Непокульчицкая Н.В. Гематологические и иммунологические показатели при внутриутробных инфекциях // Педиатрия. 1997. - № 4.- С. 59-62.

47. Семериков В.В., Лаврентьева И.Н., Таточенко В.К. Краснуха. Пермь - СПб -М., 2002.-175 с.

48. Серегин С.В., Белавин П.А., Бабкина И.Н., Максютов А.З., Вяткина Т.Г., Баранова С.Г. Получение рекомбинантных антигенов Treponema pallidum и их применение в иммуноферментной диагностике сифилиса // Вестник дерматол. и венерол. 2000. -№ 2. - С. 5-8.

49. Сидорова И.С. Внутриутробные инфекции: хламидиоз, микоплазмоз, герпес, цитомегалия / И.С. Сидорова, И.Н. Черниенко // Росс, вестн. перинатол. педиатр. -1998.-№3.-С. 7-13.

50. Скоупс Р.К. Методы очистки белков: Пер. с англ. М.: Мир. - 1985. - 358 с.

51. Скрипченко Н.В. Поражение нервной системы при врожденных инфекциях.

52. Методические рекомендации. СПб, 2003. - С. 5-7.

53. Суслопаров И. М., Плясунов И. В., Сафронов П. Ф., Бахтина М. М. Разработка и получение рекомбинантного антигена gD вируса простого герпеса 1-ГО типа (HSV-1) // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 2001.- № 2. - С. 34-37.

54. Технология лекарственных форм / Под ред. JI.A. Ивановой. М.: Медицина, 1991.т. 2.-201 с.

55. Цинзерлинг А.В. Значение инфекционных заболеваний плода и новорожденного в перинатальной патологии // Вопр. охр. мат. 1988. - № 4. - С. 34-38.

56. Цинзерлинг А. В. Современные инфекции. М., 1987.

57. Цинзерлинг А.В. Хламидиозы: диагностика, роль в патологии человека // Арх. патол.- 1989.- № 1.-С. 3-9.

58. Цинзерлинг А. В., Мельникова В.Ф. Перинатальные инфекции // Вопросы патогенеза, морфологической диагностики и клинико-морфологических сопоставлений: Руководство для врачей. СПб.: Элби - СПб, 2002. - 352 с.

59. Шабалов Н.П. Проблемы классификации внутриутробных инфекций // Педиатрия.- 2000. № 1.-С. 87-91.

60. Afanassiev, V., Hanemann, V., Wolfl, S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28.- № 12. -P. 1-5.

61. Alexandre I., Hamels S., Dufour S., Collet J., Zammatteo N., De Longueville F., Gala

62. J. L., Remacle J. Colorimetric Silver Detection of DNA Microarrays // Anal. Biochem.2001.-Vol. 295. -№i. P. 1-8.

63. Alford C.A. et al. Congenital and perinatal cytomegalovirus infection // Rev. Infect. Dis.- 1990. Vol. 12. - № 7. - P. 745 - 753.

64. Angenendt P, Glokler J, Murphy D, Lehrach H, Cahill D.J. Toward optimized antibody microarrays: a comparison of current microarray support materials // Anal. Biochem.2002. Vol. 309. - № 2. - P. 253-260.

65. Angenendt P. Progress in protein and antibody microarray technology // Drug Discov. Today. 2005. - Vol. 10. - № 7. - P. 503-511.

66. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., Voloshchuk S., Chupeeva V., Mirzabekov A. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Anal. Biochem. -2000.-Vol. 278.-№2.- P. 123-131.

67. Atreya C.D. Rubella virus and birth defects: molecular insights into the viral teratogenesis at the cellular level // Birth Defects Research (Part A): Clinical and Molecular Teratology. 2004. - Vol. 70. - P. 431-437.

68. Bacarese-Hamilton Т., Gray J., Ardizzoni, A., Frisanti A. Allergen microarrays // Methods Mol. Med. 2005. - Vol. 114.- P. 195-207.

69. Baker D.A. Herpes simplex virus infections // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 1992. -Vol. 4.-P. 676-681.

70. Beksac S. M. et al. Prenatal diagnosis of intrauterine cytomegalovirus infection in a fetus with non-immune hydrops fetalis // Am. J. Obstet. Gynecol. 2001. - Vol. 80. -P. 762-765.

71. Bhattacharya R., Bhattacharya D., Dhar Т.К. A novel signal amplification technology based on catalyzed reporter deposition and its application in a Dot-ELISA with ultra high sensitivity // Immunol. Meth. 1999. - Vol. 227. - P. 31-39.

