Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммуносенсоров для анализа гербицидов триазинового ряда и производных мочевины
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуносенсоров для анализа гербицидов триазинового ряда и производных мочевины"

На правах рукописи №

Плеханова Юлия Викторовна

□03462Э20

РАЗРАБОТКА ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕРБИЦИДОВ ТРИАЗИНОВОГО РЯДА И ПРОИЗВОДНЫХ МОЧЕВИНЫ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2009

003462920

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Решетилов Анатолий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Дыкман Лев Абрамович

доктор биологических наук, профессор Буданцев Аркадий Юстианович

Ведущая организация:

Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино

Защита состоится «¿£»МйД2009 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов,

13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте 1п1р://\¥\у\УлЬррт.5ага1оу.ги/оЬуау.(1!5.Ь1т1

Автореферат разослан «4% дрсфо/у)2009 ]

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук /" / ----------- В.Е.Никитина

ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Актуальность темы: Широкое применение гербицидов, относящихся к классам триазинов, сульфонилмочевин и фенилмочевин, обладающих различной степенью токсичности, длительным последействием, способностью аккумулироваться в окружающей среде, требует постоянного контроля за их содержанием в почве и растениях. В этой связи разработка высокочувствительных, экспрессных, селективпых и простых по конструкции аналитических устройств для определения этих соединений является актуальной задачей.

Одним из успешно развивающихся направлений анализа является разработка электрохимических иммуносенсоров. Электрохимические преобразователи способны регистрировать появление либо убыль электрохимически активного соединения, возникающего в результате взаимодействия иммунокомпонентов. Для этого вида аналитических устройств характерно сочетание высокой чувствительности и селективности, связанных с использованием иммунореагентов в качестве распознающих молекул, с несложной методикой подготовки и анализа образцов. Кроме того применение простой портативной регистрирующей аппаратуры позволяет использовать иммуносенсоры в небольших лабораториях и в полевых условиях.

Основные направления, по.которым ведется разработка иммуносенсоров: сокращение времени анализа, миниатюризация, прямое определение иммуноре-акции (без последовательного добавления иммунореагентов, без предварительной подготовки проб при анализе многокомпонентных образцов, таких как кровь, пища, сточные воды и т.д.). В качестве электрохимических преобразователей сигналов иммуносенсоров используют потепциометрические рН-чувствительные полевые транзисторы и амперометрические электроды, полученные трафаретной печатью (screen-printed electrodes). Интерес к этим видам преобразователей связан с рядом достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью. В данной работе основное внимание уделялось созданию иммуносенсоров на основе полевых транзисторов и электродов, полученных трафаретной печатью, для определения гербицидов, в которых быстрота анализа обуславливалась развитием экспрессных методик иммуноанализа при формировании рецепторного элемента сенсора и использованием методик, позволяющих избежать регенерации поверхности сенсора (сменные рецепторкые элементы; одноразовые сенсоры).

Большинство методов иммуноферментного анализа вюлочают стадии разделения иммунореагентов, а затем отмывки непрореагировавшнх иммунокомпо-нентов. Разработка методик, позволяющих избежать этих стадий, приводит к значительному сокращению продолжительности анализа.

Одним из широко распространенных методов анализа, не требующих этапов разделения, является поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), простой в исполнении и оперативный (для получения результата достаточно 2-5 мин). Довольно большое число веществ, представляющих интерес для служб экологического мониторинга или в исследовательской работе, рационально определять с помощью простого и быстрого поляризационного флуороиммуноана-

лиза, поэтому представлялось целесообразным сравнить этот метод с электрохимическим иммуносенсорным анализом.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось создание экспресс-методов анализа гербицидов на основе иммуносенсоров электрохимического типа. Для достижения поставленной цели в работе решали следующие задачи:

проведение скрининга мембранных носителей, ферментных меток и их субстратов для разработки иммуносенсоров на основе рН-чувствительного полевого транзистора и выбор оптимального сочетания указанных параметров;

разработка иммуносенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора для детекции гербицидов (использование стехиометриче-ских полиэлектролитных комплексов для экспресс-разделения иммуно-компонентов) на примере атразина и симазина (представители симм-триазинов);

разработка и оптимизация условий функционирования иммуносенсора для безразделительного анализа гербицидов с использованием трафаретных электродов на примере хлорсульфурона (представитель суль-фонилмочевин);

сравнительная оценка эффективности поляризационного флюороимму-ноанализа как альтернативного метода определения гербицидов на примере изопротурона (представитель класса фенилмочевин) и разработанных электрохимических методов; оптимизация реагентов и условий поляризационного флюороиммуноанализа изопротурона.

Научная новизна. Выполнена оценка диффузионной проницаемости протонов для ряда мембранных носителей (стекловолокно, нитроцеллюлозные и капроновые мембраны) и каталитической активности ферментных меток (пе-роксидаза хрена, глюкозооксидаза, уреаза), связанной с генерацией сигнала в иммуносенсорах на основе рН-чувствительного полевого транзистора. Впервые показана принципиальная возможность объединения методов иммунофермент-ного анализа на основе полиэлектролитных взаимодействий для разделения иммунокомпонентов с электрохимической детекцией ферментной метки рН-чувствительным полевым транзистором. Разработан потенциометрический им-муносенсор для детекции гербицидов симазина и атразина. Показана возможность расширения спектра определяемых соединений и применимость этого сенсора для определения другого класса веществ - гормона тестостерона. Разработана и оптимизирована аналитическая трехферментная система иммуноа-нализа гербицида хлорсульфурона.

Практическая значимость работы. Разработаны два типа иммуносенсоров с электрохимической детекцией сигнала для определения гербицидов симазина, атразина и хлорсульфурона. Наибольшей чувствительностью обладал сенсор на основе электродов, полученных трафаретной печатью (амперометрический преобразователь): нижний предел детекции хлорсульфурона таким иммуносен-сором составил 0,01 нг/мл. Иммуносенсор на основе нолевого транзистора (по-

тенциометрический преобразователь) был адаптирован также для определения гормона тестостерона (нижний предел определения составил 7 нг/мл).

Оптимизирована методика поляризационного флуороиммуноанализа гербицида изопротурона (нижний предел определения составил 6 нг/мл) и произведена оценка его эффективности как альтернативного метода определения гербицидов по сравнению с электрохимическими методами.

Получен патент на полезную модель "Иммуносенсор для определения сима-зина".

Разработанные иммуносенсоры можно рассматривать как прототипы для создания промышленных высокочувствительных и надежных биосенсорных систем для эффективного использования в биотехнологии, службах экологического мониторинга и медицине.

Осиовнме положения, иыноснмые на защиту.

Проведенное исследование ферментных меток и их субстратов, а также мембранных носителей позволяет определить оптимальное сочетание указанных параметров для разработки иммуносенсоров на основе рН-чувствительных транзисторов.

Использование полиэлектролитных комгшексов для разделения иммуноком-понентов, иммобилизация иммунокомпонентов на сменные мембранные носители и применение рН-чувствителыюго транзистора для детекции активности ферментной метки значительно сокращает время анализа гербицидов.

Оптимизация условий функционирования иммуносенсора на основе трех-ферментной системы анализа с помощью трафаретных электродов позволяет проводить определение гербицида без отделения образовавшихся иммуноком-плексов от несвязавшихся иммунореагентов.

Сравнительная оценка оптического и электрохимического методов анализа гербицидов показала, что электрохимические сенсоры являются более чувствительными, в то время как флуоресцентный анализ занимает меньше времени.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: V международном конгрессе по биосенсорам (Германия, 1998), Европейской конференции по тонким организованным пленкам (Германия, 1998), IV симпозиуме по биосенсорам и биологическим методам анализа окружающей среды (Испания, 1999), международной конференции "Биокатализ-2000" (Москва, 2000), всероссийской конференции "Сенсор 2000" (Санкт-Петербург, 2000); 8-й Европейской конференции по организованным пленкам (Италия, 2001); Юбилейном Х1-й Московском международном Салоне промышленной собственности «Архимед» (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ: из них 8 статей (в том числе 3 статьи в научных журналах из перечня, рекомендованного ВАК) и 7 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, 1 Методические рекомендации, 1 патент на полезную модель.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 194 ссылки, и приложения. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 64 рисунка.

Работа выполнена в лаборатории биосенсоров ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Результаты работы использованы при выполнении плановых НИР ИБФМ РАН по темам "Микробные и ферментные биосенсоры для экологического мониторинга" (№ Госрегистрации 01 20. 0403404) и "Биокаталитические сенсорные системы для экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов" (№ Госрегистрации 01 20. 0708223), а также при выполнении грантов INCO Copernicus, проект ICA2-CT-2000-10033 "Biosensor feed-back control of wastewater purification: photooxidation followed by biological degradation using highly active strains of surfactant degrading bacteria" и Федеральной Целевой Программы "Интеграция науки и высшего образования", проект № Л0145/1042 "Биосенсорный анализатор токсичных соединений".

Личный вклад. Соискатель принимал непосредственное участие в теоретических и экспериментальных исследованиях, анализе полученных результатов. Доля личного участия соискателя составляет не менее 80 %.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы даны современные представления об устройстве и классификации иммуносенсоров; уделено внимание оптическим методам анализа и, в частности, поляризационному флуоресцентному иммуноанализу; подробно рассматриваются электрохимические преобразователи сигналов иммуносенсоров (устройство, схемы измерения сигналов), в частности полевые транзисторы и электроды, полученные трафаретной печатью, а также представлены данные об известных моделях иммуносенсоров электрохимического типа для детекции гербицидов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и объекты исследования. В работе использовали глюкозоок-сидазу из Aspergillus niger (активность 150 ед/мг), пероксидазу хрена (активность 1100 ед/мг), уреазу из Canavalia ensiformis {Jack bean) (активность 5 ед/мг) (Sigma, США); стандартные образцы гербицидов разных классов (ВНИИ химических средств защиты растений, Москва), карбоксильные производные симазина, атразина, хлорсульфурона (синтезированы на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова; антисыворотки против атразина, симазина, тестостерона и хлорсульфурона (Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН); антитела против изопротурона (King's College University of London, UK). В экспериментах использовали хроматографическую стеклобумагу GF/A {Whatman), капроновую мембрану PALL (Pall, размер пор 0.45 мкм), и следующие типы нит-роцеллюлозных мембран (размер пор 0.45 мкм): Hybond-N, Hybond-N+, Ну-bond-C (Amersham, UK); Владипор (Полимерсинтез), Biodyne A, Biodyne С, Ultrabind (Pall-Gelman, США); MFS (Advantec, США); BIO-RAD (Bio-Rad, США); Millipore (Sigma, США, размер пор 0.22 мкм).

Иммобилизация ферментов. Иммобилизацию ферментов осуществляли методом физической сорбции. Для этого на фрагмент мембраны размером

3x3 мм наносили 50 мкл раствора фермента (с помощью фильтрующего устройства) и 5-7 минут подсушивали на воздухе.

Регистрация активности ферментов с помощью полевого транзистора. В работе использовали полевые транзисторы производства НПО "Позитрон", г. Санкт-Петербург. pH-чувствительным элементом сенсора являлся слой TajOj, сформированный на затворной области транзистора. Химическая чувствительность составляла 56 мВ/рН, дрейф выходного напряжения - 5-10 мВ/час. Измерения проводили в режиме фиксированного потенциала затвора. Ток стока для рабочего режима измерений задавали на линейном участке вольтамперной характеристики в пределах 200-700 мкА; сопротивление нагрузки было равно 1 кОм, питание стока составляло 2,0 В. Для определения количества иммобилизованного на мембране фермента, фрагмент мембраны помещали на рН-чувствитсльнуго область транзистора и закрепляли с помощью микрофиксатора. Измерения проводили в стеклянной кювете объемом 2 мл при 20°С и перемешивании (скорость перемешивания составляла 400 об/мин) в 1 мМ калий-фосфатном буфере, содержащем 0,015 М NaCl, pH 6,4. Детекция активности пероксидазы основывалась на изменении pH при пероксидазном окислении о-фенилендиамина в присутствии аскорбиновой кислоты и пероксида водорода; детекция активности глюкозооксидазы - на изменении pH в результате окисления глюкозы; детекция активности уреазы - на изменении pH в результате трансформации мочевины. Регистрируемым параметром являлась начальная скорость изменения pH затворной зоны транзистора.

Регистрация активности ферментов оптическим методом. Активность фермента определяли по интенсивности окрашенных пятен, сформированных па мембране в области иммобилизованного фермента продуктами ферментативной реакции. Для этого мембраны с иммобилизованной пероксидазой хрена помещали в субстратный раствор, содержащий тетрагидрохлорид 3,3'-диаминобензидипа, CoClj и Н2О2. Мембраны с иммобилизованной глюкозоок-сидазой помещали в субстратный раствор, содержащий D-глюкозу, конъюгат авидин-пероксидаза и 3,3'-диаминобензидин. Интенсивность окрашенных пятен, соответствующую количеству фермента на мембране, детектировали с помощью сканера ColorPage-CS (Genius, Taipei).

Оценка диффузионной проницаемости мембран. Фрагменты мембран помещали на затворную область транзистора, регистрировали базовый уровень сигнала, добавляли 0,1 М HCl и регистрировали параметр t90% (время достижения сигналом 90% от стационарного значения) и скорость изменения сигнала, коррелирующие со скоростью диффузии протонов в данном материале.