72. Biagini R. et al. Method for simultaneous measurement of antibodies to 23 pnumococcal capsular polysaccharides // Clin. Diagn. Lab.Immunol. 2003. - Vol. 10.- P. 744-750.

73. Binnig G., Quate C.F., Gerber C. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. -Vol. 56. - № 9. p. 930-933.

74. Blackburn J.M., Hart D.J. Fabrication of protein function microarrays for systems-oriented proteomic analysis // Methods Mol. Biol. 2005. - Vol. 310. - P. 197-21.

75. Blanco D.R., Miller J.N., Lovett M.A. Surface antigens of the Syphilis Spirocheate and their potential as virulence determinants // Emery Infect Dis. -1997.- Vol. 3. № 1. - P. 1120.

76. Bobrow M.N., Shaughnessy K.J., Litt G.J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to membrane immunoassays // J. Immunol. Meth. -1991.-Vol. 137.-P. 103.

77. Bora U., Chugh L., Nahar P. Covalent immobilization of proteins onto photoactivatedpolystyrene mierotiter plates for enzyme-linked immunosorbent assay procedures // J. Immunol. Meth. 2002. - Vol. 268. - P. 171- 177.

78. Boyer S. G., Boyer К. M. Update on TORCH infections in the newborn infant // Newborn and Infant Nursing Reviews. 2004. - Vol. 4. - № 1. -P. 70-80.

79. Braeckmans K., De Smedt S.C., Leblans M., Pauwels R., Demeester J. Encoding microcarriers: present and future technologies // Nat. Rev. Drug Discov. 2002. - Vol. 1. -№6.-P. 447-456.

80. Cahill D. J. Protein and antibody arrays and their medical applications // J. Immunol. Meth.-2001.-Vol. 250.-P. 81-91.

81. Carrol S.G., Papaioannou S., Ntumazan L.L. // J. Obstet. Gynaec. 1996. - Vol. 103. -№ 1. - P. 54-59.

82. Castillo-Solorzano C. et al. New horizons in the control of rubella and prevention of congenital rubella syndrome in the Americas // J. Infect. Dis. 2003. - Vol. 187. - № 1. - P. 146-152.

83. Cha Т., Guo, A., Zhu X.Y. Enzymatic activity on a chip: the critical role of protein orientation // Proteomics. 2005. - Vol. 5. - № 2. - P. 416-419.

84. Chen G.Y., Uttamchandani M., Zhu Q. et al. Developing a strategy for activity-based detection of enzymes in a protein microarray // Chembiochemistry.- 2003 Vol. 4. - P. 336.

85. Chiari M., Cretich M., Corti A. et al. Peptide microarrays for the characterization of antigenic regions of human chromogranin A. // Proteomics. 2005. - Vol. 5. -№ 14. - P. 3600-3603.

86. Chu X., Xiang Z., Fu X. et al. Silver-enhanced colloidal gold metalloimmunoassay for Schistosoma japonicum antibody detection // J. Immunol. Meth. 2005. - Vol. 301. - P. 7788.

87. Clyne B. Jerrard D. A. Syphilis testing // Journal of Emergency Medicine. 2000. -Vol. 18.- № 3. - P. 361-367.

88. Cold J.C. Diagnosis disseminated toxoplasmosis // CM&R. - 2005. -Vol.3. - P. 186187.

89. Combaret V., Bergeron С., Brejon S. et al. Protein chip array profiling analysis of sera from neuroblastoma patients // Cancer Lett.- 2005. Vol. 228. - № 1. - P. 91-96.

90. Cretich M., Damin F., Pirri G., Chiari M. Protein and peptide arrays: Recent trends and new directions // Biomolecular Engineering. 2006. - Vol. 23. - P. 77-88.

91. Delehanty J.B., Ligler F.S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria //Anal. Chem. 2002. - Vol. 74. - P. 5681.

92. Dietrich H.R., Knoll J., van den Doel L.R. et al. Nanoarrays: a method for performing enzymatic assays // Anal. Chem. 2004. - Vol. 76. - № 14. - P. 4112-4117.

93. Dimmock J.E. Intrahepatic bile duct paucity and cytomegalovirus infection // Pediatr. Pathol. 1993. - Vol. 13. - P. 847-852.

94. Emond R.T.D. Color atlas of infectious disease. London: Mosby-Wolfe, 1995.-439 p.

95. Ekins R.P., Chu R., Biggart E. The development of microspot, multi-analitical radiometric immunoassay using dual fluorescentlabelled antibodies // Anal Chim Acta. -1990.-Vol. 227.-P. 73-96.