Иммуноанализ с полиэлектролнтным разделением иммунореагентов. В лунках иммунологического планшета смешивали пробу, конъюгат "гербицид-пероксидаза хрена", антисыворотку и конъюгат "белок А-полианион". Смесь инкубировали 15 мин, и с помощью специального микрофильтрационного устройства переносили на мембрану, содержащую сорбированный пояикатион. После промывки мембрану извлекали из устройства, фрагменты мембраны (3x3 мм) с сорбированными иммунокомпонентами помещали на затвор транзистора и детектировали активность метки как описано в пункте "Регистрация активности ферментов с помощью полевого транзистора".

Безразделительный иммуноанализ на основе электродов, полученных трафаретной печатью. В работе использовали электроды, полученные трафаретной печатью со встроенной в поверхность рабочего электрода пероксидазой хрена (Cambridge Life Scieces, Ely, UK). Измерения проводили в стеклянной ячейке объемом 1 мл при 20°С и постоянном перемешивании в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,0. Мембрану с иммобилизованными специфическими антителами помещали на поверхность электрода, который затем вставляли в измерительную ячейку и подавали на электрод потенциал +50 mV относительно электрода сравнения (Ag/AgCl). В ячейку вносили растворы хлорсульфурона и конъюгата "хлорсульфурон - глюкозооксидаза". После инкубации (10 мин) регистрировали базовую линию тока. Затем добавляли раствор глюкозы, содержащий каталазу, и регистрировали изменение тока. Процедуру повторяли при разных концентрациях хлорсульфурона, используя для каждого измерения свежую мембрану.

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА). В стеклянные кюветы вносили пробы, содержавшие определяемый гербицид, конъюгат "гербицид - флуоресцеин" и антисыворотку. Поляризацию флуоресценции измеряли на анализаторе TDx фирмы "Abbott".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Электрохимический иммуносенсор на оспове полиэлектролитных взаимодействий для определения гербицидов.

Для создания иммуносенсора был использован подход, основанный на применении водорастворимых полиэлектролитов для эффективного разделения прореагировавших и непрореагировавших иммунореагентов [Dzantiev et al., 1994]. Антитела, ковалентно связанные с молекулами полианионов (полиме-такриловая кислота), после проведения конкурентной иммунохимической реакции с нативным и меченным ферментом гербицидами в растворе фильтровали через мембрану, содержащую поликатионы (поли-М-винил-4-этилпиридиний). После отмывки полученную мембрану помещали на затвор транзистора и измеряли активность ферментной метки, связанной на мембране (схема анализа представлена на рис. 1). Разделение иммунореагентов происходит благодаря тому, что противоположно заряженные молекулы полиэлектролитов с высокой скоростью реагируют друг с другом, образуя нерастворимый комплекс, в который включены антитела с антигенами и ферментной меткой. Высокая скорость и избирательность взаимодействия между полимерами обеспечивает вытеснение неспецифически связавшихся молекул, благодаря чему снижается фоновый сигнал и уменьшается вероятность ошибочной диагностики. При этом все им-мунохимические стадии анализа идут в растворе, где уровень диффузионных ограничений существенно ниже, а затем проводится стадия разделения реагентов. Тем самым значительно сокращается продолжительность анализа (с 100120 до 20 мин).

В иммуноферментном анализе количество фермента-метки отражает содержание анализируемого соединения в системе. В этой связи выбор оптимального фермента-метки является актуальной задачей. Наибольшее распространение в гетерогенном иммуноферментном анализе получили пероксидаза хрена, ще-

лонная фосфагаза и Р-О-галактозидаза. В то же время в бносенсорах на основе р!{-чувствительных нолевых транзисторов в основном используют уреазу и глюкозооксидазу. Представлялось целесообразным сравнить каталитическую активность трех ферментов (пероксидазы хрена, уреазы и глюкозооксидазы), проявляющуюся в генерации ДрН и выбрать оптимальный фермент-метку для дальнейшего использования в иммуносенсорах на основе полевого транзистора.

Н-++±1

поликатион

МЕМБРАНА

промывка от " несвязавшихся компонентов

(3 антиген в пробе О—а меченый антиген —антитело

конъюгат: "белок А

II II II

1+ + ++11+ + + +1 МЕМБРАНА

- полианион

н ^ о « Д о я

:г и

Л ч

Мч О

а- с

м +

Е +

М +

Б 4-

Р +|

А +

Н +

А +

промывка от несвязавшихся компонентов

/ХП субстрат

фермента регистрация изме--> нения сигнала сенсора

--в-О-®

Рис. 1. Схема анализа с применением полиэлектролитных взаимодействий

Для представления характера процесса в целом, корректности конечных измерений и оптимизации условий работы сенсора провели регистрацию активности ферментов в гомогенных условиях, затем в гетерогенных условиях (при иммобилизации ферментов на разные типы мембран) и, наконец, перешли к измерению активности фермента, включенного в состав иммунокомплекса, иммобилизованного на мембране.

Анализ эффективности трансформации субстратов ферментов.

Биокаталитические трансформации субстратов, инициируемые ферментами, приводят к изменению рН на поверхности затвора транзистора путем потребления или генерации протонов. Эти изменения рН влияют на потенциал поверхности затвора и приводят к изменению тока стока транзистора. Таким образом, с помощью полевых транзисторов можно определять каталитическую активность ферментов.

Пероксидаза хрена. Низкая общая скорость пероксидазного окисления делает невозможным использование ряда субстратов для определения пероксидазы хрена на основе смещения рН. Однако лимитирующее влияние кинетического

фактора можно преодолеть при использовании пероксидазных субстратов-усилителей. Ранее было показано, что окисление аскорбиновой кислоты при участии о-фенилендиамина, используемого в качестве электронного медиатора, существенно повышается и сопровождается значительным сдвигом рН в щелочную область ¡Хомутов и др., 1995; Акнпепко е1 ак, 1996]. Поэтому в экспериментах использовали следующую субстратную смесь: о-фенилендиамин, аскорбиновая кислота, пероксид водорода. Были изучены зависимости сигналов транзистора от концентрации каждого субстрата смеси как в водных растворах фермента, так и при иммобилизации фермента на мембрану. На рис. 2, 3 показаны результаты, полученные при иммобилизации пероксидазы хрена на мембрану НуЪопй-'Ы (концентрация фермента на мембране составляла 3,3х10"5 ед./мм2).

1 - ' • ? Рис. 2. Зависимость сиг-

0 ' 1 | налов рН- чувствитель-

,'2\ »" . ного полевого транзи-

7 1,0] * г . . : I стора от концентрации

§• 0 х I . •;,• : ., . ■: I о-фенилендиамина и ас-

корбиновой кислоты. Концентрация перокси-1 ' »" | дазы на мембране Ну-

2 0,61 с;

® ..... .

К оа\ • в "'">10,00 ^ Ьопс1-Ы-3,3x10"5 ед./мм2,

0,0*'»..., . : ,. '1,00 ¿р? пероксида водорода в

,'о,ю кювете - Зх10~3 М

1,00

0,10 \ '

Для всех субстратных компонентов увеличение концентраций субстратов в кювете в диапазоне 10"4-10° М ведет к возрастанию сигнала сенсора. Для диапазона 10~ - 5х 100 М увеличение концентраций аскорбиновой кислоты и о-фенилендиамина приводит к снижению сигнала. В этом же диапазоне увеличение концентраций Н2Ог коррелирует с дальнейшим увеличением сигнала сенсора.

Полученные данные позволили определить состав субстратной смеси, при котором сигналы сенсора максимальные: о-фенилендиамин — 1 мМ, аскорбиновом кислота - 1 мМ; пероксид водорода - 3-5 мМ. Эта смесь использовалась для дальнейших исследований.

Уреаза и глюкозооксидаза. Уреаза разлагает мочевину до аммиака и углекислого газа. Эти два продукта изменяют рН в противоположных направлениях, но образование гидроксида аммония влияет на рН более сильно, чем образование угольной кислоты, в результате рН на поверхности затвора возрастает.

Биокаталитическое окисление глюкозы до глюкоповой кислоты с сопутствующим образованием пероксида водорода, освобождает протоны в раствор электролита, приводя к увеличению кислотности на поверхности затвора. На рис. 4 показаны зависимости сигналов сенсора на основе ферментов уреазы и глюко-зооксидазы от концентрации мочевины и глюкозы, соответственно. Концентрация уреазы на мембране МШроге составляла 2,5x10° ед./мм2, концентрация глюкозооксидазы - 0,03 ед./мм2. При высоких концентрациях субстрата скорость реакции максимальна, становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата. В этом случае реакция целиком определяется концентрацией фермента. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали следующие концентрации субстратов: 10"2 М мочевины, 5х10"2 М глюкозы.

10-5 Ю-4 Ю-3 101 10"' Концентрация пероксида водорода, М

Рис. 3. Зависимость сигналов сенсора от концентрации пероксида водорода. Концентрация пероксидазы на мембране НуЪопй-'И-3,3х10'5 ед./мм', аскорбиновой кислоты - 10"3 М, о-фениленди-амина- 103 М

10"5 10"4 Ю-3 10"2 10"' Концентрация субстрата, М

Рис. 4. Зависимости сигналов сенсора на основе ферментов уреазы (кривая 1) и глюкозооксидазы (кривая 2) от концентрации мочевины и глюкозы, соответственно

Сравнительная оценка каталитической активности ферментов - меток.

Сравнение ферментов (пероксидазы, глюкозооксидазы, уреазы) выполняли в водных растворах и при иммобилизации их на мембранные носители. В таблицах 1 и 2 показаны основные характеристики, полученпые для ферментов при использовании в качестве преобразователя рН-чувствитслыюго полевого транзистора.

Из трех исследованных ферментов с помощью полевого транзистора можно определить пероксидазу в растворе и пероксидазу, иммобилизованную на мембране, в более низких концентрациях, чем остальные ферменты. Пероксидаза хрена обеспечивает наибольшее, в сравнении с глюкозооксидазой и уреазой, изменение рН и максимальную начальную скорость реакции. Следовательно, использование пероксидазы хрена в качестве метки при создании иммуносен-соров на основе полевых транзисторов должно обеспечить наиболее чувствительную детекцию антигенов. Поэтому в дальнейшем при разработке сенсора

использовали пероксидазу хрена. Однако для получения максимального сдвига рН в случае пероксидазы, необходимо ввести в реакционную среду несколько субстратов, что неизбежно ведет к увеличению ошибки измерения. Уреаза является односубстратным ферментом, что делает ее привлекательным для имму-ноанализа. По своим характеристикам уреаза несколько хуже пероксидазы (минимальные определяемые концентрации с помощью транзистора - 0,12 ед./мл в растворе, 5x10"4 ед./мм2 и 7x10"4 ед./мм2 на мембранах МИИроге и НуЪопй, соответственно, в то время как у пероксидазы эти показатели следующие - 3x10"5 ед./мл, 1x10^ ед./мм2, 1,5x10"4 ед./мм2), но ее также можно рекомендовать для создания иммуносенсоров на основе рН-чувствительных полевых транзисторов.

Таблица 1. Минимальные определяемые количества ферментов в водных растворах с помощью полевого транзистора

Фермент Нижний предел определения, ед./мл (М) Линейный диапазон концентраций, ед./мл (М)

Пероксидаза хрена 3x10"5 (6,2x10"13) 4x10"5-0,05 (8,3x10"13 - 1x10"9)

Уреаза 0,12 (5х10"8) 0,3 - 2,4 (1,25x10"7 - 1х10"6)

Глюкозооксидаза 14 (5x10'7) 30- 1400(1х10_6-5х10"5)

Таблица 2. Минимальные определяемые количества ферментов в иммоби' лизованном состоянии с помощью полевого транзистора

Фермент Мембрана МИИроге Мембрана НуЬопЛ-/V

Нижний предел определения, ед./мм2 Линейный диапазон концентраций, ед./мм2 Нижний предел определения, ед./мм2 Линейный диапазон концентраций, ед./мм2

Пероксидаза хрена 1x10"4 (0,09 нг/мм2) 1,5x10"'-24x10"4 (0,14-2,18 нг/мм2) 1,5x1с"4 (0,14 нг/мм ) 1,5х10"4 - 50Х10"4 (0,14-4,55 нг/мм2)

Уреаза 5x10"4 (0,10 мкг/мм2) 7х10"4-53х10"4 (0,14-1,06 мкг/мм2) 7x10"4 (0,14 мкг/мм2) 7х10"4-53х10"4 (0,14- 1,06 мкг/мм2)

Глюкозооксидаза 0,04 (0,27 мкг/мм ) 0,3 - 2,5 (2-16,7 мкг/мм2) 0,04 (0,27 мкг/мм2) 0,08-1,2 (0,5 - 8 мкг/мм2)

Опенка диффузионной проницаемости разных типов мембран с помощью полевого транзистора.