96. Ekins R.P., Chu F.W. Multianalitical microspot immunoassay-microanalytical "compact disk" of the future // Clin Chem. 1991. -Vol. 37. - P. 1955-67.

97. Ekins R. P. Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays // Clinical Chemistry. 1998. - Vol. 44. - P. 2015-2030.

98. Espina V., Woodhouse E.C., Wulfkuhle J. et al. Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies // J. Immunol. Meth. 2004. - Vol. 290. - P. 121133.

99. Esser P. Principles in Adsorption to Polystyrene // Nunc Laboratories. Bulletin №6 // www.nuncbrand.com.

100. Fall B.I., Eberlein-Konig В., Behrendt II. et al. Microarrays for the screening of allergenspecific IgE in human serum // Anal. Chem. 2003. - Vol. 75. - P. 556.

101. Figeys D. Adapting arrays and lab-on-a-chip technology for proteomics // Proteomics. -2002. Vol. 2. - P. 373.

102. Fowler K.B. Maternal immunity and prevention of congenital cytomegalovirus infection // JAMA. 2003. - Vol. 289. - P. 1008-1011.

103. Geho D., Lahar N., Gurnani P. et al. Pegylated, steptavidin-conjugated quantum dots are effective detection elements for reverse-phase protein microarrays // Bioconjug. Chem.2005. Vol. 16. - № 3. - p. 559-566.

104. Haab B.B., Dunham M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions // Genome Biol. -2001.-Vol .2.-№2-P. 4.

105. Hamelinck D., Zhou H„ Li L., Verweij C., Dillon D., Feng Z., Costa J., Haab B.B. Optimized normalization for antibody microarrays and application to serum-protein profiling // Mol. Cell. Proteom. 2005. - Vol. 4. - № 6. - P. 773-784.

106. Holgate C.S., Jackson P.I., Cowen P.N., Bird C.C. Immunogold silver staining: new method of immunostaining with enhanced sensitivity // J. Histochem. Cytochem. - 1983. -Vol. 31.-P. 938-944.

107. Hsu S.M., Soban E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry // J. Histochem. Cytochem. 1982. - Vol. 30. - P. 1079.

108. Huang R.P. Detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system //J. Immunol. Meth. 2001- Vol. 255. - P. 1-13.

109. Hueber W., Kidd B.A., Tomooka B.H. et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. 2005. - Vol. 52. - № 9. - P. 2645-2655.

110. Janzi M., Odling J., Pan-Hammarstrom Q. et al. Serum microarrays for large scale screening of protein levels // Mol. Cell. Proteomics. 2005. - Vol. 4. - № 12. - P. 1942— 1947.

111. Jauho E. S., Boas U., Wiuff C. et al. New technology for regiospecific covalent coupling of polysaccharide antigens in ELISA for serological detection // J. Immunol. Meth. 2000. - Vol. 242. - P. 133-143.

112. Johnsson В., Lofas S., Lindquis, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors//Anal. Biochem. -1991.-Vol. 198.-P. 268.

113. Jones V.W., Kenseth J.R., Porter M.D. et al. Microminiaturized immunoassays using atomic force microscopy and compositionally patterned antigen arrays // Anal. Chem. -1998.-Vol. 70.-P. 1233.

114. Kodadek T. Protein microarrays: prospects and problems // Chem. Biol. 2001. - № 8. -P. 105.

115. Kopf E., Shnitzer D., Zharhary D. Panorama Ab microarray cell signaling kit: a unique tool for protein expression analysis // Proteomics. 2005. - Vol. 5. - № 9. - P. 2412-2416.

116. Kukar Т., Eckenrode S., Gu Y. et al. Protein Microarrays to Detect Protein-Protein Interactions Using Red and Green Fluorescent Proteins // Analytical Biochemistry. 2002. -Vol.306. -№1.- P. 50-54.

117. Kusnezow W., Hoheisel J.D. Solid supports for microarray immunoassays // J. Mol. Recognit. 2003. - Vol. 16. - № 4. - P. 165-176.

118. Lee Y., Kang D.K., Chang S.I. et al. High-throughput screening of novel peptide inhibitors of an integrin receptor from the hexapeptide library by using a protein microarray chip // J. Biomol. Screen. 2004. - Vol. 9. - № 8. - P. 687-694.

119. Lee J.H., Hwang K.S., Park J. et al. Immunoassay of prostate-specific antigen (PSA) using resonant frequency shift of piezoelectric nanomechanical microcantilever // Biosens. Bioelectron. 2005. - Vol. 20. - № 10. - P. 2157-2162.