Так как для проведения иммуноанализа иммунокомплексы иммобилизовали на мембране, необходимо было выбрать оптимальный тип мембран. Физико-химические параметры мембран: размер пор, структура, ионо-обменные и, в частности, протон-связывающие свойства — влияют на скорость диффузии субстратов ферментов и продуктов окисления субстратов иммобилизованным ферментом. В свою очередь, скорость диффузии определяет время сенсорного измерения. Таким образом, крайне важной является сравнительная характери-

стика диффузионной проницаемости различных мембран. Для измерения этой величины регистрировали сигналы транзистора, возникающие при скачкообразном изменении рН раствора. Полученные результаты представлены в табл. 3. Время ответа транзистора без мембраны не превышало нескольких секунд (начальная скорость изменения сигнала составляла 16,7 мВ/с).

Таблица 3. Диффузионные свойства мембран

\ <D D4 и q + 2 2

\ о со С « я -а с о .о GF/A 1 О J J •а й о х> -а с о

\ 1 2 га Я 03 Ос Я £

tüO,C 87 98 100 112 >200 230 250 >260 >260

Vo, мВ/с 1,35 0,96 1,10 0,77 0,27 0,30 0,46 0,19 0,19

По возрастанию диффузионной проницаемости (снижению t90%) мембраны располагаются в следующий ряд: Hybond-N - Hybond-N'г - PALL - BIO-RAD -GF/A - Hybond С - Владипор - MFS - Millipore. Время достижения 90% максимального ответа при использовании мембраны типа Millipore составляло 87 с. Мембрана типа Hybond оказалась более "медленной". Время от введения вещества до начала развития ответа было в несколько раз больше, чем при использовании мембраны типа Millipore (25 с и 6 с, соответственно), а 90 % максимального значения сигнала достигалось более чем через 260 с после введения кислоты.

Сравнили свойства мембран Millipore и Hybond-N с иммобилизованными ферментами по скорости развития сигнала транзистора после внесения субстрата фермента (концентрация перокидазы на мембране составляла 0,003 ед./мм2, уреазы - 0,006 ед./мм2, глюкозооксидазы - 0,2 ед./мм2). Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что мембраны с иммобилизованным ферментом обладают теми же свойствами, что и без фермента, т.е. мембрана типа Millipore более проницаема для вводимого вещества и обладает более быстрыми временами развития сигнала, что позволяет рекомендовать ее при работе с pH-чувствительным полевым транзистором.

Таблица 4. Начальные скорости сигналов полевого транзистора при иммобилизации ферментов на мембраны типа Millipore и Hybond-N

Фермент Millipore Hybond-N

Пероксидаза хрена 5,5 мВ/с (0.099 рН/с) 1.3 мВ/см (0,023 рН/с)

Глюкозоокидаза 0,20 мВ/с (3,6 мрН/с) 0,05 мВ/с (0,9 мрН/с)

Уреаза 2 мВ/с (0,036 рН/с) 1,3 мВ/с (0,023 рН/с)

Проведенное сравнение девяти типов мембран по диффузионной проницаемости позволяет рекомендовать в качестве предпочтительных при работе с полевым транзистором мембраны МПИроге, МРБ и Владипор. Они характеризуются наименьшими временами достижения максимума сигнала и обеспечивают быструю диффузию вводимых веществ к затворной области транзистора

и, следовательно, высокую начальную скорость ответа. Указанные факторы важны для уменьшения времени анализа.

Несмотря на то, что начальные скорости реакций для мембран МИИроге для всех ферментов выше, чем при использовании мембраны НуЬопё-Ы, необходимая для иммуноанализа плотность иммунокомпонентов создавалась только на мембране НуЬопй-^ (для сравнения — аналитические сигналы, получаемые от иммунокомплексов, иммобилизованных на мембранах типа МИИроге, не превышали 10% от сигналов, регистрируемых при использовании мембран НуЬопй-Ы). Поэтому в дальнейших экспериментах были использованы мембраны НуЬопс!-М.

Таким образом, для ферментных биосенсоров на основе полевых транзисторов можно рекомендовать мембрану МИИроге, а для иммуносенсорных систем с иммобилизацией антител и конкурентным связыванием низкомолекулярных антигенов - мембраны НуЬопс1-М.

Характеристика иммуносенсора для определения симазнна и атразина.

В качестве фермента-маркера использовали пероксидазу хрена, для получения максимального сигнала сенсора использовали оптимизированную субстратную смесь. Иммунокомплексы иммобилизовали на мембране НуЬоЫ-Ы. В качестве объектов исследования (антигенов) были выбраны представители класса симм-триазинов гербициды атразин (2-хлор-4-этиламино-б-изопропиламино-симм-триазин) и симазин (2-хлор-4,6-бис (этиламино)-симм-триазин).

Полученные калибровочные зависимости для детекции гербицидов представлены на рис. 5 и 6. Рабочие диапазоны количественного определения составили для атразина 0,2-100 нг/мл, для симазина 2,6 - 333 нг/мл. Коэффициенты вариации (отношение среднеквадратичного отклонения к среднеарифметическому) были равны 5 - 11% и 3 - 8% для симазина и атразина, соответственно.

U-

1,0

SQ6-

¡ 0.4

0 1 10 100 Концентрация сиквзиш, нг/мп Рис. 5. Калибровочная зависимость для определения симазина

1,0

О 33 03

сх

пГ 0,6

о

X <L> 0,4

с;

Е и o¿

и

0,0-

- шквоитрашилср -дзкикжкгрия

ч 100щ

80.

60 i

40,

20 "

0 О

0,0 0,1 1 10 100

Кжцэправдяагразина, ш/мп Рис. 6. Сравнение оптического и электрохимического методов детекции на примере атразина

Для оценки возможности более широкого аналитического применения данного метода была проанализирована возможность детекции другого класса

соединений на примере гормона тестостерона ((17бета)-17-гидроксиандрост-4-ен-3-он). Рабочий диапазон концентраций для тестостерона составил 3-300 нг/мл (рис. 7). Нижний предел детекции составил 7 нг/мл, коэффициент вариации был равен 3,5-10,0%.

Конца пращя тестостерона, нг/мд

Аналитическая процедура занимала 20-25 минут, а непосредственно электрохимические измерения одного образца не более 1-2 минут. Ранее для оценки содержания гербицида в образце с использованием этого подхода применяли оптический метод. Мы использовали этот метод в качестве контрольного. Измеряли оптическую плотность пятна на мембране, сформированного продуктами пероксидазного окисления диаминобензидина. Увеличение содержания антигена в образце и, следовательно, уменьшение концентрации фермента на мембране приводило к снижению оптической плотности. Пример зависимости оптической плотности и ответов иммуносенсора от концентрации атразина приведены на рис. 6. Коэффициент корреляции данных, полученных электрохимическим и стандартным оптическим методами определения, составил 0,98 (для тестостерона и симазина эта величина составила 0,96), что свидетельствует о возможности использования потенциометрической детекции активности ферментной метки в предлагаемом иммуносенсоре. Таким образом, впервые показана принципиальная возможность объединения твердофазных методов иммуноферментного анализа на основе полиэлектролитных взаимодействий для разделения иммунокомпонент с электрохимической детекцией ферментной метки рН-чувствительным полевым транзистором.

Так как биорецептор формировали отдельно, в отличие от традиционно применяемой иммобилизации иммунокомпонентов непосредственно на поверхности электрода, не требовалась химическая обработка поверхности транзистора для иммобилизации антител и последующая регенерация поверхности транзистора после анализа для диссоциации комплекса антиген-антитело. Кроме того, использование предварительно подготовленных мембран позволяет стандартизировать, упростить и сократить процедуру анализа.

По своим параметрам разработанный иммуносенсор не уступает другим известным моделям сенсоров (таблица 5). Подходы, использованные в работе, универсальны и позволяют при минимальном изменении параметров расширить спектр применения иммуносенсора. Результаты могут быть использованы

" 0,8

Рис. 7. Калибровочная зависимость для определения тестостерона с помощью иммуносенсора

для создания многоканальных сенсоров для определения нескольких веществ одновременно.

Таблица 5. Сравнительные характеристики иммуносенсоров

Герби- Предел Время Формат Метка Принцип Ссылка

цид детекции, н г/мл анализа, мни анализа детекции

атразин 1,0 15 (+под- конку- перок- амперо- Lopez et

готовка рентный сидаза метрия al., 1998

электрода около 16 ч)

атразин 1,0 12 конку- альбу- оптиче- Skladal

рентный мин скии et al., 1999

атразин 0,2 25 конку- перок- потен- Данная

рентный сидаза цномет-рия работа

симазин 1,25 50 (+ под- конку- перок- потен- Starodub

готовка рентный сидаза циомет- et al.,

электрода рия 2000

около 15 ч)

симазин 0,1 20 ингибиро-вание связывания оптический Harris et al., 1999

симазин 2,6 25 конку- перок- потен- Данная

рентный сидаза циомет-рия работа

Иммуносенсор для безразделитсльного анализа хлорсульфурона.

Необходимость в быстрых тест-системах для анализов on-site явилась причиной значительного интереса к электрохимическим иммуносенсорам, особенно из-за возможности реализовывать их как портативные автономные приборы для полу- и полностью автоматических измерений. Электроды, полученные трафаретной печатью, оказались очень перспективными для создания на их основе иммуносенсоров вследствие того, что техника их приготовления позволяет связывать метку или рецепторные молекулы непосредственно на чувствительном электроде, и, таким образом, увеличивать детектируемый сигнал, вызванный продуктами каталитической реакции.

Разработанный иммуносенсор основан на использовании биферментной системы [Keay, McNeil, 1998]: конъюгированная с антигеном глюкозооксидаза -иммобилизованная на электроде пероксидаза хрена (схема анализа показана на рис. 8). На поверхности электрода фиксируется мембрана с иммобилизованными антителами, специфически связывающими нативные молекулы определяемого антигена и конъюгат "антиген-глюкозоксидаза". Формирование вблизи поверхности электрода иммунных комплексов, содержащих глюкозооксидаз-

ную метку, приводит к пространственному сближению ферментов, катализирующих окисление глюкозы и трансформацию генерируемого пероксида водорода. Следствием этого сближения является усиление последовательных каталитических процессов. Введение в реакционную смесь каталазы позволяет детектировать активность связанного с мембраной фермента без учета влияния глюкозооксидазы в растворе (пероксид водорода, генерируемый в растворе, расщепляется каталазой, не успевая продиффундировать через мембрану к сенсорной поверхности). Тем самым становится возможным осуществлять анализ в безразделительном режиме, что сокращает его продолжительность и снижает трудоемкость. Данный подход был реализован для определения хлорсульфуроиа (№(4-метил-6-метокси-1,3,5-триазинил-2)-]Ч'-(2-хлорфенилсульфонил) мочевины), одного из представителей сульфомочевинных гербицидов.

основной ^^н2о2--к-талаз^н2о

РАСТВОР

их

• окс-у

У, I®' Ш&ЙКй С

ИХ иосст

■ ' ■ - ЭЛЕКТРОД

Рис. 8. Схема безразделительного анализа хлорсульфурона

Оценка чувствительности системы к пероксиду водорода. Поскольку непосредственным индуктором сигнала в предложенной системе являются молекулы Н202, было установлено, в каком диапазоне концентраций возможна их достоверная детекция. Типичные ответы электрода, полученного трафаретной печатью со встроенной пероксидазой хрена, на введение некоторых концентраций Н202 представлены на рис. 9.

Эти ответы можно охарактеризовать 2-мя параметрами: (1) максимальная скорость изменения тока ((31) и (2) абсолютное значение изменения тока между начальным и конечным уровнями (Д1). Оба параметра линейно зависят от концентрации Н202 в диапазоне ее концентраций 1-100 мкМ и хорошо коррелируют друг с другом. Коэффициент корреляции составляет 0,98. Это позволяет использовать их как взаимозаменяемые характеристики при анализе.

< а:

§-100-О

е-

щ-200-

-300-

Л-

— 1 мкМ " 5мкМ

ШмкМ

Рис. 9. Виды сигналов сенсора на введение различных концентраций пероксида водорода

50 мйМ

0

120 160

Вреш,с

Определение активности глюкозоксидазы с помощью электродов, полученных трафаретной печатью. Чтобы определить способ измерения активности глюкозооксидазной метки, были изучены ответы электрода на добавление нативной глюкозооксидазы (рис. 10). Сравнение ответов электрода на добавление Н2О7 и глюкозооксидазы показывает более медленную кинетику изменения тока для последней; сигнал не достигает стабильного уровня (не выходит па плато, как в случае с Н2О2, рис.9) за время проведения эксперимента. Максимальная скорость изменения тока удовлетворительно коррелирует с концентрацией добавленного фермента. Линейный диапазон концентраций составляет 0-5 нМ (коэффициент корреляции равен 0,95). строгий линейный диапазон наблюдался для концентраций от 0 до 1,2 нМ (коэффициент корреляции равен 0,99).

20 < О

<а-20

ч

°-40 ё-60

§100

»120 °-140 -160

0,325 нМ -&65нМ _у25нМ

^ 2,5 нМ "ч5,0 нМ

20

» 40 Время, с

60

Рис. 10. Виды сигналов сенсора на введение различных концентраций глюкозооксидазы (в кювете находится 1 % (в/о) раствор глюкозы)

Выбор матрицы для иммобилизации антител. Сравнили способности мембран (НуЬопс1-А!, ВШупе А, В'юбупе С, \Jltrabind) связывать конъюгаты "хлорсульфурон - глюкозооксидаза" после адсорбции на них антител к хлор-сульфурону. Концентрацию антител варьировали в диапазоне 0,01-200 нг/мл. Для дальнейшего иммуноанализа в качестве оптимальной матрицы для иммобилизации антител были выбраны мембраны Вюйупе А вследствие их высокой сорбционной емкости и широкого диапазона линейности между концентрацией добавленных антител и уровнем электрохимического сигнала. В этом диапазоне

практически отсутствует неспсцифичсское связывание иммунореагентов с носителем - прямая сорбция на мембрану, либо низкоаффинное взаимодействие с иммуноглобулинами, неспецифическими к данному антигену.