120. Lechtzier V., Hutoran M., Levy T. et al. Sodium dodecyl sulphate-treated proteins as ligands in ELISA. //J. Immunol. Meth. 2002. - Vol. 270. - P. 19-26.

121. Lesaicherre M., Uttamchandani M., Chen G., Yao S. Developing site-Specific immobilization strategies of peptides in a microarray // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2002. - Vol. 12. - № 16. - P. 2079-2083.

122. Lesaicherre M., Uttamchandani M., Chen G., Yao S. Antibody-Based fluorescence detection of kinase activity on a peptide array // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2002. - Vol. 12. - № 16. - P. 2085-2088.

123. Libro T.I., Domenech E., Gastro R. et all. // An. Esp. Pediat. (исп.) 1997. - P. 58-62.

124. Lynch L. Prenatal diagnosis of fetal cytomegalovirus infection // Am. J. Obstet. Gynecol. 1998. - Vol. 165. - P. 714-718.

125. Liotta L.A., Espina V., Mehta A.I. et al. Protein microarrays: meeting analytical challenges for clinical applications // Cancer Cell. 2003. - Vol. 3. - № 4. - P. 317-325.

126. Lyashchenko К. P., Singh M., Colangeli R., Gennaro M. L. A multi-antigen print immunoassay for the development of serological diagnosis of infectious diseases // J. Immunol. Meth. 2000. - V. 242. - P. 91-100.

127. Manavi K. A review on infection with Chlamydia trachomatis // Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 2006. - Vol. 20. - № 6. - P. 941-951

128. Marquette C.A., Thomas D., Degiuli A., Blum L.J., Design of luminescent biochips based on enzyme, antibody, or DNA composite layers // Anal. Bioanal. Chem. 2003. -Vol. 377. - № 5. - P. 922-928.

129. Miller J.C. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: antibody screening and identification of potential biomarkers // Proteomics. 2003. - Vol. 3. - P. 5663.

130. Moeremans M., Daneels G., Dijck D.V. et al. Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining // J. Immunol. Meth. 1984. - Vol. 74. - P. 353-360.

131. Nedeljkovic J., Jovanovic Т., Oker-Blom C. Maturation of IgG avidity to individual rubella virus structural proteins // Journal of Clinical Virology. 2001. - Vol. 22. - P. 4754.

132. Nielsen U., Geierstanger B. Multiplexed sandwich assays in microarray format // J. Immunol. Meth. 2004. - Vol. 290. - P. 107- 120.

133. Oladepo D.K., Klapper P.E., Marsden H.S. Peptide based enzyme-linked immunoassays for detection of anti-HSV-2 IgG in human sera // Journal of Virological Methods. 2000. - № 87. - P.63-70.

134. Opalka D. Simultaneous quantitation of antibodies to neutralizing epitopes on viruslike particles for human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18 by multiplexed Luminex assay // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - Vol. 10. - P. 108-115.

135. Pawley J.B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Plenum, New York, 1995.

136. Paweletz C.P., Charboneau L., Bichsel V.E., Simone N.L., Chen T. et al. Reversephase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front // Oncogene. 2001. - Vol. 20. - P. 1981.

137. Peluso P., Wilson D.S., Do D., Tran H., Venkatasubbaiah M. et al. Optimizing antibody immobilization strategies for the construction of protein microarrays // Anal. Biochem.-2003.-Vol. 312.-P. 113.

138. Ramachandran N., Larson D.N., Stark P.R., Hainsworth E., LaBaer J. Emerging tools for real-time label-free detection of interactions on functional protein microarrays // FEBS J.- 2005. Vol. 272. - № 21. - P. 5412-5425.

139. Robertson S.E., Featherstone D.A., Gacic-Dobo M., Hersh B.S. Rubella and congenital rubella syndrome: global update // Rev Panam Salud Publica. 2003. - Vol. 14. - № 5. - P. 306-315.

140. Ru-Qiang L., Cui-Yan Т., Kang-Cheng R. Colorimetric detection of protein microarrays based on nanogold probe coupled with silwer enhancement // J. Immunol. Meth. 2004. - Vol. 285. - P. 157-163.

141. Schweitzer В., Roberts S., Grimwade В., Shao W., Wang M. et al. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification // Nat. Biotechnol. 2002. - Vol. 20.- P. 359.

142. Schweitzer В., Predki P., Snyder M. Microarrays to characterize protein interactions on a whole-proteome scale // Proteomics. 2003. - Vol. 3. - № 11. - P. 2190-2199.