Оценка специфичности связывания конъюгатов хлорсульфурон — глю-козооксндаза и выбор концентрации антчтел. Сравнили ответы сенсора на добавление конъюгатов "хлорсульфурон - глюкозоксидаза" при различных концентрациях антител, специфичных и неспецифичных (из не иммунизированного кролика) к хлорсульфурону, иммобилизованных на мембране. Максимальное различие между уровнями специфического и неспецифического связывания достигалось при концентрации антител равной 1 нг/мл. Эта концентрация использовалась в дальнейших экспериментах.

Иммуноанализ хлорсульфуроиа. Концентрации иммунореагентов и длительность стадий анализа были выбраны, чтобы обеспечить максимальную чувствительность анализа (таблица 6).

Таблица 6. Характеристика анализа

Параметр Значение

количество антител, наносимое на мембрану 1 нг/мл

концентрация конъюгата гаптен - глюкозооксидаза 2,5 мкг/мл

концентрация глюкозы 7,5 мкг/мл

концентрация каталазы 0,5 мкг/мл

продолжительность иммунной реакции 10 мин

продолжительность измерений 1-2 мин

суммарная продолжительность анализа 15 мин.

Выбранные условия были использованы для получения калибровочной зависимости конкурентного определения хлорсульфуроиа с помощью разработанного иммуноанализа (рис. 10). Нижний предел детекции составил 0,01 нг/мл, коэффициент вариации был равен 2-9 %.

110

100 90

са

и

V

Рис. 10. Калибровочная зависимость для определения хлорсульфуроиа

0,00 0,01 од 1

Концентрация хлорсульфурона, нг/мл

Средняя продолжительность предложенного анализа составляет 15 мин. Так как основную часть этого времени занимает собственно иммунохимическая реакция, а электрохимические измерения занимают не более 2 мин, время анализа можно сократить, если тестировать несколько образцов одновременно. Для этого был использован блок из 10 ячеек. Одновременная инкубация иммунореа-

гентов в ячейках позволяет сократить общее время анализа. В то время как этапы анализа (приготовление образца + иммунореакция + процедура измерения) одной пробы занимают 15 мин, полное тестирование серии из 10 образцов может быть проведено менее, чем за 35 мин.

Полученные результаты расширяют возможности применения трафаретных электродов и могут быть полезны при создании многоканальной установки для одновременного определения нескольких гербицидов.

Поляризационный флуороиммуноанализ изопротурона.

Задачей исследования было оптимизировать поляризационный флуороиммуноанализ гербицида изопротурона (К7,К-Диметил-М'-(4-диметилфснил) мочевина), представителя группы гербицидов - производных фенилмочевины, и провести сравнительный анализ оптического метода и разработанных электрохимических иммуносенсорных методов.

В результате изучения связывания фракций различных антител (было протестировано 10 сывороток) и меченных флуоресцеином антигенов - трейсеров (было синтезировано и протестировано 6 трейсеров) для дальнейших исследований было выбрано оптимальное сочетание указанных реагентов. Связывание выбранного трейсера в зависимости от различных разведений сыворотки показано на рис. 11 кривая 2. Для сравнения показано связывание трейсера в зависимости от различных разведений сыворотки от неиммунизированной овцы (рис. 11, кривая 4).

Рис. 11. Кривые связывания трейсера с антителами против изопротурона (1 - трейсер с И(=0,95, 2 - трей-сер с К(=0,9) и нормальной неиммунной сывороткой овцы (3 - трейсер с И£=0,95, 4 - трейсер с Я(=0,9) в зависимости от их двукратного разбавления

100 1000 10000 Разведение антсыворотки

Дополнительная очистка трейсера методом тонкослойной хроматографии на пластине фирмы "Merck" позволила увеличить поляризацию флюоресценции па 67 % при разведении сыворотки в 2500 раз, на 80 % при разведении в 10000, а при разведении в 5000 даже на 90% (рис. И, кривая 1). В результате проведенной работы определены рабочие разведения иммунореагентов для проведения анализа - 1:2000 для трейсера и 1:5000 для сыворотки.

Полученная калибровочная кривая для определения изопротурона показана на рис. 12.

Минимальная определяемая концентрация изопротурона в образце составляла 6 нг/мл. Объем пробы образца для анализа составлял 50 мкл. Для оценки воспроизводимости результатов провели анализ 3-х контрольных образцов, со-

держащих 5, 50, 500 иг/мл изопротурона в 10 повториостях. Коэффициент вариации составил 1,3; 1,2; 1,5%, соответственно, что свидетельствует о высокой точности полученных результатов.

Рис. 12. Калибровочная зависимость для определения изопротурона

При изучении специфичности анализа были исследованы перекрестные реакции с различными гербицидами: представителями фенилмочевин (фенурон, дикуран, которая, хлорсульфурон) и анилидом пропионовой кислоты (пропа-нид). Значения перекрестных активностей перечисленных соединений не превысили 1 %. Таким образом, данные по специфичности анализа показывают, что предложенный метод и качество Ат позволяют достоверно определять изопро-турон в присутствии указанных гербицидов.

По своим характеристикам анализ не уступает стандартным методикам определения гербицидов (таблица 8). Использование анализатора TDx фирмы "Abbott" позволило выполнять анализ в автоматическом режиме, при этом время анализа 10 образцов занимало около 7 мин.

Таблица 8. Сравнительные характеристики методов определения гербицида изопротурона

Нижний предел определения Время анализа Объем пробы Принцип детекции Ссылка

0,12 мкг/л 25 мин 1 мл иммуноаффинная хроматография Katmeh et al., 1997

0,03 мкг/л примерно 10 ч 100 мкл ИФА на микропланшетах Katmeh et al„ 1994

1 нг/л 6 мин + предварительная твердофазная микроэкстракция - 1 ч 2 мкл газовая хроматография Gerecke et al., 2001

6 нг/мл 10 проб за 7 мин 50 мкл поляризация флюоресценции данная работа

Т-//.-1........................................

0 1 10 100 10Ю 10000

Кмвдпраци изопрспурош, нгЛил

Полученные данные н реактивы могут быть использованы в дальнейшем для создания иммуносенсоров на основе потенциометрических и амперометри-ческих преобразователей сигнала для определения изопротурона.

В целом, разработанный в рамках проведенных исследований иммуносен-сорный и флуороиммуноанализ обеспечивает высокую чувствительность и экс-прессность анализа гербицидов, что обуславливает перспективность их практического применения. Сравнительный анализ предложенных методов (таблица 9) показывает, что применение амперометрических преобразователей позволяет добиться наибольшей чувствительности анализа гербицидов, а применение ПФИА - значительного сокращения времени анализа, простоты и надежности определения гербицидов.

Предложенные подходы могут быть использованы для разработки иммуносенсоров и многоканальных систем детекции других гербицидов, а также соединений различной природы.

Таблица 9. Сравнительные характеристики разработанных методов иммуноанализа гербицидов

Характеристики метода Электрохимический нммуноана-.ии на основе полевого транзистора Электрохимический им- муноаналнз на основе электродов, полученных трафаретной печатью Поляризационный флуоро-иммуноаналпз

Атразип Симазин Хлорсульфурон Изопротурон

Ферментная метка Пероксидаза хрена Глюкозооксидаза Флуоресцеин

Субстрат о-фенилендиамин, аскорбиновая кислота. Н2О2 Глюкоза -

Мембрана для иммобилизации им-мунокомплексов НуЬопс1-К Вюс1упе А

Объем пробы, мкл 25 100 50

Формат анализа Конкурентный с полиэлектролитным разделением иммуно-реагентов Конкурентный без разделения иммунореагентов Конкурентный без разделения иммунореагентов

Схема детектирования Изменение потенциала Изменение тока Изменение оптических свойств

Рассчитываемый показатель Изменение потенциала электрода, которое определяется ДрН реакционной среды в ходе окисления субстрата ферментной меткой Изменение тока в результате восстановления ПХ, встроенной в электрод, после введения субстрата Изменение поляризации флуоресценции в результате иммунной реакции

Минимальная определяемая концентрация, нг/мл 0,1 1,7 0,01 6

Диапазон определяемых концентраций, нг/мл 0,2-100 2,6-333 0,01-1 6-10000

Коэффициент вариации, % 3-8 5-11 2-9 1-2

Время анализа, мин. 25 15 10 проб за 7 мин

выводы

1. Проведен сравнительный анализ протонной проницаемости ряда мембранных носителей, активности ферментных меток и эффективности субстратов для разработки иммуносенсоров на основе pH-чувствительных полевых транзисторов. Для систем с иммобилизацией антител и конкурентным связыванием низкомолекулярных антигенов выбраны нитроцеллюлозные мембраны (типа Hybond). Экспериментально показана высокая активность пероксидазы хрена, обеспечивающая нижний предел детекции на мембране, равный 1,5х 10"4 ед./мм2 в сравнении с уреазой (7Х10"4 ед./мм2) и глюкозооксидазой (0,04 ед./мм2), что позволяет использовать ее в качестве ферментной метки в имму-носенсорах на основе полевого транзистора.

2. Впервые показана принципиальная возможность применения методов иммуноферментного анализа на основе полиэлектролитных взаимодействий для разделения иммунокомпонентов и сменных мембран в иммуносенсорном анализе с помощью pH-чувствительного полевого транзистора, что позволило сократить время анализа в 2-3 раза по сравнению с традиционными схемами и избежать процедуры регенерации поверхности транзистора.

3. Разработан иммуносенсор для определения гербицидов симазина и атра-зина на основе рН-Чувствителыюго полевого транзистора. Рабочие диапазоны определения составили для атразина 0,2 - 100 нг/мл, для симазина 2,6 - 333 нг/мл при ошибке измерения, не превышающей 8% и 11% для атразина и симазина, соответственно. Полный цикл анализа занимает 20-25 мин. Показана возможность расширения спектра определяемых соединений и применение разработанного иммуносенсора для детекции гормона тестостерона (нижний предел определения составил 7 нг/мл).

4. Разработана и оптимизирована аналитическая трехферментная система, основанная на использовании глюкозооксидазы в качестве метки, пероксидазы, встроенной в поверхность рабочего электрода и каталазы, позволяющей осуществлять анализ в безразделительном режиме. Нижний предел детекции гербицида хлорсульфурона с помощью этой системы составил 0,01 нг/мл при продолжительности анализа 15 мин.

5. Сравнительная оценка эффективности электрохимических и оптического методов детекции показала, что поляризационный флуоресцентный иммуноа-нализ менее чувствителен, но занимает меньше времени по сравнению с электрохимическими методами. Оптимизированный поляризационный флуороим-муноанализ для определения изопротурона позволил получить нижний предел детекции антигена 6 нг/мл при объеме тестируемой пробы 50 мкл. Коэффициент вариации не превышал 1,5 %. Время анализа 10 образцов составляло 7 мин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шувалова Ю.В. (Плеханова), Жердев A.B., Языиина Е.В. Разработка метода биосенсорной иммунодетекции с использованием полиэлектролитных комплексов // Тезисы докладов. II открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино. - Пущиио, Россия, 1997. - С. 212-213.

2. Dzantiev В.13., Reshelilov A.N., Shuvalova Yu.V. (Plekhanova), Izumrudov V.A., Yazynina E.V., Zherdev A.V. Development of immunosensor for pesticide simaz-ine based on polyelectrolytes interaction // Refereed abstracts. The Fifth World Congress on Biosensors. - Berlin, Germany, 1998. - P. 387.

3. Eliseeva T.P., Shuvalova J.V. (Plekhanova), Izumrudov V.A., Dzantiev B.B., Zherdev A.V., Reshetilov A.N. Solid-phase FET-bascd immunoassay with separation of reactants by polyelectrolytes // Proceedings. European conference thin organised films. - Potsdam, Germany, 1998. - P. 439-440.

4. Dzantiev B.B., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Shuvalova J.V. (Plekhanova), Reshetilov A.N. Express immunotechniques for triazine herbicides detection // Abstracts. The Seventh Symposium on The Chemistry and Fate of Modern Pesticides. - Kansas, USA, 1999. - P. 93.

5. Dzantiev B.B., Reshetilov A.N., Zherdev A.V., Shuvalova J.V. (Plekhanova), Yazynina E.V. Pesticides detection using immunosensor based on FET and changeable carriers // Abstracts and Conference Program. Fourth Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis. - Mao, Spain, 1999.-P. 08.

6. Дзантиев Б.Б., Решетилов A.H., Жердев A.B., Шувалова Ю.В. (Плеханова), Борисов И.А., Язынина Е.В. Иммуносенсор с ферментативным усилением на основе полевого транзистора // В сборнике «Новости науки и техники», Выпуск «Аллергия, астма и клиническая иммунология», Серия Медицина. Xs9. Изд-во ВИНИТИ РАН. М., 1999. - С. 190-192.

7. Шувалова Ю.В. (Плеханова), Язынина Е.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Решетилов А.Н. Иммуносенсор для детекции атразина // Известия Тульского государственного университета. Серия Химия и электрофизикохимические воздействия на материалы. Тула. - 2000. - С. 82-86.

8. Shuvalova Yu.V. (Plekhanova), Reshetilov A.N. Comparison of activity of glucose oxidase, urease and horseradish peroxidase as enzyme labels of potentiomet-ric immunosensors // Abstracts. International conference BIOCATALYSIS: Fundamental and Application -2000. - Москва, Россия, 2000. - P. 153-154.

9. Шувалова Ю.В. (Плеханова), Решетилов А.Н., Язынина Е.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммуносенсорная детекция тестостерона // Тезисы докладов. Всероссийская конференция с международным участием Сенсор - 2000. -Санкт-Петербург, Россия, 2000. - С. 1-С-66.

10.Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Язынина Е.В., Решетилов А.Н., Шувалова Ю.В. (Плеханова), Коржук H.JL, Борисов В.А. Применение портативных электрохимических сенсоров в иммунодетекции антигенов: Методические рекомендации. Москва: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. - 2000. - 20 с.

11.Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Язынина Е.В., Решетилов А.Н., Шувалова Ю.В. (Плеханова), Борисов В.А., Коржук H.JI. Электрохимические иммуносенсо-ры с ферментативным усилением для количественного определения антигенов // Сб. «Новости науки и техники», Серия Медицина, вып. «Аллергия, астма и клиническая иммунология». №1. Изд-во ВИНИТИ РАН. М., 2001. -С. 186-189.

12.Шувалова Ю.В. (Плеханова), Елисеева Т.П., Решетилов А.Н., Язынина Е.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммуносенсорная детекция тестостерона с при-

менением быстрого разделения компонепт с помощью линейных полиэлектролитов // Микросистемная техника. - 2001. № 9. - С. 42-44. И.Лобанов A.B., Шувалова Ю.В. (Плеханова), Кувичкина Т.Н., Зырина Н.В., Китова А.Е., Макаренко A.A., Фесай А.П., Решетилов. А.Н. Биосенсоры для экологического контроля // Экологические системы и приборы. - 2001. №6. -С. 72-76.

Н.Плеханова Ю.В., Решетилов А.Н. Аналитические биосенсоры и их применение для определения токсичных соединений // Лабораторный журнал. -

2002. №2(2).-С. 62-70.

15.PIekhanova Yu.V., Reshetilov A.N., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. A New Assay Format for Electrochemical Immunosensors: Polyelectrolyte-Based Separation on Membrane Carriers Combined with Detection of Peroxidase Activity by pH-Sensitive Field-Effect Transistor // Biosensors & Bioelectronics. -

2003.-Vol. 19.-P. 109-114.

16.Dzantiev B.B., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Plekhanova Yu.V., Reshetilov A.N., Chang S.-C., McNeil C.J. Determination of the herbicide chlorsulfuron by amperometric sensor based on separation-free bienzyme immunoassay // Sensors and Actuators B. - 2004. Vol. 98, № 2-3. - P. 254-261.

17.Плеханова Ю.В., Решетилов A.H., Язынина E.B., Дзантиев Б.Б., Жердев A.B. Иммуносенсор для определения симазина. Патент па полезную модель № 67722, Россия. 2007. Бюл. №30.

Подписано в печать:

12.02.2009

Заказ № 1566 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типофафия «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плеханова, Юлия Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Устройство и классификация иммуносенсоров.

1.1. Принципы и виды иммуноанализа.

1.2. Устройство иммуносенсоров.

1.3. Классификация иммуносенсоров.

Г^лава 2. Электрохимические иммуносенсоры.

2.1. Полевые транзисторы как преобразователи иммуносенсоров.

2.1.1.Устройство полевого транзистора.;

2.1.2. Схемы измерения сигналов.

2.1.3. Иммуносенсоры на основе полевых транзисторов.

2.2. Амперометрические преобразователи иммуносенсоров.

2.2.1. Устройство и функционирование амперометрических сенсоров.

2.2.2. Иммуносенсоры на основе электродов, полученных трафаретной печатью.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуносенсоров для анализа гербицидов триазинового ряда и производных мочевины"

Широкое применение гербицидов, относящихся к классам триазинов, сульфонилмоче-вин и фенилмочевин, обладающих различной степенью токсичности, длительным после-дейс1вием, способностью аккумулироваться в окружающей среде, требует постоянного контроля за их содержанием в почве и растениях. В связи с этим разработка высокочувствительных, экспрессных, селективных и простых по конструкции аналитических устройств, таких как биосенсоры, для определения этих соединений является актуальной задачей.

По определению, приведенному в журнале "Biosensors & Bioelectronics", биосенсор является аналитическим устройством, содержащим биологический материал (ткани, клетки микроорганизмов, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, иммуноактивные компоненты, нуклеиновые кислоты и т.д.), находящийся в непосредственном контакте с физико-химическим преобразователем или преобразующей микросистемой, представленными оптическим, электрохимическим, термометрическим, пьезоэлектрическим или магнитометрическим устройствами. Преобразователь вырабатывает периодические либо непрерывные аналоговые/цифровые сигналы, которые пропорциональны концентрации одиночного или группы анализируемых соединений. Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела н др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем электрохимического, оптического или иного типа и после обработки данных представляется в численном виде. Биосенсорная техника сочетает высокую чувствительность с простой методикой подготовки и анализа образцов, что и обусловило ее интенсивное применение для детекции веществ и объектов различной природы.

Одним из уснешно развивающихся направлений анализа является разработка электрохимических иммуносенсоров [Богдановская, Тарассвич, 1997]. Иммуносенеоры являются классом биосенсоров, в которых роль биоспецифического компонента играет антиген или антитело [Aizawa, 1987; Morgan et al., 1996]. Для этого вида аналитических устройств характерны высокие чувствительность и селективность, связанные с использованием иммуно-реагентов в качестве распознающих молекул, а применение простой портативной регистрирующей аппаратуры позволяет использовать иммуносенеоры в небольших лабораториях и в полевых условиях.

Факторами, которые в настоящее время определяют перспективность разработки имму-носенсора для определения того или иного вещества, являются:

-наличие методов высокочувствительной детекции сигнала,

-малое влияние компонентов пробы на специфическое взаимодействие и индуцируемый им электрохимический процесс,

-экспрессность системы, в которой сведены к минимуму диффузионные затруднения, обусловленные гетерогенным характером взаимодействий на поверхности электрода.

Основные направления, по которым ведется разработка иммуносенсоров, это сокращение времени анализа, миниатюризация, прямое определение иммунореакции (без последовательного добавления иммунореагентов, без предварительной подготовки проб при анализе многокомпонентных образцов, таких как кровь, пища, сточные воды и т.д.). В качестве электрохимических преобразователей сигналов иммуносенсоров используют потенциомет-рические рН-чувствительные полевые транзисторы (ПТ) и амперометрические электроды, полученные трафаретной печатью (screen-printed electrodes, далее ЭТП). Интерес к этим видам преобразователей связан с рядом достоинств: миниатюрностью, возможностью размещать на одном кристалле полупроводника несколько электродов, сопряженных со схемой обработки сигнала, низкой себестоимостью. В рамках данной работы основное внимание уделялось созданию иммуносенсоров на основе ПТ и ЭТП для определения гербицидов, в которых быстрота анализа обуславливалась развитием экспрессных методик иммуноанапн-за при формировании рецепторного элемента сенсора и использованием методик, позволяющих избежать регенерации поверхности сенсора (сменные рецспторные элементы; одноразовые сенсоры).

Большинство методов иммуноферментного анализа включают стадии разделения иммунореагентов, а затем отмывки непрореагировавших иммунокомпонент. Анализ без отделения свободных антигенов (Аг) от связанных с антителами (Ат) позволяет значительно сократить время его проведения. Одним из широко распространенных методов анализа, не требующих шагов разделения, является поляризационный флуоресцентный иммупоанализ (ПФИА), методики которого просты, а для получения результата достаточно 2-5 минут. Довольно большое число веществ, представляющих интерес для служб экологического мониторинга или в исследовательской работе, рациональнее определять с помощью простого и быстрого ПФИА, поэтому представлялось целесообразным в рамках данной работы сравнить этот метод с электрохимическим иммуносенсорным анализом. Цель и задачи исследования.

Целью исследования являлось создание экспрессных методов анализа гербицидов на основе иммуносенсоров электрохимического типа. Для достижения поставленной цели в работе решали следующие задачи:

1. Проведение скрининга мембранных носителей, ферментных меток и их субстрагов для разработки иммуносенсоров на основе рН-чувствительного полевого транзистора и выбор оптимального сочетания указанных параметров;

2. Разработка иммуносенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора для детекции гербицидов (использование стехиомегрических полиэлектролитных комплексов для экспресс-разделения иммуиокомпонент) на примере атразина и симази-на (представители симм-триазинов);

3. Разработка и оптимизация условий функционирования иммуносенсора для безразделительного анализа гербицидов с использованием трафаретных электродов на примере хлорсульфурона (представитель сульфонилмочевин);

4. Сравнительная оценка эффективности поляризационного флюороиммуноанализа как альтернативного метода определения гербицидов на примере изопротурона (представитель класса фенилмочевин) и разработанных электрохимических методов; оптимизация реагентов и условий поляризационного флюороиммуноанализа изопротурона.

Научная новизна.

Выполнена оценка диффузионной проницаемости протонов для ряда мембранных носителей (стекловолокно, нитроцеллюлозные и капроновые мембраны) и каталитической активности ферментных меток (пероксидаза хрена, глюкозооксидаза, уреаза), связанной с генерацией сигнала в иммуносенсорах на основе рН-чувствительного полевого транзистора. Впервые показана принципиальная возможность объединения методов иммуноферментного анализа на основе полиэлектролитных взаимодействий для разделения иммуиокомпонент с электрохимической детекцией ферментной метки рН-чувствительным полевым транзистором. Разработан потенциометрический иммуносенсор для детекции гербицидов симазина и атразина. Показана возможность расширения спекгра определяемых соединений и применимость этого сенсора для определения другого класса веществ - гормона тестостерона. Разработана и оптимизирована аналитическая трехферментная система иммуноанализа гербицида хлорсульфурона. Практическая значимость работы.

Разработаны два типа иммуносенсоров с электрохимической детекцией сигнала. Условия функционирования сенсоров оптимизированы для определения гербицидов симазина, атразина и хлорсульфурона. Наибольшей чувствительностью обладал сенсор на основе электродов, полученных трафаретной печатью (амперометричсский преобразователь): нижний предел детекции таким иммуносенсором для хлорсульфурона составил 0,01 нг/мл. Иммуносенсор на основе полевого транзистора (потенциометрический преобразователь) был адаптирован также для определения гормона тестостерона (нижний предел определения составил 7 нг/мл).

Оптимизирована методика поляризационного флуороиммуноапализа гербицида изопро-турона (нижний предел определения составил 6 нг/мл) и произведена оценка его эффективности как альтернативного метода определения гербицидов по сравнению с электрохимическими методами.

Получен патент на полезную модель "Иммуносенсор для определения симазина".

Разработанные иммуносенсоры можно рассматривать как прототипы для создания промышленных высокочувствительных и надежных биосенсорных систем для эффективного использования в биотехнологии, службах экологического мониторинга и медицине. Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: V международном конгрессе по биосенсорам (Германия, 1998), Европейской конференции по тонким организованным пленкам (Германия. 1998; и Италия, 2001), IV симпозиуме по биосенсорам и биологическим методам анализа окружающей среды (Испания, 1999), международной конференции "Биокагализ-2000" (Москва, 2000), всероссийской конференции "Сенсор 2000" (Санкт-Петербург, 2000); 111 Международной молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва. 2007); Юбилейном Х1-й Московском международном Салоне промышленной собс I венности «Архимед» (Москва, 2008 г.). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 8 статей (в том числе 3 статьи в научных журналах из перечня, рекомендованного ВАК), 7 сообщений в тезисной форме. 1 Методические рекомендации, 1 патент на полезную модель. Структура и объем диссер гации.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 194 ссылки. Работа изложена па 132 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 64 рисунка, приложение.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Плеханова, Юлия Викторовна

выводы

1. Проведен сравнительный анализ протонной проницаемости ряда мембранных носителей, активности ферментных меток и эффективности субстратов для разработки иммуно-сенсоров на основе pH-чувствительных полевых транзисторов. Для систем с иммобилизацией антител и конкурентным связыванием низкомолекулярных антигенов выбраны нитро-целлюлозные мембраны (типа Hybond). Экспериментально показана высокая активность перок-сидазы хрена, обеспечивающая нижний предел детекции на мембране, равный 1,5 х104 ед./мм2 в сравнении с уреазой (7x10"4 ед./мм2) и глюкозооксидазой (0.04 ед./мм2), что позволяет использовать ее в качестве ферментной метки в иммуносенсорах на основе полевого транзистора.

2. Впервые показана принципиальная возможность применения методов иммунофер-ментного анализа на основе полиэлсктролитных взаимодействий для разделения иммуно-компонентов и сменных мембран в иммуносенсорном анализе с помощью рН-чувствительного полевого транзистора, что позволило сократить время анализа в 2-3 раза по сравнению с традиционными схемами и избежать процедуры регенерации поверхности транзистора.

3. Разработан иммуносепсор для определения гербицидов симазина и атразина на основе pH-чувствительного полевого транзистора. Рабочие диапазоны определения составили для атразина 0,2 - 100 нг/мл, для симазина 2,6 - 333 нг/мл при ошибке измерения, не превышающей 8% и 11% для атразина и симазина, соответственно. Полный цикл анализа занимает 20-25 мпн. Показана возможность расширения спектра определяемых соединений и применение разработанного иммуносепсора для детекции гормона тестостерона (нижний предел определения составил 7 нг/мл).

4. Разработана и оптимизирована аналитическая трехферментпая система, основанная на использовании глюкозооксидазы в качестве метки, пероксидазы. встроенной в поверхность рабочего электрода и каталазы, позволяющей осуществлять анализ в безразделительном режиме. Нижний предел детекции гербицида хлорсульфурона с помощью этой системы составил 0,01 нг/мл при продолжительности анализа 15 мин.

5. Сравнительная оценка эффективности электрохимических и оптического методов детекции показала, что поляризационный флуоресцентный иммуноанализ менее чувствителен, но занимает меньше времени по сравнению с электрохимическими методами. Оптимизированный поляризационный флуороиммуноанализ для определения изопротурона позволил получить нижний предел детекции антигена 6 нг/мл при объеме тестируемой пробы 50 мюг. Коэффициент вариации не превышал 1,5 %. Время анализа 10 образцов составляло 7 мин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных показал, что для определения гербицидов на сегодняшний день предложены различные типы иммуносенсоров, отличающиеся по принципу детектирования, используемой метке, аналитическим возможностям. Это связано с необходимостью решения в каждом отдельном случае определенных аналитических задач.

Иммуносенсоры позволяют решать сложные аналитические задачи достаточно просто и эффективно. Это обусловлено возможностью миниатюризации и автоматизации при значительном сокращения времени анализа (с нескольких часов до 10-40 минут) и упрощении аналитической процедуры (проведением анализа в одну стадию). Возможность снижения предела обнаружения, увеличение чувствительности анализа с помощью иммуносенсоров также повышают интерес к их разработке.

В результате экспериментов разработаны два иммуносенсора (один на основе потен-циометрического преобразователя сигналов, другой на основе амперометрического преобразователя) для детекции гербицидов. Параметры анализа и реагенты оптимизированы для проведения анализа симазина, атразина и хлорсульфурона. Такие сенсоры сочетают высокую чувствительность с простой методикой подготовки и анализа образцов. Кроме того, использование полиэлектролитных взаимодействий для разделения иммунокомнонент в одном и безразделительный анализ в другом, позволило сократить время анализа с нескольких часов (традиционные схемы) до 15-25 минут.

Использование сменных носителей позволило не только избегать длительных процедур иммобилизации иммунореагентов непосредственно на затворной области транзистора или трафаретного электрода и последующей регенерации поверхности после анализа, но и сократить время проведения анализа, так как иммунореагенты иммобилизуются на сменную мембрану отдельно от преобразователя и убираются сразу после анализа. Это делает возможность приготовления рецепторов заранее и в большом количестве, и размещения их на поверхность преобразователя только для регистрации активности ферментной метки, что занимает 2-3 минуты.

Было произведено сравнение ряда мембранных носителей (стекловолокно, нитроцеллю-лозные и капроновые мембраны) по диффузионной проницаемости в случае потенциомет-рического преобразователя и по способности связывать конъюгаты антиген-метка после адсорбции на них антител к антигену в случае амперометрического преобразователя, и осуществлен выбор оптимальной мембраны для иммобилизации иммунореагентов для обоих типов преобразователей.

Важным достоинством предложенных подходов является их универсальность, т.е. возможность применения разработанных сенсоров для определения не только гербицидов, но и соединений других классов без каких-либо изменений в методике анализа (продемонстрирована возможность определения гормона тестостерона потенциометрическим иммуносен-сором, разработанным для определения гербицидов). Это обусловлено сочетанием универсальных измерительных элементов со сменными мембранными носителями, па которых происходит формирование детектируемых иммунных комплексов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плеханова, Юлия Викторовна, Саратов

1. Aizawa М. 1.mimosensors for clinical analysis // Advances in clinical chemistry. -1994. V. 31.-P. 247-275.

2. Aizawa M. Immunosensors // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1987. V.316, № 1176. - P. 121-134.

3. Aizawa M., Tanaka M., Ikariyama Y., Shinohara H. Luminescence biosensors // J Bio-lumin Chemilumin. 1989. V. 4, № 1. - P. 535-542.

4. Arce L. Zougagh M., Arce C., Moreno A., Rios A., Valcarcel M. Self-assembled monolayer-based piezoelectric flow immunosensor for the determination of canine immunoglobulin // Biosensors & Bioelectronics. 2007. V. 22, № 12. - P. 3217-3223.

5. Baumncr A.J., Schmid R.D. Development of a new immunosensor lor pesticide detection: a disposable system with liposome-enhancement and amperometric detection // Biosensors & Bioelectronics. 1998. № 13. -P. 519- 529.

6. Berggren C., Johansson G. Capacitance measurements of antibody-antigen interactions in a flow system // Analytical Chemistry. 1997. V. 69, № 18. - P. 3651-3657.

7. Bcrgveld P. Development of an ion-sensitive solid-state dcvice for neurophysiological measurement // IEEE Trans.Biomed. Eng. 1970. V. 17, № 1. - P. 70-71.

8. Bergveld P. Exploiting the dynamic properties of FET-based chemical sensors // J. Phvs. E: Sci. Instrum. 1989a. V. 22, № 9. - P. 678-683.

9. Bergveld P. Sensors and Actuators, twente // Sensors and Actuators B. 1989b. V. 17, № 1-2.-P. 3-26.

10. Bcrgveld P. Thirty years of ISFETOLOGY. What happened in the past 30 years and what may happen in the next 30 years // Sensors and Actuators B. 2003. V. 88 - P. 1-20.

11. Berney H.C., Alderman J., Lane W.A., Collins J.K. Development of a capacitive immunosensor: a comparison of monoclonal and polyclonal capture antibodies as the primary layer//J Mol Recognit. 1998. V. 11,№ 1-6. - P. 175-177.

12. Berrada H., Font G./Molto J.C. Indirect analysis of urea herbicides from environmental water using solid-phase microextraction // Journal of Chromatography A. 2000. V. 890, №?.-P. 303-312.

13. Birnbaum S., Bulow L., Hardy K., Danielsson B., Mosbach K. Rapid automated analysis of human proinsulin produced by Escherichia coli II Analytical Biochemistry. 1986. V. 158.-P. 12-19.

14. Bizet K., Gabrielli C., Perrot H., Therasse J. Validation of antibody-based recognition by piezoelectric transducers through electroacoustic admittance analysis // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13, № 3-4. - P. 259-269.

15. Bluestein B.I., Walczak I.M., Chen S.Y. Fiber optic evanescent wave immunosensors for medical diagnostics // Trends Biotechnology. 1990. V. 8, № 6. - P. 161-168.

16. Burestedt E., Nistor C., Schagerlof U., Emneus J. An enzyme flow immunoassay that uses beta-galactosidase as the label and a cellobiose dehydrogenase biosensor as the label detector // Analytical Chemistry. 2000. V. 72. № 17. - P. 4171-4177.

17. Bush D.L. Rechnitz G.A. Monoclonal antibody biosensor for antigen monitoring // Analytical Letters. 1987. V. 20, № 11.-P. 1781-1790.

18. Caras S.D., Janata J., Saupe D., Schmitt K. pH based enzyme potentiometric sensors. Part 1. Theory // Analytical Chemistry. 1985. V. 57. - P. 1917-1920.

19. Carlson M.A., Bargeron C.B., Benson R.C., Fraser A.B., Phillips T.E., Velky J.T., Groopman J.D., Strickland P.T., Ko H.W. An automated, handheld biosensor for afla-toxin//Biosensors & Bioelectronics. -2000. V. 14, № 10-11.-P. 841-848.

20. Chiron S., Barcelo D. Determination of pesticides in drinking water by on-line solidphase disk extraction followed by various liquid chromatographic systems // Journal of Chromatography. 1993. V. 645, № 1. - P. 125-134.

21. Clark L.C., Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery // Ann. N. Y. Acad. ScL. 1962. V. 102. - P. 29-45.

22. Colapicchioni C., Barbara A., Porcelli F., Giannini I. Immunoenzymatic Assay Using CHEMFET Devices // Sensors and Actuators B. 1991. V. 4. - P. 245-250.

23. Dandliker W.B., Halber S.P., Schapiro H.C. Study of penicillin antibodies by fluorescence polarisation and immunodiffusion // J. Exp. Med. — 1965. V. 122. P. 10291048.

24. Daneshvar M.I., Peralta J.M., Casay G.A., Narayanan N. Evans L., Patonay G., Stre-kowski L. Detection of biomolecules in the near-infrared spectral region via a fiber-optic immunosensor//J Immunol Methods. 1999. V. 226, № 1-2. - P. 119-128.

25. Danielsson B., Lundstrom I., Wmquist F., Mosbach K. On a new enzyme transducer combination: the enzyme transistor // Analytical Letters. 1979. V. B12. - P. 1189-1 199.

26. Devine P.J., Anis N.A., Wright J. Kim S., Eldefrawi A.T., Eldefrawi M.E. A fiber-optic cocaine biosensor//Analytical Biochemistry. 1995. V. 227, № 1. - P. 216-224.

27. Dill K., Bearden D.W. Detection of human asialo-alpha(l)-acid glycoprotein using a heterosandwich immunoassay in conjunction with the light addressable potentiometric sensor // Glycoconj J. 1996. V. 13, № 4. - P. 637-641.

28. Dock E., Lindgren A., Ruzgas T., Gorton Lo. Effect of interfering substances on current response of recombinant peroxidase and glucose oxidase-recombinant peroxidase modified graphite electrodes // Analyst. 2001. V. 126. - P. 1929-1935.

29. Dommarco R. Santilio A., Fornarelli L., Rubbiani M. Simultaneous quantitative determination of thirteen urea pesticides at sub-ppb levels on a Zorbax SB-C18 column 11 Journal of Chromatography A. 1998. V. 825, № 2. - P. 200-204.

30. Dost K., Jones D.C., Aucrbach R., Davidson G. Determination of pesticides in soil samples by supercritical fluid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection// Analyst. -2000. V. 125, № 10.-P. 1751-1755.

31. Duan, C., Meyerhoff, M.E., Separation-free sandwich enzyme immunoassays using mi-croporous gold electrodes and self-assembled monolayer/immobilized capture antibodies // Analytical Chemistry. 1994. V. 66. № 9. - P. 1369-1377.

32. Dzantiev B.B., Choi M.J., Park J., Choi J., Romanenko O.G., Zherdev A.V., Eremin S.A., Izumrudov V.A. A new visual enzyme immunoassay of methamphetamine using linear water-soluble polyelectrolytes // Immunol. Lett. 1994. V. 41, № 2-3. — P. 205211.

33. Dzantiev B.B., Zherdev A.V., Romanenko O.G., Sapegova L.A. Development and comparative study of different immunoenzymc techniques for pesticides detection // Int. J. Envir. Anal. Chem. 1996. V. 65, № 1-4. - P. 95-111.

34. Engel L., Baumann W. Direct potentiometric immunoelectrodes. IV. An immunoelec-trode for the trace level determination of Atrazine by separated incubation and potential measurement steps // Fresenius J. Anal. Chem. 1994. V. 349. - P. 447-450.

35. Eremin S.A. Fluorescence Polarisation Immunoassay for Determination of Pesticides and Biologically Active Compounds in Food Safety and Environmental Monitoring // Food technol. biotechnol. 1998. V. 36, № 3. - P. 235-243.

36. Eremin S.A., Landon J., Smith D.S., Jackman R. Development of a Polarization Fluoro-immunoassay for Sulfamethazine Using an Automated Analyser // Analyst. 1994. V. 119.-P. 2723-2726.

37. Fernandez Romero J. M., Stienc M., Kast R., Luque de Castro M.D., Bilitewski U. Ap- , plication of screen-printed electrodes as transducers in affinity flow-through sensor systems // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13, № 10. - P. 1107-1115.

38. Ghindilis A.L., Skorobogat'ko O.V., Gavrilova V.P., Yaropolov A.I. A new approach to the construction of potentiometric immunosensors // Biosensors & Bioelectronics. -1992. V. 7,№4.-P. 301-304.

39. Gizeli E., Lowe C.R. Immunosensors // Clin. Chem. 1996. V. 42. - P. 193-209.

40. Gorovits B.M. Osipov A.P., Doseeva V.V., Egorov A.M. New enzyme immunoassay with visual detection based on membrane photoimmobilized antibodies // Analytical Letters. 1991. V. 24, № 11. - P. 1937-1966.

41. Gotoh M., Suzuki M., Kubo I., Tamiya E., Karube I. Immuno-FET sensor // Journal of Molecular Catalysis. 1989. V. 53. - P. 285 - 292.

42. Guilbault G.G., Hock B., Schmid R. A piezoelectric immunobiosensor for atrazine in drinking water // Biosensors & Bioelectronics. 1992. V. 7, № 6. - P. 411-419.

43. Halamek J., Hepel M., Skladal P. Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid // Biosensors & Bioelectronics. 2001. V. 16, №4-5,-P. 253-260.

44. Hanbury C.M., Miller W.G., Harris R.B Fiber-optic immunosensor for measurement of myoglobin// Clin. Chem. 1997. V. 43, № 11. - P. 2128-2136.

45. Harris R.D., Luff B.J., Wilkinson J.S., Piehler J., Brecht A., Gauglitz G., Abuknesha R. A. Integrated optical surface plasmon resonance immunoprobe for simazine detection // Biosensors & Bioelectronics. 1999. V. 14, № 4. - P. 377-386.

46. Harsanyi G. Sensors in Biomedical Applications. Fundamentals, Technology and Applications. USA, Pennsylvania, Lancaster: Technomic Publishing Company. 2000. — 350 pp.

47. Hillier S.G., Brownsey B.G., Cameron E.H.D. Some observations on the determination of testosterone in human plasma by radioimmunoassay using antisera raised against tes-tosterone-3-BSA and testosterone-11-BSA // Steroids. 1973. V. 21, №5. - P. 735-754.

48. Howell J. O., Wightman R. M. Ultrafast voltammetry and voltammetry in highly resistive solutions with micro voltammetric electrodes // Analytical Chemistry. — 1984. V. 56. — P. 524-529.

49. Ivnitski D., Rishpon J. A one-step, separation-free amperometric enzyme immunosensor // Biosensors & Bioelectronics. 1996. V. 11, № 4. - P. 409-417.

50. Ivnitski, D., Abdel-Hamid, I., Atanasov, P., Wilkins, E. Biosensors for detection of pathogenic bacteria // Biosensors & Bioeletronics. 1999. V. 14. — P. 599-624.

51. Janata J. An immunoelectrode // J. Amer. Chem. Soc. 1975. V. 97. - P. 2914-2916.

52. Jin G., Tengvall P., Lundstrom L, Arwin H. A biosensor concept based on imaging ellip-sometry for visualization of biomolecular interactions // Analytical Biochemistry. 1995. V. 232, № l.-P. 69-72.

53. Kalab T., Skladal P. Disposable multichannel immunosensors for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using acetylcholinesterase as an enzyme label // Electroana-lysis. 1997. V. 9, № 4. - P. 293-297.

54. Karube I., Suzuki M. Novel Immunosensors // Biosensors. 1986. № 2. P. 343-362.

55. Katmeh M.F., Aherne G.W., Stevenson D. Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Determination of the Phenylurea Herbicide Chlortoluron in Water and Biological Fluids // Analyst. 1996. V. 121. - P. 1699-1703.

56. Katmeh M.F., Frost G., Aherne W., Stevenson D. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for isoproturon in water // Analyst. 1994. V. 119, № 3. - P. 431435.

57. Katmeh M.F., Godfrey A.J.M., Stevenson D., Aherne G.W. Enzyme Immunoafiinity Chromatography A Rapid Semi-quantitative Immunoassay Technique for Screening the Presence of Isoproturon in Water Samples // Analyst. - 1997. V. 122. - P. 481-486.

58. Keating M.Y., Rechnitz G.A. Potentiometric digoxin antibody measurements with anti-gen-ionophore based membrane electrodes // Analytical Chemistry. 1984. V. 56. — P. 801-806.

59. Kcay R.W., McNeil C.J. Separation-free electrochemical immunosensor for rapid determination of atrazine // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13, № 9. - P. 963-970.

60. Kelley M.M., Zahnow E.W., Petersen W.C., Toy S.T. Chlorsulfuron determination in soil extracts by enzyme immunoassay // J. Agric. Food Chem. — 1985. V. 33, № 5. — P. 962-965.

61. Kelly R.J. Digital photon evaluating fluorescence polarimcter // Analytical Chemistry. -1976. V. 48.-P. 846-850.

62. Kharitonov A.B., Zayats M., Lichtenstein A., Katz E., Willner I. Enzyme monolayer-functionalized field-effect transistors for biosensor applications // Sensors and Actuators B. 2000. V. 70. P. - 222-231.

63. Khomutov S.M., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Reshetilov A.N. Immunodetection of herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by field-effect transistor-based biosensors // Analytical Letters. 1994. V. 27, № 15. - P. 2983-2995.

64. Killard A.J., Deasy B., O'Kennedy R., Smyth M.R. Antibodies: production, functions and applications in biosensors // Trends in analytical chemistry. 1995. V. 14, № 6. - P. 257266.

65. Knopp D. Nuhn P., Dobberkau H.J. Radioimmunoassay for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid // Arch Toxicol. 1985. V. 58, № 1. - P. 27-32.

66. Koncki R., Owczarek A., Dzwolak W., Glab S. Immunoenzymatic sensitisation of membrane ion-selective electrodes // Sensors and Actuators B. 1998. V. 47. - P. 246-250.

67. Kosslinger C., Drost S., Aberl F., Wolf H., Koch S. Woias P. A quartz crystal biosensor for measurement in liquids // Biosensors & Bioelectronics. — 1992. V. 7, № 6. P. 397404.

68. Kovach P.M., Caudill W.L., Peters D.G., Wightman R.M. Faradaic electrochemistry at microcylinder, band and tubular band electrodes // J. Electroanal. Chem. 985. V. 185. -P. 285-295.

69. Kroger S, Setford S.J., Turner A.P. Immunosensor for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in aqueous/organic solvent soil extracts // Analytical Chemistry. 1998. V. 70, № 23. -P. 5047-5053.

70. Kroger S., Turner A.P., Mosbach K., Haupt K. Imprinted polymer-based sensor system for herbicides using differential-pulse voltammetry on screen-printed electrodes // Analytical Chemistry. 1999. V. 71, № 17. - P. 3698-3702.

71. Krynitsky A.J., Determination of sulfonylurea herbicides in water by capillary electrophoresis and by liquid chromatography/mass spectrometry // J. AO AC Int. — 1997. V. 80.1. P. 392-400.

72. Lee N., Skerritt J.H., Thomas M., Korth W., Bowmer K.H., Larkin K.A., Ferguson B.S. Quantification of the Urea Herbicide, Diuron, in Water by Enzyme Immunoassay // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1995. V. 55. - P. 487-493.

73. Liron Z., Tender L.M., Golden J.P., Ligler F.S. Voltage-induced inhibition of antigen-antibody binding at conducting optical waveguides // Biosensors & Bioelectronics. -2002. V. 17. № 6-7. P. 489-494.

74. Long A.R., Hsieh L.C., Malbrough M.S., Short C.R., Barker S.A. Isolation and gas chromatographic determination of chlorsulfuron in milk // J Assoc Off Anal Chem. 1989. V. 72,№5.-P. 813-815.

75. Lopez M.A., Ortega F., Dominguez E. & Katakis I. Electrochemical immunosensor for the detection of atrazine // J Mol Recognit. 1998. V. 11. - P. 178-181.

76. Lukosz W., Clerc D., Nellen P.M., Stamm C., Weiss P. Output grating couplers on planar optical waveguides as direct immunosensors // Biosensors & Bioelectronics. 1991. V. 6, № 3. — P. 227-232.

77. Mallat E., Barcelo D., Barzen C., Gauglitz G., Abuknesha R. Immunosensors for pesticide determination in natural waters // Trends in analytical chemistry. 2001a. V. 20, № 3.1. P. 124-132.

78. Mallat E., Barzen C., Abuknesha R., Gauglitz G. Barcelo D. Part per trillion level determination of isoproturon in certified and estuarine water samples with a direct optical immunosensor // Analytica Chimica Acta. 20016. V. 426. P. 209-216.

79. Marco M.-P., Gee Sh., Hammock B.D. Immunochemical techniques for environmental analysis. 1. Immunosensors // Trends in analytical chemistry. — 1995. V.14, № 7. P. 341-350.

80. Martin-Esteban A., Fernandez P., Stevenson D., Camara C. Mixed immunosorbent for selective on-line trace enrichment and liquid chromatography of phenylurea herbicides in environmental waters // Analyst. 1997. V. 122, № 10. - P. 1113-1117.

81. McGregor A.R., Crookall-Greenong J.O., Smith D.S. Polarisation fluoroimmunoassay of phenytoin// Clin. Chim. Acta. 1978. V. 83. - P. 161-166.

82. McNeil C.J., Athey D., Renneberg R. Immunosensors for clinical diagnostics // In: Frontiers in Biosesorics. II. Practical Applications. Ed. by Scheller F.W., Schubert F., FedrowitzJ. Switzerland: Birkhauser VerlagBasel, 1997.-P. 17-25.

83. Mecklenburg M., Linbladh C., Li H., Mosbach K., Danielsson B. Enzymatic amplification of a flow-injected thermometric enzyme-linked immunoassay for human insulin // Analytical Biochemistry. 1993. V. 212. - P. 388-393.

84. Meyerhoff M.E., Duan C., Meusel M. Novel nonseparation sandwich-type electrochemical enzyme immunoassay system for detecting marker proteins in undiluted blood // Clinical Chemistry. 1995. V. 41, № 9. p. 1378-1384.

85. Mirsky V.M., Riepl M., Wolfbeis O.S. Capacitive monitoring of protein immobilization and antigen-antibody reactions on monomolecular alkylthiol films on gold electrodes // Biosensors & Bioelectronics. 1997. V. 12, № 9-10. - P. 977-989.

86. Morgan L.C., Newman D.J., Price Ch.P. Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine // Clinical Chemistry. -1996. V. 42, № 2. P. 193-209.

87. Morimune K., Yamaguchi Y., Beppu Y., Miyake Sh., Takewaki Sh., Kawata M., Yuasa Y. Easy-to-use immunoassay for the residue analysis of 2,4,5-T // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 376. - P. 37-40.

88. Mosiello L., Laconi C., Del Gallo M., Ercole C., Lepidi A. Development of a monoclonal antibody based potentiometric biosensor for terbuthylazine detection // Sensors and Actuators B. 2003. V. 95. - P. 315-320.

89. Mouvet C., Broussard S., Riolland H., BaranN., Abuknesha R., Ismail G. Evaluation of ELISA microtiter plate-based assays for the direct determination of isoproturon in water samples and soil extracts // Chemosphere. 1997. V. 35. № 5. - P. 1099-1116.

90. Narang U., Anderson G.P. Ligler F.S., Burans J. Fiber optic-based biosensor for ricin // Biosensors & Bioelectronics. 1997. V. 12, № 9-10. - P. 937-945.

91. Nath N., Eldefrawi M., Wright J., Darwin D„ Huestis M. A rapid reusable fiber optic biosensor for detecting cocaine metabolites in urine // J Anal Toxicol. 1999. V. 23, № 6. - P. 460-467.

92. Nellen P.M., Lukosz W. Model experiments with integrated optical input grating couplers as direct immunosensors // Biosensors & Bioelectronics. 1991. V. 6, № 6. - P. 517-525.

93. Neufeld T., Eshkenazi I., Cohen E., Rishpon J. A micro flow injection electrochemical biosensor for organophosphorus pesticides // Biosensors & Bioelectronics. 2000. V. 15. № 5-6. - P. 323-329.

94. Ngeh-Ngwainbi J., Suleiman A.A., Guilbault G.G. Piezoelectric crystal biosensors // Biosensors & Bioelectronics. 1990. V. 5, № 1. - P. 13-26.

95. Papkovsky D.B., O'Riordan T.C., Guilbault G.G. An immunosensor based on the glucose oxidase label and optical oxygen detection // Analytical Chemistry. 1999. V. 71, №8.-P. 1568-1573.

96. Parellada J., Narvaez A., Lopez M.A., Domínguez E., Fernandez J.J., Pavlov V. Ka-takis I. Amperometric immunosensors and enzyme electrodes for environmental applications // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 362. - P. 47-57.

97. Place J.F., Sutherland R.M., Dahne C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces // Biosensors. 1985. V. 1, № 4. - P. 321-353.

98. Povvley C.R., de Bernard P.A. Screening method for nine sulfonylurea hcrbicides in soil and water by liquid chromatography with ultraviolet detection // J. Agrie. Food Chem. — 1998. V. 46. P.-514-519.

99. Pulido-Tofiño P., Barrero-Moreno J.M., Pérez-Conde M.C. Sol-gel glass doped with isoproturon antibody as selective support for the development of a flow-through fluoro-immunosensor // Analytica Chimica Acta. 2001. V. 429. - P. 337-345.

100. Ramanathan K., Danielsson B. Principles and applications of thermal biosensors // Biosensors & Bioelectronics. 2001. V.16. P. 417-423.

101. Rickert J., Gopel W., Beck W., Jung G., Heiduschka P. A 'mixed' self-assembled monolayer for an impedimetric immunosensor // Biosensors & Bioelectronics. — 1996. V. 11, №8.-P. 757-768.

102. Rishpon J., Ivnitski D. An amperometric enzyme-channeling immunosensor // Biosensors & Bioelectronics. 1997. V. 12, № 3. - P. 195-204.

103. Robinson G.A. Optical immunosensors // Biochem Soc Trans. 1991. V. 19, № 1. -P. 18-20.

104. Roos H., Karlsson R., Nilshans II., Persson A. Thermodynamic analysis of protein interactions with biosensor technology // J Mol Recognit. 1998. V. 11, № 1-6. - P. 204210.

105. Rubtsova M., Kovba G.V., Egorov A.M. Chemiluminescent biosensors based on porous supports with immobilized peroxidase // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13,№ l.-P. 75-85.

106. Sagawa T., Oda M., Morii H., Takizawa H., Kozono H., Azuma T. Conformational changes in the antibody constant domains upon hapten-binding // Mol Immunol. 2005. V. 42,№ l.-P. 9-18.

107. Sakai H., Kaneki N., Hara H., Ito K. Availability and development of an enzyme im-munomicrosensor based on an ISFET for human immunoglobulins // Analytica Chimica Acta. 1990. V. 230.-P. 189-193.

108. Salmain M., Fischer-Durand N., Pradier C.M. Infrared optical immunosensor: application to the measurement of the herbicide atrazine // Analytical Biochemistry. 2008. V. 373, № l.-P. 61-70.

109. Sarmah A.K., Kookana R.S. Simultaneous analysis of triasulfuron, metsulfuron-methyl and chlorsulluron in water and alkaline soils by high-performance liquid chromatography // J Environ Sci Health B. 1999. V. 34, № 3. - P. 363-380.

110. Schasfoort R.B., Kooyman R.P., Bergveld P., Greve J. A new approach to imnmnoFET operation // Biosensors & Bioelectronics. — 1990a. V. 5, № 2. P. 103-124.

111. Schasfoort R.B.M., Bergveld P., Borner J., Kooyman R.P.H. Greve J. Modulation of the ISFET response by an immunological reaction // Sensors and Actuators. 1989a. V. 17,№3-4.-P. 531-535.

112. Schasfoort R.B.M., Bergveld P., Kooyman R.P.H., Greve J. Possibilities and limitations of direct detection of protein charges by means of an immunological field-effect transistor // Analytica Chimica Acta. 1990b. V. 238. - P. 323-329.

113. Schasfoort R.B.M., Streekstra G.J., Bergveld P., Kooyman R.P.H., Greve J. Influence of an immunological precipitate on d.c. and a.c. behaviour of an ISFET // Sensors and Actuators. 1989b. V. 18.-P. 119-129.

114. Scheper T., Brandes W., Maschke H., Plotz F., Muller С. Two FIA-based biosensor systems studied for bioprocess monitoring // J Biotechnol. 1993. V. 31, № 3. - P. 345356.

115. Scheper Т.Н. Lammers F. Fermentation monitoring and process control // Curr Opin Biotechnol. 1994. V. 5, №2.-P. 187-191.

116. Schlaeppi J.-M. A., Kessler A., Föry W. Development of a Magnetic Particle-Based Automated Chemiluminescent Immunoassay for Triasulfuron // J. Agric. Food Chem. -1994. V. 42.-P. 1914-1919.

117. Schöning M. J., Poghossian A. Bio FEDs (Field-Effect Devices): State-of-the-Art and New Directions // Electroanalysis. 2006. V. 18, № 19-20. - P. 1893 - 1900.

118. Selvanayagam Z. E., Neuzil P., Gopalakrishnakone P., Sridhar U., Singh M., Ho L. C. An ISFET-based immunosensor for the detection of ß-Bungarotoxin // Biosensors and Bioelectronics. 2002. V. 17, № 9. - P. 821-826.

119. Sergeyeva T.A., Lavrik N.V., Rachkov A.E., Kazantseva Z.I., El'skaya A.V. An approach to conductometric immunosensor based on phthalocyanine thin film // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13, № 3-4. - P. 359-369.

120. Shankaran D.R., Gobi K.V., Sakai T., Matsumoto K., Toko K., Miura N. Surface plas-mon resonance immunosensor for highly sensitive detection of 2,4,6-trinitrotoluene // Biosensors & Bioelectronics. -2005. V. 20, № 9. P. 1750-1756.

121. Shons A., Dorman F., Najarian J. An Immunospecific Microbalance // J. Biomed. Mater. Res. 1972. V. 6. - P. 565-570.

122. Simon E., Knopp D., Carrasco P.B., Niessner R. Development of an Enzyme Immunoassay for Metsulfuron-methyl // Food and Agricultural Immunology. 1998. V. 10. -P. 105-120.

123. Skladal P., Deng A., Kolar V. Resonant mirror-based optical immunosensor: application for the measurement of atrazine in soil // Analytica Chimica Acta. 1999. V. 399. -P. 29-36.

124. Skladal P., Kalab T. A multichannel immunochemical sensor for determination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid // Analytica Chimica Acta. 1995. V. 316, №1. - P. 73-78.

125. Solna R., Skladal P., Eremin S.A. Development of a disposable electrochemical immunosensor for detection of the herbicide acetochlor // International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 2003. V. 83, № 7-8. - P. 609-620.

126. Spencer R.D., Toledo F.B., Williams B.T., Yoss N.L. Design, construction and two applications for an automated fliw-cell polarization fluorometer with digital read-out // Clin. Chem. 1973. V. 19. - P. 834-844.

127. Starodub N.F., Dzantiev B.B., Starodub V.M., Zherdev A.V. Immunosensor for the determination of the herbicide simazine based on an ion-selective field-effect transistor // Analytica Chimica Acta. 2000. V. 424. - P. 37-43.

128. Tahir Z.M., Alocilja E.C., Grooms D.L. Polyaniline synthesis and its biosensor application // Biosensors & Bioelectronics. 2005. V. 20, № 8. - P. 1690-1695.

129. Vianello F., Signor L„ Pizzariello A., Di Paolo M.L., Scarpa M., Hock B., Giersch T., Rigo A. Continuous flow immunosensor for atrazine detection // Biosensors & Bioelectronics. 1998. V. 13. - P. 45-53.

130. Wang H., Brennan J.D., Gene A., Krull U.J. Assembly of antibodies in lipid membranes for biosensor development // Appl Biochem Biotechnol. — 1995. V. 53, № 2. P. 163-181.

131. Wang J., Pamidi P.V., Rogers K.R. Sol-gel-derived thick-film ampcrometric immunosensors // Analytical Chemistry. 1998a. V. 70, № 6. - P. 1171-1175.

132. Wang J., Tian B., Rogers K. R. Thick-film electrochemical immunosensor based on stripping potentiometric detection of a metal ion label // Analytical Chemistry. 19986. V. 70.-P. 1682-1685.

133. Wang Z. H. and Jin G. Covalent immobilization of proteins for the biosensor based on imaging ellipsometry // J Immunol Methods. 2004. V. 285, № 2. - P. 237-243.

134. Watson R.A.A., London J., Shaw E.G., Smith D.S. Polarisation fluoroimmunoassay of gentamicin // Clin. Chim. Acta. 1976. V. 73. - P. 51-55.

135. Weber G. Polarisation of the fluorescence of macromolecules // Biochem. J. 1952. V. 51.-P. 155-167.

136. Willard D. Proll G., Reder S.„ Gauglitz G. New and versatile optical-immunoassay instrumentation for water monitoring // Environ Sci Pollut Res Int. 2003. V. 10. № 3. -P. 188-191.

137. Wittmann C., Hock B. Development of an ELISA for the analysis of atrazine metabolites deethylatrazine and deisopropylatrazine // J. Agric. Food Chem. 1991. V. 39, № 6.1. P. 1194-1200.

138. Wittmann Ch., Bilitewski U., Giersch Th., Kettling U., Schmid R.D. Development and Evaluation of a Dipstick Immunoassay Format for the Determination of Atrazine Residues On-site // Analyst. 1996. V. 12. - P. 863-869.

139. Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Izumrudov V.A., Gee S.J., Hammock

140. B.D. Microplate immunoassay technique using polyelectrolyte carriers: Kinetic studies and application to detection of the herbicide atrazine // Analytica Chimica Acta. 1999. V. 399, № 1-2.-P. 151-160.

141. Yokoyama K., Ikebukuro K., Tamiya E., Karube I., Ichiki N., Arikawa Y. Highly sensitive quartz crystal immunosensors for multisample detection of herbicides // Analytica Chimica Acta. 1995. V. 304.-P. 139-145.

142. Yuqing M., Jianguo G., Jianrong Ch. Ion sensitive field effect transducer-based biosensors // Biotechnology Advances. 2003. V. 21. - P. 527-534.

143. Zeder-Lutz G., Zuber E., Witz J., Van Regenmortel M.H. Thermodynamic analysis of antigen-antibody binding using biosensor measurements at different temperatures // Analytical Biochemistry. 1997. V. 246, № 1. - P. 123-132.

144. Zeravik J., Ruzgas Т., Franek M. A highly sensitive flow-through amperometric immunosensor based on the Peroxidase chip and enzyme-channeling principle // Biosensors & Bioelectronics.- 2003. V. 18.-P. 1321-1327.

145. Аналитическая химия. Проблемы и подходы: В 2 т. Том 1. Пер. с англ. /Под ред. Р.Кельн ера, Ж.-М. Мерме, М. Огго, М. Видмера. М.: Мир, ACT. 2004. 608 с.

146. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. - 704 с.

147. Блинцов А.Н., Дзантиев Б.Б., Бобкова А.Ф., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Атабе-ков И.Г. Новый метод иммуноанализа растительных вирусов, основанный на использовании интерполиэлектролитных реакций // Доклады РАН. — 1995. Т. 345, N 2.1. C. 263-267.

148. Богдановская В.А., Тарасович М.Р. Перспективы развития электрохимических биосепсоров для экологии и медицины // Сенсорные системы. 1997. Т. 11, № 4. -С. 482-493.

149. Богоявленский А.П., Дигель И.Э., Березин В.Э. Оценка чувствительности имму-нофсрментного анализа на мембранном сорбенте при использовании различных субстратов пероксидазы // Биохимия. — 1997. Т. 62, вып.8. — С. 1015-1017.

150. Гиляров М.С. Биологический энциклопедический словарь. М.: Сов. энциклопедия, 1989. - 864 с.

151. Дзантиев Б.Б., Блинцов А.Н., Бобкова А.Ф.,Изумрудов В.А., Зезин А.Б. Новые методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании интерполи-электролитных реакций // ДАН. 1995. Т. 342. № 4. - С. 549-552.

152. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

153. Ивницкий Д.М., Дзантиев Б.Б., Егоров A.M., Кашкин А.П. Амперометрический датчик для регистрации результатов иммуноферментного анализа // Прикладная биохимия и микробиология. — 1985. Т. 21, № 6. С. 821-825.

154. Коллинз У .П. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир, 1991. - 280 с.

155. Мартыненко В.И. Промоненков В.К., Кукаленко С.С., Володкович С.Д., Каспаров В.А. Пестициды: Справочник. -М.: Агропромиздат, 1992. 368 с.

156. Медведь Л.И. Справочник по пестицидам. Киев: Урожай, 1974.-448 с.

157. Мельников H.H., Новожилов К.В., Белан С.Р., Пылова Т.Н. Справочник по пестицидам. М.: Химия, 1985. - 352 с.

158. Мельниченко O.A., Еремин С.А. Поляризационный флуороиммуноанализ гербицида изопротурона // Агрохимия. 1994. № 10. - С. 126-130.

159. Приев А.И., Сарвазян А.П., Дзантиев Б.Б. Акустометрический иммуноанализ // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. 1990. Т. 24. - С. 170-193.

160. Решетилов А.Н., Егоров A.M. Иммунохимические сенсоры на основе потенцио-метрических полупроводниковых преобразователей // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. 1990. Т. 26. - С. 3-66.

161. Решетилов А.Н., Коржук H.J1. Биосенсорные анализаторы и их использование в медицине, биотехнологии и экологическом мониторинге: Учебное пособие. — Тула: Издательство ТулГУ, 2004. 124 с.

162. Савицкий А.П. Флуоресцентный иммуноанализ. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. 1987. Т. 3. - С. 117-166.

163. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. // В: Санитарные правила и нормы СанПиН 2.1.4.559-96. М.: Госкомсанэпиднадзор России, 1996.

164. Ситдыков P.A., Ивницкий Д.М., Агасян П.К., Рсйфман JI.C. Теоретическое и экспериментальное исследование амперометрических датчиков в проточно-инжекционном анализе // Журнал аналитической химии. 1989. Т. 8. - С. 14571461.

165. Стародуб В.М. Новый тип электрохимического иммуносенсора на основе ион-селективного полевого транзистора // Украинский биохимический журнал. 1999. Т. 71, №4.-С. 120-123.

166. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир, 1992.-614 с.

167. Уильяме А.Т.Р. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ. // В Коллинз У.П. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир, 1991. - С. 138-149.

168. Хомутов С.М., Решетилов А.Н., Гаврилова Е.М., Егоров A.M. Изучение эффективности некоторых субстратов для pH-детекции пероксидазной активности // Журнал аналитической химии. 1995. Т. 50, № 6. - С. 659-662.

169. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. Методы обнаружения и оценки ошибок. — JL: Химия, 1984. С. 168.

170. Чигрин A.B., Умнов A.M., Соколова Г.Д., Хохлов П.С., Чкаников Д.И. Разработка количественного иммуноферментного анализа хлорсульфурона // Агрохимия. -1989. № 8. С. 119-123.

171. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера, 2005. - 335 с.