143. Shreffler W.G., Lencer D.A., Bardina L., Sampson H.A. IgE and IgG4 epitope mapping by microarray immunoassay reveals the diversity of immune response to the peanut allergen, Ara h 2 // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. - Vol. 116. - № 4. - P. 893899.

144. Signore C. Infectious diseases update: rubella // Prim Care Update Ob/Gyns. 2001. -Vol. 8. - P. 133-137.

145. Speer R., Wulfkuhle J.D., Lotta L.A., Petricoin 3rd, E.F. Reverse-phase proteinmicroarrays for tissue-based analysis // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. - Vol. 7. - № 3. - P. 240-245.

146. Tabatabai L.B. Developments in diagnostic technologies for bioterrorism agents // IVD Technology. July/August 2005.

147. Tannapfel A. Identification of novel proteins associated with hepatocellular carcinomas using protein microarrays // J. Pathol. 2003. - Vol. 201. - P. 238-249.

148. Taton T.A., Mirkin C.A., Letsinger R.L. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes // Science. 2000. - Vol. 289. - P. 1757- 1760.

149. Templin M.F., Stoll D., Schrenk M. et al. Protein microarray technology // Trends Biotechnol. 2002. - Vol. 20 - P. 160.

150. Templin M. Stoll D., Schrenk M. et al. Protein microarray technology. // Drug Discov. Today.-2002.-№7.-P. 815.

151. The International Congress on Toxoplasmosis // Preface International Journal for Parasitology. 2004. - № 34. - P. 249-252.

152. Tomizaki K.Y., Usui K., Mihara H. Protein-detecting microarrays: current accomplishments and requirements // Chembiochem. 2005. - Vol. 6. - № 5. - P. 782-799.

153. Venkatasubbarao, S. Microarrays status and prospects // Trends Biotechnol. - 2004. -Vol. 22.-№12.- p. 630-637.

154. Vivarelli R., Grosso S., Cioni M. et al. Pseudo-TORCH syndrome or Baraitser -Reardon syndrome: diagnostic criteria // Brain and Development. 2001. - Vol. 23. - № 1. -P. 18-23.

155. Weber В., Berger A., Rabenau H. Human cytomegalovirus infection: diagnostic potential of recombinant antigens for cytomegalovirus antibody detection // Journal of Virological Methods. 2001. - Vol. 96. - P.157-170.

156. Wicher K., Horowitz H. W., Wicher V. Laboratory methods of diagnosis of syphilis for the beginning of the third millennium // Microbes and Infection. 1999. - Vol. 1. - № 1. -P. 1035-1049

157. Wiese R., Belosludtsev Y., Powdrill Т., Hogan M. Simultaneous multianalytes ELISA performed on a microarray platform // Clin. Chem. 2001. - Vol. 47. - P. 1451.

158. Wilson D.S., Nock S. Recent developments in protein microarray technology // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003. - Vol. 42. - P. 494.

159. Wong, S.J. et al. Immunoassay targeting nonstructural protein 5 to differentiate West Nile virus from dengue and St Louis encephalitis virus infections and from Flavivirus vaccination // J. Clin.Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 4217-4223.

160. Witte K.L., Nock S. Recent applications of protein arrays in target identification and disease monitoring // Drug Discovery Today: Technology. 2004. - Vol. 1. - № 1. - P. 3540.

161. Zhi Z.L., Murakami Y., Morita Y. et al. Multianalyte immunoassay with self-assembled addressable microparticle array on a chip // Anal. Biochem. 2003. - Vol. 318. -№2.-P. 236-243.

162. Zhou X., Zhou J. Protein microarrays on hybrid polymeric thin films prepared by self-assembly of polyelectrolytes for multiple-protein immunoassays // Proteomics. 2006. -Vol. 6.-№5.- P. 1415-1426.

163. Zhu H., Klemic J.F., Chang S. et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips // Nat. Genet. 2000. - Vol. 26. - P. 283.

164. Zhu H., Snyder M. Protein chip technology // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. - Vol. 7. - № 1. - P. 55-63.

165. Zhu Q., Uttamchandani M., Li D., Lesaicherre M.L., Yao S.Q. Enzymatic profiling system in a small-molecule microarray // Org. Lett. 2003. - Vol. 5. - № 8. - P. 12571260.

Информация о работе

Яковченко, Анна Михайловна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка методологии многопрофильного выявления антител к возбудителям инфекционных заболеваний перинатального периода на основе белковых матриц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